Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan A bất hoại quy mô 100.000 liều / năm

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:156

Thêm vào BST

Báo xấu

134
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo luận văn - đề án 'hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan a bất hoại quy mô 100.000 liều / năm', luận văn - báo cáo, báo cáo khoa học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan A bất hoại quy mô 100.000 liều / năm

bé khoa häc vµ c«ng nghÖ Bé y tÕ ch−¬ng tr×nh khoa häc vµ c«ng nghÖ phôc vô ch¨m sãc vµ b¶o vÖ søc kháe céng ®ång b¸o c¸o tãm t¾t dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm cÊp nhµ n−íc hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t qui m« 100.000 liÒu/n¨m m∙ sè KC.10-DA12 5972 10/8/2006 Hµ néi – 2004
dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm cÊp nhµ n−íc kc.10 – da12 hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t qui m« 100.000 liÒu/n¨m Chñ nhiÖm dù ¸n : GS.TSKH NguyÔn Thu V©n C¸c c¸n bé tham gia TS.NguyÔn TuyÕt Nga CNSH.Vò Hång Nga CN.Lª Hoµng Long TS.§ç TuÊn §¹t TS.§ç Thñy Ng©n TS.NguyÔn QuÕ Anh PGS.TS.§oµn Huy HËu PGS.TS.Hå B¸ Do BS.§inh Hång D−¬ng C¸c c¬ quan tham gia C«ng ty v¾c xin vµ sinh phÈm sè 1 - ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ Trung −¬ng Trung t©m Quèc gia KiÓm ®Þnh v¾c xin vµ c¸c chÕ phÈm sinh häc Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt v¾c xin Sabin Bé m«n DÞch tÔ - Häc viÖn Qu©n y
c¸c ch÷ viÕt t¾t ADN Desoxyribonucleic acid (axÝt desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axÝt ribonucleic) ALT Alanin transferaza AST Asparagin Transferaza CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng- Mü) cADN Complementary ADN (ADN bæ sung) §¦MD §¸p øng miÔn dÞch ED50 Effective dose 50 (LiÒu g©y miÔn dÞch 50%) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thö nghiÖm miÔn dÞch g¾n enzym) ELU ELISA Unit (§¬n vÞ ELISA) GMT Geometric mean titer (hiÖu gi¸ trung b×nh nh©n) HAV Hepatitis A Virus (Virót viªm gan A) HLA kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu ng−êi HT HuyÕt thanh IFNβ interferon-β IFNγ interferon-γ IFNα interferon-α
kD kilodalton (kil«dalton) LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle mIU mili International unit (mili ®¬n vÞ quèc tÕ) µg mcg M Mol MSV Master seed virus (Chñng gèc gièng) NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( KÝch cì giíi h¹n träng l−îng ph©n tö ) nm nanomet NCR Non coding region (Vïng kh«ng m· hãa) ORF Open reading frame (khung ®äc më) PCR Polymerase chain reaction (ph¶n øng chuçi polymeraza) PFU Plaque Forming Unit (§¬n vÞ t¹o ®¸m ho¹i tö) PMMK Primary Monkey Kidney Cell (TÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t) rpm round per minute (Vßng/phót) SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (®iÖn di trªn gel polyacrylamid) TCYTTG Tæ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi
TCID 50 Tissue Culture Infectious Dose 50 (LiÒu g©y nhiÔm 50% tÕ bµo) VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1 VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng VX V¾cxin WSV Working seed virus ( Chñng s¶n xuÊt)
môc lôc §Æt vÊn ®Ò 1 CH¦¥NG 1 : VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p 2 1.1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t 2 1.2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t 3 1. 2.1. An toµn chung ................................................................................. 3 1. 2.2. KiÓm tra v« khuÈn .................................................................... 3 1.2.3. KiÓm tra chÊt g©y sèt ........................................................................ 3 1.2.4. KiÓm tra chÊt hÊp phô Al(OH)3.......................................................... 4 1.2.5. KiÓm tra hµm l−îng Formaldehyt .................................................... 4 1.2.6. KiÓm tra hµm l−îng protein toµn phÇn ............................................ 4 1.2.7. KiÓm tra c«ng hiÖu .......................................................................... 4 1.3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t trªn thùc ®Þa l©m sµng 5 1.3.1. §èi t−îng nghiªn cøu………………………………………………. 5 1.3.2. VËt liÖu nghiªn cøu………………………………………………… 5 1.3.3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu…………………………………………… 5 CH¦¥NG 2: KÕt qu¶ vµ bµn luËn 8 2.1. Hoµn thiÖn qui tr×nh s¶n xuÊt v¾c xin viªm gan A bÊt ho¹t 8 2.1.1 HiÖu gi¸ vi rót viªm gan A trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy…………………8 2.1.2. HiÖu gi¸ vi rót viªm gan A trong qu¸ tr×nh tinh khiÕt virót ………...8 2.1.3 Hµm l−îng Protein toµn phÇn ……………......................................... 8 2.1.4. Thö nghiÖm bÊt ho¹t…………………………………………………9 2.1.5. Pha chÕ v¾c xin vµ ®ãng èng………………………………………...9 2.2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t 10
2. 2.1. X©y dùng tiªu chuÈn vÒ thµnh phÇn ho¸ häc…………………….. 10 2.2.2. X©y dùng vÒ c¸c chØ sè sinh häc…………………………………...11 2.3. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t trªn thùc ®Þa l©m sµng 13 2.3.1. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn cña v¾c xin viªm gan A trªn c¸c ®èi t−îng……………………………………………………………………… 13 2.3.2. KÕt qu¶ ®¸p øng miÔn dÞch sau tiªm VX ë nhãm ®èi t−îng cã anti-HAV (-)……………………………………………………………… 14 2.3.3. KÕt qu¶ ®¸p øng miÔn dÞch sau tiªm VX ë nhãm ®èi t−îng cã anti-HAV (+)…………………………………………………………….. 18 KÕt luËn 20 KiÕn nghÞ 22 Tµi liÖu tham kh¶o 23
®Æt vÊn ®Ò Virót viªm gan A (HAV) lµ rÊt phæ biÕn ë tÊt c¶ c¸c n−íc khu vùc T©y Th¸i B×nh D−¬ng vµ §«ng Nam ¸. §iÒu kiÖn vÖ sinh kÐm ®· lµm l©y lan HAV ë nh÷ng vïng dÞch l−u hµnh cao. Møc ®é l−u hµnh cña HAV trong céng ®ång lµ cùc kú cao. C¸c nghiªn cøu huyÕt thanh-dÞch tÔ häc ë Bangladesh, Bhutan, India, Maldive vµ Nepal chøng minh r»ng 85-95% trÎ em ë 10 tuæi ®· cã miÔn dÞch víi HAV. ChØ cã mét sè Ýt trÎ bÞ nhiÔm ph¸t triÓn thµnh c¸c tr−êng hîp nhiÔm trïng cã triÖu chøng. Nghiªn cøu c¨n nguyªn c¸c tr−êng hîp viªm gan r¶i r¸c ë c¸c n−íc nµy chøng minh r»ng nhiÔm HAV chÞu tr¸ch nhiÖm tíi kho¶ng 10-25% tÊt c¶ c¸c tr−êng hîp viªm gan ë trÎ em, trong khi nhiÔm ë ng−êi lín th−êng chØ lµ 1-5%. DÞch viªm gan A th−êng xÈy ra ë c¸c thµnh phè cã liªn quan ®Õn viÖc sö dông nguån n−íc uèng vµ thùc phÈm kh«ng an toµn. KÕt qu¶ nghiªn cøu huyÕt thanh-dÞch tÔ häc ë Indonesia vµ Th¸i Lan cho thÊy huyÕt thanh d−¬ng tÝnh ë trÎ em gi¶m xuèng trong n¨m 1994- 1995 (30-35%) so víi kÕt qu¶ nghiªn cøu ®· tiÕn hµnh vµo n¨m 1977-1978 (85-90%) ë trÎ em tuæi tõ 7-12 tuæi. §©y cã thÓ lµ kÕt qu¶ c¶i thiÖn tiªu chuÈn vÖ sinh, lµm s¹ch m«i tr−êng, thiÕt bÞ n−íc uèng vµ còng do gi¶m m¹nh sù l−u hµnh cña HAV. ë ViÖt nam nhiÒu nghiªn cøu vÒ HAV còng ®· ®−îc tiÕn hµnh vµ cho thÊy HAV lµ nguyªn nh©n chñ yÕu c¸c tr−êng hîp viªm gan cÊp tÝnh (29%), 59% trong sè ®ã cã ®é tuæi > 20 tuæi. Nh÷ng nghiªn cøu kh¸c cho thÊy 90% d©n ë n«ng th«n cã anti-HAV (IgG) thuéc tuæi thanh niªn. T×nh h×nh dÞch tÔ häc HAV ®ang thay ®æi ë nhiÒu n−íc. Víi viÖc t¨ng c−êng tiªu chuÈn vÖ sinh ë nhiÒu n−íc tû lÖ nhiÔm HAV ë trÎ nhá ®· gi¶m ®i nhiÒu, thËm trÝ c¶ ë nh÷ng n−íc vµ vïng cã dÞch l−u hµnh cao, song c¸c 1
æ dÞch thÊp ®ang xuÊt hiÖn. Do ®ã ë nhiÒu n−íc ®ang chuÈn bÞ ph¶i ®ãn nhËn c¸c tr−êng hîp viªm gan A l©m sµng ngµy cµng t¨ng ë nh÷ng trÎ lín h¬n vµ ng−êi lín. MÆc dï ®· cã v¾cxin tèt, song gi¸ thµnh rÊt ®¾t vµ v× vËy kh«ng cã kh¶ n¨ng tiªm ®¹i trµ ®−îc. C¸c sinh phÈm chÈn ®o¸n viªm gan A hiÖn nay còng rÊt ®¾t do ®ã còng h¹n chÕ viÖc sö dông ®Ó thö nghiÖm tr−íc khi tiªm phßng. §Ò tµi KHCN 11-10 ®· nghiÖm thu xuÊt s¾c, nghiªn cøu x©y dùng ®−îc c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t tõ nu«i cÊy tÕ bµo thËn khØ PMMK, ®¶m b¶o yªu cÇu tèi thiÓu cña TCYTTG vÒ lo¹i v¾cxin nµy. HiÖn nay, tiªu chuÈn ViÖt nam ®Ò ra cho lo¹i v¾cxin nµy vÉn ch−a ®−îc dù th¶o. Nghiªn cøu hoµn thiÖn quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A trªn nu«i cÊy tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t PMMK cã nguån cung cÊp dåi dµo trong n−íc nh»m gi¶m gi¸ thµnh cña v¾cxin lµ yªu cÇu cÊp thiÕt ®−îc ®Æt ra. MÆt kh¸c hiÖn nay liÒu tiªm vµ lÞch tiªm rÊt kh¸c nhau gi÷a c¸c v¾cxin viªm gan A ®−îc sö dông còng nh− sù cÇn thiÕt cña liÒu tiªm nh¾c l¹i vÉn ®ang lµ vÊn ®Ò cÇn nghiªn cøu. XuÊt ph¸t tõ nh÷ng yªu cÇu cÊp thiÕt ®ã, dù ¸n “ Hoµn thiÖn quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t quy m« 100.000 liÒu/n¨m” cã môc tiªu nh− sau: 1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t ë qui m« 100.000 liÒu/n¨m ®¹t tiªu chuÈn quèc tÕ. 2. X©y dùng tiªu chuÈn ViÖt nam cho v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t. 3. §¸nh gi¸ hiÖu lùc cña v¾cxin trªn thùc ®Þa l©m sµng, x¸c ®Þnh lÞch tiªm vµ liÒu tiªm phï hîp. Víi nh÷ng môc tiªu ®ã, Dù ¸n cã néi dung chÝnh nh− sau : 2
1.Hoµn thiÖn qui tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t tõ nu«i cÊy tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t Maccaca mulatta : bæ sung trang thiÕt bÞ cÇn thiÕt ®Ó më réng s¶n xuÊt; nghiªn cøu vµ x©y dùng ®−îc c¸c th«ng sè hãa, lý, sinh häc tèi −u; c¶i tiÕn mét sè c«ng ®o¹n trong quy tr×nh s¶n xuÊt ®Ó n©ng cao c«ng suÊt 2. X©y dùng tiªu chuÈn quèc gia thÝch hîp cho v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t vÒ c¸c thµnh phÇn ho¸ häc (protein, formaldehyt, hydroxyt nh«m, pH), an toµn, c«ng hiÖu, v« khuÈn, chÝ nhiÖt tè. Nghiªn cøu tÝnh æn ®Þnh vÒ chÊt l−îng vµ c¸c thµnh phÇn cña c¸c lo¹t v¾cxin viªm gan A do ViÖt nam s¶n xuÊt so s¸nh víi tiªu chuÈn cña TTYTTG. 3. §¸nh gi¸ hiÖu lùc cña v¾cxin viªm gan A trªn thùc ®Þa l©m sµng giai ®o¹n III, theo dâi tÝnh an toµn, ph¶n øng phô, ®¸p øng miÔn dÞch trªn nhãm ng−êi t×nh nguyÖn, ®¸nh gi¸ hiÖu lùc cña v¾cxin viªm gan A víi cì mÉu n = 300. X¸c ®Þnh liÒu tiªm vµ lÞch tiªm phï hîp cho c¸c ®èi t−îng kh¸c nhau. 3
Ch−¬ng 1 Tæng quan 1. Nh÷ng hiÓu biÕt hiÖn nay vÒ virót viªm gan A 1.1. LÞch sö virót viªm gan A Héi chøng vµng da ®· ®−îc m« t¶ trong lÞch sö tõ thÕ kû thø 8. Tuy nhiªn ®Õn tËn thÕ kû 17, 18 vµ 19 nh÷ng vô dÞch vµng da lín ®· ®−îc m« t¶ ®Çy ®ñ h¬n. N¨m 1947, Mac Callum ®· ®−a ra côm tõ viªm gan A vµ viªm gan B ®Ó ph©n biÖt c¸c lo¹i viªm gan virót. Nh÷ng côm tõ nµy ®· ®−îc Uû ban Viªm gan virót cña Tæ chøc y tÕ thÕ giíi c«ng nhËn. Virót viªm gan A ®−îc x¸c ®Þnh lÇn ®Çu tiªn b»ng kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö n¨m 1973 nhê Feinstone. N¨m 1979 Provost vµ Hilleman ®· thµnh c«ng trong nu«i cÊy virót viªm gan A trªn tÕ bµo, më ®Çu cho nh÷ng nghiªn cøu ph¸t triÓn v¾cxin. 1.2. §Æc ®iÓm virót viªm gan A Nh÷ng nghiªn cøu tiÕp sau nµy ®· x¸c ®Þnh ®−îc HAV lµ mét virót picorna. H¹t virót h×nh cÇu nhá kh«ng cã vá cã ®−êng kÝnh kho¶ng 27-32 nm, tèc ®é l¾ng 156 -160S, vµ c¸c b¨ng xung quanh 1.33 -1,34 g/cm3 trong CsCl. Gen«m lµ sîi ®¬n ARN th¼ng dµi 7,5 kb víi cùc nhËn biÕt th«ng tin ë ®Çu 5’ vµ ®Çu 3’ lµ mét chuçi poly (A). Gièng nh− tÊt c¶ c¸c virót picorna kh¸c, genom HAV cã thÓ chia thµnh 3 phÇn : (a) ®Çu 5’ kh«ng m· hãa (NCR) chiÕm kho¶ng 10% genom vµ nèi víi protein virót VPg ; (b) mét khung ®äc më m· hãa cho tÊt c¶ c¸c protein 4
virót bao gåm P1 cho protein capsit vµ P2,P3 cho protein kh«ng cÊu tróc ; (c) ®Çu 3’ ng¾n kh«ng m· hãa (NCR). §Çu 5’ NCR lµ vïng æn ®Þnh nhÊt cña genom HAV (h¬n 89% nucleotit gièng nhau trong 7 chñng ®¹i diÖn cho genotýp I,II,III. §ét biÕn vïng 5’ NCR lµm t¨ng kh¶ n¨ng thÝch øng cña HAV trong nu«i cÊy tÕ bµo nh−ng kh«ng ®ãng vai trß quan träng trong kh¶ n¨ng g©y bÖnh cña virót. §Çu 3’ NCR cã tû lÖ kh¸c biÖt cao gi÷a c¸c chñng HAV vµ ®ét biÕn (20%). T¸c ®éng cña vïng 3’ vµ 5’ trong tæng hîp ARN cña picorna virut ch−a ®−îc hiÓu biÕt ®Çy ®ñ nh−ng ®ãng vai trß quan träng. Ba protªin cÊu tróc, VP1 - VP3, s¾p xÕp theo kÝch th−íc tõ 24 ®Õn 33 kD ®−îc sao chÐp tõ tr×nh tù axit nucleic cña virót, vµ t−¬ng tù gi÷a tæ chøc genom cña HAV vµ c¸c picornavirót ®· biÕt kh¸c, song ch−a bao giê x¸c ®Þnh ®−îc ë viri«n. Ba polypeptit capsit chÝnh ®· ®−îc x¸c ®inh bao gåm : VP1 (30-33 kD), VP2 (24-27 kD), VP3 (23-29 kD). Träng l−îng ph©n tö chÝnh x¸c cña polypeptit nhá (VP4) vÉn ch−a ®−îc x¸c ®Þnh. Vïng quyÕt ®Þnh nguyªn cña protein capsit cã thÓ rÊt bÒn v÷ng trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy l©u dµi. MÆc dï qu¸ tr×nh chÕ biÕn sau phiªn dÞch vµ sè phËn cuèi cïng cña ®Çu kÕt thóc amino cña polyprotªin biÓu thÞ vÉn ch−a ®−îc x¸c ®Þnh râ rµng, mét ®o¹n tÝn hiÖu cho qóa tr×nh myrin ho¸ ë vÞ trÝ axit amin thø b¶y sau Methionin thø nhÊt víi mét vïng VP4 ng¾n gi¶ thiÕt r»ng kh¶ n¨ng cã mét ®Çu dÉn peptit t¾t (L). VP1 lµ mét protein cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng bÒ mÆt chÝnh trong picornavirut. X¸c ®Þnh tr×nh tù dùa trªn vïng VP1/2A ph©n lo¹i ®−îc 7 genotýp kh¸c nhau. Bèn trong sè c¸c genotýp ®ã cã liªn quan ®Õn kh¶ n¨ng g©y bÖnh cho ng−êi (I,II,III vµ VII). Genotýp I vµ III ®−îc t×m thÊy phæ biÕn trong c¸c nghiªn cøu trong khi genotýp II vµ VII mçi lo¹i chØ ®−îc ®¹i diÖn b»ng mét chñng ph©n lËp. So s¸nh b»ng vïng VP1 cho thÊy 23,7 % biÕn ®æi ë møc ®é nucleotit vµ 10,5% biÕn ®æi ë møc ®é axit amin gi÷a c¸c 5
