Hoàn thiện kỹ thuật tách dna từ các mẫu bệnh phẩm sinh học để xác định đột biến gen BRAF V600E

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu: Hoàn thiện kỹ thuật Realtime-PCR xác định đột biến gen BRAF V600E từ các mẫu bệnh phẩm bao gồm mẫu mô phủ parafin, mẫu mô tươi, mẫu dịch hút tế bào và mẫu máu ở bệnh nhân theo dõi chẩn đoán ung thư tuyến giáp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoàn thiện kỹ thuật tách dna từ các mẫu bệnh phẩm sinh học để xác định đột biến gen BRAF V600E

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 490 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2020 HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TÁCH DNA TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V600E Bùi Thị Lành*, Lê Anh Đức*, Bùi Minh Lý*, Đào Thị Luận* Nguyễn Quang Trung*, Nguyễn Xuân Hậu*, Nguyễn Thị Trang* TÓM TẮT samples were removed parafin by xylene, after that all of samples extracted DNA by Qiagen kit. We analyzed 59 BRAF là gen tổng hợp protein B-raf chịu trách BRAFV600E mutation from 21 patients who had nhiệm kiểm soát hoạt động phát triển và phân chia anatomical diagnosis of papillary thyroid cancer, 21 của nhiều loại tế bào trong cơ thể. Đột biến gen BRAF fresh tissue samples were taken during surgery from làm cho các tế bào bất thường này nhân lên một cách 21 patients with cytologic results monitoring thyroid không kiểm soát và hình thành ung thư. Theo nhiều cancer,22 fluid aspirated samplewere taken from 22 nghiên cứu, đột biến tại codon 600 của exon 15 patients with suspected thyroid cancer who indicated (V600E) là đột biến phổ biến nhất trên gen BRAF. Đột needle aspiration and 16 blood samples were taken biến này là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh ung thư from 16 patients with other benign thyroid diseases trong đó có ung thư tuyến giáp. Mục tiêu: Hoàn according to Realtime -PCR by BRAF V600E kit thiện kỹ thuật Realtime-PCR để xác định đột biến gen (Rusian). Results: The prevalence of BRAF BRAF V600E ở các mẫu bệnh phẩm bao gồm mẫu mô V600Emutation was 52,38% , 19,05%, 4,55% and phủ parafin, mẫu mô tươi, mẫu dịch hút tế bào và 0% fromparaffin-covered tissue sample,fresh tissue mẫu máu của bệnh nhân theo dõi chẩn đoán ung thư sample, fluid aspirated sampleand blood sample tuyến giáp. Đối tượng và phương pháp nghiên espectively. Conclusion: Complete techniques for cứu: 21 mẫu mô phủ parafin, 21 mẫu mô tươi, 22 DNA extraction from biological specimens for mẫu dịch hút tế bào và 16 mẫu máu của bệnh nhân determination mutation V600E of gene BRAF. theo dõi chẩn đoán ung thư tuyến giáp. Sử dụng kỹ Keywords: Thyroid cancer, Realtime-PCR, BRAF thuật Realtime-PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E. V600E từ các mẫu bệnh phẩm kể trên. Kết quả: Tỷ lệ xuất hiện đột biến ở mẫu mô phủ parafin là 52,38%,; I. ĐẶT VẤN ĐỀ mẫu mô tươi là 19,05%, mẫu dịch hút tế bào là 4,55%, mẫu máu là 0%. Kết luận: Hoàn thiện thành Ung thư tuyến giáp (UTTG) biệt hóa là ung công quy trình kỹ thuật Realtime-PCR để xác định đột thư phổ biến nhất của hệ thống nội tiết. Trong biến gen BRAFV600E từ các mẫu bệnh phẩm gồm những thập kỷ gần đây, tỷ lệ mắc loại ung thư mẫu mô phủ parafin, mẫu mô tươi, mẫu dịch hút tế này đã tăng gấp 3 lần [1,2]. Loại mô học phổ bào và mẫu máu ở bệnh nhân theo dõi chẩn đoán ung biến nhất của ung thư tuyến giáp biệt hóa, thư tuyến giáp. chiếm 80% -85% trong tất cả các trường hợp, là Từ khóa: Ung thư tuyến giáp, Realtime-PCR, BRAF V600E. ung thư tuyến giáp dạng nhú (PTC) [3]. PTC có tiên lượng rất tốt và tỷ lệ sống 5 năm cao; tuy SUMMARY nhiên, một số bệnh nhân không đáp ứng với COMPLETE TECHNIQUES FOR DNA điều trị, cuối cùng dẫn đến tử vong. BRAF là một EXTRACTION FROM BIOLOGICAL phần của con đường tín hiệu tế bào MAPK, ngăn SPECIMENS FOR DETERMINATION chặn apoptosis và điều chỉnh sự tăng sinh cũng MUTATION V600E OF GENE BRAF như xâm lấn của khối u [3]. Trong các khuyến Background: BRAF gene is known as a tumor nghị mới nhất của Hiệp hội Tuyến giáp Hoa Kỳ suppressor gene in Thyroid cancer (TC), which plays a role in DNA repair. The mutation in BRAF have been (ATA), sự hiện diện của đột biến BRAF V600E là associated with different types of cancer. The present một trong những yếu tố được tính đến trong study was aimed at studying the association between phân tầng nguy cơ của một nhóm lâm sàng PTC BRAF V600E mutation and TC.Object: Complete the tiên lượng xấu liên quan việc đáp ứng điều trị Realtime-PCR technique to identify the BRAF V600E I131 cũng như khả năng tái phát, di căn ở bệnh gene mutation in patient samples including paraffin- nhân UTTG [4]. Đột biến này còn được biết đến covered tissue samples, fresh tissue samples, fluid aspirate samples and blood samples from patients là một trong những dấu ấn phân tử giúp chẩn following diagnosis of thyroid cancer diagnosis. đoán phát hiện UTTG với độ nhạy và độ đặc Material and method:21 paraffin-covered tissue hiệu tương ứng 80% và 99,7% khi kết hợp với kỹ thuật chẩn đoán tế bào học[5] và hướng tới cá thể hóa điều trị đích trong tương lai.Năm *Trường Đại học Y Hà Nội 2013, Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Trang (FDA) của Hoa Kỳ đã phê chuẩn sorafenib (một Email: trangnguyen@hmu.edu.vn trong các thuốc ức chế BRAF) được phép chỉ Ngày nhận bài: 18.2.2020 Ngày phản biện khoa học: 13.4.2020 định điều trị cho nhóm BN UTTG thể biệt hóa, tái Ngày duyệt bài: 20.4.2020 phát, di căn thất bại với điều trị I131 [6,7]. Do 229
vietnam medical journal n01 - MAY - 2020 vậy kết quả sàng lọc nhằm phát hiện đột biến thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, BRAF V600E có tầm quan trọng, ảnh hưởng đến trung thực và khách quan đã được xác nhận và việc theo dõibệnh nhân cũng như cá thể hóa chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Những thông điều trị. tin của bệnh nhân được giữ bí mật và chỉ phục Mục đích nghiên cứu: Hoàn thiện kỹ thuật vụ công tác nghiên cứu. Realtime-PCR xác định đột biến gen BRAF V600E từ các mẫu bệnh phẩm bao gồm mẫu mô phủ III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU parafin, mẫu mô tươi, mẫu dịch hút tế bào và 3.1 Kết quả tách chiết DNA. Chúng tôi cải mẫu máu ở bệnh nhân theo dõi chẩn đoán ung tiến trong bước loại bỏ parafin của mẫu mô bằng thư tuyến giáp. cách dùng hóa chất là xylen. Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch đạt chuẩn thu được kết quả sau: II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh 2.1 Đối tượng nghiên cứu sạch DNA của 21 mẫu mô phủ parafin • Được chia thành 4 nhóm Nồng độ Nồng độ Độ tinh - Nhóm I: 21 mẫu mô phủ parafin lấy từ 21 DNA DNA (Ng/µl) sạch bệnh nhân đã có kết quả giải phẫu bệnh chẩn Thấp nhất 144,6 1,80 đoán xác định ung thư tuyến giáp dạng nhú. Cao nhất 748,1 2,05 - Nhóm II: 21 mẫu mô tươi được lấy trong Trung bình 338,55±81,75 1,91±0,05 quá trình phẫu thuật từ 21 bệnh nhân có kết quả Nhận xét: Lượng DNA thu được từ các mẫu tế bào học theo dõi ung thư tuyến giáp tương đối cao và ổn định với nồng độ cao nhất - Nhóm III: 22 mẫu dịch hút tế bào lấy từ 22 đạt 748,1 ng/µl, thấp nhất đạt 144,6ng/µl; độ bệnh nhân nghi ngờ ung thư tuyến giáp có chỉ tinh sạch cao nhất là 2,05 thấp nhất là 1,80. định chọc hút tế bào bằng kim nhỏ. Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ và độ tinh - Nhóm IV: 16 mẫu máu lấy từ 16 bệnh nhân sạch DNA của 21 mẫu mô tươi có bệnh tuyến giáp lành tính khác. Nồng độ Nồng độ DNA Độ tinh • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2/2019 đến DNA (Ng/µl) sạch tháng 2 /2020. Thấp nhất 168,9 1,83 • Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm tư vấn di Cao nhất 483,4 2 truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Trung bình 217,3±48,4 1,9±0,06 • Mẫu nghiên cứu: mẫu thuận tiện. Nhận xét: Lượng DNA thu được từ các mẫu 2.2 Phương pháp nghiên cứu tương đối cao và ổn định với nồng độ cao nhất Phương pháp mô tả cắt ngang đạt 483,4 ng/µl, thấp nhất đạt 168,9ng/µl; độ 2.2.1 Tách chiết DNA. Riêng mẫu mô phủ tinh sạch cao nhất là 2, thấp nhất là 1,83. parafin bước đầu tiên sử dụng xylen để loại bỏ Bảng 3.3. Kết quả đo nồng độ và độ tinh parafin, sau đó tất cả các mẫu dùng kit Qiagen sạch DNA của 22 mẫu dịch hút tế bào để tách chiết DNA. Nồng độ Nồng độ Độ tinh 2.2.2 Nhân đoạn gen bằng kỹ thuật DNA DNA (Ng/µl) sạch Realtime-PCR. DNA thu được với độ tinh sạch Thấp nhất 13,6 1,80 đạt chuẩn được pha loãng đạt nồng độ phù hợp Cao nhất 59,8 2,04 sau đókhuếch đại bằng máy CFX96 (BioRad, Trung bình 25,8±11 1,92±0,12 Mỹ)nhằm phát hiện đột biến BRAF V600E. Sự Nhận xét: Lượng DNA thu được từ các mẫu hiện diện của đột biến BRAF V600E được xác tương đối cao và ổn định với nồng độ cao nhất định bằng kỹ thuật Realtime-PCR với chất màu đạt 59,8ng/µl, thấp nhất đạt 13,6 ng/µl; độ tinh huỳnh quang không SYBR Green (Synton, Nga). sạch cao nhất là 2,04, thấp nhất là 1,80. Kích thước sản phẩm PCR là 136 bp. Cặp mồi Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ và độ tinh được sử dụng cho phản ứng PCR (B-raf-51 F và sạch DNA của 16 mẫu máu B-raf-176R) đã được mô tả trước đây [8]. Tóm Nồng độ Nồng độ Độ tinh lại, xét nghiệm PCR được thực hiện trên máy DNA DNA(Ng/µl) sạch CFX96 (Biorad, Mỹ) định lượng tương đối ddCT Thấp nhất 45,6 1,83 thời gian thực với việc sử dụng các mồi dò BRAF- Cao nhất 135,3 1,97 đột biến FAM-TAGCTACAGAGAAATC và BRAF- Trung bình 50,1±4,5 1,93±0,04 alen bình thường-HEX- CCTAGCTACAGTGAAATC Nhận xét: Lượng DNA thu được từ các mẫu với chu trình luân nhiệt: 95oC - 3 phút, 40 chu kì tương đối cao và ổn định với nồng độ cao nhất (95oC-15s, 63oC-40s). đạt 135,3ng/µl, thấp nhất đạt 46,5ng/µl; độ tinh 2.3 Đạo đức nghiên cứu. Các số liệu và sạch cao nhất là 1,97 thấp nhất là 1,83. 230
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 490 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2020 3.2 Kết quả pha loãng DNA. Nồng độ DNA Bảng 3.5: Kết quả REALTIME – PCR thu được cao nhất ở hai nhóm mẫu mô phủ Kiểu Kit REALTIME-PCR parafin và mẫu mô tươi (144,6-748,1ng/µl), thấp gen nhất ở nhóm mẫu dịch hút tế bào(13,6- 59,8ng/µl). Khi tiến hành PCR, kết quả mẫu ức chế khi nồng độ DNA >200ng/µl Bình Nồng độ DNA >200ng/µl thư ờng Dị hợp tử đột biến Ghi chú: - Hex (xanh lá cây): Alen bình thường Hình 3.1: Hình ảnh kết quả mẫu ức chế - Fam (xanh nước biển): Alen đột biến Nồng độ 100-200ng/µ Nhận xét: Hình ảnh sau khi chạy bằng kỹ thuật REALTIME -PCR cho kết quả rõ nét, đảm bảo yêu cầu, dù đã cải tiến ở bước xử lý mẫu mô và tách chiết DNA. 3.3. Xác địnhđột biến gen BRAF V600Ebằng kĩ thuật Realtime - PCR Bảng 3.6. Kết quả xác định đột biến gen bằng kỹ thuật Realtime -PCR Loại Mẫu Mẫu Mẫu mẫu mô Mẫu mô dịch phủ máu tươi hút tế parafin (N) (N) bào(N) Kết quả (N) Có đột biến 11 4 1 0 Hình 3.2. Hình ảnh kết quả nhiễu khi nồng Không có 10 17 21 16 độ DNA cao. đột biến Nồng độ A nhận thấy 21 mẫu mô phủ parafin có 11 trường hợp có đột biến (chiếm 52,38%); 21 mẫu mô tươi có 4 trường hợp có đột biến (chiếm 19,05%); 22 mẫu dịch hút tế bào có 1 trường hợp có đột biến (chiếm 4,55%); 16 mẫu máu không có trường hợp nào có đột biến. IV. BÀN LUẬN 4.1. Loại bỏ parafin bằng xylen sau đó tách chiết DNA bằng bộ kit Quiagen cải tiến. Tách chiết DNA là công đoạn rất quan trọng trong hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử. Để các phản ứng tiếp theo được tối ưu và chính xác, Hình 3.3. Hình ảnh kết quả sau khi pha mẫu DNA cần đảm bảo đủ nồng độ, độ tinh loãng ở nồng độ thích hợp. sạch, không bị đứt gãy trong quá trình tách 3.3 Kết quả REALTIME – PCR chiết. Do các mẫu mô đã được xử lý bằng 231
vietnam medical journal n01 - MAY - 2020 formalin và bọc trong parafin nên việc làm sạch Chúng tôi hi vọng rằng những kỹ thuật này sẽ parafin trước khi tách DNA là vô cùng quan được kiểm chứng trên cỡ mẫu lớn hơn để có độ trọng. Nó ảnh hưởng lớn tới độ tinh sạch của chính xác cao hơn trước khi ứng dụng trong lâm DNA. Nghiên cứu sử dụng xylen là hóa chất dễ sàng chẩn đoán và điều trị ung thư tuyến giáp. tìm, giá thành phù hợp để loại bỏ parafin, sau đó tách DNA bằng kit Quiagen giúp tiết kiệm tối đa V. KẾT LUẬN lượng hóa chất tách chiết cần thiết, góp phần - Hoàn thiện thành công kỹ thuật Realtime- giẩm giá thành dịch vụ. Kết quả thu được vẫn PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E từ 4 đảm bảo nồng độ DNA với độ OD đạt tiêu loại mẫu bệnh phẩm: mẫu mô phủ parafin, mẫu chuẩn, cho phép tiến hành Realtime-PCR. mô tươi, mẫu dịch hút tế bào, mẫu máu ở bệnh 4.2. Pha loãng nồng độ DNA nhân theo dõi chẩn đoán ung thư tuyến giáp Trong 4 loại mẫu: mẫu mô phủ parafin, mẫu dạng nhú. mô tươi, mẫu dịch hút tế bào và mẫu máu nồng - Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen ở mẫu máu là độ DNA thu được cao nhất ở nhóm mẫu mô phủ 0%; ở mẫu mô phủ parafin là 52,38%, ở mẫu mô parafin(748,1ng/µl), thấp nhất ở nhóm mẫu dịch tươi là 19,05%, ở mẫu dịch hút tế bào là 4,55%. hút tế bào(13,6 ng/µl), ổn định nhất ở nhóm Nhóm mẫu mô phủ parafin là nhóm bệnh nhân mẫu máu(với độ lệch chuẩn 50,1±4,5 ng/µl). đã có chẩn đoán xác định ung thư tuyến giáp Nồng độ DNA cao sẽ ức chế phản ứng. Sau dạng nhú trong đó 7/11(63,63%) trường hợp khi thu được DNA chúng tôi tiến hành pha loãng phát hiện đột biến có tình trạng di căn hạch, để nồng độ DNA thu được dưới 100 ng/µl trước 2/11(18,18%) trường hợp tái phát sau 1 năm. khi tiến hành PCR. Chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ DNA trong khoảng 20-50 ng/µl cho hình TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen AY, Jemal A, Ward EM. Increasing incidence ảnh kết quả Realtime-PCR đẹp, ổn định nhất. of differentiated thyroid cancer in the United States, 4.3. Kết quả xác định kiểu gen đột biến 1988–2005. Cancer. 2009; 115(16): 3801–7. bằng phương pháp Realtime– PCR 2. Li N, Du XL, Reitzel LR, Xu L, Sturgis Ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú (PTC) EM. Impact of enhanced detection on the increase in thyroid cancer incidence in the United States: chiếm 80%-90% ung thư tuyến giáp và là ung review of incidence trends by socioeconomic status thư có tiên lượng tốt [3,4]. Mặc dù được xem là within the surveillance, epidemiology, and end có tiên lượng tốt song tỷ lệ di căn hạch chiếm results registry, 1980–2008. Thyroid: official 50% và di căn xa chiếm 10% [5]. Tỷ lệ mắc journal of the American Thyroid Association. ung thư tuyến giáp tăng nhanh ở cả nữ giới và 2013;23(1):103–10. 3. Nikiforov YE, Nikiforova MN. Molecular nam giới [6]. Do đó các phương pháp chẩn đoán genetics and diagnosis of thyroid cancer. Nature cũng như điều trị mới nên được nghiên cứu và reviews Endocrinology. 2011;7(10):569–80. phát hiện. BRAF được biết đến như một gen tiền 4. Kowalska A, Walczyk A, Kowalik A et al ung thư, hoạt động như serine/threonin kinase (2017), “Response to therapy of papillary thyroid kích hoạt con đường truyền tín hiệu nội bào cancer of known BRAF status”, Clinical Endocrinology, 87(1). MAPK [7]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh 5. Pacini F, Castagna MG, Brilli L et al (2008), rằng đột biến V600E nằm trong vùng kích hoạt “Differentiated thyroid cancer: European Society BRAF(CR3) làm tăng cường kích hoạt con đường for Medical Ocology clinical recommendation for MAPK một cách liên tục, thúc đẩy các dòng tế diagnosis, treament and follow-up”, Annals of Oncology, (19), pp. 99 - 101. bào ung thư phát triển. Phát hiện đột biến gen 6. Brose MS. Nutting CM, Sherman et al. BRAF V600E là yêu cầu được đặt ra nhằm phục Rationale and design of DICISION: a doubleblind, vụ nhu cầu chẩn đoán và điều trị ung thư tuyến randomized, placebo-controlled phase III trial giáp cũng như nhiều loại ung thư khác liên quan evaluating the efficacy and safety of sorafenib in đến đột biến này. patients with locally advanced or metastatic radioactive iodine (RAI)-refractory, differentiated Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành tìm đột thyroid cancer. BMC Cancer. 2011, 11, 349. biến trên 4 loại mẫu: mẫu mô phủ parafin, mẫu 7. Ye X, Zhu Y, Cai J. Relationship between mô tươi, mẫu dịch hút tế bào và mẫu máu. Kết toxicities and clinical benefits of newly approved quả phát hiện đột biến ghi nhận 11 trường hợp tyrosine kinase inhibitors in thyroid cancer: A mang đột biến trong 21 mẫu mô phủ parafin meta-analysis of literature. J Cancer Res Ther. 2015, 11, Suppl 2, pp.185-190. (chiếm tỷ lệ 52,38%), 4 trường hợp mang đột 8. Benlloch S, Paya A, Alenda C, et al. Detection biến trong 21 mẫu mô tươi (chiếm tỷ lệ 19,05%), of BRAF V600E mutation in colorectal cancer: 1 trường hợp mang đột biến trong 22 mẫu dịch comparison of automatic sequencing and real-time hút tế bào (chiếm 4,55%) và không có trường chemistry methodology. J Mol Diagn 2006; 8(5): 540–543. hợp nào mang đột biến trong 16 mẫu máu. 232