Luận văn: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH DO VIỆN PASTEUR TP. HCM SẢN XUẤT (part 5)

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

117
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan, các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài vi nấm Aspergillus flavus trên các hạt đậu mốc và lúa mì mốc. Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm nấm Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và Carl xuất bản năm 1962, người ta gọi là aflatoxin

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH DO VIỆN PASTEUR TP. HCM SẢN XUẤT (part 5)

41 4 3 ,7 4 3 ,6 4 3 ,7 4 3 ,2 Trung bình 3,63 SD 0,28 CV% 7 ,8 Bảng 4.4: Kết quả về độ lặp lại của cột đối với AFG1 ở lượng 19 ppb Lượng AFG1 cho Lư ợng AFG1 vào cột (ppb) thu hồi (ppb) 19 16 19 17 19 16 19 15 19 15 19 15 19 16 19 15 19 14 19 14 Trung bình 15,3 SD 1 ,23 CV% 8 ,03 Nhận xét: Bảng 4.3 và b ảng 4.4 cho thấy ít có sự ch ênh lệch về kết quả khảo sát của các cột khác nhau (10 cột) với cùng một lượng AFG1 cho vào mỗi cột IAC (SD= 0,28 và 1,23 tương ứng với lượng AFG1 4 ng và 19 ng). Khả năng bắt giữ AFG1 tương đối đồng đều, thể hiện qua hệ số biến thiên thấp (CV% < 20%, CV% = 7,8% và 8,03% tương ứng với lượng AFG1 4 ng và 19 ng).
42 Từ kết quả thu được khi thí nghiệm được bố trí tương tự với AFB1 , CV% = 13,17% và 9,19% tương ứng với 5 ng và 20 ng lượng AFB1[2], cũng thấp hơn 20%, chứng tỏ cột IAC do Viện Pasteur sản xuất th ể hiện độ đồng đều chấp nhận được trong phân tích.
43 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận - Cột IAC tạo thành có kích thước 0,4 x 10 cm với nồng độ kháng thể kháng AFB1 là 2,5 mg/ml gel CNBr - activated sepharose 4B, có khả năng bắt giữ AFB1 và AFG1. - Độ nhạy của cột IAC: 1 ppb. - Độ lặp lại của cột IAC: CV = 7,8% với lư ợng 4 ng AFG1 CV = 8,03% với lượng 19 ng AFG1. 2. Đề nghị - Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá khác của cột như: dung tích cột, hiệu suất thu hồi để có thể kết lưận thuyết phục về khả năng bắt AFG1 của cột IAC. - Do có sự tương đồng về cấu trúc ở vòng difuran giữa AFB1, AFG1 và AFM1, là vị trí đặc hiệu miễn dịch của AFB1, do tính độc cũng như khả năng hiện diện trong sản phẩm sữa, cần thiết kh ảo sát các chỉ tiêu đánh giá đối với AFM1.
44 Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Dương Ngọc Diễm, 2003. Tạo kháng thể kháng ochratoxin và giá ái lực bắt 1. Ochratoxin. Khóa luận tốt nghiệp, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Bùi Th ị Mỹ Duyên, 2004. Khảo sát các đặc tính của cột sắc kí ái lực miễn dịch dùng trong định lượng Aflatoxin B1 do Viện Pasteur TP. HCM sản xuất. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong Công Ngh ệ Sinh Học. Nhà xu ất bản Khoa học và Kĩ thu ật, Hà Nội. 201 trang. 4. Trần Minh Đức, 2002. Khảo sát tình hình nhiễm Aflatoxin B1 trên thức ăn hỗn hợp cho heo tại thị xã Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Đậu Ngọ c Hào và Lê Thị Ngọ c Diệp, 2003. Nấm mộc và độc tố aflatoxin trong 5. th ức ăn chăn nuôi. Nhà xu ất b ản Nông Nghiệp, Hà Nội. 210 trang. 6. Đặng Văn Hòa, 1993. Giáo trình kiểm nghiệm thuốc, trường Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam 7. Đặng Văn Giáp, 1997. Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS – Excel. Nhà xu ất bản Giáo dục. 8. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Toán – Thống kê sinh vật, lý thuyết xác suất. Trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam 9. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Thực hành hóa sinh miễn dịch . Nhà xuất bản Đại Học Quố c Gia Hà Nội, 316 trang. Lâm Thị Nhạn, 2001. Cải tiến kĩ thuật định lượng Aflatoxin trong thực phẩm. 10. Lu ận án th ạc sĩ khoa học, chuyên nghành hóa phân tích, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quố c Gia, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam . 11. Lê Anh Phụng, 2001. Bệnh nhiễm độc Aflatoxin và các phương pháp phát hiện Aflatoxin. Chuyên đ ề cấp tiến sĩ, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
45 Trịnh Việt Anh Tài, 2002. Đánh giá hiệu quả thu hồi Aflatoxin của cột ái lực 12. miễn dịch do phân viện công nghệ sau thu hoạch Tp. HCM chế tạo. Lu ận văn tốt n ghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 13. Châu Vĩnh Th ị, 2001. Khảo sát tình hình nhiễm vi nấm sinh độc tố & độc tố a flatoxin trên một số thành phẩm đông dược Việt Nam lưu hành tại Tp Hồ Chí Minh. Luận văn thạc sĩ dược học, chuyên nghành Kiểm nghiệm - Độ c chất, trường Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh , Việt Nam. 14. Nguyễn Lê Trang, 2003. Aflatoxin B1: sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt các a flatoxin(s). Thuyết minh đề tài nghiên cứu Khoa học Công nghệ cấp bộ, phòng Miễn dịch, viện Pasteur, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. TIẾNG ANH 15. Carlos A. Muro-Cacho et al, 2004. Mycotoxins: Mechanisms of toxicity and Methods of Detection for identifying exposed individuals. Journal of Land Use, Vol. 19:2, spring, 2004. 16. Fun sun Chun, 1983. Immunoassays for analysis of Mycotoxins. Journal of Food Protection, Vol. 47, No. 7, Pages 562 -569 (July 1984). 17. M. O. Moss, 1998. Recent study of mycotoxins. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement 1998, 84, 62S-76S. 18. Maryann E. Smela et al, 2001. The chemistry and biology of aflatoxin B1: from mutational spectrometry to carcinogenesis. Carcinogenesis vol.22 no.4 pp.535- 545, 2001. 19. Yu et al, 2004. Clustered Pathway Genes in Aflatoxin Biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology, March 2004, p. 1253-1262, Vol 70, No. 3. 20. http://www.schimmel-schimmelpilze.de/schimmelpilz/aspergillus-flavus.html 21. http://www.schimmel-schimmelpilze.de/schimmelpilz/aspergillus- parasiticus.html 22. http://www.ehso.com/ehshome/aflatoxin.php
46 Phụ lục 1 : Các đặc tính lí hóa của AFT. Công Trọng Điểm Hu ỳnh Bước sóng huỳnh quang khi kích thích Aflatoxin thức lượng nóng quang bằng tia 365 nm nguyên phân chảy dưới λEx’ (nm) trong tử tia UV Metanol ACN Chloroform Aceton Nhóm difurocoumacyclopentenone AFL B1 C17H12O6 312 267 Xanh 430 416 415 422 lam AFL B2 C17H14O6 314 303- Xanh 430 419 415 420 306 lam AFL B2a C17H14O7 320 240 Xanh lam AFL M1 C17H12O7 328 299 Xanh 428 lam AFL M2 C17H14O7 330 293 Xanh 430 lam AFLM2a C17H14O8 346 248 Lục Nhóm difurocoumarolactone AFL G1 C17H12O7 328 257- Xanh 450 440 435 448 259 lục AFL G2 C17H14O7 330 237- Xanh 450 437 435 448 240 lục AFL G2a C17H14O8 346 190 Xanh lục
47 Phụ lục 2: Bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD50 trên động vật (Lu, 1996) Độc tính LD50 Cực độc (Super toxic)  5 mg/kg Rất độc (Extremely toxic) 5 -50 mg/kg Độc tính cao (Highly toxic) 50 – 500 mg/kg Độc tính khá cao (Moderately toxic) 0.5 – 5 g/kg Độc tính nhẹ (Slightly toxic) 5 – 15 g/kg Không độc (Practically nontoxic) > 15 g/kg Phụ lục 3: Sơ lược cách chế tạo cột IAC (Viện Pasteur Tp. HCM, 2002) 1. Gây miễn dịch Thỏ để gây miễn dịch phải hoàn toàn khỏe mạnh, 2-3 tháng tuổi, trọng lượng trên 2 kg. Lấy 1 ml máu tai trước khi tiêm mũi mẫn cảm để làm ch ứng. Kháng nguyên dùng tiêm là cộng hợp AFB1 – BSA của h ãng Sigma Chemical. Kháng nguyên được trộn với NaCl 0,9% và tá chất (lắc 30 phút) để thu được huyễn dịch AFB1 – BSA. Mũi mẫn cảm: tiêm 2 ml huyễn dịch/thỏ, liều tiêm được chia thành nhiều mũi trên lưng, 100 µl huyễn dịch còn lại tiêm ở một bên đùi. Đùi còn lại tiêm 100 µl vaccine ho gà. Mũi nhắc lại 1, 2, 3, 4, 5 tiêm trong 5 tháng (mỗi tháng 1 lần), quy trình tiêm tương tự nh ư trên nhưng lượng kháng nguyên AFB1 – BSA giảm dần và không có vaccine ho gà. 2. Tinh chế IgG 14 ngày sau lần tiêm thứ 5, lấy to àn bộ máu từ động mạch đùi. Ly tâm thu huyết thanh và tách bỏ hồng cầu, sau pha loãng huyết thanh gấp đôi bằng nư ớc muối sinh lí. Tủa IgG bằng (NH4)2SO4 45% bão hòa. Tiếp theo cho huyết thanh phản ứng với BSA đ ể loại các thành phần IgG kháng BSA. 3. Tạo cộng hợp sepharose – IgG kháng AFB1 IgG thu được sau khi tinh chế được gắn đồng trị lên sepharose đã được hoạt hóa bởi CNBr theo quy trình của nhà sản xuất Amersham – Biotech. Quá trình gắn
48 được thực hiện ở một trong hai chế độ: (1) 22 oC – 25oC trong 2 giờ hoặc (2) 4 oC trong 24 giờ. Trong thời gian tạo cộng hợp, hỗn hợp được trộn liên tục bằng máy lắc nhẹ. Khi cộng hợp kết thúc, cần kiểm tra lại IgG còn dư trong hỗn dịch để đánh giá hiệu suất gắn. Hiệu suất gắn càng cao thì chất lư ợng cột càng cao. Cộng hợp sepharose – IgG là gel có độ thấm cao khi cho chất lỏng chảy qua. Sau khi xử lí để loại bỏ các IgG còn bám cơ học trong gel, gel được đóng vào cột nhựa kích thước 0.4 cm x 10 cm với lượng 0.1 ml – 0.15 ml/cột. Cột được bảo quản ở nhiệt độ 4oC – 8oC. Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất 1 năm (Nguyễn Lê Trang, 2003) Phụ lục 4 : Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – H itachi) Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA).