Hispidin- một tác nhân chống ung thư mạnh phân lập từ lá cây ngái (Ficus hispida L.)

T¹p chÝ Hãa häc, T. 44 (3), Tr. 345 - 349, 2006<br /> <br /> <br /> Hispidin - Mét t¸c nh©n chèng ung th m¹nh ph©n lËp<br /> tõ l¸ c©y ng¸i (Ficus hispida L.)<br /> §Õn Tßa so¹n 15-8-2005<br /> V¨n Ngäc H íng, Vò Minh Trang<br /> Khoa Hãa häc, Tr"êng §¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §HQG H+ Néi<br /> <br /> <br /> Summary<br /> Six alkaloids in the total alkaloid residue were extracted from the leaves of Ficus hispida L.<br /> collected in Nghe An province. One of them was elucidated as hispidin by spectrocopic method<br /> which has demomtrated cytotocicity toward human hepatic cancer cell line Hep-2 (IC50 = 0.0012<br /> µg/ml) and human heart cancer line RD (IC50 = 0.0023 µg/ml).<br /> <br /> <br /> I - Më ®Çu §iÓm nãng ch¶y ®o trªn m¸y Boitius; phæ<br /> IR ghi trªn m¸y Nicolet Flo I - IR theo ph ¬ng<br /> Ng¸i l c©y bôi rËm v rÊt phæ biÕn ë n íc ta. ph¸p truyÒn qua. Phæ UV ®o trªn m¸y GBC<br /> Nã l c©y thuèc d©n téc v ® îc dïng víi tÇn suÊt 2855. Phæ céng h ëng tõ h¹t nh©n (NMR) 1D<br /> cao trong c¸c b i thuèc gia truyÒn chèng ung th v 2D ghi trªn m¸y Bruker Avance 500 MHz.<br /> cña c¸c d©n téc miÒn t©y NghÖ An [1]. Silicagel cho s¾c ký cét, s¾c ký líp máng v<br /> Sergio v céng sù ®5 chØ ra r»ng s¾c ký ®iÒu chÕ, ®Òu dïng cña h5ng MERCK<br /> o-metyltylophorilidin ph©n lËp tõ c nh v l¸ c©y lo¹i cì h¹t 40 - 63 µm ký hiÖu silicagel 60<br /> ng¸i cña Th¸i Lan cã t¸c dông chèng ung th (0,040 - 0,063 mm) b¶n nh«m tr¸ng s½n ký hiÖu<br /> m¹nh víi c¸c dßng ung th phæi (Lu1), ung th 60 F254 v b¶n kÝnh tr¸ng s½n ký hiÖu 12PCL<br /> tiÒn liÖt tuyÕn (LNCap), ung th ®¹i tr ng (Col-2) plates 20×20 cm Silicagel 60F254 2 mm, c¸c<br /> v ung th yÕt hÇu (HB) [2]. Trong th«ng b¸o dung m«i v hãa chÊt ®Òu dïng lo¹i PA cña<br /> tr íc chóng t«i ®5 kh¼ng ®Þnh cã 6 ancaloit trong MERCK v Trung Quèc.<br /> l¸ c©y ng¸i ViÖt Nam v tæng c¸c ancaloit n y cã<br /> ®éc tÝnh m¹nh ®èi víi tÕ b o ung th gan ng êi 2. Nguyªn liÖu thùc vËt<br /> Hep-2 (IC50 = 0,7 µg/ml), tÕ b o ung th m ng MÉu l¸ ng¸i (Ficus hispida L.) ® îc thu<br /> tim ng êi RD (IC50 = 0,97 µg/ml) v ung th tö mua t¹i NghÖ An v o th¸ng 11 n¨m 2003 v<br /> cung ng êi FI (IC50 = 0,95 µg/ml) [3]. ® îc GSTSKH NguyÔn NghÜa Th×n, Tr êng<br /> Trong b¸o c¸o n y, chóng t«i th«ng b¸o vÒ §¹i häc khoa häc tù nhiªn, §¹i häc Quèc gia<br /> viÖc ph©n lËp v x¸c ®Þnh cÊu tróc ph©n tö c¸c H Néi gi¸m ®Þnh. HiÖn nay tiªu b¶n mÉu<br /> ancaloit trong cÆn tæng c¸c ancaloit nªu ë trªn c©y ng¸i (m5 sè F23) ®ang ® îc l u tr÷ t¹i<br /> v kh¶o cøu ho¹t tÝnh chèng ung th cña Trung t©m B¶o t ng thùc vËt thuéc Tr êng<br /> chóng. §HKHTN, §HQG H Néi.<br /> Sau khi gi¸m ®Þnh, mÉu ® îc lo¹i bá c¸c l¸<br /> II - Thùc nghiÖm qu¸ gi , v ng óa, l¸ s©u bÖnh råi röa s¹ch v<br /> ph¬i kh« trong nh©m, sÊy ë 40 - 45oC v nghiÒn<br /> 1. C¸c thiÕt bÞ v hãa chÊt th nh bét.<br /> <br /> 345<br /> 3. ChiÕt v ph¸t hiÖn c¸c ancaloit trong l¸ Ho tan 4 g cÆn tæng ancaloit v o mét l îng<br /> c©y ng¸i (Ficus hispida L.) CHCl3 võa ®ñ ®Ó tan hÕt, råi tÈm v o 10 g<br /> silicagel cì h¹t 60 - 100 µm, v l m kh« råi cho<br /> 1 kg bét l¸ c©y ng¸i ®5 chuÈn bÞ ë 3.2 ® îc<br /> lªn cét d i 100 cm, ® êng kÝnh 3 cm cã nhåi<br /> ng©m víi dung dÞch axit tactric 3% (pH = 2)<br /> trong 2 ng y, läc qua phÔu butne v röa b5 2 lÇn s½n 150 g silicagel cì h¹t 40 - 63 µm theo<br /> b»ng n íc cÊt. DÞch läc ® îc trung ho b»ng ph ¬ng ph¸p nhåi ít víi CHCl3. Röa cét b»ng<br /> NH4OH ®Æc ®Õn pH = 10 v chiÕt b»ng CHCl3 hÖ dung m«i CHCl3: EtOAc: MeOH, 8 : 1 : 1<br /> cho ®Õn lóc dÞch tiÕt cã ©m tÝnh víi thuèc thö (v:v:v) víi tèc ®é 30 giät/phót v høng th nh<br /> Dragendoft. Gép dÞch chiÕt l m kh« b»ng 150 ph©n ®o¹n, mçi ph©n ®o¹n 7 ml. KiÓm tra<br /> Na2SO4 khan, cÊt lo¹i dung m«i thu 2,6 g cÆn c¸c ph©n ®o¹n b»ng s¾c ký líp máng v gép c¸c<br /> tæng c¸c ancaloit, hiÖu suÊt 0,26%. ph©n ®o¹n cã s¾c phæ gièng nhau th nh 6 nhãm.<br /> Ho tan mét l îng nhá cÆn tæng ancaloit Nhãm 2 gåm ph©n ®o¹n 12 ®Õn 20, lo¹i dung<br /> võa thu ® îc v o CHCl3 võa ®ñ ®Ó lÊy v o m«i, kÕt tinh l¹i trong metanol thu ® îc 0,3 g<br /> capila råi ch©m lªn b¶n nh«m tr¸ng silicagel d i tinh thÓ h×nh kim, nãng ch¶y 124 - 126oC. Rf<br /> 10cm, réng 2 cm th nh 2 vÖt, vÖt nä c¸ch vÖt kia 0,70 trong hÖ cña röa cét, hiÖn m u v ng da cam<br /> 0,8 cm c¸ch mÐp bªn 0,6 cm v c¸ch mÐp d íi víi thuèc thö Dragendoff v m u ®á víi ceri<br /> 0,5 cm. Cho b¶n v o b×nh triÓn khai s¾c ký ®5 sunfat ký hiÖu l H2. C¸c sè liÖu quang phæ cña<br /> cã s½n hÖ dung m«i CHCl3 : EtOAC : MeOH = 8 H2 nh sau:<br /> : 1: 1 (v:v:v) ®Ó tiÕn h nh s¾c ký, khi tuyÕn dung - Phæ IR; cm-1 (KBr): 1688,35; 1606,37;<br /> m«i c¸ch mÐp trªn 0,2cm th× lÊy b¶n ra, l m kh« 1512.44; 1464,16; 1252,06; 1203,98; 1169,78<br /> dung m«i v chia l m 2 phÇn. Mét phÇn hiÖn v 1031,61.