Khảo sát đột biến c.1799T>A của gen BRAF trong ung thư đại - trực tràng bằng kỹ thuật ASO-PCR

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nằm trong con đường truyền tín hiệu tế bào RAS/RAF/MAPK, đột biến gen BRAF gặp trong nhiều loại ung thư khác nhau. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật ASOPCR để phát hiện đột biến c.1799T>A của gen BRAF và ứng dụng kỹ thuật này vào khảo sát đột biến trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát đột biến c.1799T>A của gen BRAF trong ung thư đại - trực tràng bằng kỹ thuật ASO-PCR

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN c.1799T>A CỦA GEN BRAF TRONG UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT ASO-PCR Dương Bích Trâm*, Nguyễn Thế Vinh*, Nguyễn Huỳnh Minh Quân*, Đoàn Thị Phương Thảo**, Hoàng Anh Vũ* TÓM TẮT Mở đầu - mục tiêu: Nằm trong con đường truyền tín hiệu tế bào RAS/RAF/MAPK, đột biến gen BRAF gặp trong nhiều loại ung thư khác nhau. Trong ung thư đại trực tràng (UTĐTT), đột biến BRAF có ý nghĩa tiên lượng cũng như tiên đoán đáp ứng với điều trị bằng kháng thể đơn dòng chống EGFR. Trong số những đột biến của gen BRAF, c.1799T>A là dạng phổ biến nhất. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật ASO- PCR để phát hiện đột biến c.1799T>A của gen BRAF và ứng dụng kỹ thuật này vào khảo sát đột biến trên bệnh nhân UTĐTT. Đối tượng - phương pháp: Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên những mẫu mô UTĐTT không có đột biến gen KRAS và NRAS. DNA được tách chiết từ tế bào u sẽ được giải trình tự gen BRAF để chọn mẫu có mang đột biến c.1799T>A. Tiến hành thực hiện tối ưu hóa phản ứng ASO-PCR để khuếch đại đặc hiệu alen đột biến. Kết quả: Thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại những mẫu có đột biến c.1799T>A. Khảo sát trên 86 mẫu UTĐTT, chúng tôi phát hiện 17 trường hợp có mang đột biến này (19,8%). Kết luận: Trong UTĐTT không đột biến gen KRAS và NRAS, có 19,8% trường hợp mang đột biến c.1799T>A của gen BRAF. Từ khóa: Ung thư đại –trực tràng, BRAF, đột biến. ABSTRACT INVESTIGATION OF THE BRAF c. 1799T>A MUTAION IN COLORECTAL CANCER WITH ASO-PCR Duong Bich Tram, Nguyen The Vinh, Nguyen Huynh Minh Quan, Doan Thi Phuong Thao, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 22 - No 2- 2018: 54 - 58 Background and objectives: Belonging to the RAS/RAF/MAPK cellular signaling pathway, BRAF was mutated in many kinds of human cancers. In coloractal cancer (CRC), BRAF mutation plays a role in prognosis and has been shown to predict response to anti-EGFR therapy. Among BRAF mutations, c.1799T>A is the most common one. This study aimed to establish an ASO-PCR procedure for detection of c.1799T>A mutation and to apply this protocol for investigation of the c.1799T>A in clinical samples. Methods: We investigated BRAF mutational status from CRC samples without mutation in KRAS and NRAS. DNA extracted from tumor cells was sequenced to select a sample with c.1799T>A mutation as a positive control. The optimal procedure of ASO-PCR was established for detecting the mutated allele. Results: Specific primers were successfully designed for detection of c.1799T>A with ASO-PCR. From 86 CRC samples analyzed, we could find 17 samples with the c.1799T>A mutation (19.8%). Conclusion: Among CRC samples without mutations in KRAS and NRAS, 19.8% of the samples had the BRAF c.1799T>A mutation. Keywords: Colorectal cancer, BRAF, mutation * Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM **Bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TPHCM 55 Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ, ĐT: 01222993537 Email: hoangvuxinh@yahoo.com
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 ĐẶT VẤN ĐỀ nucleotide 1799, gây ra thay thế valine thành glutamate và hoạt hoá liên tục MEK, dẫn đến tế Con đường truyền tín hiệu bào tăng sinh quá mức và không còn phụ thuộc RAS/RAF/MAPK rất quan trọng cho sự hình tín hiệu từ EGFR. Nghiên cứu này nhằm xây thành ung thư đại trực tràng (UTĐTT). Các đột dựng quy trình kỹ thuật ASO-PCR (Allele- biến KRAS và NRAS xuất hiện trong khoảng specific oligonucleotide polymerase chain 50% trường hợp UTĐTT và ý nghĩa của chúng reaction) để phát hiện đột biến c.1799T>A của trong việc tiên đoán đáp ứng với điều trị bằng gen BRAF và ứng dụng kỹ thuật này vào khảo kháng thể đơn dòng chống EGFR đã được xác sát đột biến trên bệnh nhân UTĐTT. định rõ ràng. Đột biến KRAS/NRAS dẫn đến kích hoạt liên tục con đường RAS/RAF/MAPK, ĐỐITƯỢNG –PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU là hạ nguồn của thụ thể yếu tố tăng trưởng Đối tượng nghiên cứu biểu mô (EGFR), làm cho những tế bào ung Bệnh nhân UTĐTT được xét nghiệm tìm đột thư kháng lại các liệu pháp chống EGFR(2,10). biến gen KRAS và NRAS để giúp lựa chọn Vì thế, tình trạng đột biến KRAS/NRAS cần những đối tượng phù hợp cho điều trị kháng thể được xác định trên lâm sàng trong quá trình đơn dòng chống EGFR. Chúng tôi tiến hành đánh giá điều trị UTĐTT, đồng thời con đường khảo sát đột biến gen BRAF trên những bệnh RAS/RAF/MAPK trở thành mục tiêu chính để nhân đã được xác định không có đột biến gen phát triển thuốc mới cho điều trị UTĐTT(3,6). KRAS và NRAS. BRAF là một protein khác của con đường Phương pháp nghiên cứu RAS/RAF/MAPK, gần đây đã nổi lên như là Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y một dấu ấn sinh học có ý nghĩa tiên lượng và Sinh học Phân tử – Đại học Y Dược TP.HCM. là một đích phân tử mới hứa hẹn trong điều trị UTĐTT. Các đột biến của gen BRAF xuất hiện Tách chiết genomic DNA từ mẫu mô vùi nến trong khoảng 10% UTĐTT; những người mang Thu hoạch tế bào ung thư từ mô vùi nến sau đột biến BRAF có những đặc điểm lâm sàng và khi đã được chẩn đoán giải phẫu bệnh cho vào tiên lượng khác biệt(15). Hơn nữa, tình trạng đột tube 1,5 ml. Tách chiết genomic DNA bằng biến BRAF được cho là gây ra khoảng 12 - 15% Wizard® Genomic DNA Purification Kit theo trường hơp bệnh nhân thất bại với liệu pháp hướng dẫn của nhà sản xuất. chống EGFR(17). Bởi vì tầm quan trọng ngày Thiết kế mồi cho PCR và sequencing càng tăng của nó, hướng dẫn của Mạng lưới Cặp mồi nhân bản vùng exon 15 của gen Ung thư Quốc gia Mỹ (the National BRAF được thiết kế bằng phần mềm CLC Main Comprehensive Cancer Network) hiện nay Workbench v5.5. Mồi xuôi là BRAF-600F (5’- khuyến cáo nên xét nghiệm đột biến BRAF cho ACTCTTCATAATGCTTGCTC-3’) và mồi những bệnh nhân UTĐTT di căn. ngược là BRAF-600R (5’- Gen sinh ung BRAF mã hóa cho một kinase CCACAAAATGGATCCAGACA-3’). serine/threonine hoạt động phía hạ nguồn của Thiết lập điều kiện PCR KRAS trong con đường RAS/RAF/MAPK. BRAF Mỗi phản ứng (20 µl) bao gồm các thành hoạt động thông qua việc kích hoạt MAPKK phần: 0,2 µl Taq DNA polymerase (5U) của hoặc MEK, do đó thúc đẩy sự tăng sinh tế bào. Takara; 2 µl đệm 10X; 2 µl dNTPs (2,5mM); 1 µl Trong số những đột biến của gen BRAF thì mỗi loại mồi (10 µM); 1,5 µl genomic DNA (100 c.1799T>A (BRAFV600E) là dạng phổ biến nhất, ng/µl) và 12,3 µl H2O. Kỹ thuật PCR được tiến chiếm khoảng 90% tất cả các đột biến của BRAF hành trên máy luân nhiệt Mastercycler@Pro S được tìm thấy trong UTĐTT(1,14). Đây là đột biến (Eppendorf, Đức) với chu trình nhiệt như sau: do chuyển đổi thymidine thành adenine tại vị trí 56
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học khởi đầu phản ứng ở 98oC trong 3 phút, theo sau KẾT QUẢ bằng 40 chu kỳ (98oC trong 10 giây, 58oC trong Phát hiện đột biến c.1799T>A bằng giải trình tự 20 giây, 72oC trong 40 giây) và kết thúc ở 72oC Sanger trong 5 phút. Các phản ứng luôn kèm theo một Các đột biến BRAF và KRAS/NRAS có tính chứng âm không chứa DNA để kiểm soát ngoại loại trừ lẫn nhau trong UTĐTT, nghĩa là không nhiễm. cùng xuất hiện trong một tế bào ung thư(8,14). Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di Điều này ủng hộ rằng BRAF là nhân tố tác động Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di chủ yếu của KRAS/NRAS trong con đường trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium RAS/RAF/MAPK và cả hai đột biến đều có ảnh bromide và quan sát dưới hệ thống chụp gel hưởng tương đương với nhau trong sự hình GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ). thành khối u. Để thiết kế và chuẩn hóa được Tinh sạch sản phẩm PCR phản ứng ASO-PCR giúp phát hiện đột biến Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit BRAF, trước tiên chúng tôi tiến hành tìm kiếm ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Thermo mẫu chứng dương có mang đột biến c.1799T>A Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. của gen BRAF bằng cách giải trình tự DNA theo kỹ thuật Sanger. Dùng cặp mồi BRAF-600F và Thực hiện giải trình tự BRAF-600R, chúng tôi khuếch đại một phần Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được exon 15 của gen BRAF từ DNA được tách chiết thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye từ mẫu bệnh phẩm. Hình 1 minh họa kết quả Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied phát hiện đột biến c.1799T>A. Biosystems, Mỹ), theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi đoạn cần đọc. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di foemamide, biến tính ở 95oC trong 2 phút trước khi làm lành đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench v5.5. Thiết kế mồi cho ASO-PCR Chúng tôi thiết kế đoạn mồi xuôi BRAF- ASOF đặc hiệu cho alen mang đột biến Hình 1. Đột biến c.1799T>A của gen BRAF được c.1799T>A của gen BRAF như sau: 5’- phát hiện bằng giải trình tự DNA theo kỹ thuật GATTTTGGTCTAGCTACGGA-3’. Trong mồi Sanger. BRAF-ASOF, vị trí nucleotide đầu tiên của đầu tận 3’ đã được thay thế từ T sang A. Đồng thời, Chuẩn hóa điều kiện ASO-PCR để tăng tính đặc hiệu của mồi, vị trí nucleotide Sau khi đã có chứng dương mang đột biến thứ 3 của đầu tận 3’ cũng đã được thay thế từ c.1799T>A, chúng tôi tiến hành chuẩn hoá điều A sang G(12). Mồi ngược cho phản ứng ASO- kiện ASO-PCR để phát hiện đột biến này. Trong PCR là BRAF-R (5’- phản ứng ASO-PCR chúng tôi sử dụng cùng lúc GTAACTCAGCAGCATCTCAG-3’). Các đoạn 2 cặp mồi. Cặp mồi thứ nhất dùng để kiểm tra mồi được tổng hợp bởi Integrated DNA chất lượng DNA cũng như hiệu quả phản ứng Technologies (Mỹ). PCR cho mỗi lần chạy: cặp mồi này khuếch đại exon 13 của gen RB1 (394 bp), với mồi xuôi là 5’- CAGTAGTTGTGGTTACCTAG-3’ và mồi 57
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 ngược là 5’-CAGCAGGGATATAGTATCTG-3’. ra, các đột biến BRAF liên quan chặt chẽ với sự Cặp mồi trên có nhiệt độ bắt cặp tương tự cặp bất ổn định vi vệ tinh. Trong UTĐTT không di mồi BRAF-ASOF và BRAF-R (143 bp) dùng để truyền, đột biến BRAF được tìm thấy trong phát hiện đặc hiệu alen có mang đột biến khoảng 60% khối u có bất ổn định vi vệ tinh cao c.1799T>A của gen BRAF. và chỉ gặp trong 5 – 10% khối u ổn định vi vệ Thông qua quá trình chuẩn hóa điều kiện, tinh(4,7,14). Điều này là do đột biến BRAFV600E gây chúng tôi thiết lập được điều kiện nhiệt độ bắt ra sự methyl hóa quá mức vùng khởi động gen cặp thích hợp nhất ở 540C. Hình 2 minh họa kết MLH1, dẫn đến mất chức năng ức chế khối u và quả ASO-PCR thực hiện trên các mẫu có hoặc khiếm khuyết trong sửa sai bắt cặp DNA(8,19). không có đột biến c.1799T>A. Về kiểu hình, các UTĐTT có đột biến BRAF thể hiện các đặc điểm khác với UTĐTT có BRAF bình thường. Các khối u có đột biến BRAF thường gặp hơn ở bệnh nhân nữ và những bệnh nhân cao tuổi, nhất là >70 tuổi(9,11,17). Ung thư không có đột biến BRAF thì phân bố khắp nơi ở đại tràng và trực tràng; trong khi đó, ung thư với BRAF đột biến hiếm khi xảy ra ở đại tràng trái và Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm ASO-PCR. Giếng trực tràng, nhưng thay vào đó chủ yếu nằm ở 1: chứng âm, không mang đột biến c.1799T>A của đại tràng gần(9,18). gen BRAF. Giếng 2 và 3: các mẫu có đột biến Bệnh nhân UTĐTT có đột biến BRAF c.1799T>A của gen BRAF. Giếng 4: nước. Giếng 5: 1 thường đáp ứng kém đối với các liệu pháp quy kb Plus DNA ladder. ước và có thời gian sống còn toàn bộ ngắn. Kết quả khảo sát đột biến trên mẫu bệnh nhân Samowitz và cộng sự(16) khảo sát 911 bệnh nhân ở các giai đoạn từ I đến IV của ung thư Ứng dụng kỹ thuật ASO-PCR đã được xây đại tràng. Đột biến BRAF được tìm thấy ở 9,3% dựng ở trên, chúng tôi tiến hành khảo sát đột tất cả các khối u và 52% khối u có bất ổn định biến trên 86 bệnh phẩm UTĐTT: bao gồm 57 vi vệ tinh cao. Thời gian sống còn toàn bộ 5 bệnh nhân nam và 29 nữ. Kết quả phát hiện 17 năm của bệnh nhân UTĐTT có đột biến BRAF trường hợp có đột biến, chiếm 19,8%. thấp hơn đáng kể so với nhóm không có đột BÀN LUẬN biến (47,5% so với 60,7%). Có nhiều con đường dẫn đến phát sinh Đột biến KRAS là một dấu ấn sinh học đã UTĐTT. Con đường điển hình từ u tuyến đến được xác định rõ giúp tiên đoán sự đề kháng carcinôm thường đi kèm với sự mất chức năng với liệu pháp chống EGFR trong UTĐTT. Gen các gen ức chế khối u như APC và/hoặc P53, dẫn sinh ung KRAS làm cho các khối u đại trực đến sự bất ổn định nhiễm sắc thể. Con đường tràng kháng lại liệu pháp chống EGFR bằng thứ hai liên quan đến mất chức năng các gen sửa cách hoạt hóa con đường RAS/RAF/MAPK hạ lỗi bắt cặp sai DNA, được minh họa bằng các đột nguồn của EGFR. Một số nghiên cứu đã cho biến dòng mầm trong hội chứng Lynch. BRAF thấy rằng đột biến BRAF cũng mang lại kết dường như tác động thông qua con đường thứ quả kém với liệu pháp chống EGFR thông qua ba: con đường tăng methyl hoá. một cơ chế tương tự(5,13). Các khối u mang đột biến BRAF được xem là một thể bệnh rất riêng biệt. Ung thư có mang đột KẾT LUẬN biến BRAF thường có tình trạng methyl hóa cao Kỹ thuật ASO-PCR giúp phát hiện đột biến so với ung thư không có đột biến BRAF. Ngoài c.1799T>A của gen BRAF một cách nhanh chóng 58
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học và chính xác. Trong nhóm bệnh nhân UTĐTT 11. Li WQ, Kawakami K, Ruszkiewicz A, et al (2006). BRAF mutations are associated with distinctive clinical, pathological không bị đột biến gen KRAS và NRAS, có đến and molecular features of colorectal cancer independently of 19,8% mang đột biến c.1799T>A của gen BRAF. microsatellite instability status. Mol Cancer;5:2. 12. Liu J, Huang S, Sun M, Liu S, Liu Y, et al (2012). An improved TÀI LIỆU THAM KHẢO allele-specific PCR primer design method for SNP marker 1. Beeram M, Patnaik A, Rowinsky EK (2005). Raf: a strategic analysis and its application. Plant Methods;8(1):34. target for therapeutic development against cancer. J Clin 13. Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, Vincenzi B, Salvatore L, et Oncol;23(27):6771-90. al (2009). KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict 2. Chang DZ, Kumar V, Ma Y, Li K, Kopetz S (2009). resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and Individualized therapies in colorectal cancer: KRAS as a 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J marker for response to EGFR-targeted therapy. J Hematol Cancer;101(4):715-21. Oncol;2:18. 14. Rajagopalan H, Bardelli A, Lengauer C, et al (2002). 3. Cohen SJ, Cohen RB, Meropol NJ (2005). Targeting signal Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair transduction pathways in colorectal cancer-more than skin status. Nature;418(6901):934. deep. J Clin Oncol;23(23):5374-85. 15. Safaee Ardekani G, Jafarnejad SM, Tan L, Saeedi A, Li G 4. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, et al (2012). The prognostic value of BRAF mutation in colorectal (2002). Mutations of the BRAF gene in human cancer. cancer and melanoma: a systematic review and meta-analysis. Nature;417(6892):949-54. PLoS One;7(10):e47054. 5. Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, Sartore-Bianchi A, 16. Samowitz WS, Sweeney C, Herrick J, et al (2005). Poor Arena S, et al (2008). Wild-type BRAF is required for response survival associated with the BRAF V600E mutation in to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. microsatellite-stable colon cancers. Cancer Res;65(14):6063-9. J Clin Oncol;26(35):5705-12. 17. Tie J, Gibbs P, Lipton L, Christie M, Jorissen RN, et al (2011). 6. Fang JY, Richardson BC (2005). The MAPK signalling Optimizing targeted therapeutic development: analysis of a pathways and colorectal cancer. Lancet Oncol;6(5):322-7. colorectal cancer patient population with the BRAF(V600E) 7. Fransén K, Klintenäs M, Osterström A, Dimberg J, Monstein mutation. Int J Cancer;128(9):2075-84. HJ, Söderkvist P (2004). Mutation analysis of the BRAF, ARAF 18. Tran B, Kopetz S, Tie J, et al (2011). Impact of BRAF mutation and RAF-1 genes in human colorectal adenocarcinomas. and microsatellite instability on the pattern of metastatic Carcinogenesis;25(4):527-33. spread and prognosis in metastatic colorectal cancer. 8. French AJ, Sargent DJ, Burgart LJ, et al (2008). Prognostic Cancer;117(20):4623-32. significance of defective mismatch repair and BRAF V600E in 19. Wang L, Cunningham JM, Winters JL, et al (2003). BRAF patients with colon cancer. Clin Cancer Res;14(11):3408-15. mutations in colon cancer are not likely attributable to 9. Kalady MF, Dejulius KL, Sanchez JA, et al (2012). BRAF defective DNA mismatch repair. Cancer Res;63(17):5209-12. mutations in colorectal cancer are associated with distinct clinical characteristics and worse prognosis. Dis Colon Rectum;55(2):128-33. Ngày nhận bài báo: 10/11/2017 10. Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, et al (2008). K-ras Ngày phản biện nhận xét bài báo: 11/11/2017 mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med;359(17):1757-65. Ngày bài báo được đăng: 10/03/2018 59