Luận văn : ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO part 3

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

136
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vì vi sinh vật vẫn còn sống và có khả năng sinh sản trong cơ thể kí chủ nên nó kích thích các tế bào nhớ sản xuất kháng thể liên tục. Tuy nhiên, số lƣợng vi sinh vật phát triển trong cơ thể kí chủ khó có thể kiểm soát và trong một số trƣờng hợp các vi sinh vật có thể phục hồi gây bệnh. Vacxin này không nên dùng cho những con thú bị suy giảm miễn dịch. Hiện nay, ngƣời ta dùng một số phƣơng pháp công nghệ sinh học để loại bỏ gene gây bệnh...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO part 3

10 trƣờng không thích hợp, các vi sinh vật này sẽ thích nghi dần dần và trở thành không độc. Vì vi sinh vật vẫn còn sống và có khả năng sinh sản trong cơ thể kí chủ nên nó kích thích các tế bào nhớ sản xuất kháng thể liên tục. Tuy nhiên, số lƣợng vi sinh vật phát triển trong cơ thể kí chủ khó có thể kiểm soát và trong một số trƣờng hợp các vi sinh vật có thể phục hồi gây bệnh. Vacxin này không nên dùng cho những con thú bị suy giảm miễn dịch. Hiện nay, ngƣời ta dùng một số phƣơng pháp công nghệ sinh học để loại bỏ gene gây bệnh để tạo ra vacxin an toàn hơn. 2.1.2.2 Vacxin vô hoạt (inactivated vaccine) Tác nhân gây bệnh sẽ bị giết hay bất hoạt bằng phóng xạ, formalin, nhiệt độ...không còn khả năng nhân lên trong vật chủ nhƣng vẫn đảm bảo đặc tính kháng nguyên của chúng. Vacxin này an toàn hơn so với vacxin sống, dễ sản xuất và sử dụng. Tuy nhiên nó không có khả năng hoặc nếu có thì rất ít kích thích tế bào T gây độc và phải sử dụng lập lại nhiều lần. 2.1.2.3 Vacxin phân tử a. Vacxin kết hợp (conjugate vaccine)[10] Ngƣời ta chỉ sử dụng những phần của tác nhân gây bệnh có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch nhƣ protein hay carbonhydrate. Các vi sinh vật gây bệ nh sẽ bị phá vỡ từng phần và các thành phần sẽ đƣợc tinh sạch. Ngƣời ta chỉ sử dụng một vài thành phần để tiêm. Bằng cách này ngƣời ta sẽ tránh đƣợc những nguy cơ tiềm ẩn của độc tố và những thành phần che khuất kháng nguyên ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch bị loại bỏ. Tính chất kháng nguyên của các thành phần này phải đƣợc kiểm tra khả năng tạo đáp ứng miễn dịch chính xác và hiệu quả. Dựa trên hiện tƣợng một số vi khuẩn bị đột biến mất vỏ thì không có khả năng gây bệnh, ngƣời ta đã dùng vỏ polysaccharide nhƣ một kháng nguyên để làm vacxin. Tuy nhiên polysaccharide là những kháng nguyên độc lập với tế bào T (T- independent antigenes). Do đó khả năng nhớ là không có hay nếu có thì rất thấp và việc tiêm lập lại nhiều lần để tăng hàm lƣợng kháng thể cũng không hiệu quả. Ngƣời ta sử dụng thêm protein mang để liên kết với đƣờng. Việc này sẽ chuyển kháng nguyên độc lập với tế bào T thành kháng nguyên phụ thuộc tế bào T nhờ việc tạo ra những epitope của tế bào T. 10
11 Kỹ thuật này đã thành công trên những loại vacxin viêm gan B,viêm gan A, Salmonella typhi... b.Vacxin tái tổ hợp (recombinant vaccine)[17] Cùng với sự tiến bộ vƣợt bậc của các kỹ thuật sinh học phân tử, xu hƣớng sản xuất vacxin tái tổ hợp ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi. Việc sản xuất vacxin bằng các công nghệ truyền thống có nhiều hạn chế không chỉ do tính an toàn mà còn do nhiều tác nhân gây bệnh không thể nuôi cấy trên qui mô lớn. Gen mã hóa cho protein immunoprotective (những kháng nguyên tạo ra phản ứng miễn dịch tự nhiên) trên vi sinh vật gây bệnh sẽ đƣợc clone. Những gen này sau đó đƣợc tái tổ hợp với DNA của một vector của loài vi khuẩn hay virus khác, thƣờng là plasmid rồi đƣợc đƣa vào tế bào vi sinh vật tạo nên dòng vi sinh vật tái tổ hợp. Những vi sinh vật tái tổ hợp này sẽ đƣợc nuôi cấy trong các bình lên men lớn để có thể thu đƣợc lƣợng lớn protein tái tổ hợp mà sau đó sẽ đƣợc tinh sạch dễ dàng. Bằng kỹ thuật này ngƣời ta có thể sản xuất vacxin trên qui mô công nghiệp với giá thành thấp. Hiện nay, ngƣời ta đã thành công trong việc sản xuất vacxin hepatitis B, B. pertussis,...bằng phƣơng pháp này. Tuy nhiên việc nghiên cứu vacxin này đòi hỏi tốn nhiều thời gian, tài chính, trang thiết bị đắt tiền. Ngƣời ta cũng có thể dùng kỹ thuật công nghệ sinh học để loại bỏ những gen mã hóa cho những protein “không cần thiết”. Do đó có thể làm giảm tính độc của vi sinh vật. c.Vacxin peptide tổng hợp [17] Hƣớng sản xuất vacxin này phát triển nhanh nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật tạo dòng và giải trình tự của DNA. Ngƣời ta nghiên cứu các cấu trúc không gian và trình tự của các epitope của kháng nguyên đƣợc nhận biết bởi tế bào B và tế bào T. Nhóm này có thành phần vào khoảng 8-12 axit amin. Sau khi đƣợc tổng hợp các axit amin này phải đƣợc gắn vào giá đỡ, thƣờng là các hạt polyme có khả năng hấp phụ cao và sử dụng chung với các loại chất bổ trợ tốt. Ƣu điểm của loại vacxin này là an toàn, ổn định, dễ bảo quản và vận chuyển. Tuy nhiên việc sản xuất vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao. d.Vacxin DNA [17] Khi đƣa DNA của một loại plasmid vectơ có chứa gen kháng nguyên vào cơ thể thì thấy có hiện tƣợng gen kháng nguyên đó tổng hợp ra protein kháng nguyên 11
12 và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein do gen kháng nguyên kích thích sinh ra. Dựa trên hiện tƣợng này, ngƣời ta tạo ra vacxin DNA bằng cách tái tổ hợp gen kháng nguyên của một plasmid vectơ với một hệ thống promotor mạnh. Loại kháng nguyên này sẽ kích hoạt tiết interleukin 12. Interleukin này sẽ tác động vào những tế bào chết tự nhiên gây phân tiết interferon-g kích thích sự phát triển của tế bào trợ giúp T. Vacxin này có ƣu thế lớn với phƣơng thức gây miễn dịch đơn giản, bền với nhiệt độ do chỉ chứa DNA thuần khiết.Vacxin DNA an toàn đối với những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Tuy nhiên việc đƣa một DNA lạ vào cơ thể đôi khi gặp nguy hiểm do sự nhạy cảm c ủa tế bào miễn dịch đối với chính DNA đó. e.Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật[3] Nhờ công nghệ gen ngƣời ta có thể chuyển nhiều gen quý giá vào hệ gen thực vật tạo nên nhiều loại cây có khả năng sản xuất ra nhiều sản phẩm có giá trị thông qua hệ thống plasmid Ti và Agrobacter tumefaciens. Dựa vào cách này ngƣời ta đã chuyển một hay nhiều gen kháng nguyên của vacxin động vật và ngƣời vào thực vật, thƣờng chú trọng vào những loại cây thực phẩm . Nhờ đó có thể thu đƣợc vacxin thông qua thực vật. Ƣu điểm của vacxin này là an toàn, dễ sử dụng. Tuy nhiên, việc tạo vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao. 2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e Bệnh phù ở heo xuất hiện ở heo sau cai sữa với các triệu chứng phù ở nhiều vị trí nhƣ: mi mắt, sống mũi và trán, thành dạ dày, màng treo ruột và cuối cùng rối loạn thần kinh. Bệnh này liên quan độc tố VT2e không bền nhiệt đƣợc tạo ra bởi một vài chủng E. coli nhƣ: O138:K81; O139:K82; O141: K85 [11]. Độc tố này tác động lên các tế bào ruột, đồng thời chúng cũng tác động lên nội mô thành mạch máu, hậu quả là làm giảm sự hấp thu do các tế bào nhung mao ruột bị tổn thƣơng. Sự hƣ hại của các tế bào nội mô mạch máu sẽ gây ra triệu chứng xuất huyết (Nguyễn Ngọc Hải, 1999). Lƣợng độc tố cần thiết để có thể dẫn đến các triệu chứng và các thƣơng tổn thần kinh đặc trƣng cho bệnh phù thì rất thấp. Liều LD50 (Lethal Dose)của VT2e trên heo khi tiêm tĩnh mạch là 3ng/kg thể trọng (MacLeod và cộng sự, 1991). 12
13 VT2e hay còn gọi là SLT-IIv là nhóm độc tố vero, đƣợc Konowalchuk và cộng sự đặt tên đầu tiên năm 1977. Độc tố này chung họ với nhóm của Shigella và có đặc trƣng gây độc trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney) hơn là trên tế bào Hela, do đó còn đƣợc gọi là độc tố VT2e. Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I. VT2e đƣợc cấu tạo từ hai thành phần: một đơn vị A nặng 32kDa và năm đơn vị B (7.7kDa/ đơn vị). Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase. Enzyme này sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA. Sự phân cắt này sẽ làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (elongation factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với tiểu phần 60S của RNA ribosome. Do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế bào. Những tiểu phần B chịu trách nhiệm cho khả năng kết dính những thụ thể bản chất glycolipid có sẵn trên bề mặt của tế bào ruột cũng nhƣ trên các tế bào vero. Các độc tố SLT-I và SLT-II chỉ liên kết với Gal 1-4Gal -4Glc 1-1Cer (globotriosyl ceramid- Gb3), trong khi độc tố VT2e liên kết với cả Gb3 và GalNAc 1-3Gal 1- 4Gal 1-4Glc 1-Cer (globotetraosyl ceramid-Gb4), Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 11- 4Gal 1-aGlc 1-1Cer (globopenosyl- Gb5) trên tế bào vero [13]. Các tế bào của lớp nội mô ở heo nhạy cảm với độc tố VT2e. Và độc tố này gây ra những tổn thƣơng chủ yếu trên lớp nội mô của mạch máu, làm biến đổi khả năng thấm của mạch máu và hậu quả gây nên chứng phù . Năm 1988, trình tự của một operon mã hóa cho độc tố VT2e đã đựơc báo cáo. Trình tự axit amin của tiểu đơn vị A của VT2e dài hơn một axit amin và tƣơng đồng 94% so với SLT-II. Trong khi tiểu đơn vị B của VT2e ngắn hơn hai axit amin, và tƣơng đồng 87% với SLT-II [7]. Việc phòng bệnh phù nhờ vacxin dựa vào độc tố VT2e cũng đã đƣợc nghiên cứu. MacLeod và Gyles đã chứng minh đƣợc khả năng bảo vệ heo con bằng cách ti êm tĩnh mạch độc tố VT2e bị vô hoạt bởi glutaraldehyde. Gordon và cộng sự đã phát hiện độc tố VT2e sau khi xử lý với formaldehyde có thể tạo miễn dịch trên heo con [9]. Tuy nhiên cách này có thể gây tồn dƣ độc tố in vivo. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng một kháng nguyên từ độc tố VT2e đã bị thay đổi một axit amin (Glu167-->Gln) trên vùng hoạt động của tiểu đơn vị A. Việc miễn dịch này có thể bảo hộ cho heo con khỏi bệnh phù bằng đƣờng miệng và không tạo các phản ứng phụ [7]. Tuy nhiên, cho đến nay 13
14 vẫn chƣa thấy loại vacxin dựa vào độc tố VT2e nào hiệu quả trong việc phòng chống bệnh phù trên heo. 2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB[6] Protein MBP-VT2eB là protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợp từ gen MPB-VT2eB có trọng lƣợng phân tử 47kDa. Gen này đƣợc mang bởi vectơ pMal-c2X chứa trong chủng E. coli DH5 do TS. Nguyễn Ngọc Hải tạo ra tại Pháp. Gen MPB-VT2eB đƣợc cấu thành từ gen mục tiêu VT2eB và gen MBP có sẵn trong vectơ pMal-c2X. Trong đó gen VT2eB mã hóa cho tiểu phần B của độc tố VT2eB. Tiểu phần B qui định khả năng kết dính của độc tố đối với các thụ thể có bản chất glycolipid trên tế bào đích. Do đó protein tiểu phần B không có khả năng gây bệnh và mang đặc tính kháng nguyên cho độc tố này. Việc gắn kết gen mục tiêu với gen MBP sẽ tạo nên hệ thống protein dung hợp với MBP (maltose binding protein). Hệ thống này sẽ biểu hiện khi gen đƣợc cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) và tổng hợp protein dung hợp mang protein MPB ở đầu amin và protein mục tiêu ở đầu carboxyl. Protein sinh ra sẽ tích lũy trong vùng chu chất (periplasm) nằm giới hạn giữa màng trong và màng ngoài của vi khuẩn. MPB có trung tâm cơ chất có ái