Hội chứng não cấp do vi rút Banna: Nghiên cứu dịch tễ học tại một số địa phương ở Việt Nam (Luận án Tiến sỹ Y học)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

-----------------*-------------------

HOÀNG MINH ĐỨC

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC HỘI CHỨNG NÃO CẤP NGHI NGỜ DO VI RÚT BANNA TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2014

ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng não cấp (HCNC) do rất nhiều nguyên nhân khác nhau trong

đó vi rút là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây HCNC bao gồm các

nhóm vi rút lây truyền trực tiếp như vi rút Nipah, vi rút đường ruột..., nhóm vi

rút do côn trùng truyền như vi rút viêm não Nhật Bản (VNNB), vi rút viêm

não Nga xuân hạ, vi rút viêm não ngựa miền Đông... và nhóm vi rút tiềm ẩn là

một số type vi rút Herpes simplex [6],[12],[17] [29],[66],[94]. HCNC do vi

rút không có thuốc điều trị đặc hiệu (trừ vi rút Herpes simplex), nên bệnh

thường có tỷ lệ tử vong cao và di chứng thần kinh nặng nề. Biện pháp phòng

chống có hiệu quả hiện nay là sử dụng vắc xin hoặc cắt đường truyền dịch tễ

như diệt véc tơ, loại trừ yếu tố tiếp xúc trực tiếp với vi rút

[3],[31],[43],[49],[57],[65],[89],[97]. Hiện nay đã xác định được khoảng 100

loại vi rút khác nhau gây HCNC, trong số này vi rút Banna là tác nhân vi rút

mới phát hiện được cho là nguyên nhân gây HCNC ở một số nước châu Á

như Việt Nam, Trung Quốc [26],[27],[29],[32],[33],[72],[74],[ 99].

Vi rút Banna thuộc chi Seadornavirus, họ Reoviridae, là vi rút có vật

liệu di truyền là ARN sợi kép gồm có 12 phân đoạn. Chủng vi rút Banna đầu

tiên phân lập được từ dịch não tủy của bệnh nhân có HCNC và từ máu bệnh

nhân sốt không rõ nguyên nhân viêm não ở t nh unnan, Trung Quốc sau đó

c ng phân lập được ở các vùng khác nhau từ bệnh nhân, từ muỗi ở Trung

Quốc, Indonesia và Việt Nam... [19],[44],[47],[50],[83].

Việt Nam, chủng vi rút đầu tiên phân lập được từ bệnh nhân ở miền

Bắc (t nh Thanh Hóa) năm 2003 và Tây Nguyên (t nh Gia Lai) năm 2005.

Nghiên cứu hồi cứu xác định vi rút Banna đã được phân lập từ muỗi Culex tại

hai t nh Hà Tây (nay thuộc Hà Nội) và t nh Quảng B nh năm 2002

[19],[21],[83]. Việc ghi nhận vi rút Banna được phát hiện trên muỗi Culex

đồng thời c ng là loại véc tơ truyền bệnh viêm não Nhật Bản ở Việt Nam cho

thấy việc nghiên cứu sâu về một số đặc đi m lâm sàng, dịch tễ sinh học phân

tử, huyết thanh học và véc tơ truyền bệnh của vi rút Banna là rất cần thiết. Đ

góp phần vào việc giám sát, chẩn đoán, điều trị và dự phòng HCNC nghi ngờ

do vi rút Banna gây ra, nghiên cứu đề tài “Một số đặc điểm dịch tễ học hội

chứng não cấp nghi ngờ do vi rút Banna tại một số địa phương ở Việt

Nam” được thực hiện với ba mục tiêu cụ th như sau:

1. Mô tả một số đặc đi m dịch tễ học, lâm sàng hội chứng não cấp nghi

ngờ do vi rút Banna ở một số địa phương của Việt Nam, 2002 – 2012.

2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút Banna trong quần th muỗi thu thập ở

một số địa phương Việt Nam.

3. Xác định một số đặc đi m sinh học phân tử của vi rút Banna phân

lập được ở Việt Nam.

BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -----------------*-------------------

HOÀNG MINH ĐỨC

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC HỘI CHỨNG NÃO CẤP NGHI NGỜ DO VI RÚT BANNA TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành Mã số

: DỊCH TỄ HỌC : 62.72.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. PHAN THỊ NGÀ

2. GS. TS. VŨ SINH NAM

HÀ NỘI – 2014

iii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Lãnh đạo Cục Y tế dự phòng, Lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, và các thầy cô giáo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện Luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phan Thị Ngà và GS.TS. Vũ Sinh Nam những thầy cô đã trực tiếp hƣớng dẫn, động viên khích lệ, tận tình giúp đỡ và định hƣớng cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện Luận án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TS. Phạm Ngọc Đính, Phó Tổng biên tập Tạp chí Y học dự phòng đã đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành Luận án.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới ThS. Bùi Minh Trang, ThS. Đặng Thị Thu Thảo, cử nhân Nguyễn Thành Luân Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Đào tạo và Quản lý Khoa học; ThS. Đỗ Phƣơng Loan, PGS. TS. Nguyễn Thị Hiền Thanh, Khoa vi rút; Cử nhân Nguyễn Thị Yên phòng thí nghiệm Côn trùng, Khoa Côn trùng và Động vật Y học; ThS. Đỗ Thiện Hải, Phó chủ nhiệm Khoa Truyền nhiễm bệnh viện Nhi Trung ƣơng; ThS. Nguyễn Thị Tuyết, Phó chủ nhiệm Khoa Truyền nhiễm bệnh viện Đa Khoa tỉnh Bắc Giang đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm cũng nhƣ hoàn thành việc điều tra, thu thập số liệu của nghiên cứu.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành sự hợp tác và giúp đỡ của Giáo sƣ Kouichi Morita, Khoa Vi rút, Viện Y học Nhiệt đới Trƣờng đại học Nagasaki Nhật Bản trong nghiên cứu của đề tài.

Tôi vô cùng biết ơn sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của gia đình, bạn bè và các bạn đồng nghiệp trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản Luận án này.

Hà Nội, ngày 07 tháng 3 năm 2014 Tác giả luận án Hoàng Minh Đức

LỜI CAM ĐOAN

Đƣợc sự đồng ý của tác giả cho phép sử dụng số liệu của bài báo, của

đề tài nghiên vào nội dung luận án này. Tôi xin cam đoan đây là công trình

nghiên cứu của tôi, do chính tôi thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của các thầy cô

và Chủ nghiệm đề tài. Kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chƣa từng

công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của tôi.

Hà Nội, ngày 07 tháng 3 năm 2014

Tác giả luận án

Hoàng Minh Đức

MỤC LỤC

Nội dung

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

iii

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

viii

Danh mục hình, bảng biểu

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƢƠNG I – TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử hội chứng não cấp

1.1.1 Trên thế giới

1.1.2 Tại Việt Nam

1.2 Dịch tễ học hội chứng não cấp do vi rút Banna

1.2.1 Ổ chứa vi rút

1.2.2 Véc tơ truyền vi rút Banna

1.2.3 Khối cảm thụ

1.3 Đặc điểm hình thái, cấu trúc vi rút Banna

1.3.1 Đặc điểm hình thái

1.3.2 Đặc điểm cấu trúc của vi rút Banna

1.3.3 Cấu trúc genome của vi rút Banna

1.3.4 Cấu trúc và chức năng các protein của vi rút Banna

1.3.5 Phân loại và nguồn gốc vi rút Banna

1.3.6 Sự sao chép của vi rút

1.4 Đặc điểm hội chứng não cấp ở ngƣời do vi rút Banna

1.4.1 Sinh bệnh học

1.4.2 Đặc điểm lâm sàng

Nội dung

Trang

1.4.3 Đáp ứng miễn dịch

1.4.4 Điều trị và dự phòng bệnh

1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm

1.5.1 Phƣơng pháp phát hiện nhanh vi rút

1.5.2 Phƣơng pháp phân lập vi rút

1.5.3 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học

CHƢƠNG II - ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2.

Đối tƣợng nghiên cứu

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

2.3.2. Điều tra xác định các đặc điểm dịch tễ học bệnh nhân HCNC

2.4 Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm trong phòng thí nghiệm

2.4.1 Phƣơng pháp xét nghiệm kháng thể bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme gián tiếp phát hiện IgM kháng vi rút Banna – IgM INDIRECT ELISA

2.4.2 Phƣơng pháp phân lập vi rút

2.5 Thống kê toán học và một số phần mềm tin sinh học sử dụng trong phân tích về đặc điểm phân tử của các chủng vi rút Banna

2.5.1 Thống kê toán học

2.5.2 Sử dụng các phần mềm tin sinh học

2.6 Chấp thuận về đạo đức trong nghiên cứu y sinh

2.7 Hạn chế khi thiết kế nghiên cứu

CHƢƠNG III – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng của bệnh nhân hội chứng não cấp nghi ngờ do vi rút Banna ở một số địa phƣơng củaViệt Nam, 2002-2012

vii

Nội dung

Trang

3.1.1 Mô tả tỷ lệ số mắc của bệnh nhân hội chứng não cấp do vi rút Banna

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân hội chứng não cấp do vi rút Banna

3.2 Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút Banna trong quần thể muỗi thu thập ở một số địa phƣơng ở Việt Nam

3.2.1 Kết quả thu thập muỗi trong các năm 2001-2011

3.2.2 Kết quả phân lập vi rút Banna từ các mẫu muỗi thu thập

3.3 Một số đặc điểm sinh học phân tử của vi rút Banna phân lập đƣợc ở Việt Nam

3.3.1 Phân bố vi rút Banna ở Việt Nam

3.3.2 Đặc điểm dịch tễ học vi rút Banna ở Việt Nam

3.3.3 Kết quả giải trình tự nucleotide của vùng gen mã hóa số 12

3.3.4 Đặc điểm các acid amin thay thế của vùng gen mã hóa số 12

CHƢƠNG IV – BÀN LUẬN

4.1 Mô tả một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng hội chứng não cấp nghi ngờ do vi rút Banna ở một số địa phƣơng của Việt Nam, 2002 - 2012

4.2 Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút Banna trong quần thể muỗi thu thập ở một số địa phƣơng ở Việt Nam

102

4.3 Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử của vi rút Banna phân lập đƣợc ở Việt Nam

KẾT LUẬN

108

KIẾN NGHỊ

111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

112

TÀI LIỆU THAM KHẢO

114

PHỤ LỤC

129

viii

Banna vi rút Banna vi rút Trung Quốc Banna vi rút Indonesia Colorado tick fever virus Dengue virus (Vi rút sốt xuất huyết) Double-stranded RNA Eastern equine encephalitis virus (Viêm não ngựa miền Đông) Eyach virus Ngân hàng gen

Dữ liệu ngân hàng gen

BAV BAV-Ch BAV-In CTFV DENV dsRNA EEE EYAV GenBank GenBank Database HCNC

HIV

KDV LAC

MAC-ELISA

Motif NCR NLRV POW

RT-PCR

RRSV RNA SLE SDS-PAGE VNNB VIB VP

WEE

Hội chứng não cấp Human Immuno deficiencyVirus (Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời) Kadipiro virus La Crosse encephalitis (Viêm não La Crosse) IgM antibody capture – enzyme linked immunosorbent assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme phát hiện kháng thể IgM) Một đoạn trình tự giống nhau, lặp lại Non-coding regions (Vùng không mã hóa) Nilaparvata lugens reovirus Powassan (Viêm não Powassan) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi khuếch đại gen phiên mã ngƣợc) Rice ragged stunt vi rút Ribonucleic acid Saint Louis encephalitis (Viêm não St. Louis) Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Viêm não Nhật Bản Virus Inclusion Body (Thể vùi của vi rút) Viral Protein (Protein của vi rút) Western equine encephalomyelitis virus (Viêm não ngựa miền Tây)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC ẢNH, HÌNH VÀ BẢNG

DANH MỤC ẢNH

Ảnh Tên ảnh Trang

1.1 Tế bào bình thƣờng và tế bào gây nhiễm vi rút Banna 27

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1 Phân bổ địa lý của vi rút Banna ở Trung Quốc 5

1.2 Hình thái nhân và vi rút Banna của Chủng BAV-Ch 13

1.3 Vi rút Banna có ký hiệu 02VN9b đƣợc phân lập từ Cx 14

vishnui ở Hà Tây

1.4 Vi rút Banna có ký hiệu 02VN18b đƣợc phân lập từ Cx 15

vishnui ở Quảng Bình

1.5 Sơ đồ tiến hóa của họ Reoviridae 21

1.6 Sơ đồ quá trình sao chép của vi rút Banna 22

2.1 Quy trình xây dựng cây di truyền phả hệ các chủng vi rút 51

Banna

3.1 55

Sự phân bố theo tháng các trƣờng hợp hội chứng não cấp xác định do vi rút Banna, 2002-2012

3.2 57

Tỷ lệ số mắc hội chứng não cấp do vi rút Banna phân bổ theo giới

3.3 Phân bố các chủng vi rút Banna phân lập ở Việt Nam 2002-2007 76

3.4 Kết quả khuếch đại một phần vùng gen số 12 của các chủng 78

vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân, muỗi, lợn

3.5 Cây di truyền phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các chủng vi rút Banna của Việt Nam với một số chủng vi rút Banna từ một số nƣớc châu Á dựa trên trình tự nucleotide toàn bộ vùng gen mã hóa phân đoạn số 12

4.1 90

Tình hình hội chứng não cấp nghi ngờ do vi rút và sự thay đổi về tỷ lệ xác định VNNB tại Bệnh viện Nhi Trung ƣơng, 1995-2011

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Độ dài của các phân đoạn dsRNA 1-12, protein đƣợc mã hóa

17 và 5’NCR và 3’NCR của BAV

2.1 Danh sách trình tự nucleotide toàn bộ vùng gen mã hóa của phân đoạn số 12 của các chủng vi rút Banna sử dụng trong nghiên cứu

3.1 Kết quả loại trừ căn nguyên vi rút VNNB và vi rút ECHO 30 trong số các trƣờng hợp HCNC nghi ngờ do vi rút, 2002 – 2012

3.2 Kết quả xác định IgM kháng vi rút Banna trong dịch não tủy 54

bênh nhân hội chứng não cấp, 2002-2012

3.3 56

Tỷ lệ xác định theo tuổi hội chứng não cấp do vi rút Banna, 2002- 2012

3.4 57

Tỷ lệ số mắc hội chứng não cấp do vi rút Banna theo nhóm tuổi, 2002-2012

3.5 58

Thông tin chung về bệnh nhân hội chứng não cấp do vi rút Banna

3.6 Một số thông tin chung của hội chứng não cấp do vi rút Banna, khi so sánh với hội chứng não cấp do ECHO30 và VNNB ở trẻ em tại một số bệnh viện

3.7 Một số dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân khi nhập 60

viện

3.8 Các dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng sau 7 ngày điều trị bệnh nhân nhiễm vi rút Banna so sánh với nhiễm ECHO30 và VNNB

3.9 63

Số ngày điều trị hội chứng não cấp do vi rút trung bình tại bệnh viện

3.10 Kết quả sau điều trị nhiễm vi rút Banna 64

3.11 Kết quả thu thâp muỗi ở 5 tỉnh thành miền Bắc, 2001-2011 64

3.12 Kết quả thu thập muỗi ở Quảng Bình, miền Trung, 2001-2011 66

Bảng Tên bảng Trang

3.13 Kết quả thu thập muỗi ở 4 tỉnh Tây Nguyên, 2004-2011 66

3.14 Kết quả thu thập muỗi ở hai tỉnh miền Nam, 2005-2007 67

3.15 Các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở miền Bắc 68

3.16 Các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở miền Trung 69

3.17 Các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở Tây Nguyên 70

3.18 Các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở miền Nam 70

3.19 Tỷ lệ phân lập đƣợc vi rút Banna từ muỗi 71

3.20 Thông tin các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở miền Bắc 72

3.21 Thông tin các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở miền Trung 73

3.22 Thông tin các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở Tây Nguyên 73

3.23 Thông tin các chủng vi rút Banna phân lập đƣợc ở miền Nam 74

3.24 Thông tin về 5 chủng vi rút Banna phân lập từ ngƣời và muỗi ở Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu phân tích vùng gen mã hóa số 12

3.25 So sánh sự khác nhau về nucleotide vùng gen mã hóa số 12 của một số chủng vi rút Banna phân lập từ muỗi, lợn ở Việt Nam, 2002-2005

3.26 Thông tin về số đăng ký trình tự nucletide vùng gen số 12 của 80

5 chủng vi rút Banna trong ngân hàng gen quốc tế

3.27 Trình tự nucleotide vùng gen mã hóa phân đoạn số 12 vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân ở Việt Nam với chủng vi rút Banna phân lập từ Trung Quốc

3.28 Phân tích đặc điểm các axit amin thay thế của vùng gen mã hóa (ORF) số 12 của vi rút Banna ở Việt Nam có ký hiệu 03VN99 so với chủng vi rút Banna ở Trung Quốc có mã số ngân hàng gen AF052030

Chƣơng I

TỔNG QUAN

1.1. LỊCH SỬ HỘI CHỨNG NÃO CẤP

1.1.1. Trên thế giới

Trên thế giới, HCNC có tỷ lệ mắc cao, t -

ỷ ệ ắ , ỷ ệ ế

ế Còn , á - ỷ ệ

mắc HCNC ,0/100.000 dân. Tuy nhiên, á á ỷ ệ

á ỷ ệ mắc HCNC ,

1999-20 ỷ ệ ,2/100.000 dân ế nhóm

ổ - á ờng hợp ắ

HCNC ổ - ổ ớ ỷ ệ , ệ

- ớ ỷ ệ ,77/1 ,

ế ắ ỷ ệ ớ ổ Trong các

n -2002, á ỷ ệ mắc HCNC là 1,9/100.000 dân á ớ

ệ ới và c n nhiệ ới Q , B , H , á

, tỷ lệ mắc HCNC nghi ngờ ú ũ t v ề y

tế c , ặc biệt nhữ ớ á ển [42],[43],[46],[57],[65].

HCNC do nhiều nguyên nhân khác nhau và tác nhân gây bệnh ch yếu

là do vi rút nhiều ơ s ới các tác nhân là vi khuẩn hoặc ký sinh trùng. T i

vùng nông thôn châu Á, những nguyên nhân chính c a HCNC bao gồm bệnh

lao, bệnh s ơ , s t rét thể ã ú s t xu t huyết (DENV),

vi rút VNNB, vi rút Herpes Simplex, vi rút s i, m t s lo ú ờng ru t

và HIV... Mặc dù v y, nhiều qu ô Á ô á á ô

b về các nguyên nhân gây HCNC nghi ngờ do vi rút vì HC C ú ợc

coi là m t bệnh ợ ú ức.

HCNC do vi rút ô ờ ợc lây truyền t ng v t sang

ời, vi rút ờng tồn t i và phân b t i nhiều khu v c trên thế giới vi-rút

Arbo tồn t i trong t nhiên qua s truyền nhiễm sinh học giữa các v t ch

nh y c m b ng v ú á ỗi, ve và các côn trùng khác T i

Hoa K , có b á ú ã ợc phát hiện là viêm

não ng a miề ô (EEE) ề é ơ ỗi, tá ợc xác

nh l u nhữ a thế kỷ XX. G , ch bệnh do tác nhân

này gây ra l i xu t hiện t i vùng trung tâm dọc bờ biể ô V ã

ng a miền T (WEE) ợc phân l p l i California, Hoa

K t não c a loài ng a b bệnh và hiện v n còn là m t nguyên nhân quan

trọng c a bệnh viêm não miền Bắc Hoa K . Viêm não St. Louis (SLE), m t

trong những bệnh lây truyền qua muỗi phổ biến nh t Hoa K . Viêm não La

Crosse (LAC) phát hiệ i La Crosse, Wisconsin, Hoa K và h u

hế á ờng hợp mắ ợc ghi nh n những bang phía Tây (Minnesota,

Wisconsin, Iowa, Illinois, Indiana và Ohio)[42].

i với vi rút VNNB gây HCNC, ã ều bằng chứng rõ ràng c về

mặt d ch tễ học, vi rút học và lâm sàng. Bệ V B ợ á nh l u

, d ch viêm não hè-thu với các triệu chứng gợi ý c a

viêm não c ợc ghi nh n t i Nh t B , t v d ã y ra

Nh t B n vớ ờng hợp mắc và tỷ lệ tử vong lên tới 60%, tác nhân

gây bệnh ú V B , ến ú V B ới

ợc phân l p t ã ời c a m ờng hợp tử vong Tokyo, Nh t B n

và ch ú ũ ợc sử d ng làm ch ng m u về vi rút học và huyết

thanh họ , u tiên phát hiện vi rút VNNB muỗi Culex

tritaeniorhynchus và Culex ợ á nh é ơ o trong việc lây

truyền bệnh t i Châu Á [42],[62],[91].

HCNC do vi rút Herpes gây ng nặng nề tới hệ th n kinh trung

ơ , tác nhân gây bệ ờng là vi rút Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1);

H ế giớ ớc tính có kho ờng hợp,

yế ợc ghi nh n bắc châu M và nhiề ớc châu Âu [42],[43],[46].

Viêm não/màng não do m t s lo i vi rút ờng ru ũ ã ợc

khẳ nh; Theo th ng kê c a Tổ chức Y tế Thế giới mỗ ệu

tr em b nhiễm ú ờng ru t. Mặ ú ờng ru t là nguyên nhân

phổ biến c a viêm não/màng não mắc ph i trong c ồ ,

màng não do ú ờng ru t ờng thể bệnh nhẹ [32],[40],[46]. ợc

l i, viêm não thứ phát sau s i có biểu hiệ s ờng r t nặng nề,

s ca bệ ợc ghi nh n [1],[81],[94].

Vi rút Banna ợc phát hiệ u tiên t i Trung Qu d ch

não t y c a bệnh nhân HCNC và t máu c a bệnh nhân s t không rõ nguyên

nhân. Tiế , á ú ơ ú B ợc phân l p

t huyết thanh c a bệnh nhân s t không rõ nguyên nhân Mengding thu c

tỉnh Vân Nam (1992) và tỉ C ơ (X j ) ền Bắc Trung Qu c, tỷ

lệ phân l p vi rút Banna t bệnh nhân s t không rõ nguyên nhân là trên 8%

(8/98) [37],[71],[72]. Nghiên cứu t i Indonesia ã á nh các m u muỗi thu

th p trong nhữ , ũ á ệ ợc m t s ch ng vi rút

Coltivirus nhóm B, các ch ng vi rút này ợ á nh ơ vi rút

Hình 1.1: Phân bố địa lý của vi rút Banna ở Trung Quốc [72]

Banna ợc phân l p Trung Qu c [35],[37],[38].

1.1.2. Tại Việt Nam

V ệ ệ á sá HCNC nghi ngờ ú ơ s ể chẩn

á á sá ệ VNNB, á sá ề th y trong các

kho ng thời gian khác nhau, tỷ lệ mắc VNNB có s ổi. C thể, ỷ ệ

ắ VNNB ,8-4,8/100.000 dân (1991-1995); 2,57-4,1

( - ) , -2,82/100.000 dân (2001-2004). ớc nhữ

1997, h , ế ờng hợp mắc HCNC,

trong nhữ ng 1.000 – 1.200 tr ờng hợp mắc HCNC

ợc ghi nh n. Tác nhân vi rút gây bệnh ch yếu mớ á ợc vi rút

V B ú ờng ru t [13], [23]. Bệ V B ợc ghi nh n l u

i Việt Nam theo các công b c a hai nhà nghiên cứu

ời Pháp là Puyuelo H. và Prévot M. , ch viêm não mùa hè

ợ á nh là do vi rút VNNB bằng chẩ á ết thanh học t i Viện Vi trùng học Việt Nam. 2, G ỗ Quang Hà ã ợc vi rút

VNNB t i miền Bắc Việt Nam [17]. , o lây truyền

bệnh c a muỗi Culex tritaeniorhynchus t i Việ ợ á nh. T

ế , á ều tra các loài muỗi t i 14 ổ d ch VNNB

miền Bắc c a tác gi Vũ ng s , ã á nh muỗi Culex

tritaeniorhynchus chiếm tỷ lệ cao nh t (23%) so với tổng s 13 loài muỗi bắt

ợc. Bên c , ỗi Culex vishnui ũ ợ á nh là m t lo i

é ơ chính lây truyền VNNB ớ D ều kiện thời tiết khí h u nóng

ẩ , ều, c n nhiệ ới và nhiệ ớ , ô ờng r t thu n lợi cho s phát triển c a hai loài muỗi là Culex tritaeniorhynchus và Culex vishnui.

Trong nghiên cứu phân l p vi rút Arbo t muỗi bắt t i th a miền

Bắc và miền Trung Việt Nam, m t s ch ng vi rút Arbo mớ ũ ợc ghi

nh n [15], [39], [83]. Còn t d ch não t y bệ HC C ã

phân l ợc vi rút Arbo mớ ặ ú , ú ặ ểm:

Hình c u, có vỏ, ớc kho ng 50 nm – 60 nm, v t liệu di truyề ợc

á nh là ARN. Vi rút này r t thích ứng trên tế bào muỗ C

v t liệu di truyền c a vi rút không gi ng trình t c a các ch ú ã ô

b trong ngân hàng gen qu c tế, nó là m t lo i vi rút hoàn toàn mới l u

tiên phát hiện Việt Nam có tên khoa học là Nidovirus, cùng với ch ng vi rút

Cavally phân l ợc Bờ biể , ứ ợc công nh n

và xếp thành m t họ vi rút mới, họ Mesoniviridae [13],[70],[86]. Những

nghiên cứu phân l p vi rút tiếp theo t d ch não t y c a bệnh nhân, t muỗi

m t s tỉnh thành miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên trong các

– ũ ã ợc m t s ch ng vi rút Arbo mới. Trong s này có

m t s ch ợ á ú B , ặ ểm về á ơ

t ú B ớ i Trung Qu c [19],[21],[83].

1.2. DỊCH TỄ HỌC HỘI CHỨNG NÃO CẤP DO VI RÚT BANNA

1.2.1. Ổ chứa vi rút

s ứ V ệ ế ớ ú Banna ồ

ỗ , ằ ứ õ ề s ú B

ô ( ợ ) ằ ế ú . Ngoài ra, ú B ể ồ

s s ữ ề ệ

s á á ú s á á [21],[71],[72].

1.2.2. Véc tơ truyền vi rút Banna

ớ ú B , é ơ ề vi rút ỗ ã ợ ẳ

s ớ Á ằ ế ợ ú s loài ỗ

Cx. tritaeniorhynchus Cx vishnui, Cx fuscocephalus, An.vagus, Ae. albopictus

Ae. dorsalis [38], [72], [83].

1.2.2.1. Đặc điểm phân bố của các loài muỗi truyền vi rút Banna

a) Muỗi Culex (Cx)

ỗ Culex ữ ỗ ổ ế á ệ ớ

ệ ớ , ã ợ , m ỗ Cx.

tritaeniorhynchus ợ ế é ơ ế ệ

VNNB ồ ờ ũ ợ é ơ ề ú B t

s ú á , goài Cx. tritaeniorhynchus ợ là

é ơ ề ệ ổ ế , á Cx. gelidus và Cx. vishnui ũ

ợ á là ữ é ơ ề ệ ờ [14], [42],

[69], [90].

b) Muỗi Anopheles

ỗ Anopheles ắ ế ớ ớ ,

V ệ ỗ Anopheles Anopheles là

é ơ ề ệ s é s Anopheles á ồ ờ ề

ệ ỉ á ệ ú , ỗ ế á

ồ ú , , ể [58], [72].

c) Muỗi Armigeres

Các loài Armigeres ắ á ô Á C

Úc, oài Armigeres subalbatus ế ô Á (

ồ , H , B ) Á ô Á Armigeres

subalbatus ợ ế ớ é ơ ề s ệ s é , V B

ỉ [82] C ế ô ợ i rút Banna

ỗ

1.2.2.2. Vòng đời của muỗi

a) Vòng đời của muỗi Culex

ỗ á : ứ , ( ),

ỗ á ỗ - ứ ế è ổ

ặ ớ ỗ á - ứ s

ờ ỗ ế , ề ệ

ợ , s - , ỗ

s -2 ngày. b) Vòng đời của muỗi Anophenles

G á ỗ Culex, ỗ á Anopheles :

ứ , ( ), ( ), ỗ c) Vòng đời của muỗi Armigeres

ỗ : T ứ , ( ),

Còn l ế

ề ệ ợ , ứ s

, ớ ỗ , ớ ỗ á [82].

1.2.2.3. Đặc điểm sinh thái

a) Đặc điểm sinh thái của muỗi Culex

M ỗ Culex s ổ ế ắ ơ ề á

ệ ớ ệ ớ , p ỗ

ú ũ á , ế á

trung bình là 1-3km. ỗ Culex ờ - ờ s

ồ ờ sá ỗ Culex ể

s ợ ề á ớ ệ , còn h ứ ô ũ

[14], [30], [69].

b) Đặc điểm sinh thái của muỗi Anopheles

Anopheles á ề , ể ờ ế ờ, ề ô ể sớ ơ , ỗ ờ , ờ , ,

ơ ắ á , ỗ ô á s ớ s Ổ ọ

Anopheles ờ s ớ , , ờ s có cỏ

ọ , á ắ ế ế , á á ơ á

ớ ặ á ớ , ể ứ ớ á

ể ỗ Anopheles ờ c) Đặc điểm sinh thái của muỗi Armigeres

ỗ Armigeres ờ , ơ ú

ỗ ờ ổ ọ ề ơ

, ỷ ệ ỗ ợ ề ơ

ỗ á ờ ứ á ổ ớ ọ , ặ ệ á ổ ớ

ữ ơ ớ ệ s , , , ,

[ ]

1.2.2.4. Vai trò truyền bệnh

a) Vai trò truyền bệnh của muỗi Culex

ú á ễ ú , ỗ ơ ú ẩ á

V ú ơ ể ỗ ( ) và ỗ có

ề ệ . [47], [48], [72], [90].

ỗ Culex ứ ú B s hút máu ú ợ ,

vi rú ề ô ế ớ ọ ú á V ú

ú - ồ ề ệ , chu

trình ề ệ ệ ỗ ú á ú ú

ề s ờ ỗ ú á ờ [47].

b) Vai trò truyền bệnh của muỗi Anopheles và Armigeres

ỗ Anopheles ũ ợ á ề

ú B s ờ ỗ Anopheles và Armigeres ứ

ú B s khi hút máu ú ợ , ú ễ ợ ô

ế ớ ọ ú á ỗ ứ ú á ờ s ề

ú ế ớ ọ ú , vi rút

Banna ã ợ ỗ ồ : Cx. tritaeniorhynchus, Cx.

pipiens, Cx. annulus, Cx. pseudovishnui, Cx. modestus, An. sinensis, Ae.

vagus, Ae. albopictus, Ae. vexans và Ae. dorsalis [82].

