Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn [Catharanthus roseus (L.) G. Don]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN

rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G. Don]

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Thái Nguyên, năm 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN

rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G. Don]

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Thái Nguyên, năm 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới

sự hướng dẫn củ a GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Mọi trích dẫn trong luận văn đều

ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đinh Anh Tuấn

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã

tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công

trình nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công

nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường Đại

học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm củ a đề tài.

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt

thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiện đề tài luận văn.

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đinh Anh Tuấn

iii

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Đă ̣t vấn đề ........................................................................................................ 1

2. Mu ̣c tiêu nghiên cứ u ........................................................................................ 3

3. Nô ̣i dung nghiên cứ u ....................................................................................... 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4

1.1. CÂY DỪA CẠN .......................................................................................... 4

1.1.1. Hệ thống phân loại cây Dừa cạn ............................................................... 4

1.1.2. Giá trị sử dụng của cây dừa cạn ............................................................... 6

1.2. MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODING) ..................................................... 10

1.2.1. Đă ̣c điểm củ a mã vạch DNA (DNA barcoding) ........................................ 10

1.2.2. Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dươ ̣c liê ̣u .......................... 12

1.3. GEN LỤC LẠP ............................................................................................ 15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 17

2.1. VẬT LIỆU, HÓ A CHẤ T VÀ THIẾ T BI ̣ .................................................... 17

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 17

2.1.2. Hóa chất, thiết bị và máy móc ................................................................... 17

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 17

2.2.1. Phương pháp thu mẫu ............................................................................... 17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ........................................................... 18

iv

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số .................................................... 18

2.2.2.2. Phương pháp nhân gen rpoC1 bằng kĩ thuật PCR ................................ 19

2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ( phương pháp thôi gel) .......... 20

2.2.2.4. Phương pháp xá c đi ̣nh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 .......... 21

2.2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 21

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐI ̣A ĐIỂ M NGHIÊN CỨ U ............................................. 22

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 23

3.1. ĐẶC ĐIỂ M THỰC VẬT HỌC CỦ A CÁC GIỐNG DỪA CẠN THU

TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN .............................................................. 23

3.1.1. Đă ̣c điểm hình thái rễ, thân, hoa, quả và ha ̣t củ a cây dừ a ca ̣n .................. 23

3.1.2. Đặc điểm khác biê ̣t về hình thái giữa ba giố ng dừ a ca ̣n ........................... 26

3.2. PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN ................................ 28

3.2.1. Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn .................................................... 28

3.2.2. Khuếch đại đoạn gen rpoC1 bằng PCR .................................................... 28

3.2.3. Kết quả xác định trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừ a ca ̣n 29

3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁ C MẪ U DỪ A CẠN DỰA TRÊN

TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦ A

ĐOẠN GEN rpoC1 ............................................................................................. 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 37

1. Kết luâ ̣n ........................................................................................................... 37

2. Đề nghi ̣ ............................................................................................................ 37

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ........................... 38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 39

v

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1 ................................. 19

Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa các trình tự nucleotide củ a đoạn gen

rpoC1 ............................................................................................................... 32

Bảng 3. 2. Các vị trí sai khác giữa các trình tự amino acid suy diễn của gen

rpoC1 ............................................................................................................... 33

Bảng 3.3. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của

gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn ......................................................... 34

Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

củ a gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn .................................................. 36

vi

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus ......................................................... 5

Hình 3.1. Cây dừa cạn hoa trắng nhu ̣y đỏ Hà Giang ......................................... 23

Hình 3.2. Các bô ̣ phâ ̣n của cây dừa cạn ............................................................. 24

Hình 3.3. Đặc điểm khác nhau về hình thái giữa ba giống dừ a ca ̣n ................... 27

Hình 3.4. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số .............................. 28

Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen rpoC1 .......................... 29

Hình 3.6. Trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa

cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số

KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen ....................................................... 30

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn củ a đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang

mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen ............................................. 33

Hình 3.8. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của 6

mẫu dừa cạn......................................................................................................... 35

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng dựa trên trình tự amino

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

acid suy diễn của 6 mẫu dừa cạn. ........................................................................ 36

vii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid

PCR Polymerase chain reaction

rpoC1 RNA polymerase beta' chain

Cetyl trimethylammonium Bromide CTAB

Giống dừa cạn hoa hồng tím thu tại Hà Giang TIM_HG

Giống dừa cạn hoa trắng vàng thu tại Hà Giang TV_HG

Giống dừa cạn hoa hồng tím thu tại Thái Nguyên TIM_TN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Giống dừa cạn hoa trằng đỏ thu tại Thái Nguyên TRANG_TN

1

MỞ ĐẦU

1. Đă ̣t vấ n đề

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có nhiều điều kiện cho thực

vật phát triển và tạo ra sự phong phú, đa dạng của nhiều loài thực vật và nhiều

hệ sinh thái khác nhau. Theo thống kê tại Việt Nam hiện có gần 12000 loài

thực vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2256 chi, 305 họ; 69 loài thực vật hạt trần;

12000 loài thực vật hạt kín; 2200 loài nấm; 2176 loài tảo; 481 loài rêu; 368 loài

vi khuẩn lam; 691 loài dương xỉ và 100 loài khác [8].

Lịch sử phát triển môn phân loại học và các công trình nghiên cứu về

phân loại thực vật từ trước còn chưa được đầy đủ. Trong lịch sử nghiên cứu

thực vật ở nước ta đã có nhiều công trình thống kê, phân loại nhiều loài cây,

có thể kể đến một số tác giả như: Tuệ Tĩnh đã mô tả tới 579 loài cây làm

thuốc trong cuốn Nam dược thần hiệu, Lê Quí Ðôn với bộ Vân đài loại ngữ đã

phân chia thực vật thành nhiều loại: cây cho hoa, cho quả, ngũ cốc, rau, cây

loại mộc, loại thảo. Lý Thời Chân cho xuất bản cuốn Bản thảo cương mục

trong đó có đề cập tới trên 1000 vị thuốc thảo mộc...[1].

Trong thời kỳ Pháp thuộc, do tài nguyên thực vật ở nước ta rất phong phú

đã gây được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu phương Tây. Công trình lớn

nhất là bộ Thực vật chí tổng quát Ðông Dương do Lecomte và một số nhà thực

vật học người Pháp đã biên soạn, phân loại, mô tả và thống kê các cây từ Dương

xỉ tới thực vật Hạt kín của toàn Ðông Dương. Công trình nghiên cứu các cây

thuốc ở Campuchia, Lào và Việt Nam của Pételot... Phần lớn các nghiên cứu đều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tập trung vào thực vật bậc cao, đặc biệt đối với cây thuốc [1], [17].

2

Dừa cạn (Catharanthus roseus. G. Don) là loại cây cảnh phổ biến vì

dáng cây đẹp, mềm mại, lá xanh mướt, hoa rực sáng, là những nét đặc trưng

tạo được sự hấp dẫn của loài cây này. Dừa cạn cũng là một loại thảo dược dân

gian vì có chứa nhiều loại alkaloid. Từ dừa cạn có thể chiết được một số chất

điều trị ung thư như vinblastine, vincristine. Trên thế giới dừa cạn gồm 8 loài,

có ba giố ng dừ a ca ̣n trồ ng phổ biến ở Viê ̣t Nam phân biê ̣t nhau về màu sắc

hoa: hoa màu hồ ng tím, hoa màu trắng vàng và hoa màu trắng đỏ.

Đến nay, các mẫu thực vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc

điểm hình thái, giải phẫu hoặc các đặc tính sinh lý, hóa sinh, di truyền nhờ

vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp,

như mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư

hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết... đã khiến quá trình nhận diện trở

nên khó khăn thậm chí là không thể. Trong những trường hợp này mã vạch

DNA đã giúp giải quyết khó khăn trên. Mã vạch DNA (DNA barcoding) sử

dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như là một chuỗi

ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy

quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài

chúng rất giống nhau, nhưng thực sự là khác nhau. Hơn nữa, mã vạch DNA

còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật,

nó còn giúp quá trình phân tích sự tiến hóa sinh học của loài trong tự nhiên.