chñng ph©n lËp ®−îc. Nghiªn cøu cña Mauro Costa –Mattioli vµ céng sù ®· t×m thÊy ®ét biÕn trong vïng VP1 víi sù biÕn mÊt cña 15 axit amin cho thÊy kh¶ n¨ng cña ®ét biÕn trèn tho¸t kh¸ng thÓ trung hßa. Mét nghiªn cøu kh¸c t×m thÊy ®ét biÕn cña vïng VP1 víi sù biÕn mÊt cña 18 nucleotit cña chñng HAV thÝch øng trong nu«i cÊy tÕ bµo. Vïng gen m· hãa cho 2A cña picornavirut ®¹i diÖn cho vïng hay thay ®æi nhÊt trong genom. Trong khi 2A cã chøc n¨ng proteolytic trong entero vµ rhinovirut th× ë c¸c virót kh¸c kh«ng t×m thÊy tr×nh tù kiÓu proteaza hoÆc ho¹t tÝnh catalytic. CÊu tróc gen vïng 2A vµ kÝch th−íc vÉn cßn ch−a ®−îc x¸c ®Þnh râ. Mét vµi nghiªn cøu ®· chØ ra r»ng kÝch th−íc cña 2A vµ 2B kh«ng gièng nh− pháng ®o¸n ban ®Çu. ViÖc xãa bá 10 ®Õn 15 axit amin trong protein 2A chØ cã mét t¸c ®éng rÊt nhá trong nu«i cÊy HAV trªn tÕ bµo vµ gan khØ ®u«i sãc. MÆc dï ®ét biÕn vïng P2 (protein 2C vµ 2B) cÇn thiÕt cho kh¶ n¨ng thÝch øng cña chñng HM175 vµ c¸c chñng HAV kh¸c trong nu«i cÊy tÕ bµo, ®ét biÕn cña vïng 5’ kh«ng dÞch m· còng cã vai trß quan träng . H×nh 1 : H×nh ¶nh virót viªm gan A d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö 6
HAV v−ît xa poliovirót vÒ æn tÝnh ®Þnh nhiÖt hoµn toµn ë 20oC , sèng sãt do nhiÖt tíi 60oC trong mét thêi gian dµi. Sù æn ®Þnh nhiÖt nµy cho thÊy cã sù kh¸c biÖt ®¸ng kÓ trong h×nh ¶nh cÊu tróc capsit cña HAV mµ vÉn ch−a x¸c ®Þnh ®−îc. Gièng nh− c¸c enterovirót vµ cardiovirut, h¹t HAV tinh khiÕt bÒn v÷ng víi axÝt. HAV tinh khiÕt bÒn v÷ng h¬n HAV kh«ng tinh khiÕt, gi÷ ®−îc tÝnh g©y nhiÔm trªn 8 giê. HAV bÒn v÷ng víi nhiÖt ®é 60˚C ë pH trung tÝnh trong Ýt nhÊt 60 phót. Virót chØ bÊt ho¹t mét phÇn sau 10 ®Õn 12 giê kh¸c víi c¸c picornavirut kh«ng bÒn v÷ng ë 56˚C. Ho¹t tÝnh g©y nhiÔm cã thÓ duy tr× Ýt nhÊt 1 th¸ng sau khi ®«ng kh« vµ b¶o qu¶n ë 25˚C víi 42% ®é Èm hoÆc nhiÒu n¨m ë nhiÖt ®é -20˚C hoÆc thÊp h¬n. HAV kh«ng bÞ bÊt ho¹t bëi chloramin T (1g/l trong 15 phót ë 20˚C) hoÆc perchloracetic axit. HAV bÞ bÊt ho¹t nhê sÊy −ít (121˚C trong 20 phót), tia cùc tÝm hoÆc formalin (1 :4000 trong 72 giê ë 37˚C). Cuèi cïng th× qu¸ tr×nh sao chÐp cña HAV trong tÕ bµo hoµn toµn kh«ng gièng nh− phÇn lín c¸c picornavirót ®· ®−îc biÕt râ ®Æc tÝnh kh¸c. ThËm trÝ ë ®iÒu kiÖn tèi −u th× chu tr×nh sao chÐp cña HAV ®−îc thùc hiÖn vµ kÐo dµi trªn 24 ®Õn 48 giê. Sù sao chÐp cã liªn quan ®Õn hñy ho¹i tÕ bµo hiÕm khi gÆp trõ khi c¸c chñng virót kh¸c nhau ph¶i ®−îc chän läc mét c¸ch thËn träng, ë mét vµi hÖ tÕ bµo, vµ víi ®iÒu kiÖn nu«i cÊy ®−îc x¸c ®Þnh chÆt chÏ . Kh«ng cã sù lµm suy sôp sinh tæng hîp ®¹i ph©n tö ë tÕ bµo chñ. Nh×n chung mét nhiÔm trïng dai d¼ng ®· ®−îc x¸c ®Þnh vµ virót tiÒn gen cßn l¹i mét l−îng lín trong tÕ bµo.Trong mét vµi tr−êng hîp cã thÓ cÇn tíi 2 ®Õn 3 tuÇn nu«i cÊy ®Ó ®¹t ®−îc hµm l−îng virót thËm trÝ 100 ®Õn 10.000 lÇn thÊp h¬n, thÝ dô, hµm l−îng poliovirót trong cïng ®iÒu kiÖn nu«i cÊy tÕ bµo ®Æc hiÖu. §Æc ®iÓm nh©n lªn cña virót viªm gan A lµ mét trë ng¹i lín trong viÖc s¶n xuÊt vµ më réng qui m« sö dông v¾cxin viªm gan A. ViÖc nu«i cÊy HAV rÊt khã ®¹t ®−îc hiÖu suÊt cao hoÆc kh«ng t¹o ra hñy ho¹i tÕ bµo ®Ó 7
cã thÓ quan s¸t ®−îc. B»ng c¸ch sö dông kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang Provost ®· x¸c ®Þnh ®−îc HAV cÊy truyÒn 31 lÇn trªn khØ ®u«i sãc cã thÓ nu«i cÊy ®−îc trªn tÕ bµo. Kh¸ng nguyªn virót phÇn lín lµ protein néi bµo. Thêi gian ®Ó cã ®−îc l−îng kh¸ng nguyªn HAV tèi ®a trong nu«i cÊy tÕ bµo cã thÓ gi¶m sau khi cÊy truyÒn liªn tiÕp. NhiÒu dßng tÕ bµo tiªn ph¸t vµ tÕ bµo th−êng trùc cña ®éng vËt linh tr−ëng thÝch hîp cho viÖc nu«i cÊy HAV, mÆc dï kÕt qu¶ nu«i cÊy phô thuéc vµo chñng virót, lo¹i tÕ bµo vµ nhiÖt ®é. Dßng tÕ bµo c¶m nhiÔm víi HAV bao gåm tÕ bµo thËn khØ xanh ch©u Phi tiªn ph¸t vµ thø ph¸t, tÕ bµo thËn khØ cynomologus s¬ sinh, tÕ bµo thËn khØ Rhesus bµo thai (FRhK-4), tÕ bµo thËn khØ cercopithecus, tÕ bµo gan Alexander, tÕ bµo mµng èi FL, vµ tÕ bµo l−ìng béi bµo thai ng−êi (WI- 38 vµ MRC-5). TÕ bµo thËn khØ xanh ch©u Phi tiªn ph¸t (AGMK), tÕ bµo nguyªn bµo sîi cña ng−êi vµ dßng tÕ bµo phæi l−ìng béi ng−êi (MRC5) th−êng ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A. HiÖu gi¸ cña HAV trong nu«i cÊy tÕ bµo cã thÓ tõ 103 ®Õn 109 TCID50/ml. Thêi gian ®Ó cã ®−îc hiÖu gi¸ virót tèi ®a tõ 2 ngµy cho ®Õn 21 ngµy sau g©y nhiÔm. Tuy nhiªn sù æn ®Þnh hiÕm thÊy cña virót ë møc ®é cÊu tróc vµ di truyÒn sÏ lµm dÔ dµng ®i rÊt nhiÒu vÊn ®Ò nµy. Ba giai ®o¹n nh©n lªn cña virót trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy ®· ®−îc x¸c ®Þnh. Tõ ngµy thø 2 cho ®Õn ngµy thø 8 sau g©y nhiÔm, sîi ARN ©m vµ sîi d−¬ng cña virót vµ tû lÖ tæng hîp virót HAV cã kh¶ n¨ng l©y nhiÔm ®¹t møc cao nhÊt. Tõ ngµy thø 9 ®Õn ngµy thø 14, kh¸ng nguyªn virót ®−îc tæng hîp ë møc cao nhÊt vµ sîi ARN d−¬ng, HAV l©y nhiÔm vÉn ë møc cao nhÊt nh−ng sîi ARN ©m gi¶m xuèng ë d−íi møc ph¸t hiÖn ®−îc. Sè l−îng thÊp ARN sîi kÐp ph¸t hiÖn ®−îc ®· chøng minh r»ng cã rÊt Ýt sîi ARN ©m ®−îc tæng hîp. Sau 14 ngµy, cã rÊt Ýt ho¹t tÝnh qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña virót. Cã nhiÒu c¬ chÕ ®· ®−îc ®−a ra ®Ó gi¶i thÝch cho sù sao chÐp 8
chËm HAV trong tÕ bµo. Cã nhiÒu hãa chÊt ¶nh h−ëng ®Õn qu¸ tr×nh sao chÐp cña virót nh− guanidin, hãa chÊt kh¸ng virót, amantadin, monensin… Tõ nh÷ng sè liÖu cña c¸c thö nghiÖm miÔn dÞch, HAV chØ cã 1 serotýp. H¹t virót tinh khiÕt kÝch thÝch sinh kh¸ng thÓ trung hßa anti-HAV. Ng−îc l¹i, kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i protein capsit tinh khiÕt hoÆc peptit tæng hîp kh«ng cã ho¹t tÝnh trung hßa hoÆc rÊt yÕu. Mét sè nghiªn cøu kh¸c l¹i cho r»ng 98% IgG vµ 94% IgM ®−îc t×m thÊy trong giai ®o¹n nhiÔm HAV cÊp tÝnh lµ kh¸ng thÓ kh¸ng VP1. Kh¸ng thÓ anti-VP1, anti-VP0 vµ anti-VP3 IgG ®−îc t×m thÊy nhiÒu n¨m sau khi nhiÔm HAV. §iÒu ®ã cho thÊy r»ng kh¸ng thÓ kh¸ng polypeptit capsit cã thÓ cã vai trß quan träng trong viÖc duy tr× ®¸p øng miÔn dÞch l©u dµi. NhiÒu nghiªn cøu ®· chØ ra r»ng kh¸ng thÓ trung hßa cã thÓ ®−îc t¹o ra ë chuét khi g©y miÔn dÞch b»ng protein virót riªng lÎ VP1,VP2 hoÆc VP3. H¬n n÷a, vÞ trÝ g©y miÔn dÞch trung hßa ®· ®−îc t×m thÊy trªn protein capsit VP3 cña HAV. Mét kho tµng c¸c sè liÖu nghiªn cøu viªm gan A ®−îc l−u tr÷ trong h¬n mét nöa thÕ kû ®· cñng cè quan ®iÓm cho r»ng c¸c chñng virót cã tÝnh chÊt sinh bÖnh häc vµ kh¸ng nguyªn thay ®æi sÏ kh«ng xÈy ra . BÊt kú lóc nµo c¸c quan s¸t dÞch tÔ vµ l©m sµng cho r»ng cã sù thay ®æi vÒ c¸c tÝnh chÊt sinh häc c¬ b¶n cña virót, nh− khi cã dÞch viªm gan do nguån n−íc g©y nªn ë Delhi n¨m 1956, th× nghiªn cøu sau nµy ®· ph¸t hiÖn thªm mét t¸c nh©n c¨n nguyªn kh«ng cã liªn quan, còng lµ mét t¸c nh©n virót truyÒn nhiÔm ®−êng ruét, mét viªm gan kh«ng A, kh«ng B ( hiÖn nay ®−îc m« t¶ lµ virót viªm gan E). Sù æn ®Þnh vµ ®ång nhÊt kh¸ng nguyªn cña HAV cã thÓ lµ kÕt qu¶ theo dâi tiªm gl«bulin miÔn dÞch huyÕt thanh ng−êi b¶o vÖ ®−îc viªm gan A trªn toµn thÕ giíi, kh«ng phô thuéc vµo nguån gèc ®Þa lý cña chÕ phÈm gl«bulin miÔn dÞch ®· ®−îc sö dông. 9
H×nh 2 : CÊu tróc genom HAV vµ c¸c s¶n phÈm m· hãa 1.3. Sinh bÖnh häc NhiÔm trïng tù nhiªn víi HAV th−êng xÈy ra sau khi nhiÔm virót theo ®−êng tiªu hãa do c¸c chÊt bÞ nhiÔm ph©n cã chøa HAV. Qu¸ tr×nh tõ khi virót x©m nhËp theo èng tiªu hãa cho ®Õn khi g©y ra hËu qu¶ viªm gan vÉn ch−a ®−îc hiÓu biÕt ®Çy ®ñ. MÆc dï vÞ trÝ sao chÐp ®Çu tiªn cña HAV lµ tÕ bµo gan, qu¸ tr×nh tù nhiªn cña c¸c vËt thÓ c¶m thô trªn tÕ bµo chñ ®èi víi t¸c nh©n vÉn ch−a ®−îc x¸c ®Þnh râ. Tuy nhiªn, nhiÒu nghiªn cøu ®· cho biÕt sù kÕt dÝnh cña virót ®èi víi tÕ bµo lµ phô thuéc vµo canxi. Trong giai ®o¹n ñ bÖnh, tr¹ng th¸i virót huyÕt xuÊt hiÖn ®ång thêi víi sù ®µo th¶i virót theo ph©n. Tr¹ng th¸i virót huyÕt kÕt thóc nhanh sau khi triÖu chøng viªm gan xuÊt hiÖn, trong khi HAV vÉn tiÕp tôc ®µo th¶i ra ph©n trong 1 ®Õn 2 tuÇn n÷a. Trong mét vµi tr−êng hîp, HAV cã thÓ l−u hµnh trong m¸u g¾n víi nh÷ng ®o¹n mµng cã lipit cã t¸c dông b¶o vÖ virót tr¸nh kh¸ng thÓ trung hßa. 10
Phøc hîp miÔn dÞch gi÷a kh¸ng thÓ IgA ®Æc hiÖu vµ HAV trong ph©n ®· ®−îc ph¸t hiÖn. §iÒu nµy gi¶i thÝch t¹i sao HAV cã thÓ ph¸t hiÖn b»ng ph¶n øng lai ghÐp sau khi kh¸ng nguyªn HAV ©m tÝnh ®èi víi c¸c thö nghiÖm miÔn dÞch. §· cã gi¶ thuyÕt cho r»ng cã vÞ trÝ sao chÐp ban ®Çu kh¸c ngoµi tÕ bµo gan ®èi víi HAV. Trªn g©y bÖnh thùc nghiÖm cho ®éng vËt linh tr−ëng, kh¸ng nguyªn HAV vµ/hoÆc vËt liÖu di truyÒn ®· ®−îc t×m thÊy ë l¸ch, thËn, amidan vµ n−íc bät nh−ng kh«ng th−êng xuyªn thÊy ë niªm m¹c ruét. Sù ph¸t hiÖn cña HAV trong amidan vµ n−íc bät, ngay sau khi virót xuÊt hiÖn trong m¸u ®· gîi ý r»ng qu¸ tr×nh sao chÐp sím cã thÓ xÈy ra ë khoang miÖng hÇu hoÆc tuyÕn n−íc bät. MÆc dï cã nhiÒu nghiªn cøu ®· chØ ra r»ng cã vµi mèi liªn hÖ gi÷a møc ®é tiÕn triÓn cña bÖnh víi ®µo th¶i virót trong ph©n nh−ng l−îng virót ®µo th¶i trong ph©n lín nhÊt tr−íc khëi ®Çu cña tæn th−¬ng gan biÓu hiÖn b»ng ALT t¨ng cao. Trong vitro, tÕ bµo nhiÔm HAV l©u dµi kh«ng bÞ ph¸ hñy vµ sù trao ®æi chÊt hoµn toµn kh«ng bÞ ¶nh h−ëng. §iÒu ®ã gîi ý r»ng, kh¶ n¨ng g©y ®éc cña virót cã thÓ kh«ng ph¶i lµ nguyªn nh©n g©y ra nh÷ng thay ®æi bÖnh lý trong nhiÔm HAV vµ bÖnh lý gan cã thÓ lµ kÕt qu¶ ban ®Çu cña c¬ chÕ miÔn dÞch. C¬ chÕ ®µo th¶i HAV ra khái gan vÉn ch−a ®−îc nghiªn cøu nhiÒu, song cã lÏ bao gåm viÖc g©y c¶m øng c¸c tÕ bµo giÕt kh«ng ®Æc hiÖu còng nh− kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu ng−êi (HLA) líp I- giíi h¹n cho lymph« bµo T g©y ®éc. Ph©n tö ®Ých cho tÕ bµo ho¹t ho¸ kiÓu nµy ch−a ®−îc biÕt, song ng−êi ta cho r»ng pr«tªin virót ®−îc m· ho¸ cã mÆt trªn bÒ mÆt cña tÕ bµo bÞ nhiÔm. Sù ®¸p øng qua trung gian tÕ bµo nµy ®èi víi nhiÔm HAV trong gan cã lÏ chÞu tr¸ch nhiÖm phÇn lín th−¬ng tæn gan kÌm theo viªm gan A cÊp tÝnh khi virót nh©n lªn m¹nh mÏ vµ tiÕp ®Õn lµ khëi ®Çu hñy ho¹i tÕ bµo 11
gan vµ sù nh©n lªn cña phÇn lín c¸c biÕn chñng HAV lµ kh«ng g©y th−¬ng tæn hñy ho¹i tÕ bµo ë c¸c gißng tÕ bµo nu«i. TÕ bµo ®¬n nh©n còng x©m nhËp vµo bøc tranh toµn c¶nh trong tæ chøc häc cña viªm gan A cÊp tÝnh. MÆc dï vai trß cña interferon trong ®iÒu trÞ viªm gan A ch−a ®−îc x¸c ®Þnh râ, song qu¸ tr×nh nh©n lªn cña HAV cã lÏ lµ hoµn toµn nhËy c¶m víi interferon-β (IFNβ) vµ IFNγ. Tuy nhiªn IFNβ kh«ng ®−îc s¶n xuÊt tõ nguyªn bµo s¬ bÞ nhiÔm vµ chøng cí ®Ó s¶n xuÊt IFNα vÉn cßn ®ang tranh c·i. MÆt kh¸c IFNα nh− ®· biÕt sÏ ®−îc s¶n xuÊt tõ lymph« bµo T trong ®¸p øng víi viªm gan A cÊp tÝnh vµ cã lÏ ®ãng vai trß chñ yÕu trong sinh bÖnh häc cña c¨n bÖnh nµy. H¬n n÷a, ®èi víi hiÖu qu¶ kh¸ng virót trùc tiÕp, IFNα cã thÓ khëi ®éng c¸c tÕ bµo lymph« g©y ®éc b»ng c¸ch g©y c¶m øng ban ®Çu cña HLA líp kh¸ng nguyªn trªn bÒ mÆt tÕ bµo gan. 1.4. §Æc ®iÓm l©m sµng §Æc ®iÓm l©m sµng cña viªm gan virót rÊt ®a d¹ng. Qóa tr×nh nhiÔm virót viªm gan cÊp cã thÓ chia thµnh 4 giai ®o¹n : (a) giai ®o¹n ñ bÖnh gi÷a ph¬i nhiÔm vµ ngµy ®Çu tiªn xuÊt hiÖn triÖu chøng l©m sµng hoÆc vµng da ; (b) giai ®o¹n tiÒn l©m sµng ; (c) giai ®o¹n l©m sµng ; (d) giai ®o¹n håi phôc. Thêi gian ñ bÖnh cña viªm gan A tõ 10 ®Õn 50 ngµy, trung b×nh 1 th¸ng. Tuy nhiªn, l−îng virót lín x©m nhËp sÏ lµm rót ng¾n giai ®o¹n ñ bÖnh. Trong giai ®o¹n nµy, bÖnh nh©n kh«ng cã biÓu hiÖn triÖu chøng l©m sµng mÆc dï virót vÉn sao chÐp vµ nh©n lªn. §iÒu ®¸ng quan t©m nhÊt trong giai ®o¹n ñ bÖnh lµ kh¶ n¨ng l©y truyÒn. Giai ®o¹n tiÒn l©m sµng kÐo dµi tõ vµi ngµy ®Õn vµi tuÇn, kÐo theo khëi ®µu cña vµng da. TriÖu chøng th−êng gÆp lµ sèt, ch¸n ¨n, mÖt mái, ®au c¬, buån n«n, n«n. Giai ®o¹n l©m sµng bao gåm c¸c triÖu chøng n−íc tiÓu sÉm mÇu do t¨ng bilirubin niÖu, kÐo theo ph©n b¹c mÇu vµi ngµy sau ®ã vµ vµng 12
da niªm m¹c. Cã thÓ gÆp viªm gan kÞch ph¸t trong 6 ®Õn 8 tuÇn cña bÖnh g©y ra sèt cao ®ét ngét, ®au d÷ déi, n«n, vµ vµng da tiÕp theo lµ héi chøng n·o do viªm gan lªn quan ®Ðn h«n mª s©u vµ ch¶y m¸u n·o. Tû lÖ chÕt cao liªn quan ®Õn tuæi, tû lÖ sèng sãt rÊt hiÕm ®èi víi bÖnh nh©n trªn 45 tuæi. ChÈn ®o¸n l©m sµng viªm gan virót cÊp dùa trªn ®¸nh gi¸ chøc n¨ng sinh hãa cña gan víi sù t¨ng cao men gan ALT vµ AST. 1.5. ChÈn ®o¸n Bëi v× t¸c nh©n g©y bÖnh cña viªm gan virót th−êng kh«ng thÓ ph©n biÖt dùa trªn ®Æc ®iÓm l©m sµng vµ béi nhiÔm HAV cã thÓ xÈy ra trªn bÖnh nh©n nhiÔm virót viªm gan B vµ C nªn c¸c thö nghiÖm huyÕt thanh ®−îc tiÕn hµnh ®Ó x¸c ®Þnh nguyªn nh©n. §Ó chÈn ®o¸n giai ®o¹n cÊp cña nhiÔm HAV, mét dÊu Ên quan träng th−êng ®−îc x¸c ®Þnh lµ IgM anti-HAV. Kh¸ng thÓ nµy t¨ng cao nhanh chãng trong 4 ®Õn 6 tuÇn, råi gi¶m xuèng d−íi møc ph¸t hiÖn trong vßng 3 ®Õn 6 th¸ng ë phÇn lín c¸c bÖnh nh©n. Trªn 85% c¸c tr−êng hîp men gan vÉn b×nh th−êng tr−íc khi hoÆc t¹i thêi ®iÓm IgM anti-HAV biÕn mÊt. IgG anti-HAV cã thÓ ph¸t hiÖn ®−îc trong vßng 1 hoÆc 2 tuÇn cña giai ®o¹n cÊp tÝnh vµ thay thÕ IgM. IgG cã thÓ tån t¹i nhiÒu n¨m sau khi nhiÔm HAV. Ngoµi c¸c ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh kh¸ng thÓ IgG hoÆc IgM anti-HAV trong huyÕt thanh bÖnh nh©n, nhiÒu kü thuËt sinh häc ph©n tö ®· ®−îc ¸p dông nh»m t¨ng cao ®é nhËy vµ ®é ®Æc hiÖu trong chÈn ®o¸n. Kü thuËt lai ghÐp ®· ph¸t hiÖn ®−îc virót víi nång ®é 10 4-105 PFU/ml. Tuy nhiªn, kü thuËt nµy thiÕu ®é nhËy cÇn thiÕt ®Ó ph¸t hiÖn trùc tiÕp h¹t virót v¬i sè l−îng nhá trong thùc phÈm. HiÖn nay, ph¶n øng chuçi polymeraza - sao chÐp ng−îc lµ kü thuËt duy nhÊt cho phÐp ph¸t hiÖn virót ®−êng ruét trong 13