TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
NGUYỄN PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật
Hà Nội, năm 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
NGUYỄN PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật
Người hướng dẫn khoa học
ThS Phạm Thị Kim Dung
Hà Nội, năm 2019
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới cô:
ThS Phạm Thị Kim Dung Là người đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho tôi những kiến thức quý giá
giúp tôi từng bước nâng cao nhận thức để hoàn thành nội dung khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn Viện nghiên cứu khoa Sinh đã tạo điều kiện trang thiết bị cho tôi hoàn thành khóa luận, bên cạnh đó tôi cũng xin chân thành cảm ơn Phòng Đào tạo và các thầy cô trong Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.
Tôi cũng không thể không gửi lời cảm ơn đến các cộng sự, những người cùng trong nhóm làm khóa luận sát cánh nghiên cứu và thảo luận khắc phục những sự cố và khó khăn.
Tôi cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè những người tin yêu đã động viên tôi
cố gắng trong suốt thời gian qua.
Khóa luận tốt nghiệp này cũng là mốc đánh dấu những ngày chập chững tôi nghiên cứu khoa học, vì vậy không thể tránh khỏi thiếu sót và hạn chế. Tôi mong sẽ nhận được những sự góp ý quý báu từ thầy cô, bạn bè để tôi có những hành trang cho quá trình nghiên cứu sau này. Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh viên thực hiện
Nguyễn Phương Thảo
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi nội dung trong khóa luận: “Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già” hoàn toàn là công trình nghiên cứu của tôi, dựa trên sự kế thừa và phát triển của các công trình nghiên cứu liên quan.
Tôi xin cam đoan những số liệu mà tôi thống kê là do xây dựng thực nghiệm
không trùng lặp với bất kì kết quả của nghiên cứu nào.
Trong đề tài của tôi có sử dụng những thông tin từ các tài liệu tham khảo
khác. Tôi xin phép trích dẫn và ghi nguồn gốc rõ ràng.
Tôi xin chịu trách nhiệm với nội dung đề tài của mình.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh viên thực hiện
Nguyễn Phương Thảo
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
KÍ HIỆU VIẾT TẮT
NỘI DUNG
G. xylinus Gluconacetobacter xylinus 1
VLC Vật liệu cellulose 2
OD Mật độ quang phổ 3
MTD Môi trường nước dừa già 4
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 8
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................. 8
2. Mục đích của nghiên cứu ............................................................................... 9
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 9
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ........................................................................ 9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 11
1.1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG, LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU ................................................................................................................. 11
1.1.1. Tổng quan về Diclofenac natri ........................................................... 11
1.1.2. Tổng quan về Gluconacetobacter xylinus .......................................... 13
1.1.3. Tổng quan về Vật liệu cellulose (VLC) ............................................. 14
1.2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .......................................................................................................................... 18
1.2.1. Trên thế giới ....................................................................................... 18
1.2.2. Tại Việt Nam ...................................................................................... 19
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 20
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................. 20
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 20
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................ 20
2.1.3. Môi trường nghiên cứu ...................................................................... 21
2.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN ....................... 22
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 22
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 22
2.2.3. Thời gian nghiên cứu ......................................................................... 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 22
2.3.1. Tạo màng VLC lên men từ môi trường nước dừa già........................ 22
2.3.2. Xử lý VLC .......................................................................................... 23
2.3.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng VLC .............................................. 24
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri trong dung dịch methanol ...................................................................................... 24
2.3.5. Xác định lượng thuốc được hấp thụ qua màng VLC ......................... 26
2.3.6. Phương pháp xử lý thống kê .............................................................. 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 30
3.1. Tạo vật liệu VLC từ G. xylinus trong môi trường nước dừa già ............... 30
3.1.1. Thu màng VLC được lên men trong môi trường nước dừa già ......... 30
3.1.2. Đo bề dày của các loại vật liệu VLC.................................................. 31
3.1.3. Kết quả trình xử lý VLC trước khi hấp thụ Diclofenac natri ............. 32
3.2. Kết quả sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già ............................ 33
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 38
4.1. Kết luận ..................................................................................................... 38
4.2. Kiến nghị ................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 39
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng môi trường nước dừa già [10] ...................... 21
Bảng 2.2. Môi trường dừa lên men tạo vật liệu VLC ........................................... 23
Bảng 2.3. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n=3) ..................................................................................... 25
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng VLC (n=3) .................................. 34
Mật độ quang OD (Abs 283nm) ........................................................................... 34
Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào màng VLC (mht) và tỉ lệ hấp thụ thuốc (EE%) với độ dày màng khác nhau tại thời điểm 2 giờ ....................................... 35
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac natri ............................................... 11
Hình 1.2. Hình thái Gluconacetobacter xylinus ................................................... 13
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac natri tại λ =283nm ........... 26
Hình 2.2. Chuẩn bị dung dịch thuốc Diclofenac natri cần hấp thu ...................... 27
Hình 2.3. Bình chứa màng chuẩn bị hấp thụ thuốc .............................................. 27
Hình 2.4. Màng VLC đang hấp thụ ...................................................................... 28
Hình 3.1. Hình ảnh màng VLC được lên men từ môi trường nước dừa già ........ 30
Hình 3.2. Màng VLC thu được có độ dày 0,5cm và 1cm .................................... 31
Hình 3.3. Màng VLC có độ dày 0,5cm (a) và màng VLC có độ dày 1cm (b) ..... 32
Hình 3.4. Màng VLC sau khi được xử lí bởi NaOH ............................................ 32
Hình 3.5. Màng VLC tinh khiết có d = 1 cm ....................................................... 33
Hình 3.6. Màng VLC sau khi ép 50% nước ......................................................... 33
Hình 3.7. Khối lượng thuốc hấp thụ trong cùng độ dày màng ............................ 35
Hình 3.8. Tỉ lệ thuốc hấp thụ trong các độ dày màng khác nhau ......................... 36
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, trong xu thế hội nhập, kinh tế phát triển, con người có của ăn của để, thì cũng là lúc người ta quan tâm nhiều đến sức khỏe. Công nghệ sinh học cũng đang được đầu tư đẩy mạnh bởi những thành tựu của nó trong các ngành công nghiệp thực phẩm, y học… Việc nghiên cứu làm tăng khả năng sử dụng của các loại thuốc phục vụ nâng cao sức khỏe của con người đang là hướng đi có nhiều triển vọng. Dựa trên cơ sở đó, tôi quyết định nghiên cứu một dạng thuốc chống viêm có ứng dụng lớn là Diclofenac natri nhằm làm tăng cường những ưu điểm và giảm thiểu những nhược điểm mà thuốc mang lại cho người sử dụng.