1.2.2.5. Các biện pháp kiểm soát véc tơ

Có thể chia các biện pháp kiể s á é ơ á s :

a) Hạn chế sự phát triển của véc tơ

ể ế s á ể é ơ ề ệ , ể

á ể ú , ỗ á ứ ,

trù , ỗ , ể ế ỗ ứ ,

ể s á ô ờ , ỏ ơ ú ẩ ứ ỗ , ớ

ỗ ớ á ệ ể s á ô ờ ũ á

nhau ỗ Cx gelidus ớ ẩ ỏ ữ ứ

ớ ẩ , ô ể ớ ọ , ớ ớ s

á ứ ớ s dùng cho ờ , á

, ô ể á ỡ, ỏ ọ ứ ớ , ũ

ớ ọ [6], [16], [72], [90].

ử á ệ á s ọ : D á s ắ

ồ , ý s , ể á ợ ô ễ ô ờ ,

cá ệ á s ọ ỉ ệ

ỗ ô ờ s ọ ú ệ

b) Hạn chế sự tiếp xúc của véc tơ với nguồn bệnh

Ổ ứ ú B ã á ợ ợ , , D , ữ

ệ s ồ , á ể ớ ọ ồ ợ , , ờ

ệ s , ề ệ á sá ế ồ á ệ

ẩ ế s ú ỗ [21], [72], [90], [93], [99].

c) Hạn chế sự tiếp xúc của véc tơ với người

C ề ệ á ế é ơ ế ú ề ệ ờ

ớ ỗ , ặ ặ

á ệ ớ ữ ợ á ơ

ớ ệ é ơ , ũ ể á á ệ

á ơ ọ , ý ỉ ồ , ợ ệ , ỗ ằ è , h ặ á

ệ á ọ ồ ệ ỗ , ơ ỗ [6].

1.2.3. Khối cảm thụ

ợ ễ ú B ờ , ứ

s ( ) ề ú B ế

ú B ệ ữ V B ơ ỗ Cx.

tritaeniorhynchus trò là vé ơ ề ệ [72], [93].

1.2.3.1. Quá trình lây truyền vi rút V ú ễ ỗ , ú ợ á

ệ ế , á ợ ể á ô

á ặ á , s ệ ơ

ồ ã H ệ á ú ỉ ữ ngày

ệ ệ ứ á ể ệ

ễ ú , ơ ể s á ứ ễ , k á ể

ứ s ễ , k á ể I á ú

ơ á ể á ể I G ệ ứ

ơ á ể I ồ s ờ [47], [48], [62].

1.3. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, CẤU TRÚC VI RÚT BANNA

1.3.1. Đặc điểm hình thái

Ghi chú hình: (a) Vi rút nhuộm với potassium phosphotungstate b Nh n vi rút nhuộm với uranyl acetate, chỉ ra phần bảo vệ kép, (c) Nhân của BAV-Ch, (d) Lát cắt của tế bào C6/36 nhiễm BAV-Ch (thời điểm 30 giờ sau gây nhiễm), D1. Vi rút xâm nhập tế bào qua Endocytosi [được phóng đại to hơn D1A ] D2. VI D3. Virion được hình thành quanh VIB; D4. Cấu trúc không bào bao gồm virion được phóng đại to hơn D4A các virion được chỉ bởi mũi tên đen D4 cắt ngang túi màng kép (vòng trắng), D5 vi rút mọc chồi ra từ mặt ngoài của tế bào phóng đại hơn D5A

Hình 1.2. H nh thái nh n và vi rút anna của chủng AV-Ch [36]

V ú B , ờ -

ớ á ắn ề ặ , ú ô ỏ sá

á ú B ằ ể ện tử ế ế

bào muỗi C6/36 sau khi nhiễm vi rút Banna (ch ng có ký hiệu B V-C )

ệ á á ể vùi (virus inclusion body – VIB) ơ c hiện

quá trình nhân lên và lắp giáp các thành ph n c ú ơ ế

ế ứ á s ú [27], [47], [61], [62], [76].

Theo nghiên cứu F B D , H al, vi rút

B ú ô ỏ ( ), ớ ỏ s

ọ õ á ắ ề ặ ú , á

á á ề ặ ọ ú , á ờ

ơ á ú Reoviridae. T , á ớ á

ú ể “ á ” ớ ớ ỏ s ớ ú ề

ặ [47], [48].

ứ V ệ Vệ s D ễ ơ ( ),

ớ ổ ế ỗ C C ễ ệ ẩ ễ ú s

ờ ý ệ V , á ớ ử ý, s ế ớ ể

ệ ử sá á ú , ờ ú

- , ớ ề ( á ớ i rút VNNB 40-50 nm,

Hình 1.3. Vi rút Banna có ký hiệu 02VN9b được phân lập từ Cx. vishnui ở Hà T y Thước đo 100nm

ú ờ - ) H ú ớ ỏ ỏ ngoài [27].

Hình 1.4. Vi rút anna có ký hiệu 02VN18b được ph n lập từ Cx. vishnui ở Quảng nh Thước đo 100nm

ứ á ú B V ệ Vệ s D ễ ơ

( ) ũ ổ ế s ễ á ú

B ợ ỗ á - , sá rút

, ú , ờ kính ú , á

ú B ỉ ỉ [27].

1.3.2. Đặc điểm cấu trúc của vi rút Banna

Virion có 3 lớp c ú s , ợc c ú ớp capsid bao bọc

( ), ờng kính viron kho ng t 70-75 nm, viron nhu m màu

với phosphotungstic acid, là m t lo i vi rút không vỏ, có hình thái bên ngoài

ơ ú , m t lo i vi rút cùng họ Reoviridae. C u trúc vi rút

ợc quan sát bằng k thu t nhu n màu âm b i với các virion c a

ch ng vi rút Kadipiro cho th y lớp b o vệ ợc hình thành bằng m t lớp

protein kép (protein bilayer), lớ ơ ứng là lớp g n

nhân và lớp bề mặt, mặc dù capsomerese (protein t o thành capsid) hình nh n

gi ng vớ ô a m t s vi rút cùng họ Reoviridae [1], [47], [48].

Vi rút Banna có m t c u trúc tổ chứ á ơ á

rút Rota, với protein b o vệ bao bọc bên ngoài c a h t vi rút. Vi rút Banna có

7 lo i protein c u trúc, 2 trong s này (VP4 và VP9) t o thành vỏ capsid bên

ngoài; Còn õ lo i protein (VP1, VP2, VP3, VP8 và VP10)

và không có vỏ, với m t bề mặt bên ngoài nhẵn. ề á ệ s ớ ú

R ú B ỉ ớ ỏ s õ , V

ú B ú ú ắ ế ớ ế

á ễ V „ = ‟ ớp

g V „ = ‟ ợc hình thành lớp bề mặt

nhân. Kết qu so sánh chỉ ra rằng VP9 c a vi ú B ơ ơ ới VP8

và VP5 về ph m vi, tách biệt c a protein vỏ ngoài VP4 (mã s trên ngân hàng

) V ợ ế á ứng miễn

d ch và s xâm nh p c a vi rút vào bề mặt tế bào v t ch [47], [48], [61].

Nghiên cứu c a Attoui. H và Mohd Jaafar F.M cho th y genome c a vi

rút Banna gồ n ARN sợ é ( sR ), á n gen s 1, 2, 6,

, , , , ã ợc ghi nh n b i Attoui và c ng s (2000), các phân

n gen s , , ợc ghi nh n b i Mohd Jaafar F.M và c ng s (2005),

khác với m t s chi vi rút khác thu c họ Reoviridae chỉ có 10 hoặc 11 phân

n gen [35], [36], [47], [79], [80]. s

ã ú

ế ứ V ệ Vệ s D ễ ơ ,

ũ á ú ớ ỏ ỏ n

ồ , , V ệ ề ú ợ á

R ể ớ z D s R s ế ợ ớ

ữ sá ú ơ ế , ô

ế ô n sát rõ

( R ) ặ ú , ú á

ề ọ ỏ , ớ ỏ ọ ú

, ồ ế ,

protein là do vi rút mã Vớ á ắ s ỏ ể ẳ

á ắ ắ s ặ ú ế ũ s

ặ ú ệ ẩ [27].

1.3.3. Cấu trúc genome của vi rút Banna (bộ gen)

Bảng 1.1. Độ dài của các phân đoạn dsRNA 1-12 protein được mã hóa và 5’NCR và 3’NCR của BAV [36]

5’NCR

3’NCR

Phân đoạn

Độ dài (bp)

Protein (aa)

Độ dài (bp)

Terminal sequence

Độ dài(bp)

3747

1214

‟GU U U

C G C‟

3048

954

‟GU U U

C G C‟

2400

720

‟GU U U

C G C‟

214

2038

576

‟GU U U

C G C‟

281

1716

508

‟GU U U

C G C‟

158

1671

425

111

‟GU U U

C G C‟

285

1136

306

‟GU U U

C G C‟

152

1119

302

‟ GU U U

C G C‟

178

1101

283

‟ GU U U

C G C‟

226

977

249

‟ GU U U

C G C‟

199

867

108

‟ GU U U

C G C‟

249

862

207

‟ GU U U

C G C‟

195

ặ ể ử á ú ọ Reoviridae R sợ é

ồ ề ú á s á ũ

á s (R s), s, R s

ữ ú ặ ( ô ứ ),

C s s á

rút B ũ á – ,

ắ ỉ , ã

V , ô ã [36].

1.3.4. Cấu trúc và chức năng các protein của vi rút Banna

Cá n gen mã hóa protein VP1 và VP2 và toàn b chiều dài

vùng gen mã hóa protein VP6 c a các ch ng vi rút Banna có ký hiệu BAV-

In6969, BAV-In7043 và BAV-C ợc so sánh với ch ng vi rút Banna có ký

hiệu BAV-I , ã á nh s ơ ồng các axit amin t 94- % i

với VP1 (aa 338-808), t 93-99% với VP2 (aa 40-851) và t ến 99% với

VP6. Nghiên cứ á nh có b n axit amin biế ổ ợc phát hiện t i v trí

605 c a VP1 và m ợc phát hiện t i v trí 423 c a VP2 t BAV-

In6969, BAV-In7043 và BAV-Ch [47], [79], [80].

S tổng hợp protein c a tế bào ch b che l p sau 2 giờ gây nhiễm vi

rút Banna trên tế bào C6/36 và b che l p hoàn toàn sau 6 giờ nhiễm gây

nhiễm. Methionine, m t trong só những acid amin c n thiết ợc thêm vào

nuôi tế bào C6/36 t i thờ ểm sau 6 giờ nhiễ , ã ợc tổng hợp các chuỗi

protein (phân gi i bằng SDS- GE), á nh có 7 protein c u trúc. M t

trong s ển cùng với m t s các phân tử protein gắn phóng x

(radiolabelled protein) t tế bào nhiễm vi rút Banna (VP1, VP2, VP3, VP8,

VP9 và VP10), 5 trong s các phân tử ợc tìm th y , ều

ỉ ra rằng vỏ ngoài c ú ợc t o b i 2 protein (VP4 và VP9).

Phân tích c u trúc phân tử protein c B V-C ằ á ổ r ng xác

nh n s hợp thành c a nhân (V1, V2, V3, V8 và V10) với vỏ ngoài capsid

(V V ), ều này chứng tỏ VP5, VP6, VP7, VP11 và VP12 là các

protein phi c u trúc [47].

Các protein phi c u trúc VP7-VP12 c a BAV-Ch và VP9 c a BAV-

I ợc thể hiện E.Coli ể ổng hợ , ợ áng

ể t o ra kháng thể kháng l ợc VP8, VP10 và ph n ứng l i với lớp

capsid vỏ ngoài (outer-capsid layer). Protein c ú V á nh xu t hiện

h u hết ph n ứng miễn d i với protein c ú B

ặ ệ C ể V nhiên hay tái s tổ hợp c a vi

rút Banna Trung Qu c - BAV-C ( ) ã ô ợc kháng thể

kháng l i protein VP9 c a vi rút Banna Indonesia - BAV-In6969 (genotype B)

ợc l , ã ỉ ra rằng protein VP9 chính là s ổi kháng nguyên

i với t ng lo ú ặ nh n biết các vi rút Banna

c a Trung Qu c - BAV-Ch và vi rút Banna c a Indonesia BAV-I ợc

á nh bằng 2 lo i huyết thanh khác biệ i với hai genotype A và B c a vi

rút Banna [80].

Nghiên cứu cho th á ú B ý ệu

BAV-Ch có gắ ồ ã á V V n

protein chiếm h u hết ú B ợ , V

ợ ử ỏ ơ ợ ơ V V ỷ lệ á

ú B ý ệ B V-C a protein g n nhân

và bề mặ ơ ú B ú R ơ s ể

s s n khác nhau [36].

Chứ a các phân tử protein ợc á VP1 là

RNA-dependent RNA polymerase, VP2 là protein lớp vỏ trong, VP3 là

z , V ỏ , V -NS là enzyme protein kinase, VP8 là

lớ ỏ a nhân, VP9 là lớp protein vỏ ngoài gắn kèm, VP12-

NS là protein gắn dsRNA (dsRNA-binding). Jaaafar FM và c ng s ( )

ằ : V (C ) G s s , V

( j ), protein c a VP10 có thể trợ giúp cho chức

a protein VP9 [36], [61].

1.3.5. Phân loại và nguồn gốc vi rút Banna

Họ Reoviridae á rút, trong s này có 4 chi vi rút gây

bệ ờ á rút: Orthoreovirus (Reovirus), Orbivirus,

Rotavirus và Coltivirus; Các chi vi rút còn l i gây bệnh cho cây, côn trùng và

cá. C C s ồ ú C s

C s B C s ữ ú ề

ế , ế ồ á ú

ế ồ á ú C

C s B ữ ú ỗ ề ỉ ế

ứ ề á ặ ể ử á ú

C s B ú s á ệ ợ ề

á ỏ C s ể rút ớ

s ( ế ắ -E s s R s s)

ồ á s B s Á. ,

s ọ Reoviridae ồ rút

ệ ờ á rút: Orthoreovirus (Re s), s,

R s, C s s [35],[43],[47],[48],[61],[71],[72],[78].

So sánh chuỗi axit amin chỉ ra rằ ú B

ồ c vớ ú , á ơ ồng mã hóa

c n thiết b á R ớ C ơ B

không phát hiện s gi ý ĩ ữa n 12 VP12 c ú

B ú , s á ợ ằ á

sắp xế ơ C U W [54], [55], [95].

sá á ú B , ú ớ á

n gen c ú s C ( , , )

ú E ( n 12) chỉ ra 1 giá tr nhỏ nh ợ á á

nhau là 15%. Mứ ơ ớ á s sá ữ ú

á ú á ọ Reoviridae [35], [36], [37].

Hình 1.5. Sơ đồ tiến hóa của họ Reoviridae [36]

1.3.6. Sự sao chép của vi rút

s é ú B ễ ơ , ế ớ á

h t Cá ũ s ế ớ á ũ ớ á sợ

ỏ V ú á h ỏ ế à ế á ỡ

u tiên ARN sợi âm s ợc sao chép ra ARN sợ ơ n

tiếp theo ARN sợ ơ s ợ ể tổng hợp ra các protein và phiên

mã t o ra ARN sợi âm. Các protein capsid c a vi rút s ợc tổng hợp giai

n tiếp theo, genome c a vi rút s ợc t o nên b i s sao chép t sợi m ch

âm và sợi m ơ a ARN. Kết qu c a các quá trình trên s t o nên vi

rút mớ ợc lắp ráp t các thành ph ã ổng hợp, vi rút s gi i phóng ra

ngoài tế bào và tiếp t c xâm nh p vào tế bào mới ô ờng sau gây

nhiễm vi rút vào tế bào, vi rút h p ph trên bề mặt tế bào trong vòng 30 phút,

tiếp theo là giai n “ ặ ” trong kho ng 10 giờ với hiệu giá vi rút r t

th p; G n vi rút phát triển ệu giá trong kho ng 12 – 16 giờ và

hiệu giá vi rút cao nh ợc ghi nh n vào giờ thứ 36. [27],[47].

Hình 1.6. Sơ đồ quá tr nh sao chép của vi rút anna

1.4. ĐẶC ĐIỂ HCNC NGƢ I DO VI R T NN [47],[50],[62] 1.4.1. Sinh bệnh học

V ú ễ ỗ , ơ ể ú ợ

á ệ ế , á ợ di ể á

ô á ặ á , s ệ

ơ ồ ã H ệ á ú ỉ ữ

, s ú ỉ á ể

ệ ệ ú

ớ ệ ặ ể ế ử , ổ ơ ô

ờ ổ ơ ệ ã , ã , ã -

ã C ờ ợ á , s , ô á á

, ế ơ ế õ

ễ ú B , ơ ể s á ứ ễ

ô á á ề s á ể ệ ơ

ứ á ể ứ s ễ , á ể ứ ế

ế ồ ứ á ể I á

ú ơ á ể á ể I G ệ

ứ ơ á ể I Xé ệ á :

ặ ơ , ( –

metamyelocyte) ớ á .

1.4.2. Đặc điểm lâm sàng

V ú B ệ ề ễ ổ ơ ệ

ơ ặ s ô õ ã ợ ữ

ệ ể ợ ô s : ờ á : é -

ũ á ệ ô ớ ệ ứ s

, ớ , , ơ ớ , á ờ á : s -

ệ s s , , ứ ổ, ờ ơ ớ

ể ô , , sợ á sá , á , ồ ô Cá ệ

ứ ổ ơ ệ , ú ờ , ú G

ế ô ứ ữ ờ ệ ễ ử ữ

ệ HC C ú B ờ ệ ứ ể

ơ, ớp, s t và viêm não , ũ t khó chẩ á HC C ú

Banna nếu chỉ d a vào triệu chứng lâm sàng vì có r t nhiều tác nhân vi rút

HC C ã ợc ghi nh n [40],[57],[88],[89],[91].

ờ ế ể á : ứ - ệ , á ệ ứ

ỡ s , ệ ổ , ứ ơ

, ờ ú ý á ế ứ ổ ,

á , có thể b loét da ằ ờ ồ : Bệ

ỉ s ẹ, ỉ á , á è , ỉ á ứ

ứ ặ ẹ ệ ệ , ế , ơ ,

viêm m , ớ é

1.4.3. Đáp ứng miễn dịch [52]

ễ ú , ơ ể s á ứ ễ , ô

á á ú B ề s á ể ệ

ơ ứ K á ể ứ s ễ ,

khá ể ứ ế ế ồ ứ

á ể I ệ sớ á ể I G ệ ứ

ơ á ể I , ọ ệ ệ ơ ể

ú Vớ ữ ặ s ọ ặ ệ , I G ể

ú , á ú á ể I G ờ ơ

I ồ ơ á ã ỷ không có ý

ĩ ề ẩ á ề .

1.4.4. Điều trị và dự phòng bệnh [43]

1.4.4.1. Điều trị HCNC do vi rút Banna

H ệ ề ặ ệ á ờ ợ HCNC

ú B , ế ề ệ ứ ặ ề á ế ứ

ệ

1.4.4.2. Dự phòng HCNC do vi rút anna

V ú B ú ỗ ề ú ớ

ợ á ệ ỷ ế Á, ữ

ứ ề á ặ ệ ú ợ ề ế ,

c ế ắ ể ệ

1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM

1.5.1. Phƣơng pháp phát hiện nhanh vi rút [45],[48],[67],[68],[92],[100]

1.5.1.1. Phương pháp kính hiển vi điện tử

a) Phương pháp nhuộm m bản

Ưu điểm: C ế , á ệ ế á ú

ệ ẩ : á , ã ỷ, ớ ổ ế ễ ú á ớ

ế ỉ ệ é ệ , s ẩ á ợ ; Nhược điểm: Nồ ú 6, 107 FU ,

thiế ắ ề , ệ ế ề ệ ứ , ờ sử

ế ọ ế ệ

b) Phương pháp miễn dịch gắn vàng quan sát bằng kính hiển vi điện tử

Ưu điểm: s á ệ ú á ế kháng n ề

ặ ế ợ ớ á ể ặ ệ ú ứ ợ ợ á

ằ á ể á ệ ắ ; Nhược điểm: á ợ

á ể é ệ , ế s ẩ ắ ề ,

ệ ứ ỏ ờ ệ , ể ợ sử

ể á ệ

c) Phương pháp lát cắt cực mỏng

ế ô ú s ễ ệ ẩ ợ

ỏ ớ ổ C ằ % + % paraformaldehyte/

cacodylate 0,2 M + 0,2 M saccarose pH = 7,2 - , ( ể ờ ặ ệ oC) ệ á ớ ế , ô

ú ể ệ á ắ ỏ ể ế ợ sá ằ

HV ề ú ế

Ưu điểm: ơ á ặ ệ , ờ ế

ờ – 7 ngày.

Nhược điểm: C ế s ẩ ắ ề , ệ

ứ , é .

1.5.1.2. Phương pháp sinh học ph n tử

Ưu điểm: RT- CR á ợ ớ á ú ệ ề

R à ph ơ á ẩ á , ế á , ế

ợ ể s á C ể sử ể á ệ ệ ề ú

ế ệ ẩ s

Nhược điểm: ế ô ể s á ợ s ễ á á

ệ á ế ơ á ỏ ặ á , ế

ú ế ể ế .

1.5.2. Phƣơng pháp phân lập vi rút [20],[39],[41],[59],[83]

Ưu điểm: ẩ , ể ẩ á á

ú ệ , sử ế ể ú ể ô

ệ ã sử ệ ể . Vi rút sau

kh s ợ ằ R -PCR.

Nhược điểm: L ơ á ế , á

ề ế : ề ệ , ờ á ệ , ọ

ế ể , ệ ệ … ặ á , s

ú ế ể ế (CPE), ặ ô ệ

ợ ế (C E) ô ể sá ợ D , sử

s á ơ á á ể ỗ ợ ú

ớ ú B nói riêng và các vi rút Arbo ỗ ề

chung, dòng ế ỗ Aedes albopictus dòng C6/36 ớ á

ú ỗ ề ế này ợ sử ã ể

Xá s á ể ú ế ể sá s ổ ệ

ý ế ằ ể pha. ặ ệ ớ ú B , hi gây

ễ ú B ế , ệ ợ ệ ý ế ( ế

, ô á ề ặ ý ô ế s – ô ) ể

ú ớ ổ ế ễ ể á ú ằ

E I w ặ R - CR, ể á

ú ệ n [19], [ 63], [72].

A. Tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 b nh thường sau ngày thứ 3

B. Tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 nhiễm vi rút sau 3 ngày g y nhiễm vi rút

Ả 1. Tế ờ ế ễ ú B

1.5.3. Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học [1], [22], [45], [72],[75]

C ề ễ ợ ứ ẩ á ế

ọ ứ ế ế ồ , ế ợ ổ ể, á

ễ á ệ á ể , ẩ á ằ

n ữ ế é và ể phát

ệ á ể D , ữ ệ ợ sử . ợ

, E I á ệ á , á ể ệ ơ

s á á ô ứ

ổ ế .

1.5.3.1. Khái niệm về kỹ thuật ELISA phát hiện và định lượng kháng thể

ơ á E I (E z I s ss - xét

ệ ễ ế ớ z ) ề ặ

ể ề s ế ợ ặ ệ ữ á á

ể, á ể ợ ắ ớ z ơ

ợ ớ z ứ ờ H (H2O2) xúc tác, enzyme

s ơ ệ ứ ỏ ã

ứ ặ ệ ữ á ể ớ á ô

ờ ế ợ ồ á á ể á

ệ

ơ á ợ ế ế ệ á ệ ợ

s, , s, , ĩ á

ơ , é á á ặ á ể ồ

( , ) E I ợ ể á ề á

ệ s, ẩ , , kí sinh.

K E I ồ ứ : á

, á ể ệ ớ : ứ ễ

ọ ứ ọ .

1.5.3.2. Nguyên tắc đọc kết quả trong kỹ thuật ELISA [45].[98],[102]

a Đọc kết quả dựa trên giá trị OD của các mẫu xét nghiệm và mẫu chứng

ẩ ọ ế E I ọ ỷ s

ọ ( D) C á ỡ ợ sử ( -off values).

Cách 1: D á D ứ ớ

ệ ẩ ( : D)  ơ D

≥ D ứ + ( ) D

Cách 2: D ỷ s D ứ ơ ( ) ớ D

ứ ( ) s  ơ hi OD

≥ D ứ (+) D ứ (-) ≥ á ỡ ( ô ờ ọ

á ỡ ằ ặ ằ )

Cá ề ệ á ứ ợ ọ ế E I : G á

D ứ ơ á D ế < , , ứ á

ề E I ỷ s D ứ ơ D

ứ ≥ á ỡ , á D ứ ơ ≥

0,400.

b) Cách đọc kết quả ELISA dựa trên đường chuẩn

Cá ọ ế ờ ợ á ể ợ ồ

á ặ á ể ô ệ s sá ớ ờ ẩ ợ

á D ợ á ồ ã ẩ ã

ế ớ ệ á ( ờ ẩ ể á ồ

é ệ s sá ớ ẩ )

1.5.3.3. Các kỹ thuật ELISA ứng dụng trong chẩn đoán vi rút anna

a Kỹ thuật ELISA- Sandwich phát hiện vi rút hoặc kháng nguyên vi rút

Banna

Ưu điểm: C ặ ệ ể ế ớ s ợ

ớ á ử ờ ệ ắ ( ờ),

ơ ễ ệ ể ẩ á sớ ặ ệ ỉ

ệ ẩ sớ ệ , ồ ệ ẩ ,

ô ử ý, ô ờ ợ ơ ớ ế .

Tuy nhiên, ơ á ợ sử ế ể ú

B ặ ế ợ ớ s ọ ử, ể ẩ

á á vi rút Banna.

Nhược điểm: E I ờ ỡ á ệ ơ

CR .

b Kỹ thuật ELISA gián phát hiện IgM kháng vi rút anna

Ưu điểm : ặ ệ , ơ , ể á ợ ớ ễ

vi rút, á ế ô ỏ ử ý á ợ

ơ .

Nhược điểm: ớ ế ể

á ệ ợ I

c Kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện IgG kháng vi rút anna

Ưu điểm: Dễ ệ , ô ỏ ế ắ ề ,

ể ề ễ ọ

Nhược điểm: ế sử ử ý ỏ ế

, ô ể ể ẩ á sớ ợ , ể sử ữ

ệ ề ễ ế ọ s ú B ờ ặ ờ ợ ,

Chƣơng II

ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghi h i i h h h h

h g - h g 8 i h g 9 h g

i ghi i h h h h i h g

ghi gờ d i ú ở kh ự : Kh ự iề B , kh ự iề T g,

kh ự T y Ng y kh ự iề N .

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu

2.2.1. :

2.2.1.1. Tiêu chuẩn b ẩ CNC nghi ng do vi ẩ ủa Tổ chức Y tế thế giới [6], [73], [97]: - Số g 8oC, kèm theo m t trong hai tri u ch ng sau

- Ph i c i h g h y i h g i h h h i

h kh g i h ặc có d u hi u th ki h kh h d u hi u

màng não, li ; ă g g ự ; hản x b h ý; í i i u ti n; rối

lo n hô h p.

- C ối g g h ờ g g gi i .

2.2.1.2. Tiêu chuẩn b c chẩ x ịnh mắc HCNC do vi

rút Banna:

- Theo tiêu chu n của b h h c ch s g HCNC ghi gờ

do vi rút

- i tr nguyên nhân vi rút VNNB, ECHO 30 và herpes simplex type 1

và type 4 gây HCNC

- D ch não tủy trong.

- K t quả ELISA gián ti p phát hi n IgM kháng vi rút Banna trong d ch não

tủy d g í h.

2.2.1.3. Đ ề a p ắ CNC

Th h h h d h ủy h h HCNC nghi gờ

d i ú iề i số h i kh y h h i Nhi

T g g ở kh ự Miề B Miề N Miề T g T y Ng y .

iề ặ i d h ễ i h g s g dự sở iề h i

h ủ hữ g ờ g h h HCNC ghi gờ d i ú

x h d g í h ới kh g g y i ú Banna ằ g kỹ h ELISA.

õ ặ i d h ễ s g ủ HCNC d i ú B h i h h

nhân HCNC do vi rút VNNB và ECHO30 ũ g s dụ g sở s

s h ối hi . C h s dụ g h í h ặ i s g dự

sở h x h d g í h ủ hò g xé ghi .

Ph i ú B ở hữ g h h HCNC x h ge y i ú

B h h h h ở Vi N

2.2.2. Đ ề a vé ơ ỗi Culex truyền b nh

Nghi hự hi ở h số g h h HCNC ghi

gờ d i ú i kh ự Miề B Miề T g Miề N T y Ng y

i h họ i x số h h h iề i

h i ă hời gi h h kh ả g h g h g

hời i x hi hiề h HCNC q h é Culex h

i Vi N [ 4]. M i h i x h h h h i h

x h i ú B g hời x h ge y i ú h h i i

Vi N .

Loài muỗi: ối ng nghiên c u là các cá th mu i thu th c t i m t số

h g ở miền B c, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên trong các

ă – 2011.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

Thi k ghi d ch tễ học mô tả c t ngang, h i c u và ti n c u

k t h p với nghiên c u phân tích trong phòng thí nghi m với h g h h

th p m u thu n ti n, không giới h n.

2.3.2. Điều tra xác định các đặc điểm dịch tễ học bệnh nhân hội chứng não cấp

2.3.2.1 Phương pháp điều tra và lấy mẫu xét nghiệm bệnh nhân

Cỡ mẫu: L y m u toàn b các b nh nhân có HCNC nghi ngờ do vi rút theo

tiêu chu n ch khi h p vi n các b nh vi kh nh thu c các

t nh nghiên c u và b nh nhân thu c các t nh nghiên c u khi nh p vi n các

b nh Vi hi g g h ặc khu vực.

Chọn mẫu: Chọn m he h g h h n ti n, các b h h ủ tiêu

chu n lâm sàng trong b nh vi c chọn nghiên c iều tra, thu

th p thông tin và l y m u b nh ph m.

Phương pháp điều tra bệnh nhân và lấy mẫu trong nghiên cứu tiến cứu:

Công cụ điều tra: Các dụng cụ l y m u máu, khám, ch nh HCNC:

M y h y t áp, ống nghe, nhi t k , búa phản x ; ki i ý hựa,

gă g y ù g; hi iều tra b nh nhân nghi HCNC, phi u tình nguy n

cho máu và d ch não tủy.

Điều tra: iều tra viên là các bác sỹ của b nh Vi c t p hu iều tra

iền theo m u phi iề c thi t k sẵn.

Bệnh phẩm: Ở b h h HCNC he h ghĩ h c l y:

Máu và d ch não tuỷ l y ở iều ki n vô trùng và c n xét nghi m sớm n vài giờ c n bảo quản ở 40C, n u trên 1 tu n c n bảo quản ở -20C.

