intTypePromotion=1
ADSENSE

Khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh Enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương

Chia sẻ: Trần Văn Khải | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:62

101
lượt xem
6
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh Enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương trình bày: Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3, mục tiêu, nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận, kiến nghị,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh Enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương

LỜI CAM ĐOAN<br /> Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là <br /> trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào.<br /> Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được <br /> cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc.<br /> ̀ ội, ngay 19 tháng 5 năm 2017<br /> Ha N ̀<br /> Người cam đoan<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Lê Thị Hợi<br /> LỜI CẢM ƠN<br /> Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Vũ  <br /> Văn Hạnh – Trưởng phòng – Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công <br /> nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người Thầy  <br /> đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, tạo điều kiện về vật tư, hóa  <br /> chất, thiết bị cho nghiên cứu và chỉnh sửa luận văn để tôi hoàn thành bài khóa <br /> luận này.<br /> Tôi xin bày tỏ  lòng biết  ơn đến ThS. Nguyễn Thị  Thu Hằng thuộc bộ <br /> môn Vi sinh ­ Hóa sinh đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, làm  <br /> khóa luận cùng các thầy, cô giáo Viện Công nghệ  sinh học, Đại học Lâm <br /> nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý <br /> báu giúp tôi hoàn thành khóa luận.<br /> Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Nguyên Danh H<br /> ̃ ưng đa tr<br /> ̃ ực tiêp hô<br /> ́ ̃ <br /> trợ thi nghiêm, cung t<br /> ́ ̣ ̀ ập thể cán bộ và anh chị trong Phòng Các chất chức năng <br /> sinh học, Viện Công nghê sinh h<br /> ̣ ọc đa giúp đ<br /> ̃ ỡ tôi tận tình trong suốt quá trình <br /> làm khóa luận.<br /> <br /> 1<br /> Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm  ơn tới gia đình, tập thể lớp K58B –  <br /> Công nghệ sinh học và tất cả bạn bè đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá <br /> trình thực hiên đê tài này.<br /> ̀<br /> Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp do  <br /> thời gian và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót <br /> rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo tận tình của quý thầy, cô để <br /> đề tài khóa luận hoàn thiện hơn.<br /> Tôi xin chân thành cảm ơn!<br /> Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2016<br /> Sinh viên<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Lê Thị Hợi<br /> MỤC LỤC<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> DANH MỤC BẢNG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> DANH MỤC HÌNH<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> DANH MUC CAC T<br /> ̣ ́ Ư VIÊT TĂT<br /> ̀ ́ ́<br /> VSV Vi sinh vâṭ<br /> 2<br /> CT1 Công thức thi nghiêm 1<br /> ́ ̣<br /> CT2 Công thức thi nghiêm 2<br /> ́ ̣<br /> CT3 Công thức thi nghiêm 3<br /> ́ ̣<br /> CT4 Công thức thi nghiêm 4<br /> ́ ̣<br /> CT5 Công thức thi nghiêm 5<br /> ́ ̣<br /> CT6  Công thức thi nghiêm 6<br /> ́ ̣<br /> VK Vi khuân̉<br /> NS ́ ợi<br /> Nâm s<br /> KĐT ̣ ương<br /> Khô đâu t<br /> QO Quôc oai<br /> ́<br /> TB  Tinh bôṭ<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 3<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> ̣ ương la lo<br /> Khô đâu t ̀ ại nguyên liêu r<br /> ̣ ất sẵn và rẻ, công dụng của nó <br /> lại hữu ích một cách trái ngược so với giá thành. Trước đây người ta hay sử <br /> dụng acid hoặc H2SO4  để  thủy phân protein trong khô đậu tương. Nhưng <br /> kết quả cho thấy bằng cách này không tạo ra được nhiều sản phẩm mong  <br /> muốn và không đáp  ứng được tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Vì thế  hiện  <br /> nay thủy  phân protein trong khô  đậu tương  bằng enzyme  protease   đang <br /> được nghiên cưu, s<br /> ́ ử dụng nhiều và hiệu quả tương đối cao.