Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

49
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Mô tả kết quả tách chiết, tinh sạch hoạt chất chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger; xác định độ tinh sạch và giá trị IC50 của dịch chiết và sản phẩm cuối tinh sạch chứa hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1. TS. ĐỖ THỊ TUYÊN 2. ThS. ĐỖ THỊ QUỲNH HÀ NỘI - 2021
LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin được cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã truyền cảm hứng, tận tình hướng dẫn, đưa ra những góp ý và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như kinh phí để thực hiện đề tài khóa luận này. Em xin được chân thành cảm ơn tới ThS. Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra những lời khuyên quý báu, những kinh nghiệm nghiên cứu cũng như giúp đỡ em tận tình trong thời gian làm khóa luận. Tiếp đến em xin cảm ơn tập thể các anh chị, cán bộ Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trong quá trình thực nghiệm vừa qua, cũng như là chia sẻ những kinh nghiệm rất đáng quý, có ứng dụng thực tế cao trong từng thí nghiệm. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô chủ nhiệm và các thầy cô bộ môn Y Dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội trong suốt khoảng thời gian 5 năm vừa rồi đã cung cấp cho bản thân em rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập. Đồng thời em cũng xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên và tiếp thêm sức mạnh cho tôi trong những lúc khó khăn nhất. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Bùi Hồng Sơn
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ AGIs Các chất ức chế α-glucosidase DC Đối chứng DNJ 1-deoxynojirimycin ĐTĐ Đái tháo đường HPLC Sắc lý lỏng hiệu năng cao IC50 Nồng độ ức chế 50% IDF Hiệp hội Đái tháo đường thế giới LC/MS Sắc ký lỏng khối phổi Mật độ quang học của mẫu tại bước sóng OD405 405nm TLC Sắc ký lớp mỏng UV Tia tử ngoại
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số hoạt chất ức chế α-glucosidase từ vi sinh vật ............................... 15 Bảng 2.1. Thiết bị thí nghiệm.................................................................................... 22 Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng ................................................................................ 23 Bảng 2.3. Thành phần các loại đệm và dung dịch .................................................... 24 Bảng 2.4. Tính chất đặc trưng của đầu dò hấp thụ UV và đầu dò khối phổ ............. 31 Bảng 3.1. Quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase bằng các dung môi .................................................................................................................................. .33 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch thu nhận hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 ........................................................................................ 37 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính tại các nồng độ khác nhau của dịch chiết n-butanol ................................................................................................................................... 40 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính tại các nồng độ khác nhau của mẫu tinh sạch cuối .................................................................................................................................. .42
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của các thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2 ................................... 6 Hình 1.2. Lược đồ lựa chọn thuốc và phương pháp điều trị ĐTĐ tuýp 2 ................... 7 Hình 1.3. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH13 ...................... 10 Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH31 ...................... 11 Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzyme α-glucosidase tại ruột non ................................................................................................................................... 12 Hình 1.6. Cấu trúc của acarbose, miglitol, voglibose và DNJ .................................. 