Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất [6]-shogaol trong cao gừng (Zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu (Sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (Apium graveolens)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Nguyễn Tường Vi

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ NÂNG CAO HÀM LƯỢNG

HOẠT CHẤT 6-SHOGAOL TRONG CAO GỪNG (Zingiber

officinale), FUCOIDAN TRONG CAO RONG NÂU (Sargassum

mcclurei) VÀ APIGENIN TRONG CAO CẦN TÂY (Apium

graveolens)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2021

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Nguyễn Tường Vi

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ NÂNG CAO HÀM LƯỢNG

HOẠT CHẤT 6-SHOGAOL TRONG CAO GỪNG (Zingiber

officinale), FUCOIDAN TRONG CAO RONG NÂU (Sargassum

mcclurei) VÀ APIGENIN TRONG CAO CẦN TÂY (Apium

graveolens)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Nguyễn Cửu Khoa

Thành phố Hồ Chí Minh – 04/2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận văn thạc sĩ ngành Hóa hữu cơ với đề tài “Nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất [6]-shogaol trong cao gừng (Zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu (Sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (Apium graveolens)” là công trình khoa học do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS. TS. Nguyễn Cửu Khoa.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Học viên cao học

Lê Nguyễn Tường Vi

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn của GS. TS. Nguyễn Cửu Khoa.

Trong thời gian học tập chương trình đào tạo thạc sĩ tại Học viện Khoa học và Công nghệ, tôi nhận được rất nhiều kiến thức bổ ích từ tập thể Giảng viên khoa Hóa học – Học viện Khoa học và Công nghệ. Những kiến thức này giúp tôi có thể phát triển được kĩ năng và tri thức, áp dụng vào đơn vị tôi đang công tác cũng như hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này.

Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Cửu Khoa đã hết lòng hướng dẫn, định hướng và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn một cách tốt nhất.

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô thuộc khoa Hóa học đã luôn sẵn sàng hỗ trợ tôi về kiến thức và tạo điều kiện về trang thiết bị, máy móc có liên quan đến luận văn. Cảm ơn các cán bộ của Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã trực tiếp hỗ trợ và giải đáp thắc mắc trong suốt quá trình tôi thưc hiện. Cảm ơn gia đình và tập thể lớp cao học khóa 2018B đã luôn động viên tôi khi thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Kính chúc quý thầy cô luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong sự

nghiệp khoa học. Chúc các bạn học viên khóa 2018B thành công.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 06 năm 2021

Học viên cao học

Lê Nguyễn Tường Vi

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Từ đầy đủ

Acetonitrile MeCN

COSY Homonuclear Correlated Spectroscopy Phổ tương tác proton của các carbon kế cận nhau

Công thức phân tử CTPT

Mũi đơn rộng brs

Mũi đôi doublet d

Phổ DEPT DEPT Distortionles Enhancement by Polarization Transfer

Deuterated oxide

Ethyl acetate D2O EtOAc

Ethanol EtOH

EtOH abs EtOH absolute Cồn tuyệt đối

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOD

Limit of Quantitation Giới hạn định lượng LOQ

Mũi đa multiplet m

Methanol MeOH

Deuterated methanol MeOD

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

Part per million Một phần triệu ppm

quartet Mũi bốn q

singlet Mũi đơn s

Standard Deviation Độ lệch chuẩn SD

Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối RSD

SKĐ Sắc kí đồ

triplet t Mũi ba

TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng

Tetramethylsilane TMS

UV-Vis Phổ tử ngoại-khả kiến Ultraviolet-visible spectroscopy

δH, δC Độ chuyển dịch hóa học của proton và carbon

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu và hóa chất ................................................. 18

Bảng 2.2. Danh mục thiết bị và dụng cụ ......................................................... 20

Bảng 2.3. Dung dịch chuẩn khảo sát khoảng tuyến tính [6]-shogaol ............. 30

Bảng 2.4. Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính của apigenin ................. 33

Bảng 2.5. Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính fucoidan ....................... 37

Bảng 3.2. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao gừng .................... 40

Bảng 3.3. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao gừng ...... 41

Bảng 3.4. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao gừng ..... 42

Bảng 3.5. Dữ liệu NMR của hợp chất phân lập được từ gừng so với TLTK . 45

Bảng 3.6. Kết quả định lượng [6]-shogaol trong nguyên liệu gừng ............... 46

Bảng 3.7. Kết quả định lượng [6]-shogaol trong mẫu gừng thị trường .......... 47

Bảng 3.8. Kết quả định lượng [6]-shogaol trong mẫu sản phẩm chiết tách ... 47

Bảng 3.9. Kết quả tính tương thích hệ thống [6]-shogaol ............................... 49

Bảng 3.10. Độ đặc hiệu của [6]-shogaol ......................................................... 50

Bảng 3.11. Đường chuẩn [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC ................... 51

Bảng 3.12. Độ lặp lại của quy trình định lượng [6]-shogaol bằng HPLC ...... 52

Bảng 3.13. Độ đúng của quy trình thẩm định [6]-shogaol ............................. 52

Bảng 3.14. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao cần tây ............... 54

Bảng 3.15. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây . 55

Bảng 3.16. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây 56

Bảng 3.17. Kết quả NMR hợp chất phân lập từ cần tây so với TLTK ........... 59

Bảng 3.18. Kết quả định lượng apigenin trong nguyên liệu cần tây .............. 61

Bảng 3.19. Kết quả định lượng apigenin trong cao cần tây thị trường ........... 62

Bảng 3.20. Kết quả định lượng apigenin trong sản phẩm chiết tách .............. 63

Bảng 3.21. Kết quả tính tương thích hệ thống apigenin ................................. 64

Bảng 3.22. Độ đặc hiệu của quy trình thẩm định apigenin ............................. 65

Bảng 3.23. Độ lặp lại của quy trình thẩm định apigenin bằng HPLC ............ 66

Bảng 3.24. Đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA .............. 66

Bảng 3.25. Độ đúng của quy trình thẩm định apigenin .................................. 68

Bảng 3.26. Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng trích ly rong nâu .................... 69

Bảng 3.27. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly rong nâu ................... 70

Bảng 3.28. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly rong nâu ..... 71

Bảng 3.29. Kết quả định lượng fucoidan bằng HPLC .................................... 75

Bảng 3.30. Kết quả định lượng fucoidan bằng UV-Vis .................................. 76

Bảng 3.31. Tính tương thích hệ thống fucoidan bằng phương pháp UV-Vis. 76

Bảng 3.32. Độ đặc hiệu của fucoidan dùng phương pháp UV-Vis ................ 77

Bảng 3.33. Khoảng tuyến tính của fucoidan sử dụng phương pháp UV-Vis . 78

Bảng 3.34. Độ lặp lại của quy trình định lượng fucoidan bằng UV-Vis ........ 79

Bảng 3.35. Độ đúng của phương pháp định lượng fucoidan bằng UV-Vis ... 79

vii

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Củ gừng (Zingiber officinale). .......................................................... 6

Hình 1.2. Một số hợp chất có trong gừng. ........................................................ 8

Hình 1.3. Cấu trúc hợp chất [6]-shogaol. .......................................................... 9

Hình 1.4. Cần tây (Apium graveolens L.). ...................................................... 10

Hình 1.5. Một số hợp chất trong cần tây. ........................................................ 11

Hình 1.6. Cấu trúc hợp chất apigenin. ............................................................ 13

Hình 1.7. Rong nâu (Sargassum mcclurei). .................................................... 14

Hình 1.8. Một số hợp chất có trong rong nâu. ................................................ 15

Hình 1.9. Cấu trúc hợp chất fucoidan. ............................................................ 17

Sử dụng dung môi chiết ban đầu là ethanol đối với gừng. ............................. 39

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly cao gừng. .............. 39

Hình 3.2. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao gừng..................... 40

Hình 3.3. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly gừng. ............ 41

Hình 3.4. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến quá trình trích ly gừng. ........... 42

Hình 3.5. Quy trình chiết xuất [6]-shogaol trong cao gừng ............................ 43

Hình 3.6. TLC các phân đoạn cao gừng và so chuẩn. .................................... 45

Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất phân lập từ củ gừng. .......................................... 46

Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu gừng. ................................................... 47

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu gừng thị trường. ...................................................... 47

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu sản phẩm cao gừng chiết tách. ............................. 48

Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu thẩm định tính tương thích hệ thống [6]-shogaol. 49

Hình 3.12. SKĐ độ đặc hiệu của [6]-shogaol ................................................. 50

Hình 3.13. Đồ thị đường chuẩn [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC. ........ 51

Hình 3.14. SKĐ khoảng tuyến tính [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC. .. 51

Hình 3.15. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao cần tây. .............. 54

Hình 3.16. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây. 55

Hình 3.17. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây. 56

viii

Hình 3.18. Quy trình chiết xuất apigenin từ cần tây. ...................................... 59

Hình 3.19. TLC cao cần tây (a) và apigenin (b) soi dưới đèn UV. ................. 59

Hình 3.20. Cấu trúc hợp chất phân lập được từ cần tây. ................................. 61

Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu apigenin chuẩn 5 ppm. ......................................... 61

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu cần tây. .............................................. 62

Hình 3.23. Sắc ký đồ apigenin trong cao cần tây thị trường........................... 62

Hình 3.24. Sắc ký đồ mẫu apigenin của sản phẩm chiết tách. ........................ 63

Hình 3.25. Sắc ký đồ thẩm định tính tương thích hệ thống apigenin. ............ 64

Hình 3.26. Độ đặc hiệu mẫu trắng (a); apigenin chuẩn (b); mẫu thử 10 ppm (c).

......................................................................................................................... 65

Hình 3.27. Đồ thị đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA .... 67

Hình 3.28. SKĐ đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC. ............... 67

Hình 3.29. Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng trích ly rong nâu. ................... 69

Hình 3.31. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly rong nâu. .... 72

Hình 3.32. Cấu trúc hợp chất phân lập từ rong nâu. ....................................... 73

Hình 3.33. Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu. ................................... 74

Hình 3.34. Sắc ký đồ mẫu fucoidan chuẩn (a), mẫu nguyên liệu (b), mẫu sản

phẩm thị trường (c), mẫu sản phẩm chiết (d). ................................................. 76

Hình 3.35. Phổ đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử fucoidan 50 ppm. .................. 77

Hình 3.36. Đồ thị đường chuẩn fucoidan bằng phương pháp UV-Vis. .......... 78

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. 1 LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................. iii DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .................................................................. vii MỤC LỤC ......................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 6 1.1. CỦ GỪNG (ZINGIBER OFFICINALE) .................................................... 6 1.1.1. Mô tả thực vật ......................................................................................... 6

1.1.2. Phân bố .................................................................................................... 6

1.1.3. Thành phần hoá học của gừng ................................................................ 7

1.1.4. Hoạt tính sinh học của gừng.................................................................... 8

1.1.5. Một số nghiên cứu về [6]-shogaol trong gừng (Zingiber officinale) ...... 8

1.2. CẦN TÂY (APIUM GRAVEOLENS L.) ................................................... 9 1.2.1. Mô tả thực vật ......................................................................................... 9

1.2.2. Phân bố .................................................................................................. 10

1.2.3. Thành phần hóa học của cần tây ........................................................... 10

1.2.4. Hoạt tính sinh học của cần tây .............................................................. 11

1.2.5. Một số nghiên cứu về apigenin trong cần tây (A.graveolens L.) .......... 12

1.3. RONG NÂU (SARGASSUM MCCLUREI) ............................................. 13 1.3.1. Mô tả thực vật ....................................................................................... 13

1.3.2. Phân loại và phân bố ............................................................................. 13

1.3.3. Thành phần hóa học của rong nâu ........................................................ 14

1.3.4. Hoạt tính sinh học của rong nâu ............................................................ 15

1.3.5. Một số nghiên cứu về fucoidan trong rong nâu .................................... 16

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18

2.1. NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT ............................................................... 18 2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ....................................................................... 19 2.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 20 2.4. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 21 2.4.1. Khảo sát điều kiện chiết tách ................................................................ 21

2.4.2. Chiết xuất, phân lập hợp chất ................................................................ 22

2.4.3. Phương pháp định lượng bằng HPLC ................................................... 23

2.4.4. Phương pháp định lượng bằng UV-Vis ................................................ 24

2.4.5. Thẩm định phương pháp định lượng ..................................................... 24

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 27

2.5. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL TRONG CỦ GỪNG ............................................................................................................. 28 2.5.1. Chiết tách [6]-shogaol từ củ gừng ......................................................... 28

2.5.2. Định lượng [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC ............................... 28

2.5.3. Thẩm định quy trình phân tích [6]-shogaol từ củ gừng ........................ 29

2.6. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG CẦN TÂY ................................................................................................................. 31 2.6.1. Chiết tách apigenin từ cần tây ............................................................... 31

2.6.2. Định lượng apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA .......................... 32

2.6.3. Thẩm định quy trình phân tích apigenin từ cần tây .............................. 32

2.7. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN TRONG RONG NÂU ................................................................................................................ 34 2.7.1. Chiết xuất fucoidan từ rong nâu ............................................................ 34

2.7.2. Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC ................................... 35

2.7.3. Định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis ................................. 35

2.7.4. Thẩm định quy trình phân tích fucoidan từ rong nâu bằng UV-Vis ..... 36

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU [6]-SHOGAOL TỪ CỦ GỪNG .................. 39 3.1.1. Điều kiện chiết tách [6]-shogaol ........................................................... 39

3.1.2. Quy trình chiết xuất [6]-shogaol ........................................................... 42

3.1.3. Định lượng [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC ............................... 46

3.1.4. Thẩm định quy trình định lượng [6]-shogaol từ củ gừng ..................... 48

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU APIGENIN TỪ CẦN TÂY ......................... 53 3.2.1. Điều kiện chiết tách apigenin ................................................................ 53

3.2.2. Quy trình chiết xuất apigenin ................................................................ 56

3.2.3. Định lượng apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA .......................... 61

3.2.4. Thẩm định quy trình định lượng apigenin từ cần tây ........................... 63

3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TỪ RONG NÂU .................... 69 3.3.1. Điều kiện chiết tách fucoidan từ rong nâu ............................................ 69

3.3.2. Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu ............................................ 72

3.3.3. Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC ................................... 75

3.3.4. Định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis ................................. 76

3.3.5. Thẩm định quy trình định lượng fucoidan bằng UV-Vis ..................... 76

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 81 4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 81 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 83 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 90

MỞ ĐẦU

Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và hợp chất có hoạt tính sinh học

nói riêng là một trong những hướng đã và đang được nhiều nhà khoa học quan

tâm. Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay vẫn dựa

vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe. Sự kết hợp những

phương pháp phân tích hiện đại như: quang phổ hồng ngoại (IR), cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR), phổ hấp thu quang (UV-Vis)… trong lĩnh vực nghiên cứu

các hợp chất thiên nhiên cùng với việc làm sáng tỏ cấu trúc, hoạt tính của các

hợp chất có dược tính đã góp phần củng cố và phát triển, nâng cao công dụng

y học cổ truyền.

Dược điển các nước châu Á như Việt Nam, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản

đều có các chuyên luận riêng về dược liệu. Một số chuyên luận dược liệu cũng

đã được đưa vào Dược điển Mĩ, châu Âu... Vì vậy, WHO đã nhấn mạnh việc

đảm bảo chất lượng của các loại thuốc cổ truyền phải dựa trên các kỹ thuật

phân tích hiện đại kết hợp với việc sử dụng chất chuẩn phù hợp. Do đó, việc

chiết xuất, thiết lập quy trình và thẩm định quy trình định lượng ngày càng trở

nên cần thiết với công tác đảm bảo chất lượng thuốc, từ lựa chọn nguyên liệu

đầu vào đến việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cũng như giám sát chất lượng thuốc

lưu hành của cơ quan quản lý.

Loài gừng (Zingiber officinale), cần tây (Apium graveolens), rong nâu

(Sargassum mcclurei) từ lâu đã được dùng làm thực phẩm và có công dụng trị

bệnh trong dân gian. Các nhà khoa học đã xác định trong củ gừng có chứa hợp

chất [6]-shogaol, trong cần tây chứa hợp chất apigenin, trong rong nâu chứa

hợp chất fucoidan có nhiều hoạt tính sinh học như ức chế tế bào ung thư, kháng

virus, chống gốc tự do…Tuy nhiên, vẫn cần có những nghiên cứu cụ thể hơn

về các tác dụng sinh học của những loài cây này, nhằm đưa vào phục vụ cho

việc chăm sóc và nâng cao sức khỏe con người. Xuất phát từ thực tế này, luận

văn “Nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất [6]-shogaol

trong cao gừng (Zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu

(Sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (Apium graveolens)”

được thực hiện với ba mục tiêu chính như sau:

1. Xây dựng quy trình điều chế cao chiết chứa hợp chất [6]-shogaol trong củ

gừng với hàm lượng trên 15%, hợp chất apigenin trong cần tây với hàm lượng

trên 85% và fucoidan trong rong nâu với hàm lượng trên 85%.

2. Xây dựng quy trình định lượng các hợp chất [6]-shogaol, apigenin, fucoidan

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang

phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis).

3. Thẩm định quy trình phân tích định lượng để ứng dụng định lượng hợp chất

[6]-shogaol, apigenin, fucoidan trong tương lai.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. CỦ GỪNG (Zingiber officinale)

1.1.1. Mô tả thực vật

Gừng (Zingiber officinale) thuộc họ Zingiberaceae, là cây thảo sống lâu năm,

mọc nơi đất ẩm, thường có mùi thơm. Thân rễ (thường gọi là củ) không có hình

dạng nhất định, do các bẹ lá ôm chặt nhau tạo thành thân giả, cao dưới 1 m,

thường phân nhánh, dài 3 cm đến 7 cm, dày 0,5 đến 1,5 cm, nằm ngang dưới

mặt đất, chứa nhiều chất dự trữ [1-3, 4]. Mặt ngoài màu trắng tro hay vàng nhạt,

có vết nhăn dọc. Mặt cắt ngang có sợi thưa. Mùi thơm, vị cay nóng [4]. Lá gồm

có: bẹ lá, cuống lá, lưỡi lá và phiến lá. Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên, có

màu sắc, kích thước trung bình hoặc lớn [1-3].

Hình 1.1. Củ gừng (Zingiber officinale).

1.1.2. Phân bố

Với 150 loài gừng khác nhau trên thế giới đã được nghiên cứu, chi gừng được

đánh giá là chi quan trọng trong các loài thực vật cho vị cay. Loài gừng phân

bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, đặc biệt là Đông Nam Á. Ở Việt Nam, loài gừng

Z. officinale được trồng từ Bắc vào Nam, đặc biệt là các tỉnh miền núi và hải

đảo [1,5]. Việt Nam có khoảng 14 chi, 64 loài đã được khai thác và sử dụng

trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong đó, loài Zingiber officinale được sử dụng

rộng rãi lâu đời, đồng thời còn là nguồn dược liệu với nhiều tác dụng như chữa

nôn mửa, cảm lạnh, viêm khớp, kháng viêm…[6]

1.1.3. Thành phần hoá học của gừng

Nhựa dầu gừng có màu vàng sậm, mùi thơm đặc trưng, vị cay, là chất lỏng sệt,

chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% chất cay. Có khoảng 100 hợp chất trong nhựa

dầu gừng [7-10]. Các hợp chất tạo nên vị cay trong gừng gồm zingerone,

gingerol, gingerdiol, shogaol… [3,5,6,11]. Gừng tươi nhiều gingerol nhưng khi

mất nước dần chuyển thành nhóm hợp chất shogaol, vì thế gừng khô cay hơn

[12].

Hình 1.2. Một số hợp chất có trong gừng.

1.1.4. Hoạt tính sinh học của gừng

Y học hiện đại đã có những kết luận về tác dụng dược lý của gừng như sau:

- Chống ung thư: gingerol và shogaol được chứng minh là các hợp chất

gây độc tế bào ung thư liên quan tới chu trình apoptosis [13], ức chế hình

thành mạch và là hướng nghiên cứu đầy triển vọng trong phát triển thuốc

chống ung thư thế hệ mới [14-16]. Tác dụng của [6]-shogaol được chứng

minh là mạnh hơn nhiều so với [6]-gingerol.