<br /> Măṭ   khac,<br /> ́   protease   là  enzyme   xúc   tác   thủy   phân  các   mối  liên   kết <br /> peptide trong phân tử protein, được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều  <br /> lĩnh vực khác nhau như  công nghiệp chế  biến thực phẩm, y học, nông <br /> nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng... và chiếm  <br /> khoảng 60% thị trường enzyme. Hiện nay trên thế giới, đa số các chế phẩm <br /> enzyme được thu nhận từ  vi sinh vật do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu <br /> thích hợp nhất để  sản xuất enzyme  ở  quy mô lớn dùng trong công nghệ, <br /> đời sống va có nhi<br /> ̀ ều  ưu điểm vượt trội như  chu kỳ  phát triển 280 ngắn,  <br /> môi trường nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển…. Qua nhiều năm, việc gia tăng sử <br /> dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể <br /> hiệu quả  sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Vì vậy, hai phần <br /> ba protease  ứng dụng trong công nghiệp được sản xuất ra từ  vi sinh vật.  <br /> Hiện nay, trên thế giới, các chế phẩm protease đã được thương mại hóa và <br /> được đưa vào  ứng dụng một cách rộng rãi. Tuy vậy, trong thời gian gần  <br /> đây, trên thế  giới, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục tiến hành nghiên cứu  <br /> thu nhận, tinh chế, xác định các tính chất của chế phẩm san xuât t<br /> ̉ ́ ừ enzyme  <br /> protease.  Ở  Việt Nam cũng đã có một số  nghiên cứu về  protease vi sinh <br /> vật, tuy nhiên chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm nghiên cứu ứng  <br /> dụng enzyme vẫn còn hạn chế. <br /> <br /> <br /> <br /> 4<br /> Nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận enzyme protease từ  vi sinh vật,  <br /> cũng như mong muốn tao ra chê phâm san xuât t<br /> ̣ ́ ̉ ̉ ́ ừ enzyme protease co ho<br /> ́ ạt  <br /> tính cao trong thủy phân đậu tương cơ chât t<br /> ́ ự nhiên săn co, tôi đã ti<br /> ̃ ́ ến hành  <br /> đề  tài khóa luận: “Phân  lâp và<br /> ̣  tuyển chọn các chủng nấm sợi va vi<br /> ̀  <br /> khuân<br /> ̉   có  khả   năng   sinh   enzyme   protease   cao   trong   thủy   phân   đậu  <br /> tương”.<br /> <br /> <br /> CHƯƠNG 1 . TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU<br /> 1.1. Tìm hiểu chung về khô đâu t<br /> ̣ ương <br /> ̣ ương (co khi goi la khô đâu) la<br /> Khô đâu t ́ ̣ ̀ ̣ ̀ sản phẩm phụ  của ngành <br /> công nghiệp ép dầu đậu nành, la ̀môt thanh phân quan trong trong th<br /> ̣ ̀ ̀ ̣ ưc ăn<br /> ́  <br /> ̀ ́ ưng nhu câu tăng cao đôi v<br /> chăn nuôi nhăm đap  ́ ̀ ́ ới thưc ăn protein cho đông<br /> ́ ̣  <br /> ̣<br /> vât trong n ươc va xuât khâu. Theo AAFCO (hiêp hôi quan ly th<br /> ́ ̀ ́ ̉ ̣ ̣ ̉ ́ ức ăn chăn <br /> ̃ ̀ ̣ ưc ăn nay thu đ<br /> nuôi My), thi loai th ́ ̀ ược khi đa xay nhuyên phân đâu đa tach,<br /> ̃ ̃ ̀ ̣ ̃ ́  <br /> ́ ̀ ́ ̣ ̀ ̀ ̣  <br /> ep dâu thông qua qua trinh tinh chiêt hoăc dung dung môi hoa tan. Khô đâu<br /> ́ ̀<br /> tương co ham l<br /> ́ ̀ ượng protein, lysin tông sô, lysin tiêu hoa, năng l<br /> ̉ ́ ́ ượng cao và <br /> ̀ ượng chât x<br /> ham l ́ ơ thâp la nguôn phê phu phâm cung câp protein tôt nhât cho<br /> ́ ̀ ̀ ́ ̣ ̉ ́ ́ ́  <br /> gia suc, gia câm.<br /> ́ ̣ ̣ ̣ ương là loại sản phẩm rất sẵn va re, <br /> ̀ Đăc biêt khô đâu t ̀ ̉ ở <br /> nước ta môi năm l<br /> ̃ ượng KĐT thai ra t<br /> ̉ ừ cac nha may la rât l<br /> ́ ̀ ́ ̀ ́ ớn phuc vu cho<br /> ̣ ̣  <br /> ̣ ̉ ́ ực phâm va th<br /> viêc san xuât th ̉ ̀ ưc ăn chăn nuôi. Chê phâm th<br /> ́ ́ ̉ ức ăn chăn nuôi <br /> từ KĐT được xem như  là loại thức ăn cung cấp năng lượng và bổ  sung  <br /> đạm cho gia suc, gia câm, l<br /> ́ ̀ ượng tiêu thu KĐT <br /> ̣ ước tinh khoang 3.8 triêu tân<br /> ́ ̉ ̣ ́ <br /> ̀ ̣ ́<br /> (2013) va 4.05 triêu tân (2014) va tăng dân đêu lên hang năm …[<br /> ̀ ̀ ̀ ̀ 13]<br /> Bang 1.. Thanh phân dinh d<br /> ̉ ̀ ̀ ương cua khô đâu t<br /> ̃ ̉ ̣ ương<br /> <br /> Thanh phân<br /> ̀ ̀ Ham l<br /> ̀ ượng (%)<br /> Protein 45,4<br /> Lysin 2,42<br /> ́ ơ<br /> Chât x 5,5<br /> <br /> <br /> 5<br /> Photpho 0,65<br />                                                                     Nguôn: http://vcn.vnn.vn<br /> ̀<br /> 1.2. Môt sô chung vi sinh vât đ<br /> ̣ ́ ̉ ̣ ược sử dung trong lên men đâu t<br /> ̣ ̣ ương<br /> ̣ ương đ<br /> Cac vi sinh vât th<br /> ́ ̀ ược sử  dung trong lên men đâu t<br /> ̣ ̣ ương như: <br /> ́ ̣<br /> cac loai nâm môc:<br /> ́ ́  Aspergillus oryaze, Mucor, Rhizopus, Oligosporus. Nâm<br /> ́  <br /> men:  Saccharomyces   cerevisiae.   Cać   loaị   vi   khuân<br /> ̉   như:  Streptococcus <br /> thermophiles, Bacillus subtilis….<br /> 1.2.1. Nâm <br /> ́<br /> <br />  Nâm môc:<br /> ́ ́<br /> ̀ ̣ ́ ́ ́ ̉ ̉<br /> Nhiêu loai nâm môc co kha năng tông hợp một lượng lơn protease<br /> ́  <br /> được   ưng ̣   trong   công   nghiêp<br /> ́   dung ̣   thực   phâm<br /> ̉   là  cać   chung:<br /> ̉  Aspergillus <br /> oryzae, A.tericola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum…. Cać  <br /> ̣ ̉ ̉<br /> loai nâm môc nay co kha năng tông h<br /> ́ ́ ̀ ́ ợp ca 3 loai protease: acid, kiêm va<br /> ̉ ̣ ̀ ̀ <br /> ̉<br /> trung tinh. Nâm môc đen tong h<br /> ́ ́ ́ ợp chu yêu cac loai protease acid, co kha<br /> ̉ ́ ́ ̣ ́ ̉ <br /> ̉<br /> năng thuy phân protein  ở pH 2,5­ 3 [23].<br /> ̣ ́ ́ ́ ư: A. cadidatus, P. cameberti, P. roqueforti… <br /> Môt sô nâm môc khac nh<br /> ́<br /> ́ ̉ ̉<br /> cung co kha năng tông h<br /> ̃ ợp protease co kha năng đông tu s<br /> ́ ̉ ̣ ưa s<br /> ̃ ử  dung trong<br /> ̣  <br /> ̉<br /> san xuât forrmat [<br /> ́ 17].<br /> Trong thực tê A. oryzae co kha năng tiêt ra môi tr<br /> ́ ́ ̉ ́ ương cac enzyme<br /> ̀ ́  <br /> ̉<br /> thuy phân nh ư  cellulase, pectinase… khi sông trên môi tr<br /> ́ ương c<br /> ̀ ơ  chât khô<br /> ́  <br /> ̣ ương va đ<br /> đâu t ̀ ược ưng dung rât rông rai trong san xuât chê biên th<br /> ́ ̣ ́ ̣ ̃ ̉ ́ ́ ́ ực phâm<br /> ̉  <br /> [22] [12].<br /> 1.2.2. Vi khuân <br /> ̉<br /> ̉ bacteria) la nh<br /> Vi khuân ( ̀ ưng sinh vât đ<br /> ̃ ̣ ơn bao, nho be đên m<br /> ̀ ̉ ́ ́ ức chi co<br /> ̉ ́ <br /> ̉<br /> thê thây chung đ<br /> ́ ́ ược dươi kinh hiên vi quang hoc hay kinh hiên vi điên t<br /> ́ ́ ̉ ̣ ́ ̉ ̣ ử.  <br /> ̣ ̉ ́ ở vi khuân: tr<br /> Ba dang chu yêu  ̉ ực khuân, câu khuân, xoăn khuân [<br /> ̉ ̀ ̉ ́ ̉ 12].<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 6<br /> Protease   cuả   đông<br /> ̣   vâṭ   hay   thực   vâṭ   chỉ   chưá   môṭ   trong   hai   loaị  <br /> ̣ ̉ ̉ ̣<br /> endopeptidase hoăc exopeptidase, riêng vi khuân sinh ra ca hai loai trên, do  <br /> ̉ ̉ ̣ ̣ ơ  chât cao. Chung co kha năng<br /> đo protease cua vi khuân co tinh đăc hiêu c<br /> ́ ́ ́ ́ ́ ́ ̉  <br /> ̉ ơi 80% cac liên kêt peptid trong phân t<br /> phân huy t ́ ́ ́ ừ protein [9].<br /> ̉ ̉ ̉ ̉<br /> Trong cac chung vi khuân co kha năng tông h<br /> ́ ́ ợp manh protease la<br /> ̣ ̀ <br /> Bacillus   subtilis,   B.   mesentericus,   B.   thermorpoteoliticus  và  môṭ   số  giông<br /> ́  <br /> ̣<br /> thuôc chi ́ ̉ ̉<br />  Clostridium. Trong đo,́  B. subtilis  co kha năng tông hợp protease <br /> ̣ ̉<br /> manh nhât. Cac vi khuân th<br /> ́ ́ ương tông h<br /> ̀ ̉ ợp cac protease hoat đông thich h<br /> ́ ̣ ̣ ́ ợp <br /> ở vung pH trung tinh va kiêm yêu [<br /> ̀ ́ ̀ ̀ ́ 19].<br /> ̉ ̉ ̣ ̣ ở  khoang pH hep (pH<br /> Cac protease trung tinh cua vi khuân hoat đông <br /> ́ ́ ̉ ̣  <br /> ̀ ́ ̉ ̣ ̣ ́ ́ ́ ̣ ̣ ̉  <br /> 5­8) va co kha năng chiu nhiêt thâp. Cac protease trung tinh tao ra dich thuy<br /> phân protein thực phâm it đăng h<br /> ̉ ́ ́ ơn so vơi protease đông vât va tăng gia tri<br /> ́ ̣ ̀ ́ ̣ <br /> dinh dương. Cac protease trung tinh co kha năng ai l<br /> ̃ ́ ́ ́ ̉ ́ ực cao đôi v<br /> ́ ới cac amino<br /> ́  <br /> acid  ưa beo va th<br /> ́ ̀ ơm. Chung <br /> ́ được sinh ra nhiêu b<br /> ̀ ởi  B. mesentericus, B. <br /> ̀ ̣ ́ ́ ̣<br /> thermorpoteoliticus va môt sô giông thuôc chi  Clostridium [6].<br /> ̉ bacillus  ưa kiêm đăng điên băng 11, khôi l<br /> Protease cua  ̀ ̉ ̣ ̀ ́ ượng phân ra <br /> từ  20.000­30.000,   ôn<br /> ̉   đinh<br /> ̣   ở   trong   khoang<br /> ̉   pH   6­12   và  hoaṭ   đông<br /> ̣   trong <br /> ̉ ̣<br /> khoang pH rông 7­12 [29].<br /> 1.3. Enzyme protease<br /> 1.3.1. Giới thiệu chung    <br /> Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ  phân liên kết <br /> peptide (­O–NH­) trong phân tử  protein và các polypeptide. Sản phẩm của <br /> quá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide <br /> chuỗi ngắn. Nhiều protease còn có thể xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết  <br /> ester, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin. Phan <br /> ̉ ưng xay ra<br /> ́ ̉  <br /> theo sơ đồ sau:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 7<br /> Hình 1.1. Phản ứng thủy phân dưới xúc tác của enzyme protease<br /> <br /> 1.3.2. Phân loại <br /> <br />  Dựa vào cơ chế xúc tác [27]<br /> Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm: <br /> ­ Nhóm 1: Exopeptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cách đầu <br /> mạch. Thuỷ phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptidase. Nếu xúc tác ở <br /> đầu có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase.<br /> ­ Nhóm 2: Endopeptidase còn gọi là proteinase hay enzyme phân cắt nội  <br /> mạch. Xúc tác phản  ứng thuỷ  phân liên kết peptide bên trong chuỗi  <br /> polypeptidase<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme protease<br /> <br /> Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động [28]<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 8<br /> Dựa vào cấu trúc nhóm chức  ở  trung tâm hoạt động, endopeptidase  <br /> được chia thành 4 nhóm: <br /> ­ Serin – proteinase (EC 3.4.21): là những protease có nhóm (­OH)  <br /> của serine trong trung tâm hoạt động  ở  vùng kiềm và có tính đặc hiệu <br /> tương đối rộng. <br /> ­ Cystein – proteinase (EC 3.4.22): là các protein có nhóm thiol (­SH) <br /> của acid amin cysteine  ở  trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm  <br /> các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protease kí sinh trùng. <br /> Các cyteine protease thường hoạt động  ở  vùng pH trung tính, có tính đặc  <br /> hiệu cơ chất rộng. <br /> ­ Aspartic protease (EC 3.4.22): hầu hết các aspartic protease thuộc <br /> nhóm   pepsin.   Nhóm   pepsin   bao   gồm   các   enzyme   tiêu   hoá   như:   pepsin, <br /> chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic protease có các nhóm carboxyl trong <br /> trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.<br /> ­ Metallo   protease   (EC   3.4.23):   metallo   protease   là   nhóm   protease <br /> trong cấu tạo có kim loại được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi, sinh vật bậc  <br /> cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động  ở  vùng pH trung tính và  <br /> hoạt động giảm mạnh dưới tác động của EDTA. <br /> Dựa vào pH hoạt động [24]<br /> Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị  số  pH khác nhau mà <br /> enzyme protease được chia làm 3 loại: <br /> ­ Protease acid: pH  ở  trong khoảng 2÷5. Loại protease này thường <br /> được thu nhận từ các loại NS đen như: A. niger, A. awmori, A. saitoi. <br /> ­ Protease trung tính: có pH trong khoảng hẹp, từ 6÷7,5, không bền <br /> với nhiệt độ cao. Thu nhận chủ yếu từ các loại NS vàng như:  A. oryzae, A.  <br /> flavus, A. fumigatus, A. tericola.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 9<br /> ­ Protease kiềm tính: có pH ở trong khoảng 8÷11 thường được tổng <br /> hợp nhiều bởi nấm men và VK. Những protease kiềm tính là nhóm được  <br /> quan tâm khá nhiều trong những năm gần đây vì có thể sử dụng chúng như <br /> chất phụ  gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da, xử  lý chất thải <br /> môi trường.<br /> Dựa vào tính đặc hiệu của chúng với cơ  chất tổng hợp hoặc  <br /> đối với chuỗi β ­ insulin bị oxy hóa [10]<br /> Năm 1975, Morihara đã phân loại các protease được chia ra thành bốn  <br /> nhóm lớn, dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc  <br /> đối với chuỗi β – Insulin đã bị oxy hóa. <br /> ­ Nhóm I ­ Serin proteinase: Tính đặc hiệu đối với các gốc amino  <br /> acid   ở   về   phía   nhóm   –CO2   của   liên   kết   peptide   hoặc   gọi   là <br /> carbonxyendopeptidase<br /> ­ Nhóm II ­ Cystein proteinase: Giống như  cách phân loại theo đặc  <br /> điểm có cấu tạo của trung tâm hoạt động.<br /> ­ Nhóm III ­ Metallo proteinase: Có đặc hiệu đối với các gốc amino  <br /> acid   về   phía   nhóm   –NH–   của   liên   kết   peptide,   được   gọi   là <br /> aminoendopeptidase.<br /> ­ Nhóm IV ­ Aspartic proteinase: Có tính đặc hiệu đối với các nguồn <br /> gốc amino acid ở cả hai phía của liên kết peptide. <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 10<br /> 1.3.3. Cơ chế thuy phân c<br /> ̉ ủa protease <br /> <br /> <br /> <br /> <br />                <br /> Hinh 1.. Mô hinh enzyme protease thuy phân phân t<br /> ̀ ̀ ̉ ử protein<br /> Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ  phân liên kết <br /> peptide (­O–NH­) trong phân tử  protein và các polypeptide. Sản phẩm của <br /> quá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide <br /> chuỗi ngắn.<br /> 1.3.4. Ứng dụng của protease<br /> Ngày nay việc khai thác và sử  dụng enzyme đã phát triển thành một <br /> nghành công nghiệp với kỹ  thuật hoàn chỉnh đã đem lại nguồn lợi không <br /> nhỏ. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành, chiêm 59% l<br /> ́ ượng <br /> enzyme được  ưng dung nh<br /> ́ ̣ ư  công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, <br /> công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp. <br />  Công nghiệp thực phẩm [26]<br /> ­ Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat  <br /> nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. <br /> ­ Trong sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian <br /> trộn bột, giảm độ  nhớt của bột nhào do gluten gây ra, tăng độ  dẻo, làm  <br /> nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.<br /> ­ Trong công nghiệp chế  biến thịt, đồ  hộp, sản xuất dịch đạm thủy <br /> phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, …<br /> <br /> 11<br /> ­ Trong chế biến thuỷ sản, sản xuất nước mắm,….<br /> ­ Bên cạnh đó, trong công nghiệp thực phẩm, protease được sử  dụng <br /> để làm trong bia và nước hoa quả [1].<br />  Công nghiệp nhẹ[16]<br /> ­ Protease được sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, nước lau kính, kem  <br /> đánh răng và đặc biệt là trong sản xuất bột giặt, .. Một số  protease kiềm  <br /> thương   mại   được   sử   dụng   chất   tẩy   bột   giặt   như   Alcalase,   Everlase,  <br /> Esperrase do hãng Novo sản xuất.<br /> ­ Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da … Một số <br /> sản phẩm protease dùng trong công nghệ  thuộc da do công ty Novo sản <br /> xuất như Greasex, NovoCor…<br /> ­ Trong công nghiệp dệt và sản xuất tơ  tằm, protease được sử  dụng <br /> để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo...<br /> ­ Ngoài ra, protease còn được  ứng dụng trong sản xuất mĩ phẩm và <br /> hương phẩm [10].<br />  Nông nghiệp [10, 17]<br /> Protease được sử  dụng để  xử  lý nhằm tận dụng các phế  liệu giàu <br /> protein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ <br /> số  tiêu hóa thức ăn. Nhiều loại protease của vi nấm cũng có thể  bổ  sung  <br /> vào khẩu phần ăn trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nhằm tăng nhanh quá <br /> trình tiêu hóa thức ăn, tăng tốc độtăng trọng của động vật, nhất là động vật  <br /> non. Ngoài ra, protease còn được sử dụng để thủy phân trùn quế thành dịch <br /> acid amin làm thức ăn cho ấu trùng tôm [18].<br /> Y học [11]<br /> Chế  phẩm protease được sử  dụng để  sản xuất các môi trường dinh <br /> dưỡng hỗn hợp giàu protein và acid amin dùng trong nuôi cấy VK và các  <br /> VSV khác. Người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế <br /> <br /> <br /> 12<br /> các huyết thanh kháng độc để  chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch). Một số <br /> protease như  trypsin,  α–chymotrypsin dùng để  sản xuất thuốc chữa bệnh  <br /> kém tiêu hóa, bệnh nghẽn mạch, tiêu mủ  các  ổ  viêm, làm thông đường hô <br /> hấp, bệnh thiếu enzyme bẩm sinh,...GS. TSKH. Phan Thị Trân Châu đã kết <br /> hợp cùng với viện Quân Y 108 nghiên cứu sử  dụng protease có tên gọi <br /> prozimabo để điều trị phỏng [3]. Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong <br /> các lĩnh vực như xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc <br /> (Fujiwara et al., 1991; Ishikawa et al., 1993), xử lý chất thải từ động vật giáp <br /> xác (Yang et al., 2000), xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm (Dalev, 1994)  <br /> [7].<br /> 1.4. Phương phap lên men chim va lên men bê măt <br /> ́ ̀ ̀ ̀ ̣<br /> 1.4.1. Lên men chim <br /> ̀<br /> ̣<br /> Vi sinh vât ph ̉<br /> at triên tôt trong môi tr<br /> ́ ́ ương cung câp đu nguôn Cacbon<br /> ̀ ́ ̉ ̀  <br /> ̀ ̀ ̉ ̣ ̀ ̣<br /> va nguôn Nito. Đê tao điêu kiên cho VSV sinh tr ưởng tôt, ng<br /> ́ ười ta thương<br /> ̀  <br /> ̉<br /> bô sung vao môi tr<br /> ̀ ương môt sô chât thich h<br /> ̀ ̣ ́ ́ ́ ợp như: bôt đâu t<br /> ̣ ̣ ương, tinh bôt,<br /> ̣  <br /> cam mi… <br /> ́ ̀<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 13<br /> ́ ̣ ̃ ơ khi va t<br /> Cac thiêt bi lên men dê c<br /> ́ ́ ̀ ự đông hoa.<br /> ̣ ́<br /> Song ph ươ ng phap nuôi cây chim cung co môt sô nh<br /> ́ ́ ̀ ̃ ́ ̣ ́ ượ c điêm<br /> ̉  <br /> sau [8  ]:<br /> ̀ ̉ ́ ̣ ̣ ̣ ̀ ̣ ̀ ̣<br /> ­ Đoi hoi trang thiêt bi hiên đai, điêu kiên vô trung tuyêt đôi.<br /> ́<br /> ́ ̀ ́ ̉ ́ ̣<br /> ­ Trong qua trinh nuôi cây phai khuây liên tuc<br /> ̃ ̣ ̀ ̣<br /> ­ Dê bi nhiêm trung toan bô <br /> ̃ ̀<br /> 1.4.2. Lên men bê măt<br /> ̀ ̣<br /> ̀ ương phap nhăm tao điêu kiên cho VSV phat triên trên bê măt<br /> La ph ́ ̀ ̣ ̀ ̣ ́ ̉ ̀ ̣ <br /> môi trương. Nguyên liêu chinh la đâu t<br /> ̀ ̣ ́ ̀ ̣ ương, cam gao… môi tr<br /> ́ ̣ ương đ<br /> ̀ ược <br /> ̉ ̣ ́ ́<br /> bô sung thêm môt sô chât dinh d ương khac, rôi tiên hanh trôn đêu v<br /> ̃ ́ ̀ ́ ̀ ̣ ̀ ới nước  <br /> ̣ ̉ ̉<br /> sao cho đô âm khoang 40­90%, tùy chủng giống.  