Luận văn : Sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli part 1

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

92
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

1.1. Đặt vấn đề Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì một số dòng E. coli độc có thể gây bệnh trên người và một số loài động vật. Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E. coli thành nhiều...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli part 1

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì một số dòng E. coli độc có thể gây bệnh trên người và một số lo ài động vật. Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E. coli thành nhiều nhóm. Mỗi nhóm đều có những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác nhau. Một số gen độc lực quan trọng của E. coli như: gen ehxA, stx1, stx2 , và uid của nhóm STEC (Shiga toxigenic E. coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC (Enteropathogenic E. coli); … Nhìn chung, E. coli có th ể được phân lập dễ dàng ở khắp n ơi trong môi trường ô nhiễm phân. Ngoài ra, E. coli còn có thể phân lập được từ những vùng nư ớc ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật này có th ể tồn tại và phát triển rất lâu trong môi trường. Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E. coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu thức ăn hay nguồn nước n ếu quy trình sản xuất không đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt. Từ đó , có th ể gây nên các bệnh rối loạn đư ờng tiêu hóa, và nhiễm trùng đường tiết niệu, có trường hợp gây tử vong cho người và gia súc. Do vậy, việc xác định các gen độc lực của E. coli trong phân gia súc b ình thường hoặc tiêu chảy là cần thiết, góp phần trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật và đánh giá nguy cơ truyền lây sang người qua con đường thực phẩm. Từ đó, có những biện pháp phòng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi. Nh ững tiến bộ của công nghệ sinh học hiện nay với phương pháp PCR sẽ giúp chúng ta chẩn đoán chính xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với phương pháp truyền thống (nuôi cấy, phân lập, …). Vì vậy, đề tài tiến h ành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2 , eae, ehxA, và uid của E. coli phân
2 lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò. Hy vọng trong tương lai, đề tài sẽ được ứng dụng vào thực tiễn chẩn đoán và tầm soát bệnh cho gia súc cũng như cho con người qua con đ ường thực phẩm. 1.2. Mục tiêu – y êu cầu 1.2.1. Mục tiêu - Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA và uid của E. coli, đ ặc biệt là nhóm STEC. 1.2.2. Yêu cầu - Phân lập được E. coli từ phân, thịt trên một số loại môi trường chọn lọc (MAC, SMAC, CT - SMAC). - Ứng dụng kỹ thuật multiplex – P CR p hát hiện một số gen độc lực của E. coli phân lập được.
3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vi khuẩn E. coli Vi khuẩn E. coli sống bình thường trong ruột người và động vật, nhiều nhất trong ruột già. Vi khuẩn theo phân ra môi trường b ên ngoài gây ô nhiễm cho n ước, đất, không khí, dụng cụ giết mổ, các nguyên liệu sử dụng trong chế biến thực phẩm, … 2.1.1. Đặc điểm sinh học  Phân loại: vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia .  Hình thái: là trực khuẩn, gram âm, di động, không bào tử, giáp mô, có lông tơ xung quanh.  Kích thước: khoảng 0,5 m  2 – 3 m.  Đặc tính nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15 - 400C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, pH từ 6,4 – 7 ,4. Mọc tốt trên môi trư ờng thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ h ình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục, khoảng 2 – 3 m m.  Đặc tính sinh hóa: E. coli lên men nhiều loại đ ường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite. Để phân biệt E. coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là: + + - - hay - + - - (FAO, 1992). 2.1.2. Yếu tố kháng nguyên Vi khuẩn đ ường ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính ch ất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh (serotype) khác nhau (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996):  Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O là:  Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ.  Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
4  Bị hủy bởi formol 5%.  Rất độc, chỉ cần 0,05 m g đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính ch ất chuyên biệt cho từng lo ài vật chủ.  Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tư ợng ngưng kết H.  Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau và nằm ngoài kháng nguyên O. Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein. Nếu kháng nguyên K che phủ ho àn toàn thân vi khuẩn th ì sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu.  Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, d ài kho ảng 4 m, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – 7 nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn . Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, người ta có thể định danh vi khuẩn. 2.1.3. Phân loại E. coli Để phân loại E. coli gây bệnh, người ta dựa vào đ ặc điểm sinh bệnh như: gen độc lực mã hóa các protein gây bệnh cho vật chủ, sự tác động khác nhau lên màng nhầy ruột, hội chứng lâm sàng và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh. Có 5 nhóm E. coli gây bệnh (Keskimaki, 2001): (1) E. coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E. coli h ay VTEC- Verotoxigenic E. coli và EHEC Enterohemorrhagic E. coli ). (2) E. coli gây b ệnh đ ường ruột (EPEC- Enteropathogenic E. coli). (3) E. coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E. coli).
5 (4) E. coli bám dính kết tập ở ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative E. coli). (5) E. coli tấn công hay xâm lấn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E. coli). 2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC) Nhóm STEC được kết tội là liên quan đ ến nhiều đợt dịch bệnh viêm dạ dày, đã và đang đe dọa sức khỏe cộng đồng. Vào những năm đầu thập niên 1980, các dòng STEC gây ra những đợt dịch liên quan đến hội chứng viêm kết tràng xu ất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS). HUS biểu hiện ba triệu chứng điển hình là suy th ận cấp, giảm tiểu cầu và thiếu máu tan huyết do tổn thương mao mạch. Bao gồm nhiều serotype khác nhau như O26, O111, O113, O124, O145, O157, … (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996). Hiện nay, người ta công nhận các dòng STEC gây b ệnh nghiêm trọng cho con ngư ời, đặc biệt O157:H7 là serotype chính của STEC gây nhiều ổ dịch lớn trên khắp thế giới (Smith và ctv, 1988). 2.2.1. Thuật ngữ Nh ững hướng khác nhau trong nghiên cứu đ ã đưa ra những thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E. coli này. Thu ật ngữ Verotoxigenic E. coli hay Verocytotoxigenic E. coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc dòng tế bào Vero (ở thận khỉ mặt xanh châu Phi). Thuật ngữ Enterohemorrhagic E. coli ( EHEC) chỉ những dòng E. coli gây HC và HUS (Nataro và Kaper, 1998). Và thu ật ngữ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) ch ỉ nh ững serotype E. coli sản sinh độc tố gây độc tế b ào giống như độc tố của vi khu ẩn Shigella (Calderwood và ctv, 1996). STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều đề cập đến E. coli sản sinh một hay nhiều độc tố gây độc tế bào. Tuy nhiên , không phải chỉ có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác. Những dòng E. coli m ang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một hay vài yếu tố độc lực khác của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
6 2.2.2. Các y ếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC 2.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx) Shigella dysenteriae do Kiyoshi Shiga phát hiện năm 1897, sản sinh độc tố thường được gọi là Shiga. Và sau này người ta phát hiện ở STEC cũng sản xuất độc tố tác động tương tự như Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro và Kaper, 1998). Stx là một ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh trung ương. Ở ruột, E. coli gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường và các axit amin ở ruột non. Ở hệ thần kinh, nó gây biểu hiện lâm sàng trầm trọng có thể tử vong (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996). Trong số hơn 200 serotype E. coli có thể sản sinh độc tố Stx thì có h ơn 50 serotype gây HC h ay HUS ở người (Nataro và Kaper, 1998).  Cấu trúc và tổ chức các gen stx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều biến chủng như Stx2c, Stx2hp, Stx2e ... Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2, hoặc cả Stx1 lẫn Stx2, và th ậm chí nhiều dạng của Stx2. Nh ững nghiên cứu đầu thập niên 80 đ ã xác định Stx1 và Stx2 được mã hóa trên thực khuẩn th ể và thực khuẩn thể này chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli (O’Brien và ctv, 1984 ). Bảng 2.1 Danh pháp các thành viên trong họ Stx Tên gọi hiện nay Tên gọi trước đây Gen Protein stx Shiga toxin (Stx) Stx stx1 Shiga like toxin I (SLT_I) hay Verotoxin 1 (VT1) Stx1 stx2 SLT_II hay VT2 Stx2 stx2c STL_II c hay VT2c Stx2c stx2e STL_II e hay VT2e Stx2e (Nguồn: Calderwood và ctv, 1996)
7 Tất cả độc tố Stx đều gồm hai thành ph ần cấu tạo (Paton và Paton, 1998): - Tiểu đơn vị A , 32 kDa, gồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfit. Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B. - Năm tiểu đơn vị B, có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa. Các tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu của nó.  Vai trò của Stx trong sinh bệnh: Để gây bệnh, trước tiên Stx phải được tiếp nhận bởi các thụ thể đặc hiệu. Các nghiên cứu cho thấy rằng Stx có tính chất gây độc trực tiếp lên tế bào ruột do chúng nhắm đến thụ thể Gb3 (globotriaosylceramide), dạng thụ thể glycolipid, trên nhung mao của tế bào biểu mô ruột ở động vật (Stx2e có thụ thể là Gb 4). Gb3 hoặc Gb 4 còn tìm th ấy ở tế bào nội mô thận, tế b ào Vero, tế bào Hela... Nh ờ tính đ ặc hiệu của tương tác này và sự phân bố của các th ụ thể thay đổi theo loại tế bào đ ã ảnh hưởng chính đến cách sinh bệnh (Lingwood, 1996). Sau khi làm hư hại các tế b ào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mô, xâm nhập vào dòng máu và tiến đến các mô đích khác nhau có chứa thụ thể glycolipid , gây tổn thương tế b ào nội mạch, tế b ào thận … Cụ thể là những tiểu đơn vị B sẽ giúp độc tố kết hợp với các thụ thể đặc hiệu này. Sau khi đư ợc chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome, rồi cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Vì không tổng hợp được protein , những tế bào bị Stx tác động sẽ chết. Hậu quả là gây tiêu ch ảy, viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS). Trong khi đó, hậu quả do Stx2e là hiện tượng phù thủng ở heo sau cai sữa (trích d ẫn của Lê Thị Mai Khanh, 2004).  Ảnh hưởng của các loại Stx trong sinh bệnh : Các nghiên cứu dịch tễ đã ch ỉ ra rằng những dòng STEC ch ỉ sản sinh Stx2 thì gây bệnh trầm trọng hơn so với những dòng STEC chỉ sản sinh Stx1, b ệnh càng nặng hơn nếu dòng STEC sản sinh cả Stx1 lẫn Stx2, chẳng hạn như HUS (Paton và Paton, 1998).
8 2.2.2.2. Enterohemolysin (haemolysin) Enterohemolysin tồn tại ở nhiều dạng (,  và …) trong các E. coli xâm lấn hay sinh độc tố đường ruột (Manil và Daube, 2005). Độc tố n ày được tìm th ấy ở hầu hết các dòng O157:H7 và các dòng STEC không phải O157:H7. Enteroh emolysin thuộc nhóm độc tố RTX (Repeats in toxin), gây dung giải tế bào tạo thành lỗ nh ư chân lông (RTX family of pore-formin g cytolysin) (Paton và Paton, 1998). Và RTX hiện diện trong E. coli gây bệnh đường huyết niệu (uropathogenic E. coli), Pasteurella haemolytica và các tác nhân khác gây b ệnh cho ngư ời, động vật (Bauer và Welch, 1996). Haemolysin do gen ehxA n ằm trên plasmid 60 MDa pO157 mã hóa. Gen ehxA có 60% tương đồng với h lyA; h lyA cũng là gen cấu trúc mã hóa haemolysin ở E. coli gây bệnh đường huyết niệu và cho kiểu dung huyết -haemolysin (-Hly). Ngoài ra, gen cấu trúc ehxA có nhiều biến thể, được chia thành hai nhóm : nhóm 1 gồm nhiều loại EHEC phổ biến như O157:H7, O26, O111; trong khi đó, nhóm 2 gồm nhiều serotype khác còn lại cũng có tính chất gây bệnh. Gần đây, các nghiên cứu về di truyền học đã chỉ ra rằng gen ehxA của những dòng STEC có trình tự giống nhau trên 98%, nhưng vẫn có sự khác nhau lớn ở một số đoạn trình tự chuyên biệt (Feng và Monday, 2000). Beutin và ctv (1989) đ ã khảo sát và khẳng định rằng đa số các dòng STEC đều cho kiểu dung huyết alpha (-Hly). Các dòng sản sinh độc tố này thì không gây dung huyết trên thạch máu nh ưng tạo thành vòng dung huyết nhỏ, mờ trên thạch máu cừu (có bổ sung Ca2+) sau khi ủ qua đ êm . Hiện tại, phương thức tham gia gây bệnh của enterohaemolysin vẫn chưa được biết rõ. Chính sự dung huyết trở th ành nguồn cung cấp Fe kích thích sự phát triển STEC trong ống tiêu hoá (Law và Kelly, 1995). 2.2.2.3. Yếu tố bám dính Yếu tố bám dính của STEC đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột. Đó là intimin, một protein màng ngoài có trọng lượng phân tử 94-97 kDa. Intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching and effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy, gọi là bệnh tích A/E (attaching and effacing) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Có 4 loại intimin, được kí hiệu là , , , và . Trong đó:
9  -intimin thường được tìm th ấy ở những dòng E. coli thuộc nhóm EPEC ở người và chó.  -intimin có ở những dòng E. coli thuộc nhóm EPEC và EHEC ở n gười và thỏ.  -intimin chủ yếu ở nhóm STEC của người và động vật, ở EPEC của người.  -intimin hiện diện trong những dòng E. coli thuộc nhóm EHEC ở bò và người (Oswald và ctv, 2000). Có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae và khả năng gây bệnh trầm trọng của các dòng STEC trên người như HC và HUS. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ của các dòng mang gen eae ở bệnh phẩm người cao hơn trên gia súc. Hơn nữa, sự hiện diện dòng STEC mang gen eae trên gia súc thường liên quan đ ến các dòng vi khuẩn E. coli độc lực trên người mà khoa học đã từng biết, chúng thuộc serotype O157, O26, O111, … (Sandhu và ctv, 1996). Ngoài ra còn có các yếu tố liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác gây bệnh đ ường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) và LPS (lipopolysaccharide). 2.2.3. Cách sinh bệnh Cách sinh b ệnh là một quá trình gồm nhiều bước, liên quan đến sự tương tác phức tạp giữa số lượng vi khuẩn và các yếu tố của vật chủ. Cấp STEC qua đường miệng (chỉ cần liều rất thấp) thì vi khu ẩn phải sống sót trong điều kiện môi trường khắc nghiệt của dạ dày và chúng phải cạnh tranh với các vi khu ẩn khác ở đư ờng ruột để thiết lập sự định cư. Vi khuẩn STEC sống sót trong đường ruột, nhân lên và sản sinh Stx rồi được hấp thu qua tế bào biểu mô ruột, dẫn truyền vào dòng máu. Điều này cho phép toxin đặc hiệu đến bề mặt tế b ào đích gồm cả tế b ào ruột lẫn các nội quan khác (Paton và Paton, 1998).  Định cư vào ống tiêu hoá: vi khu ẩn có kh ả năng bám vào tế bào biểu mô ruột và định cư trong ống tiêu hoá người là một trong những yếu tố quyết định độc lực. Người ta ước tính liều gây nhiễm của vài dòng STEC (O111:H- và O157:H7) khoảng 1–100 CFU (colony forming unit) (Paton và ctv, 1996).