- L y d ch não tuỷ (DNT) xét nghi m 1 ml, những m u DNT có k t quả xét

nghi m âm tính với kháng nguyên vi rút VNNB i tr ă g y

vi rút ECHO30 và vi rút herpes simplex type 1 và 4 c giữ l i xét

nghi m phát hi n IgM kháng vi rút Banna.

Trong nghiên c u này s dụng 1.285 m u d ch não tủy của b nh nhân có

HCNC nghi ngờ do vi rút bao g m các m u d ch não tủy c thu th p t m t

số b nh vi n của các t nh/thành thu c miền B c, miền Trung, miền Nam và

T y Ng y chọn m u d ch não tủy làm xét nghi m phát hi n kháng th

IgM kháng vi rút Banna bằng kỹ thu t ELISA khẳ g nh (không dùng

m u huy t thanh).

2.3.2.2 Phương pháp điều tra muỗi véc tơ [4], [5], [14], [30], [39]

Cỡ mẫu: Cỡ m í h he h ờng quy của Vi VSDTTƯ; h gia

h x x i m (xã/t nh) x 1l ă = 6 t h gi h i m.

Chọn mẫu: m u là h gi h

Chọn xã: M i khu vực B c, Trung, Nam, Tây Nguyên chọn 1 xã cho 1 t nh có

số ca m c HCNC cao nh t trong khu vự he ă c chọ i m nghiên

c u.

Chọn thôn: Th c chọn ng u nhiên trong các xã nghiên c u.

Hộ gia đình: H gi h c chọn ng hi he h g h kh ảng

cách m u. H i c chọn ng u nhiên trong danh sách với số nhỏ h

khoảng cách m u và cách h ti he c trọn trong danh sách là số h u

tiên c ng với số khoảng cách m u.

Phương pháp điều tra muỗi:

Vi iều tra mu i c thực hi he h ờng quy của

Vi n VSDTTƯ ụ th là:

- Các dụng cụ phòng thí nghi m c n thi h gi s nh lo i mu i véc

: Pi è è i y t mu i, kính hi n vi, l ng mu i; b y mu i do

CDC Fort Collins thi t k .

- B t mu i bằng b y CDC: B y ặt về c d n dụ mu i bằng

khí CO2 c treo ở các v trí ngang t m thở ở chu ng gia súc sau 12 ti ng

thì thu th p mu i mang về nh lo i, cho tiêu máu và phân l p vi rút.

- B t mu i i u ngh ở trong nhà và chu g gi sú ù g 18 giờ

n 22 giờ, mùa hè t 19 giờ n 23 giờ. Mu i g h riêng, mu i ở

chu g gi sú riêng. M i iều tra b t mu i g i

s g ời b t, chia làm ba nhóm, m i h h i g ời b t. M i h gi h

b g 5 hú ; dù g è i ống nghi m thủy tinh và máy hút mu i b t

mu i.

- nh lo i mu i: The kh nh lo i mu i của Vi n Sốt rét - Ký sinh trùng -

C ù g T g g. Kỹ thu nh lo i mu i c thực hi n t i Phòng thí

nghi m Côn trùng Vi VSDTTƯ.

Có 21 loài mu i, g m 66.760 cá th c chia thành 1.091 m u mu i

s dụng trong nghiên c u này.

2.4. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm trong phòng thí nghiệm

M u b nh ph m g m d ch não tủy b nh nhân và mu i thu th p trên

thự a c ti n hành nghiên c u phân tích trong phòng thí nghi m với các

h g pháp:

2.4.1. P ơ p p xé m kháng thể bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme

gián tiếp phát hi n IgM kháng vi rút Banna - IgM INDIRECT

ELISA [1],[7],[16],[34],[60],[98],[102]

Nguyên lý: Kháng nguyên vi rút Banna tinh ch c g n vào pha r n là t m

nhựa 96 gi ng, cho m u b nh ph m (d ch não tuỷ pha loãng 1/10, huy t thanh

b h h h g s h ng h p là m t kháng th IgG kháng

IgM g ời có g e zy e e xid ze phát hi n sự có mặt của IgM g ời

kháng vi ú B . Ch h t hi n màu OPD, d ng phản g

quang bằ g y ọc ELISA với ớc kép 490nm/620nm.

Vật li u và thiết bị - Kháng nguyên vi rút Banna tinh ch , b t ho t do Vi n Y học Nhi ới

ờ g i học Nagasaki Nh t Bản cung c p. - C ng h IgG kh g IgM g ời của hãng Sigma - T m nhựa 96 gi ng của hãng NUNC - Các lo i dung d ch và hóa ch t c n thi t cho kỹ thu t ELISA. - Pipet bán tự g k h i 10 µl, 200 µl, 1000 µl và pipet bán tự

g k h i 250 µl.

- Pi e i g ng cho các lo i pipet bán tự ng. - H thố g y ọc ELISA của BioTek Elx808 của Hoa Kỳ.

Cách tiến hành Lấy bệnh phẩm

- L y ĩ h ch hoặc l y u ngón tay vô trùng.

+ Máu I l y sau khi m c b nh 1-5 ngày

+ Máu II l y sau máu I t 10-20 ngày

- L y d ch não tủy vô trùng (do bác sỹ iều tr ch nh và thực hi n).

- Thời gian l y m u:

+ D ch não tủy và m u máu th nh t: L y sau khi m c 5 ngày u của b nh.

+ M u máu th hai: L y sau m u máu th nh t t 7 n 10 ngày.

- Bảo quản m u ở -20oC h n khi xét nghi m.

Tiến hành phản ứng

- Bước 1: Phủ bản nhựa bằng kháng nguyên tinh ch pha trong dung d ch phủ

bản pH = 9,6 (theo hi gi h ) cho vào m i gi ng 100 l; ủ bản nhựa ở 4oC q ; i bỏ kháng nguyên th a bằng cách r a t m nhựa 3 l n bằng dung d ch PBS – Tween, m i l n 1 phút.

- Bước 2: L p các khoảng trống bằng Albumie bò 1% trong 1 giờ/ 37oC. R a bản h .

- Bước 3: Cho ti p xúc với m u b nh ph m

+ Huy t thanh m u ch ng và huy t thanh của b h h h g ở các

n g : 1/1000 trong dung d ch pha loãng.

+ D ch não tủy pha loãng 1/10 trong dung d ch pha loãng.

+ Cho m u vào t ng gi ng, m i gi ng 100 l; ủ bản nhựa ở 37oC/1 giờ; lo i

bỏ m u th a ở các gi ng bằng r a t m nhựa 3 l n m i l n 1 phút với PBS –

Tween.

- Bước 4: Cho ti p xúc với IgG kháng IgM g ời có g n enzyme Peroxidase ở n g thích h p, cho vào m i gi ng 100 l; ủ bản nhựa 37oC/1 giờ; lo i

bỏ c ng h p th a bằng cách r a bản nhựa ít nh t là 5 l n, m i l n 1 phút với

dung d ch PBS- Tween.

- Bước 5: Cho ti p xúc với dung d h h t OPD (ch chu n b ớc 5 phút,

cho vào m i gi ng 100 l; ủ trong bóng tối ở nhi phòng xét nghi m 15-

30 phút.

- D ng phản ng bằng axit 4N H2SO4: 75 l/ gi ng

- ọc k t quả bằ g y ọ ELISA ớc sóng 490 nm/620 nm.

Nhậ ịnh kết quả:

OD ch g d g . OD ch ng âm < 0.200

Các m x h d g í h khi:

OD m u xét nghi m/OD m u ch ng âm > 2 2.4.2. P ơ p p p ập v

- Các nguyên v t li u c n thi t cho quá trình phân l p

- Dung d h m PBS pH = 7,8

- M i ờng nuôi c y t bào: (1) M i ờng phát tri n có 10% huy t thanh

bê bào thai (90 i ờng MEM + 10 ml huy t thanh bê bào thai). (2)

M i ờng duy trì sau gây nhiễm có 2% huy t thanh bê bào thai.

- T bào mu i Aedes albopictus dòng C6/36 phân l p vi rút. - Tube nhựa nuôi c y t bào: 16x125 mm (hoặc chai nhựa lo i 25cm2).

- Lọc vô trùng 0,22 l ( ờng kính 25 mm).

- Tủ an toàn sinh học c p II.

- Các trang thi t b và v t li u c n thi kh … 2. 4.2.1. Phân lập trên tế bào muỗi C6/36 [1],[15],[59],[86],[99]

- Nuôi t bào C6/36: Quan sát t bà d ới kính hi n vi ảo g c, t o h n d ch t bào t n g 105 g i ờng phát tri m t bào bằng

bu g m); Cho 2ml h n d ch t bào này vào tube nuôi t bào (hoặc vào chai nuôi t bào). Ủ tuýp nuôi t bào ở nhi 28oC t o t bào m t lớp, quan

sát sự phát tri n của t bào bằng kính hi i ảo pha x nh.

- Gây nhiễm m u b nh ph m cho t bào: B nh ph m sau khi x lý, lọc vô

trùng, gây nhiễm cho t bào m t lớp; Lo i bỏ i ờ g ũ, th tích gây

nhiễ í h g g ằng 1/10 – 1/20 th tích nuôi c y t bào. - H p thụ 28oC/2 giờ s h i ờng duy trì. - Theo dõi sau gây nhiễm: T ở 28oC trong khoảng 5 ngày. Quan

sát sự h y i b nh lý của t d ới kính hi n vi ảo pha hàng ngày. Gặt

ớc n i th bà x nh kháng nguyên vi rút bằng kỹ thu t RT-PCR với

cặp m i ặc hi u vùng gen số 12 của vi rút Banna [21].

2.4.2.2. P ơ p p ị v [63],[77],[101]

a) Định loại vi rút Banna bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription

Polymerase Chain Reaction) trực tiếp cho vi rút có ARN sợi kép

Nguyên lý: Kỹ thu t phiên mã g c phản ng chu i y e se c phát

tri h g h PCR h g h ờng do Karl Mullis và c ng sự phát

i h ă 985. y h g h dựa vào nguyên t c t t cả các ADN

polymerase khi ho ng t ng h p m t m ch ADN mới t kh ều c n

m i ặc hi u - là nhữ g n ADN ng n có khả ă g t cặp b sung với m t

c u của m ch khuôn và ADN polymerase sẽ dùng dNTP nối dài m i thành

m ch ADN mới b sung với ADN khuôn.

Trong ờng h p v t li u di truyền của vi ú ARN h ADN í h c

gi i hi g c nhờ ng củ e zy e hi g c

(RT-Re e se s i se t ng h p các ADN b sung (cDNA) với ARN,

r i s PCR sẽ nhân bản các cDNA thành bản s ặc hi u, m t kỹ thu t

bao g m cả h i gi i y c gọi là kỹ thu t RT-PCR [63]. có sản

ph m t ng h p PCR t m u b nh ph m c gi i s : Gi i n

tách chi t v t li u di truyề gi i n khu h i gen, ki m tra sản ph m trên

th ch agarose.

Vật liệu và trang thiết bị:

- B sinh ph m tách chi t QIAamp® V ral RNA kit của QIAGEN.

- B sinh ph m RT-PCR Onse step của QIAGen củ c

- Pipet bán tự g k h i 0,5 - 10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl

- Pipet tip có lọc các lo i g ng.

- Máy ly tâm l nh Eppendorf củ c.

- Máy PCR Eppendorf củ c.

- Máy ch y i n di GelMale 2000 của Nh t Bản

- Máy chụp ảnh k t quả i n di trên th ch MultiDoc-It Digital Imaging

System

- Các v t li u và dụng cụ c n thi t khác.

Giai đoạn tách chiết ARN: S dụng b sinh ph m tách chi t ARN của hãng

Qiagen (USA-Germany) dựa trên nguyên lý s dụng m t dung d ch AVL (có

ch g ARN ly giải vi rút, khi cho m u c n tách chi t ARN vào dung

d ch AVL, vi rút n u có trong m u sẽ b ly giải, ARN của vi rút sẽ c g n

vào ch t mang ARN. Với sự có mặt của c n 100%, ARN của vi rút sẽ b tủa

l i ặc). Khi cho lọc qua màng QIA amp Silicagel, ARN của vi rút sẽ

c g n chọn lọc trên màng QIA amp Silicagen nhờ ch t mang ARN, s

dụng dung d ch r AW AW lo i các thành ph n t p bám trên màng

QIA amp Silicagen. Dung d ch chi t xu t AVE sẽ tách ARN của vi rút bám

trên màng QIA amp Silicagen với ớc thực hi h s :

Bước 1: Cho 140 l m u vào tuýp có 560 l dung d ch ly giải AVL có ch t

mang ARN, tr n bằng máy tr n Votex khoả g 5 gi y t o m u h n d ch

ng nh t giữa m u và dung d ch AVL. Ủ ở nhi phòng trong 10 phút,

ảm bảo các h t vi rút b ly giải hoàn toàn, khi vi rút b ly giải ARN c g n

vào ch t mang ARN; S y hẹ chuy n các giọt dính trên n p vào

thành tuýp xuống.

Bước 2: Cho 560 l c n 100% vào tuýp trên, tr ều bằng máy tr n trong

vòng 15 giây; C n sẽ tủa các s i ARN l i, sa y hẹ chuy n các

giọt dính trên n p và thành tuýp xuống.

Bước 3: Chu n b c t QIA amp spin. Cho 630 l (m t n a số m u trên) vào

c t QIA amp spin, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. T t cả ARN sẽ g n

trên bề mặt màng Silicagel với sự có mặt của ch g ARN. ph n d ch

c lọc trong tuýp thu nh n 2 ml, l p l i tuýp thu nh t QIA amp

spin.

Bước 4: Cho nốt ph n m u còn l i (630 l) vào c t QIA amp spin, ly tâm

8 ò g hú g hú . ph n d h c lọc trong tuýp thu nh n, l p

l i tuýp thu nh n vào c t QIA amp spin.

Bước 5: Cho 500 l dung d ch r a AW1 có ch a c n 100% vào c t QIA amp

s i y 8 ò g hú g hú lo i bỏ các thành ph n không

phải là ARN có trên mặ g Si i ge . ph n d ch lọc trong tuýp thu

nh n, l p l i tuýp thu nh n vào c t QIA amp spin.

Bước 6: Cho 500 l dung d ch r a AW2 có ch a c n 100% vào c t QIA amp

s i y 4. ò g hú g hú lo i bỏ các thành ph n không

phải là ARN có trên mặt màng Silicagel. Lo i bỏ tuýp thu nh n có ch a d ch

lọc, l p tuýp lo i 2 ml mới vào c t QIA amp spin.

Bước 7: Ly 4. ò g hú g hú ảm bảo lo i bỏ hoàn toàn

dung d ch r a.

Bước 8: Chuy n c t QIA amp spin vào tuýp Eppendorf s ch 1,5ml, lo i bỏ

tuýp ch a d ch lọc qua, mở r t nhẹ nhàng n p c t QIA amp spin, cho 60 l

dung d h AVE. y n ở nhi phòng 1 phút. T t cả ARN có trong

m u sẽ c tách khỏi màng Silicagel bằng dung d ch AVE là dung d ch

không có Rnase, có ch a 0,04% sodium azide. Khi ly tâm toàn b ARN của

m u sẽ c thu h i trong d ch lọc.

Giai đoạn khuếch đại sản phẩm PCR: Kỹ thu t RT-PCR theo quy trình kỹ

thu c cải biên cho các vi rút có v t li u di truyền là ARN s i kép, c n có

ớc du i xo n s i kép thành s i bằng nhi t hoặc hóa ch t [19],[24],[45].

Chu n b h n d ch mix cho phản ng RT-PCR he h ớng d n của sinh

ph m và b sinh ph m, chu trình nhi c tối h dự h ớng d n s

dụng sinh ph m của nhà sản xu t và thông tin cặp m i s dụng.

Trong nghiên c u này s dụng cặp m i ặc hi u vùng gen số 12 của vi rút

Banna có ký hi u và trình tự h s :

- Prime 12 -107 F: 5’ – ACT GTG TGT GAG GGT CCA AG – ’

- Prime 12- 734 R: 5’ – GGA CCT AAC GGC ACA GGA – ’

y ặp m i ặc hi u vi ú B c thi t k t trình tự n gen số

12 t vùng nh của genome vi ú cho sản ph m PCR là 676 bp [21].

H n d ch của phản ng RT – PCR c khu h i sản ph m của phản

Chu kỳ

x 35

Nhi (0C) 45 94 94 54 72 72 10

Thời gian (Phút:giây) 30:00 15:00 0:45 0:45 1:30 10:00 K t thúc

ng trên máy PCR – Eppendorf ( c he h h h s :

Giai đoạn điện di sản phẩm RT – PCR bằng thạch agarose 2 %

Nguyên lý của kỹ thuật điện di: Dự ặc tính c u trúc của axit nucleic là

i phân t í h i d ới ng củ i ờng chúng sẽ di

chuy n t cực âm về cự d g; i n di là quá trình di chuy n của các phân

t í h i g i ờng th ch d ới tác dụng củ i ờ g. T g i n

ờng của các phân t í h i n di sẽ chuy n với tố phụ thu i n

tích, hình d g kí h h ớc củ . Kí h h ớc l ặc tính sàng lọc của th ch

x nh bằng sự iều ch nh n g agarose, với n g agarose càng

kí h h ớc l càng nhỏ. Tuỳ he dài của sản ph PCR chọn n ng

agarose thích h p cho mụ í h h ới chiều dài sản ph m PCR t

100- 5 h ờng dùng th ch agarose có n g 2%). Các axit nucleic khi

di chuy n trong th ch agarose sẽ c phát hi d ới tia t ngo i (UV) theo

nguyên lý hoá phát quang (Chemilluminécence) nhờ m t ch t phát quang

Ethidium bromide, ch y c g n xen giữa các base của axit nucleic trong

quá trình ch y i n di.

Thành phần sinh phẩm dùng để chạy điện di:

- Dung d ch TAE hoặc TBE

- Agarose

- Ethidium bromide

- Thang chu n 100 bp, 1 Kb

- Dung d h ặt m u (loading buffer)

Các dụng cụ và trang thiết bị cần thiết:

- B kh y th ch, bình nón

- Pipet bán tự ng có th iều ch nh lo i 10 µl, 100µl.

- Gi tuýp, găng tay, kh g kí h…

Thực hiện kỹ thuật:

Bước 1: Chu n b kh y th ch

Bước 2: Q y h th ch agarose 2%:

- Pha dung d ch TAE: Pha 20 ml dung d h TAE x 5 g ớc c t

cho v ủ 1000 ml.

- Cho 2g agarose vào 100 ml dung d ch TEA x 1 vào bình nón, l ều,

quay trên lò vi sóng khoả g 5 hú h n khi agarose tan ng nh t hoàn

toàn trong dung d ch.

- Làm giảm nhi dung d ch th ch xuống khoảng 60oC, cho 20l

Ethidium bromide vào l ều t o dung d h ng nh t (l c nhẹ tránh t o bọt).

- th ch kh y i th ch tự g g i ở nhi

phòng sau 60 phút, nh c ra nhẹ nhàng không làm rách các gi ng th ch.

Bước 3: Ki m tra m u trên th ch 2%

- ặt bản th ch vào bu g i n di, theo chiều t cực âm sang cực

d g gi ng cho m u ở phía cực âm. Cho dung d ch TAE ng p trên bản

th ch khoảng 0,5 cm – 1cm.

- Cho thang chu n ADN 100 bp, 1 Kb, các m u PCR ch g d ng,

ch ng âm, m u ki m tra vào các gi g he s :

Gi ng 1 2 4 5 6 N 3

ADN Ch ng Ch ng ADN M u M u 1 M u 2 … 100bp + 1 Kb -

- Thang chu n ADN: 8 l

- M u c i n di: M i m u ki m tra (g m cả m u PCR ch g d g

ch ng âm) l y 12 l tr ều với 3 l dung d h ặt m u, cho vào các gi ng

h s trên.

- Ch y i n di ch y ở i n th 100V, trong 30-60 phút.

- Ki m tra sản ph m ch y i n di bằ g è UV ớc sóng 300 nm,

chụp ảnh bằng máy chụp gel.

Bước 4: Nh nh k t quả

- N u các m u c n xét nghi ă g ở v í g ng, ngang với

v trí m u ch g d g ản th ch d g í h.

- Các m u xét nghi kh g ă g h y x t hi ă g ở những v trí

khác với m u ch g d g ản th ch là âm tính.

b) Phương pháp ác định genotype vi rút Banna bằng kỹ thuật

Sequencing trực tiếp của Sanger [35], [56], [83], [95], [96]

Vật liệu và trang thiết bị:

- B sinh ph m RT-PCR Onse Step của QIAGen, b sinh ph m QIA quick

PCR purification kit của QIAGEN, b sinh ph “DTCS Q i k S Kit giải trình tự gen, b sinh ph m DyExTM2.0 Spin kit cua QIAGEN.

- Pipet bán tự g k h i 0,5 - 10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl

- Pipet tip có lọc các lo i g ng.

- Máy ly tâm l nh y h ờng Eppendorf củ c

- Máy giải trình tự gen CEQ 8000 và các v t li u, dụng cụ c n thi t khác.

Bả g . . D h s h h ự e ide ù g ge h ủ

h số ủ hủ g i s B s dụ g g ghi

Chủng

Năm

Quốc gia

Loại bệnh phẩm

Số đăng ký

GS07KD16

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331956

GS07KD12

2007

Trung Quốc

An. sinensis

GQ331954

GS07KD18

2007

Trung Quốc

An. sinensis

GQ331597

GS07KD38

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331962

GS07KD32

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331961

GS07KD30

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331960

GS07KD29

2007

Trung Quốc

Ae. albopictus

GQ331959

GS07KD27

2007

Trung Quốc

Cx tritae

GQ331958

Chủng

Năm

Quốc gia

Loại bệnh phẩm

Số đăng ký

GS07KD15

2007

Trung Quốc

Cx. tritae

GQ331957

02VN 9b

2002

Vi t Nam

Cx. annulus

EU265682

02VN018b

2002

Vi t Nam

Cx. annulus

EU265694

02VN78b

2002

Vi t Nam

Cx. tritae

EU265705

02VN178b

2002

Vi t Nam

Cx. tritae

EU265715

02VN180b

2002

Vi t Nam

Cx. tritae

EU265727

GS42-2

2006

Trung Quốc

Cx. tritae

FJ160414

LN0688

2006

Trung Quốc

An. sinensis

FJ217990

LN0684

2006

Trung Quốc

An. sinensis

FJ217989

LN0689

2006

Trung Quốc

An. sinensis

FJ217991

JKT-6969

1981

Indonesia

An. vagus

AF052008

JKT-6423

1980

Indonesia

Cx. pseudovishnui

AF019908

JKT-7043

1981

Indonesia

Cx. pipien pallens

AF052024

SX0766

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331964

SX0765

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331963

SX0767

2007

Trung Quốc

Ae. vexans

GQ331965

SX0796

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331972

SX0795

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331971

SX0771

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331966

SX0794

2007

Trung Quốc

Ae. dorsalis

GQ331970

SX0793

2007

Trung Quốc

Cx. pipien pallens

GQ331969

SX0790

2007

Trung Quốc

Ae. vexans

GQ331968

SX0789

2007

Trung Quốc

Ae. dorsalis

GQ331967

Chủng

Năm

Quốc gia

Loại bệnh phẩm

Số đăng ký

YN0659

2006

Trung Quốc

An. sinensis

FJ161965

YN0558

2005

Trung Quốc

Cx. tritae

FJ161964

NM0706

2007

Trung Quốc

Cx. modestus

GQ331973

YN-6

2001

Trung Quốc

Mu i (Không rõ)

AY568290

YN0556

2005

Trung Quốc

Cx. tritae

FJ161966

BJ95-75

1995

Trung Quốc

Mu i (Không rõ)

AY568289

BANNA

1987

Trung Quốc

D h ủy

AF052030

Florio strain

1990

Hoa Kỳ

Huy t thanh b nh nhân

NC004190

(CTF virus)

Kỹ thuật thực hiện tinh sạch sản phẩn PCR

S dụng b sinh ph m QIAquick Gel Extraction Kit của QIAGEN, quy

trình kỹ thu t thực hi he h ớng d n của nhà sản xu t sinh ph m.

B ớc 1: Thu h i sản ph m ADN t th ch bằng cách s dụ g è UV nh

d ng v trí của sản ph m trên th ch, dùng dao mỏng c n th ch có ch a

sản ph m PCR, cho vào tuýp ly tâm 1,8 ml (microcentrifuge) không màu.

B ớc 2: X nh trọ g ng th ch có ch a sản ph m PCR (Trọ g ng của

tuýp có ch a th ch tr i ọ g ng củ ý khi h h ch). Cho 3 th

tích Buffer QG (chu n b he h ớng d n) vào 1 th tích th ch (cách tính theo

công th g ≈ .

B ớc 3: Ủ ở nhi 500C trong thời gi hú h n khi th ch tan

hoàn toàn); Trong quá trình ủ th nh thoảng l c nhẹ hoặc có th tr n bằng máy

Vortex sau 2 - 3 phút ủ.

B ớc 4: Sau khi th h h ki m tra l i màu của dung d ch (có

màu vàng g n giống với dung d ch QG, n u không phải ch nh l i pH bằng

dung d ch Sodium Acetate 3M, pH= 5,0).

B ớc 5: Cho 1 th tích dung d ch Ethanol - Isopropanol nguyên ch t vào tuýp

trên.

B ớc 6: L p c t QIAquick spin vào tuýp 2 ml cung c p trong b kít.

B ớc 7: Hút toàn b dung d ch có ch a ADN trong tuýp ở trên cho vào c t

QIAquick spin và ly tâm ở 13.000 vòng/1 phút.

B ớc 8: Lo i bỏ dung d h y ặt c t QIAquick spin vào tuýp 2 ml

g ự h .

B ớc 9: Cho 0,5 ml dung d ch QG vào c t QIAquick spin và ly tâm ở 13.000

vòng/1 phút.

B ớc 10: Cho 0,75 ml dung d ch PE vào c t QIAquick spin và ly tâm ở

13.000 vòng/1 phút.

B ớc 11: Lo i bỏ dung d h y ặt c t QIAquick spin vào tuýp 2ml và ly

tâm thêm 1 phút ở 13.000 vòng/1 phút.

B ớc 12: ặt c t QIAquick spin vào tube ly tâm 1,8 ml ù g. thu toàn

b ng ADN tinh khi t, cho 50 µl dung d ch EB vào chính giữa c t

QIAquick spin, giữ thẳ g ng trong thời gian 1 phút, ly tâm ở 13.000 vòng/1

phút.  ă g khả ă g h h i l i so với g ADN u, hút 30 µl

dung d ch có ch a ADN s khi y ở l i c QIAq i k s i thẳng

ng trong 1 phút và ly tâm ở 13.000 vòng/1 phút.

B ớc 13: Ki m tra l i sản ph m DNA tinh khi t trên th ch 1,5 %.

Thực hiện phản ứng để giải trình tự gen bằng bộ sinh phẩm “DTCS Quick

Start Kit”

Sản ph m tinh s ch củ n gen số 12 củ i ú B c s dụng

làm khuôn, thực hi n phản ng giải trình tự gen bằng m t lo i m i xuôi,

hoặc m i g c củ n gen số 12.

Chu n b phản ng trong tuýp PCR 0,2 ml hoặ ĩ 96 gi ng với công

th c cho m t phản g h s :

Thành phần Cho một ph n ứng

1. DTCS Quick Start Master Mix 8 µl

2. ADN/cDNA khuôn 0,5 – 10,0 µl

3. M i ặc hi u (1,6 pmol/µl hoặc 1,6 µM) 2,0 µl

4. N ớc c iều ch nh t ng th tích phản 9,5 – 0 µl

g n 20 µl)

Tổng thể tích 20 µl

Ch g h phản ng giải trình tự gen:

960C 20 giây

500C 20 giây 30 chu kỳ

600C 4 phút

Giữ ở 100C K t thúc

Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm giải trình tự gen

Thu sản ph m giải trình tự gen ở gi i n trên, lo i bỏ các thành ph n

th a bằ g h g h e h y t trong nhữ g h g h i h

s ch sản ph m giải trình tự gen r giản, chi phí h p lý.

B ớc 1: Chu n b ý 5 kh trùng, số ng ố g g g ới

số ng m u c n tinh s ch).

B ớc 2: Thêm vào m i tuýp 0,5 ml h n h p dung d ch d ng phản ng (Stop

Solution) với các thành ph n và th í h h s :

3M Natri Acetate pH 5,2 2 µl

2 µl 100mM Na2EDTA pH 8,0

20mg/ml Glycogen (Cung c p kèm theo DTCS Quick Start Kit) 1 µl

B ớc 3: Chuy n toàn b dung d ch phản ng PCR giải trình tự vào tuýp lo i

5 h n h p dung d ch d ng (Stop Solution) và l c bằng vortex trong

vài giây.

B ớc 4; Thêm vào m i tuýp 60 µl ethanol l h 95 % e h ở – 200C), l c bằng vortex và ly tâm với tố 14.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C.

Hút bỏ dung d ch nhẹ nhàng giữ l i sản ph m PCR giải trình tự ở y ý .

B ớc 5: R a sản ph m PCR giải trình tự bằng cách thêm 200 µl ethanol l nh 7 % e h ở - 200C) và ly tâm với tố 14.000 vòng/ phút trong 2 phút ở 40C, hút bỏ dung d ch nhẹ nhàng (Bước này được thực hiện 2 lần).

B ớc 6: Làm khô m u bằng máy ly tâm chân không trong 10 phút ở nhi

phòng thí nghi m.

B ớc 7: L ng nh t sản ph m PCR giải trình tự g 4 µ SLS c

cung c p kèm theo DTCS Quick Start Kit).

Kỹ thuật chuẩn bị mẫu để đặt vào máy giải trình tự gen

B ớc 1: Chuy n toàn b dung d h ng nh t sản ph m PCR giải trình tự

trong 40 µl SLS t ớc tinh s ch vào gi g g g ĩ h y m u

(Sample plate).

B ớc 2: Nhỏ m t giọt d i e i tránh m u b y h i.

B ớc 3: ặ ĩ y Seq e i g ối h h g số của máy, cài

ặt các thông số cho phân tích k t quả giải trình tự.

Kỹ thuật làm sạch kết quả giải trình tự gen

Khi quá trình giải trình tự gen k t thúc, trình tự e ide c phân

tích, làm s ch qua các thông số của ph n mề i kè he y Seq e i g

(Ch g ọc các nucleotide, phát hi n SNP là tr g h i d ng ki u

nucleotide t i m t v í ge … .

2.5. Thống kê toán học và một số phần mềm tin sinh học sử dụng trong

phân tích về đặc điểm phân tử của các chủng vi rút Banna

2.5.1. Thống kê toán học:

Các số li u trong nghiên c u này c nh p và phân tích dữ li u bằng

ph n mềm thố g k MS Ex e E iI if STATA ảm bả tin c y và

tính khách quan của k t quả nghiên c u.

2.5.2. Sử dụng các phần mềm tin sinh học

Các ph n mề c s dụ g h : Ph n mềm GraphPad, ph n mềm

sinh họ DNAS L sege e MEGA 4. ….

Cây di truyền phả h các chủng vi rút B c vẽ bằ g h g

pháp Neibour-Joining với giá tr tính ph ă sự lặp l i; Chủng vi rút

C d i k fe e ặ i di yề g ự h i rút B d ới

8 % họ hủ g g i h ẽ y di yề hả h . Trình tự

ù g ge h h số ủa các chủ g i ú B kh h c

so sánh và s p x h ự bằ g h g h C s W sở tính

toán ma tr n về sự g ng nucleotide giữa các chủng vi rút Banna và xây

dựng cây di truyền phả h ủ hủ g i ú B he h ng pháp Neibour-Joining, UPGMA... [56], [95], [96]

Hình 2.1. Quy trình xây dựng cây di truyền phả hệ các chủng vi rút Banna

2.6. Chấp thuận về đạo đức trong nghiên cứu y sinh

Nghiên c y c sự ch p thu n của H i g c trong

nghiên c u y sinh mã số ch p thu n cho nghiên c u: Số H g y 5

h g ă .

2.7. Hạn chế khi thiết kế nghiên cứu

- Nghiên c u về m t số ặ i m d ch tễ học HCNC do vi rút Banna mới

ch có nghiên c i q n huy t thanh b nh nhân, còn nghiên c u về

d ch tễ học, véc yền b nh, d ch tễ huy t thanh học sự h h i ú

B ối với ch a vi rút g g ời h ề c n.

- D ặ i m HCNC nghi ngờ do vi rút chủ y c ghi nh n ở miền B c,

vi c s h g h g h y m u thu n ti n nên số ng m u không

giống nhau ở các khu vực nghiên c u: Miền B c, miền Trung, miền Nam

và Tây Nguyên.

- Các nghiên c g ớ i q ĩ h ực d ch tễ học của vi rút

Banna còn nghèo nàn, ít có số li tham khảo, s s h. ặc bi t sinh

ph m ch h y t thanh h h g i, ch có sinh ph m

ch là kháng nguyên tinh ch c cung c p t Khoa Vi rút, Vi n Y

học lâm sàng Nhi ới, ờ g i học Nagasaki cho thi t k kỹ thu t

ELISA gián ti p IgM.

Chương III

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng của bệnh nhân hội

chứng não cấp nghi ngờ do vi rút Banna ở một số địa phương của

Việt Nam, 2002 - 2012

3.1.1. Mô tả tỷ lệ số mắc của bệnh nhân HCNC do vi rút Banna

Bảng 3.1. Kết quả loại trừ căn nguyên vi rút VNNB và vi rút ECHO 30 trong số các trường hợp HCNC nghi ngờ do vi rút, 2002 – 2012

Số mẫu DNT xét nghiệm Số mẫu DNT chưa xác định được nguyên nhân

Số mẫu DNT dương tính với các tác nhân đã biết bao gồm VNNB và ECHO30 và vi rút herpes simplex type 1 và type 4

1.285 568 717

Trong số 1.285 mẫu dịch não tủy được xác định là HCNC nghi ngờ do

vi rút, hồi cứu và tiến cứu các kết quả xét nghiệm để xác định nguyên nhân vi

rút VNNB, ECHO 30 và herpes simplex type 1, 4 gây HCNC, đã xác định có

568 bệnh nhân được xác định căn nguyên vi rút gây HCNC, còn 717 bệnh

nhân chưa được xác định căn nguyên. Trong nghiên cứu này dịch não tủy của

717 bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút chưa xác định căn nguyên được sử

dụng để phát hiện IgM kháng vi rút Banna bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp

phát hiện IgM với kháng nguyên tinh chế được cung cấp từ Khoa Vi rút, Viện

Y học Lâm sàng Nhiệt đới, Trường Đại học Nagasaki Nhật Bản.

Bảng 3.2. Kết quả xác định IgM kháng vi rút Banna

trong dịch não tủy bệnh nhân HCNC, 2002 – 2012

Khu vực Tỉnh

Số mẫu xét nghiệm 216 Số mẫu dương tính 30 Tỷ lệ (+) (%) 13,63 Bắc Giang

Hà Tây (cũ) 120 43 35,83

Miền Bắc Hà Nội 50 17 34,00

Hải Phòng 48 11 22,92

Thái Bình 108 36 33,33

Thanh Hóa 65 21 32,31

Miền Trung Huế 18 4 22,22

Tây nguyên Gia Lai 20 5 25,00

Miền Nam Long An 72 17 23,61

Tổng số 717 184 25,66

C 717 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút

thuộc 9 tỉnh thành phố trong hoảng thời gian 2002 – 2012 (đã loại trừ căn

nguyên vi rút VNNB, ECHO 30, herpes simplex type 1 và type 4 gây HCNC),

bằng ỹ thuật E IS gián tiếp phát hiện Ig háng vi rút Banna từ các mẫu

dịch não tủy, ết quả xác định c 184 mẫu dương tính, tỷ lệ trung b nh các

mẫu dịch não tủy phát hiện c Ig háng vi rút Banna là 25,66 . Nếu tính

trên tổng thể 1.285 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút

tỷ lệ xác định dương tính với vi rút Banna sẽ là 14,32% (184/1.285).

Trong số 9 tỉnh thành phố c mẫu bệnh ph m x t nghiệm, tỷ lệ xác

định dương tính dao động trong hoảng 13,83 - 35,83 . Tỉnh thành phố c

mẫu x t nghiệm dương tính cao nhất ở tỉnh Hà Tây cũ là 35,83 , tiếp đến là

Hà Nội có tỷ lệ xác định dương tính với kháng nguyên vi rút Banna là

34,00 Tỷ lệ xác định dương tính thấp nhất với háng nguyên vi rút Banna

là 13,63 ở tỉnh Bắc Giang.

Hình 3.1. Sự phân bố theo tháng các trường hợp HCNC

xác định do vi rút Banna, 2002 – 2012

Theo kết quả giám sát huyết thanh học, HCNC do vi rút được ghi nhận

xảy ra quanh năm, nhưng số mắc được ghi nhận chủ yếu trong các tháng 5, 6

và 7, đỉnh cao của dịch được ghi nhận trong tháng 6 với số mắc được ghi nhận

là 239/717 (chiếm 33,33 % tổng số mắc). Bằng kỹ thuật ELISA IgM gián

tiếp, các trường hợp HCNC xác định dương tính với kháng nguyên vi rút

Banna được ghi nhận quanh năm, nhưng số các mắc được ghi nhận chủ yếu

trong các tháng 5, 6 và 7, số mắc cao nhất được ghi nhận trong tháng 6 là

64/184 (chiếm 34,78 % tổng số các trường hợp dương tính).

Bảng 3.3. Tỷ lệ xác định theo tuổi của HCNC do vi rút Banna, 2002 - 2012

Nhóm tuổi <1 1 - 4 5 - 9 10 - 14 ≥15 Tổng số

Số mẫu x t 61 159 183 141 173 717 nghiệm

Số mẫu 11 35 44 42 52 184 dương tính

Tỷ lệ (+)

18,03 22,01 24,04 29,79 30,06 25,6

theo tuổi (%)

Các mẫu dịch não tủy được thu thập tại một số bệnh viện thuộc miền

Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên, ở mọi lứa tuổi trong các năm

2002 – 2012, các mẫu dịch não tủy này đã được loại trừ căn nguyên vi rút

VNNB, ECHO 30 và herpes simplex type 1 và type 4 gây HCNC tương ứng

bằng kỹ thuật MAC – ELISA, kỹ thuật phân lập và PCR.

Sử dụng kỹ thuật ELISA IgM gián tiếp để phát hiện IgM kháng vi rút

Banna từ 717 mẫu dịch não tuỷ này, xác định c 184 trường hợp dương tính

với kháng nguyên vi rút Banna, tỷ lệ xác định dương tính trung b nh là 25,6 .

Các trường hợp xác định HCNC do vi rút Banna được ghi nhận ở tất cả các

nhóm tuổi, tỷ lệ xác định dương tính theo nh m tuổi dao động 18,03 % -

30,06%. Cụ thể tỷ lệ xác định dương tính HCNC do vi rút Banna ở nhóm trẻ

< 1 tuổi là 18,03 %; Ở nhóm 1 - 4 tuổi là 22,01 %, 5- 9 tuổi là 24,04 %, 10 –

14 tuổi là 29,79 % và trên 15 tuổi là 30,06 %.

Bảng 3.4. Tỷ lệ số mắc HCNC do vi rút Banna theo nhóm tuổi, 2002 – 2012

<1 1 - 4 5 - 9 10 - 14 ≥ 15 Tổng Nhóm tuổi n = 61 n = 159 n = 183 n = 141 n = 173 số

Số mẫu (+) 11 35 44 42 52 184

Tỷ lệ số mắc theo nh m tuổi 5,98 19,02 23,91 22,83 28,26 100

(%)

Trong số 717 trường hợp HCNC nghi ngờ do vi rút đã loại trừ căn

nguyên vi rút VNNB, ECHO 30 và herpes simplex type 1 và type 4 gây

HCNC, bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện IgM, kết quả xác định có

184 trường hợp dương tính với kháng nguyên vi rút Banna, các trường hợp

xác định dương tính được ghi nhận ở tất cả các nhóm tuối bao gồm <1 tuổi, 1

– 4 tuổi, 5 – 9 tuổi, 10 -14 tuổi và ≥ 15 tuổi. Các nhóm tuổi khác nhau, tỷ lệ

số mắc HCNC do vi rút Banna cũng hác nhau, dao động 5,98 % – 28,26 %.

Trong đ tỷ lệ số mắc HCNC do vi rút Banna ở trẻ dưới 1 tuổi là thấp nhất

chiếm 5,98 %; Còn tỷ lệ số mắc HCNC do vi rút Banna ở nhóm tuổi ≥ 15 là

cao nhất chiếm 28,26 %. Các nhóm tuổi 1 – 4, 5 – 9 và 10 – 14 tỷ lệ số mắc

tương ứng là 19,02 %, 23,91% và 22,83%.

Hình 3.2. Tỷ lệ số mắc HCNC do vi rút Banna phân bố theo giới

Trong số 184 trường hợp HCNC xác định do vi rút Banna, có 39,13 %

trường hợp được xác định từ bênh nhân nữ (72 184), c 60,87 trường hợp

được xác định từ bệnh nhân nam (112 184), như vậy tỷ lệ số mắc HCNC do

vi rút Banna ở nam cao hơn nữ đối với mọi lứa tuổi.

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân HCNC do vi rút Banna

Bảng 3.5. Thông tin chung về bệnh nhân HCNC do vi rút Banna

3.1.2.1. Một số tiêu chí, dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng khi nhập viện

N % Tiêu chí

67 65,00 Nam Giới

36 35,00 Nữ

34 33,00 <5 Tuổi

69 67,00 5 – 15

Trong, không màu 103 100 %

Chỉ số n

Khoảng dao động

Protein (mg/dL) 103 Giá trị trung bình 1,07 0,1 – 10,9

Đường (mg/dL) 103 3,23 0,1 – 7,9 Màu sắc dịch não tủy Xét nghiệm sinh hóa dịch não tủy

Xét nghiệm Pandy Dương tính 103

103 220,7 1 – 850

Số lượng bạch cầu (tế bào/ml)

Neutrophil % (tế bào/µl) 53 17,38 1 – 83

Lympho (tế bào/µl) 94 54,73 1 – 124

Monocyte (tế bào/µl) 92 25,72 4 - 68

Trong số 184 bệnh nhân HCNC có xét nghiệm dịch não tủy phát hiện

kháng thể Ig dương tính với kháng nguyên vi rút Banna, có 103 bệnh nhân

điều trị ở bệnh viện Nhi Trung ương (2001 – 2008). Bệnh án của 103 bệnh

nhân được điều tra hồi cứu để phân tích một số thông tin cho thấy số mắc

HCNC do vi rút Banna ở nam giới chiếm hoảng trên 64 tổng số mắc.

Phần lớn các trường hợp bị HCNC do vi rút Banna được ghi nhận ở trẻ 5 – 15

tuổi. Trong đ xác định vi rút Banna ở số bệnh nhân đã được tiêm vắc xin

VNNB là 63,1%, số bệnh nhân chưa được tiêm phòng vắc xin VNNB là

36,9%.

Đặc điểm về dịch não tủy và các chỉ số xét nghiệm sinh hóa: Kết quả

hồi cứu bệnh án cho thấy 103 bệnh nhân có mẫu dịch não tủy trong, không

màu, các chỉ số xét nghiệm sinh hóa dịch não tủy mang đặc trưng chung của

các trường hợp HCNC do vi rút, 100 % các mẫu dịch não tủy đều có kết quả

xét nghiệm Pandy dương tính.

Bảng 3.6. Một số thông tin chung HCNC do vi rút Banna, so sánh với HCNC do ECHO30 và VNNB ở trẻ em tại một số bệnh viện

Tiêm vắc xin Giới Tuổi Thông tin VNNB

Nam

Nữ

< 5

5-15

Có

Không

67 (65,0)

36 (35,0)

34 (33,0)

69 (67,0)

65 (63,1)

38 (36,9)

29 (67,4)

14 (32,6)

13 (30,2)

30 (69,8)

24 (55,8)

19 (44,2)

103 ca nhiễm vi rút Banna

43 ca nhiễm vi rút ECHO30

38 (64,4)

21 (35,6)

22 (33,9)

37 (62,7)

10 (16,9)

49 (83,1)

59 ca nhiễm vi rút VNNB

Tổng số ca 205 205 205

Điều tra hồi cứu 205 bệnh án của bệnh nhân HCNC ở bệnh viện Nhi

Trung ương và bệnh viện Đa hoa tỉnh Bắc Giang từ năm 2001 đến năm 2008

có kết quả xét nghiệm xác định tác nhân gây bệnh trong đ c 103 bệnh nhân

HCNC do vi rút Banna, 43 bệnh nhân HCNC do vi rút ECHO30 và 59 bệnh

nhân HCNC do vi rút VNNB.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, số mắc HCNC do các tác nhân vi rút khác

nhau chiếm hoảng trên 64 tổng số mắc ở nam giới. Trong số các trường

hợp bệnh nhân bị HCNC, trung bình có 48,3 % số bệnh nhân đã được tiêm

vắc xin VNNB nhưng phần lớn những trường hợp đã tiêm vắc xin VNNB

không bị HCNC do vi rút VNNB. Tuy nhiên, vẫn có 16,9% số trường hợp có

tiền sử tiêm vắc xin VNNB vẫn bị HCNC do vi rút VNNB chủ yếu ở nhóm

trẻ trên 5 tuổi. Đối với HCNC do vi rút Banna và vi rút ECHO30 tương ứng

có 63,1 % và 55,8 % số trường hợp đã tiêm vắc xin VNNB bị HCNC do hai

loại tác nhân vi rút này.

Bảng 3.7. Một số dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân khi nhập viện

Dấu hiệu, triệu chứng

Vi rút BANNA n=103 (%)

Vi rút ECHO30 n=43 (%)

Vi rút VNNB (n=5) (%)

Kiểm định tỷ lệ BANNA và ECHO30 p1

Kiểm định tỷ lệ Banna và VNNB p2

30,51 <0,0001 0,0252 Đau đầu 48,54 88,37

28,81 <0,0001 0,6685 Nôn 32,04 86,05

61,02 0,0001 0,0003 Co giật 32,04 2,33

0,2659 Buồn nôn 1,94 30,23 5,08 <0,0001

0 - - 0 Đau cơ 0

0 - - 0 Đau hớp 2,33

78,64 74,42 81,36 0,5784 0,6791

Sốt > 37,5oC

Dấu hiệu, triệu chứng

Vi rút BANNA n=103 (%)

Vi rút ECHO30 n=43 (%)

Vi rút VNNB (n=5) (%)

Kiểm định tỷ lệ BANNA và ECHO30 p1

Kiểm định tỷ lệ Banna và VNNB p2

23,30 2,33 0 0,0022 -

Thóp phồng

Cứng gáy 77,45 39,53 50,85 <0,0001 0,0005

34,88 38,98 0,0002 0,0003 67,96

Dấu hiệu Kernig

81,55 11,63 88,14 <0,0001 0,2715

Rối loạn tâm thần

18,63 4,65 23,73 0,0288 0,4390

Giảm vận động

0 0 6,78 - -

Mất cảm giác

Phân tích triệu chứng lâm sàng bệnh nhân HCNC khi nhập viện cho

thấy, hầu hết có triệu chứng điển hình của HCNC như đau đầu, nôn, co giật,

sốt cao trên 37,5 độ, thóp phồng, cứng gáy, dấu hiệu Kernig, rối loạn tâm thần

và giảm vận động xuất hiện ở bệnh nhân mới nhập viện nhiễm vi rút Banna

với tỷ lệ cao từ 23,3% đến 78,64%; Nhưng đau cơ, đau hớp và mất cảm giác

không thấy xuất hiện.

Khi so sánh triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm vi rút Banna với

vi rút ECHO30 và vi rút VNNB cho thấy có sự khác biệt c ý nghĩa thống kê

giữa tỷ lệ thóp phồng (23,3%), cứng gáy (77,45%) và dấu hiệu Kernig

(67,96%) nhiều hơn so với bệnh nhân nhiễm vi rút ECHO30 và vi rút VNNB.

Đặc biệt triệu chứng thóp phồng chủ yếu chỉ được ghi nhận ở bệnh nhân

nhiễm Banna vi rút và ít xuất hiện ở bệnh nhân bị HCNC do vi rút ECHO30

và đặc biệt không được ghi nhận ở bệnh nhân nhiễm vi rút VNNB.

3.1.2.2. Một số dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng trong khi điều trị

Bảng 3.8. Các dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng sau 7 ngày điều trị bệnh nhân

nhiễm vi rút Banna so sánh với nhiễm ECHO30 và VNNB

Kiểm định tỷ lệ do vi rút Banna và ECHO30

Kiểm định tỷ lệ do vi rút Banna và VNNB

Triệu Chứng

Vi rút BANNA (n=103) %

Vi rút ECHO30 (n=43) %

Vi rút VNNB (n=59) %

7,77 0,97 0,97 0 0,97 0 8,74 1,94 4,65 2,33 0 0 0 2,33 6,98 0 30,51 0 0 0 0 0 11,86 0

p1 0.4964 0,4882 - - - - 0,7242 -

p2 0,0001 - - - - - 0,5218 -

15,53 13,59 6,98 4,65 15,25 8,47 0,1616 0,1149 0.9621 0.3297

55,34 0 11,86 - <0,0001

2,91 0 6,78 - 0,2436

0,97 - - - -

Đau đầu Nôn Co giật Buồn nôn Đau cơ Đau hớp Sốt >37,5o Thóp phồng Cứng gáy Dấu hiệu Kernig Rối loạn tâm thần Giảm vận động Mất cảm giác

Sau 7 ngày điều trị, các triệu chứng HCNC do các tác nhân vi rút khác

nhau c xu hướng thuyên giảm ở tất cả các bệnh nhân. Tuy nhiên, các triệu chứng như đau đầu, sốt (>37,50C), cứng gáy, dấu hiệu Kernig vẫn còn ghi

nhận ở bệnh nhân nhiễm vi rút Banna, vi rút ECHO và vi rút VNNB.

Các triệu chứng như co giật, đau cơ, đau hớp, thóp phồng, mất cảm

giác chỉ còn ở một số ít bệnh nhân (1-2 bệnh nhân) thuộc nhóm nhiễm vi rút

Banna. Trong đ , co giật, đau cơ, th p phồng và mất cảm giác chỉ xuất hiện ở

bệnh nhân nhiễm vi rút Banna. Đau khớp chỉ xuất hiện ở bệnh nhân nhiễm vi

rút ECHO30.

Đối với đấu hiệu Kernig, nhóm nhiễm vi rút Banna vẫn còn ghi nhận

một tỷ lệ cao là 13,59 . Ngược lại nh m nhiễm vi rút VNNB là 8,47 và

nhóm nhiễm vi rút ECHO30 chỉ còn 4,65 . Đối với bệnh nhân rối loạn tâm

thần, h ng còn được ghi nhận ở nhóm nhiễm vi rút ECHO30, nhưng ở nh m

nhiễm vi rút Banna c một tỷ lệ rất cao 55,34 trong hi đ ở nh m nhiễm

vi rút VNNB chỉ 11,86 .

Còn đối với triệu chứng giảm vận động, ở nhóm nhiễm vi rút Banna là

2,91%, nhóm nhiễm vi rút VNNB là 6,78% và triệu chứng buồn nôn không

xuất hiện sau 7 ngày điều trị ở tất cả các bệnh nhân trong nghiên cứu này.

3.1.2.3. Kết quả sau điều trị HCNC do vi rút Banna

Bảng 3.9. Số ngày điều trị HCNC do vi rút trung bình tại bệnh viện

Tác nhân Thời gian Thời gian Thời gian tối đa Gây HCNC trung bình (ngày) tối thiểu

Vi rút Banna 13,5 1

Vi rút ECHO30 7,4 3

Vi rút VNNB 11,3 1 85 23 39

F=5,21, =0,0062 Kiểm định Bartlett’s ta c P<0,0001

Kết quả cho thấy thời gian điều trị trung b nh và thời gian điều trị tối đa

của nhiễm vi rút Banna là 13,5 ngày và 85 ngày, đây là hoảng thời gian điều

trị dài nhất so với nhiễm vi rút VNNB và vi rút ECHO30. Thời gian điều trị

trung b nh đối với hai loại vi rút này là 11, 3 ngày và 7,4 ngày. Sự khác nhau

về thời gian điều trị của bệnh nhân nhiễm vi rút Banna khi so sánh với bệnh

nhân nhiễm vi rút VNNB và vi rút ECHO30 c ý nghĩa thống kê với P

<0,0001.

Bảng 3.10. Kết quả sau điều trị nhiễm vi rút Banna

Tác nhân gâ CNC Số CNC Số t vong sau đi u t ị Tỷ lệ (%)

Vi rút Banna 103 15 14,6

Vi rút ECHO30 43 0 0

Vi rút VNNB 59 1 1,7

Tổng số 205 16 7,8

Kết quả điều tra hồi cứu cho thấy, trong tổng số 205 trường hợp HCNC

do vi rút Banna, ECHO30 và VNNB, c 16 trường hợp tử vong sau điều trị.

Trong đ tử vong do nhiễm vi rút Banna là 15 16 trường hợp, tỷ lệ tử vong

của HCNC do vi rút Banna là 14,6 (15 103), tiếp đến tỷ lệ tử vong do vi rút

VNNB là 1,7 (1 59). Ngược lại, h ng c trường hợp tử vong nào được ghi

nhận do vi rút ECHO30.

3.2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút Banna trong quần thể muỗi thu thập

tại một số địa phương ở Việt Nam.

3.2.1. Kết quả thu thập muỗi t ong các năm 2001-2011

Bảng 3.11. Kết quả thu thập muỗi ở 5 tỉnh miền Bắc, 2001-2011

TT Số mẫu muỗi

Loài

Số cá thể 10 Tỷ lệ (%) 0,06 0 ( uỗi chết) 1 Ae. albopictus

146 0,85 0 ( uỗi chết) 2 An. hyncanus

157 0,91 0 ( uỗi chết) 3 An. subgroup

TT Số mẫu muỗi

Loài

Số cá thể 234 Tỷ lệ (%) 1,36 0 ( uỗi chết) 4 An. tesellatus

114 0,66 4 5 An. vagus

104 0,60 0 ( uỗi chết) 6 Ar. magnus

149 0,87 9 7 Ar. subalbatus

13.916 80,93 551 8 Cx.tritaeniorhynchus

1 0,01 0 ( uỗi chết) 9 Cx. bitaeniorhynchus

625 3,63 0 ( uỗi chết) 10 Cx. fatigans

8 0,05 9 11 Cx. fuscocephalus

3 0,02 33 12 Cx. gelidus

2 0,01 0 ( uỗi chết) 13 Cx. pallidothorax

19 0,11 6 14 Cx. pseudovishnui

222 1,29 32 15 Cx. quinquefaciatus

1.333 7,75 100 16 Cx. vishnui

9 0,05 0 ( uỗi chết) 17 Cx. whitmorei

144 0,84 0 ( uỗi chết) 18 Mx. indiana

17.196 100,00 744 Tổng cộng

Thu thập muỗi được thực hiện từ năm 2001-2011 chủ yếu ở 5 tỉnh

thuộc miền Bắc bao gồm: Bắc Giang, Lạng Sơn, Hà Tây (nay là Hà Nội),

Thái Bình, Hà Nam trong các tháng 3 - 12. Kết quả có 17.196 cá thể muỗi của

18 loài được thu thập, nhưng c 10 loài muỗi thu thập được bị chết nên không

sử dụng để phân lập vi rút, có 8 loài muỗi còn sống được chia ra 744 mẫu

muỗi để lưu giữ phân lập vi rút, trong đ chiếm ưu thế cao nhất là Cx.

triaeniorhynchus với tỷ lệ 80,93% cá thể muỗi, tiếp đến là Cx. vishnui chiếm

tỷ lệ 7,75%, còn 16 loài khác tỷ lệ thu thập được muỗi rất thấp dao động trong

khoảng 0,06 – 3,63%. Riêng tại Bắc Giang thu thập được 02 cá thể muỗi Cx.

pallidothorax và 01 cá thể muỗi Cx. bitaeniorhynchus.

Bảng 3.12. Kết quả thu thập muỗi ở Quảng Bình, miền Trung, 2001-2011

Số mẫu muỗi

Số cá thể Loài

1.472 Tỷ lệ cá thể (%) 58,79 11

54 2,16 1

47 1,88 2

66 2,64 1

865 34,54 9 TT 1 Cx.tritaeniorhynchus 2 Cx. fuscocephalus 3 Cx. gelidus 4 Cx. quinquefaciatus 5 Cx. vishnui

Tổng cộng 2.504 100,00 24

Trong giai đoạn 2001 – 2011, thu thập muỗi tại Quảng Bình, miền

Trung được thực hiện chủ yếu trong các năm 2001 – 2003 và 2008 -2011, thời

điểm thu thập muỗi trong các tháng 3, 6, và 9. Kết quả có 2.504 cá thể của 5

loài muỗi được chia ra 24 mẫu muỗi, lưu giữ để phân lập vi rút, trong đ Cx.

triaeniorhynchus chiếm ưu thế, có tỷ lệ thu thập cao nhất 58,79%, gồm có

1.472 cá thể muỗi. Tiếp theo là Cx. vishnui chiếm tỷ lệ 34,54% gồm 865 cá

thể muỗi, các loài khác chiếm tỷ lệ thấp hơn bao gồm: Cx. quinquefatigans

(2,64%), Cx. quinquefaciatus (2,64%) và Cx. gelidus (1,88%).

Bảng 3.13. Kết quả thu thập muỗi ở 4 tỉnh Tây Nguyên, 2004-2011

TT Loài Số cá thể Số mẫu muỗi

1 Cx.tritaeniorhynchus 2 Cx. fuscocephalus 3 Cx. gelidus 4 Cx. pseudovishnui 5 Cx. quinquefaciatus 3.731 342 975 53 864 Tỷ lệ cá thể (%) 46,95 4,30 12,27 0,67 10,87 53 8 18 0 (Muỗi chết) 16

Loài Số cá thể TT Số mẫu muỗi

6 Cx. vishnui 7 Cx. whitmorei 8 Mx. uniformis Tổng cộng 1.872 66 43 7.946 Tỷ lệ cá thể (%) 23,56 0,83 0,54 123 28 0 (Muỗi chết) 0 (Muỗi chết) 100,00

Thu thập muỗi được thực hiện trong các năm 2004 - 2011 tại 4 tỉnh

Đắk Lắ , Đắk Nông, Gia Lai, Kon Tum ở khu vực Tây Nguyên trong các

tháng 3, tháng 6 và tháng 9.

Kết quả có 7.946 cá thể muỗi của 8 loài được thu thập, nhưng c 3 loài

muỗi bị chết sau khi thu thập nên không sử dụng để phân lập vi rút, chỉ có 5

loài muỗi còn sống được chia ra 123 mẫu muỗi lưu giữ để phân lập vi rút,

trong đ Cx. triaeniorhynchus chiếm ưu thế và có tỷ lệ cao nhất (46,95%)

gồm 3.731 cá thể muỗi. Tiếp theo là Cx. vishnui chiếm tỷ lệ 23,56% gồm

1.871 cá thể muỗi, các loài khác chiếm tỷ lệ thấp hơn bao gồm: Cx. gelidus

(12,27%), Cx. quinquefatigans (10,87%), còn 4 loài muỗi khác chiếm tỷ lệ

thấp dưới 1%.

Bảng 3.14. Kết quả thu thập muỗi ở hai tỉnh miền Nam, 2005-2007

TT Loài Số cá thể Số mẫu muỗi

1 Cx.tritaeniorhynchus 2.675 Tỷ lệ cá thể (%) 6,84 27

2 Cx. citiens 13 0,03 0 (Muỗi chết)

3 Cx. gelidus 2.369 6,06 17

4 Cx. pseudovishnui 29.145 74,51 88

5 Cx. quinque fatigans 4.912 12,56 68

Tổng cộng 39.114 100,00 200

Thu thập muỗi được thực hiện trong năm 2005 từ tháng 1 đến tháng 12

ở hai tỉnh Cần Thơ, ong n, miền Nam, kết quả có 39,114 cá thể muỗi của 5

loài muỗi được thu thập, trong đ c một loài muỗi sau khi thu thập đã bị

chết, chỉ có 4 loài muỗi còn sống được chia thành 200 mẫu muỗi lưu giữ để

phân lập vi rút.

Trong tổng số muỗi thu thập được, Cx. pseudovishnui chiếm ưu thế và

có tỷ lệ cao nhất (74,51%) gồm 29.145 cá thể muỗi. Tiếp theo Cx. quinque

fatigans chiếm tỷ lệ là 12,56%, còn 3 loài muỗi khác chiếm tỷ lệ dưới 10%.

Trong nghiên cứu này chỉ thu thập được 13 cá thể muỗi Cx. citiens ở Long An

(chiếm tỷ lệ 0,03%), đây cũng là những cá thể muỗi duy nhất được thu thập ở

Long An.

3.2.2. Kết quả phân lập vi rút Banna từ các mẫu muỗi thu thập

Bảng 3.15. Các chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Bắc

Loài muỗi

Số mẫu phân lập 4 Số chủng vi rút Banna phân lập 2 An. vagus Tỷ lệ phân lập (%) 50

Ar. subalbalus 9 22,22 2

Cx. pseudovishnui 6 0 -

Cx. quinque faciatus 32 3,125 1

Cx. fuscocephalus 9 11,11 1

Cx. Gelidus 33 0 -

Cx. tritaeniorhynchus 551 0,907 5

Cx. vishnui 100 1 1

Tổng cộng 744 1,61 12

Trong các năm 2001 – 2011, có 744 mẫu muỗi của 8 loài muỗi thu thập

được ở 5 tỉnh ở miền Bắc được lưu giữ để phân lập vi rút Banna, kết quả có

12 chủng vi rút Banna được phân lập từ 6 loài muỗi bao gồm An. vagus, Ar.

subalbalus, Cx. quinquefaciatus, Cx. fuscocephalus, Cx. tritaeniorhynchus và

Cx. vishnui. Tỷ lệ phân lập được vi rút Banna trung bình trên tổng số 744 mẫu

muỗi thu thập được ở một số tỉnh miền Bắc trong các năm 2001 – 2011 là

1,61% (12/744).

Trong số các chủng vi rút Banna được phân lập từ muỗi, phần lớn các

chủng vi rút Banna được phân lập từ loài muỗi Cx. tritaeniorhynchus (5/12

chủng). Trong nghiên cứu này, vi rút Banna chưa phân lập được từ hai loài muỗi

Cx. pseudovishnui, Cx. gelidus thu thập ở miền Bắc trong các năm 2001 – 2011.

ặc dù các mẫu muỗi được thu thập trong các thời điểm hác nhau để

phân lập vi rút, nhưng các mẫu dương tính từ muỗi ở miền Bắc được ghi nhận

trong các tháng 3, tháng 5 và tháng 6 ở miền Bắc Việt Nam.

Bảng 3.16. Các chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Trung

Tỷ lệ phân

Loài muỗi

Số mẫu phân lập Số chủng phân lập

lập (%)

Cx. quinque faciatus 1 0 -

Cx. fuscocephalus 1 0 -

Cx. gelidus 2 0 -

Cx. tritaeniorhynchus 11 18,18 2

Cx. vishnui 9 22,22 2

Tổng 24 16,67 4

Trong các năm 2001 – 2011, có 24 mẫu muỗi của 5 loài muỗi thu thập

được ở tỉnh Quảng Bình, miền Trung để phân lập vi rút Banna, kết quả có 4

chủng được phân lập từ 2 loài muỗi Cx. tritaeniorhynchus và Cx. vishnui. Tỷ

lệ phân lập được vi rút Banna trung bình trên tổng số 24 mẫu muỗi thu thập

được ở tỉnh Quảng Bình là 16,67% (4/24).

Trong nghiên cứu này, vi rút Banna chưa phân lập được từ 4 mẫu muỗi

của ba loài muỗi Cx. quinque faciatus, Cx. fuscocephalus, Cx. gelidus c thể

do số lượng mẫu thu thập quá ít.

Các ết quả dương tính từ mẫu muỗi thu thập ở miền Trung được ghi

nhận trong tháng 3 và tháng 8.

Bảng 3.17. Các chủng vi rút Banna phân lập được ở Tây Nguyên

Loài muỗi Số mẫu phân lập Số chủng phân lập Tỷ lệ phân lập (%)

Cx. quinque faciatus 16 3 18,75

Cx. fuscocephalus 8 1 12,5

Cx. gelidus 18 1 5,55

Cx. tritaeniorhynchus 53 2 3.77

Cx. vishnui 28 3 10,7

Tổng 123 10 8,13

Trong các năm 2004 – 2011, có 123 mẫu muỗi của 5 loài muỗi thu thập

được ở các tỉnh Gia ai, Kon Tum, Đắk Lắ và Đắk Nông thuộc khu vực Tây

Nguyên để phân lập vi rút Banna. Trong số 123 mẫu muỗi phân lập và định

loại được 10 chủng vi rút Banna. Các chủng vi rút Banna được phân lập từ 5

loài muỗi bao gồm Cx. quinque faciatus, Cx. fuscocephalus, Cx. gelidus, Cx.

tritaeniorhynchus và Cx. vishnui thu thập ở thực địa. Tỷ lệ phân lập được vi

rút Banna trung bình trên tổng số 123 mẫu muỗi thu thập được là 8,13%

(10/123), nhưng đối với từng loài muỗi, tỷ lệ này cũng hác nhau. Các mẫu

muỗi phân lập được vi rút Banna được thu thập trong tháng 3, tháng 6 và

tháng 9.

Bảng 3.18. Các chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Nam

Loài muỗi Số mẫu phân lập Số chủng phân lập

Tỷ lệ phân lập (%) 14,77 Cx. pseudovishnui 88 13

10,29 Cx. quinque faciatus 68 7

0 Cx. gelidus 17 -

0 Cx. tritaeniorhynchus 27 -

Tổng 200 20 10,00

Trong năm 2005, c 200 mẫu muỗi của 4 loài muỗi thu thập được ở 2

tỉnh Long An, Cần Thơ (miền Nam), kết quả có 20 chủng vi rút Banna được

phân lập từ 2 loài muỗi Cx. pseudovishnui và Cx. quinque faciatus. Tỷ lệ phân

lập được vi rút Banna trên tổng số 200 mẫu muỗi thu thập được ở miền Nam

là 10,00% (20/200). Trong nghiên cứu này tại Cần Thơ và ong n chưa

phân lập được từ loài muỗi Cx. gelidus và Cx. tritaeniorhynchus. Các mẫu

muỗi thu thập ở hai tỉnh Cần Thơ và ong n được thực hiện từ tháng 1 đến

tháng 12 trong năm 2005, nhưng các mẫu phân lập vi rút Banna dương tính từ

muỗi được ghi nhận chủ yếu trong tháng 3 và tháng 10, còn các tháng khác

chưa phân lập được vi rút Banna ở hai tỉnh này.

Bảng 3.19. Tỷ lệ phân lập được vi rút Banna từ muỗi

Mi n Bắc Mi n Trung Tây Nguyên Mi n Nam

Số chủng / số mẫu Số chủng / số mẫu Số chủng / số mẫu Số chủng/ số mẫu Loài

An. vagus 2/4 // // //

Ar. subalbalus 2/9 // // //

Cx. pseudovishnui 0/6 // 13/88 //

Cx. quinquefaciatus 1/32 3/16 7/68 0/1

Cx. fuscocephalus 1/9 1/8 // 0/1

Cx. gelidus 0/32 1/18 0/17 0/2

Cx. tritaeniorhynchus 5/551 2/53 0/27 2/11

Cx. vishnui 1/100 3/28 // 2/9

4/24 Tổng số chủng 12/744 (1,6%) (16,7%) 10/123 (8,1%) 20/200 (10,0%)

Trong tổng số 1.091 mẫu muỗi thu thập được ở các tỉnh thành thuộc

miền Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên, c 46 chủng vi rút Banna,

tỷ lệ phân lập vi rút Banna từ muỗi trung b nh ở Việt Nam là 4,22%. Tỷ lệ

phân lập được vi rút Banna từ muỗi thấp nhất ở miền Bắc chỉ c 1,61

(12/744), cao nhất ở miền Trung tỷ lệ phân lập dương tính là 16,67% (4/24)),

ở hu vực Tây Nguyên với tỷ lệ phân lập dương tính là 10,00% (20/200) và

miền Nam c tỷ lệ phân lập dương tính là 8,13% (10/123).

Bảng 3.20. Th ng tin các chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Bắc

TT Loài muỗi Địa điểm Giống muỗi Ký hiệu chủng vi út

1 Cx. vishnui uỗi cái 02VN 9 b Hà Tây

2 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 02VN 78 b Hà Tây

3 Cx. quinquefaciatus uỗi cái 06 VN 1 Hà Tây

4 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 06 VN 2 Hà Tây

5 An. vagus uỗi cái 06VN267 Bắc Giang

6 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 06VN268 Bắc Giang

7 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 06VN269 Bắc Giang

8 Cx. fuscocephalus uỗi cái 06VN273 Bắc Giang

9 Ar. subalbalus uỗi cái 06VN276 Bắc Giang

10 An. vagus uỗi cái 06VN263 Bắc Giang

11 Cx.tritaeniorhynchus uỗi cái 08VN117 Bắc Giang

12 Ar. subalbatus uỗi cái 08VN114 Bắc Giang

Trong số 12 chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Bắc 2001 -

2011, có 4 chủng vi rút Banna phân lập được ở tỉnh Hà Tây (cũ), 8 chủng

phân lập được ở tỉnh Bắc Giang.

Trong nghiên cứu này, vi rút Banna chưa phân lập được ở các tỉnh

Lạng Sơn, Thái B nh và Hà Nam.

Bảng 3.21. Th ng tin các chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Trung

Ký hiệu chủng STT Loài muỗi Giống muỗi Địa điểm vi rút

1 Cx. vishnui uỗi cái 02VN 9 Quảng B nh

2 Cx. vishnui uỗi cái 02VN18 b Quảng B nh

3 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 02VN178 b Quảng B nh

4 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 02VN180 b Quảng B nh

Có 4 chủng vi rút Banna được phân lập ở Quảng Bình năm 2002, các

chủng vi rút chủ yếu phân lập được từ hai loài muỗi Cx. tritaeniorhynchus.

Cx. vishnui trong số 5 loài muỗi thu thập được ở Quảng Bình.

Bảng 3.22. Th ng tin các chủng vi rút Banna phân lập được ở Tây Nguyên

Ký hiệu chủng

STT

Loài muỗi

Giống muỗi

Địa điểm

vi rút

1 Cx. vishnui uỗi cái 06VN 58 Gia Lai

2 Cx. quinquefaciatus uỗi cái 06VN 60 Gia Lai

3 Cx. fuscocephalus uỗi cái 06VN 63 Gia Lai

4 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 06VN 295 Kon Tum

5 Cx. vishnui uỗi cái 06VN 326 Đắ N ng

6 Cx. tritaeniorhynchus uỗi cái 07VN 287 Đắ N ng

7 Cx. quinquefaciatus uỗi cái 07VN 300 Đắ ắ

8 Cx. quinquefaciatus uỗi cái 07VN 307 Kon Tum

9 Cx. vishnui uỗi cái 07VN 308 Kon Tum

10 Cx. gelidus uỗi cái 07VN 309 Kon Tum

Có 10 chủng vi rút Banna được phân lập từ muỗi thu thập ở 4 tỉnh

thuộc khu vực Tây Nguyên, trong đ c 4 10 chủng phân lập được ở tỉnh Kon

Tum từ hai loài muỗi Cx. quinquefaciatus và Cx. vishnui, có 3/10 chủng phân

lập được ở tỉnh Gia Lai từ ba loài muỗi Cx. fuscocephalus, Cx.

quinquefaciatus và Cx. vishnui. Có 2/10 chủng phân lập được ở tỉnh Đă

Nông từ Cx. tritaeniorhynchus và Cx. vishnui, chỉ có 1/10 chủng phân lập

được ở tỉnh Đắk Lắk từ Cx. quinquefaciatus.

Bảng 3.23. Th ng tin các chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Nam

STT Loài muỗi Giống muỗi Ký hiệu chủng vi rút Địa điểm

1 Cx. quinquefaciatus Muỗi cái 05 VN266 Cần Thơ

2 Cx. quinquefaciatus Muỗi cái 05VN 274 Cần Thơ

3 Cx. quinquefaciatus Muỗi cái 05VN 277 Cần Thơ

4 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 280 Cần Thơ

5 Cx. quinquefaciatus Muỗi cái 05VN 290 Cần Thơ

6 Cx. quinquefaciatus Muỗi cái 05VN 301 Cần Thơ

7 Cx. quinquefaciatus Muỗi cái 05VN 305 Cần Thơ

8 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 486 Cần Thơ

9 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 487 Cần Thơ

10 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 491 Cần Thơ

11 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 492 Cần Thơ

12 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 494 Cần Thơ

STT Loài muỗi Giống muỗi Ký hiệu chủng vi rút Địa điểm

13 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 495 Cần Thơ

14 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 496 Cần Thơ

15 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 505 Cần Thơ

16 Cx. pseudovishnui Muỗi cái 05VN 507 Cần Thơ

17 Cx. pseudovishnui Muỗi cái CT-Mo-P7b Cần Thơ

18 Cx. quinquefaciatus Muỗi cái 05VN 531 Cần Thơ

19 05VN 308 Long An Cx. pseudovishnui Muỗi đực

20 05VN 311 Long An Cx. pseudovishnui Muỗi đực

C 20 chủng vi rút Banna được phân lập ở hai tỉnh Cần Thơ, ong n

(miền Nam), trong đ phần lớn các chủng vi rút Banna được phân lập từ muỗi

cái thu thập ở tỉnh Cần Thơ (18 20 chủng). Các chủng vi rút Banna phân lập ở

miền Nam chủ yếu từ hai loài muỗi Cx. quinquefaciatus và Cx.

pseudovishnui.

Trong nghiên cứu này c 2 20 chủng vi rút Banna được phân lập từ

muỗi đực Cx. pseudovishnui ở tỉnh ong n. Trong số 20 chủng vi rút Banna

được phân lập ở hai tỉnh Cần Thơ và ong n trong năm 2005, c 7 20 chủng

vi rút Banna từ muỗi Cx. quinquefaciatus, c 13 20 chủng vi rút từ Cx.

pseudovishnui.

3.3. Một số đặc điểm sinh học phân t của vi rút Banna phân lập

được ở Việt Nam.

3.3.1. Phân bố vi rút Banna ở Việt Nam

H nh 3.3. Phân bố các chủng vi rút Banna phân lập ở Việt Nam 2002 - 2007

Trong nghiên cứu này, xác định các chủng vi rút Banna được phân lập

từ người bệnh, từ muỗi, lợn 10 tỉnh thành phố của miền Bắc, miền Trung,

miền Nam và Tây Nguyên bao gồm các tỉnh Bắc Giang, Hà Tây cũ, Thanh

H a, Quảng Binh, Kon Tum, Gia ai, Đắ ắ , Đắ N ng, Cần Thơ và ong

n. Trong đ c 2 tỉnh vi rút Banna được phân lập từ bệnh nhân nam 14 tuổi

bị HCNC nghi ngờ do vi rút ở tỉnh Thanh H a (miền Bắc, 2003), còn ở tỉnh

Gia ai, vi rút Banna được phân lập từ bệnh nhân nữ 3 tuổi, năm 2005. Bước

đầu nghiên cứu về vi rút Banna, xác định vi rút lưu hành ở 9 tỉnh bao gồm

Bắc Giang, Hà Tây cũ, Quảng Bình, Kon Tum, Gia ai, Đắ ắ , Đắ N ng,

Cần Thơ và ong n. Riêng tỉnh Hà Tây cũ, vi rút Banna h ng những được

phân lập từ muỗi mà còn được phân lập từ lợn.

Bảng 3.24. Th ng tin về 5 chủng vi rút Banna phân lập từ người và

muỗi ở Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu phân tích vùng gen mã h a số 12.

Thời gian Địa điểm Ký hiệu chủng Loại mẫu bệnh phẩm

03VN 99 2003 Thanh H a (miền Bắc)

05VN 225 2005 Gia Lai (Tây Nguyên)

03VN 45 2003 Cát Quế, Hà Tây (miền Bắc)

05VN 301 2005 Cần Thơ (miền Nam)

05VN 305 2005 Cần Thơ (miền Nam) Dịch não tủy Dịch não tủy áu lợn Culex fatigan Culex fatigan

3.3.2. Đặc điểm dịch tễ học vi rút Banna ở Việt Nam

Trong nghiên cứu này chọn 5 chủng vi rút được phân lập từ người,

muỗi và lợn trong các năm 2003 – 2005 ở miền Bắc, miền Nam và Tây

Nguyên để giải mã vùng gen của phân đoạn số 12 (còn 5 chủng vi rút Banna

phân lập ở ở miền Bắc và miền Trung năm 2002 đã c mã số đăng ý trong

ngân hàng gen). Các chủng được thực hiện giải mã vùng gen số 12 trong

nghiên cứu này là các chủng vi rút có ký hiệu: 03VN99, 05VN255 (phân lập

từ bệnh nhân ở tỉnh Thanh Hóa và tỉnh Gia ai tương ứng trong các năm 2003

và 2005), 03VN45 (phân lập từ máu lợn ở Hà Tây cũ năm 2003) và

05VN301, 05VN305 (phân lập từ muỗi ở Cần Thơ năm 2005).

H nh 3.4. Kết quả huếch đại một phần vùng gen số 12 của các chủng

vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân, muỗi, lợn

ả

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu toàn bộ vùng gen mã h a phân đoạn số 12 để

huếch đại sản ph m PCR có chiều dài là 667 bp của 5 chủng vi rút Banna

phân lập từ dịch não tủy của bệnh nhân, muỗi và lợn trong các năm 2003 –

2005 ở miền Bắc, miền Nam và Tây Nguyên. Sản ph m PCR được tinh sạch

bằng bộ sinh ph m QI quic Gel Extraction Kit của hãng QI GEN để c

hu n cho phản ứng giải tr nh tự gen bằng bộ sinh ph m DTCS Quic Start

Kit. Tr nh tự nucleotide vùng gen mã h a phân đoạn số 12 được phân tích sự

hác nhau về nucleotide của 10 chủng virus Banna phân lập ở Việt Nam,

2002 – 2005 bằng phần mềm DNAStar-Lasegene.

Bảng 3.25. So sánh sự hác nhau về nucleotide vùng gen mã h a số 12 của

một số chủng vi rút Banna phân lập từ muỗi, lợn ở Việt Nam, 2002 – 2005

03VN45 2003 ợn

03VN99 2003 Người 99,7

05VN255 2005 Người 99.7 1.00

05VN301 2005 uỗi 98,7 98,7 98,7

05VN305/2005/Muỗi 99,6 99,6 99,6 98,6

EU265705/02VN078b 99,3 99,3 99,7 98,3 99,3

EU265682/02VN009b 99,3 99,3 99,7 98,3 99,3 100

So sánh tr nh tự nucleotide của toàn bộ vùng gen mã h a phân đoạn gen

số 12 của các chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân, muỗi và lợn ở Hà

Tây (miền bắc Việt Nam), Cần Thơ, miền Nam Việt Nam và Gia ai Tây

Nguyên trong các năm 2002 – 2005 với các chủng vi rút Banna phân lập ở

miền Bắc, miền Trung Việt Nam năm 2002, sự tương đồng về tr nh tự

nucleotide giữa các chủng vi rút này là rất cao, giao động trong hoảng 98,6 –

100 %. Sự tương đồng về tr nh tự nucleotide của hai chủng vi rút Banna phân

lập từ dịch não tủy của bệnh nhân trong các năm hác nhau, ở những vùng địa

lý hác nhau, có sự tương đồng rất cao (100 ). Vùng gen mã h a phân đoạn

số 12 của 5 chủng vi rút đã được giải tr nh tự và đăng ý trong ngân hàng gen

với các chủng virus có ký hiệu 03VN45 (phân lập từ lợn ở Cát Quế, Hà Tây),

03VN99 (phân lập từ dịch não tủy bênh nhân ở Thanh H a), 05VN255 (phân

lập từ dịch não tủy bênh nhân ở Gia ai), 05VN301 và 05VN305 (phân lập từ

muỗi ở Cần Thơ), tr nh tự nucleotide của vùng gen mã h a phân đoạn số 12

của 5 chủng vi rút Banna trong nghiên cứu này đã được cấp mã số của ngân

hàng gen quốc tế.

Bảng 3.26. Thông tin về số đăng ý tr nh tự nucleotide vùng gen số 12

của 5 chủng vi rút Banna trong ngân hàng gen quốc tế

Địa điểm Ký hiệu chủng Thời gian Loại mẫu bệnh phẩm Số đăng ký t ên ngân hàng gen

03VN 99 2003 Thanh Hóa AB773281

Từ DNT bệnh nhân (miền Bắc)

05VN 225 2005 Gia Lai AB773282

Từ DNT bệnh nhân (Tây Nguyên)

03VN 45 2003 Cát Quế, Máu lợn AB773283

Hà Tây (miền Bắc)

05VN 301 2005 Cần Thơ AB773284

Culex fatigan (miền Nam)

05VN 305 2005 Cần Thơ AB773285

Culex fatigan (miền Nam)

Trong nghiên cứu này c năm chủng vi rút Banna được phân lập từ

muỗi, người và lợn đăng ý trong ngân hàng gen và c các mã số để tra cứu

và chia sẻ th ng tin trong đ c 2 chủng vi rút Banna phân lập từ người bệnh,

1 chủng phân lập từ lợn và 2 chủng phân lập từ muỗi thuộc các tỉnh thành ở

miền Bắc, miền Nam và Tây Nguyên.

H nh 3.5. Cây di truyền phả hệ m tả mối quan hệ giữa các chủng vi rút

Banna của Việt Nam với một số chủng vi rút Banna từ một số nước châu

dựa trên trình tự nucleotide toàn bộ vùng gen mã h a phân đoạn số 12

Cây di truyền phả hệ được xây dựng dựa trên tr nh tự toàn bộ vùng gen

mã h a phân đoạn số 12 của 5 chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân

HCNC, từ lợn và muỗi 2003 - 2005 ở Việt Nam được so sánh với 38 tr nh tự

vùng gen mã h a phân đoạn số 12 của các chủng vi rút Banna hác ở trong

nước và 5 chủng vi rút Banna phân lập ở miền Bắc, miền Trung năm 2002, và

các chủng vi rút Banna ở một số nước châu đã c ng bố trên ngân hàng gen.

Kết quả so sánh tr nh tự tr nh tự nucleotide vùng gen mã h a số 12 của

các chủng vi rút Banna phân lập ở Việt Nam đã xác định các chủng vi rút

phân lập từ bệnh nhân, từ muỗi và lợn trong các năm 2002 – 2005 ở miền

Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên thuộc genotype , nằm trong

phân nh m genotype 1 và tạo thành một clade riêng biệt, clade Việt Nam.

Trong nghiên cứu này xác định trình tự các chủng vi rút Banna phân

lập ở miền Trung năm 2002 c hai chủng vi rút Banna phân lập từ muỗi năm

2002 ở miền Trung lại thuộc phân nh m 2 c mối liên quan gần với các

chủng vi rút Banna đầu tiên phân lập từ bệnh nhân tại Trung Quốc.

Như vậy riêng các chủng vi rút Banna phân lập ở miền Trung năm

2002 được xác định thuộc genotype A và phân nhóm genotype A1 và tạo

thành một clade riêng biệt, clade Việt Nam.

3.3.3. Kết quả giải trình tự nucleotide của vùng gen mã hóa số 12

Tr nh tự nucleotide và acid amin vùng gen mã h a số 12 được sử dụng

để phân tích đặc điểm phân tử dựa giữa hai chủng vi rút Banna phân lập từ

bệnh nhân Việt Nam với một chủng vi rút Banna phân lập ở Trung Quốc đầu

tiên từ năm 1987 (chủng Prototype).

Bảng 3.27. Trình tự nucleotide vùng gen mã hóa phân đoạn số 12 của vi rút Banna từ bệnh nhân ở Việt Nam với vi rút Banna từ bệnh nhân Trung Quốc

So sánh sắp cặp tr nh tự 667 nucleotide vùng gen mã h a phân đoạn số

12 của các chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân, ết quả xác định c 49

đột biến điểm ở vùng gen số 12 của các chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh

nhân Việt Nam so với vùng gen số 12 của chủng vi rút Banna phân lập từ

bệnh nhân ở Trung Quốc. Trong số 49 đột biến nucleotide phần lớn là đột

biến đơn, chỉ c một đột biến p duy nhất (đột biến hai nucleotide liền nhau).

Khi so sánh tr nh tự nucleotide của toàn bộ vùng gen mã h a phân đoạn

gen số 12 của 2 chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân Việt Nam (2003,

2005) với chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân ở Trung Quốc 1987, xác

định tr nh tự nucleotide của hai chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân

trong các năm hác nhau, ở những vùng địa lý hác nhau nhưng c sự tương

đồng về tr nh tự nucleotide là 100 . Ngược lại, sự tương đồng về tr nh tự

nucleotide của chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân Trung Quốc với

chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân Việt Nam là 90,6 .

Kết quả nghiên cứu phân tích này đưa ra bằng chứng cho thấy các

chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân Việt Nam h ng c mối liên hệ di

truyền gần với chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân ở Trung Quốc.

3.3.4. Đặc điểm các acid amin thay thế của vùng gen mã hóa số 12

Bảng 3.28. Phân tích đặc điểm các acid amin thay thế của vùng gen mã h a

(ORF) số 12 của vi rút Banna Việt Nam c ý hiệu 03VN99 so với chủng vi

rút Banna ở Trung Quốc c mã số trong ngân hàng gen F052030

Vị trí amino acid trên gen 12 Amino acid thay thế Kiểu thay thế

28 Pro → Gln N

29 Ser →Gly N

68 ys → rg N

89 eu → Val C

101 ys → rg C

103 Ser → eu N

Vị trí amino acid trên gen 12 Amino acid thay thế Kiểu thay thế

121 sn → sp N

124 Thr → Ser C

126 sp → Glu C

128 Gly → Ser N

144 Tyr → His N

157 Thr → Tyr N

175 Glu → sp C

180 His → Gln N

195 sp → sn N

196 Thr → Val N

Ghi chú: Kiểu thay th c ự y đổi bảo tồn: eu → Val, ys → rg, Thr → Ser, sp → Glu và Glu → sp

C : Kiể y đổi bảo tồn N: Kiể y đổi không bảo tồn.

Các đột biến điểm nucleotide thay thế sẽ làm thay đổi bộ ba mã hóa cho

axit amin trong quá trình dịch mã, n c thể làm thay đổi hoặc không làm

thay đổi axit amin của vùng gen mã h a phân đoạn số 12 Trong số 49 đột

biến nucleotide vùng gen mã h a số 12 của chủng vi rút Banna phân lập từ

bệnh nhân Việt Nam hi so sánh với chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh

nhân ở Trung Quốc, tỷ lệ đột biến nucleotide là 7,9 , Tuy nhiên, chỉ c 12

đột biến nucleotide dẫn đến đột biến thay thế axit amin ở vùng gen mã h a số

12, tỷ lệ đột biến axit amin là 5,8 , trong số này, kiểu thay đổi bảo tồn là

41,7% (5/12).

Chương IV

BÀN LUẬN

4.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng hội chứng não cấp nghi

ngờ do vi rút Banna ở một số địa phương của Việt Nam, 2002-2012

HCNC là một trong những nguyên nhân thường xuyên và nghiêm

trọng gây bệnh cho người được ghi nhận ở hầu hết các châu lục, gồm

nhiều căn nguyên vi khuẩn, vi rút và ký sinh trùng, nhưng tác nhân gây

bệnh phổ biến nhất là do vi khuẩn hoặc vi rút. Đối với tác nhân gây bệnh

là vi khuẩn, hầu hết các trường hợp viêm màng não do vi khuẩn gây ra bởi

một trong ba loài vi khuẩn, bao gồm Haemophilus influenzae (Hib),

Streptococcus pneumoniae, và Neisseria meningitidis. Theo ước tính của

Tổ chức Y tế Thế giới, hàng năm tác nhân gây bệnh do vi khuẩn Hib và

phế cầu khuẩn gây ra khoảng 3 triệu trường hợp trong đó có khoảng

800.000 trường hợp bệnh nặng (chủ yếu là viêm phổi và viêm màng não)

ở trẻ em dưới 5 tuổi và khoảng 500.000 ca tử vong. phần lớn các ca bệnh

được ghi nhận ở các nước đang phát triển [40],[42],[45],[45],[94]. Tuy

nhiên, căn nguyên vi khuẩn gây HCNC như Haemophilus influenzae

(Hib), Streptococcus pneumoniae, và Neisseria meningitidis đã và đang

được khống chế bằng vắc xin. Ngược lại, đối với tác nhân gây HCNC là

vi rút, phần lớn không có thuốc đặc cũng như không có vắc xin để dự

phòng. Hiện tại mới có vắc xin để phòng bệnh VNNB và trong số vi rút

gây HCNC chỉ có vi rút herpes simplex là điều trị được bằng thuốc kháng

vi rút [6],[40],[49],[57],[94]. Nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương do vi

rút là một nguyên nhân chính gây bệnh và tử vong, đặc biệt là ở các nước

đang phát triển. Nhiều căn nguyên vi rút là mối quan tâm đặc biệt tới sức

khỏe cộng đồng vì có thể gây ra một mối đe dọa đại dịch như vi rút đường

ruột Entero 71 [94]... Về mặt dịch tễ học, các vi rút gây HCNC cấp được

chia thành ba nhóm dựa trên cơ sở đường lây truyền đó là nhóm vi rút gây

HCNC cơ hội (nội sinh) như vi rút herpes simplex, nhóm vi rút gây

HCNC do lây truyền trực tiếp qua đường tiêu hóa, đường hô hấp như vi

rút đường ruột, vi rút Nipah và nhóm vi rút gây HCNC do lây truyền từ

động vật sang người như vi rút dại hoặc do côn trùng truyền như một số vi

rút Arbo thuộc chi Alpha hoặc chi Flavi [32],[33],[40],[67],[74]. Bên cạnh

đó, còn có những tác nhân vi rút gây HCNC vẫn chưa phát hiện hoặc chưa

có đủ bằng chứng khoa học để khẳng định vai trò gây bệnh, ví dụ như đối

với vi rút Banna, được phân lập từ bệnh nhân năm 1987, nhưng phải gần

30 năm sau mới có bằng chứng để xác định là tác nhân gây bệnh. Tương

tự như vậy, đối với vi rút VNNB, lâm sàng của bệnh được ghi nhận từ

năm 1879, nhưng mãi đến năm 1935, tác nhân gây bệnh mới được xác

định [1],[61], [89].

Phần lớn HCNC do vi rút chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, việc điều

trị chủ yếu là chăm sóc hỗ trợ. Vì vậy việc áp dụng các biện pháp phòng

bệnh có vai trò hết sức quan trọng làm giảm tỷ lệ mắc cũng như góp phần

làm giảm di chứng và tử vong. Nhưng muốn phòng bệnh một cách có hiệu

quả nhất thì cần phải hiểu biết đầy đủ về các đặc điểm dịch tễ học của

bệnh. Nhình chung, HCNC do vi rút là một bệnh ít được quan tâm, hệ thống

giám sát chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh đang trong giai đoạn củng cố

và hoàn thiện nên những nghiên cứu trên thế giới về đặc điểm dịch tễ học của

HCNC do vi rút nói chung thường ít được đề cập [40],[46],[94]. Y văn cho

thấy, có nhiều tác nhân vi rút gây HCNC với những đặc điểm lâm sàng rất đa

dạng, nếu chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán rất khó phân biệt.

Do vậy, để chẩn đoán xác định phải dựa vào kết quả xét nghiệm [1]. Nguyên

tắc để chẩn đoán những vi rút Arbo (tính hướng thần kinh) có biểu hiện lâm

sàng HCNC là: (1) Phát hiện vi rút bằng phương pháp phân lập; (2) Phát hiện

nhanh vi rút bằng kỹ thuật sinh học phân tử; (3) Phát hiện kháng thể IgM đặc

hiệu kháng vi rút trong dịch não tủy hoặc xác định có sự chênh lệch hiệu giá

kháng thể của cặp mẫu huyết thanh kép. Trong ba nguyên tắc này, kết quả

phân lập được vi rút từ người có ý nghĩa rất quan trọng để xác định nguyên

nhân gây bệnh. Tuy nhiên, việc phân lập vi rút từ người bệnh người bệnh

thường ít đạt kết quả đối với vi rút Arbo có tính hướng thần kinh vì hiệu giá

của vi rút thường rất thấp khi xuất hiện triệu chứng của bệnh, nên việc phát

hiện được IgM kháng vi rút trong dịch não tủy được coi là “tiêu chuẩn vàng”

để chẩn đoán, vì bình thường dịch não tủy không có kháng thể, kháng thể chỉ

qua hàng rào “máu-não” vào hệ thống thần kinh trung ương để diệt tác nhân

gây bệnh. Nên khi phát hiện được kháng thể IgM kháng vi rút trong dịch não

tủy đồng nghĩa với việc xác định được tác nhân gây bệnh tương tứng với

kháng nguyên dùng để phát hiện kháng thể [10], [11], [16], [98], [102].

Để chẩn đoán huyết thanh học sự nhiễm vi rút Arbo, kỹ thuật phát

hiện IgM theo nguyên lý tóm bắt kháng thể IgM (MAC-ELISA) được công

nhận là kỹ thuật chuẩn thức để chẩn đoán bệnh đặc biệt đối với những nơi có

lưu hành hai loại vi rút trong cùng một chi như vi rút dengue, vi rút VNNB

cùng chi flavivirus ở Việt Nam và một số nước châu Á [75]. Trong nghiên

cứu này, do chưa phát triển được sinh phẩm chẩn đoán cho kỹ thuật MAC-

ELISA, việc phát hiện IgM kháng vi rút Banna được thực hiện bằng kỹ thuật

ELISA IgM gián tiếp với kháng nguyên sử dụng cho kỹ thuật được cung cấp

từ Viện Y học Nhiệt đới trường đại học Nagasaki Nhật Bản. Do vậy, việc lựa

chọn mẫu bệnh phẩm để nghiên cứu trong đề tài này là dịch não tủy, cùng với

sinh phẩm xét nghiệm chuẩn sẽ là cơ sở để đảm bảo độ tin cậy của kết quả

nghiên cứu giám sát huyết thanh học để phát hiện IgM kháng vi rút Banna. Để

kiểm chứng lại tính hiệu quả của kỹ thuật trong xét nghiệm huyết thanh học

các trường hợp xác định dương tính bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện

IgM kháng vi rút Banna, có 5 mẫu dịch não tủy dương tính được kiểm tra lại

bằng kỹ thuật trung hòa tại Khoa Vi rút, Viện Y học Nhiệt đới, Trường Đại

học Nagasaki Nhật Bản, xác định có 3/5 mẫu dương tính. Có 2 mẫu âm tính

do có thể được lấy trong giai đoạn sớm của bệnh, hiệu giá kháng thể trung

hòa thấp, chưa đủ để phát hiện bằng kỹ thuật trung hòa [22]. Như vậy, kết quả

xác định IgM kháng vi rút Banna từ dịch não tủy bằng kỹ thuật ELISA có đủ

độ tin để xác định ca bệnh HCNC do vi rút Banna.

Vi rút Banna do muỗi truyền được xác định lưu hành ở Việt Nam, có

nhiều loại muỗi được xác định là véc-tơ hoặc có thể là véc-tơ truyền vi rút,

nếu lựa chọn huyết thanh bệnh nhân để chứng minh kháng thể của bệnh nhân

trung hòa vi rút Banna có thể sẽ nhầm lẫn với kháng thể do nhiễm tự nhiên

trước đây hoặc nhiễm chéo với kháng nguyên cùng một chi vi rút như công bố

trước đây về kết quả xác định dương tính giữa huyết thanh bệnh nhân HCNC

với chủng vi rút Mễ Trì (vi rút Alpha) phân lập từ muỗi ở miền Bắc Việt Nam

và cho đến nay cũng chưa phân lập được một chủng vi rút Alpha nào từ

người, mặc dù các chủng vi rút Alpha vẫn được phân lập từ muỗi trong những

nghiên cứu gần đây ở miền Bắc Việt Nam [15],[39],[51]. Do vậy, với 5 mẫu

dịch não tủy dương tính với kháng nguyên vi rút Banna bằng kỹ thuật ELISA

phát hiện IgM gián tiếp đã được sử dụng để phát hiện kháng thể trung hòa

kháng vi rút bằng kỹ thuật trung hòa trên tế bào (Forcus Asay) đã xác định có

3/5 mẫu dương tính được khẳng định bằng kỹ thuật trung hòa trên tế bào, xác

định kháng thể từ dịch não tủy của bệnh nhân HCNC trung hòa vi rút Banna

phân lập từ bệnh nhân Viêt Nam (chủng vi rút có ký hiệu 05VN255). Đây là

tiêu chí để khẳng định vi rút Banna là tác nhân gây bệnh theo giả định của

Koch và được River cải biên [1],[22],[62]. Tuy nhiên, việc thực hiện kỹ thuật

trung hòa rất phức tạp, cần có nhiều thời gian, rất tốn kém và không thể áp

dụng rộng rãi trong chẩn đoán giám sát HCNC do vi rút Banna, cho thấy

nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đoán huyết thanh học có độ nhạy và đặc

hiệu cao đối với vi rút Banna cần được thực hiện trong nghiên cứu tiếp theo.

Trong những năm gần đây việc sử dụng vắc xin VNNB đã góp phần

làm giảm số các trường hợp HCNC nghi ngờ do vi rút từ 2000 – 3000 trường

hợp trước những năm 1997 xuống còn khoảng 1000 trường hợp trong những

năm gần đây. Tuy nhiên, số trường hợp HCNC nghi ngờ do vi rút ở bệnh viện

Nhi Trung ương vẫn chưa có chiều hướng giảm, dao động trong khoảng 500 –

700 ca bệnh/năm trong những năm gần đây (chiếm gần 2/3 số các trường hợp

HCNC nghi ngờ do vi rút được ghi nhận trong cả nước). Nhưng tỷ lệ xác định

vi rút VNNB gây HCNC đã giảm từ trên 70 % trước những năm 1995 xuống

khoảng 10 % trong những năm gần đây, cho thấy HCNC do vi rút ở Việt

Nam, đặc biệt ở miền Bắc Việt Nam vẫn còn là một vấn đề cần được quan

tâm [10], [11], [23].

Hình 4.1. Tình hình HCNC nghi ngờ do vi rút và sự thay đổi về tỷ lệ xác định

VNNB tại bệnh viện Nhi Trung ương, 1995 – 2011 [23]

Trong nghiên cứu này có 717 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân HCNC

nghi ngờ do vi rút đã được loại trừ căn nguyên VNNB, ECHO 30 và herpes

simplex type 1 và type 4; Những mẫu dịch não tủy này được sử dụng để phát

hiện IgM kháng vi rút Banna bằng kỹ thuật ELISA phát hiện IgM gián tiếp.

Đây là những mẫu dịch não tủy của bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút ở 9

tỉnh/thành thuộc miền Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên. Kỹ thuật

MAC-ELISA được công nhận là kỹ thuật có độ nhạy và đặc hiệu cao trong

chẩn đoán huyết thanh học đối với các vi rút Arbo nói chung [75]. Tuy nhiên,

đối với một tác nhân vi rút mới như vi rút Banna để phát triển được sinh phẩm

cho kỹ thuật MAC-ELISA là vấn đề không đơn giản, vì trên thực tế, phần lớn

nghiên cứu tập trung vào những vi rút đã biết, nghiên cứu phát hiện tác nhân

vi rút mới và phát triển sinh phẩm chẩn đoán để thương mại cũng ít được

quan tâm và có thể cũng còn là một sự thách thức đối với các nhà khoa học

[18],[25],[51],[64],[79].

Chính vì vậy, hầu hết các nghiên cứu đã công bố là những nghiên cứu

phát hiện vi rút Banna từ dịch não tủy của bệnh nhân HCNC và sốt không rõ

nguyên nhân cũng như những nghiên cứu phát hiện vi rút Banna từ muỗi ở

một số nước châu Á. Còn nghiên cứu sự lưu hành của vi rút Banna trong ổ

chứa vi rút gần người và trong tự nhiên vẫn còn rất hạn chế, hầu hết các

nghiên cứu xác định sự lưu hành của vi rút trong ổ chứa gần người là những

nghiên cứu liên quan đến vi rút VNNB [8],[14],[72]. Hơn thế nữa, cũng chưa

có sinh phẩm để chẩn đoán, giám sát vi rút Banna được thương mại trên thị

trường, hiện tại mới có một số nghiên cứu phát triển kháng nguyên, kháng thể

để ứng dụng trong chẩn đoán tại một số Viện nghiên cứu [28],[79],[80].

Chính vì vậy những nghiên cứu về dịch tễ huyết thanh học HCNC do vi rút

Banna trên thế giới cũng như tại Việt Nam còn rất nghèo nàn, chưa có nghiên

cứu về tỷ lệ mắc của một quần thể xác định mà chỉ có những nghiên cứu về tỷ

lệ xác định dương tính với kháng nguyên vi rút Banna trong huyết thanh của

bệnh nhân có HCNC nghi ngờ do vi rút. Ví dụ như công bố của nghiên cứu sử

dụng kháng nguyên tái tổ hợp được từ vùng gen VP9 của vi rút Banna cho kỹ

thuật ELISA phát hiện IgM gián tiếp trong huyết thanh của bệnh nhân có chẩn

đoán lâm sàng VNNB ở Trung Quốc [ 72].

Như vậy, việc phát triển kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện IgM kháng

vi rút có thể dễ dàng thiết kế để kỹ thuật này nếu có kháng nguyên chuẩn là vi

rút Banna bất hoạt được tinh chế từ nước nổi tế bào nuôi cấy vi rút hoặc là

kháng nguyên tái tổ hợp [81]. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật ELISA gián

tiếp phát hiện IgM được sử dụng để phát hiện IgM đặc hiệu kháng vi rút

Banna từ mẫu dịch não tủy của bệnh nhân HCNC bằng kháng nguyên vi rút

Banna tinh chế, bất hoạt, để đưa ra bằng chứng vi rút Banna là tác nhân gây

bệnh. Kết quả đã xác định ở 9 tỉnh/thành phố có mẫu dịch não tủy xét nghiệm

phát hiện IgM kháng vi rút Banna với tỷ lệ xác định dương tính trung bình là

25,66 %.Trong số 9 địa phương xác định có các trường hợp dương tính với

kháng nguyên vi rút Banna, tỉnh có tỷ lệ xác định cao nhất là Hà Tây (cũ)

35,83%, tỉnh có tỷ lệ xác định thấp nhất là Bắc Giang 13,63% (bảng 3.2). Kết

quả nghiên cứu này không có nghĩa là chỉ có 9 tỉnh/thành phố này có các

trường hợp HCNC do vi rút Banna, nó chỉ xác định 9 tỉnh/thành phố có mẫu

dịch não tủy xét nghiệm đều xác định được ca bệnh do vi rút Banna. Cho

thấy, cần mở rộng giám sát dịch tễ huyết thanh học đo vi rút Banna ở các

tỉnh/thành phố khác trong những nghiên cứu tiếp theo để lập bản đồ dịch tễ ca

bệnh do vi rút Banna ở Việt Nam.

Do nghiên cứu được thiết kế trên cơ sở các mẫu huyết thanh được thu

thập và lưu giữ khi có ca bệnh đã loại trừ căn nguyên vi rút VNNB, ECHO 30

và herpes simplex type 1 và type 4 gây HCNC; Do vậy nếu tính tỷ lệ căn

nguyên vi rút Banna gây HCNC trong số các trường hợp nghi ngờ do vi rút sẽ

là 14,32% (184/1.285) phù hợp với kết quả nghiên cứu xác định căn nguyên

vi rút Banna gây HCNC trong số các trường hợp có chẩn đoán lâm sàng nghi

ngờ VNNB ở Trung Quốc, tỷ lệ huyết thanh bệnh nhân dương tính với kháng

nguyên vi rút Banna tái tổ hợp từ vùng gen VP9, bằng kỹ thuật ELISA phát

hiện IgM là khoảng 15% [44], [93], [99].

Sau khi đã loại trừ căn nguyên vi rút VNNB, ECHO 30 và herpes

simplex type 1 và type 4 gây HCNC kết quả xác định dương tính với kháng

nguyên vi rút Banna trong số các trường hợp HCNC nghi ngờ do vi rút ở 9

tỉnh/thành ở Việt Nam xác định dao động trong khoảng 13,83% – 35,83%

(trung bình là 25,66%). Điều này cho thấy ở các phân vùng địa lý khác nhau,

tỷ lệ mắc do một loại tác nhân gây bệnh cũng có thể khác nhau [13],[17],[46].

Kết quả giám sát huyết thanh học trong nghiên cứu này xác định các

trường hợp dương tính với kháng nguyên vi rút Banna được ghi nhận quanh

năm, nhưng tập trung chủ yếu trong các tháng hè 5, 6 và 7 với đỉnh cao của

dịch là tháng 6 (hình 3.1), trùng với mùa dịch VNNB ở miền Bắc Việt Nam.

Đây là một trong những đặc điểm HCNC của vi rút do muỗi truyền thường

xảy ra chủ yếu trong mùa hè ở vùng cận nhiệt đới [6],[11],[16]. Như vậy, sau

giai đoạn tăng cường sử dụng vắc xin VNNB để phòng bệnh, các trường hợp

HCNC nghi ngờ do vi rút vẫn chủ yếu được ghi nhận về mùa hè và vi rút

Banna được cho là một trong những tác nhân vi rút gây HCNC về mùa hè.

Trong số các trường hợp xác định dương tính, nhóm trẻ < 1 tuổi có tỷ lệ

số mắc thấp nhất chiểm 5,98 % tổng số mắc; Các nhóm tuổi khác tỷ lệ số mắc

dao động trong khoảng 19,02 % - 28,26 %. Trong đó tỷ lệ số mắc cao nhất là

nhóm tuổi trên 15 là 28,26 %. Kết quả này phù hợp với một đặc điểm nhiễm

Arbo vi rút gây HCNC như vi rút VNNB, đó là tỷ lệ số mắc ở nhóm dưới 1

tuổi rất thấp, nhưng tỷ lệ số mắc vi rút Banna ở nhóm tuổi ≥ 15 cao hơn các

nhóm khác là 28,26 % (bảng 3.4), thông thường tỷ lệ số mắc HCNC do vi rút

VNNB ở nhóm tuổi ≥ 5 khoảng 10 % theo các y văn trước đây [6], [16], [73].

Đối với vi rút VNNB, do tác động của vắc xin được sử dụng rộng rãi ở

Việt Nam nên đặc điểm dịch tễ huyết thanh học của VNNB có sự thay đổi

trong những năm gần đây. Nghiên cứu cho thấy trên 90% các trường hợp

HCNC nghi ngờ do vi rút chưa xác định được nguyên nhân ở bệnh viện Nhi

Trung ương cũng như ở các tỉnh Bắc Giang, Thái Bình [23]. Trong số các

trường hợp HCNC nghi ngờ do vi rút, âm tính với kháng nguyên vi rút VNNB

của 9 tỉnh/thành phố bao gồm Bắc Giang, Hà Tây cũ, Hà Nội, Hải Phòng,

Thái Bình, Thanh Hóa (miền Bắc), Huế (miền Trung), Gia Lai (Tây Nguyên),

Long An (miền Nam), đã phát hiện IgM kháng vi rút Banna bằng kỹ thuật

ELISA IgM gián tiếp từ mẫu dịch não tủy là cơ sở để xác định vi rút Banna là

tác nhân gây bệnh [10], [11], [12], [16], [23].

HCNC nghi ngờ do vi rút có rất nhiều tác nhân biểu hiện lâm sàng rất

đa dạng, thậm chí đối với một tác nhân gây bệnh cũng có thể có những biểu

hiện lâm sàng khác nhau [3], [32], [33], [40], [42], [49], [57], [66], [87].

Trong nghiên cứu này, để làm rõ đặc điểm lâm sàng và dịch tễ học của HCNC

do vi rút Banna, thiết kế nghiên cứu so sánh giữa đặc điểm lâm sàng và dịch

tễ của HCNC do vi rút VNNB và do vi rút đường ruột (ECHO30) ở các bệnh

nhân dưới 15 tuổi điều trị tại một số bệnh viện của miền Bắc Việt Nam, cỡ

mẫu nghiên cứu đủ lớn sẽ đảm bảo độ tin cậy của kết quả nghiên cứu về một

số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của HCNC do vi rút Banna, vi rút VNNB và vi

rút đường ruột ECHO30. Xác định căn nguyên vi rút ECHO30 căn cứ vào kết

quả phân lập và định loại vi rút [29], xác định căn nguyên vi rút Banna và vi

rút VNNB dựa vào kết quả phát hiện IgM đặc hiệu kháng vi rút. Trong nghiên

cứu này, chủ yếu chọn đối tượng từ 0 – 15 tuổi, cỡ mẫu cho từng nhóm

nghiên cứu lớn nên có độ tin cậy khi thực hiện so sánh thống kê một số đặc

điểm về triệu chứng lâm sàng HCNC do vi rút Banna, vi rút VNNB và vi rút

ECHO30.

Trong số 184 trường hợp nhiễm vi rút Banna, chọn 103 trường hợp

bệnh nhân định điều trị ở bệnh viện Nhi Trung ương, nghiên cứu phân tích

cho thấy, về đặc điểm dịch tễ học xác định tỷ lệ nhiễm vi rút Banna ở bệnh

nhân nam cao hơn nữ (67:36), tương tự như đặc điểm dịch tễ học HCNC do vi

rút VNNB, vi rút ECHO30, phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả khác ở

trong và ngoài nước [33], [46], [65]. Ngược lại, với nguyên nhân do vi rút

Nipah chủ yếu gặp ở người lớn ở tuổi trung bình là 37 tuổi (không ghi nhận

trường hợp bệnh nhân nào dưới 15 tuổi) và phần lớn là nam giới, tỷ lệ bệnh

nhân nam/bệnh nhân nữ là 4,5:1 [49]. Như vậy, tùy theo loại tác nhân gây

bệnh và phân bố ở các nhóm tuổi khác nhau.

Về đặc điểm lâm sàng, triệu chứng liên quan đến hệ thống tâm thần

như đau đầu, nôn, co giật, buồn nôn, đau khớp, nhưng những dấu hiệu này có

sự xuất hiện với tần suất khác nhau ở nhóm do vi rút Banna, vi rút ECHO30

hay do vi rút VNNB. Hầu hết những bệnh nhân do vi rút ECHO30 có triệu

chứng đau đầu, nôn và buồn nôn với tần suất cao hơn rất nhiều so với những

bệnh nhân do vi rút Banna và vi rút VNNB (bảng 3.7, bảng 3.8). Co giật là

dấu hiệu nguy hiểm, có thể gây ra các biến chứng của hệ thống thần kinh và

có thể gây tử vong, triệu chứng này chiếm tỷ lệ cao ở nhóm do vi rút VNNB

(61,02 %) trong khi đó do vi rút Banna chỉ có 30,23 %, còn do vi rút ECHO30

xuất hiện rất thấp chỉ có 2,33 %. Tuy nhiên, tỷ lệ tử vong của các trường hợp

do vi rút Banna được ghi nhận trong nghiên cứu này là khoảng 15 % cao hơn

so với tỷ lệ tử vong của vi rút VNNB (bảng 3.10). Kết quả cho thấy vi rút

Banna để lại hậu quả rất nặng nề xuất hiện các triệu chứng thóp phồng, cứng

gáy, dấu hiệu Kenig với tần suất cao hơn so với do vi rút VNNB và vi rút

ECHO30. Những trường hợp do vi rút Banna xuất hiện triệu chứng cứng gáy

với tần suất cao 77,45 % trong khi đó nhóm vi rút VNNB chỉ có 50,85 % và

do vi rút ECHO30 là 39,53%. Rối loạn tâm thần xuất hiện hầu hết ở bệnh

nhân do vi rút Banna và vi rút VNNB tương ứng là 81,55 % và 88,14 % trong

khi đó nhóm do vi rút ECHO30 triệu chứng này chỉ có 11,63 % mang tính đặc

trưng cho HCNC do vi rút Banna (bảng 3.7, bảng 3.8).

Sau một tuần điều trị, các bệnh nhân hầu hết có những biến chuyển tích

cực về các dấu hiệu và triệu chứng lâm sàng. Triệu chứng đau đầu xuất hiện

còn lại chủ yếu ở bệnh nhân HCNC do vi rút VNNB và số lượng nhỏ ở nhóm

do vi rút Banna và vi rút ECHO30. Tuy nhiên, chẩn đoán lâm sàng cho thấy

nhóm do vi rút Banna vẫn còn có các dấu hiệu lâm sàng rối loạn tâm thần tỷ

lệ cao 55,34 % trong khi đó ở nhóm do vi rút VNNB triệu chứng rối loạn

tâm thần chỉ 11,86 % còn nhóm do vi rút ECHO30 không còn được ghi nhận.

Có thể nói nhóm HCNC do vi rút ECHO30 có các triệu chứng lâm sàng nh

hơn và thấp hơn, cụ thể với triệu chứng cứng cổ chỉ có 6,98 %, dấu hiệu

Kernig là 4,65 % (bảng 3.8).

Do chưa có một công bố nào trên thế giới về đặc điểm lâm sàng của

HCNC do vi rút Banna, kết quả trong nghiên cứu này cho thấy HCNC do vi

rút Banna có một số đặc điểm khác với vi rút VNNB và vi rút đường ruột

ECHO30 đó là bệnh nhân do vi rút Banna khả năng hồi phục chậm hơn đặc

biệt là triệu chứng rối loạn tâm thần cũng như thời gian điều trị trung bình dài

hơn so với bệnh nhân HCNC do vi rút VNNB và vi rút ECHO30, còn thời

gian điều trị trung bình của bệnh nhân HCNC do vi rút ECHO30 là ngắn nhất

(bảng 3.9). Mức độ trầm trọng và hậu quả của bệnh cũng khác nhau. Tỷ lệ tử

vong do vi rút Banna trên 14%. Ngược lại do vi rút ECHO30 không có trường

hợp nào tử vong, triệu chứng lâm sàng cũng không nặng nề như những trường

hợp do vi rút đường ruột là Enterovirus 71. Tỷ lệ tử vong của vi rút VNNB

cũng được ghi nhận nhưng với một tỷ lệ rất thấp 1,7 % có thể do 16,9% bệnh

nhân bị VNNB đã được tiêm phòng vắc-xin VNNB nên khi mắc HCNC sẽ

nh hơn [3], [6], [16], [31], [42], [73]. [88]. Một điểm chung của HCNC do vi

rút, là các chỉ số xét nghiệm sinh hóa của HCNC do vi rút VNNB, ECHO30

và vi rút Banna khác biệt không có ý nghĩa thống kê, dịch não tủy trong

không màu (bảng 3.5).

Mặc dù tỷ lệ tử vong do vi rút Banna thấp hơn khi so sánh với tỷ lệ tử

vong của các trường hợp do vi rút Nipah là trên 30 % [49]. Nhưng cho đến

nay, vi rút Nipah chưa tái xuất hiện và như vậy vi rút Banna có thể sẽ trở

thành một trong những nguyên nhân gây tử vong cao cho trẻ em trong khu

vực châu Á, khi tỷ lệ tử vong ở trẻ em bị HCNC do vi rút VNNB được khống

chế bằng vắc xin [10], [23], [31]. Chính vì vậy, vi rút Banna được cho là tác

nhân tiềm tàng gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và đang đề nghị xếp

vào nhóm tác nhân nguy cơ sinh học cấp 4.

Vi rút Banna không chỉ là tác nhân gây HCNC mà còn được ghi nhận

cũng là tác nhân gây hội chứng sốt không rõ nguyên nhân ở Trung Quốc [61],

[71], [72]. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay mới chỉ phát hiện được các

chủng vi rút Banna từ bệnh nhân HCNC. Cho thấy xác định vai trò gây bệnh

của vi rút Banna cần được thực hiện trong những nghiên cứu tiếp theo ở Việt

Nam, đặc biệt xác định nguyên nhân vi rút Banna trong số những trường hợp

bệnh nhân sốt không rõ nguyên nhân.

4.2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút Banna trong quần thể muỗi thu thập ở

một số địa phương Việt Nam.

Vi rút Banna là một loại vi rút do muỗi truyền, rất thích ứng trên dòng

tế bào C6/36. Để xác định các loài muỗi mang vi rút/véc-tơ truyền vi rút phải

dựa trên kết quả phân lập và định loại được vi rút từ muỗi.

Thu thập muỗi được thực hiện từ năm 2001- 2011 thuộc 04 vùng miền trên

cả nước bao gồm các tỉnh/thành phố Bắc Giang, Lạng Sơn, Hà Tây (nay là Hà

Nội), Thái Bình, Hà Nam (khu vực phía Bắc); Quảng Bình (khu vực miền

Trung); Đắk Lắk, Đắk Nông, Gia Lai, Kon Tum (khu vực Tây Nguyên) và

Cần Thơ, Long An (khu vực phía Nam). Kết quả có 66.760 cá thể muỗi của

21 loài muỗi được chia thành 1091 mẫu muỗi được thu thập (có 58.267 cá thể

muỗi cái và 8.493 cá thể muỗi đực). Trong số các cá thể muỗi thu thập được

loài Cx. pseudovishnui chiếm ưu thế và có tỷ lệ cao nhất (43,76%) gồm

29.217 cá thể muỗi.Tiếp theo là Cx. tritaeniorhynchus chiếm tỷ lệ 32,65%,

gồm 21.794 cá thể muỗi, các loài khác chiếm tỷ lệ thấp hơn bao gồm: Cx.

quinquefatigans (7,36%), Cx. vishnui (6,10%), Cx. gelidus (5,08%), Cx.

fatigans (0,94%), Cx. fuscocephalus (0,61%), Cx. quinquefaciatus (1,73%) và

Cx. whimorei (0,11%). Trong nghiên cứu chỉ thu thập được 13 cá thể muỗi

Cx. citiens (Long An), 02 cá thể muỗi Cx. pallidothorax (Bắc Giang) và 01 cá

thể muỗi Cx. bitaeniorhynchus (Bắc Giang). Ngoài ra, cũng thu thập được các

cá thể muỗi của Anopheles, Armigeres, Aedes và Mansonia, kết quả thu thập

cho thấy chiếm tỷ lệ thấp hơn so với Culex: An. hyncanus (146 cá thể chiếm

0,22%), An. vagus (114 chiếm 0,17%), An. subgroup (157 cá thể chiếm

0,24%), An. tesellatus (234 cá thể chiếm 0,35%), Ar. subalbatus (149 cá thể

chiếm 0,22%), Ar. magnus (104 cá thể chiếm 0,16%), Ae. albopictus ( 10 cá

thể chiếm 0,01%), Mx. indiana (144 cá thể chiếm 0,22%) và Mx. uniformis

(43 cá thể chiếm 0,06%) (bảng 3.11, 3.12, 3.13 và 3.14).

Đối chiếu với kết quả giám sát các loài muỗi ở các khu vực trên cả nước

với nhau cho thấy loài Cx. tritaeniorhynchus chiếm ưu thế ở miền Bắc

(80,93%), Miền Trung (58,79) và Tây Nguyên (46,95%). Riêng khu vực miền

Nam loài Cx. pseudovishnui chiếm ưu thế và có tỷ lệ cao nhất (74,51%). Về

số loài muỗi thu thập được ở các khu vực, miền Bắc có số loài muỗi thu thập

được lớn nhất (18 loài) tiếp theo là Tây Nguyên với 8 loài, miền Trung và

miền Nam có số loài muỗi thu thập được tương đương nhau (5 loài). Riêng

các loài An. albopictus, An. hyncanus, An. subgroup, An. tesellatus, An.

vagus, Ar. magnus, Ar. subalbatus, Cx. bitaeniorhynchus, Cx. fatigan chỉ có

ở khu vực miền Bắc. Điều này cho thấy có sự khác biệt rất rõ ràng về phân

bố, số lượng các loài muỗi ở các khu vực khác nhau trên cả nước; Sự khác

biệt này có thể do điều kiện địa lý, đặc điểm sinh thái khác nhau giữa các

miền vùng ở Việt Nam [14], [30], [39].

Các mẫu muỗi thu thập từ thực địa được lưu giữ để phân lập bằng dòng

tế bào C6/36 làm cơ sở khẳng xác định các loài muỗi là véc-tơ hoặc có thể là

véc-tơ hay bị nhiễm vi rút Banna. Trong nghiên cứu này có 744 mẫu muỗi

thuộc 21 loài muỗi được thu thập từ 12 tỉnh/thành phố ở miền Bắc, miền

Trung, miền Nam và Tây Nguyên, trong nghiên cứu này đã xác định có 46

chủng vi rút Banna được phân lập bằng dòng tế bào C6/36. Đây là dòng tế

bào được sử dụng rộng rãi để phân lập các virút Arbo do muỗi truyền với ưu

điểm không cần có diện tích sử dụng lớn như sử dụng động vật thí nghiệm để

phân lập. Mặt khác, sự thích ứng của vi rút Banna trên dòng tế bào này gây

hiện tượng bệnh lý tế bào rất điển hình (ảnh 1.1) sau 2 – 5 ngày gây nhiễm

trên dòng tế bào này. Ngoài ra, sự thích ứng của vi rút Banna ở một số dòng tế

bào động vật có vú cũng được xác định, nhưng dòng tế bào muỗi C6/36 vẫn là

dòng tế bào lý tưởng được lựa chọn để phân lập vi rút Banna [27], [83], [99].

Kết quả phân lập vi rút từ muỗi bằng dòng tế bào C6/36 và định loại vi rút

bằng cặp mồi đặc hiệu vi rút Banna được thiết kế từ vùng gen số 12, để tạo

một sản phẩm PCR là 627 bp [21]. Với kết quả phân lập được 46 chủng vi rút

Banna từ muỗi, tỷ lệ phân lập được vi rút Banna từ muỗi là 4,22 % (46/1091).

Các tỉnh có mẫu muỗi phân lập được vi rút Banna có 9/12 tỉnh bao gồm: Bắc

Giang, Quảng Bình, Kon Tum, Đắk Lắk, Đắk Nông, Gia Lai, Cần Thơ, Long

100

An và Hà Tây. Tỷ lệ phân lập được vi rút khác nhau giữa các khu vực dao

động trong khoảng 1,61% - 16,67%.

Trong số 46 chủng vi rút Banna phân lập được ở 9/12 tỉnh có 02 chủng

phân lập được từ muỗi đực Cx. pseudovishnui ở Long An và 44 chủng phân

lập được từ muỗi cái của 8 loài bao gồm An. vagus, Ar. subalbalus, Cx.

quinquefaciatus, Cx. fuscocephalus, Cx. tritaeniorhynchus, Cx. vishnui, Cx.

pseudovishnui và Cx. gelidus.Việc phân lập được vi rút Banna từ muỗi đực là

một bằng chứng khoa học về sự truyền trực hệ vi rút Banna từ thế hệ này sang

thế hệ sau qua trứng và khẳng định vi rút Banna là một loại vi rút Arbo do

muỗi truyền, tồn tại trong tự nhiên ở loài muỗi và trong số các loài muỗi phân

lập được vi rút Banna, đã có được minh chứng Cx. pseudovishnui là véc tơ

chính của vi rút Banna [20]. Trong nghiên cứu này vi rút Banna được phân

lập từ rất nhiều loài muỗi khác nhau, với đặc điểm về sinh thái của những loài

vi rút này không giống nhau. Như vậy, để phòng chống véc tơ truyền vi rút

Banna sẽ phức tạp hơn nhiều so với việc phòng chống véc tơ truyền bệnh

VNNB hay sốt xuất huyết dengue [14], [30], [50], [58], [90].

Các chủng vi rút Banna phân lập được ở miền Bắc, miền Trung, Tây

Nguyên và miền Nam có sự khác biệt về số lượng ở Miền Nam số chủng vi

rút Banna phân lập được là 20 chủng/200 mẫu phân lập, tiếp theo là miền Bắc

với 12 chủng/744 mẫu phân lập, Tây Nguyên 10 chủng/123 mẫu phân lập và

cuối cùng là miền Trung 4 chủng/24 mẫu phân lập. Về số loài muỗi phân lập

được vi rút Banna: miền Bắc phân lập được vi rút Banna ở 6 loài muỗi bao

gồm An. vagus, Ar. subalbalus, Cx. quinquefaciatus, Cx. fuscocephalus, Cx.

tritaeniorhynchus và Cx. vishnui. Còn ở Tây nguyên phân lập được vi rút

Banna từ 5 loài muỗi bao gồm Cx. quinquefaciatus, Cx. fuscocephalus, Cx.

gelidus, Cx. tritaeniorhynchus và Cx. vishnui, miền Trung phân lập được vi

rút Banna từ 2 loài muỗi đó là Cx. tritaeniorhynchus và Cx. vishnui, miền

101

Nam phân lập được vi rút Banna từ 2 loài muỗi đó là Cx. pseudovishnui và

Cx. quinquefaciatus.

Như vậy vi rút Banna được phân lập từ loài muỗi Cx. tritaeniorhynchus

ở cả miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên; Riêng miền Nam không phân lập

được vi rút Banna từ Cx. tritaeniorhynchus. Ở miền Nam vi rút Banna chủ

yếu được phân lập từ loài Cx. pseudovishnui và Cx. quinquefaciatus. Trong

nghiên cứu này chưa phân lập được chủng vi rút nào từ các loài muỗi Cx.

quinquefatigans, Cx. fatigans, Cx. whimorei, C.x citiens, Cx. pallidothorax,

Cx .bitaeniorhynchus, An. hyncanus, An. subgroup, An. tesellatus, Ar.

subalbatus, Ar. magnus, Ae. albopictus, Mx. indiana và Mx. uniformis. Tuy

nhiên, việc phân lập được vi rút Banna từ 8 loài muỗi khác nhau cho thấy số

loài muỗi là véc tơ hoặc có thể là vec tơ của vi rút Banna rộng hơn so với véc

tơ truyền vi rút VNNB [14], [84], [85].

Trong số các tỉnh được chọn làm điểm thu thập muỗi, có ba tỉnh muỗi

được thu thập quanh năm đó là Cát Quế, Hà Tây (miền Bắc) và huyện Cờ Đỏ

ở tỉnh Cần Thơ và huyện Châu Thành ở tỉnh Long An (miền Nam), nhưng kết

quả phân lập được vi rút Banna từ muỗi ở miền Bắc chủ yếu trong các tháng

3, tháng 5 và tháng 6. Còn ở miền Trung vi rút Banna được phân lập chủ yếu

từ các mẫu muỗi thu thập trong các tháng 3 và tháng 8. Ở miền Nam, vi rút

Banna được phân lập chủ yếu từ các mẫu muỗi thu thập trong các tháng 3 và

tháng 10; Ở Tây Nguyên, vi rút Banna được phân lập từ muỗi thu thập ở thực

địa trong các tháng 3, tháng 6 và tháng 9. Dựa trên kết quả nghiên cứu của đề

tài này, việc lựa chọn thời điểm để thu thập muỗi phân lập vi rút Banna có thể

căn cứ vào thời điểm thu thập mẫu muỗi ở từng khu vực để có kết quả phân

lập được vi rút Banna tỷ lệ cao hơn từ muỗi, ngoài ra cũng cần phải coi trọng

sự biến đổi khí hậu, vì nó cũng có thể ảnh hưởng đến sự xuất hiện và tồn tại

của tác nhân gây bệnh [74].

102

Trong nghiên cứu này xác định có rất nhiều loại muỗi là véc tơ hoặc có

thể là véc tơ truyền vi rút Banna được phát hiện ở Việt Nam, cho thấy sự cần

thiết nghiên cứu xác định vai trò gây bệnh của vi rút Banna trong những

nghiên cứu tiếp theo. Hơn thế nữa Cx. tritaeniorhynchus và Cx. vishnui được

xác định là véc tơ chung của vi rút VNNB, vi rút Banna và vi rút Nam Định,

vi rút Alpha ở Việt Nam có thể gây hiện tượng đồng nhiễm vi rút ở người, cần

được đề cập trong những nghiên cứu tiếp theo ở Việt Nam [14],[44], [51],

[83], [84], [86].

Đối với vi rút VNNB và vi rút Banna không chỉ có véc tơ chung, mà ổ

chứa vi rút là động vật gần người (lợn) cũng đã được chứng minh bằng kết

quả giám sát huyết thanh học hoặc phân lập vi rút [5], [21], [35], [72], [93].

Ở Trung Quốc, vi rút Banna được phân lập từ muỗi, từ huyết thanh của

gia cầm, của lợn thu thập ở vùng Mending và vùng sông Lancang của tỉnh

Yunna, Hainan, Gansu, Beijing, Shenyang và ishuangbanna tỉnh Yunnan,

Trung Quốc [35], [71], [72], [93]. Tuy nhiên, số liệu về giám sát huyết thanh

học sự lưu hành của vi rút Banna trong gia cầm, ổ chứa gần người vẫn còn rất hạn chế ở Việt Nam.

4.3. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử của vi rút Banna

phân lập được ở Việt Nam.

Để định loại và xác định genotype của vi rút Banna không thể dựa

vào chẩn đoán huyết thanh học mà phải xác định bằng kỹ thuật giải trình tự

gen để đưa ra bằng chứng xác định nguồn gốc xuất hiện vi rút Banna ở Việt

Nam là do xâm nhập từ bên ngoài hay là vi rút lưu hành trong tự nhiên, nên

trong nghiên cứu này đã sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định các

genotype của một số chủng vi rút Banna phân lập được ở Việt Nâm là sự lựa

chọn kỹ thuật nghiên cứu rất khoa học và hiện đại. Các chủng vi rút Banna

103

được lựa chọn để giải trình tự gen là những chủng vi rút lần đầu tiên phân lập

được từ người bệnh/ổ chứa vi rút/muỗi tại một số điểm nghiên cứu, trên cơ sở

này đưa ra được bằng chứng có tính thuyết phục về nguồn gốc sự xuất hiện và

lưu hành của vi rút Banna ở Việt Nam.

Vi rút Banna chỉ có một type huyết thanh duy nhất, nhưng có hai

genotype khác nhau, đó là genotype A, genotype B và trong từng genotype có

phân chia phân nhóm genotype. Vi rút Banna được xác định lưu hành rộng rãi

ở một số nước trong khu vực châu và chủng vi rút Banna đầu tiên được

phân lập từ bệnh nhân ở Trung Quốc năm 1987 [35], [38], [99]. Còn ở Việt

Nam, vi rút Banna được phát hiện từ dịch não tủy của bệnh nhân HCNC, từ

muỗi và lợn trong các năm 2002 - 2005 [19], [21], [83], nên cần có nghiên

cứu về dịch tễ sinh học phân tử để xác định nguồn gốc các chủng vi rút Banna

ở Việt Nam.

Trước đây, họ Reoviridae có 9 chi vi rút, trong số này có 4 chi vi rút

gây bệnh cho người đó là các chi vi rút: Orthoreovirus (Reovirus), Orbivirus,

Rotavirus và Coltivirus; Các chi vi rút còn lại gây bệnh cho cây, côn trùng và

cá. Trong số các chi vi rút gây bệnh cho người, Chi Coltivirus bao gồm có hai

nhóm vi rút đó là Coltivirus nhóm A và Coltivirus nhóm B; Coltivirus nhóm

A là những vi rút do ve truyền có hai type huyết thanh, type huyết thanh 1 bao

gồm các chủng vi rút phân lập từ châu Mỹ và type huyết thanh 2 bao gồm các

chủng vi rút phân lập từ châu u. Còn Coltivirus nhóm B là những vi rút do

muỗi truyền chỉ có một type huyết thanh duy nhất [21], [35], [36], [47], [48].

Khi nghiên cứu về tính chất kháng nguyên và đặc điểm phân tử của các

chủng vi rút thuộc Coltivirus nhóm B cho thấy chúng có sự khác biệt nên

được đề nghị tách ra khỏi chi Coltivirus để tạo thành một chi vi rút mới đó là

chi Seadornavirus (là từ viết tắt của cụm từ tiếng Anh: South-East Asian

104

dodeca RNA viruses) bao gồm các chủng vi rút Banna và vi rút Kadipiro phân

lập từ châu [35]. Do vậy, từ sau năm 2000 họ Reoviridae bao gồm có 10 chi

vi rút trong đó có 5 chi gây bệnh cho người đó là các chi vi rút: Orthoreovirus

(Reovirus), Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus và Seadornavirus [21].

Vi rút Banna là vi rút Arbo do muỗi truyền có vật liệu di truyền là ARN

sợi kép gồm 12 phân đoạn, thuộc họ Reoviridae. Độ dài các phân đoạn của vi

rút Banna cũng rất khác nhau dao động trong khoảng 862 bp – 3747 bp, riêng

phân đoạn 12 là ngắn nhất chỉ có 862 bp, trong đó có 612 bp mã hóa protein

VP12, còn lại 250 bp là vùng không mã hóa [35], [47]. Để phân biệt các

chủng vi rút Banna, lấy ngưỡng 18 % sự khác nhau về trình tự nucleotide các

vùng gen của vi rút được sử dụng để tách các chủng vi rút Banna và Kadipiro

ra khỏi chi Coltivirus để tạo thành một chi vi rút riêng biệt, chi

Seadornavirrus [61].

Trình tự vùng gen mã hóa số 12 của các chủng vi rút Banna được lựa

chọn để phân tích genotype các chủng vi rút Banna phân lập ở Việt Nam và

một số vùng địa lý ở châu . Kết quả nghiên cứu đã xác định các chủng vi rút

Banna được chia thành hai genotype khác nhau, các chủng vi rút ở Trung

Quốc và Việt Nam thuộc genotype A, còn các chủng phân lập từ Indonesia

thuộc genotype B. Genotype A được chia thành hai phân nhóm genotype A1

và A2; Trong phân nhóm genotype A1 được chia ra 4 clade độc lập với nhau

bao gồm các chủng vi rút Banna phân lập tại ở miền Bắc Trung Quốc,

Liaoning và Việt Nam; Còn phân nhóm genotype A2 bao gồm các chủng vi

rút Banna phân lập tại Miền Trung Việt Nam và Trung Quốc.

Trong nghiên cứu này xác định các chủng vi rút Banna phân lập từ

bệnh nhân, từ muỗi, lợn ở miền Bắc, miền Nam và Tây Nguyên, Việt Nam

thuộc phân nhóm genotype A1. Trong số 4 chủng vi rút Banna phân lập ở

105

miền Trung cùng một thời gian, cùng địa điểm nhưng được xác định thuộc

phân nhóm genotype A1 và thuộc phân nhóm A2 (hình 3.5). Điều này cho

thấy tính đa dạng của các chủng vi rút Banna lưu hành ở Việt Nam.

Vi rút Banna lưu hành rất rộng rãi ở Việt Nam, đặc biệt đã xác định

nhiều loài muỗi có thể là véc-tơ truyền vi rút Banna rất phong phú bao gồm

một số loài muỗi Culex và Aedes. Các nghiên cứu đã công bố ở Trung Quốc

ghi nhận được kết quả phân lập vi rút Banna từ dịch não tủy của bệnh nhân

HCNC nghi ngờ do vi rút và từ huyết thanh của bệnh nhân sốt không rõ

nguyên nhân [21], [35], [99], nhưng với sự lưu hành rộng rãi cho thấy vi rút

Banna có thể là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho người trong tương lai,

đặc biệt trong nghiên cứu này đã xác định tỷ lệ tử vong của HCNC do vi rút

Banna rất cao khoảng 14 %, thời gian điều trị trung bình dài, cho thấy loại vi

rút này có thể tiềm tàng là một tác nhân gây bệnh ở khu vực châu Á với gánh

nặng bệnh tật cần được quan tâm trong lĩnh vực điều trị và dự phòng bệnh.

Đặc biệt, khi nghiên cứu phát triển vắc xin để phòng bệnh chưa được đề cập,

vi rút Banna đang được để nghị xếp vào loại tác nhân sinh học cấp 4 [72].

Đặc điểm phân tử của các vi rút trong họ Reoviridae là ARN sợi kép

gồm nhiều phân đoạn. Tùy từng chi vi rút khác nhau số các phân đoạn cũng

khác nhau ví dụ như chi Orthoreovirus (Reovirus), Orbivirus, Rotavirus là

những chi vi rút có 10 hoặc 11 phân đoạn (không có phân đoạn thứ 12), còn

chi Coltivirus và Seadornavirus có 12 phân đoạn [36]. Chính vì vậy trong

nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn vùng gen mã hóa số 12 để thực hiện

nghiên cứu dịch tễ học phân tử của vi rút Banna ở Việt Nam. Trong nghiên

cứu này có 10 chủng vi rút Banna phân lập được ở Việt Nam từ người bệnh,

từ muỗi và lợn được giải trình tự vùng gen số 12 để phân tích so sánh với

trình tự vùng gen số 12 của các chủng vi rút Banna phân lập trong khu vực.

Trình tự vùng gen số 12 có nguồn gốc từ người, từ lợn và từ muỗi tương ứng

106

là 2, 1 và 7 có mã số của ngân hàng gen quốc tế, trong đó có 5 trình tự

nucleotide vùng gen số 12 được đăng ký trong nghiên cứu trước đây [83], còn

5 trình tự được đăng ký trong nghiên cứu này trong đó có 2 trình tự nucleotide

vùng gen số 12 từ chủng vi rút Banna phân lập ở bệnh nhân Việt Nam. Vì

vậy, nghiên cứu giải trình tự toàn bộ genome của chủng vi rút Banna phân lập

từ bệnh nhân Việt Nam cần được đề cập đến trong nghiên cứu tiếp theo.

Tuy nhiên, các nghiên cứu về đặc điểm vi rút học của vi rút Banna cho

thấy, trình tự nucleotide và cấu trúc của phân đoạn gen số 9 và 10 (VP9 và

VP19) của vi rút Banna có nhiều điểm tương đồng với phân đoạn gen số 4

(VP4), tiểu đơn vị VP5 và VP8 của vi rút Rota. Phân đoạn gen được xác định

mã hóa cho protein cấu trúc VP4, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế miễn

dịch của vi rút Rota. Do vậy, các nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử

của các phân đoạn gen số 9 và số 10 của vi rút Banna cũng cần được tiến

hành nghiên cứu để xác định vai trò của các phân đoạn gen này trong cơ chế

miễn dịch đối với con người trong những nghiên cứu tiếp theo. Hơn thế nữa,

vùng gen số 9 mã hóa cho protein VP 9 được quan tâm nghiên cứu phát triển

kháng nguyên tái tổ hợp dùng cho chẩn đoán, giám sát huyết thanh học rất

khả thi [35], [79], [80]. Ngoài ra, nghiên cứu về dịch tễ sinh học phân tử các

chủng vi rút Banna lưu hành ở Việt Nam cần được tiếp tục thực hiện trong

tương lại để xác định chiếu hướng tiến hóa của loại vi rút này trong tự nhiên.

Vi rút Banna chỉ có 1 type huyết thanh duy nhất, các chủng vi rút

Banna phân lập được ở Trung Quốc và Việt Nam thuộc genotype A, còn các

chủng phân lập từ Indonesia thuộc genotype B. Mặc dù cùng genotype A

nhưng các chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân Việt Nam có tỷ lệ tương

đồng nucleotide với chủng vi rút Banna phân lập từ Trung Quốc là 90,6 %,

tạo thành một clade riêng biệt, clade Việt Nam trong số 4 clade của genotype

A. Điều này chứng tỏ, các chủng vi rút Banna phân lập từ bệnh nhân Việt

107

Nam không có mối quan hệ di truyền gần gũi với các chủng vi rút Banna phân

lập từ bệnh nhân ở Trung Quốc. Như vậy, vi rút Banna lưu hành ở Việt Nam

có thể là vi rút tồn tại trong tự nhiên, có tính chất địa phương.

Trong những thập kỷ gần đây, xuất hiện nhiều tác nhân vi rút mới gây

bệnh cho người ở khu vực châu Á, Thái Bình Dương, Trừ vi rút HIV và viêm

gan B, phần lớn những vi rút mới được phát hiện là do côn trùng truyền hoặc

do động vật truyền [74]. Việc phát hiện được vi rút Banna, một loại vi rút do

muỗi truyền từ người bệnh ở Trung Quốc, Việt Nam cho thấy cần phát triển

nghiên cứu về lĩnh vực vi rút học, dịch tễ học đối với vi rút Banna khi đã có

bằng chứng nó là tác nhân gây bệnh cho người [21],[35],[37].

108

KẾT LUẬN

1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng Hội chứng não cấp

do vi rút Banna ở một số địa phương Việt Nam

1.1. Tỷ lệ mắc hội chứng não cấp do vi rút Banna ở Việt Nam

Bằng kỹ thuật ELISA đã phát hiện IgM (kháng nguyên) vi rút Banna

trong số 717 dịch não tủy bệnh nhân HCNC nghi ngờ do vi rút đã được loại

trừ căn nguyên vi rút VNNB, ECHO 30 và herpes simplex type 1 và type 4 tại

10 tỉnh thành trong cả nước với các đặc điểm như sau:

- Tỷ lệ xác định dương tính với kháng nguyên vi rút Banna dao động trong

khoảng 13,83% – 35,83 % tùy từng tỉnh/thành phố, tỉnh có tỷ lệ dương

tính cao nhất là Hà Tây (cũ) 35,83%, thấp nhất là Bắc Giang 13,83%;

- Kháng nguyên vi rút Banna ở bệnh nhân HCNC được ghi nhận quanh

năm, nhưng tập trung chủ yếu trong các tháng 5, 6, 7 và 8; số xác định

dương tính cao nhất vào tháng 6 (34,78%);

- Có sự khác nhau về tỷ lệ dương tính với kháng nguyên vi rút Banna theo

nhóm tuổi, thấp nhất ở nhóm < 1 tuổi (5,98 %), cao nhất ở nhóm ≥ 15 tuổi

(28,26%), các nhóm 1 – 4 tuổi, 5 – 9 tuổi và 10 – 14 tuổi dao động 19,02

% - 23,91 %;

- Tỷ lệ xác định dương tính với kháng nguyên vi rút Banna ở nam cao hơn ở

nữ tương ứng là 60,87 % và 39,13 %.

1.2. Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng hội chứng não cấp do vi rút Banna

- Bệnh nhân HCNC do vi rút Banna điều trị tại Viện Nhi Trung ương có các triệu chứng lâm sàng: sốt cao trên 37,5oC, đau đầu, nôn, co giật,

thóp phồng, cứng gáy, dấu hiệu Kernig, rối loạn tâm thần và giảm vận

109

động với tỷ lệ cao (23,3% - 78,64%), không có triệu chứng đau cơ, đau

khớp và mất cảm giác.

- Sau một tuần điều trị, 84,5 - 99,0% bệnh nhân HCNC do Banna vi rút

không còn các triệu chứng lâm sàng như lúc nhập viện, nhưng vẫn còn

triệu chứng rối loạn tâm thần với tỷ lệ cao (55,34%).

- Thời gian điều trị trung nh của HC C do vi rút Banna là 13,5 ngày,

thời gian điều trị tối đa là 85 ngày, dài hơn so với HC C do vi rút

B (11,3 ngày) và vi rút CH 3 (7,4 ngày)

- Bệnh nhân HCNC do vi rút Banna có tỷ lệ tử vong rất cao (14,6%) so

với HC C do vi rút B (1,7%) và vi rút CH 3 ( %)

2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút Banna trong quần thể muỗi thu thập ở

một số tỉnh, thành ở Việt Nam.

Đã phân lập được 46 chủng vi rút Banna từ 744 mẫu muỗi trong tổng

số 1. 91 mẫu muỗi thu thập từ thực địa thuộc 12 tỉnh thành miền Bắc, miền

Trung, niềm am và Tây guyên; tỷ lệ phân lập vi rút Banna từ muỗi là 4,2%

(46/1. 91), giữa các khu vực tỷ lệ mẫu muỗi phân lập được vi rút Banna dao

động trong khoảng 1,61% - 16,67%.

Vi rút Banna đã phân lập được từ mẫu muỗi của 8 loài bao gồm: Cx.

gelidus, Cx. tritaeniorhynchus, Cx. vishnui, An. vagus, Ar. subalbalus, Cx.

pseudovishnui, Cx. quinquefaciatus, và Cx. fuscocephalus. Trong số 46 chủng

vi rút Banna phân lập được có 02 chủng phân lập được từ muỗi đực Cx.

pseudovishnui ở Long An.

3. Xác định một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút Banna

lưu hành ở Việt Nam.

Đặc điểm sinh học phân tử của vi rút Banna lưu hành ở iệt am

được xác định dựa trên tr nh tự nucleotide vùng gen mã hóa phân đoạn số 12

110

của 1 chủng vi rút Banna, trong đó 5 chủng thực hiện trong nghiên cứu này

đã có mã số của ngân hàng gen quốc tế B773281, B773282, B773283,

B773284 và B773285 tương ứng với các chủng vi rút có k hiệu 3 45

(phân lập từ lợn ở Cát uế, Hà Tây), 3 99 (phân lập từ dịch não tủy ệnh

nhân ở Thanh Hóa, miền Bắc), 5 255 (phân lập từ dịch não tủy ệnh nhân

ở ia ai, Tây guyên), 5 3 1, 5 3 5 (phân lập từ muỗi ở Cần Thơ,

miền am)

Phân tích đặc điểm dịch tễ sinh học phân tử xác định các chủng vi rút

Banna phân lập từ ệnh nhân, muỗi, và lợn trong 2 2 – 2 5 ở miền Bắc,

miền Trung, miền am và Tây guyên là genotype , thuộc phân nhóm

genotype 1, tạo thành một clade riêng iệt, clade iệt am Riêng có 2

chủng vi rút Banna phân lập từ muỗi ở miền Trung thuộc phân nhóm

genotype 2 ự tương đồng so với tr nh tự nucleotide vùng mã hóa số 12 của

chủng vi rút Banna phân lập từ ệnh nhân ở Trung uốc (chủng prototype)

chỉ có 9 ,6 %, kh ng định các chủng vi rút Banna phân lập từ ệnh nhân iệt

am không phải là chủng xâm nhập từ ên ngoài mà là chủng nội địa

111

KIẾN NGHỊ

Một số kiến nghị trên cở sở kết quả nghiên cứu của đề tài:

1. Giám sát huyết thanh học và điều tra hồi cứu về đặc điểm lâm sàng HCNC

do vi rút Banna cho thấy đây là một bệnh do muỗi truyền, tỷ lệ số mắc được

ghi nhận ở mọi lứa tuổi, diễn biến lâm sàng nặng, tỷ lệ tử vong cao cho thấy

cần tiếp tục nghiên cứu biện pháp điều trị và dự phòng bệnh

2. Tỷ lệ mang vi rút Banna trong quần thể muỗi cao, các loài muỗi mang vi

rút Banna rộng hơn so với vi rút VNNB nên cần tiếp tục có nghiên cứu giám

sát sự lưu hành của vi rút Banna trong quần thể muỗi và tăng cường công tác

phòng chống bệnh do muỗi truyền nói chung và do vi rút Banna nói riêng

trong khi chưa thuốc điều trị đặc hiệu và vắc xin phòng bệnh

3. Phân tích đặc điểm phân tử các chủng vi rút Banna phân lập được ở Việt

Nam xác định chúng là vi rút có trong tự nhiên không phải là vi rút Banna

xâm nhập từ Trung Quốc, đây là một tác nhân gây HCNC và sốt không rõ

nguyên nhân, vì vậy cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển sinh

phẩm chẩn đoán và giám sát bệnh để giúp cho việc điều trị và dự phòng bệnh

có hiệu quả.

112

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Bùi Minh Trang, Nguyễn Viết Hoàng, Đỗ Phương Loan, Đặng Tuấn

Đạt, Phan Thị Tuyết Nga, Tống Thị Hà, Hoàng Minh Đức, Đặng Thu

Thảo, Trần Nguyệt Lan, Phan Thị Ngà (2010), “Phát hiện virus viêm não

Nhật Bản GENOTYP 1 và một số virus Arbo khác từ muỗi ở Tây

Nguyên, 2006-2007”, Tạp chí Y học dự phòng, tập XX, số 6 (114), tr.

147-154.

2. Hoàng Minh Đức, Phan Thị Ngà, Hồ Thị Việt Thu, Vũ Sinh Nam

(2011), “Phát hiện véc tơ truyền virus Banna ở tỉnh Cần Thơ, Long An”,

Tạp chí Y học dự phòng, tập XXI, số 7 (125), tr. 7-13.

3. Hoàng Minh Đức, Bùi Minh Trang, Tống Thị Hà, Vũ Sinh Nam, Phan

Thị Ngà (2012), “Xác định các loài muỗi có khả năng là véc tơ của virus

Banna ở Việt Nam, 2001-2011”, Tạp chí Y học dự phòng, tập XXII, số

4(131), tr. 148-155.

4. Phan Thị Ngà, Đỗ Phương Loan, Bùi Minh Trang, Hoàng Minh Đức, Vũ

Sinh Nam (2012), “Xác định một số đặc điểm phân tử các chủng virus

Banna phân lập từ bệnh nhân Hội chứng não cấp ở Việt Nam”, Tạp chí Y

học dự phòng, tập XXII, số 8 (135), tr. 179-187.

5. Phan Thị Ngà, Đỗ Phương Loan, Hoàng Minh Đức, Vũ Sinh Nam

(2012), “Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi rút Banna ở Việt Nam”, Tạp

chí Y học dự phòng, tập XXII, số 8(135), tr. 188-197.

6. Hoàng Minh Đức, Trần Văn Ban, Đỗ Thiện Hải, Nguyễn Thị Tuyết,

Đặng Thu Thảo, Phan Thị Ngà (2012), “Một số đặc điểm lâm sàng, dịch

tễ Hội chứng não cấp do vi rút Banna ở Việt Nam”, Tạp chí Y học dự

phòng, tập XXII, số 8(135), tr. 198-207.

7. Phan Thị Ngà, Bùi Minh Trang, Đặng Thu Thảo, Nguyễn Thành Luân,

Hoàng Minh Đức, Đỗ Phương Loan, Futoshi Hasebe, Kouichi Morita

113

(2013), “Đặc điểm dịch tễ huyết thanh học của Hội chứng não cấp do

virus Banna ở Việt Nam, 2002-2012”, Tạp chí Y học dự phòng, tập

XXIII, số 1 (136), tr. 12-19.

8. Yuki Takamatsu, Leo Uchida, Thi Nga Phan, Kenta Okamoto, Takeshi

Nabeshima, Thao Thi Thu Dang, Thien Hai Do, Thi Tuyet Nguyen,

Minh Duc Hoang, Xuan Luat Le, Futoshi Hasebe and Kouichi Morita

(2013), “An approach for differentiating echovirus 30 and Japanese

encephalitis virus infections in acute meningitis/encephalitis: a

retrospective study of 103 cases in Vietnam”, Virology Journal, 10:280.

114

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Đặng Đức Anh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Phan Thị Ngà (2010), "Vi rút

Y học", Nhà xuất bản Y học, tr. 7-30, 115-135, 220-256.

2. Lê Huy Chính (2001), "Vi sinh y học", Nhà xuất bản Y học, tr. 55-70.

3. Phạm Văn Dịu, Nguyễn Hồng Việt, Đặng Thị Trang, Nguyễn Văn

Thơm, Đông Kim Ninh, Nguyễn Viết Hoàng, Đỗ Phương Loan và Phan

Thị Ngà (2008), "Bệnh viêm não Nhật Bản và hiệu quả phòng bệnh bằng

vác xin ở tỉnh Thái Bình, 2003 -2007". Tạp chí Y học dự phòng, tập

XVIII, số (3/95), tr. 54 – 59.

4. Bộ Y tế, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (2001). Phân tích số liệu các

bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam (1996 – 2000), tr. 9 – 15.

5. Phạm Ngọc Đính, Phạm Thị Sửu, Lê Hồng Phong, Nguyễn Bình Nguyên

(2005). Đặc điểm dịch tễ học viêm não cấp do vi rút tại một số địa

phương miền Bắc 2003 – 2004. Tạp chí Y học dự phòng, tập XV, số 4

(75), tr. 64 – 68.

6. Trịnh Quân Huấn. Bệnh viêm não Nhật Bản. Nhà xuất bản Y học

(2010) tr. 1 – 85.

7. Hoàng Thủy Long (1991), "Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật Y học", Nhà

xuất bản Văn hóa, tr. 386-393.

8. Đỗ Phương Loan, Đặng Đình Thoảng, Bùi Minh Trang, Nguyễn Viết

Hoàng, Lê Thị Hiền Thu, Phan Thị Ngà. (2008), "Phát hiện tần suất

nhiễm vi rut viêm não Nhật Bản trong quần thể lợn ở Hà Nam bằng kỹ

thuật GAC-ELISA", Tạp chí Y học dự phòng, tập 2, số 18, tr 12-17.

115

9. Phan Thị Ngà, Lê Kim Phượng và cộng sự (1996). “Phân lập vi rút viêm

não Nhật Bản từ bệnh nhân ở miền Bắc Việt Nam trong các năm 1984 –

1993 bằng chuột ổ”. Tạp chí vệ sinh phòng dịch, tập VI số 1 (26), tr. 25-

29.

10. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Huỳnh Phương Liên, Trần Văn

Tiến (2000), "Sự thay đổi giảm tỷ lệ mắc bệnh VNNB (qua chẩn đoán

huyết thanh) ở miền Bắc Việt Nam, 1998", Tuyển tập công trình 1997 –

2000, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.

72-75.

11. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Huỳnh Phương Liên và cộng sự

(2000), "Giám sát huyết thanh học bệnh VNNB, 1998-1999", Tuyển tập

công trình 1997 - 2000 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Nhà xuất bản

Y học, Hà Nội, tr. 84-87.

12. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự (2002), "Giám sát,

chẩn đoán VNNB ở Việt Nam, 2000 – 2001", Tạp chí Y học Dự phòng,

tập XII, số 4 (55), tr. 5 - 10.

13. Phan Thị Ngà and K. Morita (2004), "Phát hiện vi rút viêm não mới từ

dịch não tủy của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt

Nam", Tạp chí Nghiên cứu Y học, tập 29, số 3, tr. 13-17.

14. Phan Thị Ngà, Vũ Sinh Nam, Masahiro Takagi (2004). Nghiên cứu sự

tồn tại của vi rút viêm não Nhật Bản trong tự nhiên. Tạp chí Y học dự

phòng tập XIV, số 1 (64) tr. 21 – 26.

15. Phan Thị Ngà (2004), "Phân lập các vi rút Arbo từ muỗi bắt tại thực địa

miền bắc và miền trung Việt Nam, 9/2001-12/2003", Y học Việt Nam,

Tập 31, số 5, tr. 22 – 26.

116

16. Phan Thị Ngà (2004), "Viêm não Nhật Bản và các kỹ thuật chẩn đoán",

Nhà xuất bản Y học.

17. Phan Thị Ngà, Mary B. Crabtree (2004), "Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR

để chọn mẫu dịch não tủy cho phân lập vi rút do muỗi truyền từ bệnh

nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam", Tạp chí nghiên cứu Y

học, tập 30, số 14, tr. 5 – 10.

18. Phan Thị Ngà, Đoàn Hải Yến (2005), "Chế tạo kháng nguyên vi rút Nam

Định góp phần chẩn đoán căn nguyên vi rút gây hội chứng não cấp", Tạp

chí Vệ sinh phòng dịch, tập XV, số 5(70), tr. 62-67.

19. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thanh Thủy, Bùi Minh Trang, Nguyễn Thị Tuấn,

Đặng Tuấn Đạt và Nguyễn Trần Hiển (2007), "Phát hiện một thành viên

vi rút thuộc họ Reoviridae gây hội chứng não cấp ở tỉnh Gia Lai", Tạp

chí Y học dự phòng, tập XVII, số 2(87), tr. 5-10.

20. Phan Thị Ngà, Huỳnh Thị Kim Loan, B i Minh Trang, Phạm Đỗ uyên,

Nguyễn Việt Hoàng, Lê Thị Hiền Thu, Hồ Thị Việt Thu, Huỳnh Phương

Thảo và Vũ Thị uế Hương (2007), "Nghiên cứu sự truyền trực hệ virút

Nam Định, vi rút colti nh m B ở Culex quinque fasciatus tại Cần Thơ,

Việt Nam". Tạp chí Y học dự phòng, tập XVII, số 3 (88), tr.10-15.

21. Phan Thị Ngà, Đỗ Phương Loan, Nguyễn Viết Hoàng, B i Minh Trang,

Lê Thị Hiền Thu, Trần Như Dương (2010). Hiệu quả ph ng bệnh viêm

não Nhật Bản bằng vaccin ở một số tỉnh, miền Bắc Việt Nam, 1998 –

2007. Tạp chí Y học dự phòng, tập XX, số 5 (113), tr. 29- 35.

22. Phan Thị Ngà, Nguyễn Viết Hoàng, B i Minh Trang, Đỗ Phương Loan,

Nguyễn Thanh Thuỷ, Trần uang Huy, Hoàng Minh Đức, Đặng Đức

Anh, Nguyễn Trần Hiển (2010). Phân lập và ác định một số đặc điểm

117

của virus Chikugunya ở Việt Nam, 2007. Tạp chí Y học dự phòng, tập XX

số 6(114), tr. 188 - 197.

23. Phan Thị Ngà, Đỗ Phương Loan, Nguyễn Hải Tuấn, Bùi Minh Trang,

Nguyễn Viết Hoàng, Đặng Thị Thu Hằng, Đặng Thị Trang, Nguyễn Văn

Thơm, Lâm Văn Tuấn, Dương Thị Hiển, Đặng Thanh Minh, Nguyễn

Trần Hiển (2013). Tác động của vắc xin phòng viêm não Nhật Bản đến

đặc điểm dịch tễ huyết thanh học của viêm não Nhật Bản ở Việt Nam.

Tạp chí Y học dự phòng, tập XXIII, số 11 (147), tr. 63 – 70.

24. Đặng Thị Trang, Nguyễn Văn Thơm, Phan Thị Ngà (2012). Hiệu quả

phòng bệnh bằng vacxin viêm não Nhật Bản bất hoạt để phòng bệnh cho

trẻ 1-5 tuổi, ở tỉnh Thái Bình, 2004-2010. Tạp chí Y học dự phòng, tập 22,

số 4 (131), tr. 78 - 83.

25. Nguyễn Đỗ Quyªn (1991), "Kỹ thuật thuật sản xuất kháng thể đơn

dòng, Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học", Nhà xuất bản Văn hóa, tr.

371-374.

26. Nguyễn Thanh Thủy, Nguyễn Kim Giao, Phạm Thị Ngà (2004), "Nhận

dạng vi rút viêm não mới được phân lập từ dịch não tủy của bệnh nhân

có hội chứng não cấp bằng kỹ thuật kính hiển vi điện tử", Tạp chí Y học

thực hành, số 11, tr. 57 – 59.

27. Nguyễn Thanh Thủy, Bùi Minh Trang, Nguyễn Thị Tuấn, Phan Thị Ngà

(2008), "Đặc điểm hình thái và sự nhân lên của vi rút Banna trên tế bào

muỗi Aedes albopictus dòng C6/36", Tạp chí Y học dự phòng, tr. 35-40.

28. Nguyễn Thị Tuấn, B i Minh Trang, Đỗ Phương Loan, Nguyễn Viết

Hoàng, Lê Thị Hiền Thu, Phan Thị Ngà (2009). "Xác định sự lưu hành

của vi rút Banna ở Việt Nam và thử nghiệm chế tạo kháng thể kháng vi

rút", Tạp chí Y học dự phòng, tập XIX, số 8(107), tr.15-18.

118

29. Nguyễn Thị Hiền Thanh (2003), "Bước đầu tìm hiểu căn nguyên gây

viêm màng não ở trẻ em do một số vi rút đường ruột", Tạp chí Y học dự

phòng, tập 8, số 4 (6), tr. 5-12.

30. Đặng Đình Thoảng, Nguyễn Ngọc Tâm, B i Minh Trang, Nguyễn Thị

Yên, Phan Thị Ngà (2008), "Nghiên cứu sự biến động và ác định véc tơ

truyền vi rút viêm não Nhật Bản tại tỉnh Hà Nam, 2006 – 2007", Tạp chí

Y học dự phòng, tập XVIII, số 3 (95), tr. 45 - 52.

31. Nguyễn Thu Yến, Trần Văn Tiến, Huỳnh Phương Liên, Phan Thị Ngà và

cộng sự (2000), "Hiệu quả ph ng bệnh VNNB ở huyện Gia Lương, Bắc

Ninh sau 5 năm gây miễn dịch bằng vác in VNNB do Viện Vệ sinh

Dịch tễ Trung ương sản uất", Tuyển tập công trình 1997 - 2000 Viện Vệ

sinh Dịch tễ Trung ương, Nhà uất bản Y học, Hà Nội, tr. 63-66.

TIẾNG ANH

32. Alexander J. P., Baden L., Pallansch M. A., Anderson L. J

(1994). "Enterovirus 71 infections and neurologic disease - United

States, 1977 - 1991", Journal Infect Dis.169, pp. 905–908.

33. "Arboviral Infections of the Central Nervous System -- United States.

1996-1997", Vol 47, No. MMWR25. P. 517.

34. Atassi M Z et al (2000), "Molecular Immunology", pp. 1234-1239.

35. Attoui H., Charrel, R. N., Billoir, F., Cantaloube, J.-F., de Micco, P. &

de Lamballerie (1998), "Comparative sequence analysis of American,

European and Asian isolates of viruses in the genus Coltivirus", Gen

Virol, vol. 79, pp. 2481–2489.

119

36. Attoui H., Billoir F., Biagini P., de Micco P. & de Lamballerie X. s.l.

(2000), "Complete squence determination and genetic analysis of Bana

virus and Kadipiro virus: prosal for assignment to a new genus

(seadornavirus) within the faminy Reoviridae". J. Gen Virol, vol. 81, pp.

1507-1515.

37. Attoui H., et. al (2005). “Coltiviruses and seadornaviruses in North

America, Europem and Asia”. Journal Emerging Infectious diseases, 11

pp. 1673 - 1679.

38. Brown S E, B M Gorman, R B Tesh, and D L Knudson (1993),

"Coltiviruses isolated from Mosquitoes Collection in Indonesia",

Virology. J, vol 196 (89), pp. 363-367.

39. Bryant J. Crabtree M. B. Nam V. S., Yen N. T., Duc H. M., Miller B. R

(2003). “Isolation of arboviruses from mosquitoes collected in Northern

Vietnam”. The American Society of Medicine and Hygiene, 73, 92 pp.

470 – 473.

40. Brunel D., Leveque N., Jacques J., Renois F., Motte J., Andreoletti L.

(2008). Clinical and virological features of an aseptic meningitis

outbreak in North-Eastern France, 2005. J. Clin Virol 42 pp. 225-228.

41. Calisher C H, Shope R E and Walton T E (1998), "Cell culture for

diagnosis of Arbovirus infection in livestock and wildlife", Journal of

tissue culture method, vol 11 (3), pp. 157-163.

42. CDC (2009), "Arboviral Encephalitides".

43. Chaudhuri A., Kennedy P. G. E. s.l. (2002), "Diagnosis and treatment of

viral encephalitis", Postgrad Med J., vol. 78, pp. 575-583.

120

44. Chen B. San-ju TAO (2005), "Studies of Coltivirus in China", Chinese

medical Journal, Vol.118, No.7, pp. 581-586.

45. Edwin H. Lennette, PhD David D Lannette, PhD Evelyne T Lennette

(2005), "Diagnostic procedures for viral", Rickettsia and Chlamydial

infections, 7th edition, Vol. 11, pp. 189-209.

46. Fidan Jmor, Hedley CA Emsley, Marc Fischer, Tom Solomon, and

Penny Lewthwaite (2008), "The incidence of acute encephalitis

syndrome in Western industrialised and tropical countries", Viro J , Vol.

134, pp.5.

47. Field N B, Niber M L, Schiff L A, Tyler K L (1996), "Reoviridae,

Reovirus and their replication, Reovirus", Fields Virology, Third Edition,

pp. 1553-1555, 1557-1588, 1597-1617.

48. Field B. N. Knipe D. M, Holey P M et al (1996), "Field Virology".

Lippincott Reven Press. 3th Edition, pp. 825-885, 931-1023.

49. Goh K. J., Tan C. T., Chew N. K., Tan P. S. K., Kamarulzaman A., Sại

S. A., Wong K. T., Abdullan B. J. J., Chua K. B., Lam S. K. (2000),

"Clinical feature of Nipah virus encephalitis among pig farmers in

Malaysia", The New England Journal of Medicine, Vol. 342 (17), pp.

1229 – 1235.

50. Gong Z. D., Xu P. T., Wang Y. M., et al.(1992), "Another type of new

arboviruses recovered from mosquitoes and patients with fever of

unknown origin in Yunnan province", Chin J Virol (Chin), vol 8, pp.

152-157.

51. Ha D. Q., Calisher C. H., Tien P. H., Karabatsos N., and Gubler D. J.

(1995). “Isolation of a newly recognized Alphavirus from mosquitoes in

121

Vietnam and evidence for human infection and disease”. Am. J. Trop.

Med. Hyg. 53(1) pp. 100 -104.

52. Hallow E. and Lane D. (2001), "Production of antibody", 4th Edition,

pp. 10-45.

53. Hazelton P R, Gelderblon H R (2003), "Electron microscopy for rapid

diagnosis of infection agent in emergent situation", Emerging Infectious

Disease, vol 9(3), pp. 294-303.

54. Hein, J.J. (1990). “Unified approach to alignment and phylogenies.” In

Methods in Enzymology, Vol. 183, pp. 626-645.

55. Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989). “Fast and sensitive multiple

sequence alignments on a microcomputer.” CABIOS, Vol. 5, No. 2, pp.

151-153.

56. Hillis, D. M & Bull, J. J. (1993). An empirical test of bootstrapping as a

method for assessing confidence in phylogenetic analysis. Syst Biol 42,

pp. 182-182.

57. Hsu C. H., Lu C.Y., Shao P. L., Lee P. I., Kao C. L., Chung M. Y.,

Chang L. Y., Huang L. M. (2011). Epidemiologic and clinical features of

non-polio enteroviral infections in northern Taiwan in 2008. J Microbiol

Immunol Infect, 44, pp. 265-273.

58. Hurk A. V., Ritchie S., and Montgomery B. (1996), "The mosquitoes of

North Queensland: Identification and Biology, includes common biting

midges, in Queensland Health", Queensland Government, pp. 174.

59. Igarashi A, Mastuo S and Hayashi K (1982), "Isolation of Japanese

encephalitis and Getah viruses from mosquitoes colected in Nagasaki

122

city in the year of 1980-1981, using Aedes alpopictus clone C6/36 cells",

Tro. Med J. no. 34(78), pp. 47-53.

60. Igarashi A (2000), "Technical manual of Arbovirus study", Institute of

Tropical medicine Nagasaki University- Japan, pp. 2-26.

61. Jaafar F. M., Attoui H., Mertens P. Philippe P. C. De Micco, DE

Lamballerie Xavier (2005), "Structural organization of an encephalitis

human isolate of Banna virus", Journal of General Virology, Vol.86(4),

pp.1147-1157.

62. Knipe D. M., Howley P. M. (2007) Fields Virology, Fifth Edition,

Volume 1, Section 1, General Virology, pp. 3 – 606.

63. Kuno G (1997), "Universal diagnostic RT- PCR protocol for

Arboviruses", Journal of Virology Methods, vol. 72 (89), pp.27-41.

64. Kuno G, Gubler D J et al (1985), "Antigen capture ELISA for the

identification of dengue viruses", J. of Virolog. Meth, Vol. 12 (93), pp.

93-103.

65. Kumar R., Tripathi P., Singh S. and Bannerji G. (2006), "Clinical

features in children Hospitalized during the 2005", Epidemic of Japanese

encephalitis in Uttar Pradesh, India. Journal of Clinical infectious

díeases pp. 123 – 131.

66. Kumar A., Shukla D., Kumar R., Idris M. Z., Misra U. K., Dhole T. N.

(2011). An epidemic of encephalitis associated with human enterovirus

B in Uttar Pradesh, India, 2008. J. Clin Virol 51 pp. 142-145.

67. Kurtz J. B, Steven J Read (1999), "Laboratory diagnostics of common

viral infections of the central nervous system by using a single multiplex

PCR screening assay", J. of clinical micrology, vol. 37(5), pp.1352-1355.

123

68. Kupila L., Vuorinen T., Vainionpäā R., Marttila R. J., and Kotilainen P.

(2005), "Diagnosis of enteroviral meningitis by use of polymerase chain

reaction of cerebrospinal fluid, stool, and serum specimens", Clinical

Infectious Diseases, vol. 40, no. 7, pp. 982-987.

69. Kuwata R., Nga P. T., Yen N. T., Hoshino K.,Isawa H., Higa Y, Hoang

N. V., Trang B. M., Loan D. P., Phong T. V., Sasaki T., Tsuda Y.,

Kobayashi M., Sawabe K and Takagi M. (2013). Surveillance of

Japanese encephalitis virus infection in mosquitoes in Vietnam from

2006 to 2008. Am. J. Trop. Med. Hyg. 88 (4), pp. 681 – 688.

70. Lauber C. , Ziebuhr J., Junglen S., Drosten C., Zirkel F., Nga P. T.,

Morita K., Snijder E. J., and Gorbalenya A. E. (2013). “Mesoniviridae: a

new family in the order Nidovirales formed 4 by a single species of

mosquito-borne viruses”. For publication in Archives of Virology

71. Li QP, Xie XC, Zhi Q, et al. s.l. (1992), "First isolation of 8 strains of

new orbivirus (Banna) from patients with innominate fever in Xinjiang",

Endemic Dis Bull (Chin), Vol. 7, pp. 77-81.

72. Liu H. et al. (2010), "Banna virus in China, 1987-2007", Emerging

Infectious Diseases, Vol. 16, No. 3, pp. 514-517.

73. Lowry P. W., Truong D. H., Hinh L. D., Ladinsky J. L., Karabatsos N.,

Cropp C. B., Martin D., Gubler D. J. (1998). Japanese encephalitis

among hospitalized pediatric and adult patients with acute encephalitis

syndrome in Hanoi, Vietnam 1995. Am J Trop Med Hyg, 58, pp. 324-

329.

74. Mackenzie J. S., Chua K. B., Daniels P. W., Eaton B. T., field H. E.,

Hall R. A., Halpin K., Johansen C. A., Kirkland P. D., Lam S. K.,

124

McMinn P., Nisbet D. J., Paru R., Pyke A. T., Ritchie S. A., siba P.

Smith d. w., Smith G. a., Hurk A. F., Wang L. F., Williams D. T. (2001).

Emerging viral Diseases of Southeast Asia and the Western Pacific.

Emerging Infectious Disease, Vol. 7, No. 3, pp. 497 - 504.

75. Martin D. A., Muth D. A., Brown T, Jonhson A, Karabatos N. and

Roehrig J. T. (2000), "Standardization of Immunoglobumin M capture

enzyme- linked Immunosorbent assay for Routine diagnosis of Arboviral

infection", Journal of clinical microbiology, Vol. 89 (90), pp. 1823-

1826.

76. Max L. N. and Leslie A. S. (2001), "Reovirus and their replication",

Fields Virology, Chapter 52, pp. 1557- 1588.

77. Mertens P, s.l, "The dsRNA viruses", Virus Res, Vol. 101, pp. 29-43

78. Mertens, P. P. C., Arella, M., Attoui, H. & 41 other authors (2000),

"Reoviridae. In Virus Taxonomy: Seventh Report of the International

Committee on Taxonomy of Viruses", New York: Academic Press, pp.

395–480.

79. Mohd Jaafar F, Attou (2004), "VP9- based enzyme-linked

immunosorbent assay for detection of immunoglobulin G antibodies to

Banna virus (genus seadornavirus)", J.Virol Methods, Vol. 116 (89), pp.

55-61.

80. Mohd Jaafar F, Attoui H, Bahar MW, Siebold C, Sutton G, Mertens PP,

De Micco P, Stuart DI, Grimes JM, De Lamballerie X. s.l. (2005), "The

structure and function of the outer coat protein VP9 of Banna virus",

Structure, Vol. 13, pp. 17-28.

125

81. Mostafaie A., Roodbari F., Roustai M. H., , Soleimanjdahi H., Foroshani

R. S. and Sabahi F (2003), "Development of an enzyme-linked

immunosorbent assay for immunoglobulin M antibodies against measles

virus", Clinical and Diagnosis laboratory Immunology, Vol.10, No.3,

pp. 439-442.

82. Muller M, Montgomery B., Ingram A., and Ritchie S. (2001), "First

records of Culex gelidus from Australia", Journal of the American

Mosquito Control Association, Vol. 17, No. 1, pp. 79-80.

83. Nabeshima T, Nga P T, Guillermo P, Parquet M, C Yu F, Thuy N T,

Trang M B, Hien N T, Nam V S, Inoue S, Hasebe F and Morita K (

2008), "Isolation and molecular characterization of Banna virus derived

from mosquitoes in Northern and Central Vietnam", Emerging Infectious

Disease, Vol 14 (8), pp. 1276 - 1279.

84. Nabeshima T, Loan H.T, Inoue S., Sumiyoshi M., Haruta Y., Nga P.T.,

Huoung V.T., del Carmen Parquet M., Hasebe ,F, Morita K (2009).

Evidence of frequent introductions of Japanese encephalitis virus from

south-east Asia and continental east Asia to Japan. J. Gen Virol. pp.827-

832.

85. Nga P. T., Partquet M. C., Cuong V. D., Ma S. P., Hasebe F., Inoue S.,

Takagi M., Makino Y. and Morita K (2004). Shift in Japanese

Encephalitis virus (JEV) genotype circulating in northern Vietnam:

Implications for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to

East Asia. J. Gen Virol, pp. 1625 – 1631.

86. Nga P. T., Parquet Mdel C., Lauber C., Parida M., Nabeshima T., Yu

F., Thuy N. T., Inoue S., Ito T., Okamoto K., Ichinose A., Snijder E.

J., Morita K., Gorbalenya A. E. (2011). Discovery of the first insect

126

nidovirus, a missing evolutionary link in the emergence of the largest

RNA virus genomes. PLoS Pathog. Sep; 7(9):e1002215.

87. Norguera A. et al (2004), "Reovirus type 2 isolated from cerebrospinal

fluid", The Pediatric Infectious Disease Journal, vol 23, no 4, pp. 373 –

375.

88. Rayamajhi A., Ansari I., Ledger E., Bista K. P., Impoinvil D. E.,

Nightingale S., Kumar R., Mahaseth C., Solomon T., Griffiths M. J.

(2011). Clinical and prognostic features among children with acute

encephalitis syndrome in Nepal; a retrospective study. BMC Infect Dis

1471 – 2334/11/294 (12 pp).

89. Paireau J., Tuan N. H., Lefrançois R., Buckwaiter M. R., Nghia N. D.,

Hien N. T., Lortholary O., Poirée S., Manuguerra J. C., Gessain A.,

Albert M. L., Brey P. T., Nga P. T., Fontanet A.. 2012. Litchi -

associated Acute Encephalitis in Children Northern Vietnam, 2004 -

2009. Journal Emerging Infectious Disease, Vol 16, No 11, pp. 1817 -

1824.

90. Sirivanakarn S. 1976. A revision of the subgenus Culex in the Oriental

region (Diptera: Culicidae). Contributions of the American

Entomological Institute, Vol. 12. No. 2. pp. 1-272.

91. Sips G. J., Wilschut J., Smit J. M. (2012). Neuroinvasive flavivirus

infections. Rev Med Virol, 22 pp. 69-87.

92. Steven J. R., Katie J. M. J. and Charles R. M. B. (1997), "Aseptic

Meningitis and encephalitis: the role of PCR in the diagnostic

laboratory", J. Clinical microbiology, Vol. 56(8), pp. 691-696.

127

93. Tao S. J., Chen B. Q. (2005) Studies of Coltivirus in China. Clinical

Medical Journal, 118 (7) pp. 581 – 586.

94. Tan L. V., Qui P. T., Ha D. Q., Hieu N. B., Bao L. Q., Cam B.V., Khanh

T. H., Hien T. T., Chau N. V. V., Tam T. T., Hien V. M., Nga T. V. T.,

Schultsz C., Farra J., van Doorn H. R., de Jong M. D. (2010). Viral

Etiology of encephalitis in Children in Southern Vietnam: Results of a

One-Year prospective descriptive study. PLoS Negl Trop. Dis. 4 (10),

pp. 854 - 854.

95. Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0.

Molecular Biology and Evolution 24, pp. 1596-1599.

96. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. (1994). CLUSTAL W

Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment

through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight

matrix choice. Nucleic Acids Res 2, pp. 4673–4680.

97. Yen N. T., Duffy M. R., Hong N. M., Hien N. T., Fischer M., and Hills

S. L. (2010). Survellance for Japanese encephalitis in Vietnam, 1998 -

2007. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83 (4), pp. 816 - 819.

98. Voller A., Bidwell D. E., Bartlett A. (1982). ELISA technique in

virology. Alan Liss New York, pp. 59-81.

99. Xu P. T., Wang Y. M. (1990). New orbiviruses isolated from unknown

fever and encephalitis patients in Yunnan province. Chin J Virol, Vol.6,

pp. 27-33.

128

100. Weaver S. C., Powers A. M., Brault A. C. and Barret A. D. T. (1999),

"Molecular epimiological studies of veterinary Arboviral

encephalitides", Vet journal, Vol. 157 (4), pp.123-138.

101. Weaver R. F. (1999). Molecular Biology. 1st Edited WCB/McGraw Hill,

Boston, MA.

102. WHO (1985), "Progress in enzyme immunoassay: production of

reagents, experimental design, and interpretation", Bullection of the

WHO, Vol. 63(4), pp.793-811.

129

PHỤ LỤC

MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA HỒI CỨU BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG NÃO CẤP NGHI NGỜ DO VI RÚT

PHIẾU ĐIỀU TRA HỒI CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

Mã số :…………………………….

A. Tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu:



- Trẻ dưới 15 tuổi: : .................................................................................... - Có kết quả dương tính với virus Banna: ................................................... - Có kết quả dương tính với virus VNNB: ................................................. - Có kết quả dương tính với virus ECHO30: .............................................

  

B. Thông tin chung

[2] Ngày nhập viện: __/__/20__

[6] Dân

[1] Mã hồ sơ bệnh án: __ __ __ __ __ __ __ __ [3] Họ và tên bệnh nhi: ................................................................................................................... [4] Ngày tháng năm sinh: __/__/____ [5] Giới: Nam [1] [2] tộc:…………... [7] Họ tên bố/mẹ: ........................................................ [8] Số điện thoại liên lạc: ......................... [9] Số nhà: ................................................... [10] Phố: ................................................................... [7] Xã/phường: ............................................ [12] Quận: ...................................... .........................

C. Lý do nhập viện:

….………………………………………………………………………………

D. Thông tin lâm sàng

[01] Ngày khởi phát: __/__/____ [02] Dấu hiệu đầu tiên (1 dấu hiệu):………………….. [03] Con anh/chị có bị nhức đầu hay không? Có [1] Không [2] Không biết [3] [04] Từ lúc bị bệnh đến nay cháu có bị buồn nôn không? Có [1] Không [2] Không biết [3] [05] Cháu sau đó có nôn hay không? Có [1] Không [2] Không biết [3] [06] Nếu có, cháu bắt đầu nôn từ ngày nào? __/__/____ Không biết [3] [07] Nếu có, cháu bị nôn nhiều nhất bao nhiêu lần trong 24 giờ? __ lần Không biết [3] [08] Cháu có bị sốt không? Có [1] Không [2] Không biết [3] [09] Nếu có, cháu bắt đầu sốt từ ngày nào? __/__/____ Không biết [3] [10] Nếu có, cháu bị sốt cao nhất đo được là bao nhiêu độ trong lần bị bệnh này? _,_ 0C Không biết [3] [11] Cháu có bị đau cơ hay khớp không? Đau cơ [1] Đau khớp [1] Không đau [2]

130

PHIẾU ĐIỀU TRA HỒI CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

Mã số :…………………………….

[12] Anh chị cho cháu sử dụng thuốc gì trước khi đến đây?

[a] Uống thuốc hạ sốt Có [1] Không [2] Không biết [3] [b] Truyền dịch tĩnh mạch Có [1] Không [2] Không biết [3] [c] Thuốc kháng sinh Có [1] Không [2] Không biết [3] [d] Thuốc khác Có [1] Không [2] Không biết [3]

[13] Con của anh/chị đã được tiêm vắc xin VNNB phòng bệnh chưa?

Đã tiêm [1] Chưa tiêm [2] Không rõ/Không nhớ [3]

E. Khám khi nhập viện

[03] Cân nặng: __gram

[01] Nhiệt độ (kẹp nách): __,__0C [02] Chiều cao: ……cm [04] Thóp phồng: Có [1] Không [2] Lúc có, lúc không [4] [05] Cứng gáy: Có [1] Không [2] Lúc có, lúc không [4] [06] Dấu hiệu Kernig: Có [1] Không [2] Lúc có, lúc không [4] [07] Trạng thái tinh thần: Tỉnh táo [1] Lơ mơ [2] Hôn mê [2] [08] Vân động: Bình thường [1] Giảm vận động [2] Liệt [2]

F. Khám sau bảy ngày điều trị

[03] Cân nặng: __gram

[01] Nhiệt độ (kẹp nách): __,__0C [02] Chiều cao:……cm [04] Thóp phồng: Có [1] Không [2] Lúc có, lúc không [4] [05] Cứng gáy: Có [1] Không [2] Lúc có, lúc không [4] [06] Dấu hiệu Kernig: Có [1] Không [2] Lúc có, lúc không [4] [07] Trạng thái tinh thần: Tỉnh táo [1] Lơ mơ [2] Hôn mê [2] [08] Vân động: Bình thường [1] Giảm vận động [2] Liệt [2]

G. Thông tin về người trả lời (đặc điểm gia đình)

[01] Anh chị sinh năm nào? ________ Tuổi tính tròn theo dương lịch:_________tuổi

[02] Trình độ học vấn của bà mẹ

Không đi học [1] Tiểu học [2] THCS [3] PTTH [4] CĐ/ĐH [5] Không biết [9]

[03] Tình trạng hôn nhân?

Kết hôn [1] Độc thân [2] Góa [3] Ly dị[4] Ly thân [5] Không biết [9]

[04] Ai là người chăm sóc trẻ chính?

Mẹ [1] Khác___________ [2] Không biết [9]

131

PHIẾU ĐIỀU TRA HỒI CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

Mã số :…………………………….

[05] Trong gia đình có ai trước đó có triệu chứng giống trẻ không?

Có [1] Không [2] Không biết [3]

Cán bộ điều tra

H. Thông tin về người trả lời (đặc điểm gia đình) [01] Ngày lấy mẫu: __/__/_____ [02] Cán bộ lấy mẫu:_____________ [03] Loại mẫu: Huyết thanh [6] Dịch não tủy[7] [04] Xét nghiệm VNNB: [05] Ngày xét nghiệm:_________________________________ [06] Kết quả xét nghiệm: Dương tính [1] Âm tính [2] Không chắc chắn[3] [07] Xét nghiệm Banna: [08] Ngày xét nghiệm:_________________________________ [09] Kết quả xét nghiệm: Dương tính [1] Âm tính [2] Không chắc chắn[3] 07] Xét nghiệm Echo 30: [08] Ngày xét nghiệm:_________________________________ [09] Kết quả xét nghiệm: Dương tính [1] Âm tính [2] Không chắc chắn[3]