- Kháng khuẩn: sự có mặt của các loại tinh dầu như camphene, linalool, α-pinene và borneol nên gừng có thể ức chế một số loại vi khuẩn như A. niger, S. cerevisiae, Mycoderma spp., L. acidophilus [17-20].

- Kháng viêm: Các hợp chất phenolic, đặc biệt là gingerol trong gừng đã

được chứng minh là có khả năng chống viêm [21].

- Chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa của gừng được chứng minh trong các nghiên cứu in vitro và in vivo trên tác dụng ức chế quá trình peroxyd hóa lipid, ngăn chặn tăng cholesterol, tăng glutathione cũng như loại bỏ các gốc tự do trên mô hình động vật [2,9,22].

- Ngoài ra gừng còn có khả năng chữa trị Đau bụng lạnh, đầy trướng không

tiêu, nôn mửa, tứ chi lạnh, ho suyễn [4].

1.1.5. Một số nghiên cứu về [6]-shogaol trong gừng (Zingiber

officinale)

[6]-shogaol ((E)-1-(4-hydroxy-3-methoxy phenyl) dec-4-en-3-on) tan được

trong methanol và ethanol, tan ít trong chloroform và ethyl acetate, rất khó phát

hiện trong gừng tươi do hàm lượng thấp nhưng lại có tác dụng vượt trội hơn

[6]-gingerol nhiều về tác dụng chống viêm, chống oxi hóa và điều trị ung thư.

Nhóm shogaol là nhóm hợp chất bị biến đổi bởi gingerol theo cơ chế loại nước

trong quá trình gia nhiệt và nó còn cay hơn cả gingerol [23]. Nhóm shogaol

thường được biết ở dạng [6]-shogaol, chúng là kết quả của việc khử nhóm OH

ở C-5 với sự hình thành của liên kết đôi giữa C-4 và C-5 sau khi gingerol bị

tách nước.

Năm 2007, Chen C.Y. cùng cộng sự đã nghiên cứu khả năng gây apoptosic của

tế bào ung thư gan người p53 từ [6]-shogaol thông qua cơ chế phụ thuộc caspase

qua trung gian stress oxy hóa [24].

Năm 2019, Uddin M.D. và Sang-Youel Park đã nghiên cứu về sự giảm lượng

autophagy bởi [6]-shogaol với tế bào ung thư gan người với TRAIL gây ra

apoptosis thông qua p53 và ROS [25]. Yếu tố hoại tử khối u (TNF) liên quan

đến quá trình apoptosis tạo ra ligand TRAIL (thuộc nhóm TNF). Người ta đã

chứng minh rằng [6]‑shogaol, một thành phần có hoạt tính sinh học của gừng,

có tác dụng chống viêm và chống ung thư, làm giảm sự lan truyền tế bào khối

u và gây chết tế bào ung thư gan qua trung gian TRAIL. Nghiên cứu đã xác

định TRAIL và [6]‑shogaol đã cùng nhau điều chỉnh tăng biểu hiện protein ức

chế 53 (p53) của khối u và thay đổi màng tế bào của ty thể (MTP). Tóm lại, sử

dụng TRAIL kết hợp với [6]‑shogaol có thể là phương pháp điều trị phù hợp

để điều trị ung thư tế bào gan Huh7.

Hình 1.3. Cấu trúc hợp chất [6]-shogaol.

1.2. CẦN TÂY (Apium graveolens L.)

1.2.1. Mô tả thực vật

Cần tây (Apium graveolens L.), thuộc họ cần (Apiaceae), là loại cây được trồng

rất phổ biến trên thế giới và được di thực về trồng ở Việt Nam, có nguồn gốc

từ châu Á và châu Âu. Cây thân thảo, lưỡng tính, cao 15 – 150 cm, thân mọc

thẳng đứng, nhẵn, có nhiều rãnh dọc, chia nhiều cành, mùi thơm mạnh. Lá mọc

xen, màu xanh lục, mỏng, cuống lá có bẹ to, lá chia ba thùy, thùy cuối có dạng

hình thoi. Cụm hoa chùm hình tán kép, mọc đối diện lá, mỗi tán mang 10 – 12

hoa. Hoa trắng, tán hoa từ 7-25 hoa, hoa có kích thước 6-9 mm theo chiều

ngang. Quả hình trứng, màu nâu, cuống quả dài 1-1,5 mm, có 6 cánh, mép ngoài

mỗi cánh màu vàng nhạt. Rễ chùm màu nâu nhạt, có nhiều rễ con. Mùi thơm

đặc trưng, vị đắng, hơi cay [4]. Cây ra hoa và quả từ tháng 4 đến tháng 7 [26].

Hình 1.4. Cần tây (Apium graveolens L.).

1.2.2. Phân bố

Cần tây có nguồn gốc từ châu Âu, phạm vi trồng trọt và tiêu thụ rất rộng lớn và

nó còn được tìm thấy ở các nước châu Phi, Iran, Ấn Độ và Hoa Kỳ. Từ thời cổ

đại, cây đã được trồng và sử dụng như một loại rau ăn và là một vị thuốc phổ

biến trong nhiều nền y học cổ truyền.

1.2.3. Thành phần hóa học của cần tây

Phân tích thành phần hóa học từ chiết xuất ethanol của Apium graveolens L.

cho thấy sự hiện diện của:

Monoterpernes: limonene (73,14%), myrcene (1,14%), beta-pinene (0,79%),

beta-caryophyllene (0,54%) …[27]

Sesquiterpenes: beta-selinene (10,15%), alpha-selinene (1,67%) … [27]

Phtalides: 4,5-dihydro-3-butyl-phtalide (5,72%), butyl-phtalide (2,09%) …

[27]

Flavonoid: thành phần chính của lá cần tây là apigenin với hàm lượng 202

mg/kg, ngoài ra còn có luteolin và chrysoeriol 7-glucoside. Lá cần tây cũng

chứa furanocomarin, psoralen, bergapten, xanthotoxin và isopimpinellin [27].

Hình 1.5. Một số hợp chất trong cần tây.

1.2.4. Hoạt tính sinh học của cần tây

Một số tác dụng sinh học chính của cần tây gồm:

- Chống ung thư: một số thành phần hoạt động rất hữu ích trong việc chống ung thư khối u có ở cần tây như polyacetylenes và phthalides [28].

- Hạ huyết áp và lipid máu: Lợi ích của cần tây gồm khả năng làm giảm

mức cholesterol gây nguy cơ bệnh tim mạch.

- Chống oxi hóa: Rễ và lá cần tây có đặc tính loại bỏ gốc OH và DPPH [29]. Nó cũng được sử dụng để điều trị đau dạ dày [28]. Jung et al. trong một nghiên cứu đã kiểm tra hàm lượng nhóm phenolic và flavonoid của lá cần tây bằng phương pháp Folin-Ciocalteu. Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất cồn của lá cần tây chứa lượng hợp chất phenolic cao nhất, rễ cần tây chứa các dẫn xuất phenolic như coumarin, scopoletin và acid aescoumlic [30]. Trong một nghiên cứu in vitro đã đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và ức chế peroxid hóa lipid từ cần tây cho hiệu quả cao trong việc loại bỏ gốc tự do DPPH và giảm cường độ peroxid hóa lipid [31].

- Ngoài ra cần tây còn có khả năng trị hen suyễn, khó thở, viêm phế quản,

viêm màng phổi, trướng bụng, đầy hơi, tiêu hóa kém [4].

1.2.5. Một số nghiên cứu về apigenin trong cần tây (A.graveolens L.)

Trong nhóm flavonoids của cần tây, apigenin là hợp chất được quan tâm nhiều

nhất. Kể từ khi Birt và cộng sự lần đầu tiên báo cáo rằng apigenin có hoạt động

chống ung thư vào năm 1986 [32], ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy

apigenin có hiệu quả chống ung thư in vitro và in vivo ở chuột. Tất cả các kết

quả thu thập được cho đến nay chỉ ra apigenin có hoạt động chống ung thư

mạnh trên các loại ung thư khác nhau ở người và có thể kết hợp với nhiều tác

nhân hóa trị liệu khác.

Apigenin đã được báo cáo có thể ngăn chặn các bệnh ung thư khác nhau bằng

cách kích hoạt quá trình apoptosis và autophagy, ngăn chặn di chuyển xâm lấn

tế bào và kích thích phản ứng miễn dịch [33,34]. Apigenin đã được chứng minh

có tác dụng ở nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư đại trực tràng, ung thư vú,

ung thư gan, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt [35,37].

Trong tế bào ung thư biểu mô nang (ACC), apigenin ngăn chặn sự sống sót của

tế bào ACC-2 bằng cách gây ra cả apoptosis và bắt giữ pha G2/M phụ thuộc

vào liều và thời gian [35]. Trong tế bào ung thư ruột kết HCT116 của người,

apigenin đã kích hoạt cả chu trình autophagy lẫn apoptosis [36]. Hơn nữa, trong

các tế bào u ác tính ở người, Zhao và cộng sự đã báo cáo rằng apigenin cho

thấy tác dụng chống ung thư hiệu quả khi ngăn chặn sự di chuyển và xâm lấn

tế bào, gây ra sự bất hoạt chu kỳ tế bào ở pha G2/M và đồng thời gây ra

apoptosis tế bào [37]. Các hiệu ứng chống ung thư khác nhau được kích hoạt

đồng thời bởi apigenin đã chứng minh rằng apigenin có khả năng chống ung

thư.

Hình 1.6. Cấu trúc hợp chất apigenin.

1.3. RONG NÂU (Sargassum mcclurei)

1.3.1. Mô tả thực vật

Tản rong được cấu tạo bởi những sợi phân nhánh màu nâu đen; đường kính khoảng 0,1 cm, khô, giòn, dễ gãy, dẹt như lá. Rải rác từng quãng có những phao để rong mọc đứng trong nước. Phao hình cầu hay bầu dục. Gốc có tản rộng. Mùi tanh, vị hơi mặn [4].

1.3.2. Phân loại và phân bố

Với đa dạng của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong số các loài

thực vật biển rất đáng chú ý. Việt Nam hiện nay có khoảng 147 loài rong nâu,

trong đó chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc

ven biển với sản lượng ước tính trên 10.000 tấn/năm. Rong nâu phân bố nhiều

nhất ở Nhật Bản, Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Mỹ, Pháp, Ấn Độ…Ở

Việt Nam, rong nâu phân bố chủ yếu tại vùng biển Đà Nẵng, Quảng Nam,

Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, bờ biển Tây Nam

Bộ, chủ yếu là các loài S. binderi, S. denticarpum, S. swartzii, S. mcclurei, S.

microcystum, S. assimile, S. feldmannii, S. polycystum…

Hình 1.7. Rong nâu (Sargassum mcclurei).

1.3.3. Thành phần hóa học của rong nâu

Rong nâu chứa các thành phần có hoạt tính sinh học quý, có giá trị cao về mặt

dinh dưỡng và dược liệu như: alginate, laminaran, fucoidan. Trong số các hợp

chất polysaccharide của rong nâu thì fucoidan là hợp chất đặc biệt quan tâm

nghiên cứu do sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như chống đông tụ máu,

chống virus, chống ung thư, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa, chống

bệnh về gan, tiết niệu, bảo vệ dạ dày…[38].

Fucoidan là một sulfate polysaccharide có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính

đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với vị trí nhóm sulfate

sắp xếp không theo quy luật. Thành phần của nó chủ yếu là fucose và một số

các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose, acid uronic…

[39,40]. Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20%

trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong. Trong chi Sargassum, hàm

lượng fucoidan chiếm từ 1-2,5% trọng lượng rong khô, đây được coi là nguồn

dược liệu tiềm năng của biển Việt Nam [41-43].

Hình 1.8. Một số hợp chất có trong rong nâu.

1.3.4. Hoạt tính sinh học của rong nâu

Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt

tính sinh học thú vị như:

- Hoạt tính chống đông tụ máu: Nishino và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ các loài rong E. Kurome, H.fusiforme, L.angustata. Kết quả cho thấy chúng có hoạt tính kháng đông tụ máu cao hơn so với heparin [44]. Hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính kháng đông tụ càng lớn [45-49]. Theo các nghiên cứu [50-54] fucoidan sulfate hóa ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt tính kháng đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này. Trọng lượng phân tử fucoidan cũng có ảnh hưởng lên hoạt tính

kháng đông tụ máu. Fucoidan từ loài Lessonia vadosa có khối lượng phân tử 320.000 Da MW cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử 32.000 MW [45,51,55].

- Hoạt tính chống khối u và điều hòa miễn dịch: Fucoidan từ các loài rong L. saccharina, L. digitata, F. serratus, F. distichus và F. vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn chúng kết dính với tiểu cầu [56-58]. Fucoidan có thể tăng cường chức năng tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào… thúc đẩy kháng thể phản ứng lại với tế bào hồng cầu cừu (SRBC) in vivo [59].

- Hoạt tính chống oxy hóa: Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm in vitro. Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan [60].

- Chống viêm: Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của fucoidan từ 9 loài rong nâu. Kết quả cho thấy tất cả fucoidan của 9 loài rong đều có khả năng ức chế tăng lượng bạch cầu trên mô hình chuột bị viêm [56].

1.3.5. Một số nghiên cứu về fucoidan trong rong nâu

Năm 2012, Lee H., Kim J.S., Kim E. đã nghiên cứu fucoidan có trong rong

Fucus vesiculus ức chế sự di cư và xâm lấn tế bào ung thư phổi người thông

qua con đường PI3K-Akt-mTOR [61]. Fucoidan thể hiện tác dụng chống di căn

trên các tế bào ung thư phổi A549 thông qua việc điều chỉnh giảm ERK1/2 và

Akt-mTOR cũng như các con đường truyền tín hiệu NF-kB.

Năm 2016, Alwarsamy M., Gooneratne R., Ravichandran R. đã nghiên cứu ảnh

hưởng của fucoidan từ Turbinaria conoides với tế bào biểu mô ung thư phổi

(A549) [62]. Fucoidan làm giảm sự phụ thuộc vào liều bởi thử nghiệm MTT

(GI50 0,75 μg/mL). Quá trình apoptosis trong tế bào A549 được điều trị bằng

fucoidan được hiển thị bằng kính hiển vi đồng tiêu laser và phân tích chu kỳ tế

bào cho thấy cảm ứng bắt giữ pha Go/G1 của chu kỳ tế bào. Có thể kết luận

rằng fucoidan có khả năng hoạt động như một tác nhân chống tăng sinh tế bào

ung thư biểu mô phổi (A549).

Hình 1.9. Cấu trúc hợp chất fucoidan.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT

Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu và hóa chất

STT Hóa chất Xuất xứ

Lâm Đồng Củ gừng tươi 1

Lâm Đồng Cần tây tươi 2

Khánh Hòa Rong nâu khô 3

4 Bột gừng Jl. Alternatif Cibubur, Indonesia, số lô 0000254494 (tháng 4/2020)

5 Bột cần tây (hàm lượng 50% apigenin) Salus Nutra Inc, China, số lô 191210 (tháng 12/2019).

6 Bột rong nâu (hàm lượng 80% fucoidan) Công ty cổ phần Fucoidan Việt Nam, số lô 2018 (tháng 12/2018).

7 Apigenin analytical standard Sigma-Aldrich số lô BCCC0074, hàm lượng 99% apigenin

8 Shogaol analytical standard Sigma-Aldrich, số lô BCBZ1777, hàm lượng 90% [6]-shogaol

9 Fucoidan analytical standard Sigma Aldrich, số lô SLBZ7467, hàm lượng ≥ 95% fucoidan

10 Cồn công nghiệp Chemsol - Việt Nam

11 Hexane công nghiệp Chemsol - Việt Nam

12 Methanol công nghiệp Chemsol - Việt Nam

13 Fisher – Mỹ Ethanol, 99.8+%, for analysis, absolute

99.8+%, 14 Fisher – Mỹ Chloroform, for analysis, stabilized with amylene

15 Fisher – Mỹ Petroleum ether 40-60°C, for analysis, n-hexane < 2%

16 Methanol, for analysis Fisher – Mỹ

17 Acetic acid 99,5% Trung Quốc

18 Acetonitrile analysis HPLC grade Fisher – Mỹ

19 Methanol analysis HPLC grade Fisher – Mỹ

20 Water analysis HPLC grade Fisher – Mỹ

for 21 Fisher – Mỹ Hydrochloric acid, 37%, analysis, d=1.18

22 Acid phosphoric 85% Merck – Đức

23 Fisher – Mỹ Sulfuric acid, min 95%, for analysis, d=1.83

24 Silica gel (240-360 mesh) Ấn Độ

25 Merck – Đức Silica gel 60 F254 cho TLC

2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ

Bảng 2.2. Danh mục thiết bị và dụng cụ

Thiết bị - Xuất xứ

Nhật Bản Hệ thống cô quay chân không Eyela CCA-1111, bộ gia nhiệt OSB-2100

Bể siêu âm Elmasonic S 80H Đức

Cân phân tích DV215CD/OHAUS Mỹ

Tủ sấy OF-12G/JEIO TECH Hàn Quốc

Mỹ Hệ thống HPLC Flexar/ParkinElmer đầu dò PDA

Máy UV-VIS 1800 - Shimadzu Nhật Bản

Dụng cụ

Bình cầu cổ nhám 250, 500, 1000 mL Cốc 100, 250, 1000 mL

Ống mao quản Cột sắc ký

Micropipette 100-1000 𝜇L, 10-100 Pipette kẻ 0,5 mL,1 mL, 2 mL, 5 mL 𝜇L

Ống đong 10 mL, 25 mL, 1 L Bình định mức

Màng lọc dung môi cellulose acetate

Hệ thống bình lọc áp suất thấp (lọc nước cho HPLC) 0,45 𝜇m × 70 mm

Cột sắc ký pha đảo … Phin lọc PTFE 0,45 𝜇m × 13 mm

2.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu thực vật được dùng trong nghiên cứu là gừng (Zingiber officinale) (kí hiệu

ZO110420) được thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, cần tây (Apium

graveolens L.) (kí hiệu AG200720), được thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh

Lâm Đồng, rong nâu (Sargassum mcclurei) (SM011219) được thu hái tại huyện

Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa. Mẫu vật được định danh bởi TS. Nguyễn Ngọc

Tuấn – Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trường ĐH Công nghiệp TP.

Hồ Chí Minh và được lưu tại Trung tâm Thiết bị khoa học và phân tích Sinh

Hóa Lý – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng.

2.4. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Khảo sát điều kiện chiết tách

Quá trình trích ly cao dược liệu chịu rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến lượng sản

phẩm thu được như: loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi : nguyên

liệu, thời gian, nhiệt độ và một số yếu tố khác. Có nhiều loại dung môi như:

diethyl ether, n-hexane, chloroform, acetone, ethanol, methanol… Tuy nhiên,

với định hướng ứng dụng vào dược phẩm và thực phẩm chức năng, dung môi

ethanol hoặc nước được chọn cho quá trình trích ly ban đầu. Sau đó mới tiến

hành sử dụng các loại dung môi khác cho quá trình tinh chế hợp chất. Sau khi

chọn được dung môi phù hợp, tiến hành thí nghiệm lựa chọn nồng độ dung môi

thích hợp ở các nồng độ khác nhau. Yếu tố ảnh hưởng tiếp theo trong nghiên

cứu là lựa chọn tỷ lệ dung môi và nguyên liệu để cho lượng sản phẩm cao nhất,

lựa chọn khảo sát các tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 1:1, 2:1, 3:1, 5:1, 10:1,

15:1, 20:1. Thời gian trích ly cũng ảnh hưởng rất lớn đến lượng cao chiết thu

được. Thời gian trích ly: 1,2,3,5,8 giờ được lựa chọn khảo sát. Nhiệt độ trích ly

cũng ảnh hưởng rất lớn đến lượng cao chiết. Do đó, ảnh hưởng của nhiệt độ

đến quá trình trích ly là: 30, 40, 50, 60, 70 và 80 ℃ được lựa chọn để nghiên

cứu. Với khối lượng mỗi mẫu được khảo sát ban đầu là 100 g, sau khi tiến hành

trích ly, lọc lấy dịch, cô quay thu hồi dung môi, xác định lượng cao thô lớn nhất

để lựa chọn yếu tố khảo sát ban đầu.

2.4.2. Chiết xuất, phân lập hợp chất

a) Chiết xuất, phân lập [6]-shogaol trong củ gừng

Chất chiết được trong dược liệu được tiến hành theo phương pháp chiết với ethanol 90%. Chất chiết được trong ethanol 90 % theo quy định không được ít hơn 6,0 % tính theo dược liệu khô kiệt [4].

Định tính bằng phương pháp sắc kí lóp mỏng. Dung môi khai triển: n- Hexane – Ethyl acetate - acid acetic băng (7,5 : 2,5 : 4 giọt). Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 5 mL ethyl acetate, lắc trong 3 phút, lọc, lấy dịch lọc làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g bột thân rễ Gừng (mẫu chuẩn) chiết nbư mô tả ở phần dung dịch thừ. Cách tiên hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µL mỗi dung dịch trên. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Phun thuốc thử vanilin – sulfuric. Sấy bản mỏng ở 110℃ cho đến khi hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sẳc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Độ ẩm quy định không được vượt quá 13,0 % [4].

b) Chiết xuất, phân lập apigenin trong cần tây

Để chiết hợp chất apigenin trong cần tây, theo Dược điển Việt Nam V, lấy 5 g bột thô được chiết với 100 mL ether dầu hỏa (40-60℃) trong 2 giờ, lấy bã dược liệu để bay hết hơi ether, chiết tiếp như trên bằng 100 mL methanol trong 6 giờ, cất thu hồi dung môi. Độ ẩm không được quá 12,0 % [4]. Chất chiết được trong được liệu không được nhỏ hơn 7,0 % tính theo dược liệu khô kiệt hoặc có thể tiến hành theo phương pháp chiết nóng dùng ethanol làm dung môi. Để định tính bằng phương pháp TLC, dùng dung môi khai triển: Toluen - ethvl acetate - acid formic (4:4:0,5). Dung dịch thử: Lấy 3 g bột dược liệu, thêm 15 mL ethanol 96 %, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng, Bốc hơi dịch lọc còn khoảng 2 mL, được dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch chất đối chiếu: Hoà tan apigenin chuẩn trong methanol để thu được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/mL. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 µL mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra đề khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng từ ngoại ở bước sóng 254 nm vả 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung

dịch thử phải có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của vết apigenin trên sắc kí đồ của dung dịch chất đối chiếu. Độ ẩm không quá 11,0 % đối với dược liệu khô [4].

c) Chiết xuất, phân lập fucoidan trong rong nâu

Rong nâu được thu hoạch vào mùa hạ và mùa thu, rửa bằng nước sạch 2 lần đến 3 lần để loại muối và tạp chất, cắt đoạn nhỏ, phơi hoặc sấy khô ừ 40- 50℃. Bảo quản nơi khô mát. Độ ẩm không được quá 15,0 % [4]. Bột rong nâu được chiết với ethanol 80% theo tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và ở 70 ℃ trong 5h để loại mannitol và các chất ít phân cực, thu dung dịch, cô quay thu hồi cồn để tái sử dụng, thu được cao thô EtOH (độ ẩm 12,22%). Nguyên liệu được chiết với CaCl2 2% (ở 60 ℃) để phân lập hỗn hợp laminaran và fucoidan, khuấy hỗn hợp khoảng 45 phút tạo kết tủa. Dung dịch được chiết tiếp với nước ở 80 ℃ trong 5 giờ, thu được dịch chiết và phần cặn. Polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm ethanol 99 %, giữ ở nhiệt độ lạnh trong 2 giờ, ly tâm thu tủa (5500 vòng/phút), sấy tủa ở 70 ℃ trong 2 giờ. Thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách (12000 kDa) trong 48 giờ, đông khô thu phân đoạn fucoidan dạng bột.

2.4.3. Phương pháp định lượng bằng HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn

hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn dưới dạng

tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang

đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.

Xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu bằng phương pháp HPLC:

𝐻𝐿(%) = × 𝐴𝑢 × 𝐶𝑠 𝐴𝑠 𝑉1 × 𝑉3 × 10−4 𝑉2 × 𝑚

Trong đó:

𝐴𝑢: diện tích peak dung dịch mẫu thử

𝐴𝑠: diện tích peak dung dịch chuẩn

𝐶𝑠: nồng độ dung dịch chuẩn (𝜇g/mL)

𝑚: khối lượng cao (g)

𝑉1: thể tích pha loãng cao lần một (mL)

𝑉2: thể tích dung dịch hút đem đi pha loãng lần hai (𝜇L)

𝑉3: thể tích pha loãng lần hai (𝜇L)

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được đo trên thiết bị HPLC

Flexar/ParkinElmer đầu dò PDA tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.4.4. Phương pháp định lượng bằng UV-Vis

Phương pháp dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác

với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng

tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 200-800 nm. Phổ UV-

Vis được đo trên thiết bị UV-1800 Shimadzu tại viện Khoa học Vật liệu Ứng

dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.4.5. Thẩm định phương pháp định lượng

Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP, ICH…các thông số cần thẩm

định ứng với định lượng bằng HPLC bao gồm:

▪ Tính tương thích hệ thống (System suitability determination)

Đánh giá tính thích hợp hệ thống được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc

thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành và mẫu thử. Chuẩn bị mẫu chuẩn theo

quy trình. Nồng độ hoạt chất trong mẫu tương ứng với nồng độ giữa của đường

chuẩn. Lượng mẫu thử đủ cho ít nhất 6 lần tiêm mẫu. Tiến hành sắc ký, ghi lại

SKĐ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích peak trung bình và các thông

số khác của peak (độ phân giải, hệ số kéo đuôi...). Giá trị RSD của thời gian

lưu và diện tích peak phải ≤ 2,0%, hệ số bất đối xứng peak < 2.0 và số đĩa lý

thuyết > 2000 nếu không có quy định khác.

▪ Độ đặc hiệu (Specificity)

Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các

thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Tiến hành sắc kí các loại mẫu trắng,

mẫu chuẩn (nồng độ ở khoảng giữa của đường chuẩn) và mẫu thử (nồng độ

tương đương mẫu chuẩn) theo quy trình phân tích. Yêu cầu: Sắc ký đồ mẫu

trắng không xuất hiện peak trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian

lưu của chất chuẩn. Sắc ký đồ mẫu thử cho peak có thời gian lưu tương tự với

peak chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử nếu xuất

hiện thêm các peak khác không phải peak chất cần phân tích, thì peak của chất

cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi peak tạp và đáp ứng các yêu cầu chung

được quy định.

▪ Độ lặp lại

Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện

thí nghiệm ở khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại có thể được đánh giá trên kết

quả của tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100%. Độ lặp lại của phương

pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt

chất có trong mẫu, RSD ≤ 2% nếu không có quy định riêng.

▪ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration

curve)

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa

đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Cần ít nhất 6 điểm ở nồng độ

khác nhau và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ. Có thể chuẩn bị

các mẫu của dãy chuẩn bằng cách pha loãng từ một mẫu chuẩn với các hệ số

pha loãng khác nhau hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác

nhau. Vẽ đồ thị tương quan để xác định khoảng tuyến tính. Kết quả thử được

đánh giá bằng phương pháp tính đường hồi quy dựa vào phương pháp bình

phương tối thiểu theo phương trình y = ax + b, hệ số tương quan tuyến tính (R)

≥ 0,999.

▪ Độ đúng (Accuracy)

Độ đúng mô tả độ gần tới giá trị thực của đại lượng đo được. Tiến hành bố trí

thí nghiệm để xác định độ thu hồi đối với mẫu thêm chuẩn hoặc xác định độ

chệch đối với mẫu chuẩn được chứng nhận. Thực hiện thông qua đánh giá độ

thu hồi (recovery). Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một

lượng chất chuẩn vào các mẫu thử. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với

3 mức nồng độ 80, 100 và 120% so với mức nồng độ định lượng trong quy

trình và nằm trong khoảng tuyến tính. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất

03 mẫu độc lập. Độ đúng của phương pháp được xác định theo công thức:

R%: Độ thu hồi Trong đó: Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (ppm)

Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (ppm)

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ppm)

Yêu cầu: Độ đúng của phương pháp nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và

giá trị RSD ≤ 2,0%.

▪ Giới hạn phát hiện (Detection of Limit - LOD), giới hạn định

lượng (Quantitation of Limit - LOQ)

Giới hạn phát hiện là lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện được

nhưng không nhất thiết có thể định lượng. Có thể xác định bằng công thức sau:

𝐿𝑂𝐷 = 3,3 𝑎

Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất của chất phân có thể định lượng được.

Giới hạn định lượng thường lớn hơn giới hạn phát hiện của phương pháp. Giá

trị LOQ của phương pháp được xác định theo công thức sau:

𝐿𝑂𝑄 = 10 𝑎

Trong đó:  là độ lệch chuẩn được tính dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu chuẩn

a là độ dốc của đường chuẩn.

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu

- Tính giá trị trung bình:

𝑛 ∑ 𝑥𝑖 𝑖=1

𝑋̅ = 1 𝑛

- Tính độ lệch chuẩn:

𝑆 = √ 1 (𝑛 − 1) ∑(𝑥𝑖 − 𝑋̅)2 𝑖=1

- Tính độ lệch chuẩn tương đối:

𝑅𝑆𝐷 = × 100% 𝑆 𝑋̅

Trong đó:

𝑋̅: giá trị của hàm lượng hợp chất chính

xi: giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i

n: số thí nghiệm để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính

S: độ lệch chuẩn

RSD: độ lệch chuẩn tương đối

2.5. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL TRONG CỦ GỪNG

2.5.1. Chiết tách [6]-shogaol từ củ gừng

Gừng khô Zingiber officinale (1 kg) được chiết trong EtOH 90% ở 60 ° C trong

3 giờ dưới hỗ trợ sóng siêu âm. Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:5, cô quay

thu hồi dung môi thu được cao EtOH thô (độ ẩm 17,3%). Cao thô được lắc phân

bố lỏng – lỏng hệ ether dầu hỏa – EtOAc (1:1) trong 30 phút, lặp lại 3 lần, cô

quay thu hồi dung môi được cao ether dầu hỏa – EtOAc. Từ cao chiết EtOAc,

tiến hành sắc kí cột hệ n-hexane - EtOAc (50:1) đến EtOAc 100% được các cao

phân đoạn. Chọn phân đoạn chứa vết [6]-shogaol (kiểm tra bằng TLC) sắc kí

cột hệ ether dầu hỏa - EtOAc (10:1). Hợp chất thu được tiến hành làm rõ cấu

trúc và xác định bằng cách so sánh với dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR trong

các tài liệu tham khảo.

Kiểm tra vết bằng phương pháp TLC: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254

(Merck), dung môi khai triển: ether dầu hỏa - EtOAc (1,5:1). Sau khi khai triển,

để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng. Phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH.

Sấy bản mỏng ở 110 ℃ đến khi hiện vết, quan sát dưới ánh sáng thường.

2.5.2. Định lượng [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Chất chuẩn [6]-shogaol được cung cấp bởi Sigma-

Aldrich, số lô BCBZ1777, hàm lượng 90%. Hòa tan 10 mg [6]-shogaol chuẩn

trong 10 mL MeOH được dung dịch chuẩn 1000 ppm. Từ chuẩn gốc pha loãng

xuống các nồng độ 500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 10 ppm. Từ dung dịch chuẩn

10 ppm, pha thành dãy nồng độ 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm, 6 ppm, 8 ppm. Các mẫu

được lọc qua màng lọc 0,22 µm.

Chuẩn bị mẫu thử: Hòa tan 1 mg cao gừng trong 100 mL MeOH bằng bình

định mức được nồng độ 10 ppm, đậy nắp, lắc đều. Các mẫu được lọc qua màng

0,22 μm trước khi tiêm vào cột HPLC.

Điều kiện phân tích: cột VDSpher PUR 100 C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm); tốc

độ dòng 1,0 mL/phút; thời gian 10 phút; thể tích bơm mẫu 20 µL, nhiệt độ cột

25 oC, detector UV 280 nm. Hệ dung môi pha động MeCN - dung dịch 0,1%

H3PO4 chế độ gradient như sau:

% A (MeCN) %B (H3PO4 0,1%)

82 65 60 80 Thời gian (phút) 3,5 1 1,5 4 18 35 40 20

2.5.3. Thẩm định quy trình phân tích [6]-shogaol từ củ gừng

▪ Khảo sát tính tương thích hệ thống

Cách tiến hành:

- Cân bằng cột sắc kí bằng pha động trong 30 phút.

- Sắc kí mẫu chuẩn 8,0 ppm, 6 lần liên tiếp

- Khảo sát thông số: Diện tích peak, số đĩa lý thuyết N, hệ số bất đối xứng T.

▪ Độ đặc hiệu

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch:

- Mẫu trắng: dung môi MeOH, lọc qua màng lọc 0,22 μm.

- Mẫu thử nồng độ 8,0 ppm.

- Mẫu chuẩn nồng độ 8,0 ppm.

Sắc kí lần lượt 3 mẫu đã chuẩn bị tại cùng điều kiện sắc kí.

▪ Độ lặp lại

Cách tiến hành :

- Chuẩn bị mẫu thử nồng độ 10 ppm.

- Tiến hành định lượng mẫu 6 lần với điều kiện sắc kí đã được tối ưu hóa. Kết quả đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối % RSD của nồng độ.

▪ Khoảng tuyến tính

Cách tiến hành: từ dung dịch chuẩn gốc S0 10 ppm, pha tiếp mẫu dung dịch

chuẩn ở các nồng độ từ 1 ppm đến 10 ppm:

Bảng 2.3. Dung dịch chuẩn khảo sát khoảng tuyến tính [6]-shogaol

Cách pha

Thể tích cần định mức (mL)

Dung dịch chuẩn 1 2 3 4 5 Nồng độ [6]- shogaol (µg/mL) 2 4 5 6 8 S0 (mL) 2 4 5 6 8

Lọc 6 mẫu qua màng lọc 0,22 μm. Tiến hành sắc ký 6 mẫu dung dịch chuẩn và

lập đường biểu diễn tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn để xác định

phương trình hồi quy.

▪ Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng

LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn

của tín hiệu đo, theo công thức sau:

Trong đó:

- SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu

- a: độ dốc của đường chuẩn

Tính giá trị LOQ theo công thức sau:

▪ Độ đúng

Cách tiến hành:

- Cân chính xác 0,5 mg mẫu [6]-shogaol hòa tan trong MeOH và định mức trong bình định mức 100 mL thu được dung dịch thô (dung dịch A) nồng độ lý thuyết 5 ppm.

- Cân chính xác lần lượt mẫu chuẩn 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg hòa tan trong bình định mức 10 mL bằng MeOH. Hút 1 mL lần lượt các dung dịch chuẩn có nồng độ 40 ppm, 50 ppm và 60 ppm, pha loãng trong bình định mức 10 mL bằng dung dịch A, được các dung dịch với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80 %, 100 % và 120 % so với mẫu thử.

- Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên 3 lần liên tiếp tại cùng điều kiện sắc kí. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD).

2.6. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG CẦN TÂY

2.6.1. Chiết tách apigenin từ cần tây

Cần tây khô (1,2 kg) được chiết với EtOH 80% trong 5 giờ với sóng siêu âm ở

40 ° C, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi 1:10. Làm bay hơi dung môi dưới áp suất

giảm (800 mmBar), thu được cao thô EtOH (độ ẩm 4,53%). Phân tích HPLC

xác định được hàm lượng apigenin có trong cao EtOH.

Nâng cao hàm lượng apigenin bằng cách rửa cao EtOH thô nhiều lần (3-4 lần)

trong ethanol tuyệt đối từ 0-10 oC. Sau 2 lần rửa đầu tiên lọc bỏ tạp chất. Những

lần rửa sau thu lấy dung dịch màu vàng nhạt đến khi mất màu dung dịch, thu

được cao EtOH 2. Để phân lập apigenin có độ tinh khiết ≥ 95%, cao chiết EtOH

2 được thực hiện trên cột sắc ký với hệ dung môi n-hexane – EtOAc (100:1 –

1:1) thu được 7 phân đoạn. Phân đoạn 7 (9 g) tiếp tục thực hiện sắc kí cột hệ

n-hexane - EtOAc (2:1) thu được 6,72 g chất kết tinh dạng bột màu vàng nhạt.

Kiểm tra vết bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng: Dùng bản mỏng silica gel 60

F254 (Merck), hệ dung môi khai triển n-hexane - EtOAc (1,5:1). Triển khai sắc

ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại

ở bước sóng 254 nm để hiện vết được một vết tròn màu vàng khi soi dưới đèn

UV. Hợp chất này được xác định cấu trúc và nhận danh bằng cách so sánh dữ

liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR với các tài liệu tham khảo

2.6.2. Định lượng apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA

▪ Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử

- Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: Cân chính xác 10 mg mẫu apigenin chuẩn vào bình định mức 10 mL, thêm dung môi MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, siêu âm 30 phút và để yên trong 5 phút. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.

- Mẫu thử 10 ppm: Cân chính xác 1 mg mẫu cao chứa apigenin vào bình định mức 100 mL, thêm dung môi MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều để yên trong 5 phút, siêu âm trong 15 phút. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.

- Mẫu chuẩn 10 ppm: Từ chuẩn gốc 1000 ppm pha loãng xuống các nồng độ 500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 10 ppm bằng MeOH. Tất cả các mẫu đều được lọc qua màng lọc 0,22 µm.

Điều kiện sắc kí: Để định lượng apigenin trong cao cần tây, apigenin chuẩn

99% (Sigma-Aldrich, số lô BCCC0074), sử dụng cột pha đảo VDSpher PUR

100 C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm). Pha động MeCN - dung dịch 0,1% CH3COOH

(40:60); tốc độ dòng 1,0 mL/phút; bước sóng 335 nm; nhiệt độ cột 25 ℃; thể

tích tiêm 20 μL. Tất cả các mẫu được lọc qua màng 0,22 𝜇m.

2.6.3. Thẩm định quy trình phân tích apigenin từ cần tây

▪ Khảo sát tính tương thích hệ thống

Cách tiến hành:

- Cân bằng cột sắc kí bằng pha động trong 30 phút.

- Tiến hành sắc kí mẫu chuẩn 10,0 ppm, 6 lần liên tiếp

- Khảo sát thông số: Diện tích peak, số đĩa lý thuyết N, hệ số bất đối xứng T.

▪ Độ đặc hiệu

Cách tiến hành:

Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch:

- Mẫu trắng: Chuẩn bị 10 mL dung môi MeOH. Lọc qua màng lọc 0,22 μm.

- Mẫu thử 10 ppm.

- Mẫu chuẩn 10 ppm.

Sắc kí lần lượt 3 mẫu đã chuẩn bị tại cùng điều kiện sắc kí.

▪ Độ lặp lại

Cách tiến hành :

- Chuẩn bị mẫu thử nồng độ 10 ppm.

- Tiến hành định lượng mẫu 6 lần với điều kiện sắc ký đã được chọn. Kết quả

đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối % RSD của nồng độ.

▪ Khảo sát khoảng tuyến tính

Cách tiến hành: từ dung dịch chuẩn gốc S0 10 ppm, pha tiếp mẫu dung dịch

chuẩn ở các nồng độ từ 1 ppm đến 10 ppm:

Bảng 2.4. Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính của apigenin

Cách pha S0 (mL) Thể tích cần định mức (mL)

Dung dịch chuẩn 1 2 3 4 5 Nồng độ apigenin (µg/mL) 1 2 4 6 8 1 2 4 6 8

Lọc 6 mẫu qua màng lọc 0,22 μm. Tiến hành sắc ký 6 mẫu dung dịch chuẩn và

lập đường biểu diễn tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn để xác định

phương trình hồi quy.

▪ Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng

LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn

của tín hiệu theo công thức:

Tính giá trị LOQ theo công thức sau:

Trong đó:

SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu -

a: độ dốc của đường chuẩn -

▪ Độ đúng

Cách tiến hành:

- Cân chính xác 0,5 mg mẫu apigenin hòa tan trong MeOH, định mức trong bình định mức 100 mL thu được dung dịch mẫu thô (dung dịch A) có nồng độ lý thuyết 5 ppm.

- Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên 3 lần liên tiếp tại cùng điều kiện sắc ký. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD).

2.7. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN TRONG RONG NÂU

2.7.1. Chiết xuất fucoidan từ rong nâu

Bột rong nâu được chiết với ethanol 80% theo tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ ở nhiệt độ

phòng và ở 70 ℃ trong 5h để loại mannitol và các chất ít phân cực, thu dung

dịch, cô quay thu hồi cồn để tái sử dụng, thu được cao thô EtOH (độ ẩm

12,22%). Nguyên liệu được chiết với CaCl2 2% (ở 60 ℃) để phân lập hỗn hợp

laminaran và fucoidan, khuấy hỗn hợp khoảng 45 phút tạo kết tủa. Dung dịch

được chiết tiếp với nước ở 80 ℃ trong 5 giờ, thu được dịch chiết và phần cặn.

Polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm ethanol 99 %,

giữ ở nhiệt độ lạnh trong 2 giờ, ly tâm thu tủa (5500 vòng/phút), sấy tủa ở 70

℃ trong 2 giờ. Thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp

bằng màng thẩm tách (12000 kDa) trong 48 giờ, đông khô thu phân đoạn

fucoidan dạng bột.

2.7.2. Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC

Điều kiện sắc kí: Để định lượng fucoidan trong rong nâu, fucoidan (≥ 95%, số

lô SLBZ7467) cung cấp bởi Sigma Aldrich được sử dụng làm chất chuẩn. Sử

dụng cột gel HPLC Shodex, OH pak, KB-804 (300 × 8 mm). Điều kiện sắc ký:

pha động H2O 100%, tốc độ dòng 1,0 mL/phút; nhiệt độ cột T1 40 ℃ và T2 75

℃; thể tích tiêm 20 μL. Tất cả các mẫu được lọc qua màng 0,22 𝜇m trước khi

tiêm vào cột HPLC.

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 20 mg fucoidan chuẩn vào bình định mức

10 mL, hòa tan và làm vừa đủ bằng H2O, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.

Dung dịch thử: cân chính xác 20 mg mẫu fucoidan vào bình định mức 10 mL,

hòa tan và làm vừa đủ bằng H2O và lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.

2.7.3. Định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis

- Bước sóng phân tích: 399,5 nm

- Dung dịch chuẩn gốc 500 ppm: Cân chính xác 5 mg mẫu fucoidan chuẩn (số lô SLBZ7467, hàm lượng ≥ 95% fucoidan, Sigma - Aldrich) vào bình định mức 10 mL, thêm nước cất vừa đủ đến vạch. Siêu âm 15 phút. Từ chuẩn gốc 500 ppm, pha loãng thành các nồng độ 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.

- Mẫu thử 50 ppm: Cân chính xác 2 mg mẫu thử fucoidan, cho vào bình định mức 10 mL, thêm nước cất đến vạch. Lắc đều, siêu âm trong 15 phút. Từ mẫu thử 200 ppm, pha loãng thành 50 ppm. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.

- Phương pháp sử dụng: Thêm 1 mL dung dịch fucoidan chuẩn ở các nồng độ 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm vào các ống nghiệm. Làm lạnh các ống nghiệm ở 4oC trong 5 phút, thêm 4,5 mL H2SO4 (85%). Đậy nắp kín các ống nghiệm để tránh bốc hơi và đặt trong bồn nước sôi trong 10 phút. Làm nguội các ống nghiệm dưới vòi nước, thêm 0,3 mL acid cysteine hydrochloric 0,1% vào các ống nghiệm. Đặt các ống nghiệm trong bóng tối 2 giờ, quét bước sóng hấp thụ và đo độ hấp thụ trên thiết bị UV- Vis. Mẫu trắng và mẫu thử được chuẩn bị bằng phương pháp tương tự. Xác định hàm lượng fucoidan có trong mẫu bằng phương pháp UV-Vis ở bước sóng 399,5 nm theo đường chuẩn.

2.7.4. Thẩm định quy trình phân tích fucoidan từ rong nâu bằng UV-

Vis

▪ Tính tương thích hệ thống

Tiến hành đo dung dịch fucoidan chuẩn 50 ppm 6 lần, ghi lại độ hấp thu và phổ

đồ.

▪ Độ đặc hiệu

Đo độ hấp thụ lần lượt 3 mẫu trắng, fucoidan chuẩn 50 ppm và fucoidan thử 50

ppm.

▪ Khoảng tuyến tính

Từ dung dịch chuẩn gốc nồng độ 500 ppm, pha 5 mẫu dung dịch chuẩn ở các

nồng độ từ 10 ppm đến 500 ppm. Ghi lại độ hấp thu của các mẫu fucoidan

chuẩn có nồng độ: 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm. Mỗi nồng

độ tiến hành đo theo điều kiện đã chọn ba lần, lấy kết quả trung bình. Lập đường

biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ chuẩn để xác định phương

trình hồi quy.

Cách tiến hành: từ dung dịch chuẩn gốc S0 500 ppm, pha mẫu dung dịch chuẩn

ở các nồng độ từ 20 ppm đến 500 ppm:

Bảng 2.5. Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính fucoidan

Cách pha

Nồng độ fucoidan (ppm) Thể tích cần định mức (mL) S0 (mL) Dung dịch chuẩn

0,2 1 20

0,5 50 10 1 2 3 100

2 4 200

Lọc 5 mẫu qua màng lọc 0,22 μm. Tiến hành phân tích 5 mẫu dung dịch chuẩn

và lập đường biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ chuẩn để xác

định phương trình hồi quy.

▪ Độ lặp lại

Độ lặp lại được khảo sát bằng cách tiến hành đo 6 mẫu thử fucoidan tại nồng

độ 50 ppm. Ghi lại độ hấp thu và nồng độ thực tế.

▪ Độ đúng

Độ đúng có thể được thực hiện thông qua xác định độ thu hồi của phương pháp.

Bằng cách thêm fucoidan vào nền mẫu thử với các tỉ lệ lần lượt 80%, 100%,

120%. Sử dụng fucoidan chuẩn có dãy nồng độ 40 ppm, 50 ppm và 60 ppm để

thêm vào nền mẫu thử nồng độ 50 ppm. Phân tích các mẫu thử thêm chuẩn, đo

lặp lại tối thiểu ba lần đối với mỗi mẫu. Tính nồng độ của mẫu thử thêm chuẩn,

% độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (%

RSD).

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị dung dịch mẫu fucoidan (dung dịch A) có nồng độ lý thuyết 50

ppm.

- Chuẩn bị các mẫu chuẩn 40, 50,60 ppm pha loãng trong bình định mức 10 mL bằng dung dịch A, được các dung dịch với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80 %, 100 % và 120 % so với mẫu thử.

- Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên 3 lần liên tiếp tại cùng điều kiện. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD).

▪ Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ)

LOD và LOQ được tính dựa vào công thức k × SD/δ (k = 3,3 cho LOD và 10

cho LOQ). Trong đó SD là độ lệch chuẩn của mẫu chuẩn, δ là hệ số góc đường

hồi quy tuyến tính.

𝐿𝑂𝐷 = 3,3 × 𝑆𝐷 𝑎

𝐿𝑂𝑄 = 10 × 𝑆𝐷 𝑎

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU [6]-SHOGAOL TỪ CỦ GỪNG

3.1.1. Điều kiện chiết tách [6]-shogaol

a) Lựa chọn dung môi

Sử dụng dung môi chiết ban đầu là ethanol đối với gừng.

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mẫu nguyên liệu (100 g) được trích ly ở các nhiệt độ 40, 50, 60, 70, 80

℃. Các thông số được giữ cố định là EtOH 90%, thời gian 3 giờ, tỉ lệ nguyên

liệu : dung môi 1:5. Số liệu khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ được trình bày

trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly cao gừng

Nhiệt độ Khối lượng cao

(oC) gừng thô (g)

40 21,778

50 23,563

60 25,551

70 24,759

80 24,597

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly cao gừng.

Kết quả ở Hình 3.1 cho thấy khi tăng nhiệt độ thì khối lượng cao chiết tăng dần. Khi nhiệt độ tăng, lượng nhựa dầu tăng, tuy nhiên sự tăng nhiệt cũng ảnh hưởng đến chất lượng nhựa dầu gừng. Từ 40-60 ℃ thì khả năng trích ly tăng nhanh nên 60 ℃ được chọn.

c) Ảnh hưởng của thời gian

Tiến hành ở 1,2,3,5,8 giờ với khối lượng nguyên liệu ban đầu là 100 g.

Sau khi trích ly, mẫu được lọc lấy dịch, cô quay thu hồi dung môi, xác định

lượng cao chiết để chọn thời gian trích ly phù hợp. Các thông số được giữ cố

định gồm EtOH 90%, nhiệt độ 60 ℃, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:5. Số

liệu khảo sát ảnh hưởng của thời gian được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao gừng

Thời gian Khối lượng cao

(giờ) gừng thô (g)

1 12,662

2 17,453

3 19,931

5 18,982

8 18,125

Hình 3.2. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao gừng.

Khi tăng thời gian thì khối lượng cao thô tăng dần rồi giảm, do ở nhiệt độ cao trong thời gian dài có sự hao hụt khối lượng do một số tinh dầu dễ bay hơi. Từ 1-3 giờ thì khả năng trích ly tăng nhanh đáng kể, khối lượng cao thu được ở 3 giờ là 19,331 g. Ở thời gian dài hơn thì khả năng trích ly không thay đổi đáng kể so với 3 giờ do lượng nhựa dầu gừng trong nguyên liệu đã hết. Do đó để giảm chi phí và thời gian, thời gian trích ly được chọn là 3 giờ.

d) Ảnh hưởng của thể tích dung môi

Tiến hành khảo sát thể tích dung môi lần lượt là 0,2; 0,3; 0,5; 1;1,5 L (tương ứng với tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 1:2; 1:3; 1:5; 1:10; 1:15 g/mL), khối lượng nguyên liệu ban đầu là 100 g. Các thông số được giữ cố định là

EtOH 90%, thời gian 3 giờ, nhiệt độ 60 oC. Số liệu khảo sát về ảnh hưởng của thể tích dung môi được trình bày trong Bảng 3.3 và Hình 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao gừng

Thể tích dung môi (L) 0,2 Khối lượng cao gừng thô (g) 18,225

0,3 19,347

0,5 24,896

1 25,124

1,5 25,235

Hình 3.3. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly gừng.

Kết quả cho thấy khối lượng cao gừng tăng theo thể tích dung môi sử dụng. Thể tích 1,5 L (tương ứng với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi 1:15 g/mL) cho hiệu suất cao nhất, tuy nhiên không đáng kể so với 0,5 L (tương ứng với tỉ lệ 1:5). Do khác biệt về khối lượng cao không nhiều khi tăng thể tích dung môi từ 0,5 đến 1,5 L nên 1:5 được chọn là tỉ lệ hợp lý nhất.

e) Ảnh hưởng nồng độ dung môi

Để xác định nồng độ dung môi thích hợp, sử dụng EtOH ở các nồng độ 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, khối lượng nguyên liệu là 100 g. Các thông số cố định là thể tích nguyên liệu : dung môi (1:5), nhiệt độ 60 ℃, thời gian 3 giờ. Số liệu khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung môi được trình bày trong Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao gừng

Nồng độ dung Khối lượng cao

môi (%) gừng thô (g)

60% 12,962

70% 14,148

80% 18,995

90% 20,752

96% 20,436

Hình 3.4. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến quá trình trích ly gừng.

Hình 3.4 cho thấy nồng độ dung môi ảnh hưởng lớn đến hiệu quả trích ly. Đối với gừng, khi chiết ở nồng độ ethanol 90% hiệu quả trích ly đạt cao nhất (20,752g), từ đó chọn ethanol 90% làm nồng độ nghiên cứu.

3.1.2. Quy trình chiết xuất [6]-shogaol

a) Quy trình tách chiết cao gừng chứa [6]-shogaol

Bột gừng khô (1 kg)

Chiết EtOH 90% (1:5) 3h, siêu âm, 60 ℃

Dịch chiết

Cô quay loại dung môi 60 oC Lọc bỏ bã

Cao EtOH (độ ẩm 17,3%) hàm lượng shogaol 0,8% (m = 170 g)

EtOH lạnh

Dịch chiết

Sáp, tạp, chất màu…

Chiết lỏng -lỏng hệ ether dầu hỏa - EtOAc (1:1) Lắc 15’, để yên 30’ Chiết 3 lần CC ether dầu hỏa - EtOAc (50:1 → 1:1)

Phân đoạn 1,2

Phân đoạn 4,5,6,7

Phân đoạn 3 hàm lượng [6]- shogaol 18,86% (6 g)

CC ether dầu hỏa - EtOAc (10:1)

[6]-shogaol ≥ 95%

(m = 10,5 mg)

Xác định cấu trúc

(NMR)

Hình 3.5. Quy trình chiết xuất [6]-shogaol trong cao gừng.

Thuyết minh quy trình: Củ gừng (5 kg) sau khi thu về được rửa sạch, loại bỏ củ hư, phơi dưới bóng râm đến khi khối lượng không đổi, thu được 1 kg gừng khô. Gừng khô Zingiber officinale (1 kg) được chiết với EtOH 90% ở 60

oC trong 3 giờ với hỗ trợ sóng siêu âm theo tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:5. Sau thời gian trích ly, tiến hành lọc tách bã, cô quay chân không thu hồi dung môi thu được 170 g cao thô (độ ẩm 17,3%) đạt hiệu suất thu khối lượng cao thô là 17%. Phân tích HPLC xác định làm lượng [6]-shogaol trong cao gừng thô EtOH là 0,8%.

Tiến hành nâng cao hàm lượng [6]-shogaol trong dịch chiết EtOH thô bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng. Để tách sáp và tạp dùng EtOH lạnh, khi đó sáp và tạp sẽ đông đặc lại rồi loại chúng ra khỏi hỗn hợp. Lúc này hỗn hợp chỉ còn lại tinh dầu, nhựa dầu và dung môi ở dạng sệt, thu hồi dung môi và tinh chế để sử dụng lại. Cho nước vào dịch chiết EtOH, chiết trên phễu chiết với hệ dung môi ether dầu hỏa - EtOAc (1:1), lắc 15 phút và để yên 30 phút, lọc lấy phần dịch trong màu vàng sậm. Chiết lặp lại 3 lần để chiết kiệt hợp chất tan trong pha hữu cơ. Phân tích HPLC xác định làm lượng [6]-shogaol trong cao ether dầu hỏa – EtOAc là 18,9%.

Để phân lập [6]-shogaol đạt độ tinh khiết từ 95% cho phân tích NMR, dịch chiết ether dầu hỏa – EtOAc (1:1) sau khi cô quay thu hồi dung môi được phân lập trên cột silica gel với hệ dung môi ether dầu hỏa - EtOAc (50:1; 30:1; 20:1; 15:1; 5:1; 2:1; 1:1) thu được 7 phân đoạn. Phân đoạn 3 (6 g) được tiến hành sắc ký cột sử dụng hệ dung môi ether dầu hỏa - ethyl acetate (10:1) thu được [6]-shogaol (10,5 mg).

b) Định tính và xác định cấu trúc [6]-shogaol

Kết quả định tính [6]-shogaol: chỉ số Rf của [6]-shogaol triển khai trên

bản mỏng là 0,4; hệ dung môi khai triển ether dầu hỏa – EtOAc (1,5:1).

A B

Hình 3.6. TLC các phân đoạn cao gừng và so chuẩn.

(A): soi dưới đèn UV; (B): hiện vết bằng H2SO4 10% trong EtOH.

Cấu trúc [6]-shogaol (E)-1-(4-Hydroxy-3 methoxyphenyl)-dec-4-en-3-one:

CTPT: C7H24O3. KLPT: 276 g/mol. Dạng dầu màu vàng nhạt, vị hăng.

Bảng 3.5. Dữ liệu NMR của hợp chất phân lập được từ gừng so với TLTK

Vị trí HMBC δH (ppm)

* δH

(ppm)

δC (ppm)

* δC (ppm)

2.85 (4H, m) 2.88 (m) 30.4 31.1 1 C-3, C-6, C- 1, C-2

C-3, C-1, C-6 2.89 (2H, m)

2 3 42.5 200.4 41.3 201.5

4 C-3, C-6 130.9 130.0 6.09 (1H, d, J = 15,6 Hz)

5 C-3, C-6 6.11 (1H, q) 148.5 148.7 2.66 (m) 6.12 (brs, d, J = 15.9 Hz) 6.9 (dt, J = 15.9 Hz, J = 7.1 Hz)

6 C-7, C-4, C-5 2.22 (m) 31.9 32.1

7 8 9 28.3 32.5 23.0 27.6 29.8 22.1

10 C-8, C-9 14.5 13.0

2.19 (2H, q, J = 7,2 Hz) C-9, C-6, C-8 1.45 (2H, m) C-9, C-6, C-10 1.30 (2H, m) C-9, C-6, C-10 1.35 (2H, m) 0.89 (3H, t, J = 6,8 Hz) 133.8 1

1.48 (m) 1.34 (m) 1.34 (m) 0.93 (t, J = 7,1 Hz) 6.8 (d) 132.6 111.8 6.71 (1H, brs) 111.7 2

147.6 C-1, C-3, C- 6 146.9 3

144.4 4

144.5 114.7 114.9 5 C-2 6.69 (1H, d, J = 8.0 Hz)

120.4 6.82 (1H, m) 121.4 6 C-1, C-3, C- 6

6.71 (d, J = 8.0 Hz) 6.63 (dd, J = 8.0 Hz) 3.84 (s) 3.87 (3H, s) 55.5 C-3 3- OCH3

Kết quả 1H-NMR cho thấy hợp chất có ba proton aryl, hai proton olefinic, một nhóm metoxy tại δH 3,87, một nhóm hydroxy tại δH 5,49 và một tín hiệu mũi đôi cho proton H-4 tại δH 6,09. Sự sắp xếp các nhóm này cho thấy trong phân tử hợp chất có nhóm phenyl và alkyl. Kết quả 13C-NMR và HSQC cho thấy sự hiện diện của các nhóm alkyl không bão hòa chứa 10 carbon. Đồng thời có ba nguyên tử carbon bậc bốn trong nhóm aryl. Ngoài ra, còn có một nhóm carbonyl gắn với nhóm alkyl ở δC 202,9. Trong tương quan HMBC, hai proton olefinic ở δH 6,09 (δC 130,9) và δH 6,11 (δC 130,9) tương quan với nhau và với carbon trong nhóm ketone ở δC 202,9. Kết quả NMR kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo khẳng định hợp chất được phân lập là [6]-shogaol.

Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất phân lập từ củ gừng.

3.1.3. Định lượng [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC

Bảng 3.6. Kết quả định lượng [6]-shogaol trong nguyên liệu gừng

Nồng độ chuẩn Cs (ppm) =

8,0 X

AS AU

Mẫu Đơn vị NL1-1 NL1-2

mt mg HL% 3765660,6 7648,7 2,23 0,18% 3760596,7 10605,7 2,23 0,25% 0,22% Trung bình =

Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu gừng.

Bảng 3.7. Kết quả định lượng [6]-shogaol trong mẫu gừng thị trường

8,0 Nồng độ chuẩn Cs (𝜇g/mL) =

AS AU

Mẫu Đơn vị G1.1 G1.2 3765660,6 74977,6 3760596,7 74652,9 mt mg 4,95 4,95 Trung bình = X HL% 0,80% 0,80% 0,80%

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu gừng thị trường.

Bảng 3.8. Kết quả định lượng [6]-shogaol trong mẫu sản phẩm chiết tách

8,0 Nồng độ chuẩn Cs (𝜇g/mL) =

Mẫu X AS AU mt

Đơn vị PE2.9-1 PE2.9-2 Trung bình HL% 3765660,6 12968021,5 36,5 18,87% 3760596,7 12951959,9 36,5 18,85% 18,86%

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu sản phẩm cao gừng chiết tách.

3.1.4. Thẩm định quy trình định lượng [6]-shogaol từ củ gừng

▪ Tính tương thích hệ thống

Phân tích sắc ký 6 lần mẫu chuẩn [6]-shogaol nồng độ 8,0 ppm và ghi nhận sắc ký đồ. Kết quả thời gian lưu được xác định là 4,194 ± 0,0059 phút (x ± SD, RSD = 0,14%), diện tích peak là 1353588,4 ± 20946,1 (x ± SD, RSD = 1,547%), giá trị RSD của thời gian lưu, diện tích peak đều < 2%, hệ số kéo đuôi 1,01, hệ dung môi và tốc độ dòng không gây rộng peak. Các giá trị số đĩa lý thuyết > 4000 chứng tỏ không có hiện tượng chồng chập peak tại vị trí peak [6]-shogaol. Tín hiệu peak [6]-shogaol không bị gây nhiễu bởi chất khác. Kết luận quy trình đạt tính tương thích hệ thống.

Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu thẩm định tính tương thích hệ thống [6]-shogaol.

Bảng 3.9. Kết quả tính tương thích hệ thống [6]-shogaol

Mẫu chuẩn Hệ số kéo đuôi Số đĩa lý thuyết

4044 4849 4382 5207 4345 4702 4588 1,01 1,00 1,03 0,99 1,03 1,00 1,01

Thời gian lưu tR (phút) 4,200 4,197 4,197 4,192 4,197 4,182 4,194 0,0059 0,14 Diện tích peak (mAU) 1321655,4 1207002,9 1353625,2 1361703,8 1212083,3 1259268,4 1353588,4 20946,1 1,547 2 1 3 4 5 6 Trung bình SD RSD (%)

▪ Độ đặc hiệu

Phân tích đồng thời mẫu chuẩn [6]-shogaol 10 ppm, mẫu trắng và mẫu thử 10 ppm trong cùng điều kiện sắc ký đã chọn. Bảng 3.10 thể hiện tính đặc hiệu của phương pháp. Kết quả có sự xuất hiện peak của chất cần phân tích trên

sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện peak tương ứng trên sắc ký đồ mẫu thử, không xuất hiện peak tương ứng trên mẫu trắng. Peak của [6]-shogaol trên mẫu thử là cân đối, sắc nét. Kết quả phương pháp đảm bảo độ đặc hiệu (Hình 3.10).

Bảng 3.10. Độ đặc hiệu của [6]-shogaol

Mẫu Thời gian lưu (tR)

Mẫu trắng Mẫu chuẩn

Mẫu thử

Trung bình 4,172 4,082 4,109 4,121 Diện tích peak (mAU) 3102498,7 1386073,6 1539096,0

(a) (b)

Hình 3.12. SKĐ độ đặc hiệu của [6]-shogaol

(a) mẫu chuẩn; (b) mẫu thử

▪ Khoảng tuyến tính

Phân tích sắc ký dãy chuẩn [6]-shogaol nồng độ 2 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm theo điều kiện đã chọn. Trong khoảng nồng độ khảo sát, có mối liên hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chất phân tích. Phương trình hồi quy tuyến tính của [6]-shogaol là đường thẳng y = 166129,76x + 22743,83 với hệ số tương quan R2 = 0,9997 (Hình 3.13).

Bảng 3.11. Đường chuẩn [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC

1 2 4 5 6 3

2 4 6 8 10 5

357556,1 684520,0 841332,5 1031872,7 1355249,4 1680474,0

Mẫu Nồng độ chuẩn (ppm) Diện tích peak (mAU)

Phương trình hồi quy: y = 166129,76x + 22743,83 Hệ số tương quan: R2 = 0,9997

Hình 3.13. Đồ thị đường chuẩn [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC.

Hình 3.14. SKĐ khoảng tuyến tính [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC.

▪ Độ lặp lại

Tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt cho 6 mẫu thử vào hệ thống HPLC ở

nồng độ 100%, kết quả khảo sát được trình bày trong Bảng 3.12.

Bảng 3.12. Độ lặp lại của quy trình định lượng [6]-shogaol bằng HPLC

Diện tích peak (mAU) Nồng độ (µg/mL)

Mẫu 1 2 3 4 5 6 Trung bình RSD (%) 254382,6 247883,2 256213,4 254131,6 255960,4 256722,7 254215,7 1,455 1,416 1,466 1,393 1,464 1,469 1,444 1,99

Kết quả Bảng 3.12 cho thấy độ lặp lại chấp nhận được với RSD = 1,99% (< 2%). Dao động giữa các kết quả thử nghiệm có độ lặp lại cao. Phương pháp phân tích ổn định, ít ảnh hưởng bởi sai số hệ thống và sai số ngẫu nhiên. Do đó, quy trình có thể áp dụng để phân tích mẫu kiểm nghiệm.

▪ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

𝐿𝑂𝐷 = = = 0,42 (𝑝𝑝𝑚) 3,3 × 𝑆𝐷 𝑎 3,3 × 20946,1 166129,76

𝐿𝑂𝑄 = = = 1,26 (𝑝𝑝𝑚) 10 × 𝑆𝐷 𝑎 10 × 20946,1 166129,76

Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của [6]-shogaol

lần lượt là 0,42 ppm và 1,26 ppm.

▪ Độ đúng

Kết quả khảo sát độ đúng của [6]-shogaol được trình bày ở Bảng 3.13.

Bảng 3.13. Độ đúng của quy trình thẩm định [6]-shogaol

Mẫu Diện tích peak RSD % Nồng độ lý thuyết (µg/mL) % thêm vào Hiệu suất thu hồi (%) Trung bình (%)

80% 4 99,33 1,89

100% 5 98,87 1,24

120% 6 99,72 0,89

913287,9 879911,3 882843,7 1045295,3 1052866,8 1068383,5 1237863,9 1215788,8 1224978,6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ thực tế tìm thấy (µg/mL) 4,1 3,9 3,92 4,9 4,90 5,03 6,05 5,92 5,98 102,0 98,0 98,0 98,0 98,0 100,6 100,8 98,7 99,7

99,30 1,34 Trung bình

Nhận xét: Trong tất cả các lần thử, giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%, tỷ lệ hồi phục

trung bình đạt trong giới hạn cho phép là 98% - 102% nên phương pháp đạt chỉ

tiêu về độ đúng.

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU APIGENIN TỪ CẦN TÂY

3.2.1. Điều kiện chiết tách apigenin

a) Lựa chọn dung môi

Sử dụng dung môi là ethanol đối với cần tây.

b) Ảnh hưởng nhiệt độ

Đối với cần tây, vì apigenin là hợp chất dễ phân hủy ở nhiệt độ cao nên chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ trích ly là 40oC để đảm bảo không làm phân hủy các hợp chất cần chiết.

c) Ảnh hưởng của thời gian

Tiến hành thí nghiệm ở 1,2,3,5,8 giờ với khối lượng nguyên liệu ban đầu là 100g. Mẫu được lọc lấy dịch, cô quay thu hồi dung môi, xác định lượng cao thô cao nhất. Các thông số được giữ cố định gồm EtOH 80%, nhiệt độ 40℃, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi 1:10. Số liệu ảnh hưởng của thời gian được trình bày trong Bảng 3.14 và Hình 3.15.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao cần tây

Thời gian (giờ) 1 Khối lượng cao cần tây thô (g) 20,479

2 20,882

3 22,678

5 27,218

8 27,325

Hình 3.15. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao cần tây.

Khi tăng thời gian thì khối lượng cao thô tăng dần. Từ 1-5 giờ khả năng trích ly tăng nhanh đáng kể, khối lượng cao thu được ở 5h là 27,218 g. Tuy nhiên ở thời gian dài hơn thì hiệu suất trích ly không thay đổi nhiều so với 5h. Do đó chọn 5h làm thời gian trích ly cần tây.

d) Ảnh hưởng của thể tích dung môi

Khảo sát thể tích dung môi lần lượt là 0,2; 0,3;0,5; 1; 1,5 L (ứng với tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:2; 1:3; 1:5; 1:10; 1:15 g/mL), khối lượng nguyên liệu ban đầu là 100g. Các thông số được giữ cố định là EtOH 80%, thời gian 5h, nhiệt độ 40oC. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi được trình bày trong Bảng 3.15 và Hình 3.16.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây

Thể tích Khối lượng cao

dung môi (L) cần tây thô (g)

0,2 18,963

0,3 22,554

0,5 26,756

1 31,11

1,5 31,25

Hình 3.16. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây.

Kết quả cho thấy khối lượng cao EtOH thu được tăng theo thể tích sử dụng. Tuy nhiên, khi tăng thể tích từ 0,5 đến 1,5 L sau 5h thì lượng cao EtOH thu được thay đổi không đáng kể. Vì vậy để tiết kiệm dung môi, thời gian đồng thời thu được lượng cao thô nhiều nhất thì thể tích 1L (tỉ lệ nguyên liệu:dung môi 1:10 g/mL) được chọn.

e) Ảnh hưởng nồng độ dung môi

Sử dụng EtOH ở nồng độ 60%, 70%, 80%, 96%, khối lượng nguyên liệu là 100g. Các thông số được giữ cố định là thể tích nguyên liệu:dung môi 1:10, nhiệt độ 40oC, thời gian 5h. Số liệu về ảnh hưởng nồng độ dung môi được trình bày trong Bảng 3.16 và Hình 3.17.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây

Nồng độ dung Khối lượng cao

môi (%) cần tây (g)

60% 29,451

70% 31,886

80% 35,892

90% 35,517

96% 35,569

Hình 3.17. Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây.

Ở nồng độ 60% thì khối lượng cao thu được là 29,451g. Khi tăng nồng độ EtOH lên 70%, 80% thì khối lượng cao thô tăng dần tương ứng là 31,886; 31,892g. Khi tăng nồng độ EtOH từ 90% lên 96%, lượng cao thô thay đổi không nhiều. Như vậy, cồn 80% phù hợp nhất nên được chọn để thực hiện.

3.2.2. Quy trình chiết xuất apigenin

a) Quy trình tách chiết cao cần tây chứa apigenin

Thuyết minh quy trình: Cần tây (20 kg) sau khi thu về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hoặc sâu, phơi dưới bóng râm đến khối lượng không đổi, xay nhỏ thu được 1,2 kg bột cần tây khô. Chất chuẩn apigenin (≥ 99%, số lô BCCC0074) được cung cấp bởi Sigma Aldrich, methanol (MeOH), acetonitril (ACN), nước cất đạt tiêu chuẩn dung môi HPLC được cung cấp từ Fisher Scientific Korea Ltd. Các hóa chất, dung môi khác như ethanol (EtOH), acid sulfuric, ether dầu hỏa… được cung cấp từ hãng Chemsol (Việt Nam).

1,2 kg bột cần tây được chiết với EtOH 80% trong 5h với sóng siêu âm ở 40 ℃ và tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10. Sau khi loại bỏ EtOH 80% dưới áp suất giảm, thu được 403,2 g cao thô (độ ẩm 4,53%). Phân tích HPLC xác định được hàm lượng apigenin trong cao EtOH là 64,8%.

Nâng cao hàm lượng apigenin bằng cách rửa cao EtOH thô nhiều lần (3- 4 lần) trong ethanol tuyệt đối từ 0-10 oC. Sau 2 lần rửa đầu tiên lọc bỏ tạp chất. Những lần rửa sau thu lấy dung dịch màu vàng nhạt đến khi mất màu dung dịch, thu được cao EtOH 2 có hàm lượng apigenin 89,9% (14,64 g).

Để phân lập apigenin độ tinh khiết ≥ 95%, tiến hành sắc ký cột cao EtOH 2 với hệ dung môi n-hexane – EtOAc (100:1 – 1:1) thu được 7 phân đoạn. Phân đoạn 7 (9 g) tiếp tục thực hiện sắc kí cột hệ n-hexane - EtOAc (2:1) thu được 6,72 g chất sạch kết tinh dạng bột màu vàng nhạt. Kiểm tra lại bằng TLC hệ n- hexane - EtOAc (1,5:1), được một vết tròn màu vàng khi soi dưới đèn UV. Hợp chất này được xác định cấu trúc và nhận danh bằng cách so sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR với các tài liệu tham khảo, xác định là apigenin.

(1,2 kg)

Chiết EtOH 80% (1:10)

5h, siêu âm, 40oC

HPLC

Apigenin hàm lượng 64,8%

Cao EtOH 1 (m = 403,2 g)

Rửa EtOH lạnh 96% từ 0-10 ℃ 3 lần

Dịch màu vàng nhạt

Tạp chất

HPLC

Apigenin hàm lượng

Cắn không tan

Cao EtOH 2

89,9%

(m = 14,64 g)

CC n-hexane : EtOAc (10:1 – 1:1)

Phân đoạn 7 (m = 9g)

Phân đoạn 1-6

CC n-hexane : EtOAc (2:1)

apigenin ≥ 95%

(m = 672 mg)

Xác định cấu trúc

(NMR)

Bột cần tây khô

Hình 3.18. Quy trình chiết xuất apigenin từ cần tây.

b) Định tính và xác định cấu trúc apigenin

▪ Kết quả định tính apigenin

(a) (b)

Hình 3.19. TLC cao cần tây (a) và apigenin (b) soi dưới đèn UV.

Kết quả định tính [6]-shogaol: chỉ số Rf của [6]-shogaol triển khai trên

bản mỏng là 0,32; hệ dung môi khai triển n-hexane – EtOAc (1,5:1).

▪ Cấu trúc hợp chất apigenin:

Công thức hóa học: C15H10O5

UV-vis (λmax): 267, 336 nm

Điểm nóng chảy: 345 - 350 °C

Bảng 3.17. Kết quả NMR hợp chất phân lập từ cần tây so với TLTK

* δH

(ppm)

Vị trí 1 2 δH (ppm)

* δC (ppm) δC 183,93 166,32

(ppm) 183,0 164,19

6,61 (1H, s) 3 6,47 (s, 1H) 103,87 103,30

4 5 183,93 163,23 182,21 161,95

6 100,14 99,89

7 6,23 (d, 1H, d, J = 2 Hz) 6,21 (d, 1H, J = 2,5 Hz) 162,74 163,31

8 94,55 95,05

159,45 105,34 123,31

157,86 105,83 121,63 128,98 129,45

116,51 117,03

6,77 (d, 1H, J = 2,5 Hz) 7,93 (d, 2H, J = 8 Hz) 6,92 (d, 2H, J = 8 Hz) 161,79 6,48 (d, 1H, d, J = 2 Hz) 7,87 (2H, d, J = 7 Hz) 6,95 (2H, d, J = 7 Hz) 159,49

9 10 1 2 & 6’ 3 & 5’ 4 1H-NMR (methanol-d4, 500 MHz, TMS); 13C-NMR (methanol-d4, 125

MHz, TMS)

Phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của hai cặp đôi thơm thế meta ở δ 6,21 và 6,77 tương ứng với các proton H-6 và H-8, sáu proton thơm ở δ 7,93 (2H, d, J = 8 Hz) và δ 6,92 (2H, d, J = 8 Hz) cho H-3'/ H-5' và các proton H- 2'/H-6' của vòng B, một mũi đơn ở δ 6,47 tương ứng với proton H-3; đặc trưng cho flavone. Ngoài ra, hai tín hiệu cặp đôi ở δ 6,21 (1H, d, J = 2 Hz) và δ 6,77 (1H, d, J = 2 Hz) cho thấy tương quan vị trí meta với nhau. Điều này có nghĩa là hai tín hiệu proton nằm trong cùng một hệ thống vòng A.

Phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của 12 nguyên tử thơm; 7 nguyên tử carbon bậc bốn, 5 nguyên tử metine và 1 carbon tứ cấp. Giá trị 1H-NMR và 13C-NMR cho tất cả các nguyên tử carbon trên cơ sở tương quan HSQC và HMBC cho thấy dữ liệu phổ của hợp chất phù hợp với 4,5,7-trihydroxyflavone, còn được gọi là apigenin. Mối tương quan của HMBC giữa δH 6.48 với δC 100,14; 166,02; 159,45; 105,34 và proton δH 6,23 với các nguyên tử carbon ở C 163,23; 105,34; 166,02 và 100,14 xác nhận vị trí của δH 6,48 và 6,23 tại H- 8 và H-6 của vòng A. Tương quan khác của HMBC giữa δH 6,95 với carbon sp2 bậc bốn ở δC 123,31 và δH 7,87 với carbon sp2 bậc bốn ở δC 162,74 xác nhận sự hiện diện của hệ thống vòng B. Từ kết quả phân tích và so sánh với công bố kết luận hợp chất là apigenin.

Hình 3.20. Cấu trúc hợp chất phân lập được từ cần tây.

3.2.3. Định lượng apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA

Với điều kiện đã chọn, tiến hành định tính apigenin trong mẫu chuẩn và

mẫu thử dựa vào thời gian lưu (tR) của peak apigenin trên SKĐ.

Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu apigenin chuẩn 5 ppm.

Bảng 3.18. Kết quả định lượng apigenin trong nguyên liệu cần tây

5 Nồng độ chuẩn Cs (ppm) =

Sc mAu St mAu mt mg X %

844908,7 6514848 500 0,08% Mẫu Đơn vị Nguyên liệu

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu cần tây.

Bảng 3.19. Kết quả định lượng apigenin trong cao cần tây thị trường

5 Nồng độ chuẩn Cs (ppm) =

X %

Mẫu Sc Đơn vị mAu A1.1-1 844908,7 A1.1-2 844908,7 St mAu 521263.5 521696.3

Trung bình mt mg 2,64 45,79% 2,50 46,10% 45,95%

Hình 3.23. Sắc ký đồ apigenin trong cao cần tây thị trường.

Bảng 3.20. Kết quả định lượng apigenin trong sản phẩm chiết tách

5 Nồng độ chuẩn Cs (ppm) =

St Sc Mẫu Đơn vị

mt mg API-H2O 1.1 844908,7 841368,4 560 API-H2O 1.2 844908,7 840886,1 560 Trung bình X HL% 89,12% 88,86% 89,00%

Hình 3.24. Sắc ký đồ mẫu apigenin của sản phẩm chiết tách.

3.2.4. Thẩm định quy trình định lượng apigenin từ cần tây

▪ Tính tương thích hệ thống

Tiến hành tiêm mẫu chuẩn apigenin 6 lần vào hệ thống sắc kí và ghi sắc kí đồ,

kết quả ở Bảng 3.21.

Hình 3.25. Sắc ký đồ thẩm định tính tương thích hệ thống apigenin.

Bảng 3.21. Kết quả tính tương thích hệ thống apigenin

Mẫu chuẩn

Hệ số kéo đuôi 1,413 1,428 1,409 1,430 1,430 1,410 1,420 Số đĩa lý thuyết 2865 2721 2814 2766 2645 2602 2735,5

1 2 3 4 5 6 Trung bình SD RSD (%) Thời gian lưu tR (phút) 9,444 9,422 9,470 9,396 9,424 9,420 9,429 0,023 0,243 Diện tích peak (mAU) 804853,5 797223,4 799668,2 806875,6 802236,7 810305,9 803527,2 4382,1 0,545

Kết luận:

- % RSD 6 lần tiêm lặp lại của thời gian lưu: 0,243% < 2%

- % RSD 6 lần tiêm lặp lại của diện tích peak: 0,545% < 2%

- Giá trị trung bình của số đĩa lý thuyết: 2735,5 > 2000

- Giá trị trung bình của hệ số bất đối xứng T: 1,42 < 2,5

Như vậy, quy trình đạt tính tương thích hệ thống.

▪ Độ đặc hiệu

Tiến hành tiêm mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống sắc kí theo điều kiện đã chọn. Bảng 3.22 và Hình 3.24 thể hiện kết quả tính đặc hiệu.

Bảng 3.22. Độ đặc hiệu của quy trình thẩm định apigenin

Thời gian lưu (tR) Diện tích peak (mAU) Mẫu Mẫu trắng

Mẫu chuẩn

Mẫu thử

Trung bình Độ lệch chuẩn 796013,2 799473,8 533451,3 535528,4 666116,675 151998,497 9,509 9,548 9,440 9,430 9,482 0,056

Hình 3.26. Độ đặc hiệu mẫu trắng (a); apigenin chuẩn (b); mẫu thử 10 ppm (c).

Kết quả: Phân tích mẫu chuẩn apigenin, mẫu trắng và mẫu thử trong cùng điều kiện sắc ký. Tại vị trí xuất hiện peak của chất cần phân tích trên SKĐ mẫu chuẩn, xuất hiện peak tương ứng trên sắc ký đồ mẫu thử, đồng thời không xuất hiện peak tương ứng trên mẫu trắng. Peak của apigenin trên mẫu thử là cân đối, sắc nét, độ rộng chân peak nhỏ. Như vậy, phương pháp đảm bảo độ đặc hiệu.

▪ Độ lặp lại

Tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt cho 6 mẫu thử apigenin vào hệ thống HPLC

ở nồng độ 100%.

