Khảo sát đột biến FLT3-ITD bằng kỹ thuật Delta-PCR

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Khảo sát đột biến FLT3-ITD bằng kỹ thuật Delta-PCR” trên người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy để hoàn thiện quy trình xác định các dòng đột biến gen FLT3-ITD và đánh giá khả năng ứng dụng để chẩn đoán và theo dõi sau điều trị.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát đột biến FLT3-ITD bằng kỹ thuật Delta-PCR

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN FLT3-ITD BẰNG KỸ THUẬT DELTA-PCR Châu Thúy Hà1, Cao Văn Động1, Phù Chí Dũng1, Phan Thị Xinh2 TÓM TẮT 29 SUMMARY Mục tiêu: Triển khai kỹ thuật Delta-PCR DETECTING FLT3-ITD MUTATIONS trong khảo sát đột biến FLT3-ITD. BY USING DELTA-PCR TECHNIQUE Đối tượng: Mẫu người bệnh có 2 đột biến Objectives: To perform Delta-PCR technique FLT3-ITD đã chẩn đoán bằng kỹ thuật tạo dòng in detecting FLT3-ITD mutations. T-vector phối hợp với kỹ thuật giải trình tự Subjects: Patient samples with 2 types of Sanger. FLT3-ITD mutations were diagnosed by T- Phương pháp nghiên cứu: Mô tả triển khai vector cloning associated with Sanger kỹ thuật mới. sequencing. Kết quả: Chúng tôi đã thành công ứng dụng Method: Prospective case series. Delta-PCR (Polemerase Chain Reaction: phản Results: We have successfully applied Delta- ứng khuếch đại chuỗi) để khảo sát đột biến PCR technique in detecting FLT3-ITD FLT3-ITD (Fms Related Receptor Tyrosine mutations. The size of ITDs identified by Delta Kinase 3-internal tandem duplication: đột biến PCR in all of 4 patients were similar to the lặp đoạn gen FLT3). Kích thước đoạn chèn xác results of cloning and Sanger sequencing định bằng kỹ thuật Delta PCR ở cả 4 người bệnh techniques. This method could identify FLT3- đều hoàn toàn phù hợp với kỹ thuật tạo dòng và ITD mutant clones and determine FLT3 allel giải trình tự Sanger. Kỹ thuật này có thể định ratio with limit of detection as low as 0.1%. danh các dòng và xác định tỉ lệ các dòng đột biến Conclusion: Delta-PCR could detect FLT3- FLT3-ITD với giới hạn phát hiện thấp đến 0,1%. ITD mutant clones at low level, so it will be Kết luận: Kỹ thuật này ưu thế trong việc xác useful device in monitoring mesurable disease định các dòng minor, là công cụ tiềm năng trong postreatment. ứng dụng theo dõi tồn lưu tế bào ác tính mang Keywords: FLT3-ITD, Delta-PCR. đột biến FLT3-ITD. Từ khóa: FLT3-ITD, Delta-PCR . I. ĐẶT VẤN ĐỀ Đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu cho phép đánh giá đáp ứng điều trị, phát hiện sớm các đợt tái phát, từ đó có thể xác định những 1 Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học người bệnh cần tái điều trị sớm hay thay đổi 2 Đại Học Y dược TPHCM phác đồ điều trị. Một trong những đột biến Chịu trách nhiệm chính: Châu Thúy Hà gen xuất hiện với tần suất cao trong bạch cầu SĐT: 0939.162.969 cấp dòng tủy là FLT3-ITD. Do đó, có thể Email: drthuyha@gmail.com dùng đột biến này như một chỉ điểm để theo Ngày nhận bài: 01/8/2022 dõi tồn lưu tế bào ác tính. FLT3-ITD còn tồn Ngày phản biện khoa học: 01/8/2022 lưu tại thời điểm dị ghép tế bào gốc dự báo Ngày duyệt bài: 15/9/2022 nguy cơ tái phát cao hơn có ý nghĩa thống kê 257