13 Hình 1.7. Cấu trúc của các dẫn xuất monosaccharide .............................................. 14 Hình 1.8. Đặc điểm hình thái bào tử sau khi nuôi cấy 7 ngày chủng A. niger VTCC 031 trên đĩa thạch ...................................................................................................... 18 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu ....................................................................... 25 Hình 2.2. Các bước tiến hành tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 ........................................................................................................ 27 Hình 3.1. Thu hoạch bình nuôi cấy chủng A. niger .................................................. 32 Hình 3.2. Khả năng tách các chất trong các mẫu dịch chiết khi sử dụng 9 hệ dung môi khác nhau ........................................................................................................... 34 Hình 3.3. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel lần thứ nhất ................................................................................................................ 35 Hình 3.4. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn từ 17 đến 21 sau khi qua cột silica gel lần thứ nhất .................................................................................... 36 Hình 3.5. Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột silica gel lần thứ hai .................................................................................................................. 37 Hình 3.6. Kiểm tra độ tinh sạch cả quá trình bằng TLC ........................................... 38 Hình 3.7. Kiểm tra độ tinh sạch bằng HPLC và LC/MS .......................................... 39 Hình 3.8. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch chiết n- butanol ....................................................................................................................... 41 Hình 3.9. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của acarbose tinh khiết (Sigma) ............................................................................................................. 41 Hình 3.10. Xây dựng đường chuẩn hoạt tính ức chế α-glucosidase của mẫu tinh sạch cuối ............................................................................................................................ 42
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 1.1. Bệnh đái tháo đường .......................................................................................... 2 1.1.1. Khái niệm .......................................................................................................... 2 1.1.2. Phân loại ............................................................................................................ 2 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng ....................................................................... 3 1.1.4. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường .................................................... 5 1.2. Enzyme α-glucosidase ........................................................................................ 9 1.2.1. Giới thiệu chung về -glucosidase ................................................................... 9 1.2.2. Cấu trúc của -glucosidase ............................................................................. 10 1.2.3. Cơ chế hoạt động của enzyme trong cơ thể .................................................... 11 1.3. Chất ức chế α-glucosidase ............................................................................... 12 1.3.1. Giới thiệu và cơ chế hoạt động của chất ức chế enzyme α-glucosidase ......... 12 1.3.2. Phân loại chất ức chế enzyme α-glucosidase .................................................. 14 1.3.3. Nguồn gốc chất ức chế enzyme α-glucosidase ............................................... 15 1.4. Giới thiệu về chủng nấm sợi Aspergillus niger .............................................. 18 1.5. Tình hình nghiên cứu hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus trong nước và quốc tế .......................................................................... 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 22 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 22 2.3. Thiết bị phòng thí nghiệm và hóa chất ........................................................... 22 2.4. Môi trường nuôi cấy......................................................................................... 24 2.5. Quy trình tiến hành nghiên cứu ...................................................................... 24 2.6. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 25 2.6.1. Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase ................................................. 25 2.6.2. Tách chiết, tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ dịch nuôi cấy ................................................................................................................................... 26
2.6.3. Xác định giá trị IC50 ........................................................................................ 30 2.6.4. Kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ ................................................................................................................................... 30 2.6.5. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 32 3.1. Kết quả tinh sạch hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng A. niger VTCC 031 ................................................................................................................ 32 3.1.1. Kết quả quá trình tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase với các dung môi ................................................................................................................................... 32 3.1.2. Nghiên cứu chọn lựa các hệ dung môi pha động chạy sắc ký cột .................. 34 3.1.3. Kết quả tinh sạch bằng cột sắc ký silica gel 60 ............................................... 35 3.2. Xác định IC50 của dịch chiết n-butanol và của mẫu tinh sạch cuối cùng ... 40 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 44 ĐỀ XUẤT ................................................................................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 46
ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh đái tháo đường đang được coi là một trong những vấn đề sức khỏe toàn cầu. Theo báo cáo của Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế (IDF), số lượng bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới dự kiến có thể gần 700 triệu người vào năm 2045. Tại Việt Nam, theo ước tính của Bộ Y tế, đối với người tuổi từ 20 - 79, bệnh đái tháo đường sẽ tăng khoảng 78,5% trong giai đoạn 2017 - 2045 (từ 3,53 triệu bệnh nhân năm 2017 có thể tăng lên 6,3 triệu người mắc đái tháo đường vào năm 2045). Không những thế, dưới ảnh hưởng nghiêm trọng của đại dịch toàn cầu COVID-19, quá trình điều trị cho những bệnh nhân đái tháo đường càng trở nên khó khăn hơn. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bệnh nhân đái tháo đường kiểm soát đường huyết kém hơn khi mắc COVID-19 có tỷ lệ tử vong cao hơn khoảng 4 lần và thời gian nằm viện lâu hơn so với bệnh nhân không bị đái tháo đường [14, 64]. Một trong các nhóm thuốc đang được sử dụng để điều trị đái tháo đường hiện nay là nhóm chất ức chế α-glucosidase, được sử dụng phổ biến trên lâm sàng điển hình như: acarbose, voglibose, miglitol. Nhóm thuốc này thường được sử dụng phối hợp với các thuốc đầu tay khác như metformine, nhóm đồng vận thụ thể GLP-1 ,… cho kết quả điều trị tốt tuy nhiên chúng vẫn được ghi nhận những tác dụng không mong muốn như: đau đầu, mất ngủ, buồn nôn, đầy hơi và tiêu chảy [15]. Vì vậy việc tìm kiếm một hợp chất an toàn và thuận tiện cho việc sản xuất đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, một trong các nguồn nguyên liệu phong phú nhất là nguồn từ các chủng vi sinh vật do chúng có một quần thể vô cùng rộng lớn, có thể phát triển mạnh và không gây ô nhiễm môi trường xung quanh. Đặc biệt là chủng nấm Aspergillus với nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy ứng dụng của chúng đối với việc tổng hợp các hoạt chất thứ cấp do hoạt tính sinh học dùng để điều trị bệnh [16, 31, 39]. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger” với các mục tiêu sau: - Mô tả kết quả tách chiết, tinh sạch hoạt chất chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger; - Xác định độ tinh sạch và giá trị IC50 của dịch chiết và sản phẩm cuối tinh sạch chứa hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Bệnh đái tháo đường 1.1.1. Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) là hội chứng các rối loạn chuyển hóa mãn tính, phức tạp được đặc trưng bởi sự tăng glucose máu do tụy không sản xuất đủ insulin hoặc do cơ thể sử dụng insulin không hiệu quả hoặc cả hai [43]. Bệnh lý này có thể gây ra những tổn thương lâu dài trong nhiều hệ cơ quan như: tổn thương võng mạc, tim, thận, não và hệ thống mạch máu với các bệnh điển hình như bệnh thận do tiểu đường, bệnh võng mạc đái tháo đường, suy gan, tổn thương hệ thần kinh... nếu bệnh nhân không phát hiện, điều trị và tuân thủ điều trị nghiêm ngặt [15]. 1.1.2. Phân loại Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2021, ĐTĐ có các loại sau: ĐTĐ tuýp 1, ĐTĐ tuýp 2, ĐTĐ thai kỳ, ĐTĐ do các nguyên nhân khác [11]. Đái tháo đường tuýp 1 ĐTĐ tuýp 1, trước đó được gọi là ĐTĐ tuổi vị thành niên, được gây ra bởi quá trình tự miễn làm tổn thương tế bào beta (β) đảo tụy dẫn đến tình trạng giảm sản xuất tuyệt đối insulin. Về mặt dịch tễ học, nó chiếm 5-10% số người mắc ĐTĐ. Đái tháo đường tuýp 2 ĐTĐ tuýp 2, hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, ĐTĐ người lớn, chiếm khoảng 90-95% số người mắc ĐTĐ. Bệnh được gây ra trên nền tảng cơ thể giảm tiết insulin tương đối ở tế bào β tuyến tụy và hình thành sự kháng insulin ở tế bào. Hầu như bệnh nhân không cần điều trị bằng liệu pháp insulin trong cả cuộc đời. Đái tháo đường do các nguyên nhân khác ĐTĐ do các nguyên nhân khác, hay còn gọi là đái tháo đường thứ cấp, gồm: hội chứng đái tháo đường đơn gen (gồm đái tháo đường khởi phát ở trẻ nhỏ và đái tháo đường sơ sinh), do bệnh tụy ngoại tiết, do bệnh nội tiết, do cảm ứng thuốc, đái tháo đường qua trung gian miễn dịch và đái tháo đường do các hội chứng di truyền. Đái tháo đường thai kỳ ĐTĐ thai kỳ - một loại rối loạn chuyển hóa phổ biến nhất ở phụ nữ mang thai - được định nghĩa là hiện tượng rối loạn dung nạp glucose, được phát hiện vào giai 2
đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ mà trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu rõ ràng của bệnh đái tháo đường. Một trong những hậu quả của tình trạng béo phì ngày càng phổ biến cũng như trường hợp khi thai phụ đã lớn tuổi là sự tăng lên về tỷ lệ ĐTĐ thai kỳ trên thế giới, đặt ra một gánh nặng lớn lên hệ thống y tế công [11, 65]. Thực tế cho thấy ĐTĐ thai kỳ có nguy cơ gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng cho mẹ và thai nhi như phải sinh mổ, đẻ khó do kẹt vai, hội chứng macrosomia ở thai nhi … [21]. Hơn nữa, thai phụ mắc ĐTĐ thai kỳ dễ mắc ĐTĐ tuýp 2 hoặc các bệnh về tim mạch sau mang thai [12, 53]; trong khi thai nhi dễ phát triển mắc béo phì hoặc ĐTĐ tuýp 2 sớm trong khi lớn [20]. 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng 1.1.3.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 1 ĐTĐ tuýp 1 được đặc trưng bởi sự tấn công qua trung gian miễn dịch và phá hủy các tế bào β đảo tụy - sản xuất insulin. Quá trình bệnh sinh được điều phối bởi các tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu của tiểu đảo Langerhans, cũng như các tế bào B, và liên quan đến việc phá hủy các tế bào beta của tiểu đảo Langerhans. Trước tiên, các tế bào lympho (bạch huyết) bao quanh đảo nhỏ (viêm xung quanh tiểu đảo tụy), và sau đó xâm nhập vào vùng trung tâm của tiểu đảo, gây ra sự hủy hoại tế bào beta và cuối cùng là gây ra ĐTĐ tuýp 1. Bệnh phát sinh ở những người rối loạn về mặt di truyền, khởi phát trung bình lúc 10 – 14 tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh ở các cặp song sinh là khoảng 60%, cho thấy các yếu tố môi trường cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh [38]. Trong số các yếu tố trên, các nghiên cứu cho thấy đặc điểm di truyền đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ĐTĐ tuýp 1, đặc biệt là những người mang kháng nguyên HLA DR3 và HLA DR4 vì chúng liên quan tới việc sản xuất các tự kháng thể như kháng thể kháng đảo tụy (ICA); kháng thể kháng acid glutamic decarboxylase 65 (GAD 65) và kháng thể kháng insulin (IAA: Insulin auto antibodies),…[27]. Những cá nhân có rối loạn về di truyền sẽ tăng nguy cơ bị ĐTĐ tuýp 1 khi bị tấn công bởi yếu tố môi trường bên ngoài như virus quai bị, rubella, virus coxsackie B4. Các tự kháng thể IAA và GAD sẽ tấn công tế bào β đảo tụy khiến nó bị phá hủy, mất khả năng sản xuất insulin và hậu quả là gây ra ĐTĐ tuýp 1 [27]. 3
1.1.3.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ tuýp 2 Yếu tố di truyền kết hợp với môi trường tác động lên cơ thể gây ra tình trạng kháng insulin và giảm bài tiết insulin, dần gây ra ĐTĐ tuýp 2. Kháng insulin là sự hoạt động kém hiệu quả trong quá trình truyền tín hiệu của insulin từ receptor tới đích phân tử cuối cùng, dẫn tới giảm tác dụng của insulin. Gen mã hóa các enzyme và protein tham gia vào quá trình truyền tín hiệu của insulin như: insulin receptor substrate, phosphatidyl inositol-3-kinase hay tham gia vào quá trình bài tiết insulin như capain 10, yếu tố phiên mã 7-like 2 (the transcription factor 7-like 2) có liên quan tới bệnh ĐTĐ tuýp 2 [48]. Bên cạnh đó các yếu tố môi trường có thể làm tăng tiến triển của bệnh như lối sống không lành mạnh gồm việc giảm các hoạt động thể lực; thay đổi chế độ ăn uống theo hướng tăng tinh, giảm chất xơ gây dư thừa năng lượng. Ngoài ra chất lượng thực phẩm, các stress trong cuộc sống cũng tác động đến tình trạng bệnh. Tuổi thọ càng tăng, nguy cơ mắc bệnh càng cao, đây là yếu tố không thể can thiệp được. Hầu hết bệnh nhân béo phì hoặc thừa cân và béo phì vùng bụng với vòng eo to trong khi đó béo phì vùng bụng có liên quan với tăng acid béo trong máu, mô mỡ cũng tiết ra một số hormon làm giảm tác dụng của insulin ở các cơ quan đích như gan, tế bào mỡ, tế bào cơ (kháng insulin tại các cơ quan đích). Do hiện tượng kháng insulin, ở giai đoạn đầu xảy ra sự “bù” của các tế bào β đảo tụy khiến nó tăng tiết insulin nhiều hơn và dần dẫn đến sự suy kiệt tế bào β đảo tụy khiến tăng đường huyết và cuối cùng là bệnh nhân bắt đầu có những triệu chứng lâm sàng của ĐTĐ tuýp 2 [5]. 1.1.3.3. Biến chứng của ĐTĐ Bệnh ĐTĐ, cả tuýp 1 và 2, đều có thể gây ra những biến chứng từ nhẹ đến nghiêm trọng cho người bệnh với các biểu hiện cấp tính và mãn tính, đây là hậu quả từ tình trạng tăng glucose kéo dài. Các biểu hiện cấp tính như: nhiễm khuẩn do đường máu cao và suy giảm hệ miễn dịch; hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu, nhiễm toan thể ceton. Các biến chứng mạn tính như: biến chứng võng mạc, thận, xơ vữa động mạch. Các biến chứng cấp tính có thể đe dọa tính mạng của bệnh nhân nếu không được xử lý kịp thời còn các biến chứng mạn tính có thể gây ra hậu quả ở các mức độ khác nhau từ giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân tới khiến cho bệnh nhân tử vong. Biến chứng cấp tính thường gặp đối với ĐTĐ tuýp 1 còn biến chứng mạn tính thường gặp hơn ở các bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2. Một trong những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng 25% bệnh thận ĐTĐ có thể mắc các biến chứng về thận, gây ảnh hưởng lớn đến chức năng lọc của cầu thận, và 4
cuối cùng có thể dẫn đến suy thận nếu không điều trị kịp thời và đúng cách [2]. Ở Việt Nam, ước tính xấp xỉ 6% người lớn tuổi mắc ĐTĐ lâu ngày có nguy cơ mất thị lực do các biến chứng đáy mắt của bệnh lí võng mạc ĐTĐ. Phát hiện sớm và điều trị kịp thời võng mạc đái tháo đường có thể làm giảm nguy cơ ảnh hưởng tới thị lực của bệnh nhân ĐTĐ[1]. 1.1.4. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường Nguyên tắc điều trị chung đối với bệnh nhân ĐTĐ tập trung ở hai mục tiêu kép là kiểm soát tốt glucose máu, đặc biệt là lượng glucose máu khi đói và glucose máu sau ăn gần đạt khoảng sinh lý (
Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của các thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2 [56] Chú thích: AGI (α-glucosidase inhibitors): chất ức chế -glucose, DPP-4i (Dipeptidyl peptidase-4-inhibitors): chất ức chế enzyme DPP-4, GLP-1 RA (Glucagon-like peptide-1 receptor agonists): chất đồng vận thụ thể GLP-1, TZD: Thiazolidinediones, SGL-T2i (sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor): chất ức chế kênh đồng vận chuyển natri-glucose, MET: Metformim Căn cứ vào hiệu quả điều trị trên lâm sàng, sự phối hợp của các nhóm thuốc trong điều trị để đạt được mục tiêu theo Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường do Bộ Y tế (2020) được trình bày cụ thể trong Hình 1.2 [5]: 6
