ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
ĐẶNG THỊ QUỲNH
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT.,
HỌ GANODERMATACEAE THU HÁI TẠI TÂY NGUYÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
ĐẶNG THỊ QUỲNH
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT., HỌ GANODERMATACEAE THU HÁI TẠI TÂY NGUYÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
: QH.2014.Y Khóa Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Thị Duyên
2. TS. Nguyễn Hữu Tùng
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn diclomethan của Nấm cổ cò - Ganoderma flexipes Pat., họ Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” là kết quả cho qúa trình học tập, rèn luyện của em tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực tập tại Khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu. Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, gia đình và bạn bè. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS. Nguyễn Thị Duyên - Khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu, TS. Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn em hoàn thành đề tài khóa luận này. Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu tại Khoa trong suốt 5 năm học qua. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt là các cán bộ, nhân viên tại khoa Hóa Thực vật đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua. Dù đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ từ nhiều nguồn nhưng vì kiến thức cũng như thời gian còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến đóng góp của quý thầy cô, bạn bè để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Đặng Thị Quỳnh
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Các phương pháp sắc ký
CC HPLC Sắc ký cột thường Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Column Chromatography High Performance Liquid Chromatography Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng
1H-NMR
13C-NMR
TLC Các phương pháp phổ
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
DEPT Phổ DEPT
ESI-MS Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscop Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Electron Spray Ionization
Mass Spectrometry
HMBC
HSQC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Single Quantum Coherence Mass Spectroscopy Ultra Violet - Visible Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối Phổ tử ngoại MS UV-Vis
Các loại dung môi, phân đoạn dịch chiết
Diclomethan Dược liệu/Dung môi Phân đoạn diclomethan của nấm Cổ cò Phân đoạn etyl acetat của nấm Cổ cò Etyl acetat Methanol Phân đoạn nước của nấm Cổ cò DCM DL/DM DNCC ENCC EtOAc MeOH WNCC
Các ký hiệu sinh học
AChE AD AIDS
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Acetylcholinesterase Alzheimer Acquired Immuno Deficiency Syndrom Hội chứng mất trí nhớ Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
Enzyme Catalase Deoxyribonucleic acid Effective dose 50% CAT DNA ED50
ERK
FGFR
Liều có hiệu quả ở 50% động vật thí nghiệm Kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi
GPx HBV HIV HSV IC50
NPC Nrf2
Tế bào tiền thân thần kinh Yếu tố hạt nhân có nguồn gốc từ erythroid 2
RNA ROS SOD Extracellular signal - regulated kinases Fibroblast growth factor receptor Enzyme Glutathione Peroxidase Hepatitis B virus Human immunodeficiency virus Virus herpes simplex Nồng độ ức chế 50% Half maximal inhibitory concentration Neural progenitor cell Nuclear factor (erythroid- derived 2)-like 2 Ribonucleic acid Reactive oxygen species Superoxide dismutase
Gốc tự do oxy hóa Enzyme xúc tác quá trình phân hủy superoxide
Các ký hiệu viết tắt khác
Khối lượng/điện tích Melting Point Số thứ tự Tài liệu tham khảo Thể tích/ Thể tích Điểm nóng chảy
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
m/z Mp STT TLTK v/v VKH&CNVN Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Trang Bảng
Bảng 1.1. 6
Một số triterpen nhóm I phân lập được từ chi Ganoderma
Bảng 1.2. Một số triterpen nhóm II phân lập được từ 7
chi Ganoderma
Bảng 1.3. Một số triterpen nhóm III phân lập được từ 8
chi Ganoderma
Bảng 1.4. Một số sterol phân lập từ chi Ganoderma 9
Bảng 1.5. 17
Kết quả tra cứu tài liệu tham khảo tính đến tháng 7/2018
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Bảng 3. Dữ liệu phổ của 2 hợp chất NCC03 và NCC06 31
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của Triterpen nhóm I 6
Hình 1.2. Cấu trúc của Triterpen nhóm II 7
Hình 1.3. Cấu trúc của Triterpen nhóm III 8
Hình 1.4. Nấm cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây 16
Nguyên
Hình 2. Nguyên liệu nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes Pat. 19
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn nấm Cổ cò. 24
Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC cao tổng và các cao phân đoạn 25
nấm Cổ cò.
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao nấm Cổ cò phân 27
đoạn DCM
Hình 3.4. Kết quả chạy HPLC kiểm tra độ tinh khiết của 2 28
hợp chất NCC03 và NCC06
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03 30
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06 31
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1. Tổng quan về chi Ganoderma .............................................................. 3
1.1.1. Vài nét về thực vật của chi Ganoderma. ........................................... 3
1.1.2. Thành phần hóa học .......................................................................... 4
1.1.2.1.Triterpen/ Triterpenoid ................................................................... 4
1.1.2.2.Sterol .............................................................................................. 9
1.1.2.3.Polysaccharit .................................................................................. 9
1.1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................ 10
1.1.3.1.Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư .................................. 10
1.1.3.2.Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan ............................................ 12
1.1.3.3.Tác dụng kháng virut.................................................................... 13
1.1.3.4.Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm ......................................... 13
1.1.3.5.Tác dụng trên hệ thần kinh ........................................................... 14
1.1.3.6.Tác dụng khác .............................................................................. 15
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò. ............................ 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu. ........................................................................ 19
2.2. Hóa chất, thiết bị. ................................................................................ 19
2.2.1. Hóa chất, dung môi ......................................................................... 19
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
2.2.2. Thiết bị ............................................................................................. 19
2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết. ............................................................................................................ 20
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập ............................................... 20
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc ................................. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 24
3.1. Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn diclomethan. ......................................................................................... 24
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò. ............................................... 24
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn diclomethan của nấm Cổ cò. ...................................................................... 26
3.1.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết ......................................................... 27
3.2. Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06 .............................. 28
3.2.1. Hợp chất NCC03 ............................................................................. 28
3.2.2. Hợp chất NCC06 ............................................................................. 30
3.3. Bàn luận .............................................................................................. 32
3.3.1. Về chiết xuất ....................................................................................... 32
3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc hợp chất. ................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
1. Kết luận ............................................................................................... 35
2. Kiến nghị ............................................................................................ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự tiến bộ của khoa học – kỹ thuật, xu hướng quay về với thiên nhiên, tìm về những phương thuốc truyền thống dân gian ngày càng được quan tâm, phát triển. Dược thảo thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan trọng trong phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ. Trong đó, việc tìm ra loại dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên để chữa các bệnh hiểm nghèo trên cơ sở khoa học có ý nghĩa vô cùng to lớn [10].
Nấm Linh chi là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền. Với thành phần hóa học có chứa polysaccharit (giàu β-glucan), triterpenoid, steroid, saponin…, nấm Linh chi được ghi nhận có tác dụng phòng chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, giải độc gan, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giảm cholesterol trong máu… Chính vì thế, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong phòng ngừa và điều trị bệnh là rất lớn, không chỉ ở Việt Nam, mà còn ở nhiều nơi trên thế giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,…[9].
Theo cuốn Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam của Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, nước ta có khoảng trên 80 loài nấm Linh chi, chiếm khoảng 1/3 số loài trên thế giới với không ít loài mới, đặc hữu [7]. Riêng ở Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc khu vực Tây Nguyên, chi Ganoderma có ít nhất là 25 loài, trong đó 10 loài có tác dụng dược liệu như Ganoderma tornatum, Ganoderma amboinense, Ganoderma gibbosum, Ganoderma capense, Ganoderma lobatum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Ganoderma flexipes, Ganoderma tropicum, Ganoderma cochlear, các loài còn lại chưa biết rõ ý nghĩa [6]. Do đó, nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở Việt Nam sẽ là một công trình có ý nghĩa và mang lại hiệu quả to lớn cho người trồng nấm. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu (cả trong và ngoài nước) về chi Ganoderma mới chỉ dừng lại trên đối tượng Ganoderma lucidum. Trong khi cũng được công bố là một trong số 10 loài có tác dụng dược liệu tại Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh, nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes lại chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng.
Vì vậy, để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của Ganoderma flexipes, em thực hiện đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất
lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của nấm Cổ cò -
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
1
Ganoderma flexipes Pat., họ Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” với 2 mục tiêu cần đạt được:
1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dicloromethan. 2. Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân
đoạn.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Ganoderma
1.1.1. Vài nét về thực vật của chi Ganoderma.
Chi Ganoderma thuộc họ Ganodermataceae Donk, trong tất cả, có 219 loài trong họ đã được gán cho chi này [13], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ [5]. Ở Việt Nam, theo GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt, có khoảng 80 loài, phân bố rộng, đặc biệt vùng nhiệt đới [3]. Riêng trong hệ sinh thái của vườn Quốc gia Kon Ka Kinh ở Tây Nguyên nước ta đã định danh được 25 loài nấm thuộc chi này [6]. Các loài nấm thuộc chi Ganoderma đa số sinh trưởng và phát triển dưới tán rừng ở sinh cảnh rừng lá rộng thường xanh là chủ yếu, tiếp theo là một số sinh cảnh khác như rừng lá rộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng lá kim, rừng hỗ giao tre nứa. Đa số các loài xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 12 trong năm [6].
Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst.
Theo hệ thống phân loại của P. Karsten (1881) chi Garnoderma Karst.
thuộc:
Giới nấm (Fungi).
Ngành nấm đảm (Basidiomycota).
Lớp nấm đảm (Agaricomycetes).
Bộ nấm đa tầng (Polyporales).
Họ nấm Lim (Ganodermataceae).
Chi Ganoderma Karst. [3]
Đặc điểm của chi Ganoderma Karst:
Quả thể có cuống hoặc không cuống, mọc trên gỗ. Mũ nấm bóng láng thường dạng thận hay quạt có khi tròn. Thịt nấm màu nâu chất gỗ đến chất bì dai. Ống nấm đa số một tầng, một số ít hai tầng. Bào tử có dạng hình trứng nhụt một đầu, vỏ bào tử gồm hai lớp, lớp ngoài nhẵn lớp trong có gai nhẹ có màu vàng gỉ sắt [6]. Tuy nhiên, các đặc điểm hình thái có thể thay đổi do, ví dụ, sự khác biệt trong canh tác ở các vị trí địa lý khác nhau trong các điều kiện khí hậu khác nhau và sự phát triển di truyền tự nhiên (đột biến, tái tổ hợp) của từng loài [13].
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
3
1.1.2. Thành phần hóa học
Ngoài gần 90% là nước trong đặc trưng của tất cả các loại nấm, 10% khối lượng còn lại của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm: protein (10 - 40%), carbohydrate (3 - 28%), chất béo (2 - 28%), chất xơ (3 - 32%), vitamin và khoáng chất. Người ta đã xác nhận rằng protein có nguồn gốc từ nấm có chứa tất cả các axit amin thiết yếu và chúng đặc biệt giàu lysine và leucine. Tuy nhiên, nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong các loại nấm khác nhau của chi Ganoderma là triterpen và polysaccharit (Boh và cộng sự, 2007) [35].
1.1.2.1. Triterpen/ Triterpenoid
Terpen là một nhóm các hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, có bộ xương carbon bao gồm một hoặc nhiều đơn vị isopren. Terpen bao gồm bốn nhóm: (a) mono- và sesquiterpen dễ bay hơi (tinh dầu) (C10 và C15), (b) diterpen ít bay hơi (C20), (c) triterpen và sterol (C30) và (d) ) các sắc tố caroten (C40). Hầu hết các nghiên cứu về nấm Linh chi liên quan đến các dạng triterpene và sterol ít bay hơi hơn [13]. Triterpen là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren [13]. Hàng trăm hợp chất triterpen đã được phân lập từ chiết xuất methanol, ethanol, acetone và chloroform của bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của các loại nấm Linh chi, đặc biệt là loài G.lucidum [36]. Kubota lần đầu tiên phân lập được axit ganoderic A và axit ganoderic B từ Ganoderma lucidum (FR.) KARST năm 1982. Kể từ đó, hơn 316 triterpen đã được phân lập từ cơ thể đậu quả, bào tử, và sợi nấm của nhiều loại nấm Linh chi trong chi Ganoderma [46]. Cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên lanostane, là một chất chuyển hóa của lanosterol, thông thường chúng có hai nhóm cụ thể được xác định là ganoderic (C30) và axit lucidenic (C27). Theo nghiên cứu của Cole R. J. và Schweikert M. A. đã có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol (acid ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, acid lucidenic,...) được phân lập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi. Các triterpen tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -OAc; -O- (eter); C=O; nối đôi C=C. Cấu trúc hóa học của nó rất phức tạp và bị oxy hóa cao. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
4
tốt trong eter dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [2].
Các triterpen phân lập từ chi Ganoderma được phân thành từng nhóm
khác nhau theo 3 cấu trúc chính dưới đây.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
5
6
Hình 1.1. Cấu trúc của Triterpen nhóm I [1] Bảng 1.1. Một số triterpen nhóm I phân lập được từ chi Ganoderma
STT Triterpen Nguồn gốc TLTK
Ganoderal A 1 R1 O R2 H R3 H R6 R8 CHO G. lucidum [40] R7 Me
Acid Ganoderic S 2 H R5 R4 H Δ 24-25 H Δ 24-25 COOH G. lucidum [21] Me
α- OAc α- OAc
3
H Δ 24-25 COOH G. lucidum [1] Me
β- OAc α- OAc β- OAc
Acid lanosta- 7,9(11),24-trien- 3β,15α,22β- triacetoxy-26-oic
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
4 Ganorbiformin G O H OAc H Me COOH G. orbiforme [25]
7
Hình 1.2. Cấu trúc của Triterpen nhóm II [1]
Bảng 1.2. Một số triterpen nhóm II phân lập được từ chi Ganoderma
STT Triterpen Nguồn gốc TLTK R1 R2 R3 R4 R5
Acid lucidenic A O β-OH H Me 1
COOH G. lucidum [1] 2 Acid lucidenic C β-OH β-OH β-OH Me
3 Acid 20-hydroxylucidenic N β-OH β-OH OH COOH G. lucidum H
Methyl lucidenat F H COOMe G. lucidum O O H 4
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
O OH 20-hydroxylucidenic acid A β-OH COOH G. sinense [39] 5
8
Hình 1.3. Cấu trúc của Triterpen nhóm III [1]
Bảng 1.3. Một số triterpen nhóm III phân lập được từ chi Ganoderma
STT Triterpen TLTK R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10
Nguồn gốc
1 Acid ganoderic α β-OH O O β-OH α-Me O H COOH Me β- OAc
[17] 2 Acid ganoderic H β-OH O O O α-Me O H COOH Me β- OAc G. lucidum
3 Acid ganoderic V O α-OH H α-OAc α-Me H Δ24-25 Me COOH H
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
[1] 4 Acid ganoderic W α-OAc α-OH H α-OAc α-Me H Δ24-25 Me COOH H
1.1.2.2. Sterol
Gần đây, Fa – Huan Ge và cộng sự (2017) lần đầu tiên phân lập được từ dầu bào tử nấm Linh chi thu được bằng chiết xuất CO2 siêu tới hạn một sterol, Ganoderin A, được chứng minh là cấu trúc trước đây chưa từng có [19].
Dưới đây là một số sterol đã được phân lập và xác định từ chi
Ganoderma.
Bảng 1.4. Một số sterol phân lập dược từ chi Ganoderma
STT Sterol Nguồn gốc TLTK
1 Ergosterol G.lucidum [20, 19]
2 Fungisterol G.lucidum [18]
3 G.annulare [43]
5α-ergost-7-en-3β-ol, 5α- ergosta-7,22-dien-3β-ol
4 G.annulare [43]
5,8-epidioxy-5α,8α- ergosta-6,22-dien-3β-ol
5 Stellasterol G.lucidum [19]
1.1.2.3. Polysaccharit
9
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Polysacchrit của linh chi là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng và phức tạp [10]. Cho đến nay, hơn 200 polysaccharit đã được phân lập từ bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của chi Ganoderma (Huie và Di, 2004). Nhưng polysaccharit chỉ gồm 2 loại chính và tỉ lệ các thành phần có trong mỗi loại như sau: GL – A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Glactan, còn GL – B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan [35]. Theo các báo cáo trước đây, các polysacharit của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm glucan, galactan và/hoặc các heteropolysaccharit khác bao gồm một số monosaccharit như glucose, galactose, mannose và fucose [50]. Hầu hết các GPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharit, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000 - 1.000.000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần
polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng [2].
1.1.3. Tác dụng sinh học
Từ thời xa xưa, trong các tài liệu y học cổ đã ghi nhận nhiều tác dụng bảo vệ sức khỏe của nấm Linh chi đối với cơ thể. Ngày nay, khi nền khoa học hiện đại ngày càng phát triển, đặc biệt là lĩnh vực phân tử học và dược lý dược lâm sàng, hàng trăm những công trình nghiên cứu đã công bố, một lần nữa khẳng định tính năng, công dụng của loài thảo dược quý này. Kết quả của các nghiên cứu khoa học này cho rằng tác dụng sinh học của chi Ganoderma chủ yếu do triterpen và polysaccharit đem lại.
1.1.3.1. Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư
Tác dụng chống ung thư của các loài nấm Linh chi đã và đang được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng nhiều. Nhiều cơ sở khoa học về tác dụng này của nó đã được công bố.
Axit ganoderic T (GA-T) gây ra sự giảm sự tăng sinh của một số tế bào ung thư. Nó có độc tính tế bào cao hơn đối với dòng tế bào ung thư phổi 95-D so với các dòng tế bào bình thường. Khả năng tồn tại của các tế bào 95-D đã bị ức chế 70% ở liều 50 μg/mL trong 24 giờ bởi GA-T. GA-T ở nồng độ thấp cũng có thể ức chế mạnh sự hình thành các khuẩn lạc tế bào 95-D. Chen và cộng sự chứng minh rằng GA-T ức chế thành công sự xâm lấn tế bào ung thư trong ống nghiệm và di căn trong thí nghiệm in vivo, do đó GA-T có thể hoạt động như một loại thuốc tiềm năng để điều trị ung thư [45].
Gao và cộng sự đã nghiên cứu các tác dụng chống độc in vivo của ganoderiol F, cho thấy hoạt động mạnh nhất trong xét nghiệm độc tế bào. Nó được dùng cho chuột mang tế bào ung thư biểu mô tế bào phổi (LLC) của Lewis với ba liều 5, 10 và 20 mg/kg/ngày. Ganoderiol F ức chế đáng kể sự phát triển khối u. Trong khi đó, không có tác dụng phụ hoặc độc hại rõ ràng nào được nhận thấy [15].
10
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Su và cộng sự (2000) đã kiểm tra hoạt động gây độc tế bào của lanostan từ G. tsugae và tìm thấy hoạt động chống lại ba dòng tế bào ung thư. Lanostan và một steroid từ G. tsugae đã gây chết tế bào do apoptosis và cho rằng đó là
sterol sở hữu hoạt động ức chế chu kỳ tế bào (Gan và cộng sự, 1998a). Gonzalez và cộng sự (2002) cũng đã quan sát thấy apoptosis trong các tế bào ung thư bạch cầu ở người tiếp xúc với ba lanostanoid phân lập từ G.concinna. Ngược lại, ba triterpen từ G. concinna đã ức chế DNA polymerase của bê và chuột có liên quan đến sửa chữa DNA, tái tổ hợp và sao chép DNA (Mizushina và cộng sự, 1999) [38].
Triterpen được coi là tác nhân chống ung thư tiềm năng do hoạt động chống lại các khối u đang phát triển (Lin và cộng sự, 2003): chúng gây độc tế bào trực tiếp chống lại các tế bào khối u (Gonzalez và cộng sự, 2002) [38].
Polysacharit phân lập từ chi Ganoderma làm tăng phản ứng miễn dịch chống khối u bằng cách thúc đẩy hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên và tế bào lympho T gây độc tế bào [37]. Ngoài ra, các nó cũng được công nhận để cải thiện sự biểu hiện của phức hợp tương hợp mô, chủ yếu trong dòng tế bào u ác tính, giúp cải thiện quá trình trình diện kháng nguyên và do đó kích thích kháng virut và ung thư [44]. Polysaccharit thường không tác động trực tiếp gây đến độc tế bào trong các tế bào khối u, nhưng tác động đến các hoạt động chống khối u thông qua việc tăng cường miễn dịch qua trung gian của vật chủ [15].
Theo các nghiên cứu mới nhất của Wiater và cộng sự, các α- D -glucan được phân lập từ G. lucidum thể hiện hành động gây độc tế bào liên quan đến các tế bào ung thư HeLa biểu mô ở người [42].
Một số nghiên cứu in vivo đã chứng minh rằng polysaccharit (β- D - glucan, heteropolysaccharit và glycoprotein) được phân lập từ Ganoderma có hoạt tính chống khối u sarcoma 180 ở chuột. Sự kích thích của hệ thống miễn dịch, được trung gian bởi các polysaccharit, có thể là cơ chế chính giải thích cho khả năng chống khối u của nấm Linh chi. Trong số rất nhiều polysaccharit, β- D -glucan chịu trách nhiệm chính cho các hiệu ứng chống độc [48].
11
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Isocitrate dehydrogenase (IDH) là một trong những enzyme quan trọng trong chu trình acid tricarboxylic, và đột biến IDH có liên quan đến nhiều bệnh ung thư. Bằng phương pháp sàng lọc phối tử ảo, phát hiện rằng sterol có tiềm năng ức chế IDH1. Như vậy, phát hiện của Zheng M và cộng sự nhấn mạnh rằng hợp chất sterol từ Ganoderma sinense có thể có tiềm năng lâm sàng trong các liệu pháp khối u như một chất ức chế hiệu quả của IDH1 đột biến [51].
Hexokinase 2 (HK2), một enzyme giới hạn tốc độ trong bước đầu tiên của con đường glycolysis. HK2 cung cấp một mục tiêu mới cho điều trị ung thư do vai trò then chốt của nó trong quá trình khối u và di căn khối u. Việc sàng lọc phối tử ảo dựa trên cấu trúc trong một cơ sở dữ liệu nhỏ các sản phẩm tự nhiên đã dự đoán rằng một steroid mới, (22E, 24R) -6β-methoxyergosta-7,9 (11), 22-triene-3β, 5α-diol từ Ganoderma sinense có ái lực liên kết cao với HK2. Kết quả nghiên cứu in vitro của Bao F và cộng sự đã khẳng định rằng sterol này là chất ức chế HK2 tự nhiên đầu tiên, nó có thể được coi là một ứng cử viên thuốc tiềm năng nhắm mục tiêu tại HK2 để điều trị ung thư [12].
Ngai và cộng sự đã phân lập được một lectin từ G. capense thể hiện hoạt động giảm thiểu mạnh đối với tế bào lách chuột và hoạt động chống tăng sinh đối với các tế bào ung thư bạch cầu và tế bào gan trong ống nghiệm [36].
1.1.3.2. Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan
Trong số các thành phần hóa đã được phân lập và xác định của chi Ganoderma thì terpen được chứng minh là phần có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [15]. Sự gia tăng các enzym chống oxy hóa chủ yếu được đóng góp bởi axit ganoderic. Nó có thể kích hoạt yếu tố hạt nhân erythroid 2 liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2), từ đó khởi đầu sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa (SOD, CAT và GPx) và do đó tăng cường nồng độ enzyme chống oxy hóa (Ko và cộng sự 2008) [29].
Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, Chu cùng cộng sự (2012) suy ra rằng do sự hiện diện của lanostan triterpen có thể góp phần vào việc hạ lipid máu. Kết quả đánh dấu gan và siêu âm bụng cho thấy lanostan triterpen có thể cải thiện chức năng gan (bảo vệ gan) bằng cách giảm căng thẳng oxy hóa (ROS), lắng đọng lipid và do đó làm giảm tổn thương gan cũng như bình thường hóa các tình trạng bất thường khác nhau như gan nhiễm mỡ và polyp túi mật [14].
Các nghiên cứu này đã chứng minh tính chống oxy hóa, chống lão hóa và bảo vệ gan của triterpen bằng cách kiềm chế stress oxy hóa một cách hiệu quả.
12
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Ngoài ra, tác dụng chống oxi hóa của các loài nấm Linh chi còn được chứng minh qua hoạt tính sinh học của polysaccharit. Một nghiên cứu chéo
ngẫu nhiên, mù đôi đã được thực hiện giữa viên nang là dịch chiết nấm Linh chi được làm giàu polysaccharit (GL) và viên nang giả dược với 90% là tinh bột được thực hiện bởi Hui Fang Chiu và cộng sự. Kết quả nghiên cứu thu được ở các đối tượng được điều trị GL cho thấy sự giảm đáng kể mức độ của các dấu hiệu stress oxy hóa khác nhau. Hơn nữa, các tổn thương gan đã được bình thường hóa khi điều trị bằng GL. Do đó, nhóm tác giả đã kết luận rằng GL được làm giàu với polysaccharit có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chống oxy hóa, chống lão hóa và bảo vệ gan thông qua việc làm giảm quá mức các gốc tự do và do đó bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại [14].
Năm 2011 Kao cùng các cộng sự báo cáo rằng β-1,3-glucan (một glucan trọng lượng phân tử thấp) được phân lập từ G. lucidum có thể tăng đáng kể (40% - 80%) khả năng sống sót của dòng tế bào đại thực bào bạch cầu đơn nhân chuột (RAW 264,7) với stress oxy hóa do H2O2 gây ra, và giảm sự hình thành các loại gốc tự do oxy hóa (ROS) [27].
1.1.3.3. Tác dụng kháng virut
HIV là virut gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS). Phương pháp điều trị hiện tại cho HIV là hoãn sự phát triển của AIDS. Một số triterpen của các loài nấm Linh chi (ganoderic acid beta, lucidumol B, ganodermanondiol, ganodermanontriol và ganolucidic acid A) đã được chứng minh là có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở người, với giá trị IC50 là 20- 90 microM [32]. Hai terpen: axit lucidenic O và lucidenic lactone, đã ức chế men sao chép ngược loại 1 của HIV [36]. Nhiều nghiên cứu vẫn cần được thực hiện để tạo cơ sở cho việc khẳng định các loài nấm Linh chi là tác nhân chống HIV, tuy nhiên triterpen dường như vẫn là nhóm hợp chất chính có tác dụng chống HIV [15].
Một số nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng polysacharit của Ganoderma lucidum hòa tan trong nước đã ức chế đáng kể virut herpes simplex HSV-1 và HSV-2 [28].
1.1.3.4. Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm
13
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Heleno và cộng sự báo cáo rằng chiết xuất methanol của nấm Linh chi cho thấy hoạt động chống lại Staphylococcus aureus và Bacillus cereus cao hơn
so với kháng sinh ampicillin và streptomycin, trong khi Staphylococcus aureus và Bacillus cereus là những vi khuẩn nhạy cảm nhất. Nồng độ ức chế tối thiểu nằm trong khoảng 0,0125-0,75 mg/mL và nồng độ diệt khuẩn là 0,035-1,5 mg/mL [22]. Như vây, polysaccharit cho thấy hoạt động kháng khuẩn, ức chế sự phát triển của vi khuẩn hoặc gây ra cái chết của vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, các cơ chế hoạt động chống vi khuẩn của nấm Linh chi vẫn chưa được xác định rõ ràng [15].
Các hợp chất sterol của G.applanatum, được tìm thấy có hoạt tính phổ kháng khuẩn rộng và tác dụng diệt khuẩn [15]. Ganomycins A và B từ G.pfeifferi thể hiện hoạt động chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương [34].
Ngoài ra, Wang và cộng sự đã phân lập được protein kháng nấm 15 kDa,
được xác định là ganodermin, từ G.lucidum [45].
1.1.3.5. Tác dụng trên hệ thần kinh
Stress oxy hóa là một lý do cho sự tiến triển của nhiều bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Huntington, bệnh xơ cứng teo cơ và bệnh Alzheimer (AD). Một trong những cách tiếp cận để điều trị AD là kiểm soát chức năng của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine trong não thông qua việc ức chế acetylcholinesterase (AChE). Zhang và cộng sự đã báo cáo rằng hỗn hợp các hợp chất triterpen trong G.lucidum thúc đẩy sự tồn tại của tế bào thần kinh và giảm mệt mỏi. Và người ta đã chứng minh rằng việc tiếp tục uống G.lucidum có thể cắt giảm sự tiến triển của bệnh Alzheimer [49].
Bên cạnh đó, nghiên cứu của Huang và cộng sự cho thấy rằng polysaccharit của nấm Linh chi cũng đại diện cho một sản phẩm tự nhiên có tiềm năng lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị sớm AD. Phát hiện của nhóm tác giả cho thấy polysaccharit có thể phục vụ như một tác nhân trị liệu tái tạo để điều trị suy giảm nhận thức liên quan đến các bệnh thoái hóa thần kinh [23].
14
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Ngoài ra, từ thời cổ đại, G.lucidum được sử dụng như một thuốc giảm đau và có đặc tính thư giãn [15], Matsuzaki và cộng sự cũng đã báo cáo rằng chiết xuất nước giàu polysaccharit thể hiện tác dụng chống trầm cảm và giảm hành vi lo lắng ở chuột [33].
1.1.3.6. Tác dụng khác
Sterol phân lập từ nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng ức
chế tổng hợp cholesterol trong ống nghiệm [28].
Nucleoside, uridine và uracil từ sợi nấm của một loài nấm Linh chi - G.capense đã được tìm thấy có khả năng làm giảm mức độ aldolase trong huyết thanh của những con chuột bị chứng thiếu máu thực nghiệm. Adenosine cũng đã được chứng minh là ức chế kết tập tiểu cầu [23, 39].
Như vậy, từ những bằng chứng nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm sử dụng trong y học cổ truyền từ xa xưa, các loại nấm Linh chi đã được báo cáo là có một số tác dụng dược lý bao gồm: điều hòa miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, chống viêm, giảm đau, giảm một số tác dụng phụ do hóa trị liệu gây ra, chống ung thư, thúc đẩy giấc ngủ, kháng khuẩn, kháng virut (HBV, HSV, ... cho tới HIV), bảo vệ gan, hạ lipid máu, bảo vệ tế bào thần kinh, chống dị ứng, chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do triệt để, chống lão hóa, hạ đường huyết, hoạt động estrogen và đặc tính chống loét. Điển hình là Ganoderma lucidum hiện đã được công nhận là một chất bổ trợ thay thế trong điều trị bệnh bạch cầu, ung thư biểu mô, viêm gan và tiểu đường [13].
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò.
Nấm Cổ cò có tên khoa học là Ganoderma flexipes Pat., được cho là có nguồn gốc từ Việt Nam. Bằng chứng đã được trình bày trong các nghiên cứu phát sinh gen trước đây rằng đây là một loài độc lập (Cao và cộng sự, 2012; Wang và cộng sự, 2012), được tìm thấy rộng rãi trên khắp châu Á cận nhiệt đới và nhiệt đới. Cao và cộng sự (2012) đề xuất rằng Ganoderma atrum, Ganoderma calidophilum, Ganoderma hhaiense (J.D. Zhao và cộng sự, 1979) và Ganoderma parviungulatum (J.D. Zhao & X.Q. Zhang, 1986) tất cả được mô tả từ tỉnh Hải Nam, Trung Quốc của Giáo sư Ji-Ding Zhao và các đồng nghiệp của ông là từ đồng nghĩa của G.flexipes [52].
Vị trí phân loại của Ganoderma flexipes Pat.
Giới : Mycota hay Fungi
Ngành : Eumycota
15
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Ngành phu ̣ : Basidiomycotina
: Hymenomycetes
: Ganodermatales : Ganodermataceae : Ganoderma
Lớp Lớp phu ̣ : Hymenomycetidae Bộ Họ Chi Đặc điểm sinh học của Ganoderma flexipes Pat.
Hình 1.4. Nấm Cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây Nguyên
a. Quả thể b. Bào tử c. Bào tầng
Ghi chú: Thước đo tự nhiên = 2cm, thước đo hiển vi 2µm, thước đo bào tầng = 0.5 mm
Bào tầng dạng ống nhỏ, mỗi milimet có 4-7 ống, miệng ống nấm tròn
16
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Quả thể có màu nâu đỏ. Mũ nấm khi non có dạng vòi, sau phát triển thành dạng quạt hay móng nhỏ. Mặt trên mũ nấm có cấu trúc vòng đồng tâm và vân thớ phóng xạ. Mép mũ tà, ít lượn sóng và không chia thùy. Bề mặt mũ nấm gồ ghề, có màu nâu đỏ. Kích thước quả thể khoảng 1,5-10 x 1,0-7,0 cm; dày 0,5- 1,0 cm. Thịt nấm chất lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển sang màu nâu. Hệ sợi dimitric gồm sợi không vách ngăn ngang và sợi bện; kích thước từ 1,5-7,0 µm. Hệ sợi trong nuôi cấy trên môi trường thạch (môi trường thuần khiết) lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu vàng nhạt. đều. Miệng ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt.
Bào tử hình trứng nhụt một đầu, kích thước 6,5-7,5 x 7,5-9,0(x10) µm;
màng hai lớp (màng ngoài nhẵn, màng trong có gai nhẹ) và có màu rỉ sắt.
Nấm có cuống dài mọc rời gốc, đính bên, nấm mọc ký sinh hay hoại sinh
Đảm đơn bào, hình chùy ngắn kích thước 7-12 µm, màng là một lớp mỏng, nội chất không màu trong suốt; trong mỗi đảm có 3-4 cuống mang bào tử. trên cây gỗ mục gỗ màu trắng. Nấm phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy nhân tạo.
Nấm mọc trên gốc cây sống hoặc đã chết của nhiều loài cây gỗ, đây là
loài phân bố rộng ở các tỉnh Tây Nguyên [3, 52].
Tình hình nghiên cứu về nấm Cổ cò.
Khi tiến hành tra cứu
trang Website: Sciencedirect, trên ba ncbi.nlm.nih.gov và Scifinder với các từ khóa là Ganoderma, Ganoderma lucidum và Ganoderma flexipes cho kết quả như bảng 1.5.
Bảng 1.5. Kết quả tra cứu tài liệu tham khảo tính đến tháng 7/2018
Từ khóa Sciencedirect ncbi.nlm.ih.gov Scifinder
Ganoderma 3924 1813 20703
227 1240 11642
Ganoderma lucidum
2 1 2
Ganoderma flexipes
Kết quả bảng cho thấy trên chi Ganoderma có nhiều công bố và chủ yếu tập trung ở loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), các nghiên cứu về đối tượng nấm Cổ cò còn rất hạn chế. Hai công bố trên các website trên là:
17
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Theo nghiên cứu của Da Yu Cheng (2012) [16] về đa dạng các loài nấm lỗ polypore ở Trung Quốc có chú thích địa lý đã xác định loài nấm Cổ cò phân bố vùng nhiệt đới trên xác thực vật hạt kín. Một nghiên cứu khác về đa dạng của các loài thuộc nấm gỗ họ nấm lỗ polypore dựa trên phân tích hình thái và phát sinh loài của nhóm tác giả Li Wei Zho và cộng sự (2015) [52] đã xác định các loài Ganoderma curtisii, lingzhi, Ganoderma multipileum, Ganoderma flexipes, Ganoderma
18
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Ganoderma resinaceum, Ganoderma sessile, Ganoderma sichuanense và Ganoderma tropicum thuộc cùng một nhánh phát sinh (Clade A). Các nghiên cứu trong nước của tác giả Nguyễn Phương Đại Nguyên [6] và Trịnh Tam Kiệt [3], hai tác giả cũng chỉ có những mô tả về thực vật và phân bố của loài nấm Cổ cò tại Việt Nam. Như vậy, theo tìm hiểu của nhóm thực hiện đề tài, các nghiên cứu trong và ngoài nước về loài nấm Cổ cò còn rất hạn chế và chỉ dừng lại ở công bố về thực vật và sinh thái của loài.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
Đối tượng của nghiên cứu là cơ thể đậu quả của nấm Cổ cò được thu hái ở Tây Nguyên vào tháng 12 năm 2017. Mẫu được xác định tên khoa học là Ganoderma flexipes Pat. bởi TS.Nguyễn Phương Đại Nguyên – Bộ môn Sinh học – Trường Đại học Tây Nguyên. Mã số mẫu DL 001. Tiêu bản mẫu mã số GF1217 được lưu giữ tại khoa hóa học, Viện Dược liệu.
Hình 2. Nguyên liệu nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes Pat.
2.2. Hóa chất, thiết bị.
2.2.1. Hóa chất, dung môi
Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV: nước cất hai lần (H2O), dung môi ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), n – hexan.
Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha
đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJi Silisa Chemical Ltd.).
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien
60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).
Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol để phát hiện vết chất.
2.2.2. Thiết bị
Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình
19
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm…
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR
Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi). Tủ sấy Memmert, Binder-FD115. Bếp điện, bếp đun cách thủy. Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR. Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV. Máy siêu âm Power sonic 405. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học Các hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN. của Viện Hoá học, VKH&CNVN.
2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất
tinh khiết.
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập
20
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Toàn bộ nấm Cổ cò bao gồm: tán nấm và thân nấm được phơi khô, xay nhỏ (5,7 kg) chiết nóng tại 65ºC với methanol (3 lần, mỗi lần 3h). Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng. Cao này được hòa lại trong nước, đem chiết lỏng – lỏng lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, DCM và EtOAc, sau đó tiếp tục đem cô riêng rẽ từng phân đoạn, thu được cao phân đoạn n- hexan, phân đoạn DCM, phân đoạn EtOAc, và phân đoạn nước. Các hợp chất trong các phân đoạn của nấm Cổ cò được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), và pha đảo RP – 18. Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol. Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung môi thích hợp. Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng TLC, HPLC với các hệ dung môi phù hợp.
Các bước tiến hành: + Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để rửa giải: khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải.
+ Chuẩn bị cột: chọn cột sắc ký có kích thước phù hợp, rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định. Lót một lớp bông xung quanh vị trí vít. Cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có mỏ, thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch. Mở khóa cột, từ từ rót hỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng quanh thân cột bằng quả bóp cao su. Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột để luyện đến khi cột hoàn toàn ổn định (có thể từ 5- 10 giờ). Chú ý không được để cột bị khô dung môi làm nứt cột.
+ Nạp mẫu lên cột:
Nạp mẫu khô: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi dung môi đến khi thu được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn bên trên chất nhồi cột.
Nạp mẫu ướt: dùng pipet hút dung dịch mẫu cần phân tích, rót từ từ, nhẹ
nhàng dọc quanh thành cột.
Sau khi đưa mẫu lên cột, đặt một miếng bông lên để bảo vệ mặt tiếp xúc.
+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải. Dịch rửa giải được hứng vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích phù hợp. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau, các phân đoạn chứa chất cần được tinh chế.
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc
Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1H và 13C, DEPT, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối (MS),…; và một số đặc trưng lý hóa như điểm chảy, cảm quan,...
21
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
a. Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion.
b. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều
Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba… tới 7 đỉnh thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỉ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm. Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử.
Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
22
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY).
23
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác ta có thể xây dựng và nhận dạng được cấu trúc phân tử của hợp chất [8].
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao
phân đoạn DCM.
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò.
Toàn bộ nấm Cổ cò bao gồm: tán nấm và thân nấm được phơi khô, xay nhỏ (5,7 kg) chiết nóng tại 65ºC với MeOH (3 lần, mỗi lần 3h). Dịch chiết gộp lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng 245 g (NCCT, đạt hiệu suất là 4,3%). Lấy 240 g cao tổng bổ sung nước (1 lít) rồi chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, DCM, EtOAc. Loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cao: phân đoạn n-hexan (HNCC, 12,2 g), phân đoạn DCM (DNCC, 46,4 g), phân đoạn EtOAc (ENCC, 23,1 g), và phân đoạn nước (WNCC, 157,3 g). Quy trình được mô tả như hình 3.1.
24
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Nấm Cổ cò.
Kết quả phần chiết xuất như hình 3.1 cho thấy:
+ Hàm lượng cao tổng thấp chiếm 4,3% so với khối lượng mẫu dược
liệu khô.
+ Lượng cao phân đoạn được sắp xếp như sau: cao phân đoạn nước > cao phân đoạn DCM > cao phân đoạn EtOAc > cao phân đoạn n-hexan. Như vậy, lượng cao phân đoạn DCM khá nhiều chỉ sau phân đoạn nước, kết quả này gợi các chất có độ phân cực trung bình có hàm lượng khá cao trong dược liệu nghiên cứu - Nấm Cổ cò. Mặc dù, như trong phần tổng quan về nấm Cổ cò thì chưa có công bố nào về thành phần hóa học nhưng các nghiên cứu về loài cùng chi là loài nấm Linh chi – Ganoderma lucidum các hợp chất có độ phân cực trung bình này thường là các ergosterol hoặc lanostan-triterpen. Tiến hành sắc ký lớp mỏng (TLC) các phân đoạn n-hexan, DCM,
EtOAc và cao tổng để xác định hệ dung môi sắc ký cột.
B A
1 2 3 4 1 2 3 4
Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC cao tổng và các cao phân đoạn
nấm Cổ cò.
(Hình A: Sắc ký đồ TLC dưới ánh sáng thường, sau khi phun thuốc thử
H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối, tº
Hình B: Sắc ký đồ TLC tại bước sóng 366 nm, sau khi phun thuốc thử
H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối, tº)
Hệ dung môi triển khai: n-hexan/EtOAc/MeOH (20/5/3)
25
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Trong đó:
(1) Phân đoạn n-hexan (2) Phân đoạn DCM
(3) Phân đoạn EtOAc (4) Cao tổng.
Kết quả sắc ký đồ TLC với hệ dung môi n-hexan/EtOAc/MeOH = 20/5/3,
các vết cho sự phân tách khá tốt, đặc biệt là phân đoạn DCM.
Như vậy, sắc ký đồ TLC và kết quả chiết xuất cao phân đoạn cho thấy phân đoạn DCM có nhiều tiềm năng nên nhóm đề tài quyết định chọn cao phân đoạn này để tiến hành sắc ký cột phân lập các chất tinh khiết.
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn DCM
của nấm Cổ cò.
Cân 45 g cao phân đoạn DCM của nấm Cổ cò (DNCC) tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với hệ dung môi gradient là: n-hexan:EtOAc:MeOH (100% - 5:1:1 - 0:2:1) thu được 7 phân đoạn nhỏ ký hiệu là DNCC1-7.
Tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel RP-18 phân đoạn DNCC4 (19.3 g) với hệ dung môi rửa giải Aceton:H2O (2:1 - 20:1), thu được 2 phân đoạn ký hiệu là DNCC4.1-4.2.
Phân đoạn DNCC4.2 (6.3 g) tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi Aceton:H2O (7:1 - 25:1) thu được 2 hợp chất ký hiệu là NCC03 (15 mg) và NCC06 (10 mg).
Như vậy, bằng các kỹ thuật chiết xuất và các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng,
26
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
sắc ký cột, đã phân lập được 2 hợp chất NCC03 và NCC06 từ phân đoạn DNCC. Các hợp chất này cần tiến hành sắc ký đồ HPLC để kiểm tra độ tinh khiết cần thiết sau đó mới tiến hành đo bộ phổ (NMR và MS) để xác định cấu trúc hóa học.
CC: PR-18
CC: PR-18
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao nấm Cổ cò phân đoạn DCM
3.1.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết
Sau khi phân lập TLC để kiểm tra độ tinh sạch, tiếp tục tiến hành chạy
HPLC để xác định chính xác hơn độ tinh sạch của NCC03 và NCC06.
Các thông số kỹ thuật của chương trình chạy HPLC:
27
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
- Hệ thống sắc ký HPLC-DAD Shimadu - Cột Agilent C18 (5µm, 4.5 x 250mm) - Nhiệt độ lò cột: 40oC - Thể tích tiêm: 10 µl - Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút - Pha động: Acetonitril (ACN) – Acid phosphoric 0.1% trong nước.
Chương trình HPLC cho các chất NCC03 và NCC06 là:
- Chương trình KT ACN80: ACN 80%
- Chương trình KT ACN100: ACN 100%
NCC03
NCC06
Hình 3.4. Kết quả chạy HPLC kiểm tra độ tinh khiết của 2 hợp chất
NCC03 và NCC06
Kết quả cho thấy:
Hợp chất NCC03 phát hiện tại PDA là 243 nm, có thời gian lưu tại 16
phút và đạt độ tinh sạch là 90,336% tính theo diện tích píc.
Hợp chất NCC06 phát hiện tại PDA là 244 nm, có thời gian lưu tại 27,5
phút và đạt độ tinh sạch là 90,62% tính theo diện tích píc.
Như vậy, bằng sắc ký đồ HPLC có thể thấy hai hợp chất NCC03 và NCC06 đều khá sạch và đủ điều kiện để đo bộ phổ NMR và MS để xác định cấu trúc hóa học.
3.2. Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06
3.2.1. Hợp chất NCC03
Hợp chất NCC03 phân lập được có dạng bột không màu. Nhiệt độ nóng
chảy của hợp chất trong khoảng: 168-170ºC.
Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC03 cho tín hiệu píc ion tại m/z: 505,0 [M+Na]+ cho gợi ý một công thức phân tử là C32H50O3 có khối lượng tính toán là 482,4.
28
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Tín hiệu trên phổ 1H-NMR của hợp chất NCC03 cho tín hiệu 8 nhóm methyl gồm một nhóm acetoxyl tại δH 2,05; 6 tín hiệu singlet tại δH 0,57, 1,00, 0,89, 0,96, 0,88 và 1,67; 1 tín hiệu douplet tại δH 0,92 (d, J = 6,5 Hz); 3 tín hiệu proton của 3 olefin tại δH 5,46 (1H, br s, H-7), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-11), 5,40 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-24); 3 tín hiệu proton có độ dịch chuyển về trường
thấp tại δH 4,51 (1H, dd, J = 4,5 & 11,5 Hz, H-3), 4,00 (2H, s, H-26) đặc trưng cho các liên kết với oxy.
Các tín hiệu proton này hoàn toàn trùng khớp khi phân tích phổ
13C-NMR và DEPT. Hai phổ này cho tín hiệu của 32 carbon bao gồm có 01 tín hiệu acetyl tại δC 171,0 và 21,3; 7 tín hiệu nhóm methyl tại δC 15,7, 22,8, 28,1, 16,9, 25,6, 13,7 và 18,4; 3 cặp olefin tại δC 119,9, 142,8, 145,7, 116,6, 127,0, 134,4. Khi phân tích tương tác trực tiếp H→C trên phổ HSQC dễ dàng xác định vị trí C3 tại δC 80.9 và tín hiệu hydromethylen tại δC 69,1.
Bằng tương tác xa H → C trên phổ HMBC cho xác định các tương tác
sau:
+Các tương tác của các nhóm methyl trong cấu trúc của lanostan (xem
Bảng 3.) là:
H18 (δH 0,57) → C13 (δC 43,8), C14 (δC 50,4), C17 (δC 50,9)
H19 (δH 1,00) → C10 (δC 37,3), C9 (δC 145,7)
H21 (δH 0,92) → C17 (δC 50,9), C20 (δC 36,1), C21 (δC 18,4)
H28 (δH 0,89) → C3 (δC 80,9), C4 (δC 37,9), C29 (δC 16,9), C5 (δC 49,3)
H29 (δH 0,96) → C3 (δC 80,9), C4 (δC 37,9), C28 (δC 28,1), C5 (δC 49,3)
H30 (δH 0,88) → C14 (δC 50,4), C13 (δC 43,8), C8 (δC 142,8)
+ Tương tác H3 (δH 4,51) → COO (δC 171,0); cho xác định vị trí acetyl hóa
tại C3.
+ Tương tác H26 (δH 4,00) → C24 (δC 127,0), C25 (δC 134,4), C27 (δC 13,7) và tương tác H27 (δH 1,67) → C24 (δC 127,0), C25 (δC 134,4), C26 (δC 69,1) cho xác định vị trí hydroxy tại C26.
29
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Như vậy, bằng kết quả phân tích phổ 1D, 2D-NMR và phổ ESI-MS kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [31] có thể kết luận hợp chất NCC03 là: 3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol có cấu trúc như hình 3.5.
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03
(3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol)
3.2.2. Hợp chất NCC06
Hợp chất NCC06 phân lập được có dạng bột màu trắng, nóng chảy ở
nhiệt độ: 179–181oC.
Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC06 cho tín hiệu píc ion tại m/z: 441,3 [M+H]+ cho gợi ý một công thức phân tử là C30H48O2 có khối lượng tính toán là 440,3.
Trên phổ 1D-NMR (1H-, 13C-NMR, DEPT) của hợp chất NCC06 cho tín hiệu tương tự như hợp chất NCC03 chỉ khác là hợp chất này không có tín hiệu nhóm acetyl.
Cụ thể là: trên phổ 1H-NMR của hợp chất NCC06 cho tín hiệu 7 nhóm methyl gồm 6 tín hiệu singlet tại δH 0,57, 1,01, 0,88, 0,99, 0,88 và 1,67; 1 tín hiệu douplet tại δH 0,92 (d, J = 6,5 Hz); ba tín hiệu prtoton của 3 olefin tại δH 5,47 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,40 (1H, t, J = 7,0 Hz); ba tín hiệu proton có độ dịch chuyển về trường thấp tại δH 3,25 (1H, J = 4,5 & 11,5Hz), 4,00 (2H, s) đặc trưng cho các liên kết với oxy.
Các tín hiệu proton này hoàn toàn trùng khớp khi phân tích phổ
30
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
13C-NMR và DEPT. Hai phổ này cho tín hiệu của 30 carbon bao gồm 7 tín hiệu nhóm methyl tại δC 15,7, 22,8, 25,6, 28,1, 15,8, 13,7 và 18,4. Tín hiệu nhóm hydroxymethin tại δC 79,0 và tín hiệu 1 nhóm hydroxymethylen tại δC 69,1. Vị trí carbon khác được xác định dựa vào tín hiệu trên phổ thực nghiệm và gán các vị trị khi so sánh với tài liệu tham khảo [12] về hợp chất ganodermadiol. Như vậy, bằng kết quả phân tích các dữ liệu phổ trên có thể kết luận hợp chất NCC06
là lanostan 7,9(11),24-triene-3β,26-diol, còn gọi là ganodermadiol, có công thức như hình 3.6.
Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06
(lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol, ganodermadiol)
Bảng 3. Dữ liệu phổ của 2 hợp chất NCC03 và NCC06
NCC03 (500MHz, CDCl3)
STT
1H-NMR
HMBC
1H-NMR
13C- NMRa
13C- NMRa
13C- NMRa [31]
NCC06 (500MHz, CDCl3) 13C- NMRb [12]
1
35,4
35,7
35,8
35,4
2
24,6
24,3
24,6
28,2
H3→C28,
4,51 (1H, dd,
3,25(1H,
3
80,9
80,9
C29, C4,
79,0
79,0
4,5, 11,5)
4,5, 11,5Hz)
OAc
4
37,9
-
38,7
38,7
5
49,3
37,6 49,3
49,1
50,4
6
22,8
22,8
23,0
23,3
7
120,2
120,3
5,46 (1H, brs)
119,9
119,9
5,47 (1H, d, 6Hz)
8
142,8
142,8
142,7
142,7
9
145,7
145,7
146,0
145,9
10
37,3
-
37,4
37,9
37,2
11
116,6
116,6
116,3
116,3
5,32 (1H, d, 6,0)
5,32 (1H, d, 6,0Hz)
12
37,6
37,9
37,9
37,9
13
43,8
43,8
-
43,8
43,8
31
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
14
50,4
50,3
49,2
-
50,4
15
31,5
31,5
28,0
31,5
16
27,9
27,9
28,0
31,5
17
50,9
50,9
50,9
50,9
18
H18→C13
0,57 (3H, s)
15,7
0,57 (3H, s)
15,7
15,7
15,7
, C14, C17
19 20
1,00 (3H, s)
22,8 36,1
22,8 H19→C10 36,1
1,01(3H, s)
22,8 36,1
22,8 36,1
, C9
21
H21→
0,92 (3H, d,
0,92 (3H, d,
18,4
C17, C20,
18,4
18,4
18,4
6,5)
6,5)
C21
22
35,9
36,0
36,0
35,9
23
24,3
24,6
24,6
24,6
24
5,40 (1H, t,
5,40 (1H, t,
127,0
127,0 H24→C25
127,0
127,0
7,0Hz)
7,0Hz)
25
134,4
134,4
-
134,4
134,3
-
26
4,00 (2H, s)
69,1
4,00 (2H, s)
69,1
69,1
69,1
H27→C25
27
1,67 (3H, s)
13,7
1,67 (3H, s)
13,7
13,6
13,7
, C26, C24
28
0,89 (3H, s)
28,1
28,1
H28→C3
0,88 (3H, s)
25,6
25,6
29
0,96 (3H, s)
16,9
H29→C3
0,99 (3H, s)
28,1
27,8
16,9
30
H30→C14
0,88 (3H, s)
25,6
25,5
0,88 (3H, s)
15,8
15,8
, C13, C8
a): (125MHz, CDCl3); b): (50 MHz, CDCl3)
3.3. Bàn luận
3.3.1. Về chiết xuất
Đề tài sử dụng phương pháp chiết nóng dược liệu khô được nghiền nhỏ để thu được lượng cao tổng nhanh và lớn nhất. Ở nhiệt độ cao sự khuếch tán các chất trong dược liệu diễn ra nhanh và triệt để hơn. Hơn thế nữa dung môi MeOH dễ kiếm, rẻ tiền, được coi là dung môi đa năng hòa tan nhiều nhóm chất trong dược liệu.
32
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Đề tài sử dụng phương pháp lỏng - lỏng với dicloromethan vì: dung môi dicloromethan là dung môi có độ phân cực trung bình yếu có thể hòa tan tốt
nhóm chất steroid và triterpen. Hai nhóm chất này đều rất đặc trưng cho chi Ganoderma. Thực tế thí nghiệm cũng cho thấy lượng cao phân đoạn dicloromethan cũng cao nhất.
3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc hợp chất.
Bằng các phương pháp sắc ký cột (CC) pha thường và pha đảo, đề tài đã phân lập được 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn DCM của dịch chiết nấm Cổ cò. Đây là 2 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài G.flexipes.
Sử dụng các phương pháp thường quy trong nhận dạng cấu trúc: đặc tính lý hóa, các phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã xác định được cấu trúc của 2 hợp chất trên.
Hợp chất NCC03: từ kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh với tài liệu tham khảo [31] xác định được NCC03 có cấu trúc lanostan triterpen: 3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol.
Hợp chất NCC06: cũng thuộc nhóm cấu trúc lanostan triterpen: lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol, chính là ganodermadiol. Hợp chất này trước đó đã được phân lập từ G.lucidum, G.pfeifferi [34], G.curtisii [26].
Hoạt tính sinh học của hợp chất NCC06 (lanostan-7,9(11),24-trien-
3β,26-diol)
Năm 2003, Mothana R. A. A [34] phân lập được hợp chất NCC06 từ loài Ganoderma pfeifferi và thử hoạt tính kháng virut của các hợp chất lanostan triterpen. Bằng phương pháp nhuộm tế bào, các tác giả đã xác định được hợp chất ganodermadiol có hoạt tính bảo vệ tế bào Vero chống lại virut HSV type 1 với giá trị ED50 0,068 mmol/l và tế bào MDCK chống lại virut cúm A với giá trị lớn hơn 0,22 mmol/L. Trong một nghiên cứu khác của Jiao Y và cộng sự [26] đã phân lập được hợp chất này từ loài Ganoderma curtisii và xác định hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào tiểu thần kinh đệm gây bởi LPS với giá trị IC50 13,72 ± 0,61 µM (sử dụng quercetin làm chứng với IC50 là 15,13 ± 0,62 µM).
33
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Như vậy, việc phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất đã góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của loài G.flexipes và bổ sung thêm các dữ liệu về chi Ganoderma. Đồng thời kết quả này trở thành cơ sở khoa học đầu
34
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
tiên, định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học, tác dụng sinh học cũng như việc sử dụng của loài nấm dược liệu này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Đã phân lập được hai hợp chất tinh khiết là NCC03 (15 mg) và NCC06
(10 mg).
Xác định được hợp chất NCC03, NCC06 lần lượt là :3β-acetoxyl- lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol và
lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol (ganodermadiol).
2. Kiến nghị
Kết quả của đề tài mới chỉ dừng lại ở phân lập, xác định được 2 hợp chất
lanostan triterpen từ phân đoạn DCM của nấm Cổ cò.
Do đó, nhóm nghiên cứu kiến nghị tiếp tục thực hiện các nghiên cứu về: Thành phần hóa học bao gồm định tính, phân lập, định lượng. Từ đó xây
dựng tiêu chuẩn dược liệu, cao dược liệu của loài.
Tác dụng sinh học của loài, làm cơ sở cho việc sử dụng loài nấm quý này
35
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
trong lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài liệu Tiếng Việt
1. Vũ Thị Vân Anh (2014), Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xây dựng dấu vân tay hóa học nấm linh chi (Ganoderma lucidum (W. Curtis ex Fr.) P. Karst. (Ganodermataceae), luận văn thạc sĩ dược học, Học viện Quân y.
2. Nguyễn Minh Khang (2005), Khảo sát sinh trưởng nấm linh chi đen (amauroderma subresinosum, corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan - Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh.
3. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam, Tập I (Tái bản lần thứ 2),
NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ.
4. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam, tập II, NXB Khoa học tự
nhiên và Công nghệ, 205-206.
5. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.
6. Nguyễn Phương Đại Nguyên (2015), “Đa dạng thành phần loài của chi Ganoderma ở Vườn quốc gia Kon Ka Kinh tỉnh Gia Lai, Việt Nam”, Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 738-742.
7. Lê Xuân Thảm (2014), Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt
Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.
8. Nguyễn Văn Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học, tập I, NXB Y học.
9. Lê Lý Thùy Trâm, Võ Công Tuấn, Phạm Thi Kim Thảo (2016), Nghiên cứu nhân giống và cải thiện qui trình nuôi trồng nấm linh chi (Ganoderma lucidum) nhằm hỗ trợ chương trình phát triển nông thôn mới tại Đà Nẵng, Trung tâm thông tin học liệu và truyền thông, Đại học Đà Nẵng.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
10. Lê Thùy Trang (2014), Nghiên cứu thành phần hoạt chất polysaccharide, triterpenoid và hoạt tính sinh học của nấm lim Ganoderma sp. thiên nhiên thu hái tại tỉnh Quảng Bình, luận văn thạc sĩ ngành Hóa học, Trung tâm thông tin thư viện, Đại học khoa học Huế.
B. Tài liệu Tiếng Anh
11. Arisawa M, et al (1986), “Three new lanostanoids from Ganoderma
lucidum”, Journal of Natural Products, 49(4), 621-625.
12. Bao F, et al (2018), “New natural inhibitors of hexokinase 2 (HK2):
Steroids from Ganoderma sinense”, Fitoterapia, 125, 123-129.
13. Benzie IFF, Wachtel-Galor S (2011), Herbal Medicine: Biomolecular
and Clinical Aspects, NXB Taylor & Francis.
lucidum: a
study of
14. Chiu HF, et al (2017), “Triterpenoids and polysaccharide peptides- randomized, double-blind enriched Ganoderma its antioxidation and placebo-controlled crossover hepatoprotective efficacy in healthy volunteers”, Pharmaceutical
Biology, 55(1), 1041-1046.
15. Cör D, Knez Ž, & Knez Hrnčič M (2018) “Antitumour, Antimicrobial, Antioxidant and Antiacetylcholinesterase Effect of Ganoderma Lucidum Terpenoids and Polysaccharides: A Review”, Molecules, 23(3), 649.
16. Dai, Y.-C. (2012), “Polypore diversity in China with an annotated checklist
of Chinese polypores”, Mycoscience, 53(1), 49–80.
17. El-Mekkawy S. M. R, et al (1998), "AntiHIV-1 and Anti-HIV-1-Protease substances from Ganoderm lucidum", Phytochemistry, 49(6), 1651- 1657.
18. Ferreira, et al (2015), “Chemical features of Ganoderma polysaccharides activities”, antimicrobial antitumor and antioxidant,
with Phytochemistry, 114, 38-55.
19. Ge F.H, et al (2017), “Ganoderin A, a novel 9,11-secosterol from Ganoderma lucidum spores oil”, Journal of Asian Natural Products Research, 19(12), 1252-1257.
20. González A.G, et al (1999), "Lanostanoids triterpenes from Ganoderma
lucidum", Journal of Natural Products, 62(12), 1700-1701.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
21. Hajjaj H, et al (2005), "Effect of 26-Oxygenosterols from Ganoderma lucidum and their activity as cholesterol synthesis inhibitors", Applied and Environmental Microbiology, 71(7), 3653-3658.
22. Heleno SA, et al (2013), “Antimicrobial and demelanizing activity of Ganoderma lucidum extract, p-hydroxybenzoic and cinnamic acids and their synthetic acetylated glucuronide methyl esters”, Food and Chemical Toxicology, 58, 95-100.
23. Huang S, et al (2017), “Polysaccharides from Ganoderma lucidum Promote Cognitive Function and Neural Progenitor Proliferation in Mouse Model of Alzheimer’s Disease”, Stem Cell Reports, 8(1), 84-94. 24. Huie CW, et al (2004), “Chromatographic and electrophoretic methods for of pharmacologically components”, Journal active
Lingzhi Chromatography B, 812, 241-257.
25. Isaka M, et al (2013), “Lanostane triterpenes from cultures of the Basidiomycete Ganoderma orbiforme BCC 22324”, Phytochemistry, 87, 133-139.
26. Jiao Y, et al (2016), “Lanostane triterpenoids from Ganoderma curtisii and their NO production inhibitory activities of LPS-induced microglia”,
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 26(15), 3556-3561.
Low-Molecular-Weights Beta-1,3-Glucan from
27. Kao P.F, et al (2012), “Structural Characterization and Antioxidative Activity of the Residue of extracted Ganoderma lucidum fruiting bodies”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, 1-8.
isolated from Ganoderma lucidum alone and
28. Kim Y.S, et al (2000), “Antiherpetic activities of acidic protein bound in polysacchride combinations with interferons”, Journal of Ethnopharmacology,72, 451-458.
29. Ko H.H, et al (2008), “Antiinflammatory triterpenoids and steroids from Ganoderma lucidum and G. Tsugae”, Phytochemistry, 69(1), 30. Komoda Y, et al (1989), “Ganoderic acid and its derivatives as cholesterol synthesis inhibitors”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 37(2),
531-533.
31. Liefeng M, et al (2016), “Triterpenoid, preparation method and
application”, Patent application in China, CN 106220701A.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
32. Ma B, et al (2011), “Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum”, North American Journal of Medical Sciences, 495-498.
33. Matsuzaki H, et al (2013), “Antidepressant-like effects of a water- soluble extract from the culture medium of Ganoderma lucidum mycelia in rats”, BMC Complementary and Alternative Medicine, 13(1).
34. Mothana R. A, et al (2003), “Antiviral lanostanoid triterpenes from the
fungus Ganoderma pfeifferi”, Fitoterapia, 74(1-2), 177-180.
35. Nebojša V, et al (2016), “Ganoderma: insights into anticancer effects”,
European Jourmal of Cancer Prevention, 25(5), 462-471.
36. Ngai P.H.K, et al (2004), “A mushroom (Ganoderma capense) lectin with spectacular thermostability, potent mitogenic activity on splenocytes, and antiproliferative activity toward tumor cells”, Biochemical and
Biophysical Research Communications, 314, 988-993.
37. Pan K, et al (2013), “Optimization extraction of Ganoderma
its lucidum immunity and antioxidant activities”,
polysaccharides and International Journal of Biological Macromolecules, 55, 301-306. 38. Russell M, Paterson (2006), “Ganoderma - A therapeutic fungal
biofactory”, Phytochemistry, 67(18), 1985-2001.
39. Sato N, et al (2009), “Anti-human Immunodeficiency Virus-1 Protease Activity of New Lanostane-Type Triterpenoids from Ganoderma sinense”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 57(10), 1076–1080.
40. Shiao M.S (2003), "Natural products of the medicinal fungus Ganoderma lucidum: Occurrence, biological activities, and pharmacological functions", The Chemical Record, 3(3), 172-180.
41. Shimizu A, et al (1985), “Isolation of an inhibitor of platelet aggregation from a fungus, Ganoderma lucidum”, Chemical and Pharmaceutical
Bulletin, 33, 3012-3015.
42. Siwulski M (2012), “Biological study on carboxymethylated (1→3)-α-D- glucans from fruiting bodies of Ganoderma lucidum”, International Journal of Biological Macromolecules, 51, 1014-1023.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
43. Smania E.F.A, et al (2003), “Antifungal activity of sterols and triterpenes isolated from Ganoderma annulare”, Fitoterapia, 74(4), 375–377. 44. Sun L.X, et al (2010), “Promoting Effects of Ganoderma lucidum Polysaccharides on B16F10 Cells to Activate Lymphocytes”, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 108(3), 149-154.
45. Tang W, et al (2006), “Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lung cancer cells”, Life
Sciences, 80(3), 205-211.
46. Wang H, & Ng T.B (2006), “Ganodermin, an antifungal protein from fruiting bodies of the medicinal mushroom Ganoderma lucidum”,
Peptides, 27(1), 27-30.
47. Xia Q, et al (2014), “A Comprehensive Review of the Structure Elucidation and Biological Activity of Triterpenoids from Ganoderma spp”, Molecules, 19(11), 17478-17535.
al et Z,
lucidum Polysaccharides: (2011), “Ganoderma and Potential Anti-Tumor Activities”, The Immunomodulation
48. Xu American Journal of Chinese Medicine, 39, 15-27.
49. Zhang H, et al (2017), “Characterization of a bioactive polysaccharide from Ganoderma atrum: Re-elucidation of the fine structure”, Carbohydrate Polymers, 158, 58-67.
50. Zhang X.Q, et al (2011), “Triterpenoids with neurotrophic activity from
Ganoderma lucidum”, Natural Product Research, 25(17), 1607-1613. 51. Zheng M, et al (2018), “Steroids from Ganoderma sinense as new natural inhibitors of cancer-associated mutant IDH1”, Bioorganic Chemistry,
79, 89-97.
52. Zhou L.W, et al (2015), “Global diversity of the Ganoderma lucidum complex (Ganodermataceae, Polyporales) in ferred from morphology and multilocus phylogeny”, Phytochemistry, 114, 7-15.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
PHỤ LỤC
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
PHỤ LỤC 1. PHIẾU KIỂM ĐỊNH XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA NẤM CỔ CÒ
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
PHỤ LỤC 2. BỘ PHỔ CỦA HỢP CHẤT NCC03
Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
(3β-Acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol)
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC03
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ 1H-NMR của hợp chất NCC03
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ 13C-NMR của hợp chất NCC03
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ DEPT của hợp chất NCC03
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ HMBC của hợp chất NCC03
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ HSQC của hợp chất NCC03
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
PHỤ LỤC 3. BỘ DỮ LIỆU KHỐI PHỔ CỦA HỢP CHẤT NCC06
Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
(lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol, ganodermadiol)
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC06
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ 1H-NMR của hợp chất NCC06
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ 13C-NMR của hợp chất NCC06
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phổ DEPT của hợp chất NCC06
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