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU so với nhóm mất FLT3-ITD trước ghép [1]. - Thực hiện phản ứng khuếch đại chuỗi Tuy nhiên, đột biến FLT3-ITD thường không bằng Takara Taq (Mỹ) với 1 mồi xuôi và 2 ổn định, ở thời điểm tái phát, đột biến này có mồi ngược, các mồi tự thiết kế và điều kiện thể biến mất hoặc biểu hiện 1 kiểu lặp đoạn bắt cặp mồi sẽ được thử ở 58oC, 60oC và khác với ban đầu [2]. Mặt khác, đột biến 62oC. FLT3-ITD có thể biểu hiện nhiều dòng lúc - Điện di mao quản bằng máy 3500, ghi chẩn đoán, chính những dòng minor này nhận kích thước và diện tích các đỉnh đặc không được phát hiện bởi kỹ thuật giải trình hiệu. tự, có thể kháng với điều trị và gây nên tình Các bước tiến hành nghiên cứu trạng tái phát [3]. - Thử điều kiện phối hợp và bắt cặp Sự đa dòng cũng như tính biến thiên mồi trên 1 mẫu người bệnh có 2 đột biến dòng đột biến FLT3-ITD đòi hỏi cần có 1 kỹ FLT3-ITD đã xác định bằng giải trình tự thuật đủ nhạy và đặc hiệu để khảo sát đầy đủ Sanger. các dòng đột biến FLT3-ITD ở thời điểm - So sánh kết quả định danh đoạn chèn chẩn đoán, đồng thời, có thể theo dõi động với kỹ thuật tạo dòng phối hợp giải trình tự học của các dòng này sau điều trị. Do đó, Sanger trên 4 mẫu người bệnh có 2 đột biến chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo FLT3-ITD. sát đột biến FLT3-ITD bằng kỹ thuật Delta- - Xác định giới hạn phát hiện trên các PCR” trên người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mẫu có tỉ số alen FLT3-ITD/WT ở các mức để hoàn thiện quy trình xác định các dòng 5%, 3%, 1%, 0,1% đột biến gen FLT3-ITD và đánh giá khả năng Thu thập và xử lý số liệu ứng dụng để chẩn đoán và theo dõi sau điều Dữ liệu giải trình tự sau khi phân tích trị. bằng phần mềm GeneMapper được chúng tôi tiến hành tổng hợp và báo cáo số liệu. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nghiên cứu: III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Mẫu người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Dựa trên tham khảo bài báo của Arab và đã được chẩn đoán có đột biến FLT3-ITD cộng sự [4], chúng tôi đã thiết kế một số mồi bằng kỹ thuật Sanger hoặc kỹ thuật tạo dòng dùng trong phản ứng này với trình tự T-vector F1: 5’-TGCAGAACTGCCTATTCC-3’, F2: Địa điểm và thời gian nghiên cứu 5’-GCCTATTCCTAACTGACT-3’, Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại R1:5’-6FAM-CCTGGATTGAGACTCCTGTTTTG- Khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện 3’; R2:5’-6FAM-GCTGTCCTTCCACTATACTGT- Truyền máu Huyết học. 3’;R3:5’-6FAM-AGAGAAGAAGGCATGGGTGGG- Thời gian: Từ 10/2021 đến 4/2022 3’, các mồi F1 và F2 ở intron 13, mồi R1, R2 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu triển và R3 ở intron 15. Thử điều kiện phản ứng khai kỹ thuật mới PCR trên 1 mẫu DNA của người bệnh 14354 Kỹ thuật Delta-PCR gồm các bước như có 2 kiểu đột biến FLT3-ITD là sau: c.1815_1816ins36bp và c.1832_1833ins57bp - Ly trích DNA từ 200 uL mẫu tủy xương đã được xác định trước bằng giải trình tự chứa trong ống EDTA với kit Promega (Mỹ). Sanger, với sự phối hợp các mồi với kích 258