lực cao đối với maltose và amylose, do đó có thể tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với MPB thông qua sắc ký ái lực. Ngoài ra, trên protein tái tổ hợp còn mang vị trí nhận biết đặc hiệu của một protease, do đó có thể phân cắt protein mục tiêu dễ dàng. Hệ thống gen chung VT2eB-MPB đƣợc mang bởi vectơ plasmid pMal-C2X. Gen mục tiêu VT2eB sẽ đƣợc tái tổ hợp với gen malE nhờ các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn trên các polylinker. Gen malE qui định cho việc tổng hợp protein MBP và hoạt động dƣới sự kiểm soát của gen khởi động ptac. Gen này đƣợc hoạt hóa bởi IPTG. Do đó khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ kích ứng sự tổng hợp protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Protein này sẽ đƣợc tinh sạch bằng cách cho qua các cột sắc ký mang hạt amylose. Protein mục tiêu có ái lực với amylose sẽ đƣợc giữ lại. Sau đó, tiếp tục cho dung dịch đệm maltose chạy qua cột sắc ký sẽ thu đƣợc protein này. 2.4 PHƢƠNG PHÁP OUCHTERLONY Phƣơng pháp Ouchterlony hay còn gọi là phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch đƣợc Orjan Ouchterlony phát hiện năm 1948. 2.4.1 Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên hai nguyên tắc: 14
15 Cấu trúc phân tử của agar Cấu trúc phân tử đặc trƣng của agar hay agarose cho phép các phân tử có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn 200 kDa khuyếch tán dễ dàng qua các khoảng trống giữa chúng. Nhờ vậy mà các phân tử kháng nguyên hay kháng thể có thể khuyếch tán qua gel tùy theo nồng độ ban đầu và bán kính Stoke, trong khi đó những phân tử ở dạng kết hợp có kích thƣớc lớn sẽ không thể di chuyển. Liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể Kháng nguyên liên kết với epitop kháng thể thông qua vị trí paratop theo nguyên tắc bổ sung không gian tƣơng tự liên kết giữa “ổ khóa - chìa khóa”. Sự liên kết đƣợc thiết lập và duy trì là nhờ các lực hấp dẫn có năng lƣợng nhỏ nhƣ:  Lực tĩnh điện giữa các nhóm COO- và NH3+ đối diện nhau của axid amin trong các chuỗi polypeptit.  Các liên kết hydro giữa các nguyên tử H+ và N- hoặc O-.  Các liên kết kị nƣớc giữa các axit amin kị nƣớc.  Lực Van der Waals do sự di động của các điện tử giữa hai phân tử. Sự liên kết giữa các kháng nguyên- kháng thể là một phản ứng phát nhiệt, giải phóng ra năng lƣợng từ khoảng 2- 40Kcal/mol. Sự liên kết giữa kháng nguyên- kháng thể là một phản ứng cân bằng, có thể đƣợc biểu diễn nhƣ sau: KN + KT KN-KT + nhiệt lƣợng Hằng số kết hợp K= [KN-KT]/[KN][KT] (K: biểu hiện cho sự nghịch đảo của nồng độ l/mol). Sự phù hợp của một kháng thể đối với kháng nguyên đặc hiệu tạo điều kiện xuất hiện nhanh chóng một phản ứng kết tủa hay ngƣng kết. Phản ứng giữa kháng nguyên kháng thể là phản ứng đặc hiệu: một vị trí paratop của kháng thể chỉ kết hợp với một epitop của kháng nguyên. Tuy nhiên tính chất này chỉ tƣơng đối chứ không tuyệt đối có thể bị phân li do các yếu tố nhƣ nhiệt độ, môi trƣờng axit, môi trƣờng ion cao. Do đó phản ứng này phụ thuộc vào hằng số kết hợp, hóa trị của kháng thể và số lƣợng của epitop, nhiệt độ pH và lực ion của môi trƣờng phản ứng. 15
16 Hình 2.2 Liên kết kháng nguyên- kháng thể (http://www.biorama.ch/biblio/b60immu/i20agak/ak40.htm) 2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch Các thử nghiệm này đƣợc thực hiện bằng cách cho kháng nguyên hay kháng thể vào các giếng nhỏ đƣợc cắt trên agar hay agarose. Dung dịch kháng nguyên hay kháng thể chuẩn đƣợc cho vào các giếng trung tâm, kháng thể hay kháng nguyên cần tìm sẽ đƣợc cho vào các giếng xung quanh. Chúng sẽ khuyếch tán trong thạch. Nếu chúng gặp nhau ở cùng một tỉ lệ tƣơng đƣơng thì sẽ tạo nên một vạch có thể quan sát bằng mắt thƣờng. 2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO VERO 2.4.1 Sơ lƣợc về tế bào vero Dòng tế bào biểu mô vero nhạy cảm với độc tố SLT đƣợc Y. Yasumura và Y. Kawakita phát hiện đầu tiên vào năm 1962 ở trƣờng đại học Chipa (Nhật Bản). Tế bào này thu đƣợc từ mô tế bào thận khỉ Châu Phi trƣởng thành (African green monkey) (Cercopithecus) [13]. Dòng tế bào này có nhiều Gb3 và Gb4 trên màng tế bào chất do đó nên chúng đƣợc dùng để phát hiện các VT2e. Ngƣời ta có thể phát hiện sự hiện diện của SLT trong mẫu thông qua việc ủ dịch này trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero đơn lớp mỏng. Thông thƣờng các thử nghiệm đƣợc tiến hành trên những đĩa polystyren 96 giếng. Việc phát hiện sự hiện diện của độc tố này dựa trên sự phân tách tế bào vero sau khi ủ 48-72 giờ. 16
17 2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố [4] Khi kháng thể đặc hiệu gặp độc tố tƣơng ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố. Do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thể động vật. Phản ứng đó đƣợc gọi là phản ứng trung hòa độc tố. Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố là huyết thanh kháng độc tố. Ngƣời ta có thể định hiệu giá kháng thể kháng độc tố dựa trên phản ứng trung hòa xảy ra khi kháng độc tố kết hợp với độc tố tƣơng ứng. 2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phƣơng pháp trung hoà độc tố verotoxin trên tế bào vero. Phƣơng pháp trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá hiệu giá của kháng huyết thanh mang kháng thể của độc tố vero. Nguyên tắc của phản ứng này nhƣ sau: Trên tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ thể đặc hiệu có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào gây chết tế bào. Nếu độc tố này đƣợc ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết. Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào ngƣời ta có thể biết đƣợc là nó chết hay không. Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa đƣợc lƣợng độc tố ở liều TCID50 ngƣời ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả của vacxin. Protein MBP-VT2eB đƣợc tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trƣng trên tế bào đích. Do đó khi tiêm protein MBP-VT2eB trên heo thì heo sẽ tạo ra kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e. Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh. Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh. Nhờ đó đánh giá đƣợc khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein MBP-VT2eB trên heo. 17
18 PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM Thời gian : từ 1/3/2005 đến 30/7/2005 - Địa điểm thực hiện: -  Trại chăn nuôi heo của anh Thắng ở ấp 8, xã Tân Thạnh Đông, huyện Củ Chi.  Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.  Phòng kiểm định vacxin viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tiêm protein tái tổ hợp trên MBP-VT2e trên heo con theo mẹ và đánh giá độ an - toàn của dịch tiêm. Khảo sát liều TCID50 của độc tố VT2e trên tế bào vero. - Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP- VT2e theo phƣơng pháp khuyếch tán trên - thạch. Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2e bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố - trên tế bào vero. 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Vật liệu và thú thí nghiệm Heo con theo mẹ: 25 con. - Máu heo thí nghiệm - Vi khuẩn E. coli sinh độc tố VT2e O138:K28 (H28) - Vi khuẩn E. coli không sinh độc tố VT2e (DH5 ) - Tế bào vero - 3.3.2 Hóa chất thí nghiệm Chất bổ trợ Al(OH)3 - Môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero DMEM - - Trypsin 0,5% - Versene 0,2% Huyết thanh bê (Fetal calf serum: FCS) - Môi trƣờng lactose broth - - Agarose 18