Diclofenac natri là một dẫn xuất của Diclofenac, là một loại thuốc giảm đau trong thời gian ngắn, công dụng nhanh và mạnh. Chế phẩm thuốc không chứa steroid, đặc biệt công dụng đối với các bệnh về xương khớp. Cơ chế tác dụng của Diclofenac là làm ngăn cản sự tổng hợp của prostagladin (chất gây viêm, đau và sốt). Bên cạnh đó, thuốc cũng có tác dụng làm giảm nhiễm trùng sau phẫu thuật, làm giảm đau do vận động hay làm giảm đau bụng kinh [1,10].
Do Diclofenac natri có tác dụng ngắn và tức thì nên cần phải dùng nhắc lại nhiều lần, vì vậy thuốc ảnh hưởng tương đối đến đường tiêu hóa. Thuốc chống chỉ định với những người viêm loét dạ dày, hành tá tràng. Việc thuốc ngăn cản sự tổng hợp prostaladin cũng gây viêm cầu thận, hội chứng thận hư, hoại tử nhú đặc biệt đối với những có tiền sử suy tim và các bênh về thận [1,12].
Việc tôi lựa chọn nghiên cứu thuốc Diclofenac natri nhằm mong muốn kéo dài tác dụng của thuốc. Sự hấp thụ của thuốc được tôi lựa chọn nghiên cứu trên một loại vật liệu mang tính khả thi cao là vật liệu cellulose tạo ra từ G. xylinus.
Gluconacetobacter xylinus là vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, sống kị khí bắt buộc dưới hình thức hóa dưỡng. Khi nuôi cấy chủng vi khuẩn này trong môi trường dịch lỏng, chúng hình thành nên một lớp màng VLC [2]. Màng VLC này mang nhiều đặc tính ưu việt của một chất mang như: Có khả năng hút tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, có khả năng đàn hồi tốt, dễ dàng tương thích với các thiết bị sinh học, có tính bền, có khả năng tái sử dụng lại nhiều lần [3].
8
Do màng VLC tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus mang nhiều đặc điểm thuận lợi để sử dụng làm vật liệu nghiên cứu, nên lựa chọn nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus trong môi trường dịch lỏng để thu màng VLC. Môi trường đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn tôi lựa chọn là môi trường nước dừa già.
Từ những tìm hiểu trên, tôi quyết định lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già”.
2. Mục đích của nghiên cứu
Thiết kế thí nghiệm thu được màng VLC được lên men từ môi trường nước
dừa già.
Nghiên cứu được khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già.
3. Nội dung nghiên cứu
- Chế tạo được vật liệu VLC, thu màng VLC và đánh giá được độ tinh khiết
của vật liệu.
- Xử lý vật liệu VLC trước và sau khi cho hấp thụ thuốc. - Trong các khoảng thời gian xác định, tiến hành xác định khối lượng thuốc
hấp thụ vào vật liệu VLC.
- Khảo sát thời điểm hấp thụ Diclofenac natri tối ưu vào vật liệu VLC trong
môi trường nước dừa già.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: + Tăng thêm hiểu biết về chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus, màng VLC và những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực y học, thực phẩm và một số ngành công nghiệp
+ Xây dựng được quy trình tạo màng VLC lên men môi trường nước dừa
già, từ đó tìm ra thời gian VLC có khả năng hấp thu thuốc tốt nhất.
9
- Ý nghĩa thực tiễn: + Nâng cao khả năng hấp thụ diclofenac trên màng VLC nhằm tăng khả năng tác dụng giảm đau, chống viêm của thuốc, khắc phụ việc sử dụng thuốc nhắc lại nhiều lần của thuốc Diclofenac trong quá trình điều trị.
10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG, LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU
1.1.1. Tổng quan về Diclofenac natri
1.1.1.1. Công thức
- Công thức phân tử: : C14H10Cl2NNaO2
- Công thức cấu tạo: Hình 1.1
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac natri
- Tên quốc tế: Diclofenac - Tên biệt dược: Cambia, Cataflam, Voltaren-XR, Zipsor, Zorvolex,
Voltaren, Dyloject,… [1,8].
1.1.1.2. Tính chất và tác dụng
* Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ. Dễ tan trong methanol, tan trong ethanol 96%, hơi tan trong nước, khó tan trong aceton. [1].
* Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng: Diclofenac natri là một dẫn xuất của Diclofenac, là một loại thuốc giảm đau trong thời gian ngắn, công dụng nhanh và mạnh. Chế phẩm thuốc không chứa steroid, đặc biệt công dụng đối với các bệnh về xương khớp. Cơ chế tác dụng của Diclofenac là làm ngăn cản sự tổng hợp của prostagladin (chất gây viêm, đau và sốt). Bên cạnh đó, thuốc cũng có tác dụng làm giảm nhiễm trùng sau phẫu thuật, làm giảm đau do vận động hay làm giảm đau bụng kinh [1,13].
Do Diclofenac natri có tác dụng ngắn và tức thì nên cần phải dùng nhắc lại
nhiều lần, vì vậy, thuốc ảnh hưởng tương đối đến đường tiêu hóa. Thuốc chống
11
chỉ định với những người viêm loét dạ dày, hành tá tràng. Việc thuốc ngăn cản sự tổng hợp prostaladin cũng gây viêm cầu thận, hội chứng thận hư, hoại tử nhú đặc biệt đối với những có tiền sử suy tim và các bênh về thận [1,10].
Diclofenac natri hấp thụ nhanh khi uống đặc biệt uống lúc đói. Thuốc dạng uống được chuyển hóa qua gan lần đầu khoảng 50%. Diclofenac natri gắn nhiều với protein huyết tương, chủ yếu là albumin. Thuốc dạng tiêm sinh khả dụng trong máu tuần hoàn khoảng 50%. Tác dụng của thuốc xuất hiện sau 1-2 giờ sau khi uống, sau 30-60 phút khi đặt thuốc vào trực tràng, vầ tác dụng nhanh nhất dạng tiêm sau 20-30 phút.