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 thước băng FLT3-WT mục tiêu là (1) F1/R1 bp); (6) F2/R2 (388 bp), F2/R3 (443 bp). (354 bp), F1/R2 (398 bp); (2) F1/R1 (354 Thực hiện PCR với 3 điều kiện nhiệt độ bắt bp), F1/R3 (453 bp); (3) F1/R2 (398 bp), cặp mồi lần lượt là A: 58oC, B: 62oC, C: F1/R3 (453 bp); (4) F2/R1 (344 bp), F2/R2 60oC. Chúng tôi thu được sản phẩm PCR (388 bp); (5) F2/R1 (344 bp), F2/R3 (443 như hình 1. Hình 1. Kết quả điện di trên thạch các sản phẩm thử điều kiện Kết quả cho thấy với sự phối hợp mồi F2 và R1 + R2 (4); F2 và R1 + R3 (5) ở nhiệt độ bắt cặp của mồi 62oC (B) và 60oC (C), phản ứng PCR tạo 2 sản phẩm FLT3-WT có hình ảnh điện di cho 2 băng rõ, đậm đều. Tiếp tục đem các sản phẩm 4B, 4C, 5B, 5C điện di mao quản, chúng tôi thu được kết quả như hình 2. Hình 2. Kết quả điện di mao quản các sản phẩm thử điều kiện Chúng tôi nhận thấy ở sự phối hợp 5B, 2 đỉnh sản phẩm FLT3-WT có kích thước tương đối đều nhau, do đó chúng tôi chọn sự phối hợp mồi F2 và R1 + R3 với nhiệt độ bắt cặp là 62oC. 259
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Định danh các dòng và xác định tỉ lệ các dòng đột biến FLT3-ITD. Thực hiện Delta PCR với điều kiện đã chuẩn hóa như trên cho 4 mẫu người bệnh có 2 kiểu đột biến FLT3-ITD đã xác định bằng kỹ thuật tạo dòng T-vector phối hợp giải trình tự Sanger, chúng tôi ghi nhận kết quả như bảng 1. Bảng 1. So sánh kết quả thu được bằng Delta PCR so với phương pháp tạo dòng và giải trình tự Sanger Mã NB Delta PCR Tạo dòng + Sanger FLT3-WT FLT3-WT 10045 FLT3-ITD1 ins18bp FLT3-ITD1 c.1800_1801ins18bp FLT3-ITD2 ins60bp FLT3-ITD2 c.1803_1804ins60bp FLT3-WT FLT3-WT 10877 FLT3-ITD1 ins24bp FLT3-ITD1 c.1818_1819ins24bp FLT3-ITD2 ins69bp FLT3-ITD2 c.1824_1825ins69bp FLT3-WT FLT3-ITD1 ins21bp FLT3-WT FLT3-ITD2 ins24bp 12196 FLT3-ITD1 c.1770_1771ins21bp FLT3-ITD3 ins27bp FLT3-ITD2 c.1842_1843ins63bp FLT3-ITD4 ins60bp FLT3-ITD5 ins63bp FLT3-WT FLT3-WT 12295 FLT3-ITD1 ins21bp FLT3-ITD1 c.1794_1795ins21bp FLT3-ITD2 ins81bp FLT3-ITD2 c.1827_1828ins81bp Như vậy, so với phương pháp tạo dòng và giải trình tự Sanger, kỹ thuật Delta PCR cho kết quả định dòng đột biến tương đồng, tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là không cho biết vị trí chèn đoạn. Trong trường hợp người bệnh 12196, Delta PCR ghi nhận thêm 3 dòng minor khác là chèn đoạn 24, 27 và 60 bp với khoảng delta đặc hiệu, điều này không phát hiện được bằng Sanger. Mặt khác, với Delta PCR, chúng tôi có thể xác định tỉ số FLT3-ITD/ FLT3-WT dựa trên tỉ số diện tích đỉnh như hình 3. 260
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Hình 3. Kết quả Delta PCR của 4 người bệnh trong nghiên cứu Xác định giới hạn phát hiện của kỹ mỗi mức nồng độ này, để khảo sát giới hạn thuật Delta-PCR trong khảo sát đột biến phát hiện của Delta-PCR. Nếu có từ 95% số FLT3-ITD lần khảo sát trở lên cho kết quả dương tính Mẫu người bệnh có 1 kiểu đột biến thì giới hạn phát hiện đó được xác nhận. Kết FLT3-ITD dị hợp tử sẽ dùng phương pháp quả ghi nhận được Delta-PCR có thể theo dõi tạo dòng T-vector để tạo 2 dòng tế bào mang tồn lưu đến mức tỉ số alen là 0,1%. kiểu gen FLT3-ITD và FLT3-WT. Ly trích DNA FLT3-ITD và FLT3-WT từ plasmid IV. BÀN LUẬN của các dòng này. Tính số bản sao FLT3-ITD Với sự phối hợp mồi F2 và R1 + R3 và FLT3-WT thu nhận được. Sau đó chúng trong điều kiện phản ứng PCR có nhiệt độ tôi pha loãng FLT3-ITD và FLT3-WT theo bắt cặp là 62oC, chúng tôi thu được 2 đỉnh các mức tỉ số alen 5%, 3%, 1%, 0,1%. Phản FLT3-WT, 2 đỉnh FLT3-ITD1 và 2 đỉnh ứng Delta-PCR sẽ thực hiện lặp lại 20 lần ở FLT3-ITD2 với diện tích các cặp đỉnh tương 261
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU đồng nhau, không có sự xuất hiện các đỉnh FLT3-ITD, đặc biệt ưu thế trong việc xác sản phẩm không đặc hiệu, các kiểu FLT3- định các dòng minor, là công cụ tiềm năng ITD đồng nhất với kiểu chèn đoạn đã được giúp theo dõi tồn lưu tế bào ác tính mang đột xác định bằng phương pháp tạo dòng T biến FLT3-ITD. vector phối hợp giải trình tự Sanger. Điều này cho thấy sự phối hợp mồi và điều kiện TÀI LIỆU THAM KHẢO bắt cặp phù hợp để đạt hiệu suất PCR mong 1. Helbig, G., et al., Pre-transplant FLT3/ITD muốn. Nhiệt độ bắt cặp trong nghiên cứu của status predicts outcome in FLT3-mutated chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của acute myeloid leukemia following allogeneic Arab và cộng sự [4]. Điều đáng lưu ý là quy stem cell transplantation. Annals of trình thực hiện kỹ thuật này đơn giản và hematology, 2020. 99(8): p. 1845-1853. nhanh hơn nhiều so với quy trình tạo dòng và 2. Warren, M., et al., Clinical impact of giải trình tự. Do đó có thể triển khai dễ dàng change of FLT3 mutation status in acute ở các phòng xét nghiệm, đồng thời đạt lợi ích myeloid leukemia patients. Modern về hiệu quả và chi phí cho người bệnh. Tuy Pathology, 2012. 25(10): p. 1405-1412. nhiên, mặt hạn chế của kỹ thuật này là không 3. Ding, L., et al., Clonal evolution in relapsed xác định được vị trí chèn đoạn. Điều này acute myeloid leukaemia revealed by whole- cũng tương đồng với nghiên cứu của Arab và genome sequencing. Nature, 2012. cộng sự [4]. Dù vậy, kỹ thuật này có thể cho 481(7382): p. 506-510. biết diện tích đỉnh, nhờ đó có thể xác định tỉ 4. Arab, M., et al., Comparison of Delta-PCR số alen đồng thời. Điểm ưu thế vượt trội của and Conventional Fragment Analysis for the kỹ thuật Delta là xác định các dòng minor Detection of FLT3-ITD Mutations in Paired của người bệnh, tương tự trường hợp 12196, Diagnosis-Relapse Samples of Patients with Delta khảo sát được thêm 3 dòng đột biến Acute Myeloid Leukemia. JOURNAL OF FLT3-ITD minor trong khi kỹ thuật Sanger ADVANCES IN MEDICAL AND không thể khảo sát được. Chính các dòng BIOMEDICAL RESEARCH, 2019. 27(123): này có thể trở nên nổi trội khi tái phát [5]. p. 38-44. Chúng tôi nhận thấy Delta-PCR có thể 5. Beierl, K., et al., Detection of minor clones khảo sát đột biến FLT3-ITD với tỉ số alen with internal tandem duplication mutations khoảng 0,1%. Các nghiên cứu cho thấy kỹ of FLT3 gene in acute myeloid leukemia thuật này nhạy và đặc hiệu hơn kỹ thuật using delta-PCR. Diagn Mol Pathol, 2013. fragment tiêu chuẩn, ưu thế trong việc xác 22(1): p. 1-9. định dòng minor ở thời điểm chẩn đoán và 6. Lee, G., et al., Fragment Analysis for theo dõi sau điều trị [4]. Fragment có thể Detection of the FLT3 -Internal Tandem khảo sát đến tỉ số alen từ 3-5% trong khi Duplication: Comparison with Conventional Sanger chỉ xác định được khi tỉ số alen đột PCR and Sanger Sequencing. Laboratory biến cao hơn, từ 10-20% [6]. Medicine Online, 2017. 7: p. 13. V. KẾT LUẬN Kỹ thuật Delta-PCR có thể định danh các dòng và xác định tỉ lệ các dòng đột biến 262