Bảng 3.23. Độ lặp lại của quy trình thẩm định apigenin bằng HPLC

Mẫu Diện tích peak (mAU) Nồng độ (ppm)

1 2 3 4 5 6 Trung bình SD RSD (%) 425042,1 424701,4 425148,3 430598,5 408745,7 417526,4 421960,4 2,566 2,564 2,567 2,602 2,463 2,519 2,547 0,045 1,75

Kết luận: Độ lặp lại có thể chấp nhận được với RSD = 1,75% (< 2%). Kết quả khảo sát cho thấy dao động giữa các kết quả thử nghiệm có độ lặp lại cao. Phương pháp phân tích ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống và sai số ngẫu nhiên. Do đó, quy trình có thế áp dụng để phân tích mẫu kiểm nghiệm.

▪ Khoảng tuyến tính

Chuẩn bị dãy chuẩn có nồng độ 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm. Tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.24 để vẽ đồ thị đường chuẩn (Hình 3.25).

Bảng 3.24. Đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA

3 1 2 4 5 6

4 1 2 6 8 10

164132,9 338734,1 668489,5 958543,0 1294758,7 1582270,1

STT Nồng độ chuẩn (ppm) Diện tích peak (mAU)

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 157454x + 20975 Hệ số tương quan: R2 = 0,9994

Hình 3.27. Đồ thị đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA.

Hình 3.28. SKĐ đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC.

Kết quả: Trong khoảng nồng độ khảo sát có mối liên hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chất phân tích trong khoảng từ 1 đến 10 ppm. Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = 157454x + 20975 với hệ số tương quan R2 = 0,9994. Kết luận: R2 = 0,9994 ≥ 0,995, đạt yêu cầu khoảng tuyến tính.

▪ Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ):

𝑢𝑔 𝐿𝑂𝐷 = = = 0,09 ( ) 𝑚𝐿⁄ 3,3 × 𝑆𝐷 𝑎 3,3 × 4382,1 157454

𝑢𝑔 𝐿𝑂𝑄 = = = 0,28 ( ) 𝑚𝐿⁄ 10 × 𝑆𝐷 𝑎 10 × 4382,1 157454

Trong đó:

SD: độ lệch chuẩn tương đối của 6 lần tiêm apigenin chuẩn.

a: hệ số góc của đường chuẩn

Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của apigenin

lần lượt là 0,09 µg/mL và 0,28 µg/mL.

▪ Độ đúng

Xác định tỉ lệ thu hồi khi tính toán lượng chuẩn cần thêm vào mẫu thử với các tỉ lệ lần lượt là 80%, 100%, 120% trên nền mẫu thử. Mỗi nồng độ tiến hành 3 lần lặp lại trong cùng điều kiện khảo sát. Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.25.

Bảng 3.25. Độ đúng của quy trình thẩm định apigenin

Mẫu Diện tích peak RSD % % thêm vào Nồng độ lý thuyết (µg/mL) Hiệu suất thu hồi (%) Trung bình (%)

80% 4 99,24 1,07

5 101,39 1,20 100 % 649357,3 638348,0 650387,4 829792,6 816701,1 1 2 3 4 5 Nồng độ thực tế tìm thấy (µg/mL) 3,99 3,92 4,00 5,14 5,05 99,77 98,02 99,94 102,74 101,07

6 99,27 0,64 120 % 6 7 8 9 811135,8 964627,5 952570,4 959086,2 5,02 5,99 5,92 5,96 100,37 99,89 98,61 99,30

Trung bình 99,97 0,97

Nhận xét: Trong tất cả các lần thử, giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%, tỷ lệ hồi phục trung bình đạt trong giới hạn cho phép là 98% - 102% nên phương pháp đạt độ đúng.

3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TỪ RONG NÂU

3.3.1. Điều kiện chiết tách fucoidan từ rong nâu

a) Lựa chọn dung môi

Trong thí nghiệm với rong nâu, sử dụng dung môi là nước.

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nguyên liệu (100 g) được tiến hành trích ly ở nhiệt độ 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃. Các thông số được giữ cố định là dung môi nước, thời gian 5h, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi 1:10.

Bảng 3.26. Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng trích ly rong nâu

Nhiệt độ Khối lượng cao

(oC) rong nâu (g)

40 51,202

50 65,912

60 75,028

70 75,147

80 81,551

Hình 3.29. Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng trích ly rong nâu.

Đối với rong nâu, khi tăng nhiệt độ thì hiệu suất tách chiết tăng dần từ 40-80 ℃. Nhiệt độ 80 ℃ cho lượng cao thô tốt nhất với khối lượng 81,551 g. Đồng thời, hợp chất fucoidan ít bị phân hủy ở nhiệt độ cao nên 80 ℃ được chọn làm nhiệt độ trích ly.

c) Ảnh hưởng của thời gian

Tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện: 1, 2, 3, 5, 8 giờ với khối lượng nguyên liệu ban đầu là 100 g. Mẫu được lọc lấy dịch và cô quay thu hồi dung môi. Các thông số giữ cố định gồm nước, nhiệt độ 80 oC, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 1:10. Số liệu về ảnh hưởng của thời gian được trình bày trong Bảng 3.27 và Hình 3.28.

Bảng 3.27. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly rong nâu

Thời gian Khối lượng cao

(giờ) rong nâu thô (g)

1 57,946

2 62,318

3 68,645

5 74,852

8 75,297

Hình 3.30. Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly rong nâu.

Kết quả từ 1-5 giờ khả năng trích ly tăng đáng kể, khối lượng thu được ở 5 giờ là 74,852 g. Ở 8 giờ thì khả năng trích ly có tăng nhưng không đáng kể so với 5 giờ. Do đó, thời gian trích ly rong nâu được chọn là 5 giờ.

d) Ảnh hưởng của thể tích dung môi

Khảo sát thể tích dung môi lần lượt là 0,2; 0,3; 0,5; 1; 1,5 L (tương ứng tỉ lệ nguyên liệu : dung môi lần lượt là 1:2; 1:3; 1:5; 1:10; 1:15 g/mL), khối

lượng nguyên liệu ban đầu là 100 g. Các thông số được giữ cố định là dung môi nước, thời gian 5 giờ, nhiệt độ 80 ℃. Số liệu khảo sát về ảnh hưởng của thể tích dung môi được trình bày trong Bảng 3.28 và Hình 3.29.

Bảng 3.28. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly rong nâu

Thể tích dung Khối lượng cao

môi (L) rong nâu thô (g)

0,2 51,662

0,3 52,745

0,5 64,128

1 75,782

1,5 75,996

Hình 3.31. Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly rong nâu.

3.3.2. Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu

a) Phân lập fucoidan

Khối lượng bột fucoidan thu được là 3g (3,0% so với khối lượng rong

nguyên liệu).

▪ Cấu trúc hợp chất fucoidan

Phổ 1H-NMR được coi như một phương pháp đặc trưng để nhận biết fucoidan dựa vào tín hiệu metyl của fucose trong mạch polysaccharide ở vị trí C6. Thông tin về đặc trưng cấu trúc của fucoidan có thể thu nhận thông qua tín hiệu đặc trưng của gốc đường fucose và galactose. Theo phổ 1H-NMR có tín hiệu của H-6 (nhóm methyl) của vòng α-L-fucopyranose tại δ 1,239 ppm. Bên cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng cho proton H-6 và H-1 của gốc β-D-galactose được xác nhận thông qua các tín hiệu ở δ 5,381 và δ 3,757 ppm. Tín hiệu ở δ 3,757 là của H-2; δ 4,135 là của H-3; δ 4,610; δ 4,665; δ 4,724 là của H-5.

Hình 3.32. Cấu trúc hợp chất phân lập từ rong nâu.

b) Quy trình tách chiết cao rong nâu chứa fucoidan

Thuyết minh quy trình: Rong nâu (20 kg) sau khi thu về được rửa sạch, loại bỏ phần hư, phơi dưới bóng râm đến khối lượng không đổi, xay nhỏ thu được 5 kg bột rong nâu khô. Chất chuẩn fucoidan (≥ 95%, số lô SLBZ7467) được cung cấp bởi Sigma Aldrich (Singapore), MeOH, ACN, nước cất đạt tiêu chuẩn dung môi HPLC được cung cấp từ Fisher Scientific Korea Ltd. Các hóa chất, dung môi khác như EtOH, acid acetic, acid sulfuric, ether dầu hỏa... được cung cấp từ hãng Chemsol (Việt Nam).

5 kg bột rong nâu được chiết với EtOH 80% theo tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và ở 70 ℃ trong 5h để loại mannitol và các chất ít phân cực, thu dung dịch, cô quay thu hồi cồn để tái sử dụng. Cao EtOH (độ ẩm 12,22%) được chiết với CaCl2 2% (ở 60 ℃) để phân lập hỗn hợp laminaran và fucoidan, khuấy hỗn hợp khoảng 45 phút tạo kết tủa. Dung dịch được chiết tiếp với 1 L nước ở 80 ℃ trong 5 giờ, thu được dịch chiết và phần cặn. Các polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm 0,5 L ethanol 99 %, giữ ở nhiệt độ lạnh trong 2 giờ, ly tâm thu tủa (5500 vòng/phút), sấy tủa ở 70 ℃ trong 2 giờ, thu được tủa (m = 265g). Thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách (12000 kDa) trong 48 giờ, đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột. Khối lượng bột fucoidan thu được là 150 g, hàm lượng fucoidan được xác định là 86%.

Bột rong nâu khô

(5 kg)

Chiết EtOH 80% (1:10), 2h, to phòng 5h, 70 ℃

Mannitol, chất ít phân cực

Cao EtOH (ẩm 12,22%)

CaCl2 2%, 60oC, khuấy 45’, lọc

Cô quay loại dung môi ở 60oC

Tủa laminaran, alginate

Dịch fucoidan

Chiết 1L H2O, 80 oC, 5h

Cao H2O

Cặn

Kết tủa bằng EtOH abs, ly tâm (5500v/p)

Dung dịch

Tủa sau ly tâm

Sấy 70oC, 2h

Dung dịch

Tủa (m = 265 g)

HPLC

Fucoidan (m = 150 g)

Fucoidan hàm lượng 86%

Thẩm tách, 48h, đông khô

Xác định cấu trúc (NMR)

Hình 3.33. Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu.

3.3.3. Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC

Bảng 3.29. Kết quả định lượng fucoidan bằng HPLC

TT Tên mẫu

Thời gian lưu (Rt) Khối lượng phân tử (Da) Phân bố khối lượng phân tử (Da) Hàm lượng (%) Định lượng fucoidan (mg/g)

1 5,321 658460,31 741,772 74,2% 114732,27 – 4574567,08

2 5,348 620866,75 836,173 83,6% 83716,30 – 3289209,99

3 5,259 717988,02 858,228 85,8% 110142,67 – 3488372,07 Nguyên liệu fucoidan Fucoidan thị trường Sản phẩm fucoidan chiết tách

(a) (b)

Hình 3.34. Sắc ký đồ mẫu fucoidan chuẩn (a), mẫu nguyên liệu (b), mẫu sản phẩm thị trường (c), mẫu sản phẩm chiết (d).

3.3.4. Định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis

Bảng 3.30. Kết quả định lượng fucoidan bằng UV-Vis

49,726

STT 1 2 Tên mẫu Fucoidan chuẩn F3MT fucoidan 50 ppm Nồng độ (ppm) 49,726 45,526 45,526 Độ hấp thu 0,434 0,397 × 0,95 = 86,98 % Hàm lượng fucoidan (%) =

3.3.5. Thẩm định quy trình định lượng fucoidan bằng UV-Vis

▪ Tính tương thích hệ thống

Tiến hành đo dung dịch fucoidan chuẩn 50 ppm 6 lần, ghi lại độ hấp thu và

phổ đồ. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.31.

Bảng 3.31. Tính tương thích hệ thống fucoidan bằng phương pháp UV-Vis

Nồng độ lý thuyết (ppm) Độ hấp thu

50 ppm

Trung bình % RSD 0,422 0,422 0,423 0,423 0,423 0,423 0,423 0,112

Kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tương đối %RSD của độ hấp thu trong 6 phép thử là 0,112% ≤ 2%, chứng tỏ hệ thống phù hợp và đảm bảo sự ổn định cho các phân tích định lượng fucoidan.

▪ Độ đặc hiệu

Đo độ hấp thụ lần lượt mẫu trắng, mẫu fucoidan chuẩn 50 ppm và mẫu

fucoidan thử 50 ppm (Bảng 3.32).

Bảng 3.32. Độ đặc hiệu của fucoidan dùng phương pháp UV-Vis

Nồng độ lý thuyết Độ hấp thu

0 Mẫu Trắng

50 ppm Mẫu chuẩn

50 ppm Mẫu thử 0,001 0,427 0,434 0,404 0,409

Kết quả: Mẫu trắng không hấp thu ở bước sóng 399,5 nm, mẫu thử cho độ hấp thu ở bước sóng 399,5 nm và có độ hấp thu gần với với độ hấp thu của mẫu chuẩn. Từ các phổ đồ cho thấy phương pháp đặc hiệu đối với fucoidan.

Hình 3.35. Phổ đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử fucoidan 50 ppm.

▪ Khoảng tuyến tính

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được trình bày ở Bảng 3.33. Đồ thị

biểu diễn sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của fucoidan ở Hình 3.34.

Bảng 3.33. Khoảng tuyến tính của fucoidan sử dụng phương pháp UV-Vis

Nồng độ (ppm) Độ hấp thu Trung bình

10 0,087

20 0,180

50 0,426

100 0,868

200 1,768

0,089 0,087 0,085 0,182 0,179 0,18 0,432 0,424 0,421 0,859 0,873 0,872 1,765 1,77 1,769 Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Hình 3.36. Đồ thị đường chuẩn fucoidan bằng phương pháp UV-Vis.

Kết quả: Trong khoảng nồng độ khảo sát có mối liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thu và nồng độ chất phân tích. Phương trình hồi quy tuyến tính của fucoidan là y = 0,00884x - 0,00584 với hệ số tương quan R2 = 0,9998. Như vậy, phương pháp tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 10 đến 200 ppm.

▪ Độ lặp lại

Độ lặp lại được thực hiện bằng cách đo 6 mẫu thử fucoidan nồng độ 50

ppm. Ghi lại độ hấp thu và nồng độ thực tế (Bảng 3.34).

Bảng 3.34. Độ lặp lại của quy trình định lượng fucoidan bằng UV-Vis

Nồng độ lý thuyết

50 ppm

Trung bình %RSD Độ hấp thu 0,406 0,402 0,399 0,400 0,401 0,401 0,402 Nồng độ thực tế (ppm) 46,607 46,151 45,821 45,896 45,999 46,041 46,086 0,554

Kết quả: Độ lặp lại đạt yêu cầu vì %RSD của nồng độ thực tế là 0,554% (≤ 2%). Dao động giữa các kết quả thử nghiệm có độ lặp lại cao. Phương pháp phân tích ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống và sai số ngẫu nhiên.

▪ Độ đúng

Bảng 3.35. Độ đúng của phương pháp định lượng fucoidan bằng UV-Vis

Mẫu %RSD Hiệu suất thu hồi (%) % thêm vào Độ hấp thu Nồng độ thực tế (ppm) Trung bình (%) Nồng độ lý thuyết (ppm)

1 80% 36,8 98,81 0,169

2 100% 45 99,22 0,504

3 120% 54 98,63 0,584

0,757 0,758 0,758 0,828 0,831 0,833 0,911 0,909 0,908 36,28 36,38 36,43 44,36 44,68 44,91 53,75 53,53 53,42 98,59 98,86 98,99 98,58 99,29 99,80 99,54 98,87 98,93

Trung bình 98,97 0,419

Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp được trình bày ở Bảng 3.35 cho thấy phương pháp đạt độ đúng trong khoảng khảo sát với khả năng tìm lại là 98,97% và %RSD = 0,419.

▪ Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ)

𝑢𝑔 𝐿𝑂𝐷 = = = 18,8 ( ) 𝑚𝐿⁄ 3,3 × 𝑆𝐷 𝑎 3,3 × 0,0005 0,00884

𝑢𝑔 𝐿𝑂𝑄 = = = 56,8 ( ) 𝑚𝐿⁄ 10 × 𝑆𝐷 𝑎 10 × 0,0005 0,00884

Vậy phương pháp đạt giới hạn phát hiện (LOD) là 18,8 𝜇g/mL và giới hạn

định lượng (LOQ) là 56,8 𝜇g/mL.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ đã hoàn thành các nội dung sau :

- Khảo sát được điều kiện tách chiết ban đầu của các hợp chất với các thông

số như sau :

▪ Hợp chất [6]-shogaol được chiết trong EtOH 90%, nhiệt độ chiết 60

℃ trong 3 giờ với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:5 (g/mL).

▪ Hợp chất apigenin được chiết trong EtOH 80%, nhiệt độ chiết 40 ℃

trong 5 giờ với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:10 (g/mL).

▪ Hợp chất fucoidan được chiết trong H2O, nhiệt độ chiết 80 ℃ trong 5

giờ với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:10 (g/mL).

- Xây dựng quy trình chiết xuất cao chứa 18% [6]-shogaol từ củ gừng, cao

chứa 90% apigenin từ cần tây, cao chứa 86% fucoidan từ rong nâu.

- Xây dựng quy trình định lượng [6]-shogaol, apigenin bằng phương pháp HPLC, định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis với đầy đủ các thông số và thẩm định quy trình với các thông số đạt được như sau :

▪ Hợp chất [6]-shogaol được thẩm định với tính tương thích hệ thống đạt %RSD = 0,329% ; quy trình đạt độ đặc hiệu cao; độ lặp lại đạt %RSD của nồng độ = 1,29% ; phương trình hồi quy tuyến tính y = 166129,76x + 22743,83 (R2 = 0,9997); độ đúng đạt yêu cầu với giá trị trung bình là 99,3%; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,42 ppm và 1,26 ppm.

▪ Hợp chất apigenin được thẩm định với tính tương thích hệ thống đạt %RSD = 0,243% ; quy trình đạt độ đặc hiệu cao; độ lặp lại đạt %RSD của nồng độ = 1,75% ; phương trình hồi quy tuyến tính y = 157454x + 20975 (R2 = 0,9994); độ đúng đạt yêu cầu với giá trị trung bình là 99,97%; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,09 ppm và 0,28 ppm.

▪ Hợp chất fucoidan được thẩm định với tính tương thích hệ thống đạt %RSD = 0,112% ; quy trình đạt độ đặc hiệu cao; độ lặp lại đạt

%RSD của nồng độ = 0,55% ; phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,00884x - 0,00584 (R2 = 0,9998); độ đúng đạt yêu cầu với giá trị trung bình là 98,97%; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 18,8 ppm và 56,8 ppm.

4.2. KIẾN NGHỊ

Đề tài đã góp phần vào việc xây dựng các chỉ tiêu cho các chuyên luận về dược

liệu của [6]-shogaol, apigenin và fucoidan trong lĩnh vực y dược học. Tuy nhiên,

để đưa nghiên cứu này vào cuộc sống, đề tài cần được nghiên cứu sâu hơn như:

- Khảo sát điều kiện chiết tách bằng các phần mềm tối ưu hóa hiện đại.

- Xây dựng bộ tiêu chuẩn cơ sở nhằm kiểm tra chất lượng chế phẩm.

- Thực hiện thẩm định bộ tiêu chuẩn cơ sở để minh chứng độ tin cậy của các phương pháp thử, thông qua đó tiêu chuẩn cơ sở đạt tiêu chuẩn pháp lý khi ban hành.

- Thực hiện thêm giai đoạn thử hoạt tính sinh học trên các thử nghiệm in vitro và in vivo với cao chứa [6]-shogaol chiết xuất từ củ gừng, apigenin từ cần tây, fucoidan từ rong nâu để minh chứng cụ thể về tác dụng chữa bệnh của sản phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Quốc Bình, 2005, Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Họ Gừng

(Zingiberaceae), Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr.506.

2. Nguyễn Năng Vinh, Nguyễn Thị Minh Tú, 2009, Công nghệ chất thơm thiên

nhiên, Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội.

3. Nguyễn Quốc Bình, 2009, Hình thái của họ Gừng (Zingiberaceae Lindl) ở Việt Nam và các đặc điểm nhận biết nhanh ngoài thiên nhiên, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 3, Viện ST&TNSV-Viện KH&CN Việt Nam.

4. Bộ Y tế, 2018, Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học.

5. Nguyễn Quốc Bình, 2011, Nghiên cứu phân loại họ Gừng - Zingiberaceae Lindl. ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện KH&CN, Hà Nội.

6. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất

bản ĐH Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

7. Alexander J.M., Nirmala M.R., 1984, Volatile aroma constiments of srilankan

ginger, Phytochemistry, 23, 353-359.

8. Chen C. C., 1986, Chromatographic analyses of Gingerol compound in ginger extracted by liquid carbon dioxide, Journal of Chromatography, 360-363.

9. Govindarajan V.S., 1982, Ginger-chemistry, technology, and quality evaluation: part 1, 2, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 17(1), 1- 96, 17(3), 189-258.

10. Richard H., Multon J.L., 1992, Collection sciences et techniques Argo –

alimentaires, Tech et DOC lavoisies, Paris.

11. Belitz G., 1999, Food Chem., Second edition, Springer – Verlag Berlin

Heidenberg, 905-913.

12. Nguyễn Minh Tuyển, 2005, Quy hoạch thực nghiệm, Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật, Hà Nội.

13. Chae K.A., Yuong C.L., Cho A.Y., 2000, Antioxidant and mixture effects of curry spices extracts obtained by solvent extraction, Korean Journal of Food Science and Technology, 32(3), 491-499.

14. Vũ Ngọc Lộ, Đỗ Chung Võ, Nguyễn Mạnh Pha, Lê Thúy Hạnh, Những cây tinh dầu quý ở Việt Nam: Khai thác, chế biến, ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, 1998.

15. Debbarma J., Kishore P., Nayak B.B., Kannuchamy N., Gudipati V., 2013, Antibacterial activity of ginger, eucalyptus and sweet orange peel essential oils on fish-borne bacteria, Journal of Food Processing and Preservation, 37, 1022-1030.

16. Babarinde S.A., Sunnie-Ododo M.O., Akanbi W.B., Oyegoke O.O., Tijani R., Olaobaju S.F., 2014, Comparative susceptibility of two developmental stages of hide beetle (Dermestes maculatus Degeer, 1774) to ginger (Zingiber officinale Roscoe) essential oil, Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences.

17. Ortiz M., 2015, Antimicrobial activity of onion and ginger against two foodborne pathogens Escherichia coli and Staphylococcus aureus, MOJ Food Processing and Technology.

18. Prasad M.M., Seenayya G., 2000, Effect of spices on the growth of red halophilic cocci isolated from salt cured fish and solar salt, Food Research International, 33, 793-798.

19. Riazi S., Matthews K.R., 2011, Failure of foodborne pathogens to develop resistance to sanitizers following repeated exposure to common sanitizers, International Biodeterioration & Biodegradation, 65, 374–378.

20. Tajkarimi M.M., Ibrahim S.A., Cliver D.O., 2010, Antimicrobial herb and

spice compounds in food, Food Control, 21, 1199–1218.

21. Shukla Y., Singh M., Cancer preventive properties of ginger: A brief review,

Food Chem. Toxicol., 45, 683–690.

22. Abdul A.B.H., Al-Zubairi A.S., Tailan N.D., Wahab S.I.A., Zain Z.N.M., Ruslay S. and Syam M.M., 2008, Anticancer activity of natural compound

(zerumbone) extracted from Zingiberzerumbet in human He La cervical cancer cells, International Journal of Pharmaceutics, 4(3), 160-168.

23. Andrew P. Jarvis, David Morgan E., 1997, Isolation of plant products by

supercritical fluid extraction, Phytochemical Analysis, 8, 217-222.

24. Chen CY, Liu TZ, Liu YW, Tseng WC, Liu RH, Lu FJ et al., 2007, [6]-shogaol (alkanone from ginger) induces apoptotic cell death of human hepatoma p53 mutant Mahlavu subline via an oxydative stress-mediated Caspase-dependent mechanism, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 948–954.

25. Nazim UM, Park SY, 2019, Attenuation of autophagy flux by 6- shogaolsensitizes human liver cancer cells to TRAIL-induced apoptosis via p53 and ROS, International Journal of Molecular Medicine, 43(2), 701-708.

26. Yarnell E., 2002, Botanical medicines for the urinary tract, World Journal of

Urology, 20(5), 285-93.

26. Atta A., 1998, Anti-nociceptive and antiinflammatory effects of some Jordanian medicinal plant extracts, Journal of Ethnopharmacology, 60(2), 117-24.

27. Kooti W., Mansori E., Ghasemiboroon M. Harizi M., Amirzargar A., 2014, Protective effects of celery (Apium graveolens) on testis and cauda epididymal spermatozoa in rat, Iran J. Reprod Med, 12 (5) 365-366.

28. Zidorn C., Johrer K., Ganzera M., Schubert B., Sigmund EM., Mader J. et al, 2005, Polyacetylenes from the apiaceae vegetables carrot, celery, fennel, parsley, and parsnip and their cytotoxic activities, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(7), 2518-23.

29. Bilan M.I., Grachev A.A., Shashkov A.S, Thuy T.T.T, Van T.T.T, Ly B.M, Nifantiev N.E, Usov A.I., 2013, Preliminary investigation of a highly sulfated galactofucan fraction isolated from the brown alga Sargassum polycystum, Carbohydrate Research, 37(7), 48-57.

30. Ermertcan AT., Ozturkcan S., Sahin MT., Bilac C., Bilac DB., 2007, Acute irritant contact dermatitis due to “Apium graveolens”, Contact Dermatitis, 57(2), 122-3.

31. Kooti W., Mansori E., Ghasemiboroon M., Harizi M., Amirzargar A., 2014, Protective effects of celery (Apium graveolens) on testis and cauda epididymal spermatozoa in rat, Iranian Journal of Reproductive Medicine, 12(5), 365-366.

32. Birt DF., Walker B., Tibbels MG., Bresnick E., 1986, Anti-mutagenesis and anti-promotion by apigenin, robinetin and indole-3-carbinol, Carcinogenesis, 7, 959–963.

33. Xiaohui Yan, Miao Qi, Pengfei Li, Yihong Zhan, and Huanjie Shao, 2017, Apigenin in cancer therapy: anti-cancer effects and mechanisms of action, Cell Biosci.

34. Cardenas H, Arango D, Nicholas C, Duarte S, Nuovo GJ, He W, Voss OH, Gonzalez-Mejia ME, Guttridge DC, Grotewold E, Doseff AI, 2016, Dietary Apigenin exerts immune-regulatory activity In Vivo by reducing NF-kappaB activity, halting leukocyte infiltration and restoring normal metabolic function, International Journal of Molecular Sciences.

35. Lee YM, Lee G, Oh TI, Kim BM, Shim DW, Lee KH, Kim YJ, Lim BO, Lim JH, 2016, Inhibition of glutamine utilization sensitizes lung cancer cells to Apigenin-induced apoptosis resulting from metabolic and oxydative stress, International Journal of Oncology, 48, 399–408.

36. Lee Y, Sung B, Kang YJ, Kim DH, Jang JY, Hwang SY, Kim M, Lim HS, Yoon JH, Chung HY, Kim ND, 2014, Apigenin-induced apoptosis is enhanced by inhibition of autophagy formation in hCT116 human colon cancer cells, International Journal of Oncology, 44, 1599–1606.

37. Huang C, Wei YX, Shen MC, Tu YH, Wang CC, Huang HC, Chrysin, 2016, Abundant in Morinda citrifolia fruit water-EtOAc extracts, combined with Apigenin synergistically induced apoptosis and inhibited migration in human breast and liver cancer cells, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 64, 4235–4245.

38. Li B., Lu F., Wei X., Zhao R., 2008, Fucoidan: Structure and Bioactivity,

Molecules, 13, 1671-1695.

39. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., 1999, A study of fucoidan from the

brown seaweed Chorda filum, Carbohydrate Research, 320, 108-119.

40. Li B., Xin J.W., Sun J.L., Xu S.Y., 2006, Structural investigation of a fucoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed Hizikia fusiforme, Carbohydrate Research, 34(1), 1135-1146.

41. Bùi Minh Lý, 2006, Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất fucoidan quy mô pilot từ một số loài rong nâu Việt Nam, Đề tài Nghiên cứu KH&CN cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

42. Nguyễn Duy Nhứt, 2008, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa, Luận án tiến sỹ Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.

43. Thuy Thi Thanh Thu, Van Thi Thanh Tran, Yoshiaki Yuguchi, Ly Minh Bui and Tai Tien Nguyen, 2013, Structure of fucoidan from brown seaweed Turbinaria ornata as Studied by Electrospray ionization Mass spectrometry (MSIMS) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) Techniques, Marine Drugs, 11, 2431-2443.

44. Nishino T., Nishioka C., Ura H. and Nagumo T., 1994, Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan, Carbohydrate Research, 25(5), 213- 224.

45. Chandia N.P., Matsuhiro B., 2008, Characterization of a fucoidan from Lessonia vadosa (Phaeophyta) and its anticoagulant and elicitor properties, International Journal of Biological Macromolecules, 42, 235-240.

46. Li B., Rui X.Z., Xin J.W., 2008, Anticoagulant activity of fucoidan from

Hizikia fusiforme, AgroFOOD Industry Hi-tech, 19, 22-24.

47. Nishino T., Nagumo T., Kiyohara H. and Yamada H., 1991, Structural characterization of a new anticoagulant fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome, Carbohydrate Research, 211(1), 77-90.

48. Nishino T., Nagumo T., 1992, Anticoagulant and antithrombin activities of

oversulfated fucans, Carbohydrate Research, 229, 355-362.

49. Qiu X.D., Amarasekara A., Doctor V., 2006, Effect of oversulfateion on the chemical and biological properties of fucoidan, Carbohydrate Polymers, 224- 228.

50. Chevolot L., Foucault A., Chauber F., 1999, Further data on the structure of relationships with anticoagulant activitity, seaweed fucans:

brown Carbohydrate Research, 319, 154-165.

51. Chevolot L., Mulloy B., Racqueline J. A., 2001, Disaccharide repeat unit is the structure structure in fucoidans from two species of brown algae, Carbohydrate Research, 330, 529-535.

52. Duarate M., Cardoso M., Noseda M., 2001, Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum, Carbohydrate Research, 333, 281-293.

53. Silva T.M.A., Alves L.G., Queiroz K.C.S., Santos M.G.L., Marques C.T., Chavante S.F., Rocha H.A.O., Leite E.L, 2005, Partial characterization and anticoagulant activity of a heterofucan from the brown seaweed Padina gymnospora, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 38, 523- 533.

54. Yoon S.J., Pyun Y.R., Hwang J.K., Mourão P.A.S., 2007, A sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II dependent anticoagulant activity, Carbohydrate Research, 342, 2326-2330.

55. Cheng Z.L., Wang S., 2003, Study on anticoagulant activities in vitro of fucoidan and fucoidan/collagen blends, Reactive and Functional Polymers, 16, 557-560.

56. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E., D'Incecco A., Piccoli A., Totani L., Tinari N., Morozevich G.E., Berman A.E., Bilan M.I., Usov A.I., Nadezhda E., Grachev A.A., Sanderson C.J., Kelly M., Rabinovich G.A., Iacobelli S., 2007, A comparative study of the antiinflammatory, anticoagulant,

antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds, Glycobiology, 17, pp. 541- 552.

57. Haneji K., Matsuda T., Tomita M., Kawakami H., Ohshiro K., Uchihara J., Masuda M., Takasu N., Tanaka Y., Ohta T., Mori N., 2005, Fucoidan extracted from Cladosiphon okamuranus Tokida induces apoptosis of human T-Cell leukemia virus type 1-infected T-Cell lines and primary adult T-Cell leukemia cells., Nutrition and Cancer, 52, 189-201.

58. Maruyamaa H., Tamauchib H., Iizuka M., Nakano T., 2006, The role of NK cells in antitumor activity of dietary fucoidan from Undaria pinnatifida Sporophylls (Mekabu), Planta Medica, 72, 1415-1417.

59. Yang X.L., Sun J.Y., Xu H.N., 1995, An experimental study on immunoregulatory effect of fucoidan, Chinese Journal of Marine Drugs, 9-13.

60. Bilan M.I, Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., 2002, Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens, Carbohydrate Research, 337, 719- 730.

61. Lee H., Kim JS, Kim E, 2012, Fucoidan from seaweed Fucus vesiculosus inhibits migration and invasion of human lung cancer cell via PI3K-Akt-mTOR pathways, PloS ONE.

62. Alwarsamy M, Gooneratne R, Ravichandran R, 2016, Effect of Fucoidan from Turbinaria conoides on human lung adenocarcinoma epithelial (A549) cells, Carbohydrate Polymer, 152, 207–213.

PHỤ LỤC

PHỔ NMR CỦA HỢP CHẤT [6]-SHOGAOL

Phụ lục 1.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.3: Phổ 1H-NMR của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.4: Phổ 13C-NMR của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.5: Phổ 13C-NMR của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.7: Phổ COSY của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.8: Phổ COSY của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.9: Phổ COSY của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.10: Phổ COSY của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.11: Phổ DEPT của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.12: Phổ DEPT của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.13: Phổ HMBC của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.14: Phổ HMBC của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.15: Phổ HMBC của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.16: Phổ HMBC của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.17: Phổ HMBC của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.18: Phổ HSQC của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.19: Phổ HSQC của hợp chất [6]-shogaol.

Phụ lục 1.20: Phổ HSQC của hợp chất [6]-shogaol.

PHỔ NMR CỦA HỢP CHẤT FUCOIDAN

100

Phụ lục 1.21: Phổ 1H-NMR của hợp chất fucoidan.

Phụ lục 1.22: Phổ 1H-NMR của hợp chất fucoidan.

101

PHỔ NMR CỦA HỢP CHẤT APIGENIN

Phụ lục 1.23: Phổ 1H-NMR của hợp chất apigenin.

Phụ lục 1.24: Phổ 1H-NMR của hợp chất apigenin.

102

Phụ lục 1.25: Phổ 13C-NMR của hợp chất apigenin.

Phụ lục 1.26: Phổ 13C-NMR của hợp chất apigenin.

103

Phụ lục 1.27: Phổ HSQC của hợp chất apigenin.

Phụ lục 1.28: Phổ HSQC của hợp chất apigenin.

104

Phụ lục 1.29: Phổ HSQC của hợp chất apigenin.

Phụ lục 1.30: Phổ HMBC của hợp chất apigenin.

105

ĐỊNH LƯỢNG 6-SHOGAOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO (HPLC)

Phụ lục 1.35: Sắc ký đồ mẫu 6-shogaol chuẩn.

106

Phụ lục 1.36: Sắc ký đồ mẫu cao gừng nguyên liệu.

107

Phụ lục 1.37: Sắc ký đồ mẫu cao gừng EtOH.

108

Phụ lục 1.38: Sắc ký đồ mẫu cao gừng ether dầu hỏa – EtOAc

109

ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU

Time Area

Plates(Tangent)

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Apigenin

9.482 842,890.4 100.00 33,611.2

1.187

2,591

3,548

Apigenin

9.504

Total

842,890.4 100.00

Time Area

Area % Height

Component Name

Resolution Tailing Factor

Plates (Tangent)

Plates (Foley- Dorsey)

Apigenin

9.454

844,908.7 100.00 33,847.3

1.210

2,606

3,496

Total

844,908.7 100.00

NĂNG CAO (HPLC)

Phụ lục 1.39: Sắc ký đồ apigenin chuẩn 5 ppm.

110

Phụ lục 1.40: Sắc ký đồ định lượng apigenin trong cao nguyên liệu.

111

Phụ lục 1.41: Sắc ký đồ định lượng apigenin trong cao EtOH.

112

Time Area

Plates(Tangent)

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Apigenin

9.167 841,368.4 100.00 29,404.4

2.102

906

2,664

Total

841,368.4 100.00

Time Area

Plates(Tangent)

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Apigenin

9.124 850,886.1 100.00 30,389.8

1.494

977

3,512

Total

850,886.1 100.00

Phụ lục 1.42: Sắc ký đồ định lượng apigenin trong cao EtOH-H2O.

113

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN BẰNG HPLC

Time

Area

Height Resolution

Component Name

Area %

Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.444 804,853.5 100.00 30,113.1

1.413

1,586

2,865

Total

804,853.5 100.00

Time

Component Name

Area Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.470 799,668.2 100.00 29,766.2

1.409

1,583

2,814

Total

799,668.2 100.00

Time

Component Name

Area Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.424 802,236.7 100.00 29,468.0

1.430

1,562

2,645

Total

802,236.7 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.420 810,305.9 100.00 29,454.3

1.410

1,510

2,602

Total

810,305.9 100.00

Tính tương thích hệ thống

Phụ lục 1.43: Số liệu thẩm định tính tương thích hệ thống apigenin.

114

Độ đặc hiệu

Phụ lục 1.44: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu mẫu apigenin chuẩn.

115

Phụ lục 1.45: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu apigenin mẫu trắng.

Phụ lục 1.46: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu apigenin mẫu thử.

116

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.405 168,768.3 100.00 6,048.8

1.569

1,422

2,533

Total

168,768.3 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.367 338,734.1 100.00 12,760.9

1.619

1,418

2,667

Total

338,734.1 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.368 668,489.5 100.00 25,400.7

1.623

1,456

2,781

Total

668,489.5 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.416 958,543.0 100.00 35,287.2

1.582

1,336

2,729

Total

958,543.0 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Khoảng tuyến tính

117

Apigenin

9.387 1,294,758.7 100.00 46,916.7

1.594

1,300

2,546

Total

1,294,758.7 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

Apigenin

9.313 1,581,320.1 100.00 60,445.5

1.725

1,360

2,855

Total

1,581,320.1 100.00

Phụ lục 1.47: SKĐ khoảng tuyến tính apigenin ở các nồng độ 1,2,4,6,8,10 ppm.

Độ đúng

Phụ lục 1.48: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 1 80%.

118

Phụ lục 1.49: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 1 100%.

Phụ lục 1.50: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 1 120%.

119

Phụ lục 1.51: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 2 80%.

Phụ lục 1.52: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 2 100%.

120

Phụ lục 1.53: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 2 120%.

Phụ lục 1.54: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 3 80%.

121

Phụ lục 1.55: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 3 100%.

Phụ lục 1.56: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng apigenin mẫu 3 120%.

122

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL BẰNG HPLC

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

1.482 387.3

0.03

156.2

0.985

10,036

399

2.157 11,658.6

0.94

2,186.6

3.26

0.942

2,150

5,495

2.403 15,057.4

1.22

2,183.0

1.83

0.878

4,774

3,961

3.013 140.8

0.01

187.0

7.08

1.321

286,701

376,907

6-shogaol

4.197 1,207,002.9 97.45

129,022.6 8.69

0.998

4,849

4,413

4.855 4,382.5

0.35

689.3

2.77

1.068

12,359

7,602

Total

1,238,629.5 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

1.210 143.4

0.01

164.0

1.168

28,143

36,867

2.148 11,062.4

0.82

1,762.5

11.25

0.897

2,001

3,673

2.397 14,335.6

1.06

1,795.0

1.59

0.889

4,512

3,172

3.838 3,141.0

0.23

548.3

8.44

8,058

6-shogaol

4.200 1,321,655.4 97.48

135,903.4 1.66

1.014

4,524

4,044

4.870 5,192.9

0.38

792.7

1.039

12,052

10,618

2.96

5.514 254.0

0.02

203.0

3.077

90,904

1,199,746

6.15

Total

1,355,784.9 100.00

Time

Area

Area %

Height

Resolution

Component Name

Tailing Factor

Plates (Tangent)

2.145

9,735.9

0.68

1,847.4

0.967

4,112

Plates (Foley- Dorsey) 2,781

2.450

52,511.9

3.68

3,421.5

1.11

1.324

662

559

3.843

3,191.1

0.22

544.0

4.70

7,476

6-shogaol

4.197

1,353,625.2

94.97

138,167.3

1.60

1.027

4,382

4,001

4.859

6,269.1

0.44

897.8

2.73

1.024

10,680

7,852

Total

1,425,333.1

100.00

Time

Area

Area %

Height

Resolution

Component Name

Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.148

9,317.3

0.65

1,764.9

1.078

2,590

5,511

2.414

54,668.9

3.81

3,442.3

0.98

1.816

421

515

3.849

3,427.5

0.24

556.7

4.20

3,571

6-shogaol

4.192

1,361,703.8 94.86

141,623.2 1.32

1.004

4,621

4,132

Tính tương thích hệ thống

123

4.842

5,877.0

844.0

3.24

1.019

11,390

19,136

0.41

9.706

419.0

246.3

55.92

1.548

326,051

1,308,725

0.03

Total

1,435,413.4 100.00

Time

Area

Area %

Height

Resolution

Component Name

Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.142

9,459.1

1,579.3

1.024

1,712

4,129

0.77

2.380

6,830.5

1,070.3

1.87

0.758

11,220

6,245

0.55

3.834

2,227.1

403.4

13.01

22,121

0.18

6-shogaol 4.197

1,212,083.3 98.18

134,227.7 2.10

0.986

5,207

4,798

4.852

3,964.8

0.32

684.9

3.23

1.158

14,011

14,162

Total

1,234,564.8 100.00

Time

Area

Area %

Height

Resolution

Component Name

Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.146

7,604.5

0.58

1,518.6

0.941

3,861

6,593

2.450

50,603.3

3.83

3,144.4

1.04

1.182

731

417

3.820

3,155.0

0.24

546.2

4.00

5,491

6-shogaol 4.182

1,259,268.4 95.32

132,612.4 1.56

1.000

4,702

4,253

6.566

401.9

0.03

251.3

16.65

1.848

256,676

782,598

Total

1,321,033.3 100.00

Phụ lục 1.57: Số liệu thẩm định tính tương thích hệ thống [6]-shogaol.

124

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.146 11,861.2

0.82

1,810.6

0.884

1,910

3,497

2.383 49,386.4

3.41

3,885.3

0.74

1.922

577

375

3.587 2,353.6

0.16

546.9

3.58

0.791

19,666

6,309

6-shogaol 4.185 1,376,965.2 95.00

150,245.1 2.82

0.969

5,203

4,712

4.833 8,919.1

0.62

1,305.9

2.78

0.823

14,233

7,607

Total

1,449,485.5 100.00

Độ đặc hiệu

Phụ lục 1.58: SKĐ thẩm định độ đặc hiệu [6]-shogaol mẫu chuẩn 10 ppm lần 1.

125

Time

Area

Area %

Component Name

Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.110

972.0

379.7

0.710

18,436

0.03

13,411

2.345

42,431.2

3,498.9

0.81

1.33

342

2.612

8,274.7

1,514.6

0.26

3.469

1,970.4

338.3

0.762

14,112

0.06

5,427

6-shogaol

4.172

3,102,498.7 97.50

330,374.6 3.17

1.029

4,657

4,256

4.820

25,415.1

3,373.9

2.79

0.969

9,577

0.80

8,568

8.775

169.6

140.7

30.70

2.281

496,254

506,335

0.01

9.746

234.9

156.7

16.77

0.738

1,154,253

343,106

0.01

Total

3,181,966.5 100.00

Phụ lục 1.59: SKĐ thẩm định độ đặc hiệu [6]-shogaol mẫu chuẩn 10 ppm lần 2.

126

Time

Area

Component Name

Area %

Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

1.710 314.8

0.02

229.1

1.816

12,570

32,443

2.019 685.8

0.05

197.4

6.43

19,413

2.194 33,559.5

2.26

7,038.4

2.22

0.895

3,914

7,646

2.431 23,455.0

1.58

4,024.1

2.483 7,181.5

0.48

2,202.5

2.911 12,031.4

0.81

1,379.9

0.960

2,456

2,232

3.111 248.4

0.02

174.0

1.44

2.691

19,909

151,168

3.609 9,555.4

0.64

732.3

6-shogaol 4.082 1,386,073.6 93.17 132,131.5

0.950

3,686

3,499

5.140 14,387.3

0.97

1,019.3

3.97

0.702

11,240

6,418

5.621 132.9

0.01

153.4

3.44

1.998

544,689

935,558

Total

1,487,625.7 100.00

Phụ lục 1.60: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu [6]-shogaol mẫu thử 10 ppm lần

127

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

0.821

2,073

3,227

1.713

2,005.4

0.11

444.0

2.136

7,207.2

0.41

3,364.5

2.193

28,083.0

1.58

7,128.5

7,965

2.458

75,519.1

4.26

10,281.2

2.506

68,770.1

3.88

10,436.5

2.913

17,243.5

0.97

1,800.5

1,422

3.713

7,047.4

0.40

817.2

6-shogaol 4.109

1,539,096.0 86.81

141,068.8

3,508

0.955

3,296

1.55

5.330

27,445.8

1,149.5

3.45

5,483

0.681

2,561

0.01

8.228

204.9

150.2

12.50

574,399

603,815

1.411

0.02

9.800

390.7

178.7

2,985,314

3.946

Total

1,773,013.0 100.00

Phụ lục 1.61: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu 6-shogaol mẫu thử 10 ppm lần 2.

128

Component Name

Time Area Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

Total

Phụ lục 1.62: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu [6]-shogaol mẫu trắng.

129

Time

Area

Component Name

Area %

Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

0.243

4,614.0

0.79

981.4

0.904

0.516

21,078.1 3.60

2,695.4 1.37

1.720

2.111

1,243.0

0.21

553.8

8.33

0.716

27,455

5,740

2.367

20,311.4 3.47

3,110.9

2.458

18,010.8 3.08

2,469.9

3.179

5,487.2

0.94

872.9

1.270

6,696

5,545

3.653

14,827.9 2.53

1,487.1 1.97

2,229

3.895

9,016.6

1.54

1,030.2 0.68

1,487

6-shogaol

4.211

436,624.8 74.60 44,413.8 0.94

1.018

4,381

3,944

4.872

24,034.9 4.11

3,059.4 2.73

0.957

9,041

8,127

6.543

29,677.4 5.07

2,123.9 5.07

1.114

5,298

3,491

7.541

356.6

0.06

183.8

3.89

2.024

138,936

188,977

Độ lặp lại

130

Total

585,282.5 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.103

1,499.2

0.24

684.3

28,335

15,091

0.775

2.360

16,956.0

2.70

2,341.8

2.02

1.232

2,876

2,564

3.191

11,584.8

1.84

1,409.3

3.80

0.718

4,666

2,599

3.605

2,503.1

0.40

316.8

2.20

19,669

13,187

0.652

3.882

4,938.9

0.79

712.4

1.64

5,322

6-shogaol 4.184

531,596.0 84.61

54,891.8 1.26

1.024

4,448

3,948

4.842

14,104.2

2.24

1,838.9

2.67

0.963

8,631

7,365

5.470

2,766.1

0.44

411.4

2.09

0.976

18,198

3,417

6.467

42,353.6

6.74

2,827.9

2.43

1.068

4,137

3,353

Total

628,302.1 100.00

Time

Area

Area % Height Resolution

Component Name

Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

2.109

1,188.8

0.25

541.7

0.698

30,257

367

2.380

46,083.5

9.83

3,312.7

0.61

1.911

519

450

3.176

1,125.0

0.24

286.0

2.84

0.682

19,219

12,994

3.577

1,278.4

0.27

363.6

3.13

0.774

25,390

9,747

3.866

3,205.3

0.68

416.1

1.49

4,038

6-shogaol

4.182

387,575.8 82.66

39,751.0 1.23

1.039

4,332

3,875

4.843

23,128.6

4.93

2,782.5

2.62

1.077

8,408

6,781

5.618

301.0

0.06

154.3

5.05

4.841

62,288

98,718

6.467

4,995.0

1.07

584.9

6.21

0.668

20,382

16,433

Total

468,881.3 100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

2.111 1,373.6

0.30

664.2

0.749

29,386

41,026

2.361 7,959.8

1.74

1,615.6

3.26

0.864

11,137

7,179

3.185 8,911.4

1.94

1,092.6

4.31

0.796

5,165

2,215

3.597 2,371.8

0.52

391.4

1.56

0.672

19,963

3,105

6-shogaol

4.167 413,961.4

90.25

43,024.4 2.18

1.037

4,448

3,966

4.828 19,329.5

4.21

2,245.7

2.73

1.093

6,024

7,727

6.423 4,765.4

1.04

606.0

7.00

0.694

23,943

11,839

131

Total

458,672.9

100.00

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

2.110 1,762.5

0.26

868.1

0.763

29,749

37,408

2.372 10,173.4

1.50

1,565.0

2.99

0.809

8,773

5,204

3.182 15,263.4

2.26

1,825.0

4.86

0.739

3,743

3,977

3.569 5,633.8

0.83

696.6

1.513

2,806

1.79

3,825

3.892 5,403.7

0.80

809.8

1.35

3,980

6-shogaol

4.182 581,747.0 85.95

59,514.8

1.12

1.042

4,325

3,840

4.832 13,452.4

1.99

1,792.3

2.56

0.956

8,928

6,645

6.455 43,414.0

6.41

2,958.8

4.70

1.033

4,734

3,247

Total

676,850.1 100.00

Phụ lục 1.63: Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại mẫu thử [6]-shogaol 5 ppm.

132

Injection #

Area

IS Area

IS Name

IS Area Ratio

IS Amount Ratio

340,179

0.0

4.3

357556.1

0.0

4.259

338,365

0.0

4.2

340,179

Average

N/A

%RSD

Injection #

Area

IS Name

IS Area

IS Area Ratio

IS Amount Ratio

684520.05

0.0

4.244

706,812

0.0

4.2

713,461

0.0

4.2

684,520

Average

N/A

%RSD

Injection #

Area

IS Name

IS Area

IS Area Ratio

IS Amount Ratio

Khoảng tuyến tính

133

4.3

825,091

0.0

4.2

838,474

0.0

4.237

841332.5

0.0

Average

841,332

%RSD

N/A

Injection #

Area

IS Name

IS Area

IS Area Ratio

IS Amount Ratio

4.2

1,038,568

0.0

4.2

1,038,636

0.0

4.221

1031872.7

0.0

Average

1,031,873

%RSD

N/A

Injection #

Area

IS Name

IS Area

IS Area Ratio

IS Amount Ratio

4.2

1,339,158

0.0

4.225

1355249.4

0.0

4.2

1,390,138

0.0

Average

1,355,249

%RSD

N/A

Injection #

Area

IS Name

IS Area

IS Area Ratio

IS Amount Ratio

4.2

1,432,590

0.0

4.199

1680474.0

0.0

4.2

1,508,520

0.0

Average

1,680,474

%RSD

N/A

Phụ lục 1.64: Khoảng tuyến tính [6]-shogaol nồng độ 2,4,5,6,8,10 ppm.

134

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

1.087

932.1

0.28

246.8

2.506

2,368

2.218

6,456.2

1.94

1,429.1

0.31

5,912

2.275

2,889.5

0.87

844.2

2.423

57,886.3

17.41

3,733.0

3.347

259

658

2.958

868.2

0.26

240.9

1.94

0.690

21,307

4,611

6-shogaol 4.036

232,466.0 69.93

25,430.2 5.10

1.130

4,162

4,231

5.178

29,962.7

9.01

1,299.2

3.75

0.677

5,763

3,295

6.171

233.0

0.07

159.1

4.88

2.539

112,332

284,539

9.148

271.5

0.08

217.4

85.36

2.197

300,568

2,429,946

9.199

202.4

0.06

177.4

2.05

1.487

802,279

1,955,041

9.327

260.2

0.08

259.0

5.28

2.007

531,705

2,869,743

Total

332,428.2 100.00

Độ đúng

Phụ lục 1.65: SKĐ mẫu thử [6]-shogaol 5 ppm.

135

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

1.787 697.0

0.07

214.9

0.860

10,559

544

1.832 415.8

0.04

265.3

0.27

2.512

7,371

83,928

2.213 2,702.0

0.28

898.5

7.18

0.695

17,132

11,984

2.426 11,927.6

1.26

2,326.6

2.06

5,885

2.516 2,070.4

0.22

481.6

6-shogaol

4.042 913,287.9

96.13

99,127.1

1.086

4,286

4,251

5.127 15,641.0

1.65

678.3

0.578

11,851

4.58

8,271

5.719 2,235.8

0.24

324.3

1.533

11,392

1.56

1,854

3.25

6.621 239.0

0.03

204.0

1.008

322,609

1,127,264

8.11

7.131 461.1

0.05

238.4

1.515

227,344

80,305

9.380 409.5

0.04

252.8

26.81

1.319

541,907

312,034

Total

950,087.1

100.00

Phụ lục 1.66: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 80% lần 1.

136

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.208 3,455.9

0.36

1,050.0

0.819

10,147

9,362

2.457 12,531.9

1.29

1,363.5

1.86

0.845

5,354

3,089

2.973 4,823.1

0.50

691.4

2.37

1.184

3,112

2,125

6-shogaol

4.038 879,911.3

90.40

94,967.6 4.23

1.095

4,175

4,321

4.543 37,385.7

3.84

1,245.7

1.67

3.516

964

2,548

5.207 34,826.6

3.58

1,010.7

1.86

0.608

5,845

3,486

6.259 212.8

0.02

209.9

5.48

1.239

735,707

636,297

8.426 218.2

0.02

225.8

76.19

1.447

1,484,597

1,747,133

Total

973,365.4

100.00

Phụ lục 1.67: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 80% lần 2.

137

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

0.848 720.9

0.08

171.5

4.543

246

2.209 8,624.1

0.91

1,417.4 0.15

1.258

1,495

4,496

2.415 6,188.5

0.65

1,532.7 1.87

0.947

14,909

12,041

2.976 5,702.0

0.60

721.3

3.45

1.097

2,749

2,515

3.160 363.9

0.04

208.5

0.91

1.594

42,594

5,708

6-shogaol

4.035 882,843.7

93.25

94,815.3 4.20

1.091

4,136

4,180

5.224 41,804.8

4.42

1,239.4 3.62

0.640

4,390

2,641

5.760 464.5

0.05

183.7

1.32

3.198

29,977

3,221

Total

946,712.5

100.00

Phụ lục 1.68: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 80% lần 3.

138

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.021 190.2

0.02

158.8

1.296

44,566

117,482

2.206 6,147.2

0.57

1,420.8

2.93

0.786

4,628

7,395

2.429 10,005.8

0.93

1,660.2

2.16

0.817

11,901

8,601

2.966 5,822.0

0.54

829.6

2.65

0.938

5,489

1,554

6-shogaol

4.036 1,045,295.3 96.94

114,512.7 3.94

1.085

4,270

4,424

5.110 10,222.1

0.95

485.4

4.68

0.572

14,802

8,924

8.153 150.4

0.01

205.8

25.86

1.344

2,073,144

2,943,094

8.861 489.4

0.05

159.0

0.628

369,927

Total

1,078,322.4 100.00

Phụ lục 1.69: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 100% lần 1.

139

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

2.206

4,822.7

0.44

1,281.8

8,374

6,930

0.858

2.431

6,828.4

0.63

1,202.0

2.21

8,104

15,583

0.775

2.971

5,751.4

0.53

754.9

3.88

4,858

3,922

0.929

6-shogaol 4.041

1,052,866.8 96.92

114,952.2 5.16

4,375

4,271

1.083

5.161

14,687.4

1.35

426.9

4.46

6,430

11,674

0.553

8.372

172.2

0.02

223.4

23.14

1,402,142

2,761,226

1.818

8.956

501.4

0.05

253.8

234,840

46,104

6.25

1.650

9.010

539.0

0.05

236.2

144,006

85,434

0.37

3.140

9.530

173.8

0.02

181.8

1,431,174

3,598,281

7.26

2.249

Total

1,086,342.9 100.00

Phụ lục 1.70: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 100% lần 2.

140

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

2.208

10,174.3

0.87

1,782.9

1.167

1,875

5,465

2.432

18,360.3

1.58

3,564.2

2.490

43,474.3

3.74

3,510.7

2.970

6,686.2

929.1

0.57

2,832

3.143

326.7

0.03

206.2

1.24

2.898

24,172

49,868

3.432

370.4

0.03

144.8

3.519

188.4

0.02

192.9

264,970

6-shogaol 4.039

1,068,383.5 91.80

115,351.3 3.81

1.082

4,217

4,308

5.142

15,869.5

1.36

812.0

4.41

0.634

9,571

6,556

Total

1,163,833.5 100.00

Phụ lục 1.71: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 100% lần 3.

141

Time

Area

Component Name

Area %

Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley- Dorsey)

Plates (Tangent)

0.722 1,328.7

0.10

159.2

0.532

288

2.208 9,507.1

0.74

1,683.3

4.47

1.259

1,813

5,524

2.440 8,916.2

0.70

1,446.2

2.02

0.784

11,450

7,669

2.987 5,382.7

0.42

777.6

3.59

0.734

5,933

3,833

6-shogaol 4.047 1,237,863.9 96.69 133,755.7 4.82

1.080

4,233

4,308

5.190 17,205.7

1.34

453.2

4.28

0.550

9,976

5,199

Total

1,280,204.2 100.00

Phụ lục 1.72: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 120% lần 1.

142

Time

Area

Component Name

Area % Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

2.200

11,707.3

0.92

1,790.6

1.032

1,570

3,448

2.423

8,306.3

0.66

1,615.6

1.79

0.823

12,713

9,647

2.939

535.6

0.04

185.0

5.21

0.657

50,098

13,958

6-shogaol

4.036

1,215,788.8 95.91

132,717.4 6.39

1.073

4,316

4,381

5.252

31,254.4

2.47

783.0

3.54

0.609

4,467

2,243

Total

1,267,592.4 100.00

Phụ lục 1.73: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 120% lần 2.

143

Time

Area

Component Name

Area %

Height Resolution Tailing Factor

Plates (Foley-Dorsey)

Plates (Tangent)

2.205

11,742.0

0.89

1,733.3

1,379

4,131

2.434

16,989.2

1.28

3,496.8

2.510

44,881.6

3.39

3,650.6

2.966

6,519.5

0.49

883.1

0.989

3,734

1,718

6-shogaol

4.040

1,224,978.6 92.61 132,781.3 4.05

1.073

4,288

4,381

5.190

17,493.0

1.32

407.7

4.24

0.563

7,867

4,821

8.674

141.0

0.01

179.9

21.79

1.233

2,028,834

2,798,882

Total

1,322,744.9 100.00

Phụ lục 1.74: Độ đúng [6]-shogaol 5 ppm 120% lần 3.

144

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN BẰNG UV-VIS

Tính tương thích hệ thống

Phụ lục 1.75: Tính tương thích hệ thống của fucoidan.

Độ đặc hiệu

145

146

Phụ lục 1.76: Độ đặc hiệu fucoidan mẫu chuẩn và mẫu thử.

147

Độ lặp lại

148

149

Phụ lục 1.77: Bước sóng thẩm định độ lặp lại của các mẫu fucoidan.

150

Phụ lục 1.78: Số liệu thẩm định độ lặp lại của fucoidan.

151

Khoảng tuyến tính

Phụ lục 1.84: Đồ thị khoảng tuyến tính của fucoidan ở nồng độ 2,4,5,6,8,10,15

ppm.

152

Độ đúng

Phụ lục 1.85: Độ đúng của fucoidan bằng phương pháp UV-Vis.

Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất [6]-shogaol trong cao gừng (Zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu (Sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (Apium graveolens)

Lê Nguyễn Tường Vi

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ NÂNG CAO HÀM LƯỢNG

HOẠT CHẤT 6-SHOGAOL TRONG CAO GỪNG (Zingiber

officinale), FUCOIDAN TRONG CAO RONG NÂU (Sargassum

mcclurei) VÀ APIGENIN TRONG CAO CẦN TÂY (Apium

graveolens)

Thành phố Hồ Chí Minh – 2021

Lê Nguyễn Tường Vi

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ NÂNG CAO HÀM LƯỢNG

HOẠT CHẤT 6-SHOGAOL TRONG CAO GỪNG (Zingiber

officinale), FUCOIDAN TRONG CAO RONG NÂU (Sargassum

mcclurei) VÀ APIGENIN TRONG CAO CẦN TÂY (Apium

graveolens)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

Thành phố Hồ Chí Minh – 04/2021

Bột gừng khô (1 kg)

(NMR)

* δH

(ppm)

* δC (ppm)

* δH

(ppm)

* δC (ppm) δC 183,93 166,32

(ppm) 183,0 164,19

Kết tủa bằng EtOH abs, ly tâm (5500v/p)

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của các yếu tố thương hiệu với vai trò trung gian của Marketing truyền miệng đến quyết định chọn việc làm của nhân viên GenZ tại chuỗi nhà hàng gà rán Popeyes khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của Marketing mix đến ý định học cao học của sinh viên khối ngành kinh tế thuộc Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