* Tác dụng phụ:
Thường gặp các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa như táo bón, đau thượng
vị,... cũng có thể gây buồn nôn, choáng váng.
Một số trường hợp hiếm gây giảm bạch cầu, thiếu máu, suy tủy; hiếm thấy nổi ban đỏ, sốc phản vệ; hiếm gây bệnh da mụn nước hay có những phản ứng nhạy cảm với ánh sáng; hiếm bị hội chứng thận nhiễm mỡ, đái ra máu; hiếm gây viêm gan, mất ngủ, viêm đại tràng, hạ huyết áp, rụng tóc [8].
1.1.1.3. Cách điều trị
* Dạng thuốc: Chế phẩm dưới nhiều dạng khác nhau. Dạng muối diethylamoni và thuốc muối hydroxyethylpyrolidin được dùng bôi ngoài. Dạng base và muối kali thường được dùng làm thuốc uống [10].
+ Viên nén: 25mg, 50mg, 100mg
+ Thuốc tiêm: 75mg/2ml, 75mg/3ml + Thuốc đạn: 25mg, 100mg + Thuốc tra mắt: 0,01% + Thuốc xoa ngoài: 10mg/g * Chỉ định: - Ðiều trị dài ngày viêm khớp mạn, thoái hóa khớp. - Điều trị sau phẫu thuật hoặc đau do chấn thương. - Điều trị đau bụng kinh [10]. * Chống chỉ định:
12
- Quá mẫn với các thành phần của thuốc: diclofenac, aspirin (hen, viêm mũi,
mày đay sau khi dùng aspirin).
- Người có tiền sử loét dạ dày, chảy máu hành tá tràng. - Người có tiền sử bệnh về tim mạch, thận hoặc gan [10].
1.1.2. Tổng quan về Gluconacetobacter xylinus
1.1.2.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới
Gluconacetobacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic. Sống hiếu khí bắt
buộc, đời sống hóa dưỡng [1].
Theo hệ thống phân loại của Berey, Gluconacetobacter xylinus thuộc: + Chi: Acetobacter + Họ: Pseudomonadaceae + Bộ: Pseudomonadales + Lớp: Schizommyceles. Hiện nay họ Acetobacteraceae có 10 chi, trong đó Gluconacetobacter là
chi duy nhất có khả năng tổng hợp cellulose [4].
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái
Hình 1.2. Hình thái Gluconacetobacter xylinus
Gluconacetobacter xylinus có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có khả
năng đứng riêng rẽ hoặc thành từng chuỗi.
Kích thước: 2 µm
13
Gluconacetobacter xylinus có khả năng thích ứng 4,5% acid acetic trong môi trường [4]. Môi trường bất lợi (nồng độ acid cao), hoặc khi tế bào già, hình dạng tế bào có thể bị biến dạng (dài hơn và phình to ra).
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí và sinh hóa
* Đặc điểm sinh lí Tùy thuộc vào giống có đặc điểm nuôi cấy phát triển khác nhau. Nhiệt độ thích hợp của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus là 25 – 30oC, pH tối ưu là 4-6. Nếu nhiệt độ môi trường lên đến 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. [4]
Trong môi trường nuôi cấy rắn, khuẩn lạc Gluconacetobacter xylinus bắt đầu phát triển sau khoảng 3-7 ngày, có màu kem, nhỏ và hơi trong suốt. Sau 1 khoảng 1 tuần, khuẩn lạc phát triển to dần, dạng đục, có màu cà phê sữa và khô hơn.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, do đặc điểm vi khuẩn sống hóa dưỡng, Gluconacetobacter xylinus có khả năng chuyển hóa đường tạo thành cellulose và nổi trên bề mặt tạo màng, màng này chính là vật liệu cellulose cần nghiên cứu. Sau 36 – 48h nuôi cấy, màng dần xuất hiện, và sau 7-10 ngày, màng đạt độ dày nhất định.
* Đặc điểm sinh hóa Theo Frateur (1950), ông đứa ra khóa phân loại Gluconacetobacter xylinus dựa vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer… [9]
Gluconacetobacter xylinus có khả năng chịu được pH thấp, nên khi nuôi
cấy, người ta thưởng bổ sung thêm acid acetic để tránh sự nhiễm khuẩn lạ.
1.1.3. Tổng quan về Vật liệu cellulose (VLC)
1.1.3.1. Cấu trúc
- Vật liệu cellulose (VLC) do Gluconacetobacter xylinus tạo ra có cấu tạo gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit, đặc điểm này khiến VLC có đặc tính gần giống cellulose của tế bào thực vật. Điểm khác
14
nhau là VLC không chứa các hợp chất cao phân tử (peptin, hemicellulose, ligin và sáp nến…) Chính điều này làm nên tính vượt trội của VLC [5].
- Theo AJ. Brown (1886), VLC gồm nhiều sợi hemicellulose siêu nhỏ, có đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, các bó tiếp tục liên kết với nhau dài 100nm, rộng 3-8nm gọi là dãy.
- Trong tự nhiên cellulose có 2 dạng kết tinh phổ biến là I và II. Dạng cellulose I có thể chuyển hóa thành cellulose II nhưng không có chiều ngược lại. Cellulose I do Atalla và Vander tìm ra năm 1984, được tổng hợp từ thực vật và Gluconacetobacter xylinus ở môi trường tĩnh. Các chuỗi β-1,4 glucozen xếp song song nhau. Trong khi đó, cellulose II được tổng hợp từ môi trường lắc, có chứa các chuỗi β-1,4 glucozen sắp xếp ngẫu nhiên bằng một lượng lớn liên kết hydrogen, do vậy, chúng có độ bền về nhiệt. Cả 2 dạng cellulose đều có khả năng tổng hợp trong tự nhiên, tuy nhiên điều kiện nuôi cấy quyết định dạng kết tinh phổ biến [4].
1.1.3.2. Chức năng sinh lí của màng VLC đối với Gluconacetobacter xylinus
Tế bào Gluconacetobacter xylinus xen vào giữa mạng lưới cellulose. Các mạng lưới cellulose giúp chống đỡ cho vi sinh vật luôn ở trạng thái tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Bên cạnh đó, cellulose còn là nguồn dữ trữ dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển. Enzim exo-glucanase và endo-glucanase xúc tác cho sự phân hủy cellulose [5,6].
Nhờ khả năng thấm nước và tính dẻo của cellulose mà vi khuẩn ít chịu ảnh hưởng từ những môi trường như giảm pH, mất nước, xuất hiện độc tố và vi sinh vật gây bệnh. Bên cạnh đó, cellulose còn ngăn cản tia cực tím khiến Gluconacetobacter xylinus có khả năng sống sót sau 1 giờ chiếu tia UV liên tục. Khi vi khuẩn tách khỏi mạng lưới cellulose, khả năng sống sót của chúng chỉ còn 3% [5,6].
1.1.3.3. Tính chất độc đáo của màng VLC
Ngay từ đầu thế kỉ XIX, người ta đã tìm ra VLC và coi nó như một nguồn
nguyên liệu sinh học triển vọng với các đặc tính [3].
15
- Độ tinh khiết cao: VLC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp không chứa ligin và hemicellulose, do đó, VLC có thể phân hủy hoàn toàn và trở thành nguồn nguyên liệu tái sinh [10].
- Độ bền dai cơ học: Cellulose có trọng lượng nhẹ nhưng chịu được các lực
cơ học lớn, độ bền đáng kể [10].
- Khả năng hút nước cao: VLC có khả năng giữ nước rất lớn khi ở trạng thái ẩm. Nó có khả năng giữ được lượng nước nặng gấp 60 – 100 lần trọng lượng của nó [10].
- Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn hình thành trực tiếp màng VLC, do
đó, việc ứng dụng sản xuất giấy, sợi từ VCL không cần qua bước trung gian [3].
- Màng VLC được hình thành từ các sợi, các sợi này có khả năng biến động, xếp với nhau thành dãy tạo độ bền theo trục. Theo Brown và White (1989) tiến hành thí nghiệm dìm 1 khối đất xốp hình gang tay vào môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus, kết quả tế bào vi khuẩn tập hợp xung quanh khối đất xốp và tạo thành màng cellulose có hình gang tay. Do đó, ta có thể tạo màng cellulose theo hình mong muốn [3].
- Màng VLC có khả năng thay đổi tính chất. Ta có thể kiểm soát tính chất vật lí của cellulose phù hợp với mục đích sử dụng bằng cách bổ sung thuốc nhuộm vào môi trường nuôi cấy [3].
1.1.3.4. Các phương pháp sản xuất VLC từ Gluconacetobacter xylinus
* Lên men tĩnh Đổ môi trường dinh dưỡng để lên men Gluconacetobacter xylinus vào các khay lên men có mặt thoáng rộng. Đậy lên bề mặt khay các giấy báo có độ xốp, đảm bảo giảm khả năng nhiễm khuẩn nhưng vẫn tạo sự thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 28 – 300C. Sau 3 – 7 ngày, bề mặt nuôi cấy xuất hiện lớp màng cellulose, phân cách môi trường lỏng và môi trường không khí. Các sợi cellulose mới được tổng hợp tiếp tục di chuyển lên phía trên bám và màng cellulose tạo nên độ dày màng. Sau 7 – 10 ngày có thể thu màng VLC [11].
Như vậy lên men tĩnh là quá trình lên men không chịu sự tác động của các
16
yếu tố vật lí như khấy từ, lắc… Trong nghiên cứu này, tôi tập trung chủ yếu sử dụng phương pháp lên men tĩnh. * Lên men động: Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy và được lắc thường xuyên trong máy lắc ổn nhiệt. Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa, chuẩn bị các bình tam giác erlen đổ sẵn các môi trường nuôi cấy. Sau đó cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào bình, đem lắc trong các máy lắc ổn nhiệt 28 – 300C, 180 – 200 vòng/phút. VLC tạo ra từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hình sao hoặc dạng sợi dài, do chịu ảnh hưởng của môi trường lắc nên cellulose phân tán rất tốt và đều. Lượng Oxi hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp VLC, do vậy, để tăng hiệu suất của quá trình lên men ta cần sục khí thường xuyên [11].
1.1.3.5. Ứng dụng của màng VLC
VLC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như: dùng màng VLC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang,.. đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy ... Trong lĩnh vực y học, màng VLC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng VLC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng màng VLC giúp vết thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm trùng. Ngoài ra, màng VLC được sử dụng như trong một vài hệ thống để phân phối thuốc, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid [6,7,8].
Với những đặc tính nổi trội, VLC ngày càng được nghiên cứu nhiều và có
ứng dụng cụ thể trong bảng 1.1.
17
Bảng 1.1. Các ứng dụng của VLC [6]
LĨNH VỰC ỨNG DỤNG
SẢN PHẨM
Thực phẩm
Tráng miệng (thạch dừa), ăn kiêng (kem), vỏ bao xúc xích, thịt nhân tạo, nước uống siro không có cholesterol, trà Kobucha
Y dược Tác nhân vật chuyển thuốc, màng trị bỏng, da nhân
tạo, chất làm co mạch
Mỹ phẩm Móng nhân tạo
Môi trường Hấp thụ chất độc, quần áo, giày dép tự phân hủy
Dầu mỏ Thu hồi dầu
Trang phục Sản xuất sợi nhân tạo, y phục quân đội
Thể thao Lều lắp ráp
Sản phẩm rừng
Gỗ nhân tạo, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ, thùng hàng có độ bền cao
Lĩnh vực khác Làm màng lọc
1.2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.2.1. Trên thế giới
Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus và màng VLC đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và có nhiều giá trị ứng dụng. Các nghiên cứu hiện nay tập trung vào nhiều lĩnh vực khác nhau.
Nghiên cứu VLC từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus được nghiên cứu trên nhiều quốc gia. Tác giả Brown dùng màng cellulose làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang năng lượng cho pin và tế bào [8]. Brown, Jonas và Farad dùng màng như một chất biến đổi độ nhớt, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm.
Đặc biệt trong y học, các nhà khoa học đã tìm ra phức chất (composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinyl. Các phức chất này có ứng dụng lớn trong việc điều trị bỏng và vết loét dưới da.