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu đă ̣c điểm hình thá i và trình tự gen rpoC1 của cây dừ a ca ̣n [Catharanthus roseus (L.) G. Don]" góp phần tư liệu hóa nguồn gen cây dừa cạn phục vụ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

3

2. Mu ̣c tiêu nghiên cứ u

Phân tích đươ ̣c đă ̣c điểm hình thái và trình tự gen lu ̣c la ̣p rpoC1 của các giố ng dừ a ca ̣n khác nhau về màu sắc hoa phu ̣c vu ̣ xây dựng mã vạch DNA

cho cây dừ a ca ̣n (Catharanthus roseus (L.) G. Don).

3. Nô ̣i dung nghiên cứ u

1) Nghiên cứu đặc điểm thực vật học của cây dừa cạn và so sánh sự khác

nhau về đặc điểm hình thái giữa các giống dừa cạn hoa hồng tím, hoa trắng

vàng và hoa trắng đỏ thu từ mô ̣t số đi ̣a phương phía Bắc Viê ̣t Nam.

2) Nghiên cứu thông tin về trình tự gen rpoC1 và khuếch đa ̣i đoa ̣n gen rpoC1 từ DNA hệ gen lục la ̣p của cây dừa cạn. Giải trình tự nucleotide củ a đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ bố n mẫu dừ a ca ̣n thu từ hai tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3) Phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn củ a gen rpoC1 củ a các mẫu nghiên cứ u và củ a gen rpoC1 trên Ngân hàng gen quốc tế.

4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY DỪA CẠN

1.1.1. Hệ thống phân loại cây Dừa cạn

Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài,

hầu hết là cây thân thảo lâu năm. Trong đó, chỉ có loài Catharanthus pusillus

có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ

Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là

2n=16 [1], [22]. Tám loài thuộc giống này đó là:

 Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar;

 Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon. Madagascar;

 Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon. Madagascar;

 Catharanthus ovalis Markgr. Madagasca;

 Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;

 Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar;

 Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon. Madagascar;

 Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon. Madagascar. [1], [22].

Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường dùng để

làm cảnh và được biết đến nhiều nhất là loài Madagascar Periwinkle hay còn

gọi là vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ngoài việc có

công dụng như một loài cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loài thuốc chống đái

5

tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành…

và ngày nay người ta còn tìm được một công dụng hết sức quan trọng của loài

Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả [1], [22].

Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G. Don; Vinca rosea L;

Lochnera rosea Reich, tên gọi khác là bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân

hoa… Về phân loại khoa học, dừ a ca ̣n có tên khoa học là Catharanthus roseus

(L.) G. Don, thuô ̣c Giới (regnum) Plantae, bộ (ordo) Gentianales, họ (familia)

Apocynaceae, chi (genus) Catharanthus, loài (species) C. Roseus [1], [22].

Catharanthus roseus giàu alkaloid thuộc loại alkaloid terpenloid indole,

trong nhóm này có ba giống dừ a ca ̣n khác nhau về màu sắc hoa, ‘roseus’ với

hoa màu tím hoặc hồng, ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ, ‘albus’ với

hoa màu trắng [22].

B C A

Hình 2.1. Hoa của ba giống Catharanthus

A: Catharanthus roseus var. roseus B: Catharanthus roseus var. ocellatus C: Catharanthus roseus var. albus

1.1.2. Giá trị sử dụng của cây dừa cạn

Trong dừa cạn có trên 10 alkaloid, rất phức tạp, người ta đã phát hiện

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

có hơn 60 chất khác nhau như: ajmalicin, tetrahydroalstonin, serpentin,

6

lochnerin, akuammin, reserpin... Trong tất cả các alkaloid, có loại vinblastin

và vincritin là hai chất có tác dụng tốt trong chữa các ung thư về máu,

ajmalicin là thuốc điều trị tim mạch rất tốt cho rối loạn thần kinh tim. Nhưng

chỉ mới phát hiện ra những dược tính của dừa cạn trong việc áp dụng chữa

bệnh vì trong tài liệu cổ của y học cổ truyền không thấy đề cập đến cây này.

Tuy vậy, y học cổ truyền một số nước cũng có ghi lại một vài kinh nghiệm sử

dụng dừa cạn để chữa bệnh. Ví dụ, ở Ấn Độ, châu Úc, nam châu Phi, quần

đảo Antilles, người ta dùng dừa cạn sắc uống để chữa bệnh tiểu đường cho

thấy kết quả rất khả quan. Ngoài ra, rễ dừa cạn còn được dùng để tẩy giun,

chữa sốt, làm thuốc thông tiểu, điều kinh, trị tăng huyết áp, chữa sốt rét, kiết

lị, tiêu hóa kém...[1], [23]. Bộ phận dùng để làm thuốc của dừa cạn là rễ, lá

hoặc cả cây. Thông thường, người ta thường nhổ nguyên cả bụi cây dừa cạn

về rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô để cất dùng dần. Trước khi sử dụng có thể sao

qua cho thơm rồi sắc nước uống. Tùy theo mục đích trị liệu, dừa cạn có thể

được phối hợp với các vị thuốc khác hoặc dùng độc vị [1].

Năm 1958, xuất phát từ kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa khối u của

người dân Ấn Độ, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện chất

kháng ung thư trong lá cây dừa cạn là vincaleucoblastine (còn gọi là

vinblastin), 4 năm sau, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là

vincaleucocristin (còn gọi là vincristin). Những thực nghiệm lâm sàng cho

thấy, chiết xuất vinplastin, vincristin có tác dụng làm giảm bạch cầu, ức chế

mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein

ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng

phân chia tế bào ở pha giữa. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [23]. Hàm lượng các alkaloid này trong

7

dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với vinblastin còn

đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa). Vì thế, quá trình điều chế hai alkaliod

từ cây dừa cạn là một quá trình phức tạp và chi phí giá thành cao [3].

Còn với khoa học hiện đại, từ năm 1952, y học đã phát hiện ra dược

tính của dừa cạn. Xuất phát từ việc bác sĩ Clark Noble ở Canada đã nhận được

một gói chuyển phát nhanh loại cây này do một người dân gửi tới với lời giới

thiệu “dân địa phương đã dùng chúng trị bệnh tiểu đường” nên ông đã đưa

vào phân tích. Kết quả khá bất ngờ, thay vì tác dụng hạ đường huyết trong

máu, ông lại phát hiện ra hoạt tính trị bệnh ung thư bạch cầu của loại cây này.

Dừa cạn đã được đưa vào bệnh viện thử nghiệm và trở thành cây dược liệu

chính thức theo y khoa hiện đại. Khi dùng dừa cạn làm thuốc nên chọn loại

hoa trắng vì hoạt chất của chúng cao hơn cây hoa đỏ, hồng. Thành phần

vincristin có tác dụng với bệnh nhân ung thư nhưng chúng lại là thành phần

gây hại cho thai nhi, ức chế hệ thần kinh. Vì vậy dừa cạn là cây dược liệu có

độc, tránh dùng cho phụ nữ có thai, người huyết áp thấp. Dừa cạn được xem

là đặc hữu của vùng đất Madagascar với giá trị dược tính cao nhất thế giới.

Hiện nay hàng năm người dân Madagascar xuất khẩu đến ngàn tấn dừa cạn

phơi khô ra nước ngoài để làm dược liệu. Công ty Dược liệu Trung ương Việt

Nam II cũng đã xuất khẩu cây này từ thập niên 1990. Thị trường dược phẩm

Mỹ, Pháp, Nhật, Việt Nam… có nhiều loại thuốc được bào chế từ dừa cạn

như thuốc trị cao huyết áp, ung thư (máu, tinh hoàn, dạ con)…Kết quả phân

tích của bác sĩ Clark, chiết xuất dừa cạn giàu alkaloid (gồm các loại:

vinblastin, vincristin, tetrahydroalstonin, pirinin, vindolin, catharanthin,

vindolinin, ajmalicin….) [9]. Trong đó thành phần vincristin, vinblastin khi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tách chiết thành dạng thuốc tiêm sẽ có tác dụng lớn trong ức chế tế bào hoặc

8

sự phân bào. Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa ở

bệnh nhân ung thư máu. Đặc biệt đến nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp

gì điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với

bệnh nhân ung thư máu. Tuy nhiên không phải cứ dùng trà dừa cạn thì chữa

được ung thư, bởi một liều tiêm vincristin, vinblastin có hàm lượng rất cao,

việc dùng các thành phần này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của

bác sỹ điều trị. Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái.