Khử  trung <br /> ̀ ở 115 0C trong <br /> ́ ̉ ̣ ̀ ̀ ử VSV vao [<br /> 15­20 phut, đê nguôi rôi cho bao t ̀ 4].<br />  Ưu điêm cua ph<br /> ̉ ̉ ương phap [<br /> ́ 8]:<br /> ­ Độ   thoang<br /> ́   khí  cao,   dễ  thực   hiên,<br /> ̣   quy   trinh<br /> ̀   công   nghệ   đơn   gian<br /> ̉  <br /> ̀ ̉ ́ ̣<br /> không đoi hoi qua cao vê trang thiêt bi.<br /> ́ ̀<br /> ­ Môi trương không cân điêu kiên vô trung tuyêt đôi, nêu bi nhiêm vi<br /> ̀ ̀ ̀ ̣ ̀ ̣ ́ ́ ̣ ̃  <br /> ̣ ̣ ̃ ̃ ̀ ử ly.́<br /> sinh vât la cung dê dang x<br /> ́ ̉ ̉ ̉ ̀ ̃ ̣ ̉<br /> ­ Chê phâm dê sây khô, bao quan va dê vân chuyên <br /> ̃ ́<br /> Nhược điêm cua ph<br /> ̉ ̉ ương phap [<br /> ́ 8]<br /> ­ Không thể  kiểm soát hay điều chỉnh môi trường một cách chính <br /> xác theo ý muốn.<br /> ­ Không thể áp dụng có hiệu quả các phương pháp tối ưu <br /> ­ Khó tinh sạch<br /> 1.5. Tình  hình nghiên  cứu về  enzyme protease trong thủy phân  đậu <br /> tương <br /> Các nghiên cứu đều theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế <br /> phẩm có độ  sạch khác nhau, nghiên cứu cấu truc, m<br /> ́ ối liên quan giũa cấu <br /> <br /> <br /> 14<br /> trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả  năng  ứng dụng của enzyme  <br /> trong thực tế.<br /> 1.5.1. Tinh hinh nghiên c<br /> ̀ ̀ ưu <br /> ́ ở Viêt Nam<br /> ̣<br /> Vũ Ngọc Bội (2004) nghiên cứu protease của chung <br /> ̉ Bacillus sp. CPE <br /> thu nhận từ  B. subtilis S5 có hoạt tính 33U/g, để  chế  biến nước mắm[ 7]. <br /> Âu Thị  Bích Phượng (2006), protease từ  Bacillus  sp. đạt 1,7 U/g, Lê Văn <br /> Việt (2007) protease từ  Bacillus  sp. đạt   30,9 (U/g) [17]. Đỗ  Trần Ngoan <br /> (2007) nghiên cứu protease kiềm tính từ  B. subtilis   [2]. Trần Ngọc Hùng <br /> (2010) nghiên cứu protease 14 (U/g) từ  B.subtilis để sử dụng trong chế biến <br /> thức ăn gia cầm. Trần Thị Hồng Nghi và cs. (2009), nghiên cứu protease từ <br /> B. subtilis để thủy phân phụ phẩm cá tra[18].<br /> Từ  Acinetobacter sp.  QN6 phân lập từ  biển sinh tông h<br /> ̉ ợp protease <br /> cao Quyên Đinh Thi, và cs. (2007)[<br /> ̀ ̀ 12].<br /> ̣ ́<br /> Lê Thi Bich Ph ượng và cs. (2012) đa nghiên c<br /> ̃ ưu phân lâp, tuyên chon<br /> ́ ̣ ̉ ̣  <br /> ̣ ́ ̉ Bacillus sinh tông h<br /> môt sô chung  ̉ ợp protease [7].<br /> Trân Thanh Truc và cs (2015) đa xac đinh đ<br /> ̀ ́ ̃ ́ ược điêu kiên nuôi cây tôi<br /> ̀ ̣ ́ ́ <br /> ưu Aspergillus niger sinh tông h<br /> ̉ ợp protease cao [16].<br /> ̣ ̃ ̉ ̣ ́ ̉<br /> Lê Văn Viêt Mân và cs (2006) đa khao sat môt sô tinh chât cua chê<br /> ̃ ́ ́ ́ ́ <br /> ̉<br /> phâm protease t ừ A. oryzae để  san xuât n<br /> ̉ ́ ươc măm, rut ngăn th<br /> ́ ́ ́ ́ ời gian thuỷ  <br /> phân protein[14].<br /> 1.5.2. Tinh hinh nghiên c<br /> ̀ ̀ ưu trên thê gi<br /> ́ ́ ới<br /> Trong những năm gần đây, giá trị  thương mại của các enzyme công <br /> nghiệp trên toàn thế  giới đạt khoảng 1 tỷ  USD, trong đó chủ  yếu là các  <br /> enzyme thủy phân (75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất <br /> sử dụng trong công nghiệp (60%).<br /> Các tác giả Devi MK và cs. (2008) đã xác định đặc điểm protease của <br /> Aspergillus   niger;   Hajji   M   và   cs.   (2007)   khảo   sát   protease   của  A. <br /> <br /> <br /> 15<br /> clavatus(2007); Agarwal D, và cs. (Năm 2008)   nghiên cứu khả  năng sinh  <br /> protease của Penicillium sp.[19, 21, 26].<br /> Nhiều công trình nghiên cứu về protease từ Bacillus như: B. cereus (Sirecka <br /> et al., 1998), B. sphaericus (Singh et al., 1999), B. stearothermophilus (Kim et <br /> al, 2002), B. subtilis (Yang.et al., 2000), B. mojavensis (Beg và Gypta et al., <br /> 2003), B. lichieniformis (Mancrzinger et al., 2003, Sareen et al., 2005)[2, 32]. <br /> Protease từ A.oryzae trong lên men răn <br /> ́ ưng Jarun Chutmanop [<br /> ́ 20].  Jin Fujita <br /> va cs.(2003), Morten Carlsen (1995, 2003), Ruohang Wang va cs.(2003) đa<br /> ̀ ̀ ̃ <br /> nghiên cưu san xuât protease t<br /> ́ ̉ ́ ừ A. oryzae [31]. Guowan Su va cs. (2010) thuy<br /> ̀ ̉  <br /> ̣ ương bởi  protease từ A. oryzae,  [33].<br /> phân protein đâu t<br /> <br /> <br /> CHƯƠNG 1 ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ ƯƠNG <br /> . MUC TIÊU, NÔI DUNG, VÂT LIÊU VA PH<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Mục tiêu nghiên cứu<br /> ­ Phân lập, tuyển chọn được chủng nâm s<br /> ́ ợi va vi khuân<br /> ̀ ̉   co ho<br /> ́ ạt tính <br /> protease cao từ đất trồng đậu tương..<br /> ­ Tối ưu điều kiện lên men xốp các chủng nâm s<br /> ́ ợi va vi khuân<br /> ̀ ̉  tuyển <br /> chọn   sử   dụng   cơ   chất   là  khô   đậu   tương   (KĐT)   để   sản   xuất   enzyme <br /> protease.<br /> 2.2. Nôi dung nghiên c<br /> ̣ ưu <br /> ́<br /> ̣ ̉ ́ ợi va vi khuân t<br /> ­ Phân lâp cac chung nâm s<br /> ́ ̀ ̉ ừ mẫu đất kí hiệu là DOM <br /> ̀ ẫu đất kí hiệu EM (QO). Các mẫu đất được lấy tại vùng trồng  <br /> (QB) va m<br /> đậu tương ngoại thành Hà Nội).<br /> ̉ ̣ ̉ ́ ợi va vi khuân co hoat tinh protease va<br /> ­ Tuyên chon cac chung nâm s<br /> ́ ̀ ̉ ́ ̣ ́ ̀ <br /> ̣ ̉ ́ ̣ ́<br /> chon ra chung co hoat tinh protease cao nhât.<br /> ́<br /> ́ ưu cac điêu kiên lên men xôp c<br /> ­ Tôi  ́ ̀ ̣ ́ ơ  chât khô đâu t<br /> ́ ̣ ương vơi chung<br /> ́ ̉  <br /> ́ ợi va vi khuân đ<br /> nâm s ̀ ̉ ược tuyên chon nhăm thu đ<br /> ̉ ̣ ̀ ược hoat tinh protease cao.<br /> ̣ ́<br /> <br /> <br /> 16<br /> ­ Nghiên cưu đăc điêm hinh thai va đăc điêm sinh hoc chung chung<br /> ́ ̣ ̉ ̀ ́ ̀ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉  <br /> ́ ợi va vi khuân tuyên chon.<br /> nâm s ̀ ̉ ̉ ̣<br /> 2.3. Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy<br /> 2.3.1. Vật liệu <br /> ­ Các chủng giống được phân từ  mẫu đất kí hiệu là DOM (QB) và <br /> EM (QO), sau đó được bảo quản tại phòng Các chất chức năng sinh học, <br /> Viện Công nghê sinh h<br /> ̣ ọc ­ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ  Việt <br /> Nam <br /> ­ Cơ chất: Khô đậu tương<br /> 2.3.2. Hóa chất<br /> ­ Hóa chất được dùng để  chuẩn bị  môi trường như: cao nấm men, <br /> peptone, glucose, casein, khoai tây, các loại muối khoáng, thuốc thử  Folin­<br /> Ciocalteu, các hóa chất dùng trong phản  ứng sinh hóa có độ  tinh khiết  ở <br /> mức phân tích được cung cấp bởi các Công ty đại diện hóa chất của Đức,  <br /> Mỹ, Anh, Trung Quốc… tại Việt Nam.<br /> 2.3.3. Môi trường nuôi cấy<br /> ­ Môi trường Luria­Bertani (LB)<br /> Bang 2.. Công th<br /> ̉ ức môi trường LB<br /> <br /> Thành phần Khối lượng (g)<br /> Cao nấm men 10<br /> Peptone 5<br /> NaCl 5<br /> Agar 10<br /> pH = 6.5±0.2<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 17<br /> ­ Môi trường (Potatose Dextrose Agar: PDA) <br /> Bang 2.. Công th<br /> ̉ ức môi trường PDA<br /> Thành phần Khối lượng (g)<br /> Khoai tây 200<br /> Glucose 20<br /> Agar 20<br /> pH = 7±0.2<br /> <br /> <br /> ­ Môi trương PDB: la môi tr<br /> ̀ ̀ ường PDA bo đi thanh phân agar<br /> ̉ ̀ ̀<br /> ­ Môi trường định tính enzyme protease bằng phương pháp khuếch tán <br /> đĩa thạch<br /> Bang 2.. Công th<br /> ̉ ức môi trường định tính enzyme protease<br /> <br /> Thành phần Khối lượng (%)<br /> Đệm photphate pH =7 97,8<br /> Casein 0,2<br /> Agar 2<br /> pH = 7±0.2<br /> <br /> ­ Môi trường lên men rắn: khô đậu tương và tinh bột<br /> 2.3.4. Trang thiết bị<br /> ­ Dụng cụ:  đĩa petri,  ống falcon,  ống eppendorf,  đầu tip, pipet, đèn  <br /> cồn…<br /> ­ Thiết bị: Các thiết bị  sử  dụng trong khóa luận này thuộc Phòng Các <br /> chất Chức năng sinh học, Viện Công nghệ  Sinh học, Viện Hàn Lâm khoa <br /> học và công nghệ Việt Nam. Dưới đây là bảng liệt kê chi tiết:<br /> Bang 2.. Các thi<br /> ̉ ết bị sử dụng trong nghiên cứu<br /> <br /> Nước sản <br /> STT Thiết bị<br /> xuất<br /> <br /> <br /> 18<br /> 1 Tủ cấy vi sinh (Box Laminar­PII) Đưć<br /> 2 Cân OHAUS PA 213 Mỹ<br /> 3 Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter Ý<br /> 4 Tủ lắc ổn định Wis­10R Hàn Quốc<br /> 5 Nồi khử trùng HVE­50 Nhật Bản<br /> 6 Máy Vortex Trung Quốc<br /> 7 Tủ lạnh 40C, ­200C (Pinimax), ­800C (MDF­192) Nhật Bản<br /> 8 Kính hiển vi Trung Quốc<br /> 9 Lò vi sóng 20 lit, 30lit Liên doanh<br /> 10 Máy ảnh Sony Lens 14.1 megaPixels Nhật Bản<br /> 11 Micropipet EMC­LAB Đức<br /> 12 Máy đo OD 752N Đức<br /> 13 ́ ư gia nhiêt AHYQ 85­2<br /> May khuây t<br /> ́ ̀ ̣ Trung Quôć<br /> 14 ̉ ́<br /> Tu sây XMTA Trung Quôć<br /> 15 ̣<br /> May li tâm lanh KUBOTA 2010<br /> ́ Mỹ<br /> 16 ́ ́ ́ ̣<br /> Cac may moc chuyên dung khac…<br /> ́<br /> <br /> <br /> 2.4. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.4.1. Phương phap phân lâp va gi<br /> ́ ̣ ̀ ư chung <br /> ̃ ̉<br /> ́ ̃ ử ly cho vao 900 µl n<br /> ­ Cân 0,1 g đât đa x ́ ̀ ước cât kh<br /> ́ ử trung, dung may<br /> ̀ ̀ ́ <br /> vortex hoa tan.<br /> ̀<br /> ̃ ̃ ở  cac nông đô pha loang khac nhau: 10<br /> ­ Pha loang mâu  ́ ̀ ̣ ̃ ́ ­3<br /> ­10­7  la cac<br /> ̀ ́ <br /> ̣ ́ ợp đê phân lâp.<br /> nông đô thich h<br /> ̀ ̉ ̣<br /> ̣ ̃ ở cac nông đô trên nho lên đia Petri ch<br /> ­ Hut 50µl dich pha loang <br /> ́ ́ ̀ ̣ ̉ ̃ ứa môi <br /> trương phân lâp. Dung que gat trang đêu dich trên bê măt thach.<br /> ̀ ̣ ̀ ̣ ̀ ̣ ̀ ̣ ̣<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 19<br /> ̉ ́<br /> ­ Nuôi trong tu âm 37 0<br /> ̉ ̉ ̣<br /> C khoang 1 ngay sau đo cây ria cac khuân lac đê<br /> ̀ ́ ́ ́ ̉ <br /> ̣<br /> tao cac dong thuân.<br /> ́ ̀ ̀<br /> ­ Giư chung trong glycerol 40% <br /> ̃ ̉ [15].<br /> 2.4.2. Phương phap vi sinh<br /> ́<br /> ̣ ̉<br /> 2.4.2.1. Hoat hoa chung<br /> ́<br /> ̉ ́ ợi được hoat hoa lai trên môi tr<br /> ­ Chung nâm s ̣ ́ ̣ ương PDA, sau đo nuôi<br /> ̀ ́  <br /> ở điêu kiên nhiêt đô 30<br /> ̀ ̣ ̣ ̣ 0C±20C trong 2­3 ngay.<br /> ̀<br /> ̉ ̉ ược hoat hoa trên môi tr<br /> ­ Chung vi khuân đ ̣ ́ ương LB, sau đo nuôi <br /> ̀ ́ ở <br /> ̣ ̣ 0C trong 24h.<br /> nhiêt đô 37<br /> ́ ̉ ̉ ́ ̉ ̀ ̉ 0C.<br /> ­ Sau đo bao quan cac chung nay trong tu ­4<br /> 2.4.2.2. Phương phap lên men chim<br /> ́ ̀<br /> ̉ ́ ợi sau khi được hoat hoa, đ<br /> ­ Chung nâm s ̣ ́ ược nuôi long trong môi<br /> ̉  <br /> trương PDB <br /> ̀ ở  điêu kiên nhiêt đô 30<br /> ̀ ̣ ̣ ̣ 0C±20C, lăc 200rpm/phut, th<br /> ́ ́ ơi gian 3<br /> ̀  <br /> ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ́<br /> ngay sau đo thu dich enzyme thô đê xac đinh hoat tinh protease.<br /> ̀ ́<br /> ̉   vi   khuân<br /> ­ Chung ̉   sau   khi   đã  hoaṭ   hoa,<br /> ́   được   nuôi   long<br /> ̉   trong   môi <br /> trương LB <br /> ̀ ở điêu kiên nhiêt đô 37<br /> ̀ ̣ ̣ ̣ 0C, lăc 200rpm/phut, th<br /> ́ ́ ơi gian 2 ngay sau<br /> ̀ ̀  <br /> ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ́<br /> đo thu dich enzyme thô đê xac đinh hoat tinh protease.<br /> ́<br /> 2.4.3. Phương pháp quan sát hình thái <br /> Cấy chủng nấm mốc lên môi trường PDA,  để   ở  nhiệt độ  phòng <br /> trong 48 giờ, chủng vi khuân <br /> ̉ trên môi trường LB đê trong tu <br /> ̉ ̉ ấm 37 0C trong <br /> 24h. Sau đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc nấm mốc trên đĩa như:  <br /> màu sắc, hình dạng, kich th<br /> ́ ươc, đăc điêm bê măt khuân lac, đăc điêm phat<br /> ́ ̣ ̉ ̀ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ́ <br /> ̉<br /> triên trên môi tr ương răn (lôi, lom, det…) <br /> ̀ ́ ̀ ̃ ̣ [12].<br /> 2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng  đo đường kính  <br /> vòng phân giai casein <br /> ̉<br /> <br /> Nguyên tắc: Dựa trên phan <br /> ̉ ưng gi<br /> ́ ưa enzyme protease va c<br /> ̃ ̀ ơ  chât́ <br /> casein trên môi trương casein ­ agar khi cho protease tiêp xuc v<br /> ̀ ́ ́ ơi casein <br /> ́ ở <br /> <br /> <br /> 20<br /> ̣ ̣ ́ ợp xay ra phan <br /> nhiêt đô thich h ̉ ̉ ưng thuy phân tao thanh vong tron thuy phân<br /> ́ ̉ ̣ ̀ ̀ ̀ ̉  <br /> ̉<br /> trong suôt. Kha năng sinh enzyme protease đ<br /> ́ ược đanh gia d<br /> ́ ́ ựa trên sự  thuỷ  <br /> phân casein thông qua đường kinh cua vong phân thuy phân casein v<br /> ́ ̉ ̀ ̉ ơi s<br /> ́ ự  <br /> ̣ ́ ựa vao chât chi thi Coomassie Brillant Blue R ­ 250 [<br /> nhân biêt d ̀ ́ ̉ ̣ 30] [25].<br /> Cach tiên hanh:<br /> ́ ́ ̀<br /> Dung pipet hut 50µl<br /> ̀ ́ ̣<br />   dich chiêt enzyme đ<br /> ́ ược nho vao giêng đuc trên<br /> ̉ ̀ ́ ̣  <br /> ̃ ̣<br /> đia thach v ơi 2% agar vâ 0.2% casein (c<br /> ́ ̀ ơ  chât) trong đêm phosphate 0.1M,<br /> ́ ̣  <br /> pH7.<br /> ̣<br /> Đia thach đ<br /> ̃ ược nho dich chiêt đ<br /> ̉ ̣ ́ ược u ̉ ở  4 0C trong 4h  để  enzyme <br /> ̣<br /> khuêch tan đêu trên đia thach. Sau đo chuy<br /> ́ ́ ̀ ̃ ́ ển ra u trong tu âm 37<br /> ̉ ̉ ́ 0<br /> C trong <br /> 24h.<br /> Kiểm tra kết quả: Nhuôm b<br /> ̣ ởi chât chi thi mau<br /> ́ ̉ ̣ ̀  Coomassie Brilliant <br /> Blue R­250,  pha vơi lugol (1:3) pha trong dung dich methanol, acid acetic,<br /> ́ ̣  <br /> nươc cât theo ty lê 3:1:6 trong 1 h.<br /> ́ ́ ̉ ̣<br /> Cách đánh giá khả năng tạo enzyme:<br /> Dùng thước đo đường kính vòng phân giải: D là đường kính vòng <br /> phân giải, d là đường kính của khoan lỗ thạch, ∆D la đ<br /> ̀ ường kinh vong phân<br /> ́ ̀  <br /> ̉ ̉ ̉<br /> giai cua chung VSV sau khi tr ư đi đ<br /> ̀ ường kinh cua khoan lô thach.<br /> ́ ̉ ̃ ̣<br /> ∆D > 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh<br /> ∆D > 20mm: hoạt tính enzyme mạnh<br /> ∆D > 10mm: hoạt tính enzyme trung bình<br /> ∆D 
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2