Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học của fucoidan được phân lập từ Rong nâu Sargassum mcclurei theo các phương pháp chiết khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------------

Nguyễn Trần Bảo Huy ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI THEO CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT KHÁC NHAU

Chuyên ngành: Mã số: Hoá phân tích 8 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân

TS. Phạm Đức Thịnh

Hà Nội - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh và PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân. Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực. Những kết luận khoa học của luận văn là chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.

Nha Trang - 2021

Tác giả

Nguyễn Trần Bảo Huy

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ quý báu của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp.

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Phạm Đức Thịnh và PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Cao Thị Thúy Hằng; ThS. Đinh Thành Trung và CN. Nguyễn Thị Khánh Vy đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các quý thầy cô, anh chị học viên cao học các lớp CHE18 và CHE19 đang công tác và học tập tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công

nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang và Ban lãnh đạo Khoa Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận văn và các thủ tục cần thiết.

Tôi cũng xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, Ban lãnh đạo trường THPT Lý Tự Trọng, các anh chị em đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện trong công việc, động viên và trợ giúp tôi để tôi dành thời gian chuyên tâm học tập và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Nha Trang - 2021

Tác giả Luận văn

Nguyễn Trần Bảo Huy

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

NMR

Phổ hồng ngoại

IR

Infrared Spectroscopy desorption/ionization

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC

Chromatography

Cell Survival

Tế bào sống sót

CS

Nồng độ ức chế 50%

Inhibitory Concentration 50%

IC50

tăng trưởng của đối tượng thử

Methanol

MeOH

Ethanol

EtOH

Trifluoroacetic acid

Axit trifluoroacetic

TFA

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

DPPH

Mannose

Đường mannose

Man

Fucose

Đường fucose

Fuc

Galactose

Đường galactose

Gal

Glucose

Đường glucose

Gluc

Xylose

Đường xylose

Xyl

Glucuronic Acid

Axit glucuronic

GluA

Mannuronic Acid

Axit mannuronic

ManA

Guluronic Acid

Axit guluronic

GuluA

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. 1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu .......... 10

Hình 1. 2. Phân tử Alginic acid ....................................................................... 12

Hình 1. 3. Cấu trúc của Laminaran ................................................................. 13

Hình 1. 4. Một đoạn cấu trúc Fucoidan........................................................... 13

Hình 1. 5. Cấu trúc của fucoidan có sunfat ở vị trí C-4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome được mô tả vào năm 1991 ......................................... 17

Hình 1. 6. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus .............................................. 18

Hình 1. 7. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum .......................... 30

Hình 1. 8. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết từ rong T. decurrens. .......... 32

Hình 1. 9. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium .. 34

Hình 2. 1. Rong khô S. mcclurei ..................................................................... 36

Hình 2. 2. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng . ......................... 38

Hình 2. 3. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) ........................................................................................... 39

Hình 2. 4. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch CaCl2 2% ........ 40

Hình 2. 5. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme .............. 41

Hình 2. 6. Cơ chế hòa tan xenlulose của BmimCl .......................................... 41

Hình 2. 7. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion . ..................... 42

Hình 3. 2. Mô hình cấu trúc thành tế bào của rong nâu ................................. 50

Hình 3. 3. Hình điện di C-PAGE của fucoidan chiết bằng các phương pháp chiết khác nhau. ............................................................................................... 53

Hình 3. 4. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN1 ....... 62

Hình 3. 5. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN2 ....... 63

Hình 3. 6. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN3 ....... 64

Hình 3. 7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN4 ....... 65

Hình 3. 8. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN5 ....... 65

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. 1. Thành phần hóa học của một số loài rong ..................................... 11

Bảng 1. 2. Thành phần hóa học của một số fucoidan .................................... 16

Bảng 1. 3. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu ......... 26

Bảng 1. 4. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam .............................................. 32

Bảng 1. 5. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. .................................... 33

Bảng 2. 1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại ........... 45

Bảng 3. 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong nguyên liệu ........ 49

Bảng 3. 2. Hiệu suất thu nhận fucoidan từ các phương pháp chiết ............... 52

Bảng 3. 3. Hàm lượng fucoidan thu nhận từ các loài rong ............................. 55

Bảng 3. 4. Thành phần hóa học fucoidan thu nhận được................................ 56

Bảng 3. 5. Nhận xét các chỉ số thành phần hóa học fucoidan thu nhận được 57

Bảng 3. 6. Thành phần đường đơn của fucoidan thu nhận được .................... 58

Bảng 3. 7. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các mẫu ............................ 61

Bảng 3. 8. Hàm lượng hoạt tính oxy hóa tổng fucoidan thu nhận được ......... 67

Bảng 3. 9. Khả năng bắt gốc DPPH của fucoidan chiết từ rong nâu .............. 68

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Đường chuẩn carbohydrate tổng số ............................................... 79

Phụ lục 2. Đường chuẩn Fucose...................................................................... 80

Phụ lục 3. Đường chuẩn Galactose ................................................................. 81

Phụ lục 4. Đường chuẩn Glucose .................................................................... 82

Phụ lục 5. Đường chuẩn Sulfate...................................................................... 83

Phụ lục 6. Đường chuẩn Uronic acid .............................................................. 84

Phụ lục 7. Đường chuẩn Poly phenol .............................................................. 85

Phụ lục 8. Đường chuẩn Protein ..................................................................... 86

Phụ lục 9. Đường chuẩn Hoạt tính chống oxy hóa tổng số ............................ 87

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 8

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN ............................................................... 8

1.1.1. Giới thiệu rong biển .......................................................................... 8

1.1.2. Giới thiệu rong nâu ........................................................................... 8

1.1.3. Một số thành phần hóa học trong rong nâu ................................. 10

1.1.3.1. Polysaccharide ........................................................................... 12

1.1.3.2. Hợp chất Phenolic ..................................................................... 14

1.1.3.3. Hợp chất Carotenoid ................................................................. 14

1.1.3.4. Hợp chất Terpenoid ................................................................... 14

1.1.3.5. Protein ........................................................................................ 14

1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN .............................................................. 15

1.2.1. Thành phần hóa học của fucoidan ................................................ 15

1.2.2. Đa dạng cấu trúc của fucoidan ...................................................... 16

1.2.3. Hoạt tính sinh học của fucoidan .................................................... 18

1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus ...................................... 18

1.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa ............................................................ 19

1.2.3.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch .................................. 19

1.2.3.4. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối ................... 20

1.2.3.5. Chống lại các bệnh về gan ......................................................... 21

1.2.3.6. Giảm lipid máu........................................................................... 21

1.2.4. Ứng dụng của fucoidan ................................................................... 22

1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN .......... 23

1.3.1. Phương pháp chiết fucoidan trong axit pH 2-3 ............................ 23

1.3.2. Phương pháp chiết fucoidan trong nước nóng ............................. 23

1.3.3. Phương pháp chiết fucoidan trong dung dịch CaCl2 2% ........... 23

1.3.4. Phương pháp chiết fucoidan bằng ethanol ................................... 24

1.3.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion .......................... 24

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ..................................................................................................... 26

1.4.1 Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới ................................. 26

1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam ................................. 28

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .......................................................................... 35

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 35

2.1.1. Rong nâu Sargassum mcclurei ....................................................... 35

2.1.2. Chuẩn bị hóa chất và thiết bị ......................................................... 36

2.1.2.1. Hóa chất ..................................................................................... 36

2.1.2.2. Thiết bị ....................................................................................... 37

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 37

2.2.1. Phương pháp chiết fucoidan .......................................................... 37

2.2.1.1. Phương pháp chiết fucoidan bằng nước nóng ........................... 37

2.2.1.2. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch HCl (pH:2-3) ..... 38

2.2.1.3. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2% ........... 39

2.2.1.4. Phương pháp chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme .............. 40

2.2.1.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion ....................... 41

2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan .......... 42

2.2.2.1. Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate ............. 42

2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần đường đơn ........................ 43

2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate ................................ 43

2.2.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng uronic acid ........................ 43

2.2.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng polyphenol ........................ 44

2.2.2.6. Phương pháp phân tích hàm lượng protein ............................... 44

2.2.2.7. Phương pháp phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan 44

2.2.2.8. Phương pháp điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide .. 45

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan ........... 46

2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính oxy hóa tổng số ..................... 46

2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH. ..... 46

2.3. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 47

2.3.1. Thu thập và xử lý rong nâu Sargassum mcclurei ......................... 47

2.3.2. Chiết fucoidan trong rong nâu Sargassum mcclurei .................... 47

2.3.3. Xác định thành phần hóa học của fucoidan ................................. 48

2.3.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan .......................... 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 49

3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ............................................................. 49

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RONG NGUYÊN LIỆU ...... 49

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG SARGASSUM MCCLUREI BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU .... 51

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI .................................................................... 55

3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN VỊ TRÍ CỦA NHÓM SULFATE TRÊN FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI ....................................................... 60

3.6. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI ............................................................................. 67

3.6.1. Đánh giá hàm lượng hoạt tính oxy hóa tổng số ............................ 67

3.6.2. Đánh giá kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH ....... 67

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 70

4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 70

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 71

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 79

MỞ ĐẦU

Rong biển là nguồn cung cấp polysaccharide sulfate đa dạng và phong phú nhất, bao gồm sulfate galactan từ rong đỏ (Rhodophyta), ulvan từ rong xanh (Chlorophyta), fucoidan từ rong nâu (Phaeophyta)[1]. Trong số polysaccharide sulfate kể trên thì fucoidan sở hữu nhiều nhiều hoạt tính sinh học quý được ghi nhận như: hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối, chống virus, chống bổ thể, chống ung thư, chống viêm, giảm lipid máu và điều biến miễn dịch,…[2] Vì vậy, fucoidan thực sự trở thành một đối tượng được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu với tiềm năng rất lớn cho các ứng dụng làm thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và làm thuốc [3][4].

Fucoidan nằm trong thành tế bào rong nâu, chúng liên kết chặt chẽ với các microfibrils cellulose và tạo liên kết với cặp cellulose và hemicellulose, ngoài ra fucoidan còn tạo liên kết cộng hóa trị với hợp chất phenolic và liên kết với protein. Tất cả các liên kết trên được bó chặt bởi các phức hình thành bởi các polyme như alginate - protein và phlorotannin. Vì vậy, để thu nhận fucoidan có thể sử dụng nhiều phương pháp chiết khác nhau nhằm mục đích phá vỡ các liên kết không bền của fucoidan trong thành tế bào và thu được fucoidan trong dung dịch chiết. Điều thú vị là thành phần hóa học của fucoidan như carbohydrate, sulfate, uronic acid và tỷ lệ các thành phần đường thay đổi tuỳ theo phương pháp chiết và sự thay đổi này ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chúng. Ngoài ra, hoạt tính sinh học của fucoidan cũng đã được chứng minh phụ thuộc vào khối lượng phân tử, cấu trúc hóa học của chúng [5][6][7][8]. Do đó, mục đích khi chiết fucoidan là cần phải giữ được cấu trúc hóa học để bảo tồn hoạt tính sinh học của fucoidan.

Mặc dù đã có nhiều công trình công bố về quy trình chiết, cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của fucoidan chiết từ các loài rong nâu sinh trưởng tại các vùng khác nhau trên thế giới. Tuy nhiên, có rất ít công trình nghiên cứu sự ảnh hưởng của phương pháp chiết lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của fucoidan [9][10].

Ở Việt Nam, nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú, tính đến năm 2015, có khoảng hơn 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó riêng chi Sargassum chiếm khoảng hơn 60 loài, đây được coi là tiềm năng rất lớn cho các nghiên cứu về fucoidan theo hướng phát triển thành các sản phẩm có giá trị cao ứng dụng trong lĩnh vực y dược. Chính vì những lợi ích quý giá và điều kiện thuận lợi về vùng nguyên liệu mà fucoidan đã được quan tâm nghiên cứu ở Việt Nam trong hơn một thập kỷ qua, các kết quả mà các nhà khoa học trong nước thu được là rất có ý nghĩa, bước đầu đã đưa được sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam vào phục vụ cuộc sống. Mặc dù vậy, để có thể khai thác một cách hiệu quả nguồn lợi rong biển cần có nghiên cứu định hướng cho việc ứng dụng cho việc chiết để thu nhận được sản phẩm fucoidan có hoạt tính [11][12][13][14].

Vì vậy, tôi chọn đề tài "Đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học

của fucoidan được phân lập từ rong nâu Sargassum mcclurei theo các phương pháp chiết khác nhau" nhằm đóng góp thêm những nghiên cứu về fucoidan trong rong nâu của Việt Nam, đồng thời có được một cái nhìn tổng quát hơn, tạo tiền đề cho các nhà nghiên cứu tiếp sau tuỳ vào mục đích tạo ra các fucoidan có hoạt tính sinh học nhất định mà có thể lựa chọn được phương pháp chiết phù hợp, qua đó nâng cao giá trị của fucoidan trong đời sống và sản xuất.

Mục tiêu của đề tài:

- Mục tiêu tổng quát: Đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp chiết lên sự biến đổi thành phần hóa học và cấu trúc của fucoidan, qua đó làm cơ sở cho việc lựa chọn phương pháp chiết phù hợp cho mỗi mục đích thu nhận fucoidan khác nhau.

- Mục tiêu cụ thể: Đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học (hàm lượng sulfate, uronic acid, tổng carbohydrate) và đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu S. mcclurei được thu nhận bằng các phương pháp chiết khác nhau.

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei theo một số phương pháp chiết như: Chiết bằng nước nóng, chiết trong môi trường axit loãng (pH 2-3), chiết bằng dung dịch 2% CaCl2, chiết bằng chất lỏng ion và chiết với sự hỗ trợ của enzyme.

- Phân tích một số thành phần hóa học chính của fucoidan.

- Phân tích vị trí phân bố nhóm sulfate trên phân tử đường của

fucoidan.

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan được phân lập từ rong

nâu S. mcclurei theo các phương pháp chiết khác nhau.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN

1.1.1. Giới thiệu rong biển

Rong biển là những loài thực vật bậc thấp sống ở biển, chúng có thể là đơn bào, đa bào, sống thành quần thể với nhiều hình dạng đa dạng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hoặc hình thù rất đặc biệt. Rong biển sinh trưởng nhanh, vòng đời không quá một năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn. Chúng là một nguồn thực phẩm và dược phẩm rất có ích cho con người. Đồng thời, do có sinh khối lớn nên rong biển đã tạo ra nguồn vật chất dồi dào cho hệ sinh thái biển và lượng lớn oxygen cho sự hô hấp của con người và động vật trên cạn [15][16].

Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển

có thể được chia thành một số ngành rong chính:

1. Ngành rong nâu (Phaeophyta).

2. Ngày rong đỏ (Rhodophyta).

3. Ngành rong xanh (Chlorophyta).

Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới. Trong số các ngành rong lục, rong nâu và rong đỏ thì rong nâu là ngành rong có trữ lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại [17][3].

1.1.2. Giới thiệu rong nâu

Rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae), gồm 4 chi lớn: Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina. Đặc biệt, chi Sargassum sinh trưởng rất mạnh, có thể hình thành các thảm rong biển rộng từ vài hecta đến vài chục hecta. Chúng phân bố rộng, chiếm ưu thế trên các bãi triều ven biển của các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới.

Rong nâu phân bố nhiều nhất là ở Nhật Bản, tiếp theo là Việt Nam, Canada, Hàn Quốc, Alaska, Ai-len, Mỹ, Pháp, Ấn Độ... Trong đó, hai chi Sargassum và Turbinaria thuộc họ Sargassaceae (bộ Fucales) phân bố ở

vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới là hai đối tượng phổ biến và kinh tế nhất. Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, tiếp đến là Hàn Quốc, Nhật Bản, Na Uy, Chile [18]...

Ở Việt Nam, tính đến năm 2015, có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó các loài thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất, ước tính trên 10.000 tấn khô/năm. Chúng phân bố tập trung chủ yếu ở các vùng biển từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu gồm: chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà (Đà Nẵng); Cù Lao Chàm, Núi Thành (Quảng Nam); Bình Châu, Lý Sơn, Sa Huỳnh (Quảng Ngãi); Phù Mỹ, Quy Nhơn (Bình Định); vịnh Xuân Đài, Cù Mông (Phú Yên); vịnh Vân Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh (Khánh Hoà); Ninh Hải, Ninh Phước (Ninh Thuận). Ngoài ra, rong nâu còn xuất hiện tại vùng biển từ phường Bình San đến xã Mỹ Đức của thị xã Hà Tiên (Kiên Giang). Trong đó khu vực vịnh Nha Trang được đánh giá rất thuận lợi để sinh nâu sinh trưởng và phát triển. Dựa vào phương pháp hình thái so sánh đặc điểm của cơ quan sinh sản là cơ quan ít biến đổi theo các điều kiện sinh thái, các tác giả trong và ngoài nước đã có những công bố tương đối đầy đủ về mặt phân loại rong nâu ở Việt Nam. Một số chi rong nâu có thể thống kê được: chi Dictyota có 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài (4 loài, 1 thứ), chi Sargassum 68 loài trong đó ở Khánh Hoà 39 loài [3][11].

Tại tỉnh Khánh Hòa, nguồn lợi rong nâu phân bố tập trung tại 4 khu

vực ven biển theo trình tự từ Bắc xuống Nam.

+ Khu vực 1: Vịnh Vân Phong (Hòn Bịp, Hòn Ó, Hòn Dút, Cù Meo,

Rạn Trào, Rạn Tướng, Mũi Dù, Mũi Đá Son, Lạch Cổ Cò, Sùng Ké...).

+ Khu vực 2: Ven biển xã Ninh Thủy, Ninh Phước, Ninh Vân, Đầm Nha Phu (Bãi Đá Lát, Mỹ Giang, Hòn Khô, Bãi Đá Nọc, Bãi Cây Tra, Bãi Cỏ, Bãi Cây Bàn,... và vài bãi cạn ngầm (Bãi Cỏ - Thị xã Ninh Hòa).

+ Khu vực 3: Vịnh Nha Trang (Mũi Kê Gà, Bãi Tiên – Đường Đệ, Hòn Chồng, Hòn Đỏ, Hòn Rùa, Hòn Tre, Bãi Rạn, Bãi Ngéo, Hòn Một, Hòn Mun, Bãi rạn ngầm Lớn, Mũi cá sấu Trí Nguyên, Sông Lô, Mũi Cầu).

+ Khu vực 4: Đảo Bình Ba – xã Cam Lập (Dọc theo bờ đông bán đảo

Cam Lập, từ Mũi Sốp đến Mũi Cà Tiên) – Thành phố Cam Ranh.

Hình 1. 1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu

tỉnh Khánh Hòa [21][17]

1.1.3. Một số thành phần hóa học trong rong nâu

Rong biển nói chung và rong nâu nói riêng có thành phần hoá học rất đa dạng và có giá trị lớn về mặt dinh dưỡng cũng như dược tính như: các hợp

chất polysaccharide, axit amin, vitamin và khoáng chất, terpenoid, các hợp chất phenolic, các hợp chất màu carotenoid và một số hợp chất khác...

Bảng 1. 1. Thành phần hóa học của một số loài rong

trong 3 ngành rong chính (Tỉ lệ tính trên 100g rong tươi) [18]

Ulva sp.

Ascophylm nodosum

Laminaria digitata

Alari aesculenta

Palmaria palmata

Porpha sp.

Porphyra yezoensis

Ngành rong Nâu

Nâu

Đỏ

Lục

70 - 85

73 - 90

73 - 86

79 - 88

Nước

15 - 25

10 - 25

14 - 27

15 - 30 8 - 16

7,8

13 - 22

Tro

20 - 45

21 - 42

Alginic acid 15 - 30

29 - 45

Xylan

0 - 10

0 - 18

0 - 34

Laminaran

5 - 10

4 - 16

4 - 13

Mannitol

4 - 10

2 - 4

Fucoidan

2 - 20

Floridosid

5 - 10

8 - 15

9 - 18

8 - 25 33 - 47

43,6

15 - 25

Protein

2 - 7

1 - 2

0,3 - 0,8

0,7

2,1

0,6 - 0,7

Chất béo

2 - 10

0,1

0,5 - 6,0

Tannin

2 - 3

1,3 - 3,8

7 - 9

3,3

2,4

0,7

Kali

3 - 4

0,9 - 2,2

2,0 - 2,5 Nd

0,6

3,3

Natri

0,5 - 0,9

0,5 - 0,8

0,4 - 0,5

2,0

Magie

0,01 - 0,1

0,3 - 1,1

0,05

0,01 - 0,1 0,0005

Iod

nd: Không phát hiện thấy

1.1.3.1. Polysaccharide

Polysaccharide là thành phần chính của rong nâu, bao gồm alginate,

laminaran, fucoidan và các dẫn xuất của chúng.

- Alginate là muối của Alginic acid, là một polysaccharide dị thể được tạo thành từ các khối mannuronic acid và guluronic acid, tỉ lệ và thành phần của các khối tùy thuộc vào loài rong và các phương pháp chiết. Hàm lượng Alginate trong rong nâu chiếm khoảng từ 2-4% so với rong tươi, hàm lượng này tùy thuộc vào loài rong, vị trí địa lí, môi trường mà rong nâu sinh trưởng. Tại miền Trung nước ta, hàm lượng Alginate trong rong nâu đạt tỉ lệ cao nhất vào khoảng tháng tư hằng năm [22].

Hình 1. 2. Phân tử Alginic acid (G: guluronic acid, M: mannuronic acid)

- Laminaran là tinh bột trong rong nâu, là một polysaccharide của glucose (1(3)-(-D-glucan), gốc đường cuối mạch có thể là Mannitol (M- series) hoặc vẫn là Glucose (G-series). Một số nghiên cứu gần đây còn cho

thấy ngoài liên kết 13, Laminaran còn có thể có liên kết 16. Laminaran

có hàm lượng chiếm từ 10-15% trọng lượng rong khô, còn tùy thuộc vào loài rong, vị trí địa lí, môi trường mà rong nâu sinh trưởng. Thường vào mùa hè, khi rong nâu phát triển sinh khối mạnh mẽ thì hàm lượng Laminaran sẽ bị giảm xuống do tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong [22].

Hình 1. 3. Cấu trúc của Laminaran

- Fucoidan được mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 khi tiến hành phân lập từ rong Laminaria digitata. Với thành phần cấu trúc rất phức tạp trong đó fucose chiếm từ 18,6% đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7% đến 32%, ngoài ra còn có các phân tử đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose... và uronic acid làm cho fucoidan sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng u, kháng viêm, chống đông tụ máu, kháng virus, chống bổ thể, chống oxi hoá... Chính vì có tiềm năng rất lớn trong điều chế thực phẩm chức năng và làm thuốc nên fucoidan thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới [9].

Hình 1. 4. Một đoạn cấu trúc Fucoidan

1.1.3.2. Hợp chất Phenolic

Hợp chất Phenolic là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của thành phần hóa học trong rong nâu, là hợp chất chứa các nhóm –OH gắn trực tiếp vào nhân benzen, bao gồm các hợp chất flavonoid, lignnin, tannin và phlorotannin. Các hợp chất này đều chứa hoạt tính khác nhau [20][23].

1.1.3.3. Hợp chất Carotenoid

Carotenoid là các hợp chất màu tự nhiên được tìm thấy ở nhiều loài động vật và thực vật. Trong rong nâu có thể tìm thấy một số Carotenoid như lutein, zeaxanthin, fucoxanthin... Các Carotenoid trong rong nâu được ghi nhận nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thư, chống viêm và chống virus. Các hợp chất a-carotene, b-carotene, chlorophyll-a và phaeophytin-a đều là các hợp chất có hoạt tính sinh học quý [20][23].

1.1.3.4. Hợp chất Terpenoid

acid, sargahidroquinoic fallachoromonoic acid,

Một số Terpenoid được tách ra từ rong nâu như: sargaquinone, sargaquinoic acid, fallahidroquinone, fallaquinone, sargachromenol được xác định có hoạt tính chống oxi hóa và chống ung thư. Các hợp chất atomarianone A và atomarianone B được tách ra từ Taonia atomania có hoạt tính gây độc tế bào ung thư [20][23].

Ngoài ra, một số hợp chất diterpenoic được tách ra từ rong nâu Cystoseira meditteranea như taondiol, isoepitaondiol, stypodiol và sargaol đều được ghi nhận có hoạt tính chống oxi hóa và chống ung thư.

1.1.3.5. Protein

Protein trong rong nâu tại vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05-21% so với trọng lượng rong khô. Một số protein được tách ra từ rong nâu sỡ hữu một số hoạt tính sinh học quý như deoxylapachol a 1,4-Naphthoquinone và dẫn xuất được tách ra từ rong nâu Landsburgia quercifolia, Sargachromannol E tách ra từ rong nâu Sargassum siliquastrum có khả năng gây độc tế bào ung thư [20][23].

1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN

1.2.1. Thành phần hóa học của fucoidan

rong nâu như từ

Fucoidan được phân lập từ rong nâu lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913, khi đó ông đặt tên cho nó là “fucoidin” theo tên gọi của hợp chất đường fucose là thành phần chính cấu tạo nên hợp chất này. Tuy nhiên, nếu căn cứ theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt thì “fucoidin” chưa chính xác vì các polysaccharide được tạo nên bởi fucose và sulfate phải được đặt tên là sulfate fucan, các polysaccharide này thường thấy trên ngành Da gai, cụ thể là Cầu gai và Hải sâm. Trong khi đó, thành phần và cấu trúc của Polysaccharide sulfate được chiết từ rong nâu lại phức tạp hơn rất nhiều. Năm 1959, thuật ngữ “fucoidan” được McNeely lần đầu tiên sử dụng khi tiến hành phân loại polysaccharide. Hiện nay, để phân biệt với các polysaccharide được tạo nên từ fucose và sulfate trong động vật (được gọi là sulfate fucan), IUPAC định nghĩa “fucoidan” là thuật ngữ dùng để mô tả polysaccharide sulfate được chiết từ rong nâu và dựa vào thuật ngữ này các tác giả đặt tên cho các sản sulfate, fucogalactan phẩm khác được chiết fucoglucuronomannan sulfate, xylofucoglucuronan sulfate [9][19]…

Fucoidan là một polysaccharide dị thể có thành phần hóa học chính bao gồm fucose và sulfate và thành phần hóa học của fucoidan phụ thuộc rất nhiều vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong. Do là một polysaccharide dị thể nên hàm lượng của fucoidan rất phức tạp, trong đó, fucose chiếm từ 18,6 đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7 đến 39,2%, ngoài ra còn có chứa thêm các đường đơn khác như galactose, xylose, manose, glucuronic acid, đồng thời có thể bị acetyl hoá một phần. Trong một số nghiên cứu chỉ ra rằng với chi Sargassum, thành phần của fucoidan phức tạp hơn các loài rong nâu khác đã được nghiên cứu ở châu Âu. Ngoài α-L-fucose nó còn có thể xuất hiện các phân tử đường khác như D-galactose, D-mannose, D-glucuronic acid, D- glucose, D-xylose [18][22][25]…

Bảng 1. 2. Thành phần hóa học của một số fucoidan [1][25]

Rong nâu Thành phần hóa học

F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1.20)

F. evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1.23/0.36)

F. distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1.21/0.08)

F. serratus L. Fucose/sulfate/acetate (1/1/0.1)

Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1.12)

Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1), sulfate

Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1), sulfate

Undariapinnatifida Fucose/galactose (1/1.1), sulfate (10.4 %) (Mekabu)

Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4.9/1/1.1), sulfate (12%)

Himanthalia lorea Fucose/xylose/GlcA (2.2/1.0/2.2), sulfate (13%) và Bifurcaria bifurcate

Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose Padina pavonia (1.5/1.5/1.2/1.2/1), sulfate (17.6 %)

Laminaria angustata Fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose

1.2.2. Đa dạng cấu trúc của fucoidan

Cấu trúc của fucoidan chiết xuất từ rong nâu vô cùng phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glicoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polimer. Ngoài ra,

fucoidan có thể có mạch nhánh, trong phân tử có thể xuất hiện một số gốc đường khác nhau và cũng có thể có các gốc acetyl… Chính vì vậy, việc phân tích cấu trúc của fucoidan là một vấn đề nan giải ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR với độ phân giải cao mới nhất cũng chỉ có thể cho biết một phần thông tin về cấu trúc của fucoidan mà thôi [26][27].

Năm 1950, Percival, Ross và cộng sự đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong nâu thường gặp Fucus vesiculosus là một polysaccharide có bộ khung chính là α -L-fucose (1→2), vị trí nhánh là α -L-fucose (1→3) và các nhóm sulfate ở vị trí 4 của gốc đường L-fucospyranose [28][29]. Mô hình cấu trúc này của fucoidan đã tồn tại 43 năm đến năm 1993, cấu trúc fucoidan của chính loài rong này đã được nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của fucoidan này với mạch chính là α -L-fucose(1→3) thay vì α - L-fucose(1→2), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí C-4, phù hợp với mô hình đã công bố trước. Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của Percival và Ross được Pantakar giải thích bởi việc sử dụng dung môi chiết khác nhau và sự đưa sử dụng kỹ thuật phân tích hiện đại là GC-EI/MS đã xác định sự có mặt các nhóm acetyl (axetyl) tại vị trí khác nhau của vòng pyranose trong phương pháp methyl hoá.

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo mới chỉ đưa ra đặc điểm chung của cấu trúc là sự có mặt của gốc α -L-fucose (1→3) với các nhóm sulfate ở C-4, không loại trừ sự có mặt của các nhóm sulfate khác hoặc các nhánh ở vị trí C-2 [30].

Hình 1. 5. Cấu trúc của fucoidan có sunfat ở vị trí C-4 và liên kết 3-O-linked

từ loài rong E. Kurome được mô tả vào năm 1991 [30]

-)-(1→]n

Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ rong Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, cấu trúc của fucoidan này tương đồng với cấu trúc fucoidan của rong A.nodosum [26]. Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và C2,4 [27][31].

-)-(1→4)- α -L-Fucp-(2SO3

[→3)- α -L-Fucp-(2,4 SO3

Trong đó:

-, R2 = H chiếm 50%

-)-

-)-(1→3) α -L-fucp(2SO3

R1 = SO3

R1 = H, R2 = α -L-fucp-(1→4)- α -L-fucp(2SO3 (1→ chiếm 50%

Hình 1. 6. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus [27]

Như vậy, fucoidan là tập hợp của rất nhiều mảnh cấu trúc khác nhau, không phải là tập hợp của các phân tử đồng nhất như nhau, việc mô tả hoàn chỉnh cấu trúc của fucoidan là việc vô cùng khó. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc của fucoidan đã được công bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan.

1.2.3. Hoạt tính sinh học của fucoidan

1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus

Năm 1995, các nhà khoa học Rumani đã công bố rằng fucoidan có khả

năng ức chế đáng kể sự phát triển của khuẩn Gram dương (Gr(+)) và Gram âm (Gr(-)), đồng thời kích thích hệ thóng miễn dịch bằng cách tăng cường thực bào (tế bào nuốt và tiêu hóa vi khuẩn).

Trong những năm gần đây, các thử nghiệm về hoạt tính kháng virus của fucoidan đã được thực hiện bằng cả “in vitro” và “in vivo” và cho thấy yếu tố gây độc tế bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm thử nghiệm trong y học lâm sàng. Các nghiên cứu cho thấy fucoidan kích thích khả năng tạo ra các dạng interleukin và interferon được tiết ra nhờ các tế bào miễn dịch giống tế bào T, từ đó kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau (T-cells, NK-cells, macrophage-đại thực bào) cần thiết để phòng nhiễm trùng và bệnh tật. Các nhà khoa học tin rằng, fucoidan có thể đem lại một sự điều trị hiệu quả chống lại các virus viêm gan, mệt mãn tính và thậm chí ngay cả virus HIV [9][32][33].

1.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa

Một số công bố đã cho rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm “in vitro”, fucoidan có thể làm mất gốc peroxide hiệu quả, ảnh hưởng của nó lên gốc hidroxyl là yếu và ít có ảnh hưởng trên 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH). Điều đó cho thấy fucoidan là một chất chống oxy hóa tự nhiên tốt, giúp ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do. Một số thử nghiệm trên chuột nhận thấy fucoidan thu được từ L. japonica có thể ngăn chặn sự tăng peroxide lipid trong huyết thanh gan, lá lách của chuột bị tiểu đường một cách rõ ràng. Trong một nghiên cứu khác, Michiline và cộng sự cũng công bố rằng fucoidan (homofucan) từ F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã có tác dụng ức chế sự hình thành gốc tự do hidroxyl và gốc peroxide, trong đó fucan cho thấy hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn so với fucoidan [2][34].

1.2.3.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch

Năm 1990, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã sàng lọc trên 46 loài rong ở dạng bột, khô tự nhiên trong không khí (trong đó có 4 loài rong lục, 21 loài rong nâu, 21 loài rong đỏ). Hoạt tính chống ung thư biểu mô dạng

Ehrlich được thấy có ở rong nâu Scytosiphon lomentaria (ngăn chặn 69.8%), Lessonia nigrescens (60.0%), Laminaria japonica (57.6%), Sargassum ringgoldianum (46.5%), rong đỏ Porphyra yezoensis (53.2%), Eucheuma gelatinae (52.1%) và rong lục Enteromorpha prolifera (51.7%). Năm loài rong nâu và bốn loài rong đỏ có tác dụng chống ung thư dạng Meth-A fibrosarcoma[35]. Ba năm sau cũng nhóm tác giả này tiến hành chiết các hợp chất trong rong nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến axit, đem thử hoạt tính kháng ung thư và họ nhận ra rằng hai phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình khoảng 13500Da và 19000Da có hoạt tính kháng ung thư. Các fucoidan này đã tương tác trực tiếp với tế bào ung thư và tiêu diệt chúng, cả hai phân đoạn đều không tan trong nước và phải chiết ra bằng axit nóng. Bằng các phương pháp phân tích hoá học cũng như các phương pháp phổ cơ bản họ đã chứng minh được các hợp chất này chính là fucoidan [36].

Sự suy yếu trong hệ thống kiểm soát miễn dịch dẫn đến các tế bào ung thư phát triển không nhận biết được. Fucoidan phục hồi lại các tế bào phòng vệ miễn dịch và như vậy, chúng có thể trở nên cảnh giác hơn trong việc nhằm vào các tế bào khác thường để phá hủy. Hệ miễn dịch vừa là hàng rào phòng thủ đầu tiên và vừa là cuối cùng chống lại ung thư [15].

1.2.3.4. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối

Nishino và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ 9 loài rong nâu. Trong số các fucoidan thử nghiệm, fucoidan từ E. kurome thể hiện hoạt tính cao nhất đối với APTT (activated partial thromboplastin time) (38 đơn vị/mg) và TT (thromboplastin time) (35 đơn vị/mg), với fucoidan từ H. fusiforme hoạt tính APTT và TT tương ứng là 25 đơn vị/mg và 22 đơn vị/mg. Hoạt tính chống huyết khối của phân đoạn F4 của fucoidan từ L.angustata var. longissima là 200 đơn vị/mg, so với heparin (140 đơn vị/mg). Các nghiên cứu về hoạt tính chống đông tụ máu của fucoidan từ một số loài rong (E. kurome, H. fusiforme, vv…) đã chỉ ra rằng hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống đông tụ máu, hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính chống đông tụ càng lớn. Fucoidan sulfate hóa toàn phần bằng biến đổi hóa học fucoidan tự nhiên cũng làm tăng hoạt tính này [33].

1.2.3.5. Chống lại các bệnh về gan

Fucoidan tìm thấy trong rong nâu làm tăng đáng kể việc sản xuất một chất được gọi IT-IGF hoặc HGF. Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học ở Nhật, đã nghiên cứu cấu tạo xơ của một vài loại rong, trong khi tiến hành các nghiên cứu này họ đã phát hiện ra rằng fucoidan tìm thấy trong nhiều loài rong nâu có thể làm tăng đáng kể việc sản xuất HGF. HGF là một cytokin rất đặc biệt, nó không chỉ kích thích việc tái tạo các tế bào gan mà đồng thời còn tăng cường việc sản xuất các tế bào da, tế bào cơ tim, sụn. Các nghiên cứu cho thấy HGF thực hiện một tổ hợp rộng các chức năng sinh hóa và được coi là quan trọng để tạo thành sẹo và phục hồi các mô cơ thể. Chúng ta còn biết rằng HGF là một protein làm chậm quá trình lão hóa. Một số nghiên cứu tiền lâm sàng được tiến hành sau 1992 đã phát hiện ra rằng HGF có thể ngăn chặn viêm gan, điều trị xơ gan, liệt gan, xơ hóa phổi và làm chậm quá trình già hóa.

Việc khám phá ra các hợp chất fucoidan có thể tăng cường việc sản xuất HGF, không chỉ chứa một niềm hy vọng lớn đối với những người bị đau do các bệnh gan, mà còn cho niềm hy vọng đối với tất cả những ai chịu đựng các bệnh suy thoái, bao gồm suy yếu mô xuất hiện khi có tuổi [37].

1.2.3.6. Giảm lipid máu

Số liệu từ phòng thí nghiệm cho thấy rằng, những con chuột ăn rong nâu có mức mỡ máu thấp hơn đáng kể so với những con không ăn rong. Sau 21 ngày thử rong biển các nhà khoa học đã kết luận rằng các hợp chất rong nâu làm thay đổi hoạt tính của các enzyme trong gan, kiểm soát cách các axit béo được chuyển hóa, dẫn đến mức cholesterol thấp hơn. Các nhà nghiên cứu của Nhật Bản đã tiến hành một nghiên cứu mà trong đó các đối tượng kiểm tra được cho ăn 5g rong biển (có chứa fucoidan)/ngày trong 3 tuần. Kết quả, huyết áp và mức cholesterol cao của họ được cải thiện đáng kể. Kết quả đó đã được WHO công bố và họ khẳng định rằng thành phần fucoidan của một số thực vật biển xúc tiến việc đốt chất béo trong gan - một tác động hỗ trợ và bảo vệ hệ tim mạch. Fucoidan đồng thời còn tối ưu hóa các mức của men HGF trong gan mà ở đó cholesterol được tạo ra và các axit béo được tổng hợp. Hơn nữa, rõ ràng là fucoidan có thể ngăn chặn sự tạo thành các cục máu đông, làm

giảm rủi ro do các cơn đau tim và đột qụy. Hoạt tính này đã được khảo sát trên người và đã được FDA của Mỹ cấp chứng nhận [38].

1.2.4. Ứng dụng của fucoidan

Trong suốt những thập niên vừa qua có rất nhiều những nghiên cứu đã đưa ra số lượng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một hợp chất sulfated polysaccharide hóa giàu fucose từ rong nâu. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ dày,…

Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch,… U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra sự giáng hóa các tế bào ung thư,… Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi Import Export Co.,Ltd., Trung Quốc được sử dụng để phục hồi khả năng kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch,. Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch.

Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Công ty Sannet Khánh Hòa. Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới [19][20].

1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN

1.3.1. Phương pháp chiết fucoidan trong axit pH 2-3

Mẫu rong đã xay được trộn với HCl 0,1N ở pH 2-2,5 theo tỷ lệ 1:10 và được giữ ở 70 °C, tiến hành khuấy liên tục bằng máy khuấy từ trong 1 giờ. Quá trình này được lặp lại ba lần và mỗi lần, dịch lọc được thu thập, gom lại và đuổi bớt dung môi bằng cách cho bay hơi nước. Tiến hành tủa fucoidan bằng cách thêm ethanol 80%. Fucoidan được tinh chế thêm bằng cách thêm fomanđehit, sau đó được làm khô và mang đi phân tích thành phần [16][19].

1.3.2. Phương pháp chiết fucoidan trong nước nóng

Các mẫu rong được xay nhỏ, lấy khoảng 10 gam ngâm dầm trong 300 ml nước nóng và giữ ở 100 °C trong 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp được mang đi lọc và dịch lọc được tiến hành ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Thêm vào dịch lọc sau ly tâm một lượng tương đương ethanol 70% cho đến khi tạo kết tủa. Quá trình ly tâm sau đó được thực hiện một lần nữa để tách fucoidan rắn ra khỏi chất lỏng, cuối cùng thu được fucoidan kết tủa [39].

1.3.3. Phương pháp chiết fucoidan trong dung dịch CaCl2 2%

Năm 2018, Bilan và cộng sự đã thực hiện chiết thành công fucoidan từ rong nâu Alaria Marginata sinh trưởng tại vùng biển Thái Bình Dương bằng phương pháp chiết trong dung môi CaCl2 2%. Mẫu rong khô 200g được xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH-CHCl3-H2O tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với axeton, sấy khô. Sau khi sấy khô bã rong được chiết với 250ml dung dịch CaCl2 2% (5 lần) mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 85 oC trong 5 giờ. Dịch chiết 5 lần được gom lại, sau đó thêm 80ml dung dịch hexadecyltrimethylammoniumbromide nồng độ 10% trong nước. Tủa tạo thành được li tâm, rửa với nước nhiều lần, sau đó khuấy trộn với 150ml dung dịch NaI 20% trong cồn để ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, ly tâm tách lấy phần tủa (làm như vậy 5 lần), sau đó rửa với cồn và hòa tan lại trong nước. Dung dịch được thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu được fucoidan thô dưới dạng muối Na, hiệu suất chiết tính theo trọng lượng rong khô [40][20].

1.3.4. Phương pháp chiết fucoidan bằng ethanol

Trong phương pháp này, mẫu rong được xay nhỏ và được ngâm trong ethanol 95% theo tỷ lệ 1 : 2 và lắc đều trong 1 giờ để loại bỏ sắc tố, protein và lipid và sau đó được ly tâm trong 10 phút. Kết tủa thu được được pha với nước cất hai lần (w/v = 1:10) và đặt trong nồi cách thủy duy trì ở 40 oC trong 15 phút, lắc đều. Hỗn hợp sau đó được để lắng trong 10 phút và thu lấy phần nổi phía trên. Ethanol 95% được thêm vào phần nổi thu được ở trên để tạo ra ethanol 20%. Hỗn hợp tiếp tục để lắng một lần nữa trong 30 phút, tiếp tục thu lấy phần nổi phía trên. Ethanol 95% lại được thêm vào một lần nữa cho đến khi nồng độ ethanol cuối cùng là 50% là nồng độ ổn định để có thể thu được fucoidan. Fucoidan rắn thu được bằng cách sấy khô ở 40 oC [39].

1.3.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion

Chất lỏng ion (ILs) được biết đến như là một loại muối nóng chảy ở nhiệt độ thường từ năm 1914 bởi Walden[41], chúng được hình thành bởi các cation và các anion có tính đối xứng và mật độ điện tích thấp[42] và thành phần cation và anion này tạo nên tính chất hóa lý riêng biệt của từng ILs như điểm nóng chảy, độ phân cực tính, độ nhớt, mức độ ổn định nhiệt và hóa học, tính chất solvation hóa[43] ... Các cấu trúc của ILs có thể dễ dàng bị biến đổi thông qua thay đổi các cation hoặc anion. Có vô số các kiểu kết hợp khác nhau của cặp ion cation/anion khác nhau, điều này dẫn đến khả năng điều chỉnh các đặc tính của ILs như tính chất nhiệt vật lý, khả năng phân hủy sinh học, độc tính, tính kỵ nước…để đáp ứng nhu cầu ứng dụng. Chính vậy mà ILs mô tả như là một loại dung môi được thiết kế để đưa ra các giải pháp “designer solvents”[44]. Nhờ áp suất hơi bão hòa thấp, không bắt lửa, cửa sổ điện hóa rộng, ổn định nhiệt và hóa học cao, và có khả năng hòa tan một loạt các hợp chất hữu cơ và vô cơ mà ILs tỏ ra vượt trội so với các dung môi hữu cơ[45]. Sự thay thế dung môi hữu cơ dễ bay hơi bởi ILs không bay hơi giúp loại bỏ tổn thất dung môi vào khí quyển, làm giảm ô nhiễm môi trường. Đây là lý do chính mà chất lỏng ion là được coi là dung môi xanh. Với những tính chất ưu việt của mình , ILs được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như hóa lý, hóa phân tích, hóa hữu cơ... ILs được hi vọng là sẽ tạo ra một hướng mới

trong hóa học khi hướng đến hóa học xanh thân thiện với môi trường.

bằng

Nhiều hợp chất trong rong biển có ích và có giá trị kinh tế cao như sufate polysaccharide, lipid, các chất chuyển hóa thứ cấp, nhóm các hợp chất làm nguyên liệu và nhiên liệu hóa học... Tuy nhiên khả năng hòa tan không tốt trong dung môi thông thường đã hạn chế khả năng sử dụng hiệu quả chúng. Trong thập kỷ trở lại đây đã có công trình nghiên cứu mà ILs đã được sử dụng làm dung môi chiết để thu hồi các hóa chất có giá trị từ vi tảo biển. Teixeira RE[46] đã nghiên cứu sử dụng 03 loại ILs để chiết lipid từ loài vi tảo Chlorella vulgaris là ([Bmim][BF4],[Bmim] Cl và[Amim] Cl). Kết quả là cả 03 loài Ils sử dụng đều có khả năng chiết xuất lipid một cách hiệu quả và việc bổ sung CO2 vào[Bmim][BF4] trong quá trình chiết có thể làm tăng hiệu suất chiết lipid từ 14,2% lên 15,6%. Cùng đối tượng loài vi tảo này, các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu quy trình chiết lipid từ sinh khối tảo bằng hỗn hợp[Bmim][CF3SO3] và methanol [47]. Tổng hàm lượng lipid được chiết xuất từ Chlorella Vulgaris thương mại và nuôi cấy theo phương pháp Bligh và Dyer thông thường lần lượt là 10,6% và 11,1%, trong khi sử dụng hỗn hợp[Bmim][CF3SO3] và methanol hiệu suất lipid tăng lên 12,5% và 19,0% , tương ứng. Đặc biệt là nghiên cứu của một số nhóm tác giả Nhật Bản vào năm 2013[48] đã xác nhận khả năng hòa tan vi tảo biển Saliferous ướt (95 % nước) methylphosphate 1-Ethyl-3-methylimidazolium ([C2mim][MeO(H)PO(2)]) có tính chất phân cực trong thời gian 30 phút mà không cần cung cấp nhiệt đã mở ra khả năng ứng dụng chất lỏng ion trong chế biến vi tảo biển đầy tiềm năng. Không chỉ nghiên cứu trên đối tượng vi tảo biển còn có một số công bố trên đối tượng rong biển. Nhóm tác giả Tushar J và CS đã sử dụng 03 loại Ils có độ nhớt thấp và khả năng tại liên kết hydro mạnh là [Emim][OAc], [Ch][OAc] và [Emim][Dep] để chiết tách agarose từ loài rong đỏ Gracilaria dura. Kết quả là cả 03 loại Ils trên đều có khả năng hòa tan rong và tủa agarose bằng methanol, trong đó [Emim][OAc] có khả năng chiết cao nhất đạt hiệu suất chiết lên tới 39,5% khi có sự hỗ trợ của nhiệt và lò vi sóng [49]. Pezoa-Conte và cộng sự [50] đã phát hiện ra rằng Ils là ([TMGH+][EtCO2−]) có thể hòa tan 67 % carbohydrate từ sinh khối tảo xanh Ulva rigida và khi tăng nhiệt độ từ 100 oC lên 120 oC hiệu suất hòa tan

carbohyrate tăng lên gấp 3 lần. Điều thú vị là ở chỗ carbohydrate có thể thu hồi bằng phương pháp kết tủa đạt 92,0 %. Như vậy có thể cho rằng Ils là dung môi đầy tiềm năng trong công nghệ chiết các hoạt chất từ rong biển.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.4.1 Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới

Mặc dù đã có rất nhiều công trình công bố về cấu trúc của fucoidan, nhưng chỉ có một số công bố đưa ra được cấu trúc một cách rõ ràng nhưng phần lớn chỉ đưa ra cấu trúc của một phân đoạn có độ lặp lại cao của chúng. Một số cấu trúc chi tiết của fucoidan chiết từ một số loài rong nâu trên thế giới được dẫn ra trên Bảng 1.3.

Bảng 1. 3. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu [20]

Loài rong nâu Cấu trúc hóa học của các Fucoidan

-)-

-)-(1→4)-α-L-Fucp(2,3-điSO3

3(4Fucp) và 1 (2Fucp) /10 (1→3)-α-L-Fucp(2/4SO3 Analipus japonicus

Ascophyllum nodosum [→3)-α-L-Fucp(2SO3 (1→]n

A.nodosum (1→3)-α-L-Fucp và một ít (1→4)-α-L-Fucp cùng (1→3)-α- L-(2 và hoặc 4 Fucp)

-)-(1→

Chorda filum -[→3)-α-L-Fucp-(1-]3→3)-α-L-Fucp(2Fucp)-(1→

-)-(1→4)-α-L-Fucp-(2SO3

-)-(1→

Fucusdistichus L →3)-α-L-Fucp-(2,4-diSO3

-)-(1→4)-α-L-Fucp(2SO3

-)-(1→

F.evanescens →3)-α-L-Fucp(2SO3

→3)-α-L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)-α-L-Fucp(2SO3

- , R2 = H

-)-(1→

a. (~50%): R1 = SO3 F.serratus L b. (~50%): R1 = H, R2 = α-L-Fucp-(1→4) )-α-L-

-)-(1→3)-α-L-Fucp(2SO3

Fucp(2SO3

-)-(1→ và thêm →3) )-α-L-Fucp(4SO3

-)-(1→

Laminaria sacharina →3)-α-L-Fucp(4SO3 hoặc 2Fucp)-(1→

-)-(1→ và →4-α-L-Fucp(2SO3

→3)-α-L-Fucp(2/4SO3 Stoechosperm ummarginatum

Trong thành phần của các fucoidan ngoài fucose và sulfate còn có một lượng nhỏ các monosaccharide như galactose, glucose, mannose, xylose, uronic acid. Cùng với sự xuất hiện của nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. Một số fucoidan mà thành phần chủ yếu là galactose, fucose và sulfate hay còn gọi là galactofucan sulfate được tách từ một số loài rong nâu như Laminaria angustata, Laminaria longissima, Alaria fistulosa, Undaria pinnatifida, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Laminaria gurjanovae và Sargassum patens. Trong khi đó có rất nhiều fucoidan có cấu trúc rất phức tạp được chiết và phân lập từ một số loài rong nâu Dictyota menstrualis, Padina gymnospora, Spatoglossum schroederi, Hizikia fusiforme, Sargassum fusiforme, Kjellmaniella crassifolia. Thành phần hóa học của chúng chứa rất nhiều các đường đơn như fucose, galactose, glucose, mannose, xylose, còn có uronic acid và sulfate, ngoài ra có thể có nhóm acetyl hóa. Vì vậy việc xác định cấu trúc của chúng gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, các nhà khoa học phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác như phân tích methyl hóa, đề sulfate hóa, tự thủy phân, enzyme thủy phân fucoidan,… kết hợp cùng các phương pháp hóa lý hiện đại như NMR 2D, 3D, MALDI-TOF/MS/MS, SAXS để giải quyết bài toán cấu trúc phức tạp của fucoidan [22][23].

Việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI- TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng đã tạo ra một bước đột phá mới trong phân tích cấu trúc phức tạp của polysaccharide rong biển. Ưu điểm của phương pháp này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng như trật tự giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan. Trên cơ sở phương pháp MS, Anastyuk và CS tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Liên

bang Nga đã xác định thêm 03 loại cấu trúc fucoidan mới từ các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii. Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều kết hợp với biến đổi hóa học, Usov và cộng sự tại Viện Hóa Hữu cơ Liên bang Nga đã xác định cấu trúc chi tiết của 04 loại cấu trúc của fucoidan từ các loài rong nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus.

Trong một thập kỷ trở lại đây, đã có các công bố đưa ra cấu trúc của phân đoạn Fucoidan dạng fucogalactan sulfate từ một số loài rong như Sargassum duplicatum, Padina boryana . Roza V. Usoltseva và các cộng sự người Nga đã đưa ra cấu trúc của Fucoidan từ rong Sargassum duplicatum như sau: mạch chính được tạo ra từ các đơn vị lặp lại {→4)-α-L-Fuc-(1→4)- β-D-Gal- 1→}n, ), với các nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2, C4 và ít hơn ở C3 trên gốc đường fucose, nhóm sulfate chủ yếu tại vị trí C2, C3 và ít hơn ở C4, C6 trên gốc đường glactose. Trong khi với cấu trúc fucoidan từ rong Padina boryana nhóm tác giả trên mới chỉ đưa ra một vài đặc điểm cấu trúc là bao gồm bởi các gốc 1,4-α-L-fucopyranose và 1,3-β-D-Galactopyranose và các nhóm sulfate đính vào các vị trí C2,C3 và C4 trên cả 2 gốc đường fucose và galactose [23].

1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam

Fucoidan mới chỉ được biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.

Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ

phòng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học tự nhiên vốn có của chúng.

Các nghiên cứu công bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra các đặc điểm về cấu trúc như thành phần đường, vị trí nhóm sulfate và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thô. Năm 2008, nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Nhứt đã công bố thành phần và cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đường đơn khác như rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81 - 22,07%), tác giả đã đưa ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic acid và fucose, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [18].

Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố fucoidan từ rong Turbina ornata có hàm lượng sulfate cao và thành phần đường rất đơn giản chỉ gồm fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhóm sulfate cũng được phát hiện thấy chiếm ưu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh được tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4. Hàm lượng fucoidan trong rong nâu Việt Nam chiếm từ 0,5-2,7 % khối lượng khô và chúng thuộc về nhóm galactofucan sulfate. Các fucoidan chiết từ 05 loài rong S. polycystum, S. microcystum, S. swatzii, S. denticarpum và Turbinaria ornata có hoạt tính chống ung thư gan (Hep-2), ung thư màng tim (RD) và fucoidan chiết từ rong S. mcclurei có hoạt tính chống ung thư vú, cả 6 loại fucoidan này đều có hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính chống kháng trực khuẩn mủ xanh là P. Aeruginosa. Trong số fucoidan đem thử hoạt tính thì fucoidan từ rong S.polycystum và Turbinaria ornata có hoạt tính cao nhất. Sử dụng các phương pháp phân tích hóa học, GLC, IR, NMR và ESI-MS nhóm tác giả đã bước đầu đưa ra được đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn fucoidan từ loài rong S.polycystum; S.swartzii và Turbina ornata [51].

Vị trí nhóm sulfate trong fucoidan chiết từ 03 loài rong thuộc chi rong Sargassum và loài rong Turbina ornata nằm ở vị trí C4 của vòng pyranose và chỉ một phần H4 bị sulfate hóa. Nhóm sulfate ở vị trí C4 của cả 02 monome:

fucose và galactose đối với fucoidan từ rong Turbina ornata. Liên kết glycoside chính trong mạch là liên kết (1→3) và có thể có mạch nhánh. Tuy nhiên, các cấu trúc đưa ra trên vẫn chỉ là dự đoán và còn một số vấn đề chưa giải quyết thỏa đáng đó là các dữ liệu phổ về các kiểu liên kết và các chuỗi oligosaccharide trong mạch chính và mạch nhánh của fucoidan.

Năm 2013, các tác giả Bùi Minh Lý, Thành Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Usov và cộng sự đã tìm ra được cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum Việt Nam:

Hình 1. 7. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum

Phạm Đức Thịnh và cộng sự đã chiết fucoidan từ 5 loài rong S. denticapum, S. polycystum, S. swartzii, S. mcclurei và Turbina ornata và nghiên cứu đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn đại diện cho fucoidan của

mỗi loài rong. Tất cả fucoidan chiết từ 5 loài rong nói trên đều thuộc fucogalactan sulfate với liên kết chủ yếu trong mạch chính là 1-3. Đặc biệt, lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L-Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong Sargassum [19].

Trong luận án của Hồ Đức Cường, fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum henslowianum đã được xác định với thành phần đường chính là fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α-(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C2, C4 và một phần của C3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C4 và liên kết với mạch chính qua liên kết glycoside (1 - 4). Đã xác định fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thước cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng các phương pháp hiện đại như tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan được nghiên cứu. Hồ Đức Cường và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm nhưng không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày đã có tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh hoá mỡ máu, khối lượng mỡ trên mô hình chuột béo phì [22].

Đến năm 2017, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã chiết, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lượng phân tử trung bình của các fucoidan từ 6 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss), và T. ornata (Fto) [20].

Điểm nổi bật nhất và mới nhất cho đến hiện nay trong luận án của tác giả Bùi Văn Nguyên là đã nghiên cứu và mô tả được đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ hai loài rong Sargassum duplicatum và Sargassum binderi [20].

-)-1→]n

Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS chothấy phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một galactofucan tạo thành từ 2 loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C2 và β-D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C6. Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N được đề xuất như sau:

-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3

[→3-α-L-Fucp2(OSO3

Hình 1. 8. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết từ rong Turbinaria decurrens.

Bảng 1. 4. Hàm lượng, thành phần hóa học và khối lượng phân tử trung bình

của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam [20].

Thành phần đường trung bình

Gluc

Sulfate

MW

HS

A

(% mol)

Tên loài

(%)

kDa

(%)

Fuc Man Gal Xyl Glc

2,70 32,4

2,7

36,3 11,1 10,2

6,8

25,7

52 S. polycystum

2,10 40,0

2,1

33,1

6,2

20,6

5,2

26,5

26 S. mcclurei

1,60 37,6

1,6

37,0 10,7

7,1

6,5

24,9

38 S. oligocystum

2,2

38,9 15,9

2,0

5,8

25,2

41 S. denticarpum 2,20 42,1

0,68 37,0

0,68

34,8 15,5

6,5

7,4

23,4

41 S. swatzii

2,75 30,3

vết

9,0

vết

7,8

25,6

88 T. ornata

Ngoài ra, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hình dáng và kích thước của các mẫu fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính toán cho các mô hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đường.

Tác giả Bùi Văn Nguyên đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu α đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7 µg/mL).

Bảng 1. 5. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD[20].

Hep-G2 RD

Mẫu Fucoidan

CS% CS% IC50 (µg/mL) IC50 (µg/mL)

29,7 5,5 11,8 5,7 S. polycystum

39,3 14,2 64,8 > 20 S. mcclurei

35,3 15,8 11,2 11,4 S. oligocystum

37,5 7.3 27.9 15.9 S. denticarpum

31,1 5,8 16,5 18,7 S. swatzii

21,8 3,1 4,5 1,6 T. ornata

Năm 2017, nhóm tác giả do Bilan đứng đầu và các cộng sự tại các viện nghiên cứu của Việt Nam đã công bố cấu trúc của fucoidan từ Sargassum aquifolium thu nhận tại vùng biển Việt Nam, bằng phương pháp phân tích

methyl hóa kết hợp phổ NMR các tác giả này đã xác định được 03 polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sulfate deS-2, deS-4, deS-6. Ngoài ra, nhóm các nhà khoa học này đã sử dụng thêm phương pháp đo phổ NMR, HSQC và chứng minh được rằng fucoidan thu nhận từ rong Sargassum aquifolium là một polysaccharide sulfate có cấu trúc vô cùng phức tạp. Thành phần mạch chính được bắt đầu với fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, mức độ phân nhánh cao và bất thường. Trong thành phần cấu trúc có chưa các gốc đường mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic acid và một số lượng lớn nhóm sulfate đính tại các vị trí khác nhau [52].

Hình 1. 9. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Rong nâu Sargassum mcclurei

Rong nâu Sargassum mcclurei hay còn có tên gọi khác là rong mơ hay

rong lá mơ là một loài thuộc ngành rong nâu được phân loài như sau:

Ngành: Ochrophyta

Lớp: Phaeophyceae

Bộ: Facales

Họ: Sargassaceae

Chi: Sargassum

Loài: Sargassum mcclurei

Rong thuộc nhóm túi khí dạng lá, cao đến 2m. Lá với răng cưa ở mép, có nhiều hình dạng: hình nêm ở gốc, hình trứng đến bầu dục ở phần giữa đến đỉnh. Rong mọc thành thảm lớn trên đá, ở mực triều thấp đến vùng dưới triều, nơi sóng vừa [53].

Rong S. mcclurei phân bố dọc bờ biển nước ta ở khu vực miền trung và phía nam từ tỉnh Quảng Bình đến Bà Rịa – Vũng Tàu. Trên địa bàn tỉnh Khánh Hoà, rong S. mcclurei được ghi nhận phân bố tại nhiều địa điểm khác nhau trải dài từ bắc xuống nam gồm: Mũi Dù, Hòn Khói thuộc vịnh Vân Phong, Vạn Ninh; Mỹ Giang, Ninh Vân, Đầm Nha Phu thuộc thị xã Ninh Hoà; Bãi Tiên – Đường Đệ, Hòn Chồng – Sông Lô, Hòn Tre thuộc Vịnh Nha Trang; đảo Bình Ba, Mũi Sốp thuộc vịnh Cam Ranh [20].

Trong luận văn này, rong S. mcclurei được thu thập tại Hòn Chồng - Vịnh Nha Trang vào tháng 6/2020, ngay sau thời kì sinh sản của rong, thường là khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hằng năm. Rong S. mcclurei được thu thập và định danh bởi TS. Võ Thành Trung (chuyên gia phân loài rong biển thuộc Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang).

Hình 2. 1. Rong khô S. mcclurei

2.1.2. Chuẩn bị hóa chất và thiết bị

2.1.2.1. Hóa chất

- Nước cất 2 lần. - Dung dịch HCl.

- Đệm acetate pH=4,5. - CaCl2.

- Viscozyme. - Chất lỏng ion BmimCl.

- Ethanol 96%. - Phenol.

- D-glucose. - Dung dịch H2SO4 đặc 98%.

- Triclorua acetic acid. - Gelatin.

- K2SO4. - BaCl2.

- Carbazole. - NaBH4.

- D-glucuronic acid. - Thuốc thử Folin Ciocalteu.

- Phloroglucinol. - Na2CO3.

- NaK Tartrate. - NaOH.

- Anbumin huyết thanh bò (BSA). - CuSO4.5H2O.

- Amoni molydat. - Na2SO4.

- Axit ascorbic. - DPPH.

2.1.2.2. Thiết bị

- Tủ ấm. - Máy đo mật độ quang.

- Máy khuấy từ. - Máy ly tâm.

- Máy thẩm tách màng 10kDa. - Máy cô quay chân không.

- Bếp đun. - Thiết bị điện di DcodeTM (Biorad)

- Cốc, bình chiết, bình tam giác, ống nghiệm chịu nhiệt, pipette…

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp chiết fucoidan

2.2.1.1. Phương pháp chiết fucoidan bằng nước nóng

Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng được thực hiện theo phương pháp của Sharmilla và cộng sự [39]. Các mẫu rong nâu được cắt nhỏ từ 2-3 cm, xử lý loại màu và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp với Ethanol 85%, Aceton, Chloroform theo tỉ lệ w/v=1/10 trong thời gian từ 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, thu được rong đã loại chất béo, đem phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

Rong khô đã loại chất béo được xay nhỏ, đem ngâm trong nước nóng (tỉ lệ w/v = 1:20) và giữ ở 60 oC trong 3 giờ. Tiến hành chiết lặp lại ba lần, dịch chiết được gom lại, cho thêm tiếp dung dịch CaCl2, lắc đều và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ kết tủa. Sau đó, dịch chiết được thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa và tủa với 4 lần thể tích ethanol 96% thu được polysaccharide thô có chứa fucoidan. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.2.

Rong khô

Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp

Chiết với (Ethanol, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày

Rong đã loại chất béo

Bã rong

Chiết với H2O nóng, 60 oC, t = 3 giờ (3 lần)

Dịch chiết rong

Kết tủa Canxi alginate

Dung dịch CaCl2, ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút

Dịch chiết fucoidan

Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa

Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa

Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96%

Fucoidan thô

Hình 2. 2. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng [39].

2.2.1.2. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch HCl (pH:2-3)

Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch axit HCl (pH:2-3) được thực hiện theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [19]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được chiết với dung môi axit HCl (pH=2), tỉ lệ w/v = 1:20, giữ ở nhiệt độ 60 oC trong thời gian 3 giờ (3 lần). Dịch chiết được gom lại và lọc qua vải lọc, sau đó trung hòa với NaHCO3 đến pH=6-7 và cô quay chân không ở nhiệt độ 60 oC, sau đó thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa. Dịch chiết sau khi làm sạch được cô đặc đến 1/10 thể tích ban đầu và được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% hoặc đông khô thu được bột polysaccharide có chứa fucoidan thô. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.3.

Rong khô

Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp

Chiết với (Cồn, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày

Rong đã loại chất béo

Bã rong

Chiết với HCl, pH=2, 60 oC, t = 3 giờ (3 lần)

Dịch chiết rong

Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa

Trung hòa với NaHCO3 8%, cô đặc thẩm tách bằng màng 10kDa

Dịch chiết fucoidan

Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96%

hoặc đông khô

Fucoidan thô

Hình 2. 3. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu

theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [19].

2.2.1.3. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2%

Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch CaCl2 2% được thực hiện theo phương pháp của Bilan và cộng sự [54]. Rong nâu được xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH:CHCl3:H2O tỷ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với aceton, sấy khô. Rong sau khi sấy khô được chiết với CaCl2 2% (3 lần), mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 85 oC trong 3 giờ. Dịch chiết 3 lần được gom lại, sau đó được thẩm tách loại muối bằng màng 10kDa và được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% thu được bột polysaccharide. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.4.

Rong khô

Hợp chất màu, chất béo có trọng lượng phân tử thấp

Chiết với (MeOH:CHCl3:H2O=4:2:1)

Rong đã loại chất béo

Bã rong

Chiết với CaCl2 2%, 85 oC t = 3 giờ (3 lần)

Dịch chiết rong

Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa

Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa

Dịch chiết fucoidan

Tủa với 3-4 lần thể tích cồn 96%

Fucoidan thô

Hình 2. 4. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu

bằng dung dịch CaCl2 2% [54].

2.2.1.4. Phương pháp chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme

Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme được thực hiện theo phương pháp của Thuan và cộng sự [55]. Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được xay nhỏ, bổ sung đệm acetate pH=4,5 có chứa 1% Viscozyme. Bình chiết được cho vào tủ ấm lắc với nhiệt độ 40 oC trong vòng 6 giờ. Tiến hành chiết lặp lại ba lần, dịch chiết được gom lại, cho thêm tiếp dung dịch CaCl2, lắc đều và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ kết tủa. Dịch chiết sau đó được cô đặc qua màng 10kDa, được kết tủa với 4 lần thể tích EtOH 96% thu được bột polysaccharide. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.5.

Rong khô

Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp

Chiết với (Cồn, Aceton, Chloroform) Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày

Rong đã loại chất béo

Bã rong

Chiết với đệm acetate pH=4,5; 40 oC, Bổ sung 1% viscozyme; t = 6 giờ (3 lần)

Dịch chiết rong

Kết tủa Canxi alginate

Dung dịch CaCl2, ly tâm 5000 vòng/phút

Dịch chiết fucoidan

Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa

Muối, kim loại nặng, các hợp chất có trọng lượng phân tử <10kDa

Tủa với 4 lần thể tích cồn 96%

Fucoidan thô

Hình 2. 5. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme

2.2.1.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion

Phương pháp chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion được thực

hiện theo phương pháp của Pinker và cộng sự[56].

Hình 2. 6. Cơ chế hòa tan xenlulose của BmimCl

(1-butyl-3methylimidazolium chloride) được đề nghị bởi Pinker và cs [56].

Rong nâu được xử lý loại các hợp chất màu và chất béo tương tự như

sơ đồ được nêu tại Hình 2.2. Mẫu rong đã loại chất béo được xay nhỏ, tiến hành chiết trong dung dịch chiết là chất lỏng ion với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu (ml/g) là 30:1, thời gian chiết là 3 giờ, nhiệt độ chiết là 80 oC. Sau đó, thêm vào dung dịch chiết nước cất nóng và khuấy cho đến khi dung dịch đồng nhất, lọc lấy dung dịch chiết, rồi cho cồn để tủa polysaccharide (Vcồn : Vdịch = 4 : 1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 85o, 96o. Đông khô thu được fucoidan. Sơ đồ chiết được trình bày trên Hình 2.7.

Rong khô

Chiết với (Ethanol, Aceton, Chloroform)

Polyphenol, chất màu, các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp

Tỉ lệ w/v=1/10, 10-15 ngày

Rong đã loại chất béo

Chiết với chất lỏng ion, 80 oC,

Bã rong

Tỉ lệ (ml/g) = 30:1; t = 3 giờ (3 lần)

Dịch chiết rong

Thêm nước cất nóng và khuấy

cho đến khi dung dịch đồng nhất

Tủa với 4 lần thể tích cồn 96%

Fucoidan thô

Hình 2. 7. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion [56].

2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan

2.2.2.1. Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate

Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfuric. Chuẩn bị dung dịch mẫu có nồng độ carbohydrate thích hợp, lấy 200µl dung dịch mẫu thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axit sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Dung dịch chuẩn sử dụng glucose hoặc

galactose [57].

2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần đường đơn

Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC sau khi fucoidan được thủy phân axit về các monomer và tiến hành xây dựng đường chuẩn dựa trên diện tích pic tương ứng. Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic acid) 2M, thủy phân trong 6 giờ ở 100 oC sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích hydrat cacbon IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0.6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C- R2 AX. [58].

2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate

Hàm lượng sulfate được xác định bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin. Cân khoảng 5 mg mẫu fucoidan trong một lọ thủy tinh có nút vặn, dung tích 5ml, thêm 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, thời gian 6 giờ. Lấy 10 µl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 µl TCA (Triclorua acetic acid) và 100µl hỗn hợp (0,5% gelatin và 0,5% BaCl2), lắc đều và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 360 nm [59].

2.2.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng uronic acid

Hàm lượng uronic acid được xác định theo phương pháp Carbazol. Lấy 250 μl dung dịch mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic acid) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 ml dung dịch A (0,9g NaBH4 trong 10ml nước cất, thêm 90ml H2SO4 và để lạnh qua đêm), phản ứng được tiến hành ở 100 oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B (100mg carbazole trong 100ml ethanol 96%) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100 oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ = 525 nm. Dùng D-glucuronic acid làm chất chuẩn [60].

2.2.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp Folin Ciocalteu. Lấy 0,5 ml mẫu thêm 0,5 ml nước, tiếp theo cho vào mẫu 1 ml thuốc thử Folin Ciocalteu và 2 ml Na2CO3 10%. Hỗn hợp ủ trong tối 30 phút. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 750 nm. Dùng Phloroglucinol làm chất chuẩn [61].

2.2.2.6. Phương pháp phân tích hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry. Chuẩn bị

hóa chất làm thuốc thử:

- Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N

- Dung dịch B: NaK Tartrate 1% trong nước cất

- Dung dịch C: CuSO4.5H2O 0,5% trong nước cất

Lấy 0,5 ml dung dịch mẫu chứa protein với hàm lượng thích hợp, thêm vào đó 2 ml dung dịch D (48ddA:1ddB:1ddC), lắc đều để yên trong 10 phút, sau đó thêm vào hỗn hợp 0,25 ml Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ cực đại. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 750 nm. Dùng Anbumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn [62].

2.2.2.7. Phương pháp phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan

Vị trí nhóm sulfate được xác định bằng phương pháp phổ IR.

Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (Bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial. Phổ IR được đo trên máy FT-IR Brucker tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [26][58][63].

Bảng 2. 1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại

Đỉnh Dao động

775 Dao động dãn vòng của α- anome

802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6

822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial

845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial

847 Dao động của liên kết C1-H của α- anome

893 Dao động của liên kết C1-H của β- anomer

917 Dao động vòng của α-anome

1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal

1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C

1255-1264 Dao động hoá trị của S=O

1420 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-O

1430 Dao dộng gấp của C-H

1730 Dao động hoá trị của C=O

3300-3440 Dao động hoá trị của O-H

2.2.2.8. Phương pháp điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide

Điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide (C-PAGE) là một phương pháp được sử dụng để mô tả polysaccharide thành tế bào thực vật như hemicellulose, pectins và các sản phẩm thủy phân của carrageenan, fucoidan. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thêm việc sử dụng C-PAGE để khảo sát sự khác nhau về khối lượng phân tử của Fucoidan được thu nhận từ các phương pháp chiết khác nhau, qua đó có thêm cơ sở để nhận xét sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan do việc kết tủa trong tỉ lệ 1:4 thể tích cồn 96% của fucoidan phụ thuộc nhiều vào khối lượng

phân tử của chúng, khối lượng phân tử lớn thì khả năng kết tủa trong cồn của fucoidan càng hiệu quả. Ngoài ra, hoạt tính sinh học của fucoidan cũng đã được chứng minh phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng [5][6][7][8].

Quy trình phân tích C-PAGE được mô tả như sau. Các fucoidan thô được trộn với 10μL dung dịch đệm chứa 10% glyxerol trong nước và 0,02% phenol đỏ. Điện di các oligosaccharide đã sunfat hóa được thực hiện bằng cách sử dụng gel xếp chồng 5% (w / v) với đệm Tris-HCl 50 mM có pH=6,8 và 27% (w / v) phân giải gel polyacrylamide với đệm Tris-HCl 150 mM có pH=8,8. Nhuộm gel được thực hiện với dung dịch chứa 0,01% O-toluidine xanh lam trong etanol, axit axetic và nước với tỷ lệ thể tích 2:1:1 hoặc với xanh lam alcian và xanh lam toluidine. Quá trình nhuộm các oligomer fucoidan cũng được thực hiện bằng dung dịch nitrat xanh và bạc alcian. Các dải trên điện đồ tương ứng với các oligosaccharide tích điện âm[64].

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan

2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính oxy hóa tổng số

Khả năng chống oxy hóa tổng được xác định bằng phương pháp Prieto. Lấy 0,5 ml mẫu thêm 0,5 ml nước và 3 ml dung dịch phản ứng (0,6 Mol axit sunfuric, 28 mMol natrisulfate và 4 mMol amoni molydat) được đặt ở 95 oC trong 90 phút. Đo mật độ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 695 nm. Dùng axit ascorbic làm chất chuẩn [65].

2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH.

Chuẩn bị hóa chất:

- Dung dịch DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl): Cân 25 mg pha

trong 1000 ml ethanol tuyệt đối. Giữ trong bình tối.

- Axit ascorbic: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước.

- Các mẫu chất: Pha nồng độ 1 mg/ml trong nước.

Tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH:

- Mẫu trắng: 1 ml nước cất + 3 ml ethanol tuyệt đối.

- Mẫu âm tính: 1 ml nước cất + 3 ml DPPH.

- Các mẫu kiểm tra: 0,5 ml mẫu chất + 0,5 ml nước cất + 3 ml DPPH.

Tất cả các thí nghiệm được lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút, sau đó được đo độ hấp thu quang ở bước sóng 517 nm [66]. Khả năng khử gốc tự do DPPH (SC) được xác định theo công thức sau:

SC (%) = 100 – {100 x ( OD mẫu kiểm tra – OD mẫu trắng)/OD âm tính}

2.3. THỰC NGHIỆM

2.3.1. Thu thập và xử lý rong nâu Sargassum mcclurei

Mẫu rong S. mcclurei được thu thập ngay sau thời kì sinh sản vào tháng 6 năm 2020 tại khu vực Hòn Chồng, vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch tạp chất bằng nước biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khối lượng mỗi mẫu thu tối tiểu là 10kg rong tươi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.

2.3.2. Chiết fucoidan trong rong nâu Sargassum mcclurei

Trong luận văn này, tiến hành chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei

theo 05 phương pháp gồm:

Chiết fucoidan từ nước nóng theo phương pháp đã trình bày tại Tiểu

mục 2.2.1.1.;

Chiết fucoidan bằng dung dịch axit HCl (pH=2-3) theo phương pháp đã

trình bày tại Tiểu mục 2.2.1.2.;

Chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2% theo phương pháp đã trình

bày tại Tiểu mục 2.2.1.3.;

Chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme theo phương pháp đã trình bày

tại Tiểu mục 2.2.1.4.;

Chiết fucoidan bằng chất lỏng ion theo phương pháp đã trình bày tại

Tiểu mục 2.2.1.5.

2.3.3. Xác định thành phần hóa học của fucoidan

Tiến hành phân tích hàm lượng carbohydrate theo phương pháp đã trình

bày tại tiểu mục 2.2.2.1.;

Tiến hành phân tích hàm lượng sulfate theo phương pháp đã trình bày tại

tiểu mục 2.2.2.3.;

Tiến hành phân tích hàm lượng uronic acid theo phương pháp đã trình

bày tại tiểu mục 2.2.2.4.;

Tiến hành phân tích hàm lượng polyphenol theo phương pháp đã trình

bày tại tiểu mục 2.2.2.5.;

Tiến hành phân tích hàm lượng protein theo phương pháp đã trình bày

tại tiểu mục 2.2.2.6.;

Tiến hành phân tích thành phần đường đơn theo phương pháp đã trình

bày tại tiểu mục 2.2.2.2.;

Tiến hành phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan theo phương

pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.2.7.

2.3.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan

Tiến hành xác định hoạt tính oxy hóa tổng số của fucoidan theo phương

pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.1.;

Tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH theo phương

pháp đã trình bày tại tiểu mục 2.2.3.2.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN

Trong luận văn này, chúng tôi phân tích các chỉ tiêu carbohydrate tổng số, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid, hàm lượng polyphenol, hàm lượng protein, hàm lượng hoạt tính chống oxy hóa tổng số, thành phần đường đơn bằng các phương pháp truyền thống như trắc quang và phương pháp hiện đại như HPLC... Để phân tích định lượng các chỉ tiêu trên, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn để xác định khoảng tuyến tính và độ tin cậy. Kết quả dẫn ra trên các phụ lục 1, 5, 6, 7, 8.

Kết quả phân tích cho thấy tất cả các giá trị R2 của các phương trình đường chuẩn đều có giá trị ~ 1,0 chứng tỏ các phương trình tuyến tính có độ tin cậy cao. Chúng tôi xác định hàm lượng các chất thông qua phương trình đường chuẩn và khoảng tuyến tính của nồng độ tương ứng.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RONG NGUYÊN LIỆU

Để định hướng các phương pháp chiết, đầu tiên, các thành phần hóa học của rong nguyên liệu S. mcclurei được xác định. Kết quả phân tích các thành phần hóa học của rong nguyên liệu bao gồm: Tro; Độ ẩm; Protein tổng số; Carbohydate tổng số; Fucoidan; Alginate; Polyphenol tổng số và Hàm lượng sulfate tổng số thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3. 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong nguyên liệu

Chỉ tiêu phân tích M1 M2 M3 S T T Đơn vị tính Kết quả phân tích Giá trị trung bình

37,8 36,8 38,8 37,8 ± 1,0 % 1 Tro

19,4 18,3 20,2 19,3 ± 1,0 % 2 Độ ẩm

5,5 5,8 5,9 5,7 ± 0,2 % 3 Protein tổng số

35,0 34,5 36,4 35,3 ± 1,0 % 4 Carbohydate tổng số

29,9 30,8 32,7 31,1 ± 1,4 % 5 Alginate

0,2 0,2 0,2 0,2 ± 0,0 % 6 Polyphenol tổng số

% 3,2 3,3 3,6 3,4 ± 0,2 7 Fucoidan

% 4,5 4,3 4,7 4,5 ± 0,2 8 Hàm lượng sulfate tổng số

5,1 5,2 5,4 5,2 ± 0,2 9 Hàm lượng cellulose tổng số %

Kết quả tại Bảng 3.1 cho thấy, các thành phần cơ bản trong thành tế bào rong nâu đều hiện diện trong thành phần của rong S. mcclurei. Trong đó, hàm lượng fucoidan khi chiết bằng phương pháp hóa học chiếm 3,4%; alginate chiếm 31,1% và polyphenol tổng số chiếm 0,2%. Để có thể thích nghi với điều kiện sống ở vùng biển nhiệt đới, các thành phần như alginate, fucoidan và polyphenol liên kết chặt chẽ với nhau, liên kết với cellulose để tạo cấu trúc thành tế bào vững chắc [67] (Hình 3.1.).

Hình 3. 1. Mô hình cấu trúc thành tế bào của rong nâu [67]

Trong các thành phần rong nâu thì fucoidan liên kết chặt chẽ với mạng lưới cellulose và hemicellulose, liên kết với protein và cả với polyphenol thông qua các liên kết hóa học chặt chẽ. Do đó, muốn chiết xuất hiệu quả fucoidan cần có những phương pháp chiết thích hợp. Nguyên tắc của sự chiết xuất là sự thẩm thấu của fucoidan qua thành tế bào vào môi trường chiết (phương pháp chiết axit, nước và CaCl2), bên cạnh đó khi sử dụng enzyme hoặc dùng chất lỏng ion có thể phá vỡ các liên kết của của fucoidan với thành phần khác của thành tế bào như cellulose và hemicellulose có thể dẫn đến nâng cao hiệu suất chiết fucoidan, đồng thời với điều kiện chiết nhẹ nhàng có thể bảo tồn được cấu trúc của fucoidan. Do đó, trong đề tài này, 5 phương

pháp chiết được sử dụng đó là: Chiết bằng nước nóng; Chiết bằng axit HCl (pH=2-3); Chiết bằng dung dịch CaCl2 2%; Chiết có hỗ trợ enzyme và Chiết bằng chất lỏng ion được thực hiện với các nguyên tắc sau:

- Chiết bằng nước nóng: Dựa vào sự thẩm thấu của fucoidan trong môi

trường nước, nhiệt độ càng cao thì khả năng hòa tan cao.

- Chiết bằng dung dịch CaCl2 2%: Ion Ca2+ đã kết tủa với các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu về dạng muối canxi alginate không tan, do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc.

- Chiết bằng HCl (pH 2-3): Trong môi trường axit, các muối alginate chuyển về dạng axit alginic không tan, do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc.

- Chiết có hỗ trợ enzyme: Sử dụng Viscozyme với thành phần gồm cellulase và hemicellulase để phá vỡ thành cellulsose, giải phóng fucoidan vào môi trường chiết.

- Chiết bằng chất lỏng ion: Chất lỏng ion có thể hòa tan một lượng lớn carbohydrate từ sinh khối của rong nâu, nhiệt độ càng tăng thì khả năng hòa tan càng mạnh, phá vỡ thành cellulsose, giải phóng fucoidan vào môi trường chiết.

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG SARGASSUM MCCLUREI BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chiết fucoidan bằng các phương pháp chiết gồm: chiết bằng nước nóng, chiết bằng dung dịch axit HCl (pH=2-3), chiết bằng dung dịch CaCl2 2%, chiết có sự hỗ trợ của enzyme và chiết bằng chất lỏng ion từ loài rong nâu S. mcclurei được thu nhận vào cùng một thời điểm, cùng một địa điểm (khu vực biển Hòn Chồng, Vịnh Nha Trang vào tháng 06/2020), nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu nhận fucoidan. Kết quả dẫn ra trên Bảng 3.2.

Bảng 3. 2. Hiệu suất thu nhận fucoidan từ các phương pháp chiết khác nhau

Phương pháp chiết

Các kết quả

thu nhận

Chiết có hỗ trợ enzyme Chiết bằng chất lỏng ion Chiết bằng nước nóng Chiết bằng HCl (pH=2-3) Chiết bằng CaCl2 2%

50 50 50 50 50 Khối lượng rong khô đã chiết (g)

3,8 ± 0,5 3,4 ± 0,2 2,8 ± 0,2 13,4 ± 0,4 13,1 ± 0,5

Hiệu suất thu nhận fucoidan (% khối lượng của rong khô)

Kết quả thực nghiệm tại Bảng 3.2 cho thấy hiệu suất chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei thu nhận tại cùng 1 địa điểm, cùng 1 thời điểm đối với những phương pháp chiết khác nhau là khác nhau, dao động từ 2,8 ± 0,2 % (đối với chiết bằng CaCl2 2%) đến 13,4 ± 0,4 % (đối với chiết có hỗ trợ enzyme). Trong đó, hiệu suất chiết của 2 phương pháp có hỗ trợ enzyme và sử dụng chất lỏng ion là gần như nhau với các giá trị 13,4 % và 13,1 % và hiệu suất này cao gấp 3,5 đến 4,7 lần so với các phương pháp chiết còn lại là pháp chiết bằng dung môi trung tính (nước nóng), chiết bằng dung môi axit, chiết bằng dung dịch CaCl2 2%.

Khi sử dụng phương pháp chiết với sự hỗ trợ của enzyme, hiệu suất thu nhận là lớn nhất đạt 13,4 %. Điều này có thể được giải thích đó là do sự hoạt động của enzyme cellulase và hemicellulase đã phá vỡ cấu trúc bền vững của thành thế bào rong nâu, giải phóng fucoidan vào trong môi trường chiết. Bên cạnh đó, với điều kiện chiết của enzyme, fucoidan không bị phá vỡ cấu trúc thành những mono hoặc oligosaccharide không thể kết tủa được bằng cồn nên hiệu suất thu nhận được cao. Điều này được chứng minh bằng việc so sánh khối lượng phân tử của fucoidan bằng phương pháp C-PAGE (Hình 3.2)

1 2 3 4 5

Hình 3. 2. Hình điện di C-PAGE của fucoidan chiết bằng các phương pháp chiết khác nhau: (1) Chiết bằng HCl; (2) Chiết có hỗ trợ enzyme; (3) chiết bằng CaCl2; (4) Chiết bằng chất lỏng ion; (5) Chiết bằng nước nóng.

Theo kết quả phân tích tại Bảng 3.1. (Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong nguyên liệu) thì hàm lượng carbohydrate chiếm đến 35,3% bao gồm fucoidan, laminaran, cellulose, hemicelulose và lượng nhỏ tinh bột (α-1,4- glucan) khoảng 1-4,0 %. Trong đó, cellulose tan trong chất lỏng ion dạng[Bmim][Cl] do hình thành liên kết hydro giữa OH-cellulose và chất lỏng ion (Ils) theo cơ chế cho nhận Hình 2.6, kết quả là thành tế bào rong nâu hoàn toàn bị phá vỡ kéo theo phần lớn các chất chứa trong chúng được hòa tan trong chất lỏng ion. Sau đó, chiết fucoidan ra khỏi chất lỏng ion và tủa bằng cồn.

Như vậy, chiết với hỗ trợ enzyme và chiết bằng chất lỏng ion đều tác động đến thành tế bào rong nâu thông qua sự phá vỡ liên kết của cellulose, hemicelulose và hòa tan cellulose. Kết quả này dẫn theo các chất tan trong dung dịch chiết sẽ được kéo ra khỏi thành tế bào rong, chính vì vậy mà hiệu suất chiết fucoidan bằng 02 phương pháp nói trên là cao nhất và có giá trị gần như nhau. Trong khi đó, chiết fucoidan bằng 03 phương pháp còn lại là chiết bằng nước nóng, dung dịch HCl pH=2 và chiết bằng dung dịch CaCl2 2% đều dựa trên khả năng fucoidan và một số hợp chất khác được thẩm thấu qua thành tế bào rong

nâu và hòa tan trong dung môi chiết, vì vậy hiệu suất chiết fucoidan của cả 03 phương pháp này đều khác biệt hoàn toàn so với hiệu suất của 02 phương pháp có khả năng phá vỡ và hòa tan thành tế bào rong nâu.

Bên cạnh đó, sự khác nhau về hiệu suất chiết fucoidan bằng các dung môi khác nhau còn có thể được giải thích là do các dung môi khác nhau sẽ có độ phân cực, moment lưỡng cực và liên kết hiđro khác nhau..., từ đó chúng sẽ có sự tác động khác nhau để phá vỡ các liên kết không bền của fucoidan trong thành tế bào rong nâu và thu được fucoidan trong dung dịch chiết, chính sự tác động khác nhau này của các phương pháp chiết đã làm cho ở cùng 1 loài rong rong nâu S. mcclurei thu nhận tại cùng 1 địa điểm, cùng 1 thời gian mà hiệu suất chiết fucoidan thu nhận được có sự khác nhau. Cụ thể, khi tiến hành chiết fucoidan với dung dịch CaCl2 2% và dung môi axit, ion Ca2+ và H+ đã xảy ra phản ứng trao đổi với các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu để đưa về dạng kết tủa của muối canxi alginate và axit alginic do đó thành phần alginate được cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc. Tuy nhiên, cũng chính những kết tủa này vô hình trung đã bó chặt các phân tử fucoidan trên thành tế bào của rong nâu, làm cho hiệu suất chiết fucoidan của phương pháp chiết bằng 2 dung môi này giảm đi rõ rệt so với chiết sử dụng dung môi nước. Ngoài ra, CaCl2 còn liên kết với các hợp chất polyphenol hình thành phức không tan và cố định trên bã rong, do đó sản phẩm fucoidan thô thu nhận được khi chiết bằng phương pháp này cũng tinh khiết hơn.

So với các kết quả về hàm lượng fucoidan đã được công bố trước đó của các loài rong cùng chi Sargassum của Việt Nam theo các phương pháp chiết khác nhau: chiết bằng nước nóng, chiết bằng dung dịch axit HCl (pH=2- 3), chiết bằng dung dịch CaCl2 (Bảng 3.3). Có thể thấy hàm lượng fucoidan trong cùng một chi rong theo các phương pháp chiết khác nhau cũng khác nhau, theo các nhà nghiên cứu trước đây sự khác nhau về hàm lượng fucoidan trong các loài rong này có thể được giải thích là do sự khác nhau về thời gian thu rong, vị trí địa lý và đặc biệt là do sự khác nhau ở phương pháp chiết.

Bảng 3. 3. Hàm lượng fucoidan thu nhận từ các loài rong

cùng chi Sargassum của Việt Nam theo các phương pháp chiết khác nhau

Loài rong Stt Hàm lượng fucoidan Tài liệu tham khảo và phương pháp chiết Thời điểm thu hoạch rong Địa điểm thu hoạch rong % *

1 2,00 [19] Từ 3- 6/2014 Sông Lô - Nha Trang Sargassum denticapum chiết bằng axit HCl (pH=2-3)

2 1,98 [20] Tháng 5/2014 Sông Lô - Nha Trang Sargassum denticapum chiết bằng CaCl2 2%

3 2,30 [16] Từ 3- 6/2018 Vịnh Nha Trang Sargassum Oligocystum chiết bằng nước nóng

4 1,78 [16] Từ 3- 6/2018 Vịnh Nha Trang Sargassum Oligocystum chiết bằng axit HCl (pH=2-3)

5 1,44 [16] Từ 3- 6/2018 Vịnh Nha Trang Sargassum Oligocystum chiết bằng CaCl2 2%

* Hàm lượng tính theo khối lượng rong khô đã loại chất béo

Như vậy, phương pháp chiết có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất chiết fucoidan. Hiệu suất chiết fucoidan đạt giá trị cao nhất khi phương pháp chiết có hỗ trợ enzyme và phương pháp chiết sử dụng nhựa lỏng ion. Hiệu suất chiết fucoidan thấp nhất khi chiết sử dụng dung dịch CaCl2.

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI

Để có căn cứ nhằm đưa ra những đánh giá khoa học về phân tích ảnh hưởng của phương pháp chiết lên thành phần hóa học của fucoidan được thu nhận từ rong nâu S. mcclurei, chúng tôi tiến hành hệ thống các trị số phân tích về hàm lượng: carbohydrate, sulfate, uronic axit, protein và polyphenol trong Bảng 3.4; Thành phần đường đơn của fucoidan thu nhận được trong Bảng 3.6.

Bảng 3. 4. Thành phần hóa học fucoidan thu nhận được

từ các phương pháp chiết khác nhau

Phương pháp chiết

Các kết quả Chiết có

thu nhận

Chiết bằng nước nóng Chiết bằng HCl (pH=2-3) Chiết bằng CaCl2 2% Chiết bằng chất lỏng ion hỗ trợ enzyme

(TN1) (TN2) (TN3) (TN5) (TN4)

17,17 11,94 8,42 18,79 19,00

± 0,02 ± 0,03 ± 0,03 ± 0,05 ± 0,20 Hàm lượng carbohydrate tổng (%) (*)

Hàm lượng sulfate 28,45 44,36 48,18 19,25 22,60

(%) (*) ± 0,03 ± 0,02 ± 0,05 ± 0,03 ± 0,30

12,53 5,24 3,92 7,08 9,80

Hàm lượng uronic acid (%) (*) ± 0,02 ± 0,02 ± 0,02 ± 0,02 ± 0,10

17,76 8,82 7,89 13,28 12,70

Hàm lượng protein (%) (*) ± 0,01 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,03 ± 0,30

3,20 3,14 2,97 1,75 4,00

Hàm lượng polyphenol (%) (*) ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,05

* Hàm lượng tính theo khối lượng mẫu fucoidan thô phân tích

Dựa vào kết quả phân tích Bảng 3.4 dễ dàng nhận thấy rằng phương pháp chiết có ảnh hưởng rõ rệt lên thành phần hóa học chính của fucoidan. Các phương pháp chiết kèm theo sự phá vỡ liên kết của cellulose, hemicelulose và hòa tan cellulose như chiết hỗ trợ enzyme và chiết bằng nhựa lỏng ion có sự thay đổi thành phần so với các phương pháp chiết khác như chiết bằng dung dịch HCl pH=2 và chiết bằng dung dịch CaCl2. Sự thay đổi các thành phần cao nhất và thấp nhất được chúng tôi đưa ra trên Bảng 3.5.

Bảng 3. 5. Nhận xét các chỉ số thành phần hóa học fucoidan thu nhận được

từ các phương pháp chiết khác nhau

Chỉ số Cao nhất Thấp nhất

TN5 TN3 Carbohydrate

(Chiết bằng chất lỏng ion) tổng (Chiết bằng CaCl2 2%)

TN3 TN4 Sulfate (Chiết có hỗ trợ enzyme) (Chiết bằng CaCl2 2%)

TN1 TN3 Uronic acid (Chiết H2O) (Chiết bằng CaCl2 2%)

TN1 TN3 Protein (Chiết H2O) (Chiết bằng CaCl2 2%)

TN5 TN4 Polyphenol (Chiết bằng chất lỏng ion) (Chiết có hỗ trợ enzyme)

Hàm lượng carbohydrate, uronic acid, protein của các dịch chiết bằng 02 phương pháp hỗ trợ enzyme và nhựa lỏng ion cao hơn nhiều so với hàm lượng các chất tương ứng của các dịch chiết của 02 phương pháp chiết bằng dung dịch HCl pH=2 và dung dịch CaCl2. Trong khi đó, hàm lượng sulfate lại nhỏ hơn nhiều khi so sánh giữa 2 nhóm phương pháp trên. Cụ thể như sau hàm lượng carbohydrate cao hơn từ 1,57 đến 2,23 lần, hàm lượng uronic acid cao hơn từ 1,35 đến 2,5 lần, hàm lượng protein cao hơn từ 1,43 đến 1,86 lần và hàm lượng sulfate lại nhỏ hơn từ 2,1 đến 2,5 lần. Kết quả trên có thể giải thích như sau:

Trong rong nâu thành phần các polysaccharide tan trong nước bao gồm: laminaran, axit manuronic, sulfate polysaccharide (fucoidan) và một số đường tự do như manitol... Các hợp chất này tồn tại bên trong tế bào rong nâu hoặc tạo liên kết yếu với các các polyme khác như alginate, phlorotannin và mạch

peptide, tuy nhiên các liên kết này dễ dàng bị phá hủy tại nhiệt độ cao. Khi thành rong nâu (cellulose và hemicellulose) bị phá vỡ bằng enzyme và tan trong nhựa lỏng ion thì các polysaccharide này dễ dàng tan trong dung môi chiết. Chính vì vậy mà hàm lượng carbohydrate, uronic acid và protein (Bảng 3.4) của dung dịch chiết fucoidan bằng 02 phương pháp này cao hơn các phương pháp khác. Điều này cũng giải thích hàm lượng các thành phần đường như glucose và manitol cao (Bảng 3.6) của dịch chiết từ 02 phương pháp trên.

Khi sử dụng dung môi chiết là dung dịch HCl có pH=2 và dung dịch CaCl2 không những chuyển các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu về dạng muối canxi alginate không tan mà còn chuyển một số dạng axit uronic và muối của chúng ở dạng tan trong nước có trong thành tế bào rong nâu như (axit manuronic, axit guluronic) thành muối canxi uronate không tan trong nước hoặc axit uronic khó tan trong nước. Đây là nguyên nhân gây ra sự khác biệt rõ ràng về hàm lượng các thành phần các axit uronic trong các dung dịch chiết khi sử dụng các phương pháp chiết khác nhau. Đó là hàm lượng axit manuronic và axit guluronic trong dịch chiết bằng 02 phương pháp chiết hỗ trợ enzyme và chiết bằng nhựa lỏng ion cao hơn nhiều lần so với hàm lượng các axit tương ứng trong các phương pháp chiết bằng dung dịch HCl pH=2 và dung dịch CaCl2 (Bảng 3.6).

Bảng 3. 6. Thành phần đường đơn của fucoidan thu nhận được

từ các phương pháp chiết khác nhau (µmol/ml)

Chiết bằng HCl

Chiết bằng CaCl2

Chiết H2O

Chiết có hỗ trợ enzyme

Chiết bằng chất lỏng ion

Loại đường

pH=2-3

2%

(TN1)

(TN4)

(TN5)

(TN2)

(TN3)

Mannitol 0,30 ± 0,03

0,28 ± 0,06

0,28 ± 0,05

0,91 ± 0,41

0,89 ± 0,30

Fucose

5,25 ± 0,18

2,30 ± 0,07

4,45 ± 0,01

0,49 ± 0,14

0,70 ± 0,10

Không

Rhamnose 0,37 ± 0,05

0,37 ± 0,07

0,42 ± 0,00

0,01 ± 0,00

phát hiện

Galactose 1,37 ± 0,19

1,88 ± 0,28

0,50 ± 0,01

0,43 ± 0,11

0,60 ± 0,10

Glucose

2,32 ± 0,16

1,56 ± 0,39

1,27 ± 0,02

6,16 ±1,38

6,40 ± 0,20

Xylose

0,62 ± 0,04

1,02 ± 0,06

0,43 ± 0,05

0,21 ± 0,07

0,50 ± 0,16

Mannose 0,21 ± 0,08

0,24 ± 0,02

0,20 ± 0,03

0,26 ± 0,06

0,10 ± 0,05

GuluA

0,81 ± 0,16

0,81 ± 0,02

0,28 ± 0,02

5,65 ± 0,14

0,90 ± 0,10

GluA

0,21 ± 0,04

0,21 ± 0,16

0,21 ± 0,00

0,12 ± 0,03

0,20 ± 0,05

ManA

6,16 ± 1,18

6,16 ± 0,04

0,49 ± 0,00

18,45 ± 0,02 18,70 ± 0,20

Kết quả Bảng 3.6 cho thấy rong S. mcclurei có chứa các loại monosaccharide trung tính như mannitol, fucose, rhamnose, galactose, glucose, xylose và mannose với tỷ lệ khác nhau. Sự hiện diện của các monosaccharid trung tính quyết định sự hiện diện của polysaccharid trong rong nâu như fucose là thành phần đường cơ bản của fucoidan; glucose là thành phần của laminaran hoặc cellulose và uronic acid là thành phần của alginic acid. Do đó, fucoidan, laminaran và alginic acid là các polysacchride đều hiện diện trong thành phần của fucoidan thô chiết từ rong S. mcclurei bằng các phương pháp chiết khác nhau.

Tiến hành so sánh hàm lượng fucose trong các phương pháp chiết khác nhau, có thể nhận thấy tỉ lệ fucose:galactose biến đổi từ 1:0,112 đến 1:0,938. Đặc biệt, hàm lượng galactose chiếm tỉ lệ gần bằng hàm lượng fucose được lặp lại ở phương pháp chiết axit, chiết có hỗ trợ enzyme và chiết bằng chất lỏng ion, từ đó có thể dự đoán fucoidan thu được từ rong S. mcclurei là galactofucan, phù hợp với công bố của Phạm Đức Thịnh và cộng sự năm 2015[19].

Phân tích về hàm lượng uronic acid có trong rong nhận thấy, hàm lượng uronic acid trong S. mcclurei rất cao, trong đó ManA là thành phần chính với lần lượt là 6,16; 6,16; 0,49; 18,45; 18,70% theo thứ tự các phương pháp chiết khác nhau từ TN1 đến TN5. Điều này có thể được giải thích rằng các uronic acid là thành phần của alginate vẫn còn lẫn trong fucoidan. Bên cạnh đó, các uronic acid còn là thành phần cấu tạo nên fucoidan[54].

Ngoài ra, khi so sánh với các phương pháp chiết hóa học ở TN1, TN2

và TN3, có thể nhận thấy lượng monosaccharide nói chung và lượng đường fucose nói riêng là một loại monosaccharide đặc trưng của fucoidan trong TN4 (chiết có hỗ trợ enzyme) có sự thấp hơn rõ rệt, điều này có thể dự đoán là do các phân tử đường trong fucoidan bị ảnh hưởng khi xử lý bằng enzyme. Đồng thời lượng fucose thấp đi và lượng uronic acid tăng lên rõ rệt khi chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme cũng có thể được giải thích thêm là do enzyme sử dụng trong TN4 không chọn lọc mục tiêu là alginate, dẫn đến hàm lượng alginate trong fucoidan thô thu được khi chiết có hỗ trợ enzyme tăng hơn nhiều.

Như vậy, phương pháp chiết có ảnh hưởng đến thành phần hóa học của dịch chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei, tuy nhiên dạng cấu trúc của fucoidan không thay đổi đó là dạng galactofucan sulfate. Phương pháp chiết ảnh hưởng đến hàm lượng các thành phần của dịch chiết làm chúng thay đổi nhiều lần như manitol (từ 0,28 đến 0,91%), fucose (từ 0,49 đến 5,25%), glucose (từ 1,27 đến 6,40%), axit manuronic (từ 0,49 đến 18,70%), axit guluronic (từ 0,12 đến 0,21%),...

3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN VỊ TRÍ CỦA NHÓM SULFATE TRÊN FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI

Theo các tài liệu đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường,... trong đó hàm lượng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của fucoidan. Sulfate là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định hoạt tính sinh học của fucoidan, theo các nhà khoa học, hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng ung thư của fucoidan phụ thuộc vào mật độ và vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường. Vì vậy, việc phân tích hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường trong phân tử fucoidan sẽ giúp ta làm sáng tỏ về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và đặc trưng cấu trúc của chúng. Phổ hồng ngoại IR là một trong những phương pháp đơn giản nhất thường được

sử dụng để xác định vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường.

Phổ hồng ngoại là phương pháp phân tích nhanh và thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vạch phổ dao động tương ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử. Trong phân tích cấu trúc của polysaccharide, phương pháp phổ IR cho biết các thông tin về vị trí nhóm sulfate tồn tại trong phân tử fucoidan, từ đó cho biết về đặc trưng cấu trúc của chúng. Theo các tài liệu tham khảo, các dao động hấp thụ ở vùng số sóng 820-828 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-S ở vị trí equatorial C2 hoặc/và C3, vùng 840-848 cm-1 đặc trưng cho liện kết C-O-S ở vị trí axial C4, vùng 1240-1272 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của S=O, vùng 1610-1625 cm- 1 và 1410 cm-1 đặc trưng cho dao động đối xứng và không đối xứng của nhóm cacboxylat.

Để khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết lên vị trí của nhóm sulfate của polysaccharide, chúng tôi tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR) của các mẫu polysaccharide thu được khi sử dụng các phương pháp chiết khác nhau. Phổ hồng ngoại của các mẫu được trình bày trên Hình 3.3 đến 3.7 và phân tích phổ được dẫn ra trên Bảng 3.7.

Bảng 3. 7. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các mẫu

sulfate polysaccharide trong vùng 800-4000 cm-1

Mẫu polysaccharide

Tần số

Dạng dao động

cm-1

TN1 TN2 TN3 TN4 TN5

OH

++++ ++++ ++++ ++++ ++++

3650-3200

C-H

++

+

++

3000-2850

Uronic acid

++++ +++ ++++ ++++ +++

1650

O=S=O

+

++

+

++

1370

1240-1260

S=O of sulphate esters

++++

++++ +++ ++++

C-O-C

+++

1150

Liên kết glycoside C-O-C

++++

+

++

1050

960 Galactose

+++

+

845-850

+++

++++

+

+++

C–O–SO4 on C4 of pyrannose

825-830

C–O–SO4 on C3 of pyrannose

805-808

C–O–SO4 on C2 of

+

pyrannose

++++: Cường độ rất mạnh +++: Cường độ mạnh

++: Cường độ trung bình +: Cường độ yếu

Khi khảo sát phổ IR mẫu fucoidan thô từ TN1 đến TN5, chúng tôi nhận thấy tương tự như phổ hồng ngoại của fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới và ở Việt Nam, phổ hồng ngoại của mẫu fucoidan thô chiết từ rong nâu S. mcclurei tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa cũng chứa những tín hiệu hấp thụ ở vùng số sóng 1240-1272 cm-1 (vùng dao động đặc trưng của liên kết S=O) và vùng 800-848 cm-1 (vùng dao động của liên kết C- O-S) khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate.

Hình 3. 3. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN1

Trên phổ IR của mẫu fucoidan thô chiết từ TN1 (Chiết bằng H2O) (Hình 3.3) xuất hiện các tín hiệu hấp thụ tại 3418,32 cm-1 là của nhóm O-H,

dải hấp thụ rộng tại 1263,55 cm-1 thuộc về các dao động hóa trị S=O của nhóm sulfate (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1635,80 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic acid. Dải hấp thụ tại 840,96 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C4 và/hoặc C-2, C- 3 của vòng pyranose. Dải hấp thụ ở 1042,11 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal. Ngoài ra, trên phổ IR của mẫu TN1 còn xuất hiện 02 vân phổ có cường độ nhỏ tại vùng 960 cm-1 và 805 cm-1, thuộc về dao động của gốc đường galactose và dao động của liên kết C- S-O tại vị trí C2 trong vòng pyrannose.

Hình 3. 4. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN2

Phổ IR của fucoidan thô TN2 (Chiết bằng axit HCl pH=2) (Hình 3.4): Dải hấp thụ tại 3445,26 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ tại 2924 cm-1 là đặc trưng cho các liên kết C-H. Dải hấp thụ ở 1632,62 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic acid. Dải hấp thụ ở 1122,68 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal. Trên phổ hồng ngoại IR có xuất hiện tín hiệu tại 1384 cm-1 xác nhận sự có mặt của liên kết O=S=O, tuy nhiên không thấy xuất hiện các vân phổ tại 1250 cm-1 và các vân phổ thuộc vùng 800-850 cm-1 xác nhận sự có mặt các liên kết C-O-S. Trong khi kết quả phân tích tại Bảng 3.5 cho thấy hàm lượng sulfate của mẫu fucoidan TN2 là 44,36 %. Kết quả này có thể là do khi chiết tại môi trường pH=2 đã xảy ra quá trình phá vỡ một số liên kết không bền trong đó có liên kết C-O-S

và như vậy dẫn đến hàm lượng sulfate tạo liên kết với gốc đường giảm, chính vì vậy mà trên phổ hồng ngoại chỉ thấy xuất hiện vân phổ xác nhận sự có mặt nhóm sulfate mà không xuất hiện vân phổ xác nhận sự có mặt liên kết C-O-S.

Hình 3. 5. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN3

Phổ IR của fucoidan thô TN3 (Chiết bằng CaCl2 2%) (Hình 3.5): Xuất hiện các dải hấp thụ tại 3444,71 cm-1 và 2938 cm-1 xác nhận sự có mặt của các liên kết thuộc nhóm O-H, và nhóm C-H tương ứng. Dải hấp thụ tại 1253,83 cm-1 (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1646,03 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic acid. Dải hấp thụ tại 963,26 cm-1 khẳng định sự có mặt của gốc đường galactose. Dải hấp thụ ở 1044,47 cm−1 thuộc về dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal. Trong vùng 850 - 800 cm-1 có xuất hiện vân phổ 839,6 cm-1 với cường độ mạnh và vân phổ 805 cm-1 với cường độ yếu. Kết quả này có thể khẳng định nhóm sulfate của mẫu TN3 chủ yếu liên kết tại vị trí C4 trong vòng pyrannose và một lượng nhỏ liên kết tại vị trí C2 trong vòng pyrannose.

Hình 3. 6. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN4

Phổ IR của fucoidan thô TN4 (Chiết có sự hỗ trợ của enzyme) (Hình 3.6): Dải hấp thụ tại 3445,94 cm-1 và 2925,96 cm-1 là của nhóm O-H và nhóm C-H. Dải hấp thụ ở 1633,18 cm−1 xác nhận sự có mặt của uronic acid. Sự có mặt của nhóm sulfate được xác nhận bới 02 vân phổ 1250 cm-1 với cường độ mạnh và vân phổ 1385 cm-1 với cường độ yếu. Tuy nhiên các tín hiệu tại vùng từ 800 cm-1 đến 850 cm-1 chỉ xuất hiện các tín hiệu nhỏ với cường độ yếu, điều này có thể khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C- 4 và/hoặc C-2, C-3 của vòng pyranose. Dải hấp thụ ở 1081,43 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal.

Hình 3. 7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN5

Phổ IR của fucoidan thô TN5 (Chiết bằng chất lỏng ion) (Hình 3.7): Dải hấp thụ tại 3445,05 cm-1 và 2926,34 cm-1 thuộc về các dao động hóa trị

của nhóm O-H và nhóm C-H. Dải hấp thụ tại 1635,18 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic acid. Sự có mặt của nhóm sulfate được xác nhận bởi sự có mặt của 2 vân phổ có cường độ mạnh tại 1384,1 cm-1 là đặc trưng của liên kết O=S=O và vân phổ 1266,36 cm-1 (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Vị trí của nhóm sulfate được xác định tại vị trí C4 trong vòng pyrannose thông qua vân phổ 840,71 cm-1 và vị trí C2 trong vòng pyrannose thông qua vân phổ 805 cm-1 . Dải hấp thụ ở 1098,18 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal.

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (Bảng 3.7) cho thấy rằng tất cả các phổ đều xuất hiện các dải hấp thụ xác nhận sự có mặt liên kết O-H và C-H. Đây là đặc điểm chung của các polysaccharide chiết từ rong nâu. Theo kết quả phân tích thành phần các dịch chiết đều có chứa sulfate (từ 19,25 đến 48,18%) và hàm lượng uronic axit (từ 3,92 đến 12,53%). Điều này thể hiện trên phổ hồng ngoại của tất cả các mẫu. Đó là sự xuất hiện của vân phổ tại vùng 1650 cm-1 thuộc về axit uronic và vân phổ tại vùng 1350 cm-1 thuộc về O=S=O với cường độ khác nhau. Các thông tin về vị trí của nhóm sulfate được thể hiện rất rõ trên phổ của các mẫu TN1, TN3, TN4 và TN5 thông qua các vân phổ tại vùng 1250 cm-1, vân phổ tại vùng 800-850 cm-1. Dựa vào cường độ các vân phổ có thể cho rằng vị trí của nhóm sulfate chủ yếu tại vị trí C4 và lượng nhỏ tại vị trí C2 trong vòng pyrannose. Đối với mẫu TN2 thu được bằng phương pháp chiết sử dụng dung dịch axit pH=2, trên phổ hồng ngoại không thấy xuất hiện các vân phổ xác nhận vị trí của nhóm sulfate cũng như sự tồn tại của liên kết sulfate este. Điều này có thể giải thích khi sử dụng dung dịch pH=2 để chiết đã xảy ra hiện tượng là cắt mạch liên kết C-O-S của nhóm sulfate hemiester của phân tử polysaccharide (dạng fucoidan), dẫn đến giảm số liên kết trên đến giá trị mà phổ hồng ngoại không phát hiện những vân phổ thuộc về liên kết trên. Theo kết quả phân tích phổ của các mẫu TN1, TN3, TN4, TN5 thì vị trí của nhóm sulfate là tại C4 và C2 trong pyrannose tương ứng với vị trí không gian của nhóm sulfate là equatorial (C4) và axial (C2), vì vậy khi xảy ra cắt liên kết sẽ ưu tiên cắt liên kết tại vị trí axial trước. Từ kết quả trên có thể cho rằng phương pháp chiết bằng dung dịch axit có ảnh hưởng vị trí của nhóm sulfate.

3.6. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI

Để có căn cứ đánh giá sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hoạt tính sinh học của dung dịch chiết, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan được thu nhận từ rong nâu S. mcclurei thông qua 02 phép thử là hoạt tính oxy hóa tổng số và khả năng bắt gốc tự do DPPH.

3.6.1. Đánh giá hàm lượng hoạt tính oxy hóa tổng số

Hoạt tính oxy hóa tổng số của fucoidan chiết từ rong nâu S. mcclurei

chiết bằng các phương pháp khác nhau được dẫn ra trên Bảng 3.8.

Bảng 3. 8. Hàm lượng hoạt tính oxy hóa tổng fucoidan thu nhận được

từ các phương pháp chiết khác nhau

Phương pháp chiết

Các kết quả Chiết có thu nhận

Chiết bằng nước nóng Chiết bằng HCl (pH=2-3) Chiết bằng CaCl2 2% Chiết bằng chất lỏng ion hỗ trợ enzyme

104,83 62,76 68,56 60,22 99,60

± 0,02 ± 0,02 ± 0,02 ± 0,02 ± 0,20 Hoạt tính chống oxy hóa tổng (mg Axit ascorbic/g chất chiết)

Tất cả các mẫu đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, cao nhất là mẫu fucoidan chiết bằng nước nóng (104,83 mg axit ascorbic/g chất chiết) và thấp nhất là fucoidan chiết hỗ trợ enzyme (60,22 mg axit ascorbic/g chất chiết). Như vậy, phương pháp chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa tổng số của fucoidan.

3.6.2. Đánh giá kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH

DPPH là gốc ổn định được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa nhờ ưu điểm nổi bật là nhanh, đơn giản hơn các phương pháp

khác. Hoạt tính bắt gốc DPPH của các mẫu fucoidan dẫn ra trên Bảng 3.9 cho thấy tại nồng độ 5mg/ml, tất cả các mẫu đều thể hiện khả năng bắt gốc theo mức độ khác nhau phụ thuộc vào phuơng pháp chiết. Cao nhất là fucoidan chiết bằng nước nóng (Sc=58,54), sau đó là fucoidan chiết bằng nhựa lỏng ion (Sc=50,80) và thấp nhất là fucoidan chiết bằng dung dịch HCl có pH=2 (Sc=35,37). Theo kết quả phân tích Bảng 3.5 thì tất cả các mẫu fucoidan đều có chứa hợp chất polyphenol là chất có hoạt tính chống oxy hóa và protein là hợp chất chống oxy hóa yếu. Như vậy, hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu trên là do sự có mặt 03 hợp chất chống oxy hóa là fucoidan, polyphenol và protein.

Bảng 3. 9. Khả năng bắt gốc DPPH của fucoidan chiết từ rong nâu

S. mcclurei bằng các phương pháp chiết khác nhau

Phương pháp chiết

Khả năng bắt gốc DPPH của dung dịch fucoidan 5mg/ml Chiết bằng nước nóng Chiết bằng HCl (pH=2-3) Chiết bằng CaCl2 2% Chiết có hỗ trợ enzyme Chiết bằng chất lỏng ion

58,54 31,40 46,89 35,37 50,80 (%SC)

từ 02 loài

Gốc DPPH bị bắt bới tính oxy hóa của hợp chất đem thử thông qua khả năng nhận gốc hydrogen để thành phân tử DPPH-H bền. Đặc điểm cấu trúc của DPPH tương tự như nhóm -OH và -OSO3H. Trong phân tử fucoidan một phần các nhóm OH đã được thay thế bởi nhóm –OSO3H, nên ảnh hưởng của nhóm OH được loại bỏ. Vì lý do trên mà sự có mặt nhóm sulfate hemiester có liên quan đến hoạt tính bắt gốc DPPH của fucoidan. Đây cũng là kết quả nghiên cứu của các tác giả Zhang, Q và CS và nhóm tác giả Yoshizawa, Y., khi nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của rong Porphyra haitanesis và Prophyra polysaccharide yezoensis[68][69].

Khả năng bắt gốc DPPH của fucoidan thu nhận bằng phương pháp

chiết nước nóng và chiết bằng nhựa lỏng ion cao hơn các mẫu còn lại được giải thích bởi trong thành phần của chúng có hàm lượng các chất chống oxy hóa cao như protein, polyphenol và sulfate hemiester (cường độ vân phổ 1250 cm-1) mạnh. Mẫu fucoidan chiết bằng dung dịch axit HCl pH=2, mặc dù có hàm lượng sulfate cao lên đến 44,36%, tuy nhiên hoạt tính bắt gốc DPPH thấp nhất có thể do khi sử dụng dung dịch axit không chỉ cắt liên kết hemiester – OSO3H mà còn cắt mạch liên kết glycosite làm khối lượng phân tử thấp hơn (Hình 3.2) làm ảnh hưởng đến hoạt tính bắt gốc của chúng.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu các kết quả chính của đề tài đạt được như sau:

1. Phương pháp chiết có ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Fucoidan từ rong nâu S. mcclurei theo thứ tăng dần như sau: chiết bằng dung dịch CaCl2 (2,8%); chiết bằng dung dịch axit (3,4%); chiết bằng nước nóng (3,8%); chiết bằng chất lỏng ion (13,1%); chiết có hỗ trợ của enzyme (13,4%).

2. Phương pháp chiết có ảnh hưởng đến thành phần hóa học của dịch chiết fucoidan từ rong nâu S. mcclurei làm cho hàm lượng các thành phần của dịch chiết thay đổi nhiều lần như manitol (0,28 - 0,91%), fucose (0,49 - 5,25%), glucose (1,27 - 6,40%), axit manuronic (0,49 - 18,70%), axit guluronic (0,12 - 0,21%),...

3. Phương pháp chiết có ảnh hưởng đến vị trí không gian của nhóm sulfate trên phân tử đường thường gắn ở vị trí equatorial (C4) và axial (C2). Phương pháp chiết bằng dung dịch axit ảnh hưởng vị trí của nhóm sulfate.

4. Phương pháp chiết có ảnh hưởng lên hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan, cao nhất là chiết bằng nước nóng và thấp nhất là chiết có hỗ trợ enzyme. Khả năng bắt gốc DPPH cao nhất là chiết bằng nước nóng và thấp nhất là chiết bằng axit.

4.2. KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu phân tích chi tiết cấu trúc hóa học và các hoạt tính sinh học khác của Fucoidan được phân lập từ rong nâu S. mcclurei nhằm đánh giá thêm ảnh hưởng của phương pháp chiết đến cấu trúc và các hoạt tính sinh học khác, từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên rong nâu của Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Usov A.I., Bilan M.I., 2009, Fucoidans - sulfated polysaccharides

of brown algae, Russian Chemical Reveiws, 78(8), 785–799.

[2] Micheline R.S., Cybelle M., Celina G.D., Fernando F.S., Hugo O.R., Edda L., 2007, Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds, J. Appl. Phycol, 19, 153–160.

[3] Nguyễn Hữu Đại, 1997, Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam: Nguồn

lợi và sử dụng, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh.

[4] Trần Đình Toại, Châu Văn Minh, 2004, Tiềm năng rong biển Việt

Nam, NXB KHKT Hà Nội.

[5] Usoltseva R.V., 2018, Structural characteristics and anticancer activity in vitro of fucoidan from brown alga Padina boryana, Carbohydr. Polym., 184, 260-268.

[6] Surits S.P., Usoltseva R.V., Shevchenko N.M., Thinh P.D., Ermakova, 2020, Structural characteristics and anticancer activity in vitro of fucoidans from brown seaweeds Sargassum miyabei and S. oligocystum, Chem. Nat. Compd, 56, 34-38.

[7] Cho S.C., Lee M.L., You B.Y., 2011, Relationship between oversulfation and conformation of low and high molecular weight fucoidans and evaluation of their in vitro anticancer activity, Molecules, 16, 291-297.

[8] Atashrazm J.L., Lowenthal F., Woods R.M., Holloway G.M., Dickinson A.F., 2015, Fucoidan and cancer: A multifunctional molecule with anti-tumor potential, Mar. Drugs, 2327-2346.

[9] Kylin H., 1913, Zur biochemie der Meersalgen, Z. Physiol, Chem,

83, 171-197.

[10] Ahmad T.B.S., 2015, Methods for quantification and extraction of fucoidan, and quantification of the release of total carbohydrate and fucoidan from the brown algae Laminaria hyperborea.

[11] Nguyễn Hữu Đại, Phạm Hữu Trí, 2003, Một số loài rong biển mới

bổ sung cho Việt Nam - Phần II, Tuyển tập Nghiên cứu biển, 13, 95-114.

[12] Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn

Văn Tiến, 1993, Rong biển miền Bắc Việt Nam, NXB KHKT Hà Nội.

[13] Nguyễn Hữu Đại, Phạm Hữu Trí, Một số loài rong biển mới bổ sung cho khu hệ rong biển Việt Nam - Phần I, 2002, Tuyển tập Nghiên cứu biển, 12, 149-158.

[14] Phạm Hoàng Hộ, 1969, Rong biển Việt Nam - Phần III.

Phaeophyceae, NXB Trung tâm học liệu Sài Gòn.

[15] Võ Thị Như Trim, 2020, Sử dụng amin bậc 4 (quaternary ammonium) để xác định hàm lượng fucoidan trong polysaccharide tách chiết từ rong nâu, Luận văn thạc sĩ hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

[16] Lê Đỗ Thùy Vi, 2019, Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum, Luận văn thạc sĩ hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

[17] Nguyễn Văn Tú, Lê Như Hậu, 2013, Góp phần nghiên cứu thành phần loài ngành rong nâu (Ochrophyta-phaeophyceae) ở Việt Nam, Kỷ yếu Hội nghị Quốc tế “Biển Đông 2012", 119–129.

[18] Nguyễn Duy Nhứt, 2008, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

[19] Phạm Đức Thịnh, 2015, Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

[20] Bùi Văn Nguyên, 2018, Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan từ mọt số loài rong nâu Việt Nam, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

[21] Bùi Minh Lý, Lê Như Hậu, 2010, Đánh giá hiện trạng và nghiên cứu giải pháp bảo vệ nguồn lợi rong Mơ (Sargassum) tại Khánh Hòa, Đề tài cấp tỉnh Khánh Hòa.

[22] Hồ Đức Cường, 2014, Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của Fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianun và Sargassum swartzii của Việt Nam, Luận án tiến sĩ Hóa học, Đại học Bách Khoa, Hà Nội.

[23] Tôn Nữ Ngọc Minh, 2020, Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của Polysaccharide Sulfate được phân lập từ rong nâu Sargassum microcystum, Luận văn thạc sĩ hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

[24] Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung, 2009, Nghiên cứu Fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tách từ rong nâu Sargasum swartzii bằng phương pháp phổ khối nhiều lần, Tạp chí Hóa học, 47(3), 300–307.

[25] Li B., Lu F., Wei X., Zhao R., 2008, Fucoidan: Structure and

bioactivity, Molecules, 13(8), 1671–1695.

[26] Bilan M.I., Grachev A.A., Ustyuzhanina N.E., 2002, Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C. Ag, Carbohydr. Res., 337, 238–245.

[27] Bilan M.I., Grachev A.A., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I., 2006, Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L., Carbohydr. Res., 341, 238–245.

[28] Percival E., McDowell R., 1967, Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides, Acad. Press. London New York, 6–28 & 73– 96 &157–174.

[29] Percival E., Ross A., 1950, Fucoidin Part I: The isolation and

purification of fucoidin from brown seaweeds, J. Chem. Soc., 717–720.

[30] Nishino T., Aizu Y., Nagumo T., 1991, The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity, Thromb. Res., 64, 723–731.

[31] Bilan M.I., Grachev A.A., Ustyuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I., 2004, A Highly regular fraction of a Fucoidan

from the brown seaweed Fucus distichus L, Carbohydr. Res., 339, 511–517.

[32] Dohura K., Kuge T., Uomoto M., Nishizawa K., Kawasaki Y., Iha M., 2007, Prophylactic effect of dietary seaweed Fucoidan against enteral prion infection, Antimicrob. Agents Chemother, 51, 2274–2277.

[33] Nishino T., Yokoyama G., Dobahi K., 1989, Isolation, purification and characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities, Carbohydr. Res., 186, 119–129.

[34] Zhang Q.B., Yu P.Z., Zhou G.F., Li Z.E., Xu Z.H., 2003, Studies on antioxidant activities of fucoidan from Laminaria japonica, Chin. Trad. Herb. Drugs, 34, 824–826.

[35] Noda H., Amano H., Arashima K., Nisizawa K., 1990, Antitumor

activity of marine algae, Hydrobiologia, 204, 577–584.

[36] Hiroko I., Hiroyuki N., Amano H., Zhuaug C., Mizuno T., Ito H., 1993, Antitumor activity and immunological properties of marine algal polysaccharides, especially fucoidan, prepared from Sargassum thunbergii of Phaeophyceae, Anticancer Res, 13(6A), 2045–2052.

[37] Kobayashi T., Honke K., Miyazaki T., Matsumoto K., Nakamura T., Ishizuka I., Makita A., 1994, Hepatocyte growth factor (HGF) specifically binds to sulfoglycolipids, J.Biol chem, 269(13), 9817–9821.

[38] Administration Washington DC, 2000, Public Heath service Food

and drug, 14.

[39] Sharmila G., Anna Sheba L., Ilakkia A., 2018, Determination of in vitro antioxidant activity of crude fucoidan extracted from Sargassum wightii by different methods, Int. J. Res. Pharm. Sci., 9(3), 984–989.

[40] Bilan M.I., Klochkova N.G., Shashkov A.S., Usov A.I., 2018, Polysaccharides of Algae 71*. Polysaccharides of the Pacific brown alga Alaria marginata, Russ. Chem. Bull., 67(1), 137–143.

[41] Endres F., Abedin S.Z.E., 2006, Air and water stable ionic liquids

in physical chemistry, Endres F. S.Z.E. Abedin, 8, 2101–2116.

[42] Seddon K.R., 1997, Ionic Liquids for Clean Technology, J. Chem.

Technol. Biotechnol., 68, 351–356.

[43] Stark A., 2011, Ionic liquids in the biorefinery: a critical

assessment of their potential., Energy Environ. Sci., 4, 19–32.

[44] Passos H., Freire M.G., Coutinho J.A.P., 2014, Ionic liquid solutions as extractive solvents for value-added compounds from biomass., Green Chem., 16, 4786–4815.

[45] Canales R.I., Brennecke J.F., 2016, Comparison of Ionic Liquids to Conventional Organic Solvents for Extraction of Aromatics from Aliphatics., J. Chem. Engeneering data, 81, 1685–1699.

[46] Teixeira R.E., 2012, Energy-Efficient Extraction of Fuel and

Chemical Feedstocks from Algae., Green Chem., 14, 419–427.

[47] Kim Y.H., Choi Y.K., Park J., Lee S., Yang Y.H., Kim H.J., Park T.J., Kim Y.H., Lee S.H., 2012, Ionic Liquid-Mediated Extraction of Lipids from Algal Biomass., Bioresour. Technol., 109, 312–315.

[48] Fujita K., Kobayanshi D., Nakamura N., Ohno H., 2013, Direct Dissolution of Wet and Saliferous Marine Mi-croalgae by Polar Ionic Liquids without Heating., Enzyme Microbial Technology, 52, 199-202.

[49] Tushar J., Trivedi A.K., 2014, Efficient Extraction of Agarose

from Red Algae Using Ionic Liquids, Green Sustain. Chem., 4, 190–201.

[50] Pezoa-Conte R., Leyton A., Anugwom I., von Schoultz S., Paranko J., Mäki-Arvela P., Willför S., Muszyński M., Nowicki J., Lienqueo M.E.,. Mikkola J.P, 2015, Deconstruction of the green alga Ulva rigida in ionic liquids: Closing the mass balance, Algal Res., 12, 265–273.

[51] Thuy T.T.T., Van T.T.T., Yuguchi Y., Bui L.M., Nguyen T.T., 2013, Structure of fucoidan from brown seaweed Turbinaria ornata as Studied by Electrospray ionization Mass spectrometry (MSIMS) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) Techniques, Mar.Drugs, 11, 2431–2443.

[52] Maria I. Bilan, Nadezhda E. Ustyuzhanina, Alexander S. Shashkov, Thi Thu Thuy Thanh, Minh Ly Bui, Thi Thanh Van Tran, Van Nguyen Bui, Anatolii I. Usov, 2017, Sulfated polysaccharides of the Vietnamese brown alga Sargassum aquifolium (Fucales, Sargassaceae), Carbohydr. Res., 449, 23–31.

[53] Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, 2001, Năm loài mới thuộc chi rong Mơ - Sargassum ở ven biển Việt Nam., Tạp chí Sinh học, 23(1), 1–10.

[54] Maria I. Bilan, Nadezhda E. Ustyuzhanina, Alexander S. Shashkov, Thi Thu Thuy Thanh, Minh Ly Bui, Thi Thanh Van Tran, Van Nguyen Bui, Nikolay E. Nifantiev, Anatolii I. Usov, 2018, A sulfated galactofucan from the brown alga Hormophysa cuneiformis (Fucales, Sargassaceae), Carbohydr. Res., 469, 48–54.

[55] Thuan Thi Nguyen, Mikkelsen Maria Dalgaard, Vy Ha Nguyen Tran, Dieu Trang Vo Thi, Rhein-Knudsen Nanna, Holck Jesper, Rasin Anton B., Thuy Cao Hang Thi, Thanh Van Tran Thi, Meyer Anne S., 2020, Enzyme- assisted fucoidan extraction from brown macroalgae fucus distichus subsp. Evanescens and saccharina latissima, Mar. Drugs, 18, 296.

[56] Pinker A., Marsh K.N., Pang S., Staiger M.P., 2009, Ionic Liquids

and Their Interaction with Cellulose., Chem. Rev., 109, 6712–6728.

[57] Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F., 1956, Colorimetric method for determination of sugars and related substances., Anal. Chem, 28, 350–356.

[58] Vishchuk O.S., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N., 2011, Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics, and antitumor activity., Carbohydr. Res., 346, 2769–2776.

[59] Dodgson K.S., Price R.G., 1962, A Note on the Determination of the Ester Sulfate Content of Sulfated Polysaccharides., Biochem. J., 84, 106– 110.

[60] Bitter T., Muir H.M., 1962, A modified uronic acid carbazole

reaction., Anal. Biochem, 4, 330–334.

[61] Velioglu Y.S., Mazza G., Gao L., Oomah B. D., 1998, Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products., J. Agric. Food Chem., 46(10), 4113–4117.

[62] Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagent., J. biol. Chem., 193, 265–275.

[63] Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., 1999, A study of fucoidan

from the brown seaweed Chorda filum., Carbohydr. Res., 320, 108–119.

[64] Hang T. T. Cao, Maria D. Mikkelsen, Mateusz J. Lezyk, Ly M. Bui, Van T. T. Tran, Artem S. Silchenko, Mikhail I. Kusaykin, Thinh D. Pham, Bang H. Truong, Jesper Holck and Anne S. Meyer, 2018, Novel Enzyme Actions for Sulphated Galactofucan Depolymerisation and a New Engineering Strategy for Molecular Stabilisation of Fucoidan Degrading Enzymes, Mar.Drugs, 16, 422.

through the

[65] Prieto P., Pineda M., Aguilar M., 1999, Spectrophotometric formation of a quantitation of antioxidant capacity phosphomolybdenum complex: Specifi c application to the determination of vitamin E., Anal. Biochem., 269, 337–341.

[66] Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Công Thùy Trâm, Đỗ Thị Phương, Vũ Thị Thu Phương, Thị Nguyễn Nga, Truan Gilles, Đỗ Thị Thảo, 2017, Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan in vitro của các dịch chiết từ cây phèn đen (phyllanthus reticulates poir.), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 15, 251–258.

[67] Deniaud-Bouët E., Kervarec N., Michel G., Tonon T., Kloareg B., Hervé C., 2014, Chemical and enzymatic fractionation of cell walls from Fucales: Insights into the structure of the extracellular matrix of brown algae., Ann. Bot., 114(6), 1203–1216.

[68] Zhang Q., Yu P., Li Z., Zhang H., Xu Z., Li P., 2003, Antioxidant

activities of sulfated polysaccharide fractions from Porphyra haitanesis., J. Appl. Phycol., 15, 305–310.

[69] Yoshizawa Y., Ametani A., Tsunehiro J., Nomura K., Itoh M., 1995, Macrophage stimulation activity of the polysaccharide fraction from a marine alga (Prophyra yezoensis): Structure-function relationships and improved solubility., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1933–1937.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Đường chuẩn carbohydrate tổng số

Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ D-glucose

Nồng độ

OD 490nm

D-glucose

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

(µg/ml)

0,175

0,173

0,178

0,175 ± 0,003

0,338

0,331

0,344

0,338 ± 0,007

0,665

0,656

0,671

0,664 ± 0,008

120

0,902

0,887

0,904

0,898 ± 0,009

160

1,170

1,183

1,164

1,172 ± 0,010

200

1,513

1,502

1,501

1,505 ± 0,007

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng carbohydrate tổng số

Phương trình: D = 0,0073C + 0,0294 tuyến tính trong khoảng 0-200µg/ml

Với giá trị R2= 0,9975  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µg/ml) và D: mật độ quang.

Phụ lục 2. Đường chuẩn Fucose

Bảng: Giá trị diện tích pic tương ứng với nồng độ fucose

Nồng độ fucose (µmol/L) Diện tích pic

250 56,95

500 113,33

1000 223,73

2000 437,32

5000 1001,17

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng fucose

Phương trình có dạng: D = 0,1979C + 20,203

Với giá trị R2= 0,9987  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) và D: Diện tích pic.

Phụ lục 3. Đường chuẩn Galactose

Bảng: Giá trị diện tích pic tương ứng với nồng độ galactose.

Nồng độ galactose (µmol/L) Diện tích pic

250 124,10

500 247,88

1000 494,49

2000 984,46

5000 2308,26

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng galactose

Phương trình có dạng: D = 0,4587C + 29,042

Với giá trị R2= 0,9993  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) và D: Diện tích pic.

Phụ lục 4. Đường chuẩn Glucose

Bảng: Giá trị diện tích pic tương ứng với nồng độ glucose

Nồng độ galactose (µmol/L) Diện tích pic

250 103,86

500 206,57

1000 408,01

2000 800,50

5000 1812,18

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng glucose

Phương trình có dạng: D = 0,358C + 39,759

Với giá trị R2= 0,9983  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) và D: Diện tích pic.

Phụ lục 5. Đường chuẩn Sulfate

Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ K2SO4

OD 360nm Nồng độ

K2SO4 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (µg/ml)

100 0,030 0,031 0,031 0,031 ± 0,001

250 0,095 0,097 0,996 0,096 ± 0,001

500 0,190 0,195 0,199 0,195 ± 0,005

750 0,274 0,275 0,265 0,271 ± 0,006

1000 0,365 0,363 0,366 0,365 ± 0,002

1250 0,445 0,444 0,469 0,453 ± 0,014

1500 0.519 0.512 0,521 0.517 ± 0,005

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate

Phương trình: D = 0,0004C+0,0057, tuyến tính trong khoảng 0-1500µg/ml

Với giá trị R2 = 0,9974  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) và D: mật độ quang.

Phụ lục 6. Đường chuẩn Uronic acid

Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ D-glucuronic acid

Nồng độ

OD 525nm

D-glucuronic acid

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

(µg/ml)

0,042

0,055

0,044

0,047 ± 0,007

0,076

0,087

0,078

0,080 ± 0,006

0,139

0,148

0,155

0,147 ± 0,008

0,260

0,267

0,253

0,260 ± 0,007

0,321

0,326

0,317

0,321 ± 0,005

100

0,594

0,599

0,575

0,589 ± 0,013

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng uronic acid

Phương trình: D = 0,0058C+0,0198, tuyến tính trong khoảng 0-100µg/ml

Với giá trị R2= 0,9966  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) và D: mật độ quang.

Phụ lục 7. Đường chuẩn Poly phenol

Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ phloroglucinol.

Nồng độ

OD 750nm

phloroglucinol

A1

A2

A3

Atb

(µg/ml)

0,110

0,113

0,118

0,114 ± 0,004

0,233

0,238

0,232

0,234 ± 0,003

0,541

0,544

0,561

0,549 ± 0,011

0,840

0,842

0,847

0,843 ± 0,004

1,156

1,166

1,179

1,167 ± 0,012

100

1,389

1,382

1,389

1,387 ± 0,004

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng poly phenol

Phương trình: D = 0,0144C-0,0228 tuyến tính trong khoảng 0 - 100µg/ml

Với giá trị R2= 0,9978  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) và D: mật độ quang.

Phụ lục 8. Đường chuẩn Protein

Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA.

OD 750nm

Nồng độ

BSA

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

(µg/ml)

0,037

0,036 ± 0,001

0,035

0,095

0,096

0,095 ± 0,002

0,093

0,153

0,152

0,152 ± 0,002

0,150

0,221

0,224

0,224 ± 0,003

0,226

100

0,285

0,289

0,285 ± 0,004

0,282

120

0,347

0,359

0,352 ± 0,006

0,350

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein

Phương trình: D = 0,003C-0,0169 tuyến tính trong khoảng 0-120µg/ml

Với giá trị R2= 0,9939  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µg/mL) và D: mật độ quang.

Phụ lục 9. Đường chuẩn Hoạt tính chống oxy hóa tổng số

Bảng: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ ascobic acid.

OD 490nm

Nồng độ

Ascorbic acid

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

(µg/ml)

0,037

0,339

0,040 ± 0,003

0,343

0,081

0,079

0,079 ± 0,003

0,076

0,181

0,186

0,186 ± 0,006

0,192

0,303

0,314

0,309 ± 0,006

0,310

0,430

0,413

0,423 ± 0,009

0,425

100

0,538

0,546

0,544 ± 0,005

0,547

Đồ thị đường chuẩn xác định Hoạt tính chống oxy hóa tổng số

Phương trình: D = 0,0055C-0,0185 tuyến tính trong khoảng 0-100 µg/ml

Với giá trị R2= 0,9965  1  Có thể áp dụng

Trong đó: C: nồng độ (µmol/mL) và D: mật độ quang.