intTypePromotion=3

Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 3

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

0
136
lượt xem
18
download

Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 3

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ở cả hai trƣờng hợp, các phân đoạn DNA sẽ đƣợc phân tách thông qua điện di trên gel polyacrylamide hay polymer trong các mao quản có khả năng phân tách hai đoạn DNA chỉ chênh lệch nhau một nucleotide. Với việc sử dụng một loại nucleotide có đánh dấu, kết quả trình tự cần xác định đƣợc đọc từ bản điện di. (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002). 2.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV Những nghiên cứu về...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 3

  1. 12 Ở cả hai trƣờng hợp, các phân đoạn DNA sẽ đƣợc phân tách thông qua điện di trên gel polyacrylamide hay polymer trong các mao quản có khả năng phân tách hai đoạn DNA chỉ chênh lệch nhau một nucleotide. Với việc sử dụng một loại nucleotide có đánh dấu, kết quả trình tự cần xác định đƣợc đọc từ bản điện di. (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002). 2.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV Những nghiên cứu về bệnh virus thực vật nói chung và trên khoai tây nói riêng ở Việt Nam ngày càng phong phú và đa dạng, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung vào việc chẩn đoán và xác định bệnh. - Năm1967 Nguyễn Hữu Thụy (Ban điều tra cơ bản côn trùng bệnh cây) đã xác định sự có mặt của virus X khoai tây. - Từ năm 1973 – 1985, Vũ Triệu Mân đã xác định 7 virus chính gây hại trên khoai tây ở Việt Nam là PVY, PVX, PVA, PVS, PVM, PAMV, PLRV bằng phƣơng pháp cây chỉ thị, phƣơng pháp ELISA, phƣơng pháp hiển vi điện tử. - Các tác giả Nguyễn Viết Tùng, Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Kim Oanh đã nghiên cứu các môi giới truyền bệnh ở vùng Gia Lâm (Hà Nội) – vùng Xuân Mai (Hòa Bình) truyền bệnh virus khoai tây. - Từ năm 1980 – 1985, đề tài cấp nhà nƣớc chống bệnh virus, đã tổ chức phòng trừ bằng chọn lọc vệ sinh cho nhiều vùng sản xuất khoai tây ở miền bắc (Hà Nam, Nam Định, Hà Bắc, Hải Dƣơng, Hƣng Yên). - 1985 – 1992, Trƣờng Đại học Nông Nghiệp 1 đã đề xuất việc sản xuất khoai tây giống trên vùng cách li địa hình ngay ở đồng bằng sông Hồng chống bệnh virus có hiệu quả ở vùng Hà Tây. - Các virus PVX, PVY, PMV và một số virus khác đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất thử kháng huyết thanh tại trƣờng Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội. Kỹ thuật ELISA đƣợc sử dụng từ năm 1990, kỹ thuật PCR bắt đầu áp dụng từ năm 1995 để chẩn đóan bệnh. - Tại Trung tâm Nghiên cứu khoai tây Đà Lạt chỉ mới dừng lại ở kiểm tra ELISA trên các giống do Trung tâm sản xuất.
  2. 13 - Các kỹ thuật RT-PCR, giải trình tự chƣa đƣợc áp dụng phổ biến trong công tác chẩn đoán virus PLRV. 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV - Nie và Singh (2002) đã dùng kỹ thuật RT-PCR trong việc xác định trình tự nucleotide của PVY ở Châu Âu và Bắc Mỹ (PVYNTN gây đốm hoại tử ở củ ). Thông qua nghiên cứu này, họ muốn xác định khoảng cách di truyền và phƣơng pháp phân biệt các chủng PVY, đồng thời cũng giúp xác định những trình tự mới xuất hiện ở những vùng địa lí khác nhau do biến chủng từ PVYNTN. Nghiên cứu này dựa trên sự khác biệt ở đoạn gen P1 và 5’ - UTR. - Nie, Xianzhou, Singh và Rudra (2003) đã dùng kỹ thuật multiplex RT-PCR để phân biệt các chủng PVYN, PVYO và PVYNTN. - Nie và Singh (2000) đã sử dụng các primer ngẫu nhiên cho multiplex RT-PCR nhằm mục đích xác định sự hiện diện của virus và viroid trong rệp, lá và củ - Singh, Kurz, Boiteau và Moore (1997) đã dùng kỹ thuật PT-PCR để xác định sự hiện diện của PLRV trong rệp bắt từ ruộng khoai tây. Trong nghiên cứu này 3 loại rệp là Myzus persicae: green peach aphid; buckthorn aphid và potatoaphid Macrosiphum euphorbiae đƣợc lấy từ ruộng cây khoai tây thƣơng mại New Brunswick (1988-1994) đều cho kết quả dƣơng tính với PLRV. - Singh, Nie, Sing, Coffin và Duplessis (2002) cho rằng phản ứng RT-PCR bị ức chế bởi hợp chất phenolic từ mô cây. Nghiên cứu này xác định việc bổ sung Na 2SO3 trong bƣớc cho dung dịch đệm li trích RNA có thể nâng cao hiệu quả của RT-PCR. Bởi vì Na2SO3 (Sodium sulphite) có khả năng ức chế hợp chất phenolic hiện diện trong quá trình ly trích RNA. - Công ty Monsanto Canada Inc đã thành công trong việc tạo ra giống khoai tây “Newleaf-plusTM Russet Burbank” với các dòng RBMT 21-129, RBMT21-350 và RBMT22-082 có khả năng kháng lại PLRV. Bằng cách chuyển gen CryIIIA từ Bacillus thuringensis và hai trình tự ORF1, ORF2 từ PLRV , quá trình chuyển gen đƣợc thực hiện nhờ Agrobacterium.
  3. 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 21 tháng 03 đến ngày 15 tháng 07 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA để phát hiện PVX, PVY và PLRV a. Nguồn mẫu thí nghiệm Tất cả các mẫu thí nghiệm đƣợc lấy từ năm phƣờng (5, 8, 9, 11 và 12) tại Đà Lạt, đƣợc bảo quản trong điều kiện -20oC. b. Hóa chất: Các loại hóa chất cần cho quá trình chẩn đoán đƣợc cung cấp đầy đủ trong các bộ kit Potato virus X - PVX test kit 480 test, potato virus Y - PVY test kit 480 test và potato leafroll virus - PLRV test kit 480 test (do Bio – Rad cung cấp) gồm có: - Dịch trích mẫu (Tampon De Broyage Extraction buffer 1X) - Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer) - Kháng thể + Đối với PVX và PVY dùng kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody) + Đối với PLRV dùng kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody) - Dịch rửa (PBS - Tween) - Đối chứng dƣơng (Positive control) - Đối chứng âm (Negative control) - Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (Conjugate buffer) - Kháng thể gắn enzyme alkaline-phosphatase (Conjugate antibodies) - Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu - Chất chỉ thị màu p-NPP Ngoài ra cần phải chuẩn bị - Cồn 70o - Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng
  4. 15 3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV 3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA RNA đƣợc ly trích theo quy trình của kit ly trích (The Aurum total RNA mini kit ) do Bio-Rad sản xuất Những loại hóa chất có sẵn trong kit: - Dịch trích mẫu (Lysis solution) 50 ml - Dịch rửa nhẹ 5X (Low stringency wash solution) 20 ml - Dịch rửa mạnh (High stringency wash solution) 40 ml - DNase I dạng bột 1 hủ - Dịch pha loãng DNase I 10 ml - Dịch hòa tan RNA (Elution solution) 10 ml Bên cạnh đó ta phải chuẩn bị một số hóa chất sau : - Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP) 2% - Tris-base - β-mercaptoethanol 14,2 M - Ethanol 95 - 100% - NaOH 0,1 M - EDTA 1M 3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR *Giai đoạn tổng hợp cDNA Dùng kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit) do Bio - Rad cung cấp với thành phần nhƣ sau: - Hỗn hợp phản ứng đã pha sẵn (5X iScript Reaction Mix)100 µl. Hỗn hợp này đã đƣợc trộn với primer poly T (oligo dT) và các hexamer ngẫu nhiên, chúng có khả năng bắt cặp với những RNA mục tiêu khác nhau. Hỗn hợp này sẽ cho kết quả tối ƣu với những sản phẩm < 1 kb. - Nƣớc không nhiễm enzyme thủy phân nucleotide (Nuclease free water) 1,5 ml. - Enzyme phiên mã ngƣợc (iScript Reverse Transcriptase) 25 µl, là enzyme MMLV với hoạt tính RNAse H+ có độ nhạy cao hơn những enzyme có hoạt tính RNAse H-. Enzyme này đƣợc bổ sung thêm chất ức chế enzyme phân hủy RNA (RNAse). Ta chỉ cần bổ sung thêm RNA và chạy theo chu trình nhiệt của kit. + Giai đoạn thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các phân tử cDNA
  5. 16 - cDNA đƣợc lấy từ quá trình tổng hợp ở trên. - Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease free water) - Dung dịch đệm PCR (10X PCR buffer) - MgCl2 50 mM - Hỗn hợp dNTP 10 mM - iTaq polymerase 5 U / µl - Primer với trình tự nhƣ sau : Sense primer: 5’CGC GCT AAC AGA GTT CAG CC 3’ Antisense primer: 5’GCA ATG GGG GTC CAA CTC AT 3’ Bên cạnh đó cần phải chuẩn bị một số hóa chất khác nhƣ: - Agarose (Promega - Mỹ) - Loading dye 6X - Thang chuẩn (ladder) 100bp (Bio – Rad) - TAE 0,5X 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Nội dung nghiên cứu - Điều tra tình hình nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt thông qua việc thực hiện phản ứng ELISA trên các mẫu thu thập tại các phƣờng. - Kiểm tra các mẫu có phản ứng ELISA dƣơng tính với virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. - Giải trình tự đoạn DNA có đƣợc từ sản phẩm RT-PCR để khẳng định nguồn gốc của đoạn gen đó, đánh giá mức độ tƣơng đồng với gen của virus PLRV có trên ngân hàng gen. 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu Công tác điều tra tình hình bệnh virus trên khoai tây ở thành phố Đà Lạt đƣợc tiến hành nhƣ sau - Liên hệ Phòng Nông nghiệp, Chi cục Bảo vệ Thực vật và Trạm Khuyến nông thành phố để điều tra tình hình phân bố diện tích, chủng loại giống, vùng tập trung và các yếu tố liên quan đến bệnh virus trên khoai tây từ đó xác định địa bàn tiêu biểu cần điều tra.
  6. 17 - Điều tra tại các hộ nông dân có trồng khoai tây theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu nhƣ: Đặc điểm vƣờn trồng, chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh. Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Tùy theo diện tích có thể lấy từ 5 - 10 mẫu /vƣờn theo đƣờng chéo. Mẫu là toàn bộ thân cây, đƣợc cho vào bao nylon có ghi nhãn cẩn thận về thời gian, địa điểm, chủ vƣờn, loại cây, tuổi cây, triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu đƣợc cho vào thùng xốp và đƣợc giữ lạnh cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu. - Mẫu đƣợc đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện đƣợc giữ lạnh và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc tp.Đà Lạt Giống Tuổi cây Thế hệ Địa điểm Tổng số STT Lấy mẫu mẫu 06 07 1T 1.5T 2T 2.5T 3T F1 F2 F3 Phƣờng 5 1 32 22 10 5 6 6 10 5 16 0 16 Phƣờng 8 2 24 0 24 0 0 0 0 24 11 13 0 Phƣờng 9 3 54 0 54 15 10 12 0 17 32 22 0 Phƣờng 11 4 18 0 18 0 8 0 0 10 0 10 8 Phƣờng 12 5 23 0 23 0 0 13 0 10 11 12 0 Tổng cộng 150 22 128 20 24 31 10 66 70 57 24 T: tháng 3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV 3.3.3.1 Phát hiện PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA Sử dụng phƣơng pháp dDAS-ELISA (direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) theo sự hƣớng dẫn thực hiện của bộ kit và đƣợc tiến hành qua 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: Thực hiện 1 lần ly trích virus để kiểm tra cả virus PVX, PVY và PLRV. Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA. Giai đoạn 1: Ly trích mẫu Trƣớc tiên ta phải dùng nƣớc cất vô trùng (chuẩn bị trƣớc) để pha dịch ly trích mẫu từ 20X xuống còn 1X. Dịch trích đƣợc pha loãng để dùng ly trích cả PVX, PVY và PLRV. Tổng số mẫu cần nghiền là 135 mẫu Các mẫu đƣợc lấy ra từ tủ lạnh -20oC, cắt lấy phần thân, chồi non hoặc gân chính của lá (có cả phiến lá) và cân khoảng 0,5 gam cho vào cối.
  7. 18 Hút 2,5 ml dung dịch trích mẫu, dùng chày nghiền mẫu cho đến khi các thành phần đều nát vụn. Đổ dịch mẫu vừa nghiền xong vào eppendoff 1,5 ml. Sau đó ta đem li tâm với tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC. Đem mẫu cất vào tủ mát (2 - 8oC) để dùng sau. Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA Bƣớc 1 Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu. Theo chỉ dẫn của kit, ta bỏ hà ng A và H; bỏ cột 12. Do đó đĩa ELISA 96 giếng chỉ kiểm tra đƣợc 27 mẫu, mỗi mẫu đƣợc cho vào 2 giếng. Mỗi đĩa đều đƣợc ghi số thứ tự từ 1 đến 5 và tên của virus đang thực hiện chẩn đoán. Sơ đồ bố trí trên đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H 1; 2…; 27: Số thứ tự của mẫu BF: Buffer PC (Positive control) : Đối chứng dƣơng NC (Negative control): Đối chứng âm Substrate: Cơ chất Bƣớc 2 Pha loãng kháng thể (kháng thể 1) bằng dung dịch đệm (tỷ lệ pha theo bảng dƣới đây). Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm 10ml 10ml 10ml Kháng thể 100µl 100µl 20µl
  8. 19 Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất vào cột số 1. Cũng với pipet trên ta hút kháng thể cho vào các giếng từ cột số 2 đến số 11 (100 µl / giếng). Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Sau đó rửa 3 lần với PBS-Tween bằng máy rửa đĩa ELISA. Bƣớc 3 - Trƣớc tiên ta phải hòa tan đối chứng dƣơng và đối chứng âm với cùng một thể tích nƣớc là 1ml - Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (substrate). - Cho 100 µl đối chứng dƣơng vào 2 ô PC (Positive control). - Cho 100 µl đối chứng âm vào 2 ô NC (Negative control). - Cho dịch trích mẫu vào (100 µl / giếng). Tổng cộng 135 mẫu sẽ đƣợc cho vào 5 đĩa, mỗi đĩa 27 mẫu, mỗi mẫu 2 giếng theo bố trí ở bảng 3.1. - Dùng keo trong dán kín mặt đĩa, đem ủ qua đêm trong tủ mát 2 - 8oC. Sau đó đem rửa 3 lần với PBS - Tween. Trong bƣớc này cần chú ý các điểm sau đây. - Cần ghi lại chính xác kí hiệu của mẫu tƣơng ứng với số thứ tự của mẫu trên đĩa. - Thao tác cẩn thận tránh hiện tƣợng nhiễm chéo. Bƣớc 4 - Pha loãng kháng thể gắn enzyme (Conjugate antibodies) (kháng thể 2) trong dung dịch đệm theo tỉ lệ cho trong bảng dƣới đây. Kháng thể này đƣợc pha trong đĩa petri. Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm 1X 10ml 10ml 10ml Kháng thể gắn enzyme 100µl 100µl 20µl - Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (Substrate). - Dùng pipet 8 đầu hút kháng thể đã pha loãng vào mỗi giếng từ cột số 2 đến số 11 (100 µl / giếng). Dùng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ 37oC trong 2 giờ. Sau đó rữa 3 lần với PBS - Tween.
  9. 20 Bƣớc 5 Chuẩn bị cơ chất tạo màu: p-NPP (p - nitrophenyl phosphate) có trong kit ở dạng viên rắn. Ta phải xác định lƣợng cơ chất cần thiết cho sự hiển thị màu. Sau đó đem những viên này đi nghiền nát ra và cho vào dung dịch đệm với tỷ lệ cho dƣới đây. Dùng một hủ nhựa nhỏ để hòa tan chất tạo màu và sau đó đổ ra đĩa petri. Dùng pipet 8 đầu, hút 100 µl p-NPP vào mỗi giếng từ cột số 1 đến số 11. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ 37oC và đọc kết quả. Bảng 3.4. Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm 1X 10 ml 10 ml 10 ml p - NPP (2 viên 5 mg) 5 mg 5 mg 5 mg Bƣớc 6 Đọc kết quả bằng máy đọc của hãng Bio - Rad với bƣớc sóng 405 nm tại các thời điểm 30 phút, 1giờ sau khi ủ với chất tạo màu. OD mẫu = OD đọc (thô) – OD trung bình của các giếng có cơ chất (Substrate). OD mẫu so với ngƣỡng (ngƣỡng = hai lần trung bình OD của đối chứng âm). POS: Kết quả dƣơng tính-nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt quá ngƣỡng. NEG: Kết quả âm tính – Không nhiễm bệnh khi OD của mẫu dƣới ngƣỡng. Bên cạnh đó kết quả cũng có thể đƣợc đánh giá bằng mắt thƣờng thông qua sự đổi màu của các giếng: - Nếu màu đậm tƣơng đƣơng hoặc cao hơn so với đối chứng dƣơng: Đánh giá nhiễm bệnh - Nếu giếng không màu tƣơng đƣơng hoặc thấp hơn so với đối chứng âm: Đánh giá không nhiễm bệnh. 3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR Các mẫu sau khi đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọ n ra để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Trong đề tài này chúng tôi chỉ thực hiện phản ứng RT- PCR trên đối tƣợng virus PLRV. Tiêu chuẩn chọn mẫu để thực hiện RT-PCR - Dƣơng tính. - Trị số dƣơng tính từ máy đọc phải cao.
  10. 21 - Triệu chứng đƣợc quan sát phải đặc trƣng và biểu hiện ra ngoài. - Mẫu đƣợc bảo quản tốt (còn tƣơi). Dựa trên những tiêu chí trên, ta chọn ra đƣợc 5 mẫu đại diện cho 5 phƣờng tại thành phố Đà Lạt - Phƣờng 5: Mẫu 148 - Phƣờng 8: Mẫu 97 - Phƣờng 9: Mẫu 45 - Phƣờng 11: Mẫu 92 - Phƣờng 12: Mẫu 10 Kỹ thuật RT-PCR đƣợc sử dụng là 2 bƣớc (two steps), tức là gồm giai đoạn tổng hợp cDNA (Reverse) và giai đoạn khuếch đại cDNA (PCR). Virus PLRV đƣợc phát hiện dựa trên một đoạn gen có kích thƣớc 336 bp, mã hóa cho phân tử protein vỏ. Quá trình thực hiện phải qua 2 giai đoạn: Ly trích RNA, tổng hợp và khuếch đại cDNA nhờ phản ứng RT-PCR. Giai đoạn 1: Ly trích RNA Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA (The Aurum total RNA kit). Tuy nhiên để thực hiện đúng yêu cầu ta phải chuẩn bị trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau: - Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử trùng sau khi đã đƣợc tráng nƣớc chƣa khử DEPC. - Đầu tip, eppendoff phải đƣợc xử lý sao cho đảm bảo vô trùng và không còn sự hiện diện của enzyme phân hủy RNA. Tất cả phải đƣợc chuẩn bị trƣớc khi ly trích một ngày. *Quy trình ly trích Thực hiện theo chỉ dẫn của bộ kit. Lƣu ý, một số hóa chất không đƣợc cung cấp cùng với kit nên ta phải chuẩn bị riêng. Ta phải chuẩn bị - Polyvinyl pyrolidone (PVP) 2% -Tris base pH = 7,5 - Ethanol 70%, 100% - β - mercaptoethanol - Pha DNase I từ dạng bột thành dạng lỏng - Pha low stringency
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản