Hiệu quả khử khuẩn và ảnh hưởng của tia gamma lên cấu trúc vi thể của xương vòm sọ chó bảo quản lạnh sâu

Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 2 - tháng 04/2018<br /> <br /> HIỆU QUẢ KHỬ KHUẨN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA TIA GAMMA<br /> LÊN CẤU TRÚC VI THỂ CỦA XƯƠNG VÒM SỌ CHÓ<br /> BẢO QUẢN LẠNH SÂU<br /> <br /> Nguyễn Phương Thảo Tiên, Trần Anh Hùng, Lê Văn Tâm, Phùng Hữu Thảo, Nguyễn Phan Quỳnh Anh<br /> Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế<br /> <br /> Tóm tắt<br /> Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả khử khuẩn và ảnh hưởng của tia gamma lên cấu trúc vi thể ở những mảnh<br /> xương vòm sọ chó sau chiếu xạ. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 50 cặp mảnh xương vòm sọ chó có<br /> kích thước như nhau, được lấy đối xứng qua đường dọc giữa xương sọ. Lô chứng gồm 50 mảnh, chỉ được bảo<br /> quản lạnh sâu, không chiếu tia gamma. Lô thực nghiệm gồm 50 mảnh, được bảo quản lạnh sâu và chiếu tia<br /> gamma với liều 25kGy. Đánh giá hiệu quả khử khuẩn và so sánh sự biến đổi về cấu trúc vi thể của các lô với<br /> nhau. Kết quả: Sau chiếu tia gamma với liều 25 kGy, tất cả các mảnh xương vòm sọ chó đều có kết quả cấy<br /> khuẩn âm tính. Ở mức độ vi thể, không thấy có sự biến đổi cấu trúc ở các mảnh xương được chiếu xạ. Kết<br /> luận: Tia gamma với liều chiếu 25 kGy: (i) Có khả năng diệt khuẩn hoàn toàn đối với các chủng loại vi khuẩn<br /> thường nhiễm trong các loại mô. (ii) Không gây biến đổi cấu trúc của mô xương sọ ở mức độ cấu tạo vi thể.<br /> Từ khóa: Xương sọ chó, tia gamma, khử khuẩn<br /> Abstract<br /> <br /> THE EFFECT OF GAMMA STERILIZATION AND ITS EFFECT ON<br /> MICROSCOPIC STRUCTURE OF DEEP FROZEN DOG SKULL<br /> <br /> Nguyen Phuong Thao Tien, Tran Anh Hung, Le Van Tam, Phung Huu Thao, Nguyen Phan Quynh Anh<br /> Hue University of Medicine and Pharmacy, Hue University<br /> <br /> Objective:  To evaluate the effect of gamma sterilization and its effect on microscopic structure of deeply<br /> frozen dog skull. Subjects and methods: 50 pairs of dog skull fragments have the same size,which were taken<br /> symmetrically through the midline of the skull, were divided into two lots. Evident lot consisting of 50 pieces<br /> are just deeply frozen, not irradicated. Experimental lot which was composed of 50 pieces were deeply frozen<br /> and exposed to 25kGy of gamma radiation. Afterwards,  to evaluate the effect of gamma sterilization and<br /> compare the alter of bone matrix between lot groups. Results: After gamma irradiation, all dog skull fragments<br /> were negative with bacteriological examination. In microscopic scale, no difference was found between the<br /> two lots and there was no structural change in the irradiated fragments of all dog skull. Conclusion: Gamma<br /> irradiation with 25 kGy: (i) It has the ability to kill bacteria completely in the type of bacteria commonly<br /> infected tissue. (ii) It does not alter the structure of dog skull in microstructures.<br /> Key words: dog skull, gamma, sterilize<br /> 1. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Chiếu xạ bằng tia gamma là phương pháp vật lý<br /> khử khuẩn phổ biến nhất hiện nay trong qui trình<br /> xử lý, bảo quản lạnh sâu mô xương ở các ngân hàng<br /> mô [2],[4],[7],[8]. Hầu hết các sản phẩm mô ghép<br /> cũng như các vật liệu sinh học thay thế mô đều được<br /> khử trùng bằng tia gamma vì nó có ưu điểm: loại trừ<br /> được mầm bệnh có trong mô, không phá huỷ mô<br /> ở liều phù hợp và có thể giảm đáng kể tính kháng<br /> nguyên của mô.<br /> Tại Việt Nam, các ngân hàng mô như Ngân hàng<br /> mô Thành phố Hồ Chí Minh, Ngân hàng mô Học viện<br /> <br /> Quân Y, Trung tâm Công nghệ mô ghép Đại học Y<br /> Hà Nội và Đơn vị Bảo quản Mô- Bệnh viện Đại học<br /> Y Dược Huế đều dùng tia gamma để khử trùng mô<br /> ghép, nhất là mô xương sọ. Tuy nhiên, bên cạnh khả<br /> năng tiêu diệt vi khuẩn, tia gamma liều cao cũng<br /> có thể làm biến đổi cấu trúc, thậm chí phá hủy mô<br /> ghép [1],[2]. Do đó,việc đánh giá chất lượng của các<br /> mảnh xương sọ sau quá trình bảo quản lạnh sâu có<br /> chiếu tia gamma là rất cần thiết. Trên thực tế, có rất<br /> ít nghiên cứu được thực hiện trên xương sọ người<br /> do những hạn chế về vấn đề đạo đức y học.<br /> Chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu thực<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Phương Thảo Tiên, email: npthaotien@gmail.com<br /> Ngày nhận bài: 16/8/2017, Ngày đồng ý đăng: 16/3/2018; Ngày xuất bản: 27/4/2018<br /> <br /> JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY<br /> <br /> 37<br /> <br /> Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 2 - tháng 04/2018<br /> <br /> nghiệm “Đánh giá hiệu quả khử khuẩn và ảnh<br /> hưởng của tia gamma lên cấu trúc vi thể của vòm<br /> sọ chó bảo quản lạnh sâu”, với 2 mục tiêu:<br /> 1/ Đánh giá hiệu quả khử khuẩn của tia gamma<br /> lên các mảnh xương vòm sọ chó sau chiếu xạ;<br /> 2/ Đánh giá sự biến đổi về cấu trúc vi thể ở các<br /> mảnh xương vòm sọ chó sau chiếu xạ.<br /> 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Đối tượng nghiên cứu<br /> - Động vật: 50 chó ta khỏe mạnh, không phân<br /> biệt đực cái có cân nặng 10 – 12 kg/con.<br /> - Tạo các mảnh xương sọ có kích thước khoảng<br /> 4x4cm ở đỉnh đầu, theo nguyên tắc đối xứng<br /> - Sau khi được cắt rời khởi cơ thể sống, các<br /> mảnh xương được xử lý theo quy trình xử lý xương<br /> sọ và bảo quản ở nhiệt độ - 85oC tại Đơn vị Bảo quản<br /> Mô, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế.<br /> 2.2. Phân lô nghiên cứu<br /> - Mỗi xương vòm sọ chó được cưa theo đường<br /> dọc giữa chia vòm sọ ra thành hai phần trái (lô A) và<br /> phải (lô B).<br /> - Lô A (lô chứng): chỉ bảo quản lạnh sâu -85ºC,<br /> không chiếu xạ<br /> - Lô B (lô thực nghiệm): bảo quản lạnh sâu<br /> -85ºC, sau đó chiếu xạ với liều chiếu 25 kGy.<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực<br /> nghiệm<br /> 2.3.1. Chiếu xạ:<br /> - Tại Trung tâm chiếu xạ quốc gia (Hà Nội)<br /> - Thời gian chiếu xạ: 24 giờ<br /> - Chọn liều chiếu 25kGy là liều chiếu xạ được<br /> Hiệp Hội Ngân Hàng Mô Châu Á- Thái Bình Dương<br /> khuyến cáo<br /> 2.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả khử<br /> trùng của tia gamma<br /> - Cấy tìm khuẩn lạc ở các mảnh xương sọ ngay<br /> <br /> trước khi bắt đầu quy trình xử lý mảnh xương sọ và<br /> sau khi mảnh xương sọ chó đã được bảo quản lạnh<br /> sâu và chiếu xạ.<br /> - Quy trình thực hiện tại Khoa Vi sinh- Bệnh viện<br /> Đại học Y Dược Huế.<br /> 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu mô học<br /> - Kỹ thuật làm tiêu bản mô học: thực hiện tại Bộ<br /> môn Mô Phôi, Trường Đại học Y Dược Huế<br /> • Cố định mẫu và khử canxi bằng dung dịch<br /> formol 8% và acid HNO3 8%<br /> • Chuyển mẫu theo quy trình<br /> • Đúc mô<br /> • Cắt lát mỏng 4 - 5μm<br /> • Nhuộm Hematoxylin – Eosin (H.E)<br /> - Quan sát và chụp ảnh vi thể bằng kính hiển vi<br /> truyền hình chụp ảnh:<br /> • Sử dụng kính hiển vi truyền hình chụp ảnh Nikon<br /> • Quan sát cấu trúc vi thể của mảnh xương vòm<br /> sọ chó trước và sau chiếu xạ ở độ phóng đại x 100<br /> và x 400.