<br /> b»ng Dragendoft v phÇn kia hiÖn b»ng ceri<br /> - Phæ UV (MeOH) max, log , nm: 201,8<br /> sunfat. KÕt qu¶ s¾c ký líp máng ph¸t hiÖn c¸c<br /> (0,9429) 239,4 (0,6411); 259,0 (0,7601) v<br /> ancaloit trong l¸ c©y ng¸i thÓ hiÖn trong b¶ng 1.<br /> 286,3 (0,5299).<br /> 4. Ph©n lËp v x¸c ®Þnh cÊu tróc ph©n tö - Phæ EI-MS: 356; 350; 296; 268… Sè liÖu<br /> ancaloit cña l¸ c©y ng¸i phæ 1H&13C-NMR (xem b¶ng 2, phÇn 3).<br /> <br /> B¶ng 1: C¸c ancaloit trong l¸ Ficus hispida L.<br /> Sè v ký hiÖu Rf § êng kÝnh vÖt, cm Dragendoft Ceri sunfat<br /> H1 0,75* 0,7 V ng da cam Hång t ¬i<br /> H2 0,70* 0,8 V ng da cam §á<br /> H3 0,68 0,2 V ng da cam X¸m<br /> H4 0,50 0,3 V ng da cam Xanh<br /> H5 0,45 0,4 V ng da cam TÝm<br /> H6 0,38 0,2 V ng da cam N©u<br /> Ancaloit H1 v+ H2 cã ®"êng kÝnh vÖt lín nhÊt v+ m+u s¾c phæ ®Ëm nhÊt.<br /> <br /> 5. Thö ho¹t tÝnh chèng ung th1 cña ancaloit phiÕn vi l îng 96 giÕng. PhiÕn thö bao gåm tÕ<br /> H2 ph©n lËp ®1îc tõ l¸ c©y ng¸i b o ung th , m«i tr êng nu«i cÊy v chÊt thö<br /> C¸c tÕ b o ung th ® îc duy tr× sèng liªn ® îc ñ trong tñ Êm CO2/37oC/48-72 giê ®Ó tÕ<br /> tôc trong ®iÒu kiÖn chuÈn. Sau khi tÕ b o ® îc b o tiÕp tôc ph¸t triÓn sau ®ã lÊy phiÕn ra ®Ó cè<br /> ho¹t hãa ph¸t triÓn ®Õn phase log sÏ ® îc sö ®Þnh tÕ b o, röa, nhuém, lo¹i thuèc nhuém thõa,<br /> dông ®Ó thö víi ancaloit H2 ®5 chuÈn bÞ s½n ë 4 - råi ho tan l¹i v o dung dÞch chuÈn. KÕt qu¶ ®äc<br /> 10 thang nång ®é kh¸c nhau; lÆp l¹i 3 lÇn trªn trªn m¸y Elisa ë b íc sãng 695 - 515 nm.<br /> <br /> 346<br />  Gi¸ trÞ IC50 ® îc tÝnh theo ch ¬ng tr×nh b¶ng nh©n kia l nh©n thÕ 1,3,4 ® îc thÓ hiÖn ë pic cã<br /> ® êng cong víi gi¸ trÞ logarit dùa trªn d5y nång = 6,99 ppm v 6,67 ppm 1H; dd J = 8,2 v 2,0<br /> ®é kh¸c nhau cña chÊt thö v gi¸ trÞ OD ®o Hz; = 6,78; d; 1H, J = 2,0 Hz nghÜa l cã<br /> ® îc. KÕt qu¶ cho thÊy IC50 cña H2 ®èi víi Hep t ¬ng t¸c octo-octo v octo-meta. C¸c pic =<br /> - G2 l 0,0012 µg/ml ®èi víi RD l 0,0023 3,76, 3,72 v 3,52 ppm, s, 3H. §©y l tÝn hiÖu<br /> µg/ml. cña 3 nhãm metoxy ë 2 nh©n benzen trong ph©n<br /> tö H2. Phæ IR còng chøng minh ®iÒu n y b»ng<br /> III - KÕt qu¶ v% th¶o luËn tÇn sè hÊp thô C-O-C = 1031 cm-1. Phæ IR cßn<br /> cho thÊy nit¬ trong H2 liªn kÕt víi cacbon theo<br /> 1. Ph©n lËp v x¸c ®Þnh cÊu tróc ph©n tö cña kiÓu amin bËc 3 thÓ hiÖn ë = 1252,0 v 1169,2<br /> ancaloit cm-1. Phæ UV cña H2 cã 4 cùc ®¹i hÊp thô 201,8,<br /> Khi kh¶o s¸t hiÖu qu¶ chiÕt ancaloit trong l¸ 259,0, 239,4 v 368,3 nm. §iÒu n y cho thÊy 2<br /> c©y ng¸i theo c êng ®é axit, chóng t«i nhËn nh©n benzen liªn kÕt víi nhau qua nhãm etylen.