7 Hình 1.2. Lược đồ lựa chọn thuốc và phương pháp điều trị ĐTĐ tuýp 2 [5]
Trong quá trình điều trị và theo dõi bệnh nhân, các nghiên cứu cũng đưa ra khuyến cáo về một số yếu tố cần xem xét khi chọn lựa thuốc điều trị cho bệnh nhân ĐTĐ gồm [5]: a) Hiệu quả giảm glucose huyết b) Nguy cơ hạ glucose máu: sulfonylurea, insulin c) Tăng cân: Pioglitazon, insulin, sulfonylurea d) Giảm cân: GLP-1 RA, ức chế SGLT2, ức chế DPP-4 (giảm cân ít) e) Không ảnh hưởng nhiều lên cân nặng: ức chế enzyme DPP-4, metformin, ức chế enzyme α-glucosidase f) Ảnh hưởng lên bệnh lý tim mạch do xơ vữa: - Hiệu quả có lợi (bằng chứng rõ ràng: GLP-1 RA và ức chế SGLT-2 trừ lixisenatide trung tính). - Có thể có lợi pioglitazone và metformin g) Ảnh hưởng lên các vấn đề về tim mạch, đặc biệt suy tim có phân suất tống máu giảm LVEF 65 tuổi): Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, SGLT-2i - Suy thận: Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, linaglipin đối với suy thận nhẹ, trung bình hay nặng. SGLT-2i được ưu tiên trên BN có eGFR 30-60 mL/phút/1,73m2 da hoặc albumin niệu > 30mg/g creatinin để giảm tiến triển bệnh thận mạn 8
- Suy gan: Không cần chỉnh liều GLP-1 RA, SGLT-2i đối với suy gan nhẹ hoặc trung bình. Ở BN suy gan nặng, dapagliflozin có thể khởi trị với liều 5 mg, nếu dung nạp có thể tăng lên 10 mg. Empagliflozin không khuyến cáo trên bệnh nhân suy gan nặng. j) Giá thuốc, tính sẵn có, sự dung nạp và khả năng chi trả của bệnh nhân k) Phác đồ sử dụng dễ nhớ, dễ thực hiện và khả năng tuân thủ điều trị của người bệnh 1.2. Enzyme α-glucosidase 1.2.1. Giới thiệu chung về α-glucosidase Enzyme -glucosidase (E.C.3.2.1.20) là một nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycoside bao gồm một số loại như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α- glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α- 1,4-glucosidase, α-D-glucosid glucohydrolase. Đáng chú ý, các enzyme này thủy phân oligosaccharide nhanh hơn so với polysaccharide. Enzyme α-glucosidase là một enzyme họ exohydrolysis, có hoạt tính thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate giải phóng các phân tử α-D-glucose. Cơ chất phổ biến của enzyme -glucosidase là oligosaccharide, disaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside, …[41]. Enzyme -glucosidase là một trong những enzyme thuộc lớp glycoside hydrolase (GH), một lớp gồm các enzyme thường tách các liên kết glycoside giữa hai phân tử carbohydrate – một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy trong các polymer tự nhiên. Tốc độ phân cắt các liên kết glycoside được tăng lên gấp 1017 lần so với phản ứng thông thường không có enzyme xúc tác [63]. Enzyme α-glucosidase phân bố trong các họ GH khác nhau như GH4, GH3, GH31, GH63, GH97 [25, 26], trong đó GH3 và GH31 là hai nhóm chủ yếu của enzyme α-glucosidase. Những enzyme α-glucosidase thuộc nhóm GH13 được phát hiện nhiều ở vi khuẩn, còn những sinh vật bậc cao hơn thường có enzyme α-glucosidase thuộc nhóm GH31. Enzyme α-glucosidase có nguồn gốc đa dạng, từ nhiều loài sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc, động vật và thực vật). Chính nhờ đó, tính đặc hiệu cơ chất của enzyme cũng đa dạng hơn, và enzyme α-glucosidase được phân chia thành 3 loại dựa trên tính đa dạng này. Loại 1 là các enzyme α-glucosidase ưu tiên thủy phân các liên kết heteroside (glycoside) chẳng hạn sucrose và các aryl α-glucoside (ví dụ như p- 9
nitrophenyl α-D-glucopyranoside - pNPG), hơn là các liên kết holoside, chẳng hạn như các α-glucobiose, malto-oligosaccharide, and α-glucan). Enzyme loại II và III thì ngược lại, hoạt động mạnh hơn trên các holoside và có hoạt tính thấp đối với các heteroside. Enzyme loại III giống loại II, nhưng khác nhau trong quá trình thủy phân polysaccharide: enzyme loại II có hoạt tính khá thấp trên α-glucan, trong khi loại III lại có hoạt tính cao [41]. Trong công nghiệp ứng dụng, sinh vật sản xuất chính enzyme α-glucosidase là vi khuẩn và nấm (Lactobacillus, Bacillus và Aspergillus) [22, 58]. Vi khuẩn ưa nhiệt tạo ra các chất có hoạt tính α-glucosidase hoạt động ngay cả ở các môi trường pH trung tính và kiềm, và ở nhiệt độ từ 20- 40°C [32]. 1.2.2. Cấu trúc của α-glucosidase Enzyme α-glucosidase nhóm GH13 và GH31 có những đặc điểm về cấu trúc, hình thái không gian và hoạt tính sinh học khác nhau, do chúng có sự khác biệt về nguồn gốc và tính đặc hiệu cơ chất. Đối với các enzyme -glucosidase GH13, chúng có cấu trúc tương đối giống với oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10; O16G) và dextran glucosidase (glucan 1,6- α-glucosidase; EC 3.2.1.70; DG). Cho đến nay, cấu trúc không gian của enzyme α- glucosidase GH13 đã được xác định qua nhiều nghiên cứu, và cấu trúc tổng thể của chúng tương tự nhau, chủ yếu được hình thành từ 3 domain A, B và C [41] (Hình 1.3a, b). Hình 1.3. Cấu trúc không gian 3D của enzym α-glucosidase GH13 [41] Chú thích: A. Cấu trúc tổng quan của phức hợp Halomonas sp. α-glucosidase và maltose, B. Cấu trúc tổng quan của phức hợp Streptococcus mutans DG và isomaltotriose 10
Đối với các enzyme - glucosidase nhóm GH31, hầu hết chúng phổ biến ở các sinh vật phụ thuộc vào tinh bột như một nguồn năng lượng chính trong cơ thể. Ví dụ, sucrase–isomaltase (SI) và maltase – glucoamylase (MGAM), được tiết ra tại ruột non của động vật có vú, có liên quan đến sự phân hủy tinh bột trong khẩu phần ăn. SI và MGAM chịu trách nhiệm thủy phân các oligo-saccharide thu được thành glucose. Mỗi polypeptit MGAM và SI bao gồm 2 thành phần enzyme khác nhau, tạo ra tổng số 4 α-glucosidase trong cấu trúc 2 enzyme này. Bốn enzyme có cấu trúc liên quan chặt chẽ với nhau do phát triển từ một nguồn gốc chung, đều được xếp vào họ glycoside hydrolase GH31 và có quan hệ mật thiết với nhau theo cấu trúc nếp gấp. Về danh pháp, vùng maltase của MGAM được gọi là NtMGAM và vùng glucoamylase được gọi là CtMGAM. Đối với SI, vùng isomaltase là NtSI và vùng sucrase là CtSI [46]. NtMGAM và CtMGAM giống nhau đều chịu trách nhiệm chính trong việc thủy phân các liên kết α-(1→4) nhưng khác nhau ở chỗ chúng thể hiện các ưu tiên khác nhau đối với các cơ chất có mức độ polyme hóa (DP) khác nhau: CtMGAM thích thủy phân các cơ chất có giá trị DP cao hơn NtMGAM [45]. NtSI có xu hướng thủy phân của các liên kết α-(1→6)-glucosidic [51]. CtSI có thể thủy phân các liên kết α- (12) trong sucrose [29]. Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3D của enzyme α-glucosidase GH31 [41] (A. Mô hình cấu trúc của NtMGAM; B. Vùng hoạt động của NtMGAM) 1.2.3. Cơ chế hoạt động của enzyme α-glucosidase trong cơ thể Khi con người đưa thức ăn vào đường tiêu hóa, các phân tử cacbohydrate trong thức ăn sẽ được thủy phân, chia cắt thành các phân tử nhỏ bởi hệ enzyme trong ruột 11
non. Cụ thể, các sản phảm giàu tinh bột, dạng glucid chính trong khẩu phần ăn sau khi qua dạ dày sẽ được enzyme α-amylase tiết từ tuyến tụy và nước bọt thủy phân thành các malto-oligosaccharid, chẳng hạn như maltose, maltotriose, và các malto- oligosaccharid mạch ngắn có các nhánh α-(1-6) [41]. Enzyme α-glucosidase được tiết ra từ diềm bàn chải tế bào ruột non, lại tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường glucose nhỏ hơn rồi mới thẩm thấu qua màng ruột vào mạch bạch huyết rồi cuối cùng đổ về hệ tuần hoàn. Chính nhờ cơ chế này, việc ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase có thể làm hạn chế quá trình thủy phân carbohydrate và làm giảm, làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [3, 8]. 1.3. Chất ức chế α-glucosidase 1.3.1. Giới thiệu và cơ chế hoạt động của chất ức chế enzyme α-glucosidase Chất ức chế enzyme α-glucosidase (α-glucosidase inhibitors-AGIs) là các chất làm giảm hoạt tính của enzyme α-glucosidase dẫn đến làm chậm quá trình tiêu hóa các chất carbohydrate thành đường đơn glucose ở ruột non, từ đó ngăn hiện tượng tăng đường huyết sau ăn. Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế enzyme α-glucosidase tại ruột non (AG: α-glucosidase; AGI: chất ức chế enzyme α-glucosidase) Phần lớn AGIs có khả năng gắn vào vùng liên kết với carbohydrate của enzyme -glucosidase vì chúng có cấu trúc tương tự với các disaccharide hoặc oligosaccharide. Các phức hợp này có ái lực lớn hơn phức hợp thông thường 12