18
Những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng VLC, đồng thời, nghiên cứu sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn; nghiên cứu về con đường hình thành cellulose vi khuẩn, nghiên cứu về cấu trúc sợi cellulose và các đặc tính của màng cellulose; mối quan hệ giữa khả năng hình thành màng cellulose và acid acetic [13]. Trong khi đó, Alina Krystynowicz và cộng sự (2005) đã so sánh đặc điểm sinh học phân tử của chủng Gluconacetobacter (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến (không có khả năng tổng hợp cellulose). Tác giả Neelobon và cộng sự (2007) nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc, nuôi cấy bioreactor) đến khả năng hình thành màng [14]. Năm 2008, Barbara Surma và cộng sự [15] đã đưa ra phương pháp chế tạo màng và ảnh hưởng của nguồn carbon, glucose, manitol đến sự hình thành màng; nghiên cứu đặc điểm, cấu trúc màng cellulose và ứng dụng của nó trong sản xuất giấy.
1.2.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu còn khá mới mẻ, mới chỉ quan tâm đến quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc màng. Về ứng dụng thực tiễn mới chỉ ứng dụng thực tiễn cho quá trình trị bỏng như đề tài của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh (2007) ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Năm 2011, có nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh [5] đã công bố 12 công trình nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylium tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”. Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Kim Ngoan đã thu nhận màng từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus và ứng dụng nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái tới quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Sprirulina” [5].
Hiện nay các nghiên cứu chủ yếu đi sâu về ứng dụng chế tạo màng sinh học trong trị bỏng và ứng dụng sản xuất thạch dừa. Hiện nay, việc nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho khả năng hấp thụ thuốc đối với màng VLC còn mới và ít thành tựu.
19
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già.
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
* Giống vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus dùng lên men thu nhận vật liệu VLC được nhập từ Nhật Bản, được dự trữ bởi Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, khoa Sinh – KTNN, trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2.
* Nguyên liệu và hóa chất
- Nguyên liệu: Nước dừa già, nước cất 2 lần, gạc vô trùng. - Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và hóa chất thông thường
có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam.
+ Diclofenac + Pepton + Đường glucose + Diamonium hydrogen phosphate (NH4)2HPO4 + Amoni sunfat (NH4)2SO4 + NaOH + Nước cất + Acid acetic CH3COOH
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy đo quang phổ UV – Nhật Bản - Cân phân tích, cân kỹ thuật – Nhật Bản - Nồi hấp khử trùng, buồng cấy vô trùng – Trung Quốc - Tủ sấy, tủ ấm, máy khuấy từ gia nhiệt – Nhật Bản
20
- Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.3. Môi trường nghiên cứu
- Môi trường nuôi cấy G. xylinus là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sunfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và vi lượng. Để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tạo màng cellulose từ G. xylinus tôi lựa chọn môi trường dinh dưỡng nước dừa già để nuôi cấy.
- Nước dừa già là môi trường thích hợp để thu VLC từ Gluconacetobacter xylinus. Đây là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích sinh trưởng như: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol,…
- Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản trong 3 ngày, tránh để lâu khiến hàm lượng đường và chất dinh dưỡng suy giảm. Thành phần môi trường nước dừa già được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng môi trường nước dừa già [10]
THÀNH PHẦN
THÀNH PHẦN
TỈ LỆ
TỈ LỆ 0,1
Nước (%) 94,99 Kẽm (mg/100g)
0,04 Protein (%) 0,72 Đồng (mg/100g)
0,142 Chất béo toàn phần (%) 0,2 Mangan (mg/100g)
1 Carbonhydrat (%) Selenium (µg/100g) 3,17
2,4 Đường (%) Vitamin C (mg/100g) 2,16
0,03 Calcium (mg/100g) 24 Thiamin (mg/100g)
0,057 Sắt (mg/100g) 0,29 Riboflavin (mg/100g)
0,08 Magiê (mg/100g) Niacin (mg/100g) 25
0,043 Phosphorus (mg/100g) Acid Pathenic (mg/100g) 20
0,032 Kali (mg/100g) Vitamin B6 (mg/100g) 250
3 Natri (mg/100g) Folate (mg/100g) 105
21
2.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8/2018 đến tháng 3/2019
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tạo màng VLC lên men từ môi trường nước dừa già
VLC được tạo ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus lên men trong môi
trường nước dừa già (MTD)
Bước 1: Chuẩn bị các bình và dụng cụ và cho vào sấy. Với dụng cụ vật liệu từ thủy tinh, sấy ở nhiệt độ 2000C, với các dụng cụ vật liệu từ nhựa, sẩy ở nhiệt độ 500C. Sấy xong lấy ra để nguội dụng cụ.
Bước 2: G. xylinus được nuôi cấy trong môi trường cải biến môi trường chuẩn bằng cách thay cao nấm men bằng nước dừa già và được trình bày theo Bảng 2.2.
Lưu ý: pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH; pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4-6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác.
22
Bảng 2.2. Môi trường dừa lên men tạo vật liệu VLC
Thành phần MTD
Glucose 20g
Pepton 10g
Diamoni photphat 0,3g
Amoni sulfat 0,5g
Acid acetic 2%
Nước dừa già 1000ml
Dịch giống 10%
Bước 3: Hấp khử trùng các môi trường ở nhiệt độ 1130C trong 15 phút (phải
bọc các bình bằng giấy bạc).
Bước 4: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trường.
Bước 5: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch (trong quá trình này phải chú ý để môi trường và dịch giống không bị nhiễm khuẩn).
Bước 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày ở 280C.
Bước 7: Thu vật liệu VLC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước (xả nước nhẹ).
2.3.2. Xử lý VLC
Mục đích: Loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời, phá
hủy và trung hòa độc tố vi khuẩn.
Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, màng VLC nổi trên bề mặt môi trường,
thu màng loại bỏ môi trường.
- Trong vật liệu chứa một lượng lớn vi khuẩn, vì vậy, hấp vật liệu trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ.
23
- Sau khi ngâm NaOH, vớt vật liệu đặt dưới vòi nước chảy đến khi vật liệu trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt VLC cần đạt là trung tính, ta thu được VLC tinh khiết.
2.3.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng VLC
* Mục đích: Nhằm đảm bảo màng VLC sau khi xử lý đã loại được loại các
tạp chất có thể gây độc hại. Chất được khảo sát là protein của vi khuẩn. * Tìm sự hiện diện của protein trong màng VLC tinh chế Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo kết tủa
của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: Màng VLC tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất, lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng.
+ Mẫu chứng âm (Mẫu đối chứng) là nước cất. + Mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để nuôi
cấy vi khuẩn). Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục.
So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein [10, 11]. Màng VLC tinh
chế dùng để tạo màng nạp thuốc phải đạt được những tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính
che phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô [7].
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri trong dung dịch methanol
Nguyên lí: Sử dụng máy UV-2450 (Shimadru - Nhật Bản) đo quang phổ
hấp thụ của Diclofenac natri ở các nồng độ khác nhau với bước sóng 283 nm [9].
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: Methanol - Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc Diclofenac natri ở các nồng độ (mg/ml)
khác nhau: 10%, 20%, 40%, 60%, 80% và 100% mg/ml trong dung môi methanol.
24
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 đo mật độ quang phổ (OD)
của các dung dịch đã pha ở trên với bước sóng 283 nm [9].
- Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Phương trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Diclofenac natri và độ hấp thụ được xử lí bằng phần mềm Excel 2016.
- Giá trị mật độ OD của dung dịch thuốc Diclofenac natri ở các nồng độ
khác nhau được thể hiện trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n=3)
Giá trị OD 283 nm STT Nồng độ Giá trị trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 10% 0,105 0,106 0,103 0,105 ± 0,002
2 20% 0,288 0,29 0,291 0,290 ± 0,002
3 40% 0,587 0,589 0,583 0,586 ± 0,003
4 60% 0,769 0,765 0,768 0,767 ± 0,002
5 80% 1,052 1,053 1,058 1,054 ± 0,003
6 100% 1,312 1,313 1,314 1,313 ± 0,001
Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofemac bằng phần mềm Ecel
2016, kết quả được biểu thị ở Hình 2.1.
25
- 0.1655 R² = 0. 996
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac natri tại λ =283nm
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ x và độ hấp thụ OD y có dạng:
y = 0,2432x – 0,1655 với R2 = 0,996
Trong đó: y: Giá trị OD tương ứng với nồng độ x
x: Nồng độ của Diclofenac natri (mg/ml) R: Hệ số tương quan bình phương
2.3.5. Xác định lượng thuốc được hấp thụ qua màng VLC
Lượng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng VLC được tiến hành thí
nghiệm trên 4 mẫu với 2 độ dày màng khác nhau:
- Mẫu 1: màng VLC có độ dày 0.5cm, giữ nguyên - Mẫu 2: màng VLC có độ dày 0.5cm, ép 50% - Mẫu 3: màng VLC có độ dày 1 cm, giữ nguyên - Mẫu 4: màng VLC có độ dày 1 cm, ép 50% Chuẩn bị 4 bình tam giác, mỗi bình chứa 90ml dung dịch thuốc Diclofenac natri nồng độ 10%. Cho lần lượt vào các bình 4 mẫu màng, mỗi mỗi số lượng khoảng 10 màng đã đục nhỏ kích thước d=1cm. Cho các bình vào máy lắc với chế độ lắc 200 vòng/phút. Sau những khoảng thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ
26
tiến hành rút mẫu ra đo quang phổ bằng máy UV – 2450 để xác định lượng thuốc còn lại trong dung dịch tại thời điểm lấy mẫu.
Pha dung dịch thuốc Diclofenac natri trong dung dịch đệm methanol. (Hình 2.2). Cho màng VLC vào các bình chứa 90ml dung dịch Diclofenac natri được thể hiện ở Hình 2.3.
b a
Hình 2.2. Chuẩn bị dung dịch thuốc Diclofenac natri cần hấp thu
Hình 2.3. Bình chứa màng chuẩn bị hấp thụ thuốc
27
Sau khi cho màng vào dung dịch Diclofenac natri, đặt các bình vào máy lắc với chế độ 200vòng/phút, được thể hiện ở Hình 2.4.
Hình 2.4. Màng VLC đang hấp thụ
Qua các lần đo, xác định thời điểm lượng thuốc hấp thụ vào màng đến giá trị OD không đổi hoặc không đáng kể. Lặp lại thí nghiệm 3 lần để lấy giá trị trung bình tính toán.
𝒎𝒄𝒕 (𝒎𝒈)
- Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được nồng độ Diclofenac natri (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng Diclofenac natri trong dung dịch theo công thức:
𝑽𝒅𝒅 (𝒎𝒍)
C% (w/v) = (1) 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
Trong đó: + C%: Là nồng độ phần trăm khối lượng – thể tích + mct: Khối lượng chất tan có trong dung dịch (mg) + Vdd: Thể tích của dung dịch (ml)
- Sau khi tính được lượng thuốc Diclofenac natri có trong dung dịch, ta tính
được khối lượng Diclofenac natri hấp thụ vào màng theo công thức:
mht = m1 – m2 (2)
Trong đó: + mht - Khối lượng thuốc đã được hấp thụ vào màng
+ m1 - Khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch (mg)
28
+ m2 - Khối lượng thuốc có trong dung dịch sau hấp thụ thuốc (mg)
- Tỉ lệ thuốc được hấp thụ vào màng được tính theo công thức:
𝑸𝒕
(3) EE (%) = 𝑸𝒕−𝑸𝒅 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
Trong đó: + EE: Phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng (%) + Qt: Lượng thuốc ban đầu cho (mg) + Qd: Lượng thuốc còn lại (mg)
2.3.6. Phương pháp xử lý thống kê
Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2016 và phần mềm JMP phiên bản 9.0. Kết quả được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của các mẫu bằng cách sử dụng hàm t-test thống kê: Two Sample Assuming Unequal Variences với mức ý nghĩa α = 0,05. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi trị số p<0,05.
29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu VLC từ G. xylinus trong môi trường nước dừa già
Vi khuẩn G. xylinus khi được bổ sung vào môi trường sẽ sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường nước dừa già để tổng hợp nên cellulose. Giai đoạn đầu, vi khuẩn thích nghi với môi trường, tích lũy dần chất dinh dưỡng và năng lượng chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo.
Những ngày tiếp theo, vi khuẩn bắt đầu sinh trưởng, đi vào giai đoạn phát triển mạnh. G. xylinus bắt đầu sản sinh một lớp màng trên bề mặt môi trường có màu trắng đục, chứa nhiều tạp chất. Lớp màng này dần dần dày lên đến khi môi trường hết chất dinh dưỡng, vi khuẩn ngừng sinh trưởng.
Sau thời gian 7-10 ngày nuôi cấy tĩnh, màng có độ dày 0,5 – 1 cm. Độ dày
màng tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy.
Kết quả tạo màng VLC từ vi khuẩn G. xylinus dược thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Hình ảnh màng VLC được lên men từ môi trường nước dừa già
3.1.1. Thu màng VLC được lên men trong môi trường nước dừa già
Kết quả thu màng VLC tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi
trường nước dừa già được thể hiện ở hình 3.2.
30
Hình 3.2. Màng VLC thu được có độ dày 0,5cm và 1cm
Từ hình 3.2 ta thấy, màng VLC nuôi cấy trong môi trường nước dừa già có màu trắng ngà, bề mặt trơn, chứa nhiều nước, dẻo dai. Vi khuẩn G. xylinus trong môi trường nuôi cấy sử dụng chất dinh dưỡng có trong màng để sinh trưởng và phát triển liên tục. Chúng sản sinh liên tục các sợi cellulose nổi lên và bám lên bề mặt màng, tạo nên độ dày màng. Do đó, thời gian nuôi cấy càng lâu thì độ dày lớp màng VLC càng lớn, đến khi môi trường hết chất dinh dưỡng, G. xylinus ngừng sinh trưởng thì độ dày màng mới ngừng tăng.
3.1.2. Đo bề dày của các loại vật liệu VLC
- Độ dày của màng phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy vi khuẩn
Gluconacetobacter xylinus.
- VLC được nuôi cấy trong MTD được thể hiện ở hình 3.3.
31
Hình 3.3. Màng VLC có độ dày 0,5cm (a) và màng VLC có độ dày 1cm (b)
3.1.3. Kết quả trình xử lý VLC trước khi hấp thụ Diclofenac natri
Hình 3.4. Màng VLC sau khi được xử lí bởi NaOH
32
Hình 3.5. Màng VLC tinh khiết có d = 1 cm
Hình 3.6. Màng VLC sau khi ép 50% nước
3.2. Kết quả sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già
33
Sau các khoảng thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ lấy dung dịch ra đo quang phổ bằng máy UV - 2450 xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng, kết quả đo quang phổ được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng VLC (n=3)
Mật độ quang OD (Abs 283nm)
GIÁ TRỊ OD THEO THỜI GIAN
ĐỘ DÀY MÀNG
ĐẶC ĐIỂM CỦA MÀNG
0,5 giờ 1 giờ 1,5 giờ 2 giờ
Màng giữ nguyên 1,098 ±0,0028 0,992 ±0.0031 0,876 ±0.0034 0,543 ±0,0025 0,5 cm
Màng ép loại nước 50% 1,087 ±0.0016 0,921 ±0.0018 0,754 ±0.0027 0,539 ±0.0024
Màng giữ nguyên 1,071 ±0.0019 0,897 ±0.0012 0,870 ±0.0015 0,578 ±0.0017 1 cm
Màng ép loại nước 50% 1,028 ±0.0023 0,789 ±0.0031 0,886 ±0.0027 0,532 ±0.0021
Từ kết quả thu được ở bảng 3.1 ta thấy sau 2 giờ lắc màng, giá trị OD thu được gần như không giảm, chứng tỏ lượng thuốc hấp thụ vào màng đã đạt cực đại. Lấy giá trị đo OD thu được từ bảng 3.1 thay vào phương trình đường chuẩn của Diclofenac natri, ta tìm được nồng độ Diclofenac natri (%) trong dung dịch, lấy C% thay vào công thức (1) ta được khối lượng Diclofenac natri có trong dung dịch (mct). Lấy khối lượng Diclofenac natri có trong dung dịch thay vào công thức (2) ta được khối lượng Diclofenac natri hấp thụ vào màng VLC (mht), tiếp tục lấy khối lượng Diclofenac natri được hấp thụ vào màng thay vào công thức (3) ta được tỉ lệ thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng VLC.
Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng VLC ở các độ dày khác nhau tại thời
điểm 2 giờ được thể hiện ở Bảng 3.2.
34
Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào màng VLC (mht) và tỉ lệ hấp thụ thuốc (EE%) với độ dày màng khác nhau tại thời điểm 2 giờ
Màng giữ nguyên Màng ép 50% nước
0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm
mht
22,10 ±0,0022 22,01 ±0,0026 22,47 ±0,0019 22,34 ±0,0024
EE%
88,40 ±0,0028 88,03 ±0,0031 89,86 ±0,0041 89,37 ±0,0033
Bảng 3.2 cho thấy: + Trong cùng điều kiện thì lượng thuốc hấp thụ vào màng có độ dày 0,5cm
nhiều hơn so với màng có độ dày 1cm.
+ Trong cùng một độ dày màng thì màng ép 50% nước hấp thụ tốt hơn màng
giữ nguyên.
+ Màng 0,5cm ép 50% nước có khả năng hấp thụ thuốc tốt nhất.
22.47
) g m
( ụ h
t
p ấ h c ố u h
t
g n ợ ư
l i
ố h K
Màng giữ nước
Màng ép 50% nước
Tất cả sự sai khác này có nghĩa thống kê với p < 0,05. Tỉ lệ thuốc hấp thụ vào màng VLC khác nhau với độ dày màng khác nhau trong 2 giờ được trình bày ở Hình 3.7 và Hình 3.8.
Hình 3.7. Khối lượng thuốc hấp thụ trong cùng độ dày màng
35
89.86
% E E
Màng giữ nước
Màng ép 50% nước
0.5 cm 1 cm
Hình 3.8. Tỉ lệ thuốc hấp thụ trong các độ dày màng khác nhau
Số liệu trong Bảng 3.2 và các Hình 3.7 và Hình 3.8 cho thấy:
Sau 2 giờ, xét cùng loại màng giữ nước, màng VLC độ dày 0,5cm có hiệu suất hấp thụ 88,4%, trong khi màng VLC độ dày 1cm hiệu suất hấp thụ 88,03%.
Như vậy, màng giữ nguyên độ dày 0,5cm có hiệu suất hấp thụ thuốc
Diclofenac natri cao hơn màng cùng loại độ dày 1cm.
Xét cùng loại màng ép 50% nước, màng VLC có độ dày 0,5cm có hiệu suất hấp thụ là 89,86%, và màng VLC độ dày 1cm có hiệu suất hấp thụ 89,37%. Như vậy, ở loại màng ép 50% nước, màng VLC có độ dày 0,5cm vẫn hấp thụ thuốc tốt hơn màng có độ dày 1cm.
Xét trong cùng 1 độ dày màng, ở VLC độ dày 1cm, màng giữ nguyên có khối lượng hấp thụ thuốc là 22,01 mg, trong khi màng ép 50% nước có khối lượng hấp thụ thuốc Diclofenac natri là 22,34 mg. Như vậy trong cùng độ dày 1cm, màng ép 50% nước hấp thụ thuốc tốt hơn màng giữ nguyên.
Tương tự đối với vật liệu VLC có độ dày màng 0,5cm, màng ép 50% nước
cũng có khối lượng hấp thụ (22,47 mg) cao hơn màng giữ nước (22,1 mg).
Nhìn vào sơ đồ Hình 3.7 và Hình 3.8, ta thấy, vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus lên men trong môi trường nước dừa già hấp thụ thuốc Diclofenac natri cao nhất ở màng ép 50% nước độ dày 0,5cm.
36
Tất cả sự sai khác này đều có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Có thể thấy màng giữ nguyên hấp thụ thuốc kém hơn màng ép nước 50% và màng mỏng d=0,5cm hấp thụ thuốc tốt hơn màng dày d=1cm. Điều này có thể giải thích do màng mỏng các sợi cellulose liên kết lỏng lẻo màng có nhiều khoảng trống tạo điều kiện giúp màng hấp thụ thuốc tốt hơn.
Như vậy, so sánh với kết quả của các công trình nghiên cứu tương tự như Nguyễn Thị Hà năm 2017, “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng celluloso vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già” [10], ta thấy có sự sai lệch nhỏ về số liệu đo OD và tỉ lệ hấp thụ thuốc giữa các loại màng, nhưng kết luận về so sánh khả năng thấm hút nước của các loại màng trùng khớp, màng ép nước 50% độ dày d=0,5cm vẫn có khả năng hấp thụ cao nhất. Sự sai khác này có thể do tôi nghiên cứu loại thuốc khác so với tác giả Nguyễn Thị Hà, sử dụng vi khuẩn lên men màng là Gluconacetobacter xylinus khác với tác giả, hoặc trong quá trình làm thí nghiệm có sự chênh lệch về số liệu thống kê …
37
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Sau khi hoàn thành xong khóa luận, tôi thu được các kết quả như sau:
- Thu được màng VLC tinh khiết tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già với độ dày 0,5cm và 1cm. Màng VLC có chất lượng phù hợp với nhu cầu làm thí nghiệm.
- Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng VLC trong môi trường
nước dừa già đạt cực đại tại 2 giờ.
- Ở cùng một độ dày màng thì màng ép 50% hấp thụ thuốc Diclofenac natri
cao hơn màng giữ nguyên.
- Màng VLC ở độ dày 0,5cm, có khả năng hấp thụ thuốc tốt hơn màng VLC
có độ dày 1cm trong cùng khoảng thời gian.
- Màng VLC ở độ dày 0,5cm, ép 50% nước có khả năng hấp thụ thuốc tốt
nhất. 4.2. Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng VLC ở môi trường nước dừa già và một số môi trường khác nhằm mở rộng nguồn nguyên liệu phục vụ cho quá trình tạo ra màng VLC trên quy mô lớn.
- Tiếp tục nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng VLC ở các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu cho sự hấp thụ thuốc.
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
[1] Trường Đại học dược Hà Nội, “Hội nghi khoa học bộ môn bào chế trường Đại học dược Hà Nội”.
[2] Nguyễn Ngọc Mai, “Nghiên cứu khả năng tạ màng VLC từ chủng Gluconacetobacter dưới tác dụng của tia UV”, Luận văn thạc sĩ Sinh học.
[3] Nguyễn Thúy Hương, Bùi Thị Thanh Hương, “Nghiên cứu điều kiện cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae N28 bằng chất mang cellulose vi khuẩn và bước đầu ứng dụng trong lên men rượu vang”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(3): 383-389, 2008.
[4] Dương Minh Lam, Nguyễn Thị Thủy Vân, Đinh Thị Kim Nhung, “Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng vi khuẩn BHN2 sinh màng cellulose”, Tạp chí Sinh học, 2013.
[5] Nguyễn Thị Kim Ngoan, “Ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái tới quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Sprirulina”, Luận văn thạc sĩ Sinh học.
[6] Đặng Thị Hồng (2007), “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (VLC), Luận văn thạc sỹ Sinh học ĐHSP Hà Nội.
[7] Nguyễn Bình (2000), Các quá trình thiết bị trong công nghệ hóa chất và thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật.
[8] Bộ Y tế (2013), Danh mục thuốc tân dược thiết yếu lần thứ VI,
[9] Lê Hậu, Hoàng Minh Châu, Lê Quan Nghiệm, Ampol Mitrevej, “Điều chế vi hạt diclofenac phóng thích hoạt chất kéo dài bằng thiết bị tầng sôi”, Y học TP.Hồ Chí Minh, Tập 6 (2002).
[10] Nguyễn Thị Hà, 2017, “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng celluloso vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”
Tài liệu tiếng Anh:
[11] Stanislaw Bielecki, Alina Krystynowies Marianna, Turkiewies, Halina Kalinowska (1981), "Bacterial cellulose", Technical University of Ldz, Stefanowskieg, Poland, 901-924.
[12] Chein Y. W., Cabana B. E., Mares S. E. (1982). “Ocular controlled release drug administration”, Drugs anf the pharmaceutical sciences, Vol.14
[13] Alexander Steinbudel, Sang Ki Rhee, (2005), Polysaccharisders and
polyamides in the food industry, www.wiley.vch. Pp. 31-85.
[14] Neelobon S. Jirapora B. Swanncee T.. (2007). “Effect of culture conditions on bacterial cellulose (VLC) production from Acetobacter xylium TISTR976 and physical properties of VLC parchmem paper”, Suranaree J.Scri. Technol. Vol 14
[15] Frateur J. (1950), Essal sur la sysemasique des Acetobacter, La cellule, Vol. 53, pp. 278-389.