<br /> thÊy dung dÞch axit tactric 3% cho phÐp chiÕt KÕt hîp c¸c sè liÖu quang phæ trªn, chóng ta<br /> c¸c ancaloit trong l¸ c©y ng¸i cã hiÖu qu¶ tèt cã c«ng thøc cÊu t¹o cña H2 ® îc chØ ra trªn<br /> nhÊt v hiÖu suÊt cao nhÊt [3], ¸p dông quy tr×nh h×nh 1.<br /> n y, tõ 1 kg bét l¸ c©y ng¸i (Ficus hispida L.)<br /> thu mua t¹i NghÖ An. Chóng t«i chiÕt ® îc 2,6g 11<br /> cÆn tæng c¸c ancaloit, hiÖu suÊt 0,26%. §Þnh<br /> tÝnh c¸c ancaloit trong cÆn n y b»ng thuèc thö CH3O 12 10 H<br /> 21 1<br /> Dragendoft v xeri sunfat chóng t«i ph¸t hiÖn cã 13 9 3<br /> 6 ancaloit kh¸c nhau trong l¸ c©y ng¸i, trong ®ã 14 8 2<br /> 4<br /> cã hai ancaloit cã h m l îng lín l c¸c ancaloit 16 7 N<br /> 17<br /> cã Rf 0,75 v 0,70 (xem b¶ng 1). 15 6 5<br /> TiÕn h nh s¾c ký cét trªn silicagel cì h¹t 40 18<br /> 20<br /> - 63 µm víi dung m«i cña CHCl3/MeOH theo CH3O 19<br /> gradient chóng t«i ph©n lËp ® îc 1 ancaloit 22 OCH3<br /> trong 6 ancaloit trªn v ký hiÖu l H2.<br /> H×nh 1<br /> H2 l tinh thÓ h×nh kim m u tr¾ng, kÕt tinh<br /> l¹i trong MeOH nãng ch¶y ë 124 - 125oC; cã Rf Nh thÕ trong ph©n tö H2 cã C2 l bÊt ®èi<br /> = 0,7 (CHCl3/EtOAc/MeOH; 8 : 1 : 1; : : ) xøng, ®Ó x¸c ®Þnh cÊu h×nh cña C2 chóng ta dùa<br /> cã m u v ng da cam víi thuèc thö Dragendof v v o phæ NOESY cña nã, phæ n y cho thÊy cã sù<br /> phæ khèi EI-MS cña H2 cho M+ = 365. §iÒu n y t ¬ng t¸c cña Hc2 ( = 2,50 ppm) víi Hc5 ( =<br /> cho thÊy trong ph©n tö H2 cã mét sè lÎ nguyªn 2,3 ppm) v Hc6 ( = 2,77 ppm). §iÒu n y<br /> tö nit¬. Phæ 13C-NMR cho thÊy cã 23 nguyªn tö<br /> kh¼ng ®Þnh Hc2 ë d¹ng v nh thÕ cÊu h×nh C2<br /> cacbon trong ph©n tö H2 trong ®ã cã 8CH, 5CH2<br /> l cÊu h×nh S. Phæ COSY cña Hc2 cho thÊy t ¬ng<br /> v 3CH3 thÓ hiÖn trong phæ DEPT cña nã, nh<br /> t¸c cña Hc2 víi 2 nguyªn tö hi®ro ë C1 cã J = 2,7<br /> vËy sè nguyªn tö cacbon bËc 4 trong ph©n tö H2<br /> v 3,5 Hz, ®iÒu n y cã nghÜa l Hc2 ë vÞ trÝ<br /> l 7.<br /> equatorial.<br /> Phæ IR cña H2 cho thÊy cã nh©n benzen<br /> C¸c sè liÖu phæ céng h ëng tõ h¹t nh©n cña<br /> trong ph©n tö nªn cã c¸c tÇn sè dao ®éng hãa trÞ<br /> H2 thÓ hiÖn ë b¶ng 2.<br /> 1606,4, 1510,4 v 1463,1 cm-1. Phæ 1H-NMR<br /> cho thÊy cã hai lo¹i nh©n benzen thÕ trong ph©n §iÓm nãng ch¶y v c¸c sè liÖu vÒ phæ IR v<br /> tö H2: lo¹i nh©n benzen thÕ 1,4 thÓ hiÖn ë UV cña H2 trung víi c¸c sè liÖu cña ancaloit<br /> doublet-doublet kiÓu AB ë vïng tr êng thÊp hispidin m Venkatachaham SR v céng sù<br /> 6,98 - 6,98 ppm v 6,71 - 6,71 ppm cã 2H v ph©n lËp tõ c©y Ficus hispida cña Th¸i Lan [4],<br /> 2H, h»ng sè t ¬ng t¸c spin-spin 8,8 v 2,1 Hz nh ng trong c¸c t i liÖu n y ch a cã sè liÖu phæ<br /> nghÜa l t ¬ng t¸c octo-octo v meta-meta, cßn céng h ëng tõ h¹t nh©n 1D v 2D. Nh vËy<br /> <br /> <br /> <br /> 347<br />  B¶ng 2: Sè liÖu 1H v 13<br /> C-NMR cña H2<br /> 13 1<br /> Sè trªn C-NMR H-NMR<br /> khung nhãm C cã<br /> cacbon C, ppm H.ppm Sè hidro §é béi J.Hz<br /> hi®ro<br /> 1 56,2 CH2 2,16 2H dd 2,7; 3,5<br /> 2 61,9 CH 2,50 1H m<br /> 3 55,0 CH2 1,93 2H m<br /> 4 55,6 CH2 1,57 2H m<br /> 5 56,3 CH2 2,53 2H t<br /> 6 68,3 CH2 2,77 2H s<br /> 7 134,2<br /> 8 134,7<br /> 9 133,2<br /> 10 131,0 CH 6,98 dd 8,8; 2,0<br /> 11 114,6 CH 6,71 dd 8,8; 2,0<br /> 12 159,7<br /> 13 114,2 CH 6,71 dd 8,8; 2,0<br /> 14 131,0 CH 6,98 dd 8,8; 2,0<br /> 15 136,0<br /> 16 122,4 CH 6,99 dd 8,8; 2,0<br /> 17 115,2 CH 6,67 d 8,2<br /> 18 149,2<br /> 19 149,7<br /> 20 112,5 CH 6,78 1H d 2,0<br /> 21 56,3 CH3 3,72 3H s<br /> 22 56,2 CH3 2,52 3H s<br /> 23 36,6 CH3 3,76 3H s<br /> <br /> chóng t«i ®5 ph©n lËp ® îc hispidin tõ l¸ c©y th m ng tim ng êi RD v ho¹t tÝnh chèng ung<br /> ng¸i ViÖt Nam v bæ sung c¸c sè liÖu phæ hiÖn th m¹nh nhÊt l cÆn tæng c¸c ancaloit [3].<br /> ®¹i cña nã. Nh ng cÆn tæng ancaloit n y cã 6 lo¹i ancaloit<br /> kh¸c nhau. VËy ancaloit n o cã t¸c dông chèng<br /> 2. Kh¶o s¸t ho¹t tÝnh chèng ung th1 cña<br /> ung th thùc sù l vÊn ®Ò cÇn gi¶i ®¸p, do ®ã<br /> hispidin kh¶o cøu ho¹t tÝnh chèng ung th cña c¸c<br /> Khi kh¶o cøu ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ b o ung ancaloit ph©n lËp ® îc tõ cÆn tæng ancaloit n y<br /> th (ho¹t tÝnh chèng ung th ) in vitro cña cÆn l viÖc l m tÊt yÕu. HiÖn nay, chóng t«i ®5 ph©n<br /> tæng c¸c ancaloit v cÆn cña c¸c phi ancaloit cña lËp ® îc 5 ancaloit cã trong cÆn tæng ancaloit<br /> l¸ c©y ng¸i, chóng t«i thÊy c¶ hai cÆn n y ®Òu cã cña l¸ c©y ng¸i ë