<br /> 3. KẾT QUẢ<br /> 3.1. Kết quả khử khuẩn của tia gamma ở liều 25<br /> kGy lên mô xương sọ<br /> Trước chiếu xạ, có 39 mẫu xương sọ (78%) có kết<br /> quả cấy khuẩn dương tính, 11 mẫu có kết quả âm<br /> tính (tỷ lệ 22%). Sau chiếu xạ, tất cả 50 mẫu được<br /> kiểm tra cấy khuẩn lại đều cho kết quả âm tính (tỷ<br /> lệ 100%).<br /> Loại mẫu Trước chiếu xạ Sau chiếu xạ<br /> n=50<br /> n=50<br /> Kết quả<br /> SL<br /> %<br /> SL<br /> %<br /> Âm tính<br /> <br /> 11<br /> <br /> 22<br /> <br /> 50<br /> <br /> 100<br /> <br /> Dương tính<br /> <br /> 39<br /> <br /> 78<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả cấy khuẩn các mẫu xương vòm sọ chó<br /> <br /> Biểu đồ 1. Kết quả kiểm tra vi khuẩn sau liều chiếu 25 kGy.<br /> 38<br /> <br /> JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY<br /> <br /> Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 2 - tháng 04/2018<br /> <br /> 3.2. Sự biến đổi về cấu trúc vi thể xương vòm sọ sau chiếu xạ.<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh vi thể mô xương sọ lô chứng (A: HE x 100; B: HE x 400), lô hấp thụ<br /> tia gamma liều 25 kGy (C: HE x 100; D: HE x 400).<br /> 1. Tế bào xương, 2. Chất căn bản, 3. Hốc tủy<br /> Kết quả nghiên cứu cấu trúc vi thể mô xương<br /> giữa lô chứng và lô chiếu xạ liều 25 kGy cho thấy<br /> không có sự thay đổi cấu trúc mô xương khi quan<br /> sát trên tiêu bản nhuộm H.E. Chất căn bản ưa acid.<br /> Cấu trúc các lá xương tương đối rõ, có lá xương chạy<br /> theo hướng thẳng, có lá chạy xiên. Trên các lá xương<br /> có nhiều ổ xương. Các ổ xương hình tròn hay hình<br /> bầu dục chứa tế bào xương, bào tương tế bào ưa<br /> acid có thể nhìn thấy nhân bắt mầu tím, nhân tròn<br /> hạt nhân rõ. Tùy vị trí cắt mà ta có thể nhìn thấy<br /> rõ bào tương, nhân tế bào xương. Có vị trí trong ổ<br /> xương ta không nhìn thấy tế bào xương, hoặc chỉ<br /> nhìn thấy một phần tế bào. Hình thái cấu tạo của sợi<br /> collagen trong chất căn bản của mô xương không<br /> quan sát được ở mức độ vi thể.<br /> 4. BÀN LUẬN<br /> 4.1. Về hiệu quả khử khuẩn của tia gamma ở<br /> liều 25 kGy lên mô xương sọ<br /> Kết quả cấy khuẩn kiểm tra các mẫu trong cùng<br /> một điều kiện, các mẫu xương sọ sau chiếu xạ đều<br /> âm tính. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê<br /> Thị Hồng Nhung (2006). Tia gamma là tia có bước<br /> sóng ngắn nhưng mang năng lượng lớn, đủ sức tiêu<br /> diệt hầu hết vi sinh vật trên đường đi của nó. Theo<br /> một số tác giả, ở liều chiếu từ 10 kGy trở lên, tia<br /> gamma đã có khả năng diệt khuẩn [8]. Tuy nhiên,<br /> tính kháng xạ của các vi sinh vật là khác nhau, do đó,<br /> vật phẩm bị nhiễm bởi vi sinh vật có tính kháng xạ<br /> <br /> cao thì phải dùng liều bức xạ ion hóa cao hơn để khử<br /> trùng. Mặt khác, việc khống chế nhiễm các vi sinh<br /> vật ban đầu cũng gặp nhiều khó khăn mặc dù mô<br /> được lấy trong điều kiện vô trùng ngoại khoa, song<br /> quá trình vận chuyển, xử lý, đóng gói cũng có thể<br /> gây nhiễm. Các chủng loại vi sinh vật thường nhiễm<br /> trong mô không đa dạng và thường ít kháng xạ [1].<br /> Tại Mỹ, các ngân hàng mô thuộc Hiệp hội Ngân hàng<br /> mô Hoa Kỳ (AATB) đều sử dụng liều chiếu 15 kGy. Tại<br /> Việt nam và các nước có Ngân hàng mô thuộc Hiệp<br /> Hội Ngân hàng mô Châu Á- Thái Bình Dương đều sử<br /> dụng liều chiếu 25 kGy [4],[7]. Sử dụng liều chiếu<br /> cao hơn có thể phá hủy mô. Do đó, chúng tôi lựa<br /> chọn sử dụng liều chiếu an toàn là 25kGy.<br /> 4.2. Về sự biến đổi về cấu trúc vi thể xương vòm<br /> sọ sau chiếu xạ<br /> Kết quả nghiên cứu cấu trúc vi thể mô xương<br /> giữa lô chứng và lô chiếu xạ liều 25 kGy cho thấy<br /> không có sự thay đổi cấu trúc mô xương khi quan<br /> sát trên tiêu bản nhuộm H.E. Kết quả nghiên cứu của<br /> chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Hồng<br /> Nhung (2010) và Bùi Thanh Thủy (2016). Ngoài ra,<br /> chúng tôi chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào<br /> chỉ ra sự biến đổi cấu trúc hình thái vi thể của mô<br /> xương chiếu xạ và không chiếu xạ. Theo chúng tôi,<br /> sự thoái hóa tế bào, thoái hóa mô chỉ có thể quan<br /> sát được sau một thời gian dài chiếu tia xạ lên một<br /> cơ thể sống. Mẫu mô nghiên cứu của chúng tôi khi<br /> chiếu xạ đã là mẫu mô chết. Sự biến đổi nếu có chỉ<br /> JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY<br /> <br /> 39<br /> <br /> Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 8, số 2 - tháng 04/2018<br /> <br /> xảy ra theo hướng lý học: tổn thương vì nhiệt độ<br /> tăng lên khi chiếu xạ. Với liều chiếu 25kGy, theo<br /> tính toán nhiệt độ tăng lên là 600C. Tuy nhiên, mẫu<br /> mô khi chiếu xạ được bảo quản trong đá khô (đá<br /> C02) để duy trì nhiệt độ - 700C trong khi chiếu nên<br /> khả năng tổn thương do nhiệt không thể xảy ra [1].<br /> Một số công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, với liều<br /> chiếu từ 25 kGy trở lên, quan sát dưới kính hiển vi<br /> điện tử quét ở mức độ siêu cấu trúc, có thể nhận<br /> thấy được sự đứt gãy các sợi collagen trong chất căn<br /> bản xương [1], [5]. Sợi collagen tham gia trực tiếp<br /> vào độ chịu lực cơ học của xương, do đó tổn thương<br /> <br /> sợi collagen sẽ làm giảm độ bền của mô xương [6].<br /> Ngoài ra sợi collagen còn tham gia dẫn tạo xương<br /> trong quá trình sinh xương. Trong thực hành lâm<br /> sàng, mô ghép xương tỏ ra chậm liền khi bị chiếu xạ<br /> liều cao > 50kGy [5].<br /> 5. KẾT LUẬN<br /> Tia gamma với liều chiếu 25 kGy:<br /> - Có khả năng diệt khuẩn hoàn toàn đối với các<br /> chủng loại vi khuẩn thường nhiễm trong các loại mô.<br /> - Không gây biến đổi cấu trúc của mô xương sọ<br /> ở mức độ cấu tạo vi thể<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Lê Thị Hồng Nhung (2006). “Nghiên cứu thực nghiệm<br /> lựa chọn liều chiếu tia gamma khử trùng cho mảnh xương sọ<br /> bảo quản lạnh sâu”, Luận văn Thạc sĩ Y học.<br /> 2. Ngô Duy Thìn, Lê Thị Hồng Nhung (2012), “Khử<br /> khuẩn bằng tia gamma và ảnh hưởng đến độ bền mô<br /> xương vòm sọ chó bảo quản lạnh sâu”, Tạp chí Nghiên cứu<br /> Y học, Phụ trương 80, số 3C, trang 135-139.<br /> 3. Bùi Thanh Thủy (2015), “Đánh giá hiệu quả của<br /> phương pháp ghép tự thân mảnh<br /> xương sọ bảo quản lạnh sâu trên thực nghiệm và ở<br /> người”, Luận án Tiến sĩ Y học<br /> 4. AATB (2008), Standards for Tissue Banking,<br /> American Association of Tissue banks, Virgina.<br /> <br /> 40<br /> <br /> JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY<br /> <br /> 5. Burchardt H (1997), “Biology of bone<br /> transplantation” Orthop. Clin. North. Am.18, pp: 187-196.<br /> 6. Loty B, Courpied JP, Tomeno B, Postel M, Forest M,<br /> Abelanet R. (2005), “Bone allografts sterilised by irradiation.<br /> Biological properties, procurement and results of 150<br /> massive allografts” Scand J Surg 94 (1), pp: 67 – 70.<br /> 7. Thai association of tissue banking Bangkok<br /> biomaterial center (2001), Advance tissue banking guideline<br /> ( 20 years experience of tissue banking in Thailand)<br /> 8. Thomas F. Baker, Chad J.Ronholdt, MBA and Simon<br /> Bogdansky, Ph.D (2005), “Validating low dose gamma<br /> sterilization for allografts using iso 111337 method 2B”,<br /> Cell and Tissue Banking 6, pp: 271 -275.<br /> <br />