Khảo sát đột biến gen BCR/ABL kháng mạnh với imatinib bằng kỹ thuật ASO‐PCR tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013<br /> <br /> KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL KHÁNG MẠNH VỚI IMATINIB <br /> BẰNG KỸ THUẬT ASO‐PCR TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC <br /> Phạm Thị Mỹ Hạnh*, Phan Thị Xinh** <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật ASO‐PCR khảo sát 6 kiểu đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, <br /> T315I của tổ hợp gen BCR/ABL gây kháng mạnh với imatinib (IM) trên bệnh nhân (BN) bạch cầu mạn dòng tủy <br /> (BCMDT). <br /> Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu thực hiện trên 30 mẫu tủy xương của BN BCMDT kháng IM tại <br /> Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng 01/2012 đến 05/2013 có chỉ định tìm đột biến BCR‐ABL kháng IM <br /> bằng kỹ thuật giải trình tự DNA. Đồng thời, xây dựng điều kiện kỹ thuật ASO‐PCR với 6 cặp mồi chuyên biệt <br /> của 6 kiểu đột biến và chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho từng cặp mồi để khảo sát đột biến cho 30 mẫu BN trên. <br /> Kết quả: Sau khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp cho từng cặp mồi chuyên biệt, chúng tôi đã xác định được nhiệt <br /> độ  tối  ưu  cho  phản  ứng  ASO‐PCR  đối  với  6  kiểu  đột  biến  gen  BCR/ABL  kháng  mạnh  với  IM  là  G250E  và <br /> Y253H ở 650C, Y253F ở 550C, E255K và E255V ở 680C, và T315I ở 630C. Đồng thời, kết quả khảo sát 6 kiểu đột <br /> biến trên 30 BN BCMDT kháng IM bằng kỹ thuật ASO‐PCR phát hiện 17 lượt đột biến trên 15 BN so với 15 <br /> lượt đột biến trên 14 BN bằng giải trình tự chuỗi DNA, cho thấy kỹ thuật ASO‐PCR có độ nhạy cao hơn so với <br /> giải trình tự chuỗi DNA.  <br /> Kết luận: Xây dựng thành công kỹ thuật ASO‐PCR khảo sát 6 kiểu đột biến thường gặp, kháng mạnh với <br /> IM giúp các bác sĩ lâm sàng quyết định hướng điều trị phù hợp cho BN. Ngoài ra, ASO‐PCR là kỹ thuật đơn <br /> giản, hiệu quả có thể triển khai rộng rãi ở các Bệnh viện có chuyên khoa huyết học để chẩn đoán đột biến điểm <br /> BCR/ABL đã biết. <br /> Từ khóa: bạch cầu mạn dòng tủy, đột biến kháng imatinib, ASO‐PCR. <br /> <br /> ABSTRACT <br /> DETECTION OF BCR/ABL MUTATIONS WHICH STRONGLY RESIST TO IMATINIB USING ASO‐<br /> PCR AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL <br /> Pham Thi My Hanh, Phan Thi Xinh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 200 - 204 <br /> Objective:  Using  ASO‐PCR  to detect  the 6 types  (Y253F,  Y253H, E255K,  E255V,  T315I)  of BCR/ABL <br /> mutation which strongly resist to Imatinib (IM) in chronic myeloid leukemia (CML). <br /> Methods:  This  study  was  performed  in  30  IM‐resistant  CML  patients  which  were  analyzed  BCR/ABL <br /> mutations by direct sequencing at Blood transfusion and Hematology hospital from January 2012 to May 2013. <br /> ASO‐PCR conditions were established to dectect the 6 types of BCR/ABL mutation strong resistance to IM. <br /> Results: By adjusting primer annealing temperature, we determined optimal primer annealing temperature <br /> for ASO‐PCR to dectect the 6 types of BCR/ABL mutation (G250E and Y253H at 650C, Y253F at 550C, E255K <br /> and  E255V  at  680C,  and  T315I  at  630C).  Concomitantly,  the  results  of  detecting  the  6  types  of  BCR/ABL <br /> mutation  in  30  patients  showed  that  there  were  17  mutations  in  15  patients  by  using  ASO‐PCR  and  15 <br /> mutations in 14 patients by using direct sequencing. These results indicate that ASO‐PCR is more sensitive than <br /> direct sequencing technique. <br /> Conclusion:  Successful  development  of  ASO‐PCR  procedure  for  detecting  the  6  types  of  BCR/ABL <br /> * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh  ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh <br /> Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh <br />  ĐT: 0932.728.115 <br />  Email: phanthixinh@yahoo.com <br /> <br /> 200<br /> <br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> mutation helps the doctors in selecting suitable therapy regiment for patient. Moreover, ASO‐PCR is simple and <br /> effective  technique  which  can  apply  for  detecting  the  known  BCR/ABL  kinase  domain  mutations  in  other <br /> hematology hospitals. <br /> Keywords: chronic myeloid leukemia, mutations resistance to Imatinib, ASO‐PCR <br /> trường hợp mang đột biến kháng mạnh với IM <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> thường gặp. <br /> Khoảng 20% đến 30% bệnh nhân (BN) bạch <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> cầu  mạn  dòng  tủy  (BCMDT)  được  phát  hiện <br /> kháng  imatinib  (IM)  sau  khi  điều  trị  với  thuốc <br /> Đối tượng nghiên cứu <br /> một thời gian. Các cơ chế kháng IM đã được mô <br /> Nghiên cứu được tiến hành trên 30 mẫu tủy <br /> tả  mà  nguyên  nhân  chủ  yếu  là  do  những  đột <br /> xương của BN BCMDT kháng IM tại BV.TMHH <br /> biến trên ABL kinase domain (chiếm tới 30 ‐ 90% <br /> TP.HCM  từ  tháng  01/2012  đến  05/2013  có  chỉ <br /> các  BN  kháng  IM)  và  tăng  biểu  hiện  do  sự <br /> định  tìm  đột  biến  BCR/ABL  kháng  IM  bằng  kỹ <br /> khuếch đại của gen BCR/ABL(2,4). Do đó, khảo sát <br /> thuật giải trình tự chuỗi DNA. <br /> các đột biến vùng kinase trên BCR/ABL là yếu tố <br /> Phương pháp nghiên cứu <br /> quan trọng giúp quyết định hướng điều trị cho <br /> Thiết kế nghiên cứu <br /> BN BCMDT kháng IM. <br /> Mô tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới. <br /> Từ  năm  2010  đến  năm  2012,  tại  Bệnh  viện <br /> Truyền  máu  Huyết  học  (BV.TMHH)  TP.HCM, <br /> chúng tôi đã khảo sát 103 BN BCMDT kháng IM <br /> bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA(3). Kết quả <br /> nghiên  cứu  cho  thấy  có  46,6%  BN  mang  đột <br /> biến, trong đó các kiểu đột biến thường gặp gây <br /> kháng  mạnh  với  IM  là  G250E,  Y253F,  Y253H, <br /> E255K,  E255V,  E279K,  T315I  (23/103  =  22,3%). <br /> Việc phát hiện các đột biến gây kháng mạnh này <br /> giúp các bác sĩ quyết định ngừng sử dụng IM và <br /> đưa ra lựa chọn điều trị khác thích hợp cho BN.  <br /> Mặc  dù  kỹ  thuật  giải  trình  tự  chuỗi  DNA <br /> phù  hợp  để  khảo  sát  tất  cả  các  kiểu  đột  biến <br /> BCR/ABL gây kháng IM nhưng đòi hỏi phải có <br /> đủ  trang  thiết  bị  hiện  đại,  đắt  tiền,  nhân  lực <br /> được đào tạo tốt có thể phân tích đột biến nên <br /> khó triển khai rộng rãi. Trong khi đó, kỹ thuật <br /> ASO‐PCR có độ nhạy và tính chuyên biệt cao, <br /> có  thể  sử  dụng  để  phát  hiện  nhanh  các  đột <br /> biến đã biết kháng mạnh với IM sử dụng trang <br /> thiết  bị  đơn  giản  như  máy  luân  nhiệt  và  kỹ <br /> thuật viên có thể thực hiện được nếu quy trình <br /> đã được xây dựng tốt.  <br /> Trong nghiên cứu này chúng tôi xây dựng <br /> quy  trình  ASO‐PCR  khảo  sát  đột  biến  G250E, <br /> Y253F,  Y253H,  E255K,  E255V,  T315I  để  giúp <br /> hoàn  thiện  kỹ  thuật  phát  hiện  nhanh  các <br /> <br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học <br /> <br /> Phương pháp tiến hành <br /> Ly  trích  DNA:  Lấy  2  ml  tủy  xương  từ  gai <br /> chậu  hoặc  5  ml  máu  ngoại  biên  (nếu  số  lượng <br /> bạch cầu ≥ 20 K/μL) trong chống đông EDTA. Ly <br /> trích  DNA  từ  tủy  xương  hoặc  máu  ngoại  biên <br /> bằng GenElute blood genomic DNA kit (Sigma, <br /> Mỹ). Sản phẩm DNA sau ly trích được kiểm tra <br /> nồng  độ  và  độ  tinh  sạch  bằng  máy  đo  quang <br /> phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm. <br /> Thực  hiện  phản  ứng  ASO‐PCR:  Thành  phần <br /> phản  ứng  ASO‐PCR  gồm  có  1μL  (10μM)  mồi <br /> cho  mỗi  loại  (bảng  1),  0,1μL  (5UI  /  μL)  Takara <br /> Taq HotStart Polymerase (Takara, Nhật) và 1 μL <br /> (100ng) DNA trong 20μL thể tích phản ứng. Tiến <br /> hành thử điều kiện của phản ứng PCR với nhiệt <br /> độ bắt cặp mồi trong khoảng từ 55 ~ 680C. Chu <br /> kỳ luân nhiệt trên máy Applied Biosystems 2720 <br /> Thermal Cycler (Life Technologies, Hoa Kỳ) bao <br /> gồm 940C trong 5 phút; theo sau là 30 chu kỳ của <br /> 940C  trong  25  giây,  55  ~  680C  trong  25  giây  và <br /> 720C trong 30 giây. Sản phẩm PCR được điện di <br /> trên  thạch  2%  có  chứa  ethidium  bromide  trong <br /> 0,5 x TBE và quan sát bằng hệ thống Gel Doc EQ <br /> (Biorad, Mỹ). Chứng dương và chứng âm được <br /> chọn  từ  những  mẫu  có  đột  biến  và  không  đột <br /> <br /> 201<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> biến  đã  khảo  sát  bằng  kỹ  thuật  giải  trình  tự <br /> chuỗi DNA. <br /> Bảng 1: Các cặp mồi dùng cho ASO‐PCR và kích <br /> thước sản phẩm PCR tương ứng <br /> Kiểu đột<br /> Mồi<br /> Mồi xuôi<br /> biến<br /> ngược<br /> G250E<br /> Y253H<br /> Y253F<br /> E255K<br /> E255V<br /> T315I<br /> <br /> 250mu<br /> 253mu1<br /> 253mu2<br /> 255mu1<br /> 255mu2<br /> 315mu<br /> <br /> 244R<br /> <br /> 315R<br /> <br /> Kích thước<br /> sản phẩm<br /> PCR<br /> 208 bp<br /> 199 bp<br /> 198 bp<br /> 194 bp<br /> 194 bp<br /> 158 bp<br /> <br /> 560C<br /> <br /> 600C<br /> <br /> 550C<br /> <br /> 650C<br /> <br /> Nhiệt độ bắt<br /> cặp tối ưu<br /> 65oC<br /> 65oC<br /> 55oC<br /> 68oC<br /> 68oC<br /> 63oC<br /> <br /> KẾT QUẢ <br /> Chúng tôi đã tiến hành thử điều kiện phản <br /> ứng ASO‐PCR để chọn điều kiện nhiệt độ bắt <br /> cặp mồi tối ưu khuếch đại đặc hiệu 6 kiểu đột <br /> biến  BCR/ABL  kháng  mạnh  với  IM.  Kết  quả <br /> thử điều kiện của từng kiểu đột biến được mô <br /> tả như sau: <br /> Đối  với  đột  biến  G250E,  chúng  tôi  khảo  sát <br /> nhiệt độ bắt cặp mồi ở 560C, 600C và 650C đối với <br /> mẫu chứng âm mang đột biến T315I (giếng 1, 4, <br /> 7), mẫu mang đột biến G250E (giếng 2, 5, 8) và <br /> nước (giếng 3, 6, 8) (hình 1A). Kết quả cho thấy <br /> cả 3 điều kiện đều xuất hiện băng đặc hiệu cho <br /> đột biến G250E (208 bp) như kết quả của giếng 2, <br /> 5, 8 và nước hoàn toàn không có băng (hình 1A). <br /> Giếng 1 và 4 xuất hiện băng mờ không đặc hiệu <br /> ở 560C và 600C, trong khi đó ở 65oC băng không <br /> đặc hiệu này biến mất (giếng 7, Hình 1A). Điều <br /> kiện  tối  ưu  của  phản  ứng  được  kiểm  tra  trên  3 <br /> mẫu chứng dương và lặp lại 2 lần. <br /> Đối với đột biến Y253H, chúng tôi khảo sát ở <br /> 4 mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C, 620C, 650C và <br /> 680C đối với mẫu có đột biến Y253H, mẫu chứng <br /> âm mang  đột  biến  Y253F  và  nước. Kết  quả  cho <br /> thấy  ở  650C  mẫu  có  đột  biến  Y253H  xuất  hiện <br /> băng  đậm  và  rõ  nét  hơn  các  điều  kiện  khác. <br /> Ngược lại, với đột biến Y253F chúng tôi khảo sát <br /> ở  550C,  kết  quả  cho  thấy  chỉ  có  mẫu  mang  đột <br /> biến Y253F mới xuất hiện băng đặc hiệu (198 bp) <br /> ở giếng 1, mẫu chứng âm mang đột biến Y253H <br /> (giếng  2),  mẫu  không  có  đột  biến  (giếng  3)  và <br /> nước  (giếng  4)  đều  không  xuất  hiện  băng  đặc <br /> <br /> 202<br /> <br /> hiệu  (hình  1B).  Điều  kiện  tối  ưu  của  Y253H  và <br /> Y253F được kiểm tra trên 3 mẫu và 2 mẫu chứng <br /> dương tương ứng và lặp lại 2 lần. <br /> <br /> B<br /> <br /> A<br /> <br />  <br /> Hình 1: ASO‐PCR phát hiện đột biến G250E (A) và <br /> Y253F (B) (A): Giếng 1, 4, 7 là mẫu chứng âm có đột biến <br /> T315I; giếng 2, 5, 8 là mẫu có đột biến G250E; giếng 3, 6, 8 <br /> là nước. (B): Giếng 1 là mẫu có đột biến Y253F; giếng 2 là <br /> mẫu chứng âm có đột biến Y253H; giếng 3 là mẫu không <br /> có đột biến; và giếng 4 là nước. <br /> <br /> Đối với đột biến E255K, chúng tôi khảo sát 3 <br /> mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C, 620C và 680C <br /> với mẫu chứng dương có đột biến E255K, chứng <br /> âm có đột biến E255V và nước. Kết quả cho thấy <br /> ở điều kiện 68oC cho kết quả tối ưu nhất (Hình <br /> 2A).  Ngược  lại,  với  đột  biến  E255V  chúng  tôi <br /> khảo  sát  4  mốc  nhiệt  độ  bắt  cặp  là  580C,  600C, <br /> 650C và 680C với mẫu chứng dương có đột biến <br /> E255V, chứng âm có đột biến E255K và nước, và <br /> kết quả cho thấy ở điều kiện 68oC cho kết quả tối <br /> ưu nhất (Hình 2B). Điều kiện tối ưu của E255K <br /> và  E255V  được  kiểm  tra  trên  3  mẫu  và  1  mẫu <br /> chứng dương tương ứng và lặp lại 2 lần. <br /> 600C<br /> <br /> 620C<br /> <br /> A<br /> <br /> 680C<br /> <br /> 58oC<br /> <br /> 60oC<br /> <br /> 65oC<br /> <br /> 68oC<br /> <br /> B<br /> <br />  <br /> <br /> Hình 2: ASO‐PCR phát hiện đột biến E255K (A) và <br /> E255V (B) (A): Giếng 1, 4, 7 là mẫu có đột biến E255K; <br /> giếng 2, 5, 8 là mẫu chứng âm có đột biến E255V; giếng 3, <br /> 6, 8 là nước. (B): Giếng 1, 4, 7 và 10 là mẫu có đột biến <br /> E255V; giếng 2, 5, 8 và 11 là mẫu chứng âm có đột biến <br /> E255K; giếng 3, 6, 9 và 12 là nước. <br /> <br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 <br /> Đối với đột biến T315I, chúng tôi khảo sát ở 3 <br /> mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 630C, 640C và 650C, <br /> mẫu chứng dương có đột biến T315I (giếng 1, 4, <br /> 7), mẫu chứng âm có đột biến G250E (giếng 2, 5, <br /> 8)  và  nước  (giếng  3,  6,  9).  Kết  quả  cho  thấy  ở <br /> điều kiện 63oC cho kết quả tối ưu nhất với băng <br /> đột biến (158bp) rõ nét nhất (hình 3). Điều kiện <br /> tối  ưu  của  phản  ứng  được  kiểm tra trên 3 mẫu <br /> chứng dương và lặp lại 2 lần. <br /> <br /> 63<br /> <br /> 0<br /> <br /> 64<br /> <br /> 0<br /> <br /> 65<br /> <br /> 0<br /> <br />  <br /> Hình 3: ASO‐PCR phát hiện đột biến T315I <br /> Giếng 1, 4, 7 là mẫu có đột biến T315I; giếng 2, 5, 8 là mẫu <br /> chúng âm có đột biến G250E; giếng 3, 6, 9 là nước. <br /> <br /> Sau  khi  chuẩn  hóa  điều  kiện  ASO‐PCR <br /> thành  công,  chúng  tôi  khảo  sát  6  kiểu  đột  biến <br /> G250E,  Y253F,  Y253H,  E255K,  E255V,  T315I <br /> kháng mạnh với IM trên 30 BN BCMDT kháng <br /> IM.  Kết  quả  cho  thấy  có  17  lượt  đột  biến  của  6 <br /> kiểu trên 15 BN (bảng 2). Kiểm tra bằng kỹ thuật <br /> giải trình tự chuỗi DNA cho thấy 6 kiểu đột biến <br /> trên được phát hiện 15 lượt trên 14 BN, 5 BN có <br /> đột biến khác và 11 BN không phát hiện đột biến <br /> vùng ATP‐binding domain. <br /> Bảng 2: Các kiểu đột biến BCR/ABL kháng IM <br /> Kiểu đột biến<br /> G250E<br /> Y253H<br /> Y253F<br /> E255K<br /> E255V<br /> T315I<br /> Không phát hiện 6 kiểu đột biến trên<br /> Đột biến khác ngoài 6 đột biến trên<br /> <br /> ASOPCR<br /> 3<br /> 5<br /> 2<br /> 3<br /> 1<br /> 3<br /> 15<br /> <br /> Giải trình<br /> tự DNA<br /> 3<br /> 3<br /> 2<br /> 3<br /> 1<br /> 3<br /> 5<br /> <br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Kiểu đột biến<br /> Không phát hiện đột biến vùng ATPbinding domain<br /> <br /> ASOPCR<br /> <br /> Giải trình<br /> tự DNA<br /> 11<br /> <br /> BÀN LUẬN <br /> Khi khảo sát các kiểu đột biến, chúng tôi sử <br /> dụng  DNA  trong  phản  ứng  PCR  và  thử  điều <br /> kiện  với  2  loại  taq  polymerase  là  GoTaq  Plexi <br /> DNA polymerase (Promega, Hoa Kỳ) và Takara <br /> Taq  HotStart  Polymerase.  Kết  quả  của  GoTaq <br /> Plexi cho nhiều băng phụ ngoài băng đặc hiệu ở <br /> cùng điều kiện nhiệt độ nên Takara Taq HotStart <br /> Polymerase  được  chọn  sử  dụng  trong  nghiên <br /> cứu này. Với việc thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi <br /> cho từng phản ứng PCR, chúng tôi đã xác định <br /> được  điều  kiện nhiệt  độ  phù hợp  cho  các phản <br /> ứng  ASO‐PCR  phát  6  kiểu  đột  biến  BCR/ABL <br /> kháng  mạnh  với  IM  (Bảng  1).  Điều  kiện  phản <br /> ứng  ASO‐PCR  đã  xây  dựng  trong  nghiên  cứu <br /> cho thấy kết quả khảo sát đặc hiệu cho từng kiểu <br /> đột biến như tại vị trí Y253 và E255 đều có 2 kiểu <br /> đột biến xảy ra là Y253K/Y253F và E255K/E255V, <br /> khi  khảo  sát  đột  biến  Y253F  thì  Y253K  được <br /> dùng  làm  chứng  âm  nhưng  chỉ  có  mẫu  mang <br /> đột  biến  Y253F  xuất  hiện  băng  đặc  hiệu  và <br /> ngược lại (Hình 1B), tương tự đối với E255K và <br /> E255V (Hình 2). <br /> Kết  quả  khảo  sát  30  BN  BCMDT  kháng  IM <br /> bằng 2 kỹ thuật ASO‐PCR và giải trình tự chuỗi <br /> DNA  cho  thấy  giá  trị  của  ASO‐PCR  trong  việc <br /> tầm soát các đột biến đã biết. Trong 30 BN được <br /> khảo sát, có 15 BN biểu hiện 17 lượt của 6 kiểu <br /> đột  biến  G250E,  Y253F,  Y253H,  E255K,  E255V, <br /> T315I, cao hơn so với kết quả giải trình tự chuỗi <br /> DNA (15 lượt của 14 BN) (Bảng 2). Trong đó, có <br /> 2  BN  (IAP‐015  và  IAP‐025)  không  tìm  thấy  đột <br /> biến  Y253H  bằng  kỹ  thuật  giải  trình  tự  chuỗi <br /> DNA nhưng băng đột biến được phát hiện bằng <br /> kỹ  thuật  ASO‐PCR  (giếng  3,  Hình  4A).  Tuy <br /> nhiên, kết quả giải trình tự chuỗi DNA của 2 BN <br /> trên cũng cho thấy tại vị trí aa253 ngoài sóng T <br /> bình  thường  còn  xuất  hiện  sóng  C  rất  nhỏ  gần <br /> bằng  sóng  nền  (sóng  nhiễu)  nên  rất  khó  nhận <br /> diện và quyết định là sóng bất thường (Hình 4B), <br /> chứng tỏ trên 2 BN này đã xuất hiện dòng tế bào <br /> <br /> 203<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> mang đột biến Y253H chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều <br /> so với dòng tế bào không mang đột biến (