d¹ng tinh khiÕt ®Ó kh¶o cøu<br /> ho¹t tÝnh chèng c¸c dßng tÕ b o ung th gan ho¹t tÝnh chèng ung th cña chóng. ë ®©y chóng<br /> ng êi Hep-2, ung th tö cung ng êi FI v ung t«i th«ng b¸o ho¹t tÝnh chèng ung th cña<br /> 348<br /> hispidin ph©n lËp ® îc tõ cÆn tæng ancaloit n y. nghiªn cøu ho¹t tÝnh chèng ung th cña<br /> B»ng c¸ch kh¶o cøu ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ b o hispidin víi c¸c dßng ung th kh¸c nh ung th<br /> ung th in vitro theo ph ¬ng ph¸p hiÖn ®ang ¸p phæi Lu-1, ung th tiÒn liÖt tuyÕn LNCap, ung<br /> dông t¹i ViÖn Nghiªn cøu ung th quèc gia, Hoa th vßm häng KB, ung th ®¹i tr ng Col-1, ung<br /> Kú (NIC) [5]. KÕt qu¶ cho thÊy nång ®é g©y ®éc th vó MEF-7… còng nh nghiªn cøu 5<br /> 50% tÕ b o ung th gan ng êi ancaloit kh¸c ®5 ph©n lËp ® îc tõ l¸ c©y ng¸i<br /> Hep-2 IC50 = 0,0012 µg/ml v ung th m ng tim ®èi víi c¸c dßng ung th trªn m kÕt qu¶ sÏ<br /> ng êi RD IC50 = 0,0023 µg/ml. ® îc c«ng bè trong thêi gian s¾p tíi.<br /> C¸c nång ®é øc chÕ tÕ b o ung th n y cho T%i liÖu tham kh¶o<br /> thÊy hispidin l mét ancaloit chèng ung th rÊt<br /> m¹nh; v× nång ®é chuÈn øc chÕ tÕ b o ung th 1. NguyÔn NghÜa Th×n, NguyÔn ThÞ H¹nh,<br /> cña taxol ph©n lËp tõ c©y th«ng ®á còng biÕn Ng« Trùc Nh . Thùc vËt häc d©n téc, c©y<br /> thiªn tõ 0,012 ®Õn 0,008 µg/ml tuú theo ung thuèc cña ®ång b o Th¸i Con Cu«ng NghÖ<br /> th . NÕu so s¸nh ®éc tÝnh cña hispidin v ®éc An. Nxb. N«ng nghiÖp, Tr. 131 - 132<br /> tÝnh cña cÆn tæng ancaloit cña l¸ c©y ng¸i ®èi (2001).<br /> víi dßng tÕ b o ung th gan ng êi 2. Sergio R. Peragen - Sanduz et. al. Planta<br /> Hep-2 v ung th m ng tim ng êi RD th× Med. 183 - 186 (2002).<br /> c êng ®é ®éc cña hispidin m¹nh gÊp h ng tr¨m<br /> lÇn c êng ®é ®éc cña cÆn tæng ancaloit cña l¸ 3. V¨n Ngäc H íng, Vò Minh Trang. T¹p chÝ<br /> c©y ng¸i ®èi víi Hep-2 v 583 lÇn ®èi víi RD Hãa häc T. 43, sè 3, Tr. 312 - 316 (2005).<br /> l 421 lÇn. §iÒu n y cho thÊy trong cÆn tæng 4. Venkatachalam et al. Naturwissens-<br /> ancaloit cña l¸ ng¸i cßn nhiÒu t¹p chÊt v cã chanften, 69, 287 - 288 (1982).<br /> thÓ trong 6 ancaloit cã trong ®ã còng cã 5. P.A. Vanden Bergher and J. VlintinK<br /> ancaloit kh«ng cã ho¹t tÝnh ®éc ®èi víi Hep-2 Method in Plant Biochemistry, Vol. 6, P.<br /> v RD. KÕt qu¶ n y khuyÕn khÝch chóng t«i 47 - 67 (1991).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 349<br />