Giống trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở

Madagascar, chứa khoảng 0,1- 0,2% alkaloid toàn phần. Tỷ lệ alkaloid trong rễ

(0,7-2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37-1,15%). Các nước Hàn Quốc,

Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức bào chế thuốc từ loại cây này [22].

Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có độc,

có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc,

hoạt huyết, tiêu thũng. Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm sự phát

triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ

bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphô cấp, một số ung thư. Trong dân gian vẫn

dùng trị cao huyết áp, trị bệnh đái đường, điều kinh, chữa tiêu hóa kém và chữa

lỵ, thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít. Có người dùng trị ung thư máu,

ung thư phổi [1], [23]. Ở Trung Quốc, toàn cây dừa cạn dùng trị cao huyết áp,

bệnh bạch huyết lymphô cấp tính và ung thư, mụn nhọt độc. Còn ở Nouvelle-

Calédonie (châu Đại Dương), dừa cạn cũng là vị thuốc chống ung thư. Ở

Australia, nước hãm rễ cây dừa cạn là loại thuốc dân gian chống tiểu đường [36].

Theo Tiến sĩ Võ Văn Chi, từ năm 1926 người ta đã tìm thấy một phức hợp có

tính chất của digitalin, tới năm 1944 đã tìm thấy một hoạt chất có chức năng của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

insulin, điều đó cắt nghĩa được tác dụng hạ đường huyết của dừa cạn [1], [19].

9

Theo kinh nghiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước, rễ dừa

cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt, lị trực trùng, chứng tiêu khát, u xơ tuyến

tiền liệt... Thân và lá có tính chất săn da (astringent), lọc máu (despuratif),

dùng chữa một số bệnh ngoài da, sốt rét, bệnh máu trắng, thông tiểu. Kinh

nghiệm dùng dừa cạn chữa bệnh tiểu đường cũng được ghi nhận ở Ấn Ðộ,

châu Úc, nam châu Phi, quần đảo Antilles, nhưng chứng minh bằng thực tế

khoa học thì chưa có [1], [22].

Chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học Canada đã phát

hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và dẫn

đến sự phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng có tác dụng

chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin. Ngoài ra người ta còn phát hiện

tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và

vindolidin. Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những

năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác [1], [22].

Ở nước ta, nhân dân dùng dừa cạn dưới dạng thuốc sắc để làm thuốc lợi

tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường, ngày dùng 10-16g. Các bệnh về nội tiết như

đái tháo đường, thông tiểu, viêm đường tiết niệu, tiểu tiện có máu, ít nước tiểu

và trong bế kinh. Rễ và lá dùng rất tốt trong hạ huyết áp, nếu cần ta cho thêm

cây hoa đại (bông sứ), cỏ mần trầu và lá lạc tiên mỗi thứ khoản 20g sắc nước

uống liên tục trong nhiều tháng liền đối với huyết áp cao ở giai đoạn đầu dù

có nguyên nhân hay không có nguyên nhân vẫn rất tốt. Có nơi dùng cây dừa

cạn khô 20g dạng sắc nước uống để chữa những khối u nhỏ trong cơ thể, thời

gian qua ở nhiều cơ sở điều trị đã chiết xuất vinblastin và vincristin là thuốc

lựa chọn thứ nhất trong điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, là thuốc chọn thứ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hai trong điều trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô tế bào, có vảy

10

ở đầu và cổ, ung thư biểu mô tế bào thận và còn là một trong những thuốc lựa

chọn thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư vòm họng

và ung thư dạng nấm da [23], [36].

Dừa cạn còn dùng để điều trị bệnh sarcoma lympho, sarcoma bạch huyết

bào, bệnh sarcoma chảy máu Kaposi, sarcoma tế bào lưỡi. Đặc biệt dừa cạn

không có sự kháng chéo giữa vinblastin với các loại thuốc chống ung thư

khác. Liều dùng thân và lá phơi khô 8 - 20g (dạng thuốc sắc, cao lỏng hay

viên nén từ cao khô). Nước ta đã chiết được vinblastin từ lá dừa cạn và dùng

dưới dạng thuốc tiêm để chữa bệnh bạch cầu lymphô cấp. Tương tự các loại

thuốc kháng ung thư khác, các chế phẩm alkaloid của dừa cạn cũng gây một

số phản ứng bất lợi như: buồn nôn, nôn, nhức đầu, tiêu chảy, táo bón, tắc ruột,

liệt, chán ăn, viêm miệng, rụng tóc, giảm bạch cầu, viêm thần kinh. Sử dụng

liều cao và kéo dài có thể gây mù, tử vong. Thuốc có thể gây độc cho thai,

nên tránh dùng cho thai phụ và người đang nuôi con bằng sữa mẹ, người bị

thấp huyết áp [1], [36].

1.2. MÃ VẠCH DNA

1.2.1. Đă ̣c điểm củ a mã vạch DNA (DNA barcoding)

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây

dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng

tương đối đầy đủ và toàn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào

sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ

quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, cách thứ c phân loa ̣i này cũng gặp rất nhiều

khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển

(chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân

11

loại thấp như loài và dưới loài [16]. Từ giữa những năm 1990, với sự phát

triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong

lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại

học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA)

trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích

hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA)

khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [5]. Phân loại học phân tử

(Molecular taxonomy) đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc

phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá

đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của

nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị

DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường. Đối

với thực vật, hệ gen lục lạp (cpDNA) là những gen rất bảo thủ trong tiến hóa.

Trong đó rpoC1 là một gen lu ̣c la ̣p, cấu trú c vò ng kép, bền vững, chiều dài dao động từ 409- 545 bp [17]. Chức năng của rpoC1 mã hóa cho tiểu đơn vị β

- RNA polymerase. Căn cứ mứ c đô ̣ đô ̣t biến trong trình tự nucleotide củ a gen mà có thể phân biệt hai loài hay xác đi ̣nh đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đối tươ ̣ng nghiên cứ u. Kết quả nghiên cứ u sẽ gó p phần cho viê ̣c thiết lâ ̣p mã va ̣ch

DNA (DNA barcoding) cho cây dừ a ca ̣n.

Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,

Canada, đề xuất thuâ ̣t ngữ "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách

để xác định loài [6]. Mã vạch được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một

phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân

biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất

12

giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch,

máy quét có thể phân biệt được. Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng

được các yêu cầu sau: (i) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều

loài thực vật; (ii) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;

(iii) Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [5], [6].

1.2.2. Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dươ ̣c liê ̣u

Những ứng dụng của mã vạch DNA không chỉ nhận diện nhanh các

mẫu mà còn rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù

chúng hầu như không giống nhau về hình thái.

Trong lĩnh vực pháp y, chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ, thậm chí chỉ vài

dấu vết để lại trên hiện trường cũng có thể giúp cảnh sát truy tìm nguồn gốc

tội phạm.

Trong nông nghiệp, một trong những điều đáng lo ngại nhất là kiểm

soát những tác nhân gây bệnh cho cây trồng, chi phí cho việc đó lên đến hàng

tỷ USD mỗi năm. Sử dụng mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chóng các

loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chương trình

kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng. Cho đến nay, về cơ bản đã hoàn thành

mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển

giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ

có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh. Kinh

doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ được đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời

gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh. Mã vạch DNA cũng được

sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian gây bệnh. Các nhà khoa học

những người mà không phải là nhà phân loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trùng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa

13

người và động vật. Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như

phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng. Mã vạch DNA cho những

vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và bước đầu đưa vào sử dụng, điều này

cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ và phương

pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng.

Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác

định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu, để ngăn cản sự vận

chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới. Một

thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút,

trong đó nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng. Không thể kiểm soát được săn

bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trưởng giảm 90% .

Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang giã quý hiếm

hay không. Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền

chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp

pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học. Một dự án chiến lược trên toàn thế

giới của mã vạch DNA đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện

mã vạch của các loài đang bị đe dọa. Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn

ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó

còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp. Một số quốc

gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc

khai thác quá mức nguồn tài nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra

sự suy giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng của nhiều loài. Để kiểm soát khai thác,

nhà chức trách cần phải thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

soát kinh doanh các sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp. Có ít nhất hai

14

dự án về mã vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy

công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên [17], [22].

Cuộc sống của chúng ta phụ thuộc vào nước. Hiện tại nước ngọt trở

thành nguồn tài nguyên quý giá cần được bảo vệ ở mỗi quốc gia. Nguồn nước

bị ô nhiễm cần được xác định để phòng ngừa và có biện pháp xử lý. Một vài

sinh vật đơn giản trong nước được xem là ô nhiễm (ví dụ như ấu trùng của

muỗi). Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc xác

định các chỉ số ô nhiễm. Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học đang cố

gắng xây dựng thư viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập mờ”. Điều này

giúp cho cán bộ quản lý môi trường tiêu chuẩn hóa lại các chỉ số trong việc

đánh giá mức độ ô nhiễm của nước và thiết lập quy trình đánh giá tiêu chuẩn

nước tốt hơn ở mỗi quốc gia.

Thực vật dùng làm thuốc luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy

xác định chính xác loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất

lượng sản phẩm. Cùng với sự phát triển của thị trường thảo dược, sự giả mạo

các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu. Các nguyên

liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan

hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo. Việc giả mạo các

nguyên liệu thảo dược thường là do: Vật liệu không phân biệt được bằng đă ̣c

điểm hình thái; Những vật liệu có tên tương tự nhau; Việc thay thế những

nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu khác rẻ tiền hơn.

Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm

thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương

pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy,

15

phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến

hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch

DNA có thể bảo vệ người dùng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc

giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng [5].

Trước đây người ta phân chia dừa cạn thành 2 giống là

Catharanthusroseus var. roseus và Catharanthusroseus var. angustus, đến

2004, dừa cạn có khoảng 100 giống khác nhau. Đã có nhiều nghiên cứu về

dừa cạn như chọn giống dựa vào hình thái hoặc dựa trên hàm lượng alkaloid,

nghiên cứ u con đườ ng sinh tổ ng hơ ̣p alkaloid, so sánh hàm lươ ̣ng alkaloid giữa lá, rễ, sử du ̣ng dừ a ca ̣n điều chế thuố c chữa bê ̣nh, sử dụng các kỹ thuật

AFLP, RAPD và sử dụng hóa phân loại để nhận dạng dừ a ca ̣n [5], [11], [22].

1.3. GEN LỤC LẠP

Tế bào thực vật bậc cao chứa 3 cơ quan di truyền đó là: nhân, ty thể và lạp

thể. Mỗi cơ quan tử chứa bộ gen riêng của nó. Di truyền gen ty thể và lục lạp

không tuân theo quy luật Menden và thường di truyền theo kiểu đơn bố mẹ

cho thế hệ sau. Hiện tại các nhà khoa học tập trung nghiên cứu lạp thể nhất là

lục lạp. Ris và Plaut (1962) là những người đầu tiên khám phá ra sự có mặt

của DNA trong lục lạp bằng cách quan sát tảo xanh Chlamydomonas

moewusii dưới kính hiển vi. DNA lục lạp có dạng vòng kép, thường có

khoảng 120-170 nghìn bp, chiều dài khoảng 30-60µm, khối lượng khoảng 80-

130000000 dalton [7].

Hầu hết gen lục lạp của thực vật thường tồn tại ở dạng vòng, kép lớn. Nhưng

ở một số loài như tảo dinophyte, hệ gen lục lạp lại được chia thành nhiều

plasmid nhỏ, mỗi plasmid này có từ 2000-10000 bp, nhưng không có DNA mã

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hóa [6]. Bộ gen của lục lạp gồm khoảng 100 gen, ở các loài thực vật trên cạn,

16

trình tự gen gần như là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosome, 30-

31 tRNA, 21 proteins ribosome và 4 RNA polymerase tiểu đơn vị.

Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ được gọi là phần bảo thủ. Phần này chứa

một trình tự các nucleotide bền vững, khó bị các tác nhân lý, hóa học tác động

gây đột biến, do đó đoạn nucleotide này hầu như không bị biến đổi trong quá

trình tiến hóa. Do vậy các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu, sử dụng các

đoạn gen này ở các loài thực vật khác nhau cho công nghệ mã vạch DNA, qua

đó phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen đó để xét mối quan hệ họ hàng

giữa các loài trong sinh giới hiện nay.

Rất nhiều vùng gen trong hệ gen lục lạp đã được sử dụng trong công nghệ

mã vạch DNA như: matK, rpoC1, ... [5].

Maturase K trình tự gen này đã thành công trong việc xác định các loại

thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L

(Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf, R.

officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội bộ loài và

giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định

các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [5], [6].

rpoC1 là gen lu ̣c la ̣p, cấu trú c vò ng kép, bền vững. Chiều dài trung bình 520 bp. Chức năng mã hóa cho enzyme RNA polymerase β – tiểu đơn vị [4],

[8], [11].

Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã thấy rằng trong số

các gen mã vạch, rpoC1 là một ứng cử viên hứa hẹn cho mã vạch DNA thực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vật. Căn cứ mứ c đô ̣ đô ̣t biến trong trình tự nucleotide củ a gen mà có thể xác định đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đố i tươ ̣ng nghiên cứ u [4], [8], [11].

17

Những thay đổi ở DNA lục lạp (cpDNA) đã và đang được sử dụng cho

các nghiên cứu về tiến hóa, sinh thái và phát sinh chủng loại ở thực vật.

CpDNA có mức độ bảo thủ trong việc thay thế cho các nucleotide. Điều này

tạo điều kiện cho sự so sánh những thay đổi ở phạm vi rộng trong phân loại

thực vật. Một số chỉ thị cpDNA như microsatellite lục lạp, một số vùng không

mã hóa, một số phân đoạn của chuỗi đơn lớn (trnC – trnD, trnD – trnT, psaA

– trnS, petB – petD, trnH – psaA, trnD – trnT) và một số vùng đệm giữa các

gen (trnL – trnF) đã được dử dụng trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền

và phát sinh loài ở thực vật [10].

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU, HÓ A CHẤ T VÀ THIẾ T BI ̣

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Mẫu Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don) được thu thập tại hai

tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên. Hai mẫu dừ a ca ̣n hoa màu hồ ng tím (ký hiệu

là TIM_HG) và dừ a ca ̣n hoa màu trắng vàng (ký hiệu là TV_HG) thu ta ̣i Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

18

Giang; hai mẫu dừ a ca ̣n hoa màu hồ ng tím (ký hiệu là TIM_TN) và dừ a ca ̣n hoa trắng đỏ (ký hiệu là TRANG_TN).

2.1.2. Hóa chất, thiết bị và máy móc

Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử như: Tris HCl, EDTA,

phenol, ethanol (100%), agarose... thuộc các hãng: Merck, Sigma, Biolabscasc

của các nước nước Mỹ, Anh, Đức. Ngoài ra còn một số hóa chất khác.

Các thí nghiệm được tiến hành trên các trang thiết bị như bộ nguồn

điện di NanoPAC - 500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver

Scientific, Anh, máy PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800,

Nhật Bản, một số thiết bị khác như lò vi sóng (Electrolux của Việt Nam), tủ

sấy (Nuaire của Mĩ), tủ lạnh -20oC (Panasonic của Nhật Bản), tủ lạnh -85oC

(Nuaire của Mĩ), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử trùng và một số

thiết bị khác.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp thu mẫu

Thu thập mẫu dừa cạn có hoa màu hồng tím và hoa trắng ở khu vực

thành phố Hà Giang và thành phố Thái Nguyên, cây dừa cạn được chọn đều là

các cây khỏe mạnh, hoa đẹp. Tiến hành trồng các cây này ở một địa điểm

thích hợp có cường độ ánh sáng vừa đủ, tưới nước hàng ngày với lượng nước

như nhau. Sau một thời gian, thu hoạch lá non để tiến hành tách DNA. Sau

khi thu, mẫu lá được làm sạch bằng cồn và nước cất sau đó được cho vào túi

nilon, buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm bảo quản ở -80oC để tách chiết

DNA phục vụ nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử

19

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá non của các mẫu giống dừa cạn sử

dụng hóa chất CTAB. Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các

bước như sau:

Bước 1. Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng (– 1960C) thành bột

mịn. Bổ sung vào mẫu 600µl đệm rửa có thành phần (Tris – HCl 100mM, pH

= 8,0; EDTA 5mM, pH = 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350mM; nước). Chia

ra 4 ống Eppendorf 1,5ml. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút

ở 4ºC, bỏ dịch, thu cặn. ( Bước này lặp lại 2 lần).

Bước 2. Thêm vào mỗi ống 500 µl đệm chiết ( bao gồm các thành

phần: Tris – HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 20mM, pH = 8,0; CTAB 4%;

NaCl 1,4M; nước), trộn nhẹ, ủ ở nhiệt độ 65ºC trong vòng 2 giờ (15 phút đảo

nhẹ ống 1 lần). Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

Bước 3. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC. Thu

dịch pha trên chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.

Bước 4. Bổ sung thêm 500µl cloroform : isoamyl alcohol (24 cloroform

: 1 isoamyl alcohol) để loại protein và tạp chất, đảo đều ống trong 15 phút. Li

tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC. Hút cẩn thận 500µl dịch

trong ở pha trên sang ống Eppendorf 1,5µl mới (bỏ tủa). Bước này lặp lại 2 lần.

Bước 5. Thêm 500µl isopropanol, trộn nhẹ, tủa DNA ở -20ºC để qua đêm.

Sau đó li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại dịch thu tủa.

Bước 6. Bổ sung 500µl cồn 70 độ. Li tâm 10 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC,

loại bỏ dịch thu tủa (lặp lại 2-3 lần). Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong 50µl nước cất 2 lần đã khử trùng. Bảo quản ở tủ -200C đến khi sử dụng.

20

2.2.2.2. Phương pháp nhân gen rpoC1 bằng kĩ thuật PCR

Bước 1. Nhân gen rpoC1 bằng kỹ thuật PCR

Tham khảo công bố củ a Peter và cs (2011) và bảng các că ̣p mồi DNA Barcoding [37], că ̣p mồi rpoC1-1F/rpoC1-3R được tổng hơ ̣p có trình tự nucleotide như sau:

rpoC1-1f: 5’-GTGGATACACTTCTTGATAATGG-3’

rpoC1-3r: 5’-TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC-3’

Đoa ̣n gen rpoC1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc

hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r vớ i kích thướ c dự kiến là khoảng 508 nucleotide.

Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng được trình bày

ở bảng 2.1

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1

Thể tích (l) STT Thành phần Nồng độ

1 PCR Masster Mix 2X 7,5

10 pmol/l 2 Mồi xuôi 0,5

10 pmol/l 3 Mồi ngược 0,5

4 DNA khuôn 10ng/μl 0,5

5 Nước khử ion - 6,0

Tổng thể tích 15

Chu trình nhiệt và thời gian hoạt động của máy PCR bao gồm: Biến tính

khởi động ở 94oC trong 4 phút; lặp lại 35 chu kì vớ i (biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 55oC trong 40 giây, tổng hợp và kéo dài ở 72oC trong 40 giây);

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút và bảo quản mẫu ở 4oC.

21

Bước 2. Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Chuẩn bị khuôn đổ gel đã cài sẵn răng lược. Hòa tan 0,8 gam agarose

trong 100ml TAE 1X trong bình thủy tinh chịu nhiệt, đun sôi trong lò vi sóng

khoảng 2 phút sau đó bỏ ra, lắc đều cho agarose tan rồi tiếp tục đun trong lò vi

sóng khoảng 30 giây nữa. Để agarose nguội đến khoảng 60oC thì đổ vào khuôn

đổ gel. Đợi khoảng 15 phút cho gel đông thì bỏ răng lược ra. Đặt bản gel trong

bể điện di, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho đến khi mức đệm cao hơn mặt

gel từ 1 – 2 mm. Trộn 7µl DNA với 4µl dye, tra vào một giếng nhỏ trên gel.

Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110 V trong khoảng 30 phút

Bước 3. Nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh

sáng đèn cực tím.

Lấy bản gel ra khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose

cho vào hộp chứa dung dịch Ethidium bromide. Nhuộm trong 10 phút. Lấy

bản gel ra, rửa bằng cách ngâm trong nước 2 – 3 phút. Đem vào máy quan sát

dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh.

2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi nhân bản được đoạn gen rpoC1, bước tiếp theo cần thu nhận

gen ở dạng tinh sạch.

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification

của hãng Thermo Scientific gồm các bước sau:

Bước 1. Điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống

Eppendorf 1,5ml

Bước 2. Bổ sung dung dịch bám (binding solution), tỉ lệ 3 : 1 về thể tích.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bước 3. Ủ ở nhiệt độ khoảng 50-60oC cho đến khi gel tan hoàn toàn.

22

Bước 4. Hút dịch sang cột thôi gel, li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút

ở 4oC, loại bỏ dịch.

Bước 5. Bổ sung 700 µl dung dịch rửa vào cột, li tâm 12000 vòng/phút

trong 2 phút, bỏ dịch.

Bước 6. Chuyển cột lọc sang ống Eppendort 1,5 ml, để ở nhiệt độ phòng,

mở nắp trong 3 phút cho bay cồn.

Bước 7. Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút ở nhiệt độ phòng, li tâm

12000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ cột, thu dịch đáy được sản phẩm DNA tinh

sạch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%

trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản

sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.

2.2.2.4. Phương pháp xá c đi ̣nh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1

Trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 được xác định bằng máy giải

trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu. Trình tự

gen đó được phân tích, so sánh và lập cây phát sinh chủng loại bằng các

chương trình Bioedit, BLAST, DNAstar.

2.2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Sau khi cây dừ cạn được thu về sẽ tiến hành đo các kích thước như:

chiều cao của cây, kích thước trung bình của rễ, cuống lá, phiến lá, ống tràng,

hoa, quả, đếm số hạt...so sánh giữa các mẫu khác nhau và rút ra nhận xét.

Trình tự nucleotide sau khi được xử lý bằng các phần mềm Bioedit,

BLAST, DNAstar, sẽ tiếp tục lập bảng biểu và nhập các số liệu sau đó nhận

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xét, phân tích và rút ra kết luận.

23

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐI ̣A ĐIỂ M NGHIÊN CỨ U

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016

Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường

Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂ M THỰC VẬT HỌC CỦ A CÁC GIỐNG DỪA CẠN THU

TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN

3.1.1. Đă ̣c điểm chung về hình thá i rễ, thân, hoa, quả và ha ̣t củ a cây dừ a ca ̣n

Cây dừ a ca ̣n là cây thân thảo hoặc cây bụi nhỏ thường xanh, cao tới 1 m,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phân cành nhiều (Hình 3.1).

24

Hình 3.1. Cây dừa cạn hoa trắng đỏ Hà Giang

Hình 3.1 là hình ảnh cây dừ a ca ̣n hoa trắng đỏ thu ta ̣i Hà Giang. Hình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thái rễ, thân, hoa, quả và hạt của cây dừ a ca ̣n đươ ̣c mô tả ở hình 3.2.

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.2. Các bô ̣ phâ ̣n của cây dừa cạn

26

1-Rễ; 2-thân; 3-cách sắp xếp lá; 4-lá; 5-cụm hoa; 6-ống tràng; 7-tiền khai hoa;

8-lá noãn; 9-nhị; 10-hạt phấn; 11-đĩa mật; 12-hoa; 13-quả; 14-hạt.

Rễ cây dừa cạn rất phát triển, rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ

phụ, rễ cong queo hoặc thẳng, dài 10 – 20 cm, đường kính 1 - 2 cm, phía trên

có đoạn gốc thân dài 3 – 5 cm, phía dưới có nhiều rễ con nhỏ, mặt ngoài hơi

nhẵn, có màu nâu vàng, rễ cứng khó bẻ, mặt cắt ngang có màu trắng ngà,

không mùi, vị đắng, rễ cái đâm thẳng xuống đất có thể đạt chiều dài 35 - 40

cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa, ngắn, phát triển theo chiều ngang. Thân gỗ

ở phía gốc, mặt cắt ngang có hình tròn, mềm ở phần trên, mặt cắt ngang có

hình vuông do trên thân non có bốn đường gân chạy dọc thân, các đường gân

hơi vặn theo chiều kim đồng hồ, thân nhẵn hoặc có lông ngắn tùy loài, thân

non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím hoặc xanh phớt hồng

mọc thành bụi dày, thân mềm tẽ nhiều cành nên cây thường nghiêng về một

phía. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, thuôn dài, đầu lá hơi

nhọn, phía cuống hẹp nhọn, dài 3 - 8cm, rộng 1 - 2,5cm, xanh bóng, không

lông hoặc có lông ngắn tùy loài, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, gân lá hình lông

chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên,

gân lá nhạt màu hơn phiến lá và cuống lá ngắn (dài 1 – 1,8 cm). Cụm hoa, hai

hoa ở kẽ lá, hoa đều, lưỡng tính, hoa mẫu 5, cuống hoa dài 4 - 5 mm, hoa có

màu từ trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu đỏ hơn, mùi thơm, hoa mọc

riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5

thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4 mm. Cánh hoa 5,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4 cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có

27

5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, …ở mặt trên, mặt

dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7 cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu

khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa

màu hồng tím). Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị 5, rời, dính ở

phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi

tên, 2 ô, hướng trong, khai dọc, dính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu

nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn 2, rời ở bầu nhưng

dính ở vòi và đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều

noãn, đính noãn mép, bầu trên. Vòi nhụy 1, dài bằng ống tràng, dạng sợi màu

trắng. Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng

mỏng màu vàng, đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn.

Quả có 2 đại hơi choãi ra, thường tập trung ở phần ngọn, quả dài 2 - 4cm, rộng

2 - 3mm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả

hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có

các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm [1], [22].

3.1.2. Đặc điểm khá c biê ̣t về hình thá i giữa ba giố ng dừ a ca ̣n

Đặc điểm khác biê ̣t giữa ba giố ng dừ a ca ̣n (dừa cạn hoa hồng tím, dừa

cạn hoa trắng đỏ, dừa cạn hoa trắng vàng đươ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.3). Kết quả

phân tích cho thấy, phần lớn các giống dừa cạn có đặc điểm hình thái tương

tự nhau, chỉ khác nhau ở một vài đă ̣c điểm hình thái chi tiết nhỏ. Giố ng dừa

cạn hoa hồng tím và giố ng hoa trắng đỏ có thân cây và gân lá màu xanh phớt

hồng, trong khi giố ng dừa cạn hoa màu trắng vàng có thân cây và gân lá có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

màu xanh nhạt. Sự khác biê ̣t rõ nhất thể hiê ̣n ở màu sắc hoa. Giố ng dừa cạn

28

hoa hồng tím có cánh hoa màu hồng tím (Hình 3.3A), giố ng dừa cạn hoa

trắng đỏ có cánh hoa màu trắng, phía tâm hoa màu đỏ (Hình 3.3B) và dừa cạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hoa trắng vàng có cánh hoa màu trắng và phía tâm hoa màu vàng (Hình 3.3C).

29

Hình 3.3. Đặc điểm khác nhau về hình thái giữa ba giống dừ a ca ̣n

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1A, 2A, 3A, 4A: dừ a ca ̣n hoa hồ ng tím; 1B, 2B, 3B, 4B: dừ a ca ̣n hoa trắng đỏ ; 1C, 2C, 3C, 4C: dừ a ca ̣n hoa trắng vàng.

30

3.2. PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN

3.2.1. Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn

DNA tổng số đươ ̣c tách chiết từ các mẫu lá của cây dừa cạn thu đươ ̣c từ

Hà Giang và thái Nguyên bằng CTAB 2%, kết quả kiểm tra sản phẩm bằng

điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại

(UV) và chụp ảnh.

Hình 3.4. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số

(1: TIM_HG ; 2: TV_HG; 3: TIM_TN; 4: TRANG_TN )

Hình 3.4 cho thấy kết quả điện di ở cả 4 mẫu lá dừa ca ̣n đều thu đươ ̣c

băng DNA, chất lươ ̣ng các mẫu DNA tổ ng số đều đảm bảo cho phản ứ ng nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2.2. Khuếch đại đoạn gen rpoC1 bằng phản ứng PCR

31

DNA tổng số đươ ̣c tách chiết từ mẫu lá dừa cạn được sử dụng làm

khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r, kết quả

kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng thang DNA

chuẩn 1 kb được thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen rpoC1

M: thang DNA 1kb; 1- TIM_HG, 2- TV_HG; 3- TIM_TN; 4- TRANG_TN

Hình 3.5 cho thấy sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm đều thu

được một băng DNA sáng rõ nét, có kích thước khoảng 500 bp phù hợp với

kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gen rpoC1 như dự kiến. Kết quả điện di cũng cho thấy, không có băng DNA phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn PCR

nhân bản đoạn gen rpoC1 là đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp các sản phẩm

này để xác định trình trình tự nucleotide.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2.3. Kết quả xác định trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừ a ca ̣n

32

Sau khi khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Gen JET

PCR Purification của hãng Thermo Scientific sau đó được xác định trình tự

trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer,

sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Kết quả xác

định trình tự đoạn rpoC1 từ các mẫu dừ a ca ̣n TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN thu ta ̣i Hà Giang và Thái Nguyên đươ ̣c trình bày ở hình 3.6.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6. Trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen

33

Kết quả so sánh trình tự nucleotid bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.6 cho

thấy, gen rpoC1 phân lâ ̣p từ bốn mẫu TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN đều có kích thướ c 505 bp. Trong đó, đoạn gen rpoC1 từ mẫu TIM_HG và TIM_TN đều có 139 base loại A, 161 base loại T, 84 base loại C,

121 base loại G. Đoạn gen rpoC1 từ mẫu TV_HG có 139 base loại A, 161 base

loại T, 84 base loại C và 121 base loại G. Đoạn gen rpoC1 từ mẫu TRANG_TN

có 138 base loại A, 162 base loại T, 84 base loại C và 121 base loại G.

Phân tích bằng BLAST trong NCBI cho kết quả trình tự gen rpoC1

phân lập từ bốn mẫu dừ a ca ̣n hoa hồ ng tím, hoa trắng vàng và hoa trắng đỏ có

đô ̣ tương đồ ng với trình tự gen rpoC1 mang mã số KC561139 và JN115007

trên Ngân hàng Gen là 99%. Kết quả phân tích bằng BLAST đã khẳng đi ̣nh

đoa ̣n gen phân lâ ̣p từ bố n mẫu dừ a ca ̣n ở trên là gen rpoC1. Như vậy, chúng

tôi đã nhân bản thành công và giải trình tự đoạn gen rpoC1 phân lâ ̣p từ 4 mẫu

dừa ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN thu ta ̣i hai tỉnh Hà Giang

và Thái Nguyên.

Kết quả so sánh trình tự đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ bố n mẫu dừ a ca ̣n

cho thấy, ba đoạn gen rpoC1 ở các mẫu TIM_HG, TV_HG và KC561139 trên

Ngân hàng Gen có độ tương đồng với nhau đạt 100%; tương đồ ng so vớ i trình

tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 của mẫu dừa cạn TIM_TN là 99,6%, với

TRANG_TN là 99,4%. Trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 phân lâ ̣p từ

mẫu dừ a ca ̣n TIM_TN và TRANG_TN thu ta ̣i Thái Nguyên tương đồng với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhau là 99,8%.

34

Tuy nhiên, trình tự nucleotide củ a gen rpoC1 phân lập từ mẫu TIM_TN

có sự sai khác so với trình tự mang mã số KC561139, JK115007 ở hai vị trí

nucleotide (495 và 496), gen rpoC1 củ a mẫu TRANG_TN có sự sai khác so với

trình tự mang mã số KC561139 ở 3 vị trí nucleotide (494, 495 và 496); trình tự

nucleotide củ a gen rpoC1 ở hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN khác nhau ở 1

nucleotide (494), sự sai khác về trình tự nucleotide được tóm tắt ở bảng 3.1.

Sự sai khác về trình tự nucleotid giữa các giống dừa cạn là thông tin rất

quan trọng để xây dựng mã vạch DNA cho các giống dừa cạn khác nhau.

Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa các trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1

494 495 496 Vi ̣ trí

KC561139 T G A

JK115007 T G A

TIM_HG T G A

TIM_TN G T A

TRANG_TN G T T

TV_HG T G A

Tiếp tu ̣c phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự đoa ̣n gen rpoC1 củ a bốn mẫu dừ a ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN vớ i protein suy diễn từ hai trình tự gen mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng gen quốc tế, kết quả đươ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.7. Kết quả cho thấy gen rpoC1 đều có 168 amino acid. So vớ i protein suy diễn từ trình tự gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

35

mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng gen với trình tự amino acid suy diễn củ a mẫu TIM_HG và mẫu TV_HG đều có đô ̣ tương đồ ng

100%; và có độ tương đồ ng với hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN là 99,4%;

độ tương đồng giữa hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN là 99,4%.

Tuy nhiên các trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1 biểu hiện sự khác nhau ở mô ̣t amino acid. Trình tự amino acid suy diễn từ gen rpoC1 phân

lâ ̣p từ các mẫu TIM_HG và TV_HG, JN115007 và KC561139 là methionine ở vị trí amino acid thứ 165, còn ở mẫu TIM_TN là serine, ở mẫu

TRANG_TN là cysteine (Bảng 3.2).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn củ a đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen

36

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa các trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1

Vị trí 165

KC561139 M

JN115007 M

TIM_HG M

TIM_TN S

TRANG_TN C

TV_HG M

3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁ C MẪ U DỪ A CẠN DỰA TRÊN

TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN

CỦ A ĐOẠN GEN rpoC1

Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 mẫu

TIM_HG, TV_HG, TIM_TN và TRANG_TN ở Việt Nam với 2 trình tự gen đã

công bố trên Ngân hàng gen quốc tế để xác định hệ số tương đồng và hệ số sai

khác của các trình tự đoạn gen rpoC1, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây để

phân tích sự đa dạng của các mẫu dừa cạn thông qua trình tự đoạn gen rpoC1.

Bảng 3.3. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn

37

Trong các trình tự đoạn gen rpoC1 của dừa cạn được sử dụng để so

sánh có 4 mẫu phân lập từ Hà Giang và Thái Nguyên, 2 mẫu từ Ngân hàng

gen mang mã số KC561139 và JN115007. Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy hệ số

tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 99,4% đến 100%; còn hệ số sai

khác từ 0,0% đến 0,6%.

Mối quan hệ di truyền của 6 mẫu dừa cạn trên cơ sở phân tích gen

rpoC1 được thể hiện ở sơ đồ hình cây trên hình 3.8. Sơ đồ hình cây ở hình 3.8

dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 cho thấy 6

mẫu dừa cạn được phân thành hai nhánh chính, nhánh thứ nhất gồm 4 mẫu

chia thành hai nhánh phụ, nhánh phụ 1 gồm 3 mẫu: TV_HG, TIM_HG, và

TIM_TN; nhóm phụ 2 gồm 1 mẫu là TRANG_TN. Nhánh phụ thứ hai lại chia

thành 2 nhóm nhỏ: nhóm nhỏ 1 gồm 2 mẫu là TV_HG và TIM_HG; nhóm

nhỏ 2 gồm 1 mẫu TIM_TN. Nhóm II gồm 2 mẫu, phân thành 2 nhóm phụ:

nhóm phụ là JN115007 và nhóm phụ 2 là KC561139. Khoảng cách di truyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giữa hai nhánh là 5,4%.

38

Hình 3.8. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của 6 mẫu dừa cạn

Như vậy, bốn mẫu dừa cạn mà chúng tôi nghiên cứu thuộc cùng một nhánh

chính thứ nhất nhưng ở hai nhánh phụ khác nhau; ba giống TV_HG, TIM_HG và

TIM_TN thuộc cùng nhóm, còn giống TRANG_TN thuộc nhóm cò n la ̣i.

Tiếp tục phân tích mối quan hệ của bốn mẫu dừa cạn dựa trên trình tự

amino acid suy diễn, kết quả thể hiện ở bảng 3.4. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, các

mẫu dừa cạn so sánh có hệ số tương đồng về trình tự amino acid suy diễn là rất

cao, dao động từ 99,4% đến 100%, hệ số sai khác dao động từ 0,0% đến 0,6%.

Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

củ a gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn

39

Hình 3.9 trình bày mối quan hê ̣ di truyền giữa các mẫu dừa ca ̣n dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1. Khoảng cách di truyền được xác định trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoc1 giữa 6 mẫu dừa cạn là 5,4% (Hình 3.8), còn dựa trên trình tự amino acid suy diễn thì khoảng cách di truyền giữa các mẫu lại rất thấp, chỉ có 0,4% (Hình 3.9).

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng dựa trên trình tự amino acid suy diễn của 6 mẫu dừa cạn.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

40

1. Kết luâ ̣n

1.1. Bố n mẫu dừa cạn thu ở Hà Giang và Thái Nguyên thuộc ba giống dừa

cạn hoa hồng tím, hoa trắng vàng và hoa trắng đỏ. Các giố ng dừ a ca ̣n nghiên

cứu có thân thảo mọc đứng, rễ chùm, các rễ màu nâu nhạt dần về phía chóp

rễ; lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng; hoa lưỡng tính. Ba giống dừa ca ̣n khác nhau về mô ̣t số đă ̣c điểm hình thái và sự khác biê ̣t rõ nhất là màu sắc hoa.

1.2. Đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu dừ a ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN thu ta ̣i Hà Giang và Thái Nguyên đã được nhân bản và xác định được trình tự nucleotide. Đoa ̣n gen rpoC1 của cả bốn mẫu dừa cạn có kích thướ c 505 nucleotide, mã hóa 168 amino acid. Hệ số tương đồng về trình tự

nucleotide của đoạn gen rpoC1 giữa mẫu dừa cạn TIM_HG, TIM_TN,

TV_HG, TRANG_TN từ 96,6% đến 100%; còn về trình tự amino acid suy

diễn là 99,4% đến 100%.

1.3. Khoảng cách di truyền giữa 4 mẫu dừ a ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN dựa trên trình tự nucleotide là 5,4%, dựa trên trình tự amino acid suy diễn là 0,4%.

2. Đề nghi ̣

Cần tiếp tục phân tích trình tự nucleotide củ a các gen phân loại khác nhe gen matK, ITS, … làm cơ sở phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dừa cạn.

41

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Hoàng Phú Hiê ̣p, Bù i Thị Hà, Trần Đứ c Cườ ng, Đinh Anh Tuấn, Nguyễn Thi ̣ Tâm, Chu Hoàng Mâ ̣u (2016), “Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu

dừa cạn (Cantharanthus roseus) dựa trên trình tự gen rpoc1 phân lập từ hệ

gen lục lạp”, Bá o cá o khoa học về nghiên cứ u và giả ng dạy sinh học ở Viê ̣t

Nam. Hô ̣i nghi ̣ khoa ho ̣c quố c gia lần thứ 2, 5/2016. Nxb Đa ̣i ho ̣c Quố c

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Gia Hà Nô ̣i, tr 326-331. ISBN: 978-604-62-5440-9.

42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Viện dược liệu (2001), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập

1, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tr. 57-89.

2. Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận, Vương Chí Hùng, Nguyễn Tiến Hùng

(2009), Study on the dynamic variation of 10-DAB and taxol contents of

Taxus wallichiana needles cultivated in Lam Dong province. PHARMA

INDOCHINA VI. The development of indochina pharmacy in the

context of global economic recession. 15-18/12/2009, tr.621-624.

3. Trần Văn Thanh (2002), Nghiên cứu chiết xuất Ajmalicin từ rễ dừa cạn

(Catharanthus roseus (L.) G. Don), Luận án tiến sĩ dược học, Đại học

dược Hà Nội.

Tiếng Anh

4. Germán S and Pal M. (1998), “RNA Polymerase Subunits Encoded by

the Plastid rpo Genes Are Not Shared with the Nucleus-Encoded Plastid

Enzyme”. Plant Physiol. 117(4), pp. 1165–1170.

5. Hollingsworth PM, Graham SW, Little DP. (2011), “Choosing and using

a plant DNA barcode”, PloS one. 6(5):e19254. doi: 10.1371/journal.

pone.0019254.

6. Paul DN Hebert, Alina C, Shelley LB and Jeremy RW (2003).

“Biological identifications through DNA barcodes”. Proc. R. Soc. Lond.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

B (270, pp. 313–321; DOI 10.1098/rspb.2002.2218.

43

7. Sandelius, Anna Stina, Aronsson, Henrik (2009). The Chloroplast:

Interactions with the Environment. Springer. pp. 18. ISBN 978-3-540-

68696-5.

8. Samigullin TK, Martin WF, Troitsky AV, Antonov AS. (1999),

“Molecular data from the chloroplast rpoC1 gene suggest a deep and

distinct dichotomy of contemporary spermatophytes into two

monophyla: gymnosperms (including Gnetales) and angiosperms”. J Mol

Evol. 49(3), pp. 310-315.

9. Guggisberg A., Hesse M. (2007), Alkaloids, The University of Zurich.

10. Wouter G van Doorn (2009), Role of chloroplasts and other plastids in

ageing and death of plants and animals: a tale of Vishnu and Shiva.

Ageing research reviews 9 (2), pp. 117-130. DOI: 10.1016/j.arr.

2009.08.003

11. ParveenI, Singh H.K, Raghuvanshi S and Babbar SB (2013),

“Catharanthus roseus voucher SBB-1090 RNA polymerase beta' subunit

(rpoC1) gene”, partial cds; chloroplast. GenBank: JN115007.1.

12. Blasko G, Cordell GA (1990) Isolation, structure elucidation, and

biosynthesis of the bisindole alkaloids of Catharanthus. In: Brossi A,

Suffness M, editors. The alkaloids. San Diego, CA: Academic Press. pp.1–

76.

13. Facchini PJ, De Luca V (2008), “Opium poppy and Madagascar

periwincle: model non-model systems to investigate alkaloid

biosynthesis in plants”, Plant J. 54, pp. 763–784.

14. Guimaraes G, Cardoso L, Oliveira H, Santos C, Duarte P, et al. (2012),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

“Cytogenetic characterization and genome size of the medicinal plant

44

Catharanthus roseus (L.) G. Don”. AoB Plants doi:10.1093/aobpla/

pls002.

15. Kim S, Ban S, Jeong S-C, Chung H-J, Ko S et al. (2007), “Genetic

discrimination between Catharanthus roseus cultivars by metabolic

fingerprinting using1H NMR spectra of aromatic compounds”,

Biotechnol Bioprocess Eng. 12, pp. 646-652. doi:10.1007/BF02931081.

16. Kim S, Kim J, Liu J (2009), “The Complete Plastid Genome Sequence of

Madagascar Periwinkle Catharanthus roseus (L.) G. Don: Plastid

Genome Evolution, Molecular Marker Identification, and Phylogenetic

Implications in Asterids”, J Plant Biol 52, pp. 462-465. doi:10.1007

/s12374-009-9059-1.

17. Kool A, de Boer HJ, Krüger Å, Rydberg A, Abbad A, Björk L, et al.

(2012), “Molecular Identification of Commercialized Medicinal Plants in

Southern Morocco” PLoS ONE 7(6), pp. 39459. doi:10.1371/journal.

pone.0039459.

18. Magnotta M, Murata J, Chen JV, De LV (2006), “Identification of a low

vindoline accumulating cultivar of Catharanthus roseus (L.) G. Don by

alkaloid and enzymatic profiling”. Phytochemistry 67, pp. 1758–1764.

19. Nammi S, Boini MK, Lodagala SD, Behara RB (2003). “The Juice of

fresh leaves of Catharanthus roseus Linn reduces blood glucose in normal

and alloxan diabetic rabbits”. BMC Compliment Altern Med. PMID:

12950994; PMCID: PMC194756; DOI: 10.1186/1472-6882-3-4.

20. Rischer H, Oresic M, Seppanen-Laakso T, Katajamaa M, Lammertyn F,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

et al. (2006), “Gene-to-metabolite networks for terpenoid indole alkaloid

45

biosynthesis in Catharanthus roseus cells”. Proc Natl Acad Sci USA

103, pp. 5614–5619.

21. Shukla AK, Shasany AK, Gupta MM, Khanuja SPS (2006).

“Transcriptome analysis in Catharanthus roseus leaves and roots for

comparative terpenoid indole alkaloid profiles”. J Exp Bot. 57, pp. 3921–

3932.

22. Pahwa D. (2008), Catharanthus alkaloids. B. Pharm Punjab University

Chandigarh 19(1), pp. 52 – 63.

23. Svoboda GH, Blake DA (1975). The phytochemistry and pharmacology

of Catharanthus roseus (L) G. In: Taylor WI, Farnsworth NR, editors.

The catharanthus alkaloids. New York, NY: Marcel Dekker, pp. 45–83.

24. Manske RHF (1965), The alkaloid, Chemistry and physiology 8, pp 1-

861. Academic Press New York, London; ISBN: 978-0-12-469517-7.

25. Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular Cloning: A laboratory

Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

26. Sottomayor M, Lopes CI, Pereira LG, Ros BA (2004), “Peroxidase and

the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal

plant Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Phytochem Rev. 3, pp. 159–171.

27. Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994), “The production

of imperatorin from Angelica dahurica var. formosana by cell suspesion

culture”, J Agric Assoc China 168, pp. 32-48.

28. Vander HR, Jabos D, Snoeijer W, Hallard D, Verpoorte R (2004), “The

Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology”, Curr Med

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chem. 11, pp. 607–628.

46

29. Verpoorte R, Van der Heijden R, Moreno PRH. (1997), Biosynthesis of

terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus cells, The Alkaloids.

G.A. Cordell (Editor) Academic Press, pp. 221–299.

30. Woerdenbag HJ, Van Uden W, Frijlink HW, Lerk CF., Pras N, and

Malingre TM. (1990), “Increased podophyllotoxin production in

Podophyllum hexandrum cell suspension cultures after -cyclodextrin

complex”, Plant Cell Rep 9, pp. 97-100.

31. Yamada Y, and Sato F. (1981). “Production of berberine in cultured of

Coptis japonica”, Phytochemistry 20, pp. 545-547.

32. Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS. (1994), “Tissue

culture of Dioscorea doryophora Hance.II. Estabilshment of suspension

culture and the measurement of diosgenin content”, Chinese Agronomy

Journal 4, pp. 257-268.

33. Yoshida K., Kaothien P., Matsui T., Kawaoka A., Shinmyo A. (2003),

“Molecular biology and application of plant peroxidase genes”, Appl

Microbiol Biotechnol. 60(6), pp. 665-670.

34. Zhao J., Verpoorte R. (2007), “Manipulating indole alkaloid production

by Catharanthus roseus cell cultures in bioreactors: from biochemical

processing to metabolic engineering”, Phytochem Rev. 6, pp. 435–457.

Trang web

35. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC561139

36. http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

37. http://www.kew.org/barcoding/protocols.html

47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn