Kết quả gây miễn dịch động vật thí nghiệm bằ̀ng quyế́t định kháng nguyên Cyfra21-1

Lê Đình Chắc và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 85(09)/2: 17 - 19<br /> <br /> KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊ CH ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM BẰNG<br /> QUYẾT ĐỊ NH KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1<br /> Lê Đì nh Chắc 1, Nguyễn Thị Thủy 2, Lê Quang Huấn2<br /> 1<br /> <br /> Trường ĐH Hồng Đức - Thanh Hóa<br /> 2<br /> Viện Công nghệ sinh học<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Ung thƣ phổi là một trong nhƣ̃ng căn bệnh hiểm nghèo do sƣ̣ tăng sinh không bì nh thƣờng của tế<br /> bào và có tỉ lệ tử vong cao . Thƣ̣c tế đã có nhiều các chỉ thị kháng nguyên đƣợc sƣ̉ dụng để chẩn<br /> đoán căn bệnh nguy hiểm này , tuy nhiên kháng nguyên Cyfra 21-1 là chỉ thị đặc hiệu cho ung thƣ<br /> phổi dạng tế bào không nhỏ (non small cell carcinoma). Để tạo đƣợc kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu<br /> kháng nguyên trên , chúng tôi đã tiến hành thu nhận kháng nguyên Cyfra 21-1 tƣ̀ bệnh phẩm và tiến<br /> hành gây miễn dịch động vật thí nghiệm bằng khán g nguyên thu đƣợc . Kết quả gây miễn dị ch đã<br /> thành công và thu đƣợc đáp ứng miễn dịch rất cao ở động vật thí nghiệm , điều này hoàn toàn phù<br /> hợp với lý thuyết và làm cơ sở cho các nghiên cƣ́u tiếp theo .<br /> Từ khóa: miễn dịch động vật, kháng nguyên, Cyfra21-1<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ*<br /> Ung thƣ phổi (UTP) là một trong nhƣ̃ng căn bệnh<br /> hiểm nghèo do sƣ̣ tăng sinh không bì nh thƣờng<br /> của tế bào, chiếm ƣu thế ở nam giới , mà chủ yếu<br /> là lứa tuổi 50-70, đặc biệt là những ngƣời đã hoặc<br /> đang hút thuốc lá (80%), đây là một trong nhƣ̃ng<br /> căn bệnh có tỉ lệ tử vong lớn nhất trong các bệnh<br /> ung thƣ (chiếm 31%) [5]. Vì vậy, việc phát hiện<br /> sớm ung thƣ phổi có ý nghĩa sống còn với bệnh<br /> nhân, bởi khi phát hiện đƣợc ung thƣ phổi ở giai<br /> đoạn sớm có thể đƣa ra biện pháp điều trị hợp lý<br /> , có<br /> khả năng chữa khỏi bệnh . Nếu ở giai đoạn muộn<br /> hơn khi ung thƣ đã di căn thì thực sự là một khó<br /> khăn trong điều trị do vậy tí nh mạng của bệnh nhân<br /> khó có thể tồn tại đƣợc.<br /> Trong thƣ̣c tế , ung thƣ phổi đã có nhiều nhỉ thị có<br /> thể sƣ̉ dụng để phát hiện<br /> (Carcinoembryonic<br /> antigen (CEA), cytokeratin 19cyfra21-1, neuron<br /> specific enolase (NES), CA125…) [1,2,4]. Tuy<br /> nhiên kháng nguyên Cyfra 21-1 là một chỉ thị<br /> điển hình cho khoảng 80% bệnh UTP và tăng<br /> nồng độ nhanh chóng ngay khi tế bào biểu mô<br /> phổi tăng sinh bất thƣờng, nếu phát hiện đƣợc sự<br /> có mặt của Cyfra 21-1 sẽ góp phần chẩn đoán<br /> sớm căn bệnh ung thƣ phổi . Trong bài viết này ,<br /> chúng tôi trình bày kết quả gây miễn dịch động<br /> vật thí nghiệm bằng quyết đị nh kháng nguyên<br /> cyfra21-1 thu đƣợc làm tiền đề cho các nghiên<br /> cƣ́u tiếp theo.<br /> *<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> NGUYÊN LIỆU, PHƢƠNG PHÁP VÀ QUY<br /> TRÌNH NGHIÊN CỨU<br /> Nguyên liệu<br /> - Kháng nguyên cyfra 21.1 tái tổ hợp do phòng<br /> Công nghệ tế bào động vật cung cấp.<br /> - Gà lơgor do viện chăn nuôi cung cấp.<br /> - Các hóa chất và tinh sạch sản phẩm đều đƣợc<br /> mua tƣ̀ các hãng có uy tí n.<br /> Phương pháp<br /> - Gây miễn dị ch động vật được sử dụng theo<br /> phương pháp của Westerfeld (2005) với kháng<br /> nguyên tái tổ hợp Cyfra21-1.<br /> - Phương pháp kiểm tra đáp ứng miễn dị ch bằng<br /> ELISA<br /> Các bƣớc trong ELISA . ( 1) Phủ đĩa bằng kháng<br /> thể (2) Thêm mẫu (huyết thanh gà đã gây miễn<br /> dịch) cần xác định kháng nguyên . Kháng nguyên<br /> (nếu có) sẽ gắn với kháng thể ; (3) kháng thể dùng<br /> để phát hiện đƣợc thêm vào và kết hợp với kháng<br /> nguyên; (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với<br /> enzyme. Kháng thể thứ cấp s ẽ gắn với kháng thể<br /> dùng để phát hiện ; (5) Thêm cơ chất . Enzym sẽ<br /> làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu phát hiện và<br /> đo đƣợc. [3]<br /> Quy trì nh gây miễn dị ch ở gà<br /> Quyết đị nh kháng nguyên Cyfra 21-1 đã tinh sạch<br /> đƣợc trộn với tá dƣợc (lần đầu dung dị ch kháng<br /> nguyên đƣợc trộn với chất bổ trợ hoàn toàn<br /> Freund (complete) và các lần sau với chất bổ trợ<br /> 17<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Lê Đình Chắc và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> không hoàn toàn Freund (incomplete) theo tỉ lệ<br /> 1:1) và tiêm dƣới da 04 lần, cách nhau 1 tuần.<br /> Trƣớc khi giết gà lấy tủy và lách , tách RNA, các<br /> mẫu huyết thanh gà đƣợc kiểm tra đáp ƣ́ng miễn<br /> dịch bằng kỹ thuất ELISA.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Sở dĩ chúng tôi chọn gà vì trong quá trì nh tiến<br /> hóa, các protein của động vật có vú thƣờ ng có<br /> tính bảo thủ cao , do đó khi sƣ̉ dụng gà để gây<br /> miễn dị ch sẽ có phản ứng đáp ứng miễn dịch<br /> mạnh hơn so với việc gây miễn dịch bằng thỏ<br /> hoặc chuột. Mặt khác , phân tƣ̉ kháng thể của gà<br /> IgY có cấu trúc và tí nh chất<br /> giống với IgG ở<br /> ngƣời. [1]<br /> Kết quả xác đị nh đáp ứng miễn dị ch với<br /> quyết đị nh kháng nguyên Cyfra<br /> 21-1 bằng<br /> ELISA trước khi gây miễn dị ch lần thứ<br /> 4 ở<br /> gà<br /> Bảng 1: Kết quả đáp ƣ́ng miễn dị ch ở gà với quyết<br /> đị nh kháng nguyên Cyfra 21-1 theo tỉ lệ pha loãng<br /> huyết thanh khác nhau trƣớc khi gây miễn dị ch lần<br /> thƣ́ 4<br /> A<br /> B<br /> C<br /> D<br /> <br /> 1<br /> 2,015<br /> 0,913<br /> 0,525<br /> 0,168<br /> <br /> 2<br /> 1,35<br /> 0,705<br /> 0,247<br /> 0,081<br /> <br /> 3<br /> 1,461<br /> 0,789<br /> 0,544<br /> 0,226<br /> <br /> 4<br /> 0,484<br /> 0,531<br /> 0,228<br /> 0,097<br /> <br /> 5<br /> 0,044<br /> 0,046<br /> 0,046<br /> 0,045<br /> <br /> Trong đó: 1,2,3 là các giếng chứa huyết thanh của<br /> tƣ̀ng gà đã gây miễn dị ch trƣớc khi gây miễn dị ch<br /> lần thƣ́ 4. 