ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
ĐẶNG THỊ THANH HÀ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU TẠO LACCASE TÁI TỔ HỢP
VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHỬ MÀU
MỘT SỐ THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP
Huế, năm 2022
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
ĐẶNG THỊ THANH HÀ
NGHIÊN CỨU TẠO LACCASE TÁI TỔ HỢP VÀ THỬ NGHIỆM
KHẢ NĂNG KHỬ MÀU MỘT SỐ THUỐC NHUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP
Ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 9420201
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học
1. PGS. TS. Phạm Thị Ngọc Lan
2. TS. Nguyễn Đức Huy
Huế, năm 2022
i
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... x
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .......................................................................... 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.................................................................................... 2
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 2
4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 4
1.1. LACCASE ............................................................................................................ 4
1.1.1. Giới thiệu chung về laccase .............................................................................. 4
1.1.2. Cấu tạo của laccase ........................................................................................... 4
1.1.3. Cơ chế xúc tác của laccase ................................................................................ 6
1.1.4. Đặc tính của laccase .......................................................................................... 8
1.1.5. Các nguồn thu nhận laccase ............................................................................ 11
1.1.6. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase ........ 14
1.1.7. Ứng dụng của laccase ...................................................................................... 15
1.2. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Pichia pastoris ......................................................... 18
1.2.1. Giới thiệu chung về hệ thống P. pastoris ........................................................ 18
1.2.2. Ưu, nhược điểm của P. pastoris so với các hệ thống biểu hiện khác ............. 19
1.2.3. Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp tương đồng sử dụng P. pastoris ...................... 20
1.3. THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ ............... 25
1.3.1. Thuốc nhuộm công nghiệp .............................................................................. 25
1.3.2. Các phương pháp xử lý thuốc nhuộm công nghiệp ........................................ 27
1.3.3. Xử lý màu thuốc nhuộm bằng laccase ............................................................ 28
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 33
ii
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 33
2.1.1. Đối tượng ........................................................................................................ 33
2.1.2. Thu thập mẫu ................................................................................................... 33
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 33
2.2.1. Phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính laccase ......................................... 33
2.2.2. Khảo sát sinh tổng hợp laccase từ các chủng phân lập ................................... 34
2.2.3. Xác định hoạt độ enzyme laccase ................................................................... 35
2.2.4. Phương pháp xác định protein ngoại bào ........................................................ 35
2.2.5. Xác định một số đặc tính của laccase thô từ chủng phân lập .......................... 36
2.2.6. Định danh phân tử chủng nấm phân lập ......................................................... 36
2.2.7. Phân lập các gen mã hóa laccase .................................................................... 38
2.2.8. Biểu hiện cFolac1 trong Pichia pastoris ........................................................ 40
2.2.9. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện laccase tái tổ hợp ............... 43
2.2.10. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp ......................................................................... 44
2.2.11. Điện di SDS – PAGE .................................................................................... 45
2.2.12. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ laccase tái tổ hợp ............... 45
2.2.13. Thử nghiệm khả năng khử màu thuốc nhuộm tổng hợp ............................... 46
2.2.14. Xử lý thống kê ............................................................................................... 47
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 48
3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH LACCASE ........... 48
3.1.1. Phân lập, làm thuần và giữ giống các chủng nấm mốc ................................... 48
3.1.2. Sàng lọc các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase ...................................... 49
3.1.3. Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của các chủng nấm
phân lập ..................................................................................................................... 50
3.1.4. Đánh giá khả năng sinh laccase của chủng nấm phân lập .............................. 51
3.1.5. Khảo sát một số đặc tính của laccase tự nhiên ................................................ 58
3.1.6. Định danh vi sinh vật ...................................................................................... 60
3.2. TẠO DÒNG CÁC GEN MÃ HÓA LACCASE TỪ F. oxysporum .................. 63
3.2.1. Khuếch đại các gen laccase từ cDNA của F. oxysporum ............................... 63
iii
3.2.2. Tạo dòng các gen mã hóa enzyme laccase trong vector pGEM®T-Easy ........ 64
3.2.3. Giải trình tự gen laccase .................................................................................. 71
3.3. BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA LACCASE TRONG Pichia pastoris .................. 77
3.3.1. Tạo dòng cFolac1 vào pGEM®T-Easy và biến nạp vào E. coli Top10 .......... 77
3.3.2. Tạo dòng vào vector biểu hiện pPICZαA ....................................................... 77
3.3.3. Tối ưu hóa sự biểu hiện laccase tái tổ hợp ...................................................... 80
3.3.4. Tinh sạch enzyme ............................................................................................ 86
3.3.5. Khảo sát đặc điểm enzyme tái tổ hợp ............................................................. 87
3.4. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP
CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP ................................................................................ 91
Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 95
4.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH LACCASE ........... 95
4.1.1. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 95
4.1.2. Khảo sát một số đặc tính của laccase tự nhiên ................................................ 96
4.2. PHÂN LẬP CÁC GEN MÃ HÓA LACCASE ................................................. 99
4.3. BIỂU HIỆN GEN FOLAC1 MÃ HÓA EMZYME TRONG NẤM MEN Pichia
pastoris .................................................................................................................... 100
4.3.1. Biểu hiện gen Folac1 .................................................................................... 100
4.3.2. Khảo sát đặc tính enzyme tái tổ hợp ............................................................. 102
4.3.3. Tối ưu hóa sự biểu hiện laccase tái tổ hợp .................................................... 103
4.4. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC NHUỘM CÔNG NGHIỆP
CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP .............................................................................. 106
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 109
1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 109
2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 109
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ......................... 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 111
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 126
