Luận văn : KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO part 2

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

97
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

. Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, còn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng không phải là mối quan hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khoáng chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hoá và chuyển hoá quan trọng ở cây chủ. Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo hƣơng vị ở dâu tây...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO part 2

21 và có đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (môi trƣờng chỉ thích hợp với một vài loài vi khuẩn) [44], [50]. Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, còn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng không phải là mối quan hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khoáng chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hoá và chuyển hoá quan trọng ở cây chủ. Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hóa một số cơ chất không cần thiết ở thực vật thành sản phẩm có giá trị [35]. Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9]. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trƣờng nuôi cấy in vitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh) [39], [40]. Năm 1994, Holland và cộng sự công bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hoá nickel [35]. Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây có mối quan hệ mật thiết với các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp. có tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo. Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ: nuôi cấy mô, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong môi trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng
22 làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao cây mạ trong điều kiện in vitro [46]. Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. có hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả năng đẻ nhánh của lúa góp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngoài ra, các vi khuẩn Methylobacterium sp. còn có vai trò ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây lúa, góp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7%. Công trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tƣơng quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [47]. Qua các kết quả khảo sát về ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobactreium sp. lên sự hình thành mô sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn có ảnh hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mô sẹo ở các loại mô hay các loại cây nuôi cấy. Đối với Chrysanthenum sp. vi khuẩn hạn chế sự hình thành mô sẹo nhƣng kích thích sự hình thành phôi ở các mô sẹo này, trong khi đó ở Nicotiana tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mô sẹo ở mô phiến lá và mô lóng thân. Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng tác động lên quá trình biệt hóa cơ quan ở thực vật. Ngoài vai trò tác động của vi khuẩn thì bản chất của mô và loài thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ quan của nuôi cấy invitro. Bên cạnh đó các kết quả thí nghiệm còn cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sp. còn có khả năng tăng cƣờng quá trình hình thành rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp., so với đối chứng ở nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều hơn [9]. Ngoài PPFM, còn có những nghiên cứu sử dụng các loài vi khuẩn có lợi khác nhƣ khảo sát sự tăng trƣởng và phát triển của cây hoa Cúc, cây hoa Bi Bi và cây Địa Lan có sự hiện diện của Bacillus spp. trong nuôi cấy in vitro [5] cho kết quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp. có tác dụng khác nhau nhƣ tăng chiều cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi. Vi khuẩn Methanotropic có ảnh hƣởng đến sự
23 hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh cây [40]. Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên môi trƣờng nuôi cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39]. Từ những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ tƣơng hỗ có lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trƣởng của thực vật trong điều kiện in vitro và in vivo. 2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin Không chỉ có thực vật mà vi sinh vật cũng có thể tổng hợp auxin và cytokinin, đối với các vi khuẩn có lợi và vi khuẩn tƣơng tác với thực vật thì đây có thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển. Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi trƣờng chứa dịch nổi của PPFM bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) đã chứng tỏ vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50]. Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM có ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin có trong mô tế bào thực vật [35].
24 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian : từ tháng 3/2006 đến tháng 7/2006 Địa điểm : phòng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên giống lúa VĐ20 đƣợc cung cấp từ Công ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam. * Đặc tính nông học Giống lúa VĐ 20: là giống lúa cao sản ngắn ngày, thời gian sinh trƣởng 95- 100 ngày, cây cao 85- 90 cm, năng suất 6- 8 tấn/ ha. Dạng hình khá, bông to, ít lép, chín sớm, nhiễm bệnh vàng lá, chịu phèn trung bình. Hạt gạo thon dài, không bạc bụng, cơm thơm dẻo (Công ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam). (a) (b) Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bóc vỏ trấu, (b) hạt bóc vỏ trấu
25 Chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. 1019 do phòng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên phân lập cung cấp. * Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng 1019 [9] Đặc điểm hình thái, sinh lý Chủng 1019 là những vi khuẩn có màu hồng, hình que ngắn, có khả năng di động, Gram âm, nhiệt độ tăng trƣởng thích hợp từ 25-35oC Đặc điểm Chủng 1019 Màu sắc khuẩn lạc trên MMS Hồng nhạt Đƣờng kính khuẩn lạc 2-3 mm Hình dạng khuẩn lạc Tròn, lồi, nhầy, có viền trắng bên ngoài Kích thƣớc tế bào 2-4 x 4-6 m Khả năng di động Có Gram - pH thích hợp 5,8 ± 1 25-35oC Nhiệt độ Hình dạng tế bào Dấu phẩy, phình to ở hai đầu Trong giới hạn nồng độ các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật thƣờng sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật, thì nồng độ các chất điều hoà tăng trƣởng thực vật không ảnh hƣởng tới sự phát triển của chủng 1019, do vậy việc bổ sung hormone vào môi trƣờng nuôi cấy thực vật sẽ không ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng của vi khuẩn. Chủng 1019 tăng trƣởng tối đa sau 30 giờ nuôi cấy do đó thời gian thích hợp để thu nhận sinh khối tế bào là từ 12 đến 32 giờ sau nuôi cấy.
26 11 log (N/ml) 10,5 10 9,5 9 8,5 8 7,5 h 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019 Đặc điểm sinh hóa Chủng có hoạt tính catalase dƣơng tính và hoạt tính oxidase yếu. Hợp chất Chủng 1019 Methylamine - Trimethylamine + Acetate + Citrate + L-Glutamate + D-Glucose + D-Xylose, + L-arabinose Fructose + Betaine + Tartrate + Serbacate +
27 Ethanol + Nutrient agar + Lactose + Sucrose + Chủng 1019 có khả năng tổng hợp cytokinin và một lƣợng thấp auxin trên môi trƣờng nuôi cấy mô thƣc vật. 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu Thiết bị : tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân phân tích, phòng nuôi cây… Dụng cụ : pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, bình tam giác, đĩa petri, đèn cồn… 3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy Mẫu cấy : các hạt lúa giống VĐ20 Điều kiện nuôi cấy : môi trƣờng trƣớc khi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 20 phút. Phòng nuôi cấy: Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux - Nhiệt độ : 27 ± 2oC - Ẩm độ 70%- 80% - Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày - 3.2.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn Chủng 1019 đƣợc giữ trong glycerol 10%, sau đó phân lập trên môi trƣờng MMS + 1% methanol.
28 3.2.5 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) (Phụ lục 1). Môi trƣờng phân lập và làm thuần chủng 1019 là môi trƣờng MMS (methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Môi trƣờng MMS đƣợc thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút, sau đó để nguội và bổ sung methanol vào môi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, môi trƣờng rắn có bổ sung agar 20g/l trƣớc khi hấp. Hầu hết các chủng PPFM đều không cần vitamine hay các nhân tố tăng trƣởng khác trong quá trình tăng sinh. Môi trƣờng giữ giống chủng 1019 là môi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ lục 3). * Các môi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Các thành phần khác: Đƣờng: 20g/l - - Agar: 7g/l pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 – 5,8 Các chất kích thích sinh trƣởng: - BAP (6- benzylamino purine) NAA (α- naphthaleneacetic acid) - 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo) Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khi khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng MS + 2 mg/l 2,4- D để tạo mô sẹo [16].
29 Khử trùng mẫu: Hạt lúa bóc vỏ trấu Rửa xà bông trong 5-10 phút Rửa sạch bằng nƣớc máy mang vô tủ cấy Tráng bằng nƣớc cất vô trùng Lắc cồn 70o trong 1 phút Lắc Javel (1 Javel:3 H2O) xấp mặt hạt đổ Javel Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Gấp vào cấy Các mẫu cấy đƣợc đặt trong tối, nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ 72%. Theo dõi sự hình thành và phát triển của mô sẹo sau 2, 3 tuần, sau đó sử dụng mô sẹo làm vật liệu thí nghiệm.
30 Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên môi trƣờng tạo sẹo 3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng MMS (sử dụng phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 1010 tế bào/ml), lắc ở 37oC sau 87 giờ, sử dụng để bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm. 3.3.3 Nội dung thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số mẫu ở mỗi nghiệm thức là 30 mẫu. * Xử lý số liệu: Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC, sau đó dựa vào giá trị Prob trong bảng ANOVA để quyết định nên trắc nghiệm phân hạng hay không. Nếu có, dùng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan, ở mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết quả thí nghiệm. 3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt nhất cho khả năng nhân sẹo ở giống lúa VĐ20. Theo Đoàn Thị Phƣơng Thùy [6] có sự khác nhau giữa nồng độ auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo và nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng trƣởng mô sẹo của các giống lúa khác nhau, ở thí nghiệm này thay đổi nồng độ 2,4-D để xác định lại nồng độ auxin thích hợp cho khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20. Môi trƣờng nền (MTN): khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + 1mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP, bổ sung nồng độ 2,4-D [6]. Mẫu cấy: mô sẹo có diện tích bằng nhau. NT1: MTN + 0 mg/l 2,4-D NT2: MTN + 1 mg/l 2,4-D
31 NT3: MTN + 2 mg/l 2,4-D NT4: MTN + 3 mg/l 2,4-D Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mô sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 3.3.3.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ BAP/NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + bổ sung nồng độ BAP/NAA. Mẫu cấy: mô sẹo NT1: MTN + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT2: MTN + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT3: MTN + 1 mg/l BAP + 1mg/l NAA NT4: MTN + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT5: MTN + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT6: MTN + 2 mg/l BAP + 1mg/l NAA Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tạo chồi từ mô sẹo, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = (số mẫu tái sinh / số mẫu cấy)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu 3.3.3.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo.
32 Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA. Mẫu cấy: mô sẹo NT1: MTN + 0,5 mg/l NAA NT2: MTN + 1 mg/l NAA NT3: MTN + 1,5 mg/l NAA NT4: MTN + 2 mg/l NAA Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu: tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100 số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu 3.3.3.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + 2mg/l 2,4-D. Mẫu cấy: hạt lúa đã khử Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mô sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc.
33 3.3.3.5 Thí nghiệm 5: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l NAA, bổ sung nồng độ 2,4-D thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 1) Mẫu cấy: mô sẹo có diện tích bằng nhau. Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mô sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 3.3.3.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ BAP/ NAA thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 2) Mẫu cấy: mô sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấ y vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
34 NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy chồi(%) = (số cây nảy chồi / tổng số cây)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu 3.3.3.7 Thí nghiệm 7 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA thich hợp (kết quả từ thí nghiệm 4) Mẫu cấy: mô sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấ y vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu: tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100 số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu 3.3.3.8 Thí nghiệm 8 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20.
35 Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng. Mẫu cấy: mô sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mô sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc.
36 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần nuôi cấy Nghiệm Kích thƣớc mô sẹo 2,4-D (mg/l) BAP (mg/l) NAA (mg/l) thức (cm) sau 4 tuần 0,91c 1.1 0 0,5 1 0,63a 1.2 1 0,5 1 0,78b 1.3 2 0,5 1 0,71ab 1.4 3 0,5 1 * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). cm 1 0,91 0,9 0,78 0,8 0,71 0,63 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Nghiệ m th ức 1.1 1.2 1.3 1.4 Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau
37 Sau 4 tuần nuôi cấy, theo bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức (1.1) có kích thƣớc mô sẹo lớn nhất và có sự khác biệt rõ rệt so với các nghiệm thức còn lại. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P
38 (1.1) (1.2) (1.3) (1.4) 1 cm Hình 4.2: Các mô sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuôi cấy 4.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo Nghiệm Tỷ lệ tái sinh chồi (%) BAP NAA thức 2 tuần 3 tuần (mg/l) (mg/l) 41,66ab 58,33ab 2.1 1 0,1 50ab 66,66ab 2.2 1 0,5 58,33ab 58,33ab 2.3 1 1 33,33a 33,33a 2.4 2 0,1 33,33a 50,33ab 2.5 2 0,5 66,66b 75b 2.6 2 1 * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05).
39 Tỷ lệ ( %) 80 70 60 tuần 2 50 tuần 3 40 30 20 10 0 Nghiệ m thức 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Nhìn chung tỷ lệ tái sinh chồi khá cao. Theo kết quả thống kê, tỷ lệ tái sinh chồi của các nghiệm thức đều tăng chỉ có ở 2 nghiệm thức (2.3) và (2.4) là không tăng, và nghiệm thức (2.6) có tỷ lệ tái sinh cao nhất. Sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05). Từ kết quả bảng cho thấy, tỷ lệ nồng độ giữa BAP và NAA quá cao sẽ gây ức chế sự tái sinh chồi, nhƣ nghiệm thức (2.4) mô sẹo không những tái sinh chồi ít mà một số mẫu bị đen không phát triển, do đó việc kết hợp thích hợp tỷ lệ nồng độ BAP và NAA sẽ giúp mô sẹo tái sinh tốt.
40 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mô sẹo Nghiệm Số chồi trên mẫu BAP NAA thức 2 tuần 3 tuần (mg/l) (mg/l) 1.16ab 1,33ab 2.1 1 0,1 1,75ab 2,08b 2.2 1 0,5 1,91b 2,41b 2.3 1 1 0,66a 0,66a 2.4 2 0,1 1,66ab 2,16b 2.5 2 0,5 1,91b 2,5b 2.6 2 1 * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 3 2,5 2 Số chồi tuần 2 1,5 tuần 3 1 0,5 0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghi ệm thức Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian