Khảo sát giá trị của xét nghiệm định danh vi khuẩn ở bệnh nhân nhiễm khuẩn mắt dựa trên đoạn GEN 16s rDNA

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM ĐỊNH DANH VI KHUẨN<br /> Ở BỆNH NHÂN NHIỄM KHUẨN MẮT DỰA TRÊN ĐOẠN GEN 16s rDNA<br /> Lê Xuân Trường*, Nguyễn Vũ Uyên**<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Đặt vấn đề: Phương pháp nuôi cấy thông thường trong nhiễm khuẩn mắt thường cho kết quả dương tính<br /> thấp và thời gian trả kết quả lâu. Để rút ngắn thời gian trả kết quả cũng như có kết quả dương tính cao, gần đây<br /> người ta nói đến kỹ thuật định danh vi khuẩn dựa trên đoạn gen 16s rDNA trong sinh học phân tử. Để đánh giá<br /> kỹ thuật mới ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm phát triển phương pháp định danh vi khuẩn<br /> bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở bệnh phẩm mắt.<br /> Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân có chỉ định nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ tại Bệnh viện<br /> Mắt thành phố Hồ Chí Minh từ 02/9/2013 – 30/9/2013.<br /> Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Trong 72 bệnh nhân nghiên cứu, tăm bông vô trùng được dùng để<br /> lấy mẫu và sau đó cấy vào dung dịch BHI từ 24 – 48 giờ. Dung dịch BHI sau đó được song song định danh bằng<br /> cả 2 xét nghiệm nuôi cấy thông thường và giải trình tự đoạn gen 16s rDNA. Kết quả giải trình tự được so sánh<br /> trên ngân hàng gen NCBI để định danh vi khuẩn. Cuối cùng so sánh 2 kết quả nuôi cấy và giải trình tự đoạn gen<br /> 16s rDNA.<br /> Kết quả: Trong tổng số 72 mẫu làm xét nghiệm, có 39 mẫu dương tính với kỹ thuật PCR, 32 mẫu dương<br /> tính với phương pháp nuôi cấy thông thường. Nuôi cấy chỉ dương tính với các vi khuẩn: Acineto bacter<br /> baumannii (n=2), Pseudomonas (n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=2), Staphylococci coagulase âm (n=2),<br /> Staphylococci coagulase âm kháng methicillin (n=20), Staphylococcus aureus (n=2). Nói chung, có 39/72 mẫu<br /> (chiếm 45,2 %) cho kết quả 16s rDNA dương tính, trong khi đó chỉ có 32/72 mẫu (tức 44,4%) nuôi cấy dương<br /> tính. Không có mẫu nào nuôi cấy dương tính cho kết quả định danh 16s rDNA âm tính.<br /> Kết luận: Giải trình tự đoạn gen 16s rDNA là phương pháp phù hợp để phát hiện và định danh vi khuẩn ở<br /> mắt nhiễm trùng. Xét nghiệm này cho kết quả nhanh và có thể phát hiện những vi khuẩn không phát hiện được<br /> bằng phương pháp nuôi cấy thông thường.<br /> Từ khóa: kỹ thuật PCR, DNA, định danh vi khuẩn<br /> <br /> ABSTRACT<br /> SURVEY VALUE TEST FOR IDENTIFICATION OF BACTERIA BASED ON GENE OF 16S rDNA<br /> IN INFECTION EYES<br /> Le Xuan Truong, Nguyen Vu Uyen<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 - 2014: 77 - 80<br /> Background: Conventional culture method for eye infection specimens often results in low positive and<br /> lasting results time pay. To shorten the duration of high culture as well as positive results are high, we mention<br /> about modern techniques in molecular biology. To evaluate the new technique, we conducted this research topic to<br /> develop methods of bacterial identification by molecular biology techniques in eye swabs, this new method will<br /> result in faster than culture.<br /> * Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM ** Khoa xét nghiệm, Bệnh viện Mắt TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. BS. Lê Xuân Trường<br /> ĐT: 01269872057<br /> Email: lxtruong57@yahoo.com<br /> <br /> Mắt<br /> <br /> 77<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Material and method: Patients indicated bacterial culture and antimicrobial susceptibility at Eye Hospital<br /> of Ho Chi Minh City from 02/09/2013 - 30/09/2013. Cross-sectional descriptive study. From 72 patients in<br /> survey, swabs were taken and cultured in BHI for 24 – 48 hours. After that, we parallel identify bacteria by both<br /> culture and sequencing 16s rDNA. Sequences were compared with sequences of known bacteria listed in the<br /> NCBI data bank. Finally, the results were compared with results obtained from conventional cultivation.<br /> Results: In 72 specimens, there are 39 specimens gave positive for PCR technique, 32 specimens gave<br /> positive conventional culture. Culture was only positive for: Acineto bacter baumannii (n=2), Pseudomonas<br /> (n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=2), Staphylococci coagulase negative (n=2), Staphylococci coagulase negative<br /> resist methicillin (n=20), Staphylococcus aureus (n=2). In total, 45.2 % (39/72) analyzed specimens have 16s<br /> rDNA positive, whereas only 44.4% (32/72) were culture positive. No specimen positive by culture gave negative<br /> results by 16s rDNA.<br /> Conclusions: 16S rDNA sequence analyses are appropriated methods for the detection and identification<br /> ocular infections of bacteria that might not be detected by conventional cultivation and this PCR test gave quicker<br /> result.<br /> Keyword: PCR technique, DNA, identify bacteria<br /> <br /> ĐẶT VẤNĐỀ<br /> Các bệnh lý nhiễm trùng ở mắt là bệnh lý<br /> thường gặp trong Nhãn khoa, định danh vi<br /> khuẩn là vô cùng cần thiết giúp chẩn đoán và<br /> điều trị, nhưng việc định danh vi khuẩn<br /> không phải là dễ dàng vì một số vi khuẩn chỉ<br /> tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy đặc<br /> biệt. Hơn nữa, lượng bệnh phẩm từ mắt<br /> thường rất ít nên nuôi cấy cho kết quả dương<br /> tính thấp và thời gian nuôi cấy lâu từ 3-4 ngày.<br /> Để giải quyết những khó khăn trên, chúng ta<br /> có thể ứng dụng các kỹ thuật mới vào việc<br /> định danh vi khuẩn trong Nhãn khoa bằng<br /> cách giải mã trình tự đoạn gen 16s rDNA với<br /> kỹ thuật PCR.<br /> Tại Việt Nam đã có các nghiên cứu về<br /> VMNN (viêm mủ nội nhãn) của Bệnh viện<br /> Mắt Trung Ương “Ứng dụng PCR và giải trình<br /> tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân<br /> viêm mủ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn”(1),<br /> nhiễm trùng ở Mắt có tác giả Nguyễn Thị Bình<br /> Minh, Phùng Thị Tục thuộc bệnh viện tỉnh Hà<br /> Tây thực hiện nghiên cứu “Nhận xét 84<br /> trường hợp viêm loét giác mạc điều trị tại<br /> Khoa Mắt bệnh viện tỉnh Hà Tây ”(3) và tác giả<br /> Vũ Hoàng Việt Chi, Phạm Thị Khánh Vân<br /> thực hiện nghiên cứu “Viêm loét giác mạc<br /> <br /> 78<br /> <br /> nhiễm trùng tại bệnh viện Mắt Trung Ương<br /> đặc điểm lâm sàng và vi sinh”(5).<br /> Các nghiên cứu trên chỉ ứng dụng sinh học<br /> phân tử vào các trường hợp VMNN mà chưa có<br /> nghiên cứu khả năng ứng dụng của xét nghiệm<br /> 16s rDNA vào các bệnh nhiễm trùng Mắt vì vậy<br /> chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng<br /> Tất cả bệnh nhân có chỉ định nuôi cấy vi<br /> khuẩn và làm kháng sinh đồ tại bệnh viện Mắt<br /> TP.Hồ Chí Minh từ 02/9/2013 – 30/9/2013.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Lấy mẫu thuận tiện trên những mẫu xét<br /> nghiệm được chỉ định nuôi cấy và làm kháng<br /> sinh đồ, bao gồm những mẫu nuôi cấy dương<br /> tính và âm tính.<br /> Mẫu xét nghiệm được lấy trên tăm bông<br /> vô trùng hay dịch mủ nội nhãn được đem<br /> nuôi cấy trong dung dịch BHI qua đêm.<br /> Sau 24 – 48 giờ dung dịch BHI được cấy<br /> chuyển lên thạch, các mẫu dung dịch BHI còn<br /> lại được làm xét nghiệm 16s rDNA dù vi<br /> khuẩn có mọc hay không.<br /> <br /> Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Bảng 6. So sánh tỷ lệ dương tính ở các nghiên cứu<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀNLUẬN<br /> Bảng 1. So sánh kết quả dương tính của 2 xét nghiệm<br /> Dương tính<br /> 32 (44,4%)<br /> 39 (54,2%)<br /> <br /> Nuôi cấy<br /> 16s rDNA<br /> <br /> (2)<br /> <br /> Ấn Độ<br /> (4)<br /> Đại Học Y Vienna, Áo<br /> Chúng tôi<br /> <br /> Bảng 2. So sánh 2 xét nghiệm<br /> <br /> 16s rDNA dương<br /> 16s rDNA âm<br /> Tổng cộng<br /> <br /> Nuôi cấy<br /> dương<br /> 32<br /> 0<br /> 32<br /> <br /> Nuôi cấy<br /> âm<br /> 7<br /> 33<br /> 40<br /> <br /> Tổng cộng<br /> 39<br /> 33<br /> 72<br /> <br /> Độ nhạy của xét nghiệm 16s rDNA<br /> Ss = 32/32 = 100 %.<br /> Bảng 3. Kiểm định McNemar<br /> Nuôi cấy<br /> P<br /> Dương tính n Âm tính n<br /> Dương tính n<br /> 32<br /> 7<br /> 16 s rDNA<br /> 0,015<br /> Âm tính n<br /> 0<br /> 33<br /> <br /> Kiểm định McNemar với p = 0,015 cho<br /> thấy có sự khác biệt giữa 2 xét nghiệm.<br /> Bảng 4. Thống kê các mẫu dương tính được định<br /> danh bằng nuôi cấy<br /> Tên<br /> Acineto bacter baumannii<br /> Pseudomonas<br /> Pseudomonas aeruginosa<br /> Staphylococci coagulase âm<br /> Staphylococci coagulase âm<br /> kháng methicillin<br /> Staphylococcus aureus<br /> Tổng cộng<br /> <br /> Số lượng<br /> 2<br /> 4<br /> 2<br /> 2<br /> <br /> Tỷ lệ (%)<br /> 6,25<br /> 12,5<br /> 6,25<br /> 6,25<br /> <br /> 20<br /> <br /> 62,5<br /> <br /> 2<br /> 32<br /> <br /> 6,25<br /> 100<br /> <br /> Bảng 5: Thống kê các mẫu dương tính được định<br /> danh bằng 16s rDNA<br /> Tên<br /> Acineto bacter calcoacetius<br /> Bacillus cereus<br /> Bulkhoderia cenocepacia<br /> Corynebacterium sp<br /> Kocuria sp.<br /> Pseudomonas aeruginosa<br /> Pseudomonas otitidis<br /> Staphylococcus aureus<br /> Staphylococcus epidermidis<br /> Staphylococcus heamolyticus<br /> Staphylococcus hominis<br /> Streptococcus intermedius<br /> Streptococus mitis<br /> Streptococus oralis<br /> Tổng cộng<br /> <br /> Mắt<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Số lượng Tỷ lệ (%)<br /> 1<br /> 2,56<br /> 1<br /> 2,56<br /> 1<br /> 2,56<br /> 1<br /> 2,56<br /> 1<br /> 2,56<br /> 5<br /> 12,83<br /> 2<br /> 5,14<br /> 2<br /> 5,14<br /> 18<br /> 46,16<br /> 3<br /> 7,69<br /> 1<br /> 2,56<br /> 1<br /> 2,56<br /> 1<br /> 2,56<br /> 1<br /> 2,56<br /> 39<br /> 100<br /> <br /> % Sinh học phân % Nuôi cấy<br /> tử dương tính dương tính<br /> 31,6%<br /> 22%<br /> 45%<br /> 22%<br /> 54,2%<br /> 44.4%<br /> <br /> Theo nghiên cứu của trường Đại Học Y<br /> Vienna, Áo(4), tỷ lệ dương tính của PCR là 45%<br /> trong khi đó nuôi cấy dương tính chỉ có 22%.<br /> Kết quả của xét nghiệm 16s rDNA của<br /> nghiên cứu chúng tôi là 54,2% và nuôi cấy là<br /> 44,4% phù hợp với thống kê bệnh viện Mắt hàng<br /> tháng về tỷ lệ nuôi cấy dương tính, kết quả này<br /> của nghiên cứu chúng tôi có thể khác biệt vì sự<br /> phân bố mẫu của nghiên cứu trên đối với vi<br /> khuẩn và nấm có sự khác biệt, nghiên cứu ở Ấn<br /> Độ(2) có 48 mẫu là vi khuẩn và 66 mẫu là nấm.<br /> Nói chung cả 3 nghiên cứu đều cho thấy<br /> khả năng định danh vi khuẩn tốt hơn của kỹ<br /> thuật sinh học phân tử so với phương pháp<br /> nuôi cấy cổ điển và có khả năng phát hiện<br /> những trường hợp âm tính giả của nuôi cấy do<br /> hạn chế của kỹ thuật.<br /> Các mẫu nuôi cấy âm tính và cho 16s rDNA<br /> dương tính, trong đó có một số loại vi khuẩn<br /> không phát hiện trên nuôi cấy như: Bacillus<br /> cereus, Corynebacterium sp., Kocuria sp., tuy số<br /> lượng không nhiều nhưng góp phần giúp chúng<br /> ta không bỏ sót chẩn đoán và hỗ trợ điều trị.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Xét nghiệm 16s r DNA cho tỷ lệ dương tính<br /> 54,2% cao hơn kết quả nuôi cấy chỉ có 44,4%.<br /> Kỹ thuật sinh học phân tử mới 16s rDNA là<br /> công cụ hữu ích giúp hỗ trợ chẩn đoán và điều<br /> trị trong bệnh lý nhiễm trùng ở mắt. Đây là một<br /> xét nghiệm với độ nhạy cao là 100%.<br /> Các mẫu nuôi cấy âm tính nhưng 16s rDNA<br /> dương tính góp phần giúp chúng ta không bỏ<br /> sót chẩn đoán và hỗ trợ điều trị.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAMKHẢO<br /> 1.<br /> <br /> Bệnh viện Mắt Trung Ương (2009). “Ứng dụng PCR và giải<br /> trình tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mủ<br /> nội<br /> nhãn<br /> nội<br /> sinh<br /> do<br /> vi<br /> khuẩn”,<br /> http://www.thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/ung-dung-pcr-<br /> <br /> 79<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 80<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> va-giai-trinh-tu-trong-chan-doan-dinh-danh-nguyen-nhanviem-mu-noi-nhan-noi-sinh-do-vi khuan/5177.yhoc<br /> Kim E, Chidambaram JD, Srinivasan M, Lalitha P, Wee<br /> D, Lietman TM, Whitcher JP, Van Gelder RN (2008)<br /> “Prospective comparison of microbial culture and polymerase<br /> chain reaction in the diagnosis of corneal ulcer”. Am J<br /> Ophthalmol, 146 (5): 714-23;723 e1.<br /> Nguyễn Thị Bình Minh, Phùng Thị Tục (2000) “Nhận xét 84<br /> trường hợp viêm loét giác mạc điều trị tại Khoa Mắt bệnh<br /> viện tỉnh Hà Tây (1999-2000)”, bệnh viện Mắt Trung Ương,<br /> http://www.vnio.vn/Cac-so-TCNK-Cong-trinh-nghien-cuuTCNK-so-2/nhn-xet-84-trng-hp-viem-loet-giac-mc-iu-tr-tikhoa-mt-bnh-vin-tnh-ha-tay-1999-2000.html,<br /> Schabereiter-Gurtnerm C, et al (2001). “16S-rDNA-based<br /> identification of bacteria from conjunctival swabs by PCR and<br /> <br /> 5.<br /> <br /> DGGE fingerprinting”. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42 (6),<br /> 1164-71.<br /> Vũ Hoàng Việt Chi, Phạm Thị Khánh Vân (2011). “Viêm loét<br /> giác mạc nhiễm trùng tại bệnh viện Mắt Trung Ương đặc<br /> điểm<br /> lâm<br /> sàng<br /> và<br /> vi<br /> sinh”,<br /> http://thaythuocvietnam.com.vn/Viem-loat-giac-mac-nhiemtrung-tai-Benh-vien-Mat-Trung-Uong-dac-diem-lam-sang-vavi-sinh-di1239--n7597.<br /> <br /> Ngày nhận bài báo:01/11/2013<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo:26/11/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014<br /> <br /> Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt<br /> <br />