4 là giếng chứa mẫu huyết thanh của gà<br /> không gây miễn dị ch với kháng nguyên Cyfra 211. 5 là giếng không có huyết thanh gà.<br /> A: Huyết thanh không pha loãng<br /> B: Huyết thanh đã pha loãng 10 lần<br /> C: Huyết thanh đã pha loãng 100 lần<br /> D: Huyết thanh đã pha loãng 1000 lần<br /> <br /> 85(09)/2: 17 - 19<br /> <br /> Biểu đồ 1. Kết quả đáp ƣ́ng miễn dị ch ở gà với quyết<br /> đị nh kháng nguyên Cyfra 21-1 theo tỉ lệ pha loãng<br /> huyết thanh khác nhau trƣớc khi gây miễn dị ch lần thƣ́<br /> 4<br /> <br /> Tƣ̀ kết quả thu đƣợc ở bảng 1 và biểu đồ 1, chúng<br /> ta thấy rằng ở các con g à đã đƣợc gây miễn dịch<br /> bằng quyết đị nh kháng nguyên Cyfra 21-1 có sự<br /> đáp ƣ́ng miễn dị ch mạnh , tỉ lệ đáp ứng miễn dịch<br /> giản dần qua tỉ lệ pha loãng huyết thanh tăng dần .<br /> Điều này chƣ́ng tỏ , chúng tôi đã thành công trong<br /> việc gây miễn dị ch bằng quyết đị nh kháng nguyên<br /> Cyfra21-1 ở gà làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp<br /> theo.<br /> Kết quả xác đị nh đáp ứng miễn dị ch của gà bằng<br /> ELISA trước khi lấy tủy xương và lách<br /> Bảng 2: Kết quả xác đị nh đáp ƣ́ng miễn dị ch của gà<br /> bằng ELISA trƣớ c khi lấy tủy xƣơng và lách<br /> 1<br /> 2.714<br /> 0.433<br /> <br /> C<br /> D<br /> <br /> 2<br /> 2.029<br /> 0.438<br /> <br /> 3<br /> 2.133<br /> 0.544<br /> <br /> 4<br /> 0.5<br /> 0.162<br /> <br /> 5<br /> 0.059<br /> 0.057<br /> <br /> Trong đó, 1,2,3 là các giếng chứa huyết thanh của<br /> tƣ̀ng con gà đã gây miễn dị ch trƣớc khi lấy tủy<br /> xƣơng và lách để tách RNA ; 4 - Giếng chƣ́a mẫu<br /> huyết thanh gà không gây miễn dị ch với quyết<br /> đị nh kháng nguyên Cyfra 21-1; 5 - Giếng không<br /> có huyế t thanh gà ; C - Huyết thanh gà đã gây<br /> miễn dị ch với quyết đị nh kháng nguyên Cyfra 211 đƣợc pha loãng 100 lần; D - Huyết thanh gà đã<br /> gây miễn dị ch với quyết đị nh kháng nguyên<br /> Cyfra21-1 đƣợc pha loãng 1000 lần.<br /> Tƣ̀ kết quả thu đƣợc ở bảng 2 và biểu đồ 2, chúng<br /> ta khẳng đị nh một lần nƣ̃a sƣ̣ đáp ƣ́ng miễn dị ch<br /> diễn ra mạnh ở gà bằng quyết đị nh kháng nguyên<br /> Cyfra21-1. Tƣ̀ đó , chúng tôi tiến hành tách RNA<br /> để phục vụ cho các nghiên cứu sau này.<br /> 3<br /> 2.5<br /> <br /> 2.500<br /> <br /> 2<br /> <br /> 2.000<br /> A<br /> 1.500<br /> <br /> D<br /> <br /> 1<br /> <br /> C<br /> <br /> 1.000<br /> <br /> C<br /> <br /> 1.5<br /> <br /> B<br /> D<br /> <br /> 0.5<br /> <br /> 0.500<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0.000<br /> Gà 1<br /> <br /> Gà 2<br /> <br /> Gà 3<br /> <br /> Gà 4<br /> <br /> Gà 1<br /> <br /> ĐC<br /> <br /> Gà 2<br /> <br /> Gà 3<br /> <br /> Gà 4<br /> <br /> ĐC(-)<br /> <br /> Biểu đồ 2. Kết quả xác đị nh đáp ƣ́ng miễn dị ch của<br /> gà bằng ELISA trƣớc khi lấy tủy xƣơng và lách<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 18<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Lê Đình Chắc và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Chúng tôi đã gây miễn dịch thành công ở gà bằng<br /> quyết đị nh kháng nguyên Cyfra21-1 và đã xác định<br /> đƣợc sƣ̣ đáp ƣ́ng miễn dị ch bằng kỹ thuật ELISA ,<br /> với kết quả này đã chƣ́ng minh sƣ̉ dụng gà gây<br /> miễn dị ch bằng protein – kháng nguyên có bản chất<br /> của ngƣời hoặc động vật có vú sẽ có đáp ứng miễn<br /> dịch mạnh . Điều này hoàn toàn phù hợp với lý<br /> thuyết và là cơ sở cho các nghiên cƣ́u sau nà.y<br /> <br /> 85(09)/2: 17 - 19<br /> <br /> [2]. Lê Thị Minh Phúc, Nguyễn Xuân Hƣng, Lã Thị<br /> Huyền, Nguyễn Thị Phƣơng Hiền, Lê Quang Huấn<br /> (2008). “Thu nhận kháng nguyên ung thƣ phổi, CYFRA<br /> 21-1, bằng kỹ thuật gen” Tạp chí Khoa học và Công<br /> nghệ, tập 6: 41-48.<br /> [3].<br /> Lê Trần Bì nh , Phan Văn Chi , Nông Văn Hải ,<br /> Trƣơng Nam Hải , Lê Quang Huấn (2003) Áp dụng<br /> các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh<br /> vật Việt Nam Nxb Khoa học và Kỹ thuật .<br /> [4].<br /> De Jaeger, C., De Wilde, C., Eeckhout, D.,<br /> Fiers, E., Depicker, A (2000), “The plantibody<br /> approach: expression of antibody genes in plants to<br /> modulate plant metabolism or to obtain pathogen<br /> resistance”, Plant Mol. Biol. 43:419-428<br /> [5].<br /> http://www.google.com<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Lê Quang Huấn , Lã Thị Huyề n (2009) Kháng thể<br /> tái tổ hợp và ứng dụng, Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công<br /> nghệ .<br /> <br /> SUMMARY<br /> RESULTS OF IMMUNIZATION ON EXPERIMENTAL ANIMALS BY ANTIGENIC<br /> DETERMINANTS CYFRA21.1<br /> Le Dinh Chac1*, Nguyen Thi Thuy2, Le Quang Huan2<br /> 1<br /> <br /> Hong Duc University - Thanh Hoa, 2Institute of biotechnology<br /> <br /> Lung cancer is one of the serious diseases caused by proliferation of abnormal cells and has high mortality rate.<br /> In fact there were many antigen indicators used to diagnose this serious disease, but Cyfra21-1 antigen is a<br /> specific designation for the non small cell carcinoma. To generate antibodies specific recombinant antigens, we<br /> conducted admitted Cyfra21-1 antigen from swabs and carry immunize experimental animals using an antigen<br /> obtained. Resulting immune successful and obtained a very high immune response in experimental animals, this<br /> is completely consistent with the theory and a base for further research.<br /> Key words: animals immunization, antigen, Cyfra21-1<br /> <br /> *<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 19<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />