Kết quả ngoại kiểm chuẩn xét nghiệm đột biến gen EGFR năm 2014 và 2015 tại Bệnh viện Bạch Mai

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017<br /> <br /> KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM CHUẨN XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR<br /> NĂM 2014 VÀ 2015 TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI<br /> Ph m C m Ph ơng*; Mai Tr ng Khoa*; Nguy n Ti n Lung*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: chuẩn hóa kỹ thuật và xác định tính chính xác của xét nghiệm đột biến gen EGFR<br /> bằng kỹ thuật Strip Assay đang thực hiện tại Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai. Phương<br /> pháp: 29 mẫu bệnh phẩm do Mạng lưới Kiểm soát Chất lượng Di truyền học Phân tử châu Âu<br /> (The European Molecular Genetics Quality Network - EMQN) và Hệ thống Ngoại kiểm Chất<br /> lượng Vương quốc Anh (UK National External Quality Assessment Schemes - UK NEQAS)<br /> cung cấp năm 2014, 2015 để xác định đột biến gen EGFR bằng kít EGFR StripAssay®<br /> (ViennaLab). Các kết quả này sẽ được gửi trả trực tuyến và các tổ chức này đánh giá, công bố<br /> kết quả. Kết quả: cả 29 mẫu kiểm chuẩn thực hiện đều cho kết quả chính xác với công bố của<br /> EMQN và UK NEQAS (đạt 100%). Kết luận: kỹ thuật xét nghiệm sử dụng kít EGFR StripAssay®<br /> và thiết bị hiện có tại Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai đảm bảo tiêu chuẩn để phát hiện<br /> đột biến gen EGFR. Các xét nghiệm này có độ chính xác cao, ổn định, từ đó cung cấp thông tin<br /> chính xác cho bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và lập điều trị cho bệnh nhân (BN) ung thư phổi<br /> (UTP) không tế bào nhỏ.<br /> * Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhỏ; Đột biến gen EGFR; Ngoại kiểm kiểm tra chất<br /> lượng xét nghiệm.<br /> <br /> The Results of External Quality Assessment of EGFR Mutations<br /> Testing at Bachmai Hospital<br /> Summary<br /> Objectives: To standardize the technique and assess the realibility of EGFR mutations tests<br /> by Strip Assay technique at the Gene Therapy Unit, Bachmai Hospital. Methods: 29 samples for<br /> external quality assessment which obtained from the European Molecular Genetics Quality<br /> Network (EMQN) and UK National External Quality Assessment Schemes (UK NEQAS) from<br /> 2014 to 2015 were detected EGFR mutations by EGFR StripAssay® (ViennaLab), these results<br /> were submited online and compared with validated results. Results: All of samples had same<br /> results with publication of EMQN and UK NEQAS (100% efficiency). Conclusion: EGFR mutations<br /> tests with EGFR StripAssay® kit and equipment available at the Gene Therapy Unit, Bachmai<br /> Hospital ensure the quality to detect EGFR mutations. These tests have high accuracy, providing<br /> more details for clinicians in diagnosis and treatment of non-small lung cancer management.<br /> * Key words: Non-small cell lung cancer; EGFR mutation; External quality assessment.<br /> * Bệnh viện Bạch Mai<br /> Ng i ph n h i (Corresponding): Ph m C m Ph ơng (camphuongmd@yahoo.com)<br /> Ngày nh n bài: 04/07/2016; Ngày ph n bi n đánh giá bài báo: 13/12/2016<br /> Ngày bài báo đ c đăng: 23/12/2016<br /> <br /> 47<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư phổi là bệnh ung thư phổ biến<br /> trên thế giới và ở Việt Nam. Hiện nay, có<br /> nhiều tiến bộ trong chẩn đoán (sinh học<br /> phân tử, tế bào…) và điều trị bệnh UTP<br /> (phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, điều trị đích…),<br /> do đó đã nâng cao hiệu quả điều trị và cải<br /> thiện chất lượng sống cho người bệnh.<br /> Một trong những tiến bộ trong chẩn<br /> đoán là xét nghiệm đột biến gen EGFR<br /> (Epidermal Growth Factor Receptor: thụ<br /> thể yếu tố phát triển biểu mô). Gen EGFR<br /> này đóng vai trò quan trọng trong hoạt<br /> động chức năng phát triển và biệt hóa<br /> của tế bào. Đột biến EGFR dẫn đến tăng<br /> biểu hiện hoặc tăng cường hoạt động của<br /> EGFR được phát hiện trong nhiều loại<br /> bệnh ung thư trong đó có UTP.<br /> Hiện nay, đã có nhiều bước tiến quan<br /> trọng trong điều trị, như sự ra đời của các<br /> thuốc điều trị đích (kháng thể đơn dòng,<br /> thuốc phân tử nhỏ, ức chế vùng tyrosine<br /> kinase [tyrosine kinase inhibitor - TKI] của<br /> thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô) đã<br /> được sử dụng để điều trị cho BN UTP<br /> không tế bào nhỏ. Các nghiên cứu trên<br /> thế giới và tại Việt Nam đã cho thấy BN<br /> có đột biến EGFR có thời gian sống thêm<br /> không bệnh tiến triển (progression-free<br /> survival - PFS) và thời gian sống thêm<br /> toàn bộ (overall survival - OS) cao hơn<br /> BN không có đột biến EGFR khi được<br /> điều trị bằng các thuốc TKI [1, 2]. Vì vậy,<br /> xét nghiệm đột biến gen EGFR cho BN<br /> UTP không tế bào nhỏ thực sự cần thiết<br /> để các bác sỹ lâm sàng lựa chọn phương<br /> án điều trị tối ưu nhất cho người bệnh.<br /> 48<br /> <br /> Hiện nay, có nhiều phương pháp khác<br /> nhau để xét nghiệm đột biến gen EGFR<br /> như giải trình tự gen (giải trình tự Sanger<br /> hoặc pyrosequencing), real time PCR<br /> (ví dụ kít therascreen - Qiagen), lai đầu dò<br /> (Strip Assay - ViennaLab)… Mỗi phương<br /> pháp đều có những ưu nhược điểm riêng:<br /> các kít therascreen, Strip Assay có độ<br /> nhạy cao, nhưng chỉ phát hiện được số<br /> lượng đột biến giới hạn theo thiết kế kít;<br /> trong khi các phương pháp giải trình tự có<br /> khả năng phát hiện đột biến mới, hiếm<br /> gặp, nhưng đòi hỏi số lượng tế bào mang<br /> đột biến trong mẫu phân tích lớn [3]. Do<br /> vậy, các phương pháp xét nghiệm này có<br /> thể cho kết quả khác nhau trên cùng một<br /> mẫu phân tích. Vì vậy, việc ngoại kiểm tra<br /> chất lượng xét nghiệm có vai trò đặc biệt<br /> quan trọng trong đánh giá khả năng phát<br /> hiện đột biến gen EGFR.<br /> Nhằm chuẩn hóa kỹ thuật, đồng thời<br /> xác định tính chính xác và tính ổn định<br /> của xét nghiệm đột biến gen EGFR, Đơn<br /> vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai đã<br /> tham gia các đợt ngoại kiểm chuẩn chất<br /> lượng xét nghiệm của Mạng lưới EMQN<br /> và Hệ thống UK NEQAS, đều có trụ sở tại<br /> Thành phố Manchester, Anh.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> 29 mẫu bệnh phẩm UTP không tế bào<br /> nhỏ nhận được từ EMQN (10 mẫu năm<br /> 2014, 10 mẫu năm 2015) và UK NEQAS<br /> (9 mẫu năm 2015). Các mẫu này đều<br /> được cố định bằng formalin và đúc paraffin<br /> (formalin-fixed, paraffin-embedded - FFPE)<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017<br /> để làm tiêu bản HE và phân tích đột biến<br /> gen EGFR. Đây là các mẫu mù, gửi cho<br /> tất cả các phòng thí nghiệm đăng ký tham<br /> gia ngoại kiểm, trong đó tình trạng đột<br /> biến gen EGFR xác định trước đó từ một<br /> phòng thí nghiệm chuẩn.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Địa điểm nghiên cứu: Đơn vị Gen Trị<br /> liệu, Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung<br /> bướu - Bệnh viện Bạch Mai.<br /> * Thời gian nghiên cứu: năm 2014 2015.<br /> * Phương pháp nghiên cứu: đối chiếu<br /> kết quả phân tích đột biến EGFR tại Bệnh<br /> viện Bạch Mai với kết quả của các tổ<br /> chức ngoại kiểm.<br /> * Thiết bị, vật tư, hóa chất:<br /> - Thiết bị: thiết bị cơ bản của phòng thí<br /> nghiệm sinh học phân tử như bộ pipet<br /> kèm giá đỡ (Eppendorf Research Plus),<br /> máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5424R),<br /> máy ủ nhiệt kèm lắc rung (Eppendorf<br /> Thermomixer comfort), máy định lượng<br /> ADN theo nguyên tắc huỳnh quang<br /> (Qubit® 2.0 Fluorometer), máy PCR<br /> (Eppendorf Mastercycler pro S)…<br /> - Hóa chất: kít tách ADN từ mô FFPE<br /> (PureLink® Genomic DNA Mini Kit,<br /> Invitrogen), kít định lượng ADN theo<br /> nguyên tắc huỳnh quang (Qubit™ dsDNA<br /> HS, Molecular Probes), kít xác định đột<br /> biến gen EGFR (EGFR StripAssay®,<br /> ViennaLab)…<br /> - Vật tư tiêu hao: vật tư cần thiết được<br /> các hãng uy tín cung cấp: ống PCR; ống<br /> ly tâm 1,7 ml; đầu tip 10, 20, 200, 1.000 µl<br /> (Corning); ống Qubit assay (Invitrogen)…<br /> <br /> * Các bước tiến hành: 29 mẫu bệnh<br /> phẩm được thực hiện xét nghiệm đột biến<br /> EGFR theo quy trình như sau: tách ADN<br /> từ mô FFPE (sử dụng kít PureLink®<br /> Genomic DNA Mini Kit, Hãng Invitrogen),<br /> định lượng ADN (Qubit™ dsDNA HS,<br /> Molecular Probes), khuếch đại đoạn gen<br /> quan tâm bằng phản ứng PCR và lai sản<br /> phẩm khuếch đại với đầu dò đặc hiệu<br /> (EGFR StripAssay®, ViennaLab), phân tích<br /> kết quả (sử dụng phần mềm StripAssay®<br /> Evaluator, ViennaLab).<br /> * Đối chiếu kết quả: kết quả phân tích<br /> được gửi trực tuyến cho EMQN và UK<br /> NEQAS. Sau đó, các tổ chức này sẽ so<br /> sánh kết quả của Bệnh viện Bạch Mai với<br /> kết quả xét nghiệm đã biết trước, từ đó sẽ<br /> phân tích, đánh giá về chất lượng xét<br /> nghiệm EGFR tại Đơn vị Gen Trị liệu,<br /> Bệnh viện Bạch Mai.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả ngoại kiểm của EMQN<br /> năm 2014.<br /> Việc ngoại kiểm tra chất lượng xét<br /> nghiệm có vai trò đặc biệt quan trọng<br /> trong đánh giá khả năng phát hiện đột<br /> biến gen EGFR. Nhằm chuẩn hóa kỹ<br /> thuật, đồng thời xác định tính chính xác<br /> và tính ổn định của xét nghiệm đột biến<br /> gen EGFR, Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện<br /> Bạch Mai đã tham gia các đợt ngoại kiểm<br /> của hai tổ chức kiểm chuẩn chất lượng<br /> xét nghiệm uy tin trên thế giới: EMQN (từ<br /> năm 2014) và UK NEQAS (từ năm 2015).<br /> 49<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017<br /> Bảng 1: Kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên các mẫu kiểm chuẩn EMQN 2014.<br /> Mã bệnh<br /> phẩm<br /> <br /> Chẩn đoán<br /> <br /> Vị trí/phương pháp<br /> lấy mẫu<br /> <br /> Kết quả của<br /> EMQN<br /> <br /> Kết quả phân tích<br /> tại Đơn vị Gen Trị<br /> liệu<br /> <br /> 01.6127774<br /> <br /> UTP (biểu mô<br /> tuyến)<br /> <br /> U thùy trên phổi phải<br /> (phẫu thuật)<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> 02.6130768<br /> <br /> UTP (biểu mô<br /> tuyến)<br /> <br /> Phế quản (sinh thiết)<br /> <br /> Đột biến L858R<br /> (exon 21)<br /> <br /> Đột biến L858R<br /> (exon 21)<br /> <br /> 03.6153218<br /> <br /> UTP (biểu mô<br /> tuyến)<br /> <br /> U thùy trên phổi phải<br /> (phẫu thuật)<br /> <br /> Đột biến G719S<br /> (exon 18)<br /> <br /> Đột biến G719S<br /> (exon 18)<br /> <br /> 04.6126965<br /> <br /> EMQN không<br /> cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung<br /> cấp<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> 05.6127265<br /> <br /> EMQN không<br /> cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung<br /> cấp<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> 06.6130038<br /> <br /> EMQN không<br /> cung cấp<br /> <br /> EMQN khôngcung cấp<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> Không phát hiện<br /> đột biến<br /> <br /> 07.6130241<br /> <br /> EMQN không<br /> cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung<br /> cấp<br /> <br /> Đột biến<br /> E746_A750del<br /> (exon 19)<br /> <br /> Đột biến<br /> E746_A750del<br /> (exon 19)<br /> <br /> 08.6126384<br /> <br /> EMQN không<br /> cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung<br /> cấp<br /> <br /> Đột biến L861Q<br /> (exon 21)<br /> <br /> Đột biến L861Q<br /> (exon 21)<br /> <br /> 09.6161625<br /> <br /> EMQN không<br /> cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung<br /> cấp<br /> <br /> Đột biến L858R<br /> (exon 21)<br /> <br /> Đột biến L858R<br /> (exon 21)<br /> <br /> 10.6161844<br /> <br /> EMQN không<br /> cung cấp<br /> <br /> EMQN không cung<br /> cấp<br /> <br /> Đột biến<br /> E746_A750del<br /> (exon 19)<br /> <br /> Đột biến<br /> E746_A750del<br /> (exon 19)<br /> <br /> Gen EGFR nằm ở nhiễm sắc thể 7p11.2,<br /> dài khoảng 200 kb, chứa 28 exon. Các đột<br /> biến liên quan đến đáp ứng với TKI nằm<br /> trên các exon từ 18 - 21, trong đó các đột<br /> biến thay thế ở exon 18 và 21, mất đoạn<br /> ở exon 19 (chiếm chủ yếu) làm tăng độ<br /> nhạy với thuốc, đột biến thay thế T790M<br /> và một số đột biến thêm đoạn trên exon<br /> 20 (chiếm tỷ lệ nhỏ) liên quan đến kháng<br /> thuốc. Tỷ lệ đột biến EGFR phụ thuộc vào<br /> chủng tộc, tình trạng hút thuốc lá, giới…,<br /> tỷ lệ đột biến EGFR ở người chủng tộc<br /> châu Á cao hơn chủng tộc châu Âu, châu<br /> Mỹ [2, 4].<br /> 50<br /> <br /> Chúng tôi sử dụng kít EGFR StripAssay®<br /> (ViennaLab) để phân tích đột biến gen<br /> EGFR. Đây là kít được thiết kế theo<br /> nguyên tắc PCR kết hợp lai đầu dò đặc<br /> hiệu: giai đoạn PCR sử dụng mồi (primer)<br /> đặc hiệu giúp khuếch đại chính xác với<br /> các trình tự gen quan tâm. Phân tử biotin<br /> được gắn trên mồi nhờ đó cũng đưa vào<br /> sản phẩm khuếch đại. Ở giai đoạn lai,<br /> những đoạn ADN được khuếch đại kết<br /> hợp chính xác với đầu dò (probe) tương<br /> ứng trên teststrip, phân tử biotin gắn<br /> trên những đoạn này được hoạt hoá<br /> bởi streptavidin thành dạng phát màu.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017<br /> Nhờ đó, dễ dàng phát hiện kết quả bằng<br /> cách so màu trên teststrip, đối chiếu với<br /> thang chuẩn bằng mắt thường hoặc<br /> phần mềm StripAssay® Evaluator. Bộ kít<br /> có độ nhạy cao, có khả năng phát hiện<br /> khi số lượng tế bào mang đột biến < 1%,<br /> đồng thời được cấp chứng chỉ tiêu<br /> chuẩn xét nghiệm châu Âu áp dụng cho<br /> chẩn đoán bệnh (European Conformity In Vitro Diagnostics, CE-IVD). Kít EGFR<br /> <br /> StripAssay® có khả năng phát hiện<br /> 16 đột biến, chiếm tỷ lệ cao nhất trên<br /> exon 18 - 21 và có vai trò trong đáp ứng<br /> điều trị với TKI. Hiện nay, chúng tôi<br /> đã chuyển sang sử dụng kít EGFR XL<br /> StripAssay® được cải tiến từ kít EGFR<br /> StripAssay®, trong đó số lượng đột biến<br /> phát hiện cao hơn (30 đột biến trên các<br /> exon 18 - 21) để nâng cao hơn chất lượng<br /> xét nghiệm.<br /> <br /> Kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên 10 mẫu kiểm chuẩn tại Đơn vị Gen Trị<br /> liệu đều cho kết quả chính xác theo công bố của EMQN 2014, đạt tỷ lệ 100%.<br /> <br /> Hình 1: Phân tích kết quả trên thanh teststrip.<br /> (Trên mỗi thanh teststrip có sẵn vạch control cho phản ứng lai, PCR negative control<br /> cho từng exon [vạch 17 - 20] và PCR positive control (vạch 21) làm đối chứng. Các vạch<br /> 1 - 16 tương ứng với 16 đột biến trên 4 exon 18 - 21. Mẫu 01.6127774 [trái] không<br /> phát hiện đột biến, mẫu 02.6130768 [giữa] phát hiện đột biến L858R trên exon 21,<br /> mẫu 03.6153218 [phải] phát hiện đột biến G719S trên exon 18)<br /> 51<br /> <br />