ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỐNG THỊ THÚY VÂN
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG MỘT SỐ SAPONIN CHÍNH TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO
(GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THÁI NGUYÊN - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
TỐNG THỊ THÚY VÂN PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG MỘT SỐ SAPONIN CHÍNH TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO
(GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) Ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. PHAN VĂN KIỆM THÁI NGUYÊN - 2018
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến PGS.TS. Phan Văn Kiệm, TS Phạm Hải Yến đã giao đề tài và hết lòng
hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em trong
suốt quá trình hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn hóa Phân
tích - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, các thầy giáo, cô giáo hướng
dẫn phòng thí nghiệm thuộc Viện hóa sinh biển - Viện hàn lâm Việt Nam đã
tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành luận văn.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, anh chị em và bạn
bè đã quan tâm, động viên em hoàn thành luận văn của mình.
Thái Nguyên, ngày 17 tháng 05 năm 2018
Học viên
Tống Thị Thúy Vân
a
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ a
MỤC LỤC ..................................................................................................... b
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... d
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. e
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... f
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 2
1.1. Những nghiên cứu tổng quan về cây Thìa canh lá to ............................... 2
1.1.1. Thực vật học ......................................................................................... 2
1.1.2. Mô tả cây .............................................................................................. 2
1.1.3. Phân bố ................................................................................................. 4
1.1.4. Một số công dụng của dây thìa canh trong y học dân gian .................... 4
1.1.5. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ............................................ 4
1.2. Tổng quan về phương pháp sắc kí ......................................................... 14
1.2.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí ............................................ 14
1.2.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí ............................................................ 14
1.2.3. Phân loại các phương pháp sắc kí ....................................................... 15
1.3. Một số phương pháp hóa lí ứng dụng trong xác định cấu trúc của các
hợp chất hữu cơ ............................................................................................ 17
Chương 2. THỰC NGHIỆM ..................................................................... 21
2.1. Mẫu thực vật ......................................................................................... 21
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ....................................................... 21
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ...................................................................... 21
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ................................................................... 21
2.2.3. Sắc ký cột (CC) .................................................................................. 21
b
2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ
phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................................. 22 2.3.1. Phổ 1H - NMR .................................................................................... 22 2.3.2. Phổ 13C - NMR ................................................................................... 22
2.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer) .... 22
2.3.4. Phổ 2D - NMR ................................................................................... 22
2.4. Thực nghiệm ......................................................................................... 23
2.4.1. Phân lập các hợp chất ......................................................................... 23
2.4.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được ......... 26
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27
3.1. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL1 ........................................ 27
3.2. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL2 ........................................ 33
3.3. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL3 ........................................ 39
3.4. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL4 ........................................ 45
3.5. Tổng hợp cấu trúc hóa học của một số hợp chất saponin phân lập
được từ loài G. latiflolium và đánh giá sơ bộ hàm lượng .............................. 51
KẾT LUẬN ................................................................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 55
PHỤ LỤC
c
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ (Tiếng Anh) Viết đầy đủ (Tiếng Việt)
1H-NMR
Viết tắt 13C-NMR
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Proton Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Cộng hưởng từ hạt nhân proton
CC Resonance Column chromatography Sắc kí cột
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dimethyl sulfoxide
DMSO DPPH
ESI-MS
EtOAc MeOH HMBC Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dimethyl sulfoxide 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện Etyl axetat Metanol Tương tác dị hạt nhân qua Electrospray Ionization Mass Spectrometry Ethyl acetate Methanol Heteronuclear mutiple Bond
HPLC nhiều liên kết Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Connectivity High-performance liquid chromatography HR-ESI-MS High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry Phổ khối lượng phân giải cao ion hóa phun mù điện
HSQC
Heteronuclear Single-Quantum Coherence Reserve phase C-18 Thin layer chromatography Tetramethylsilane Correlation Spectroscopy Tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Chất hấp phụ pha đảo C-18 Sắc ký lớp mỏng Tetramethylsilane Phổ tương quan giữa 1H - 1H RP-18 TLC TMS COSY
d
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Số liệu phổ của hợp chất GL1 và hợp chất tham khảo ............... 29
Bảng 3.2. Số liệu phổ của hợp chất GL2 và hợp chất tham khảo ............... 34
Bảng 3.3. Số liệu phổ của hợp chất GL3 và hợp chất tham khảo ............... 40
Bảng 3.4. Số liệu phổ của hợp chất GL4 và hợp chất tham khảo ............... 46
Bảng 3.5. Đánh giá sơ bộ về hàm lượng của các hợp chất saponin trong
mẫu dây thìa canh lá to .............................................................. 53
e
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn MeOH của loài G. latifolium...... 25
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL1 .......................................... 27
Hình 3.2. Các tương tác HMBC chính của hợp chất GL1 ......................... 28 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL1 ............................................... 31 Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL1 .............................................. 31
Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất GL1 ................................................... 32
Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất GL1 .................................................. 32
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL2 .......................................... 33
Hình 3.8. Tương tác HMBC chính của hợp chất GL2 .............................. 34 Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL2 ............................................... 37 Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL2 .............................................. 37
Hình 3.11. Phổ HSQC của hợp chất GL2 ................................................... 38
Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất GL2 .................................................. 38
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL3 .......................................... 39
Hình 3.14. Tương tác HMBC chính của hợp chất GL3 .............................. 40 Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL3 ............................................... 43 Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL3 .............................................. 43
Hình 3.17. Phổ HSQC của hợp chất GL3 ................................................... 44
Hình 3.18. Phổ HMBC của hợp chất GL3 .................................................. 44
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL4 .......................................... 45
Hình 3.20. Tương tác HMBC chính của hợp chất GL4 .............................. 46 Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL4 ............................................... 49 Hình 3.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL4 .............................................. 49
Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất GL4 ................................................... 50
Hình 3.24. Phổ HMBC của hợp chất GL4 .................................................. 50
Hình 3.25. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất saponin (GL1-GL4)
từ loài G. latifolium .................................................................. 52
f
MỞ ĐẦU
Đái tháo đường hay còn gọi là bệnh tiểu đường là một trong số các căn
bệnh phổ biến và khó điều trị hiện nay. Theo thống kê, hiện nay trên thế giới
đang có hàng trăm triệu người mắc phải căn bệnh này và đang ngày càng gia
tăng. Ở nước ta, bệnh đái tháo đường cũng là một bệnh phổ biến với tỉ lệ người
nhiễm bệnh ngày càng cao. Bệnh đái tháo đường gây ra những tác động xấu ảnh
hưởng không nhỏ tới sinh hoạt, cuộc sống, sức khỏe và có thể đe dọa tới tính
mạng của người bệnh mà chưa có biện pháp chữa trị triệt để. Không những thế,
bệnh đái tháo đường được xác định là một trong những nguyên nhân chính gây
ra các bệnh hiểm nghèo khác như bệnh tim mạch, suy thận, tai biến mạch máu
não, liệt dương,…
Dây thìa canh là một thảo dược quý trong việc điều trị bệnh đái tháo
đường, đây là loại cây có tác dụng hỗ trợ hạ đường huyết tốt ở người bệnh đái
tháo đường tuýp 1 và 2. Ngoài ra, cây còn mang đến nhiều tác dụng chữa bệnh
khác cho con người.
Gần đây, các nhà khoa học đã chứng minh nhiều ứng dụng của dây thìa
canh và là một phương thuốc tự nhiên quan trọng trong các hệ thống thảo dược.
Việc nghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của dây
thìa canh ở Việt Nam đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp
lý và có hiệu quả. Đó là điều thiết yếu để phát hiện các thành phần hoặc các hoạt
chất có hoạt tính sinh học. Vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích
cấu trúc, hàm lượng một số saponin chính từ loài thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight)”.
Nhiệm vụ của luận văn:
- Nghiên cứu chiết tách một số saponin chính từ loài thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight)
- Phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng một số saponin chính từ loài
thìa canh lá to phân lập được.
1
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Những nghiên cứu tổng quan về cây Thìa canh lá to
1.1.1. Thực vật học
Cây Thìa canh lá to còn gọi là dây mỏ hay lõa ti nhuộm. Theo hệ thống
phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, (Gymnema latifolium Wall. ex
Wight) có được phân loại như sau:
+ Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
+ Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
+ Phân Lớp Bạc hà (Lamiidae)
+ Bộ Long đởm (Gentianales)
+ Họ Trúc đào (Apocynaceae)
+ Phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae)
+ Chi Gymnema R.Br.
+ Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight
1.1.2. Mô tả cây
Cây Thìa canh lá to còn gọi là dây mỏ hay lõa ti nhuộm. Dây leo nhỏ, dài
lên tới 7-10 m, phình lên ở các mấu, lúc non có lông. Toàn thân có nhựa mủ màu
vàng tươi. Thân non đường kính 1-3 mm, phủ lông màu hung đỏ, dày đặc ở
ngọn; thân bánh tẻ có lỗ bì và lông thưa; thân già có bần hóa xốp có khía dọc;
lóng thân từ 4-18 cm.
Lá đơn, nguyên, mọc đối; cuống lá 3-5 cm, phủ lông dày; phiến lá hình
bầu dục, dài 10-14 cm, rộng 5-8 cm; gốc lá tròn, có khi hơi lõm hoặc hơi lệch;
mép lá nguyên; ngọn lá nhọn; mặt trên xanh thẫm, phủ lông ráp; mặt dưới màu
xanh hơi vàng, phủ lông ráp. Lá non có lông dày, mềm; lá bánh tẻ ráp do lông
cứng, nhiều hơn ở mặt dưới lá, dày hơn ở phần gân lá; lá già có màu vàng đặc
trưng.
2
Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một
cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8
mm. Đài hình trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở
mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng,
khoảng 1,2×1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng.
Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu
núm nhụy. Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi.
Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5-5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc. Hạt
hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cmx5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3
(b) Dạng sống; (c) Cụm hoa; (d) Mặt trên lá; (e) Mặt dưới lá; (f) Cụm hoa xim; (g) Lá bắc của cụm hoa; (h) Một hoa nguyên vẹn; (i) Đài; (j) Tràng; (k) Trụ nhị nhụy; (l) Thể truyền phấn; (m) Bộ nhụy; (n) Quả
cm.
3
1.1.3. Phân bố
Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng Đông,
Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra,
Tamil Nadu), Myanmar, Thailand, Việt Nam (Cúc Phương, Hoà Bình, Thái
Nguyên).
1.1.4. Một số công dụng của dây thìa canh trong y học dân gian
Tiểu đường là một căn bện nguy hiểm và chưa có thuốc chữa khỏi, song
ta vẫn kiểm soát được nếu có một sự hiểu biết cơ bản về bệnh và đặc biệt là có
một lối sống khoa học, ăn uống, sinh hoạt và sử dụng thuốc hợp lý.
Liều dùng mỗi ngày:
+ Định lượng : Ngày dùng 50 gram
+ Lượng nước sử dụng: 1,5 lít nước.
+ Cách dùng: Lấy 50 gram dây thìa canh rửa sạch, đun sôi 50 gram dây
thìa canh với 1,5 lít nước trong thời gian 15 phút. Chắt nước uống hàng ngày
(Lưu ý nên uống cách bữa ăn khoảng 30 phút).
Ngoài ra lá thìa canh được dùng thuốc giúp kích thích hệ tiêu hóa hoạt
động tốt. Hay khi bị rắn cắn có thể dùng lá thìa canh đắp lên vết thương, đồng
thời dùng nước sắc dây thìa canh để uống giải độc rắn cắn.
1.1.5. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài
thuộc chi Gymnema được bắt đầu vào những năm 1950, chủ yếu bởi các nhà khoa
học Ấn Độ. Hoạt tính sinh học đặc trưng của loài G. sylvestre là khả năng hạ
đường huyết [4]. Tuy nhiên nghiên cứu về thành phần hóa học thực sự bắt đầu khi
có các thiết bị xác định cấu trúc như phổ cộng hưởng từ nhân, phổ khối lượng.
Vào khoảng những năm 1980-1990, các nhà khoa học Nhật Bản tập trung mạnh
vào nghiên cứu thành phần hóa học loài này. Cụ thể từ lá loài G. sylvestre được
các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất
mới conduritol A (1) [5]. Hợp chất này đã được phát hiện có khả năng ức chế
4
enzyme aldose mạnh trên chuột và không gây độc [6]. Tiếp đó, Yoshikawa và
cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc thành công của 7 hợp chất mới
gymnemic acid I-VII (2-8) [7, 8]. Trong quá trình tìm kiếm các hợp chất có tác
dụng diệt cỏ, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định được 5 hợp chất mới
từ lá loài G. sylvestre là gymnemic acid VIII-XII (9-13) [9].
Từ lá loài G. sylvestre, Sahu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc
của 4 hợp chất mới, được đặt tên là gymnemasin A-D (14-17) [10]. Tiếp đó
vào năm 1996, Murakami và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 2
hợp chất mới, đặt tên là gymnemoside a và b (18-19) cùng với 10 hợp chất đã
biết. Cũng tiếp tục nghiên cứu này, Yosikawa và cộng sự đã tiến hành nghiên
cứu thành phần hóa học và đã xác định được 4 hợp chất mới và được đặt tên là
gymnemoside c-f (20-23) [11]. Các nhà khoa học Trung Quốc, đã phân lập và
xác định cấu trúc của 6 hợp chất mới (24-29) và 2 hợp chất đã biết [12].
5
Vào năm 2001, Ye và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra
4 hợp chất mới có tác dụng diệt cỏ từ loài G. sylvestre, 4 hợp chất này được đặt tên
là 21α-O-benzoylsitakisogenin 3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α-D-
6
glucuronopyranoside (30), longispinogenin 3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α-D-
glucuronopyranoside potassium (31), 29-hydroxylongispinogenin 3-O-α-D-
glucopyranosyl(1→3)-α-D-glucuronopyranoside potassium (32), alternoside II
sodium (33) [13].
Liu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 1 hợp chất mới (34) và 4
hợp chất đã biết từ loài G. sylvestre [14]. Tiếp nối các nghiên cứu, Zhu và cộng sự
đã phân lập được 2 hợp chất mới, 16β-hydroxyl olean-12-en-3-O-[β-D-
glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranoside (35) và
16β,21β,28-trihydroxy-olean-12-ene-3-O-glucoronopyranoside (36) [15].
7
Zhang và cộng sự đã thông báo phân lập được 1 hợp chất mới, 3β,16 β,22α-
trihydroxy-olean-12-ene 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-
(1→6)-β-D-glucopyranoside (37) và 4 hợp chất đã biết từ loài G. sylvestre [16].
Zarrelli và cộng sự thông báo được 7 hợp chất mới, bao gồm 6 oleanane (38-43):
3β,16β,21β,23-tetrahydroxyolean-12-ene, 3β,16β,21α,23,28-pentahydroxyolean-
12-ene, 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-13(18)-ene, 16β,23,28-trihydroxyolean-
12-en-3-one,16β,21β,23,28-tetrahydroxyolean-12-en-3-one, 16β,21β,22α,23,28-
pentahydroxyolean-12-en-3-one và 1 lupane 3β,16β,23,28-tetrahydroxylup-20(29)-ene
(44) cùng với 6 hợp chất đã biết từ phần trên mặt đất loài G. sylvestre [17].
8
Cũng các nghiên cứu thuộc nhóm tác giả này tiếp tục công bố 6 hợp chất
mới khác, đó là (3β,16β)-olean-12-ene-3,16,23,28-tetrayl tetraacetate,
(3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl (2S)-2-
methylbutanoate,(3β,16β,21β,22α)-28-(acetyloxy)-3,16,22,23-tetrahydroxyolean -
12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentakis
(acetyloxy) olean-12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-
3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl (2E)-2-methylbut-2-enoate, và
(3β,16β)-lupane-3,16,20,23,28-pentol (45-50) [18].
9
Từ loài G. inodorum, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc
của 2 hợp chất mới: 2α,3β-dihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioic acid-3-O-β-D-
glucopyranoside và 2α,3β,15β-trihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioic acid-3-O-β-
D-glucopyranoside [19]. Cũng từ loài này, Atsuchi và cộng sự đã phân lập được
1 hợp chất mới (3β,16β)-16,28-dihydroxyolean-12-en-3-yl-2-O-β-D-
glucopyranosyl-β-D-glucopyranosiduronic acid [20].
Từ loài G. alternifolium, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định
cấu trúc của 6 hợp chất mới và được đặt tên là gymnepregoside A-F [21]. Cũng
từ loài này, nhóm tác giả tiếp tục công bố phân lập và xác định cấu trúc của 11
OH
COOH
HO
OH
HOOC
HO
O
O
HO
HO
R
O
O
HO
HO
O
OH
O
HO
hợp chất mới khác và đặt tên là gymnepregoside G-Q [22].
53
COOH 51 R = H 52 R = OH
OH
HO
HO
O
OH
OR2
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
A
RO
B
R1O
OH
Me
OH 59 R = b Me
Me
O
O
O
Me
Me
Me
R1 R2 A b A a H c H b B a
54 55 56 57 58
O
O
O
O
O
O
OMe
OMe
OMe
Me
Me
Me
OO
OO
OO
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
Me
Me
Me
O
O
O
O
O
O
OMe
HO
O
HO
HO
O
OMe OH
OMe OH
OH
OH
c
a
b
OH
OH
10
6 hợp chất mới đặt tên là gymnetinoside A-F cùng với 6 hợp chất cũ,
sequinoside K, khaephuoside B, and albibrissinoside A (60-69) được Tian và
cộng sự phân lập từ loài G. tingens. Các hợp chất này được phát hiện có khả
năng bảo vệ tế bào gan mạnh [23].
8 hợp chất mới thuộc khung pregnane steroidal glycoside đã được phân
lập từ vỏ quả loài G. griffithii và được đặt tên là gymnemogriffithoside A-H.
Các hợp chất này đã được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào
ung thư (BT 474, Chago, Hep-G2, KATO-III và SW620) và hoạt tính ức chế
enzyme α-glucosidase và thể hiện hoạt tính ở mức độ trung bình [24].
11
* Hoạt tính sinh học:
Bên cạnh việc sử dụng phổ biến để điều trị bệnh tiểu đường, các loài
thuộc chi Gymnema còn được sử dụng để điều trị một số bệnh như béo phì,
viêm khớp, bệnh Parkinson và bệnh sơ vữa động mạch. Các hoạt chất từ các
loài thuộc chi Gymnema đã được nghiên cứu về tác dụng kháng viêm, kháng
khuẩn, và kháng ung thư, và kháng cỏ dại. Dược tính của các loài này đã được
nghiên cứu rộng dãi. Hơn 70 hợp chất mới đã được phân lập. Dịch chiết đã
được nghiên cứu lâm sàng và trên động vật. Các hoạt tính được thử nghiệm
bao gồm:
* Hoạt tính trị bệnh tiểu đường
Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết saponin cùng với 5 triterpene
saponin gymnemic acid I-IV và gymnemasaponin V từ loài G. sylvestre đã được
thông báo. Hợp chất gymnemic acid IV (3.4/13.4 mg/kg) được phát hiện có tác
dụng hạ đường huyết từ 14,0-60% trong vòng 6h khi so sánh với glibenclamide.
Thêm vào đó, hợp chất này cũng làm tăng lượng insulin khi cho chuột bị tiểu
đường uống ở nồng độ 13.4 mg/kg [25]. Nghiên cứu khác về tác dụng hạ đường
huyết của lá loài G. sylvestre thông qua kiểm soát hàm lượng glyucose trong
máu và lipid trên chuột Wistar ở nồng độ 200mg/kgP. Kết quả cho thấy dịch
chiết loài này làm giảm đáng kể đường trong huyết tương và mỡ máu (thông qua
các thông số cholesterol VLDL, LDL) [26]. Với liều triacetate dihydroxy
gymnemic (20 mg/kgP) bằng đường uống trong 45 ngày trên chuột bị tiểu
đường. Các thông số đánh giá bao gồm đường huyết, insulin, hemoglobin
glycated (HbA1c), mô glycogen, các thông số lipid như triglycerid, cholesterol
tổng, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol và họat tính của các enzym gan đánh
dấu, như aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT),
alkaline phosphatase (ALP) và phosphatase acid (ACP). Kết quả cho thấy hợp
chất dihydroxy triacetate gymnemic tại liều 20 mg đã tác động đáng kể trên tất
cả các thông số sinh hóa học so với nhóm chuột mang bệnh tiểu đường [27].
12
Gymnemic acid từ lá loài G. sylvestre đã làm tăng đáng kể sự tiết ra insulin từ tế
bào β- tuyến tụy của chuột mang bệnh tiểu đường [28].
Một nghiên cứu ở cấp độ lâm sàng về tác dụng tiết insulin của dịch chiết
ethanol loài G. sylvestre thông qua đường uống (500 mg/ngày) trong 60 ngày
cho thấy nồng độ glucose trong máu lúc đói giảm từ 162 mg/L xuống còn 119
mg/L, nồng độ glucose trong máu sau ăn giảm từ 291 mg/L xuống 236 mb/L;
tăng nồng độ insulin huyết thanh từ 24 đến 32 μU/mL, tăng nồng độ C-peptide
huyết thanh từ 298 đến 447 pmol/L, nhưng không ảnh hưởng đến cân nặng [29].
Một số nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết loài G. inodorum đã chỉ
dịch chiết cũng như các hợp chất từ loài này đã thể hiện tác dụng hạ đường
huyết mạnh [30, 31].
* Hoạt tính chống béo phì
Saponin từ dịch chiết nước của lá loài G. sylvestre đã được phát hiện có
tác dụng chống béo phì tương đương với orlistat, một loại thuốc tổng hợp dùng
để điều trị bệnh béo phì [32]. Dịch chiết nước loài G. sylvestre đã phát hiện có
khả năng chống béo phì trên chuột thông qua giảm nồng độ serum lipid, leptin,
insulin, glucose, apolipoprotein B và LDH trong khi tăng nồng độ HDL-
cholesterol, apolipoprotein A1 [33].
* Hoạt tính kháng viêm khớp
Dịch chiết nước và ether dầu hỏa từ lá loài G. sylvestre đã được phát hiện
có tác dụng rõ rệt trong việc kiểm soát hiệu quả bệnh nhân viêm khớp [34].
Thêm vào đó, các dịch chiết khác nhau từ loài này cũng đã được phân bố đều
trong 1% Tween 8 và diclofenac sodium cho chuột viêm đa khớp uống 1
lần/ngày trong 21 ngày. Kết quả cho thấy dịch chiết ether dầu hỏa làm giảm rõ
các yếu tố viêm như IL-1b, TNF-α, GM-CSF, PGDF [34].
13
Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu về hoạt tính diệt tế bào ung thư [35],
kháng viêm [36], kháng khuẩn [37] từ các hợp chất cũng như cặn chiết của loài
thuộc chi Gymnema.
1.2. Tổng quan về phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí là một trong những phương pháp phổ biến và hữu
hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu
cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.2.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp
phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh
Sắc kí gồm pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của
hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với các tính chất của
chúng ví dụ như: tính bị hấp phụ, tính tan.v.v...
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí thì hết lớp pha tĩnh
nay tới lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lai quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết
quả là các chất có ái lực lớn đối với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ
thống sắc kí so với các chất tương tác yêu hơn. Nhờ đặc điểm này mà người ta
có thể tách các chất thông qua quá trình sắc kí.
1.2.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha
động và tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng
chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch hoặc với chất khí là áp suất
riêng phần gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
n = n∞bC 1+bC
Trong đó: n - Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng;
n∞- Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó;
b - Là hằng số;
C - là nồng độ của chất bị hấp phụ
14
1.2.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái
khí hay lỏng), còn pha tĩnh các chất có thể ở pha lỏng hay rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai
nhóm lớn: Sắc kí khí và sắc kí lỏng
Dựa vào cách tiến hành người ta chia ra thành các phương pháp sắc kí chủ
yếu sau:
1.2.3.1. Sắc kí cột
Đây là phương pháp phổ biến nhất thường được sử dụng và cũng là
phương pháp khá đơn giản, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có
kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,ODS, Dianion… Chất
hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc bằng kim loại nhưng
phổ biến nhất là bằng thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng,
nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của
chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và
ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ
chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng trương không đủ lớn sẽ
gây ra hiện tượng tắc cột, khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung
bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan
trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách,
tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí tỉ lệ giữa quãng đường đi
của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một
chất cụ thể sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau của Rf mà ta có thể
tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với chất hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu cầu
tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp từ 1/5 - 1/10, còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này
cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách tức là phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của
các chất, mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
15
Sắc kí cột việc đưa chất lên cột rất quan trọng, tùy thuộc vào lượng chất
và dạng chất mà người ta có thể đưa lên cột bằng các phương pháp khác nhau.
Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến nhất là tẩm chất vào silicagel rồi
làm khô, tơi hoàn toàn rồi đua lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp lên cột
bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô, theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hập
phụ được sắp xếp chặt trong cột sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến
khi cột trong suốt
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi
chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ
lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột cần lưu ý, không để bọt khí bên trong nếu có
bọt khí gây lên hiên tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách, và cột
không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng tới hiệu quả tách. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá thấp sẽ
kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng tới tiến độ công việc.
1.2.3.2. Sắc kí lớp mỏng
Săc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel
trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra SKLM còn để điều chế thu trực tiếp.
Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silicagel dày hơn), có
thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo
riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích
hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất n trên bản mỏng
bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dung
dịch H2SO4 10%.
16
1.3. Một số phương pháp hóa lí ứng dụng trong phân tích cấu trúc của các
hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ thường được xác định nhờ vào ứng
dụng của các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của
từng chất mà sử dụng các phương pháp phổ cho phù hợp. Cấu trúc càng phức
tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường
hợp, để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất người ta phải dựa vào các
phương pháp phổ khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với phương pháp sắc kí
so sánh…
- Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các
liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu
liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ
hồng ngoại có thể xác định các nhóm đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hyđroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O là khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm NH là khoảng 3100-3500 cm-1.v.v…
- Phổ khối lượng(Mass spectroscopy - MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của
phân tử chất dươi sự bán phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic
ion mảnh khác mà dựa vào đó ma người ta có thể xác định được cơ chế phân
mảnh, và dựng lại được cấu trúc các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều phương
pháp phổ khối lượng, sau đây là một số phương pháp chủ yếu:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự
phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ
biến là 70 eV.
+ Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ
phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn
17
nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là các pic ion phân tử và
các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp dễ bị phá
vỡ.
+ Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở mức năng lượng thấp, do đó
phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),
cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với sự chính xác cao.
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí
kết hợp với phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ), LC - MS (sắc kí lỏng
- khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích
thành phần của hỗn hợp chất đặc biệt là đối với phân tích thuốc trong ngành
dược.v.v…
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy - NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện
đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR
một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của hợp
chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và 13C) dưới tác dụng của từ
trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển
hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa
vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
+ Phổ 1H - NMR: Trong phổ 1H - NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của
các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai
hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác
spin mà ta xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
18
+ Phổ 13C - NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử
cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C - NMR là ppm, với dải thang độ rộng 0-230ppm.
+ Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer): Phổ
này cho ta tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT cacbon
bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 nằm về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ
của các CH.
+ Phổ 2D - NMR: đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương tác
của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ
yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)
Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ một là trục phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác
HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (Homocosy), (1H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với
cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các
tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được
xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton
không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không
gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences để xác
19
định cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ
trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía vế
không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho
tín hiệu cộng hưởng với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra còn sử dụng X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc
không gian của toàn phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng tinh thể.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ người ta còn sử dụng
kết hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp
phân tích so sánh kết hợp khác. Đặc biệt với phân tử nhiều mạch chính dài, tín
hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chính xác chiều dài các
mạch. Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác các loại
đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy
phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các
đường chuẩn dự kiến.
20
Chương 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) được thu
hái ở Trung tâm nghiên cứu Trồng và Chế biến cây thuốc Hà Nội vào tháng
4/2017. Mẫu được giám định bởi TS Đỗ Văn Hải, TS. Nguyễn Thế Cường, Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Tiêu bản được lưu trữ tại phòng Nghiên cứu
cấu trúc, Viện Hóa sinh biển.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được
phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel
60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung
dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để
xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại
bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và
pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).
Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd.). Nhựa
trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).
21
2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ phổ
cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện
đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR
một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của hợp
chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và 13C) dưới tác dụng của từ
trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển
hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa
vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). 2.3.1. Phổ 1H - NMR
Trong phổ 1H - NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác
định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử
cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà ta xác định
được cấu trúc hóa học của các hợp chất. 2.3.2. Phổ 13C - NMR
Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C
- NMR là ppm, với dải thang độ rộng 0-230ppm.
2.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer)
Phổ này cho ta tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ
DEPT cacbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 nằm về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
2.3.4. Phổ 2D - NMR
Đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương tác của các hạt nhân
từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được
sử dụng như sau:
22
- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ
này. Trên phổ một là trục phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác
HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ COSY (Correlation Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với
cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các
tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được
xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không
kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa
vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
2.4. Thực nghiệm
2.4.1. Phân lập các hợp chất
Thân lá G. latifolium được phơi khô, nghiền nhỏ thu được 4 kg. Ngâm
4 kg bột G. latifolium với 20 lít MeOH và siêu âm ở nhiệt độ phòng (3 lần,
mỗi lần 2 giờ) thu được dịch chiết methanol. Sau khi loại dung môi dưới áp
suất giảm, cặn chiết MeOH (GL, 750 g) được phân bố đều trong nước cất và
chiết phân lớp lần lượt với dung môi n-Hexane và EtOAc thu được các cặn n-
Hexan (GL1A, 130g), cặn EtOAc (GL1B, 400g) và lớp nước (GL1C, 580g).
Phân lớp nước (GL1C, 580 g) được phân tách qua cột Diaion HP-20 rửa
giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (25%Me, 50%Me, 75%Me, 100%Me, v:v)
thu được bốn phân đoạn tương ứng GL2A (20.0 g), GL2B (31.6 g), GL2C
(42.0 g) và GL2D (50 g). Phân đoạn GL2B được phân tách trên cột Gradient
23
rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:MeOH (20:1, 10:1, 5:1, v:v:v) thu được ba
phân đoạn tương ứng GL3A (5.0 g), GL3B (8.0 g) và GL3C (10.0 g). Phân
đoạn GL3B tiếp tục được phân tách qua cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ
dung môi MeOH:H2O (1.5:1, v:v) thu được sáu phân đoạn GL4A (500 mg),
GL4B (1.0 g), GL4C (600 mg), GL4D (650 mg), GL4G (400 mg) và GL4F
(1.2 g).
Phân đoạn GL4C cho chạy qua cột nhồi silica gel pha đảo, hệ dung môi
axeton:nước (1:1,v:v) thu được phân đoạn GL4C1, chất sạch GL1 (60.7 mg) thu
được khi tinh chế phân đoạn GL4C1 bằng cột pha đảo sử dụng hệ dung môi
axeton: nước (1:3, v:v)
Phân đoạn GL4D cho chạy qua cột nhồi silica gel pha đảo, hệ dung môi
axeton:nước (1:1,v:v) thu được phân đoạn GL4D1, chất sạch GL2 (50.3 mg) thu
được khi tinh chế phân đoạn GL4D1 bằng cột pha đảo sử dụng hệ dung môi
axeton: nước (1:2.5, v:v)
Phân đoạn GL4G cho chạy qua cột nhồi silica gel pha đảo, hệ dung môi
MeOH:H2O (1:1, v:v) thu được phân đoạn GL4G1, phân đoạn GL4G1 tiếp tục
được phân tách bằng cột pha đảo sử dụng hệ dung môi axeton: nước (1:2, v:v),
thu được chất sạch GL3 (73.5 mg).
Phân đoạn GL4F cho chạy qua cột nhồi silica gel pha đảo, hệ dung môi
MeOH:H2O (1:1, v:v) thu được phân đoạn GL4F1, phân đoạn GL4F1 tiếp tục
được phân tách bằng cột pha đảo sử dụng hệ dung môi axeton: nước (1:2, v:v),
thu được chất sạch GL4 (66.4 mg).
24
Bột GL khô (4Kg)
Chiết siêu âm với methanol (3lần x20L)
GL (750g)
n-Hexane
EtOAc
GL1A 130g
GL1C 580g
GL1B 400g
25%M
100%Me
75%Me
50%Me
GL2B 31.6 g
GL2D 50 g
GL2C 42 g
C.C, Gradient (CM 20/1 10/1 5/1)
GL2A 20 g
GL3C 10 g
GL3A 5 g
GL3B 8.0 g MW 1.5/1
GL4G 400 mg
GL4F 1.2 g
GL4D 650 mg
GL4A 500 mg
GL4B 1.0 g
GL4C 600 mg
RP-18, MW 1/1
RP-18, MW 1/1
RP-18, MW 1/1
RP-18, AW 1/1
GL4G1 90 mg
GL4C1 150 mg
GL4D1 100 mg
GL4F1 120 mg
RP-18, AW 1/2
RP-18, AW 1/2
RP-18, AW 1/3
RP-18, AW1/2.5
GL3 73.5 mg
GL4 66.4 mg
GL1 60.7 mg
GL2 50.3 mg
Ký hiệu các chữ viết tắt:
EtOAc: ethyl acetat W: nước
C: chloroform A: axeton
M: methanol C.C: Sắc ký cột pha thường
RP-18: Sắc ký cột pha đảo
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn MeOH của loài G. latifolium
25
2.4.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được
2.4.2.1. Hợp chất GL1
Bột vô định hình màu trắng.
: -26.6° (c 0.004, CH3OH)
Công thức phân tử: C48H80O18
Độ quay cực [ ] 1H, 13C-NMR: xem Bảng 3.1
2.4.2.2. Hợp chất GL2
Bột vô định hình màu trắng.
: -23.4° (c 3.1, CH3OH)
Công thức phân tử: C51H82O20
Độ quay cực [ ] 1H, 13C-NMR: xem Bảng 3.2
2.4.2.3. Hợp chất GL3
Bột vô định hình màu trắng.
: -9.6° (c 0.2, CH3OH)
Công thức phân tử: C53H86O22
Độ quay cực [ ] 1H, 13C-NMR: xem Bảng 3.3
2.4.2.4. Hợp chất GL4
Bột vô định hình màu trắng.
: -12.1° (c 0.12, CH3OH)
Công thức phân tử: C54H88O23
Độ quay cực [ ] 1H, 13C-NMR: xem Bảng 3.4
26
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL1: Gymnemoside-W1
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL1
Hợp chất GL1 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL1 cho tín hiệu của 7 nhóm methyl singlet tại δH 0.84,
0.88, 0.91, 0.96, 1.03, 1.05 và 1.23; một proton olefin tại δH 5.22 (1H, br s), 3
proton anome tại δH 4.16 (1H, d, J = 7.6 Hz), 4.32 (1H, d, J = 7.6 Hz) và 4.38 (1H, d, J = 8.0 Hz). Kết hợp phổ 13H-NMR và HSQC cho thấy GL1 có 7 cacbon
methyl [δC 16.2, 17.0, 17.6, 24.3, 27.4, 28.5 và 33.7], 2 cacbon olefin [δC 124.2
và 144.0], 3 cacbon anome [δC 104.8, 105.1 và 106.8], 12 cacbon methilen [δC
19.3, 26.7, 27.1, 24.7, 33.7, 34.7, 36.9, 39.9, 47.6, 62.7, 62.8, 69.8], 1 cacbon
oximetin [δC 90.7] và các cacbon vùng đường [ δC 71.6-78.3]. Các tín hiệu phổ
trên cho phép dự đoán về một saponin khung oleane đính 3 đơn vị đường β-D-
glucose. Tín hiệu δC 69.8 gợi ý đường glucose có thể bị thế ở vị trí C-6. So sánh
các dữ kiện phổ của hợp chất GL1 với hợp chất Gymnemoside-W1 [41] thấy
hoàn toàn tương đồng. Cấu trúc của hợp chất GL1 được làm rõ thông qua phổ
hai chiều HMBC. Trên phổ HMBC của GL1, tương tác HMBC từ H-23 (δH
27
1.05), H-24 (δH 0.84) tới C-3 (δC 90.7)/ C-4 (δC 40.2)/ C-5 (δC 56.9) và từ H-3
(δH 3.17) tới C-4 (δC 40.2)/ C-23 (δC 28.5)/ C-24 (δC 17.0) cho thấy liên kết C-O
tại C-3 và có 2 nhóm metyl tại C-4. Tương tác HMBC từ H-25 (δH 0.96) tới C-1
(δC 39.9)/ C-5 (δC 56.9)/ C-9 (δC 48.1)/ C-10 (δC 37.7), từ H-26 (δH 1.03) tới C-7
(δC 33.7)/ C-8 (δC 41.1)/ C-9 (δC 48.1)/ C-14 (δC 44.9) và từ H-27 (δH 1.23) tới C-
8 (δC 41.1)/ C-13 (δC 144.0)/ C-14(δC 44.9)/ C-15 (δC 36.9) cho thấy 3 nhóm metyl
lần lượt tại C-10, C-8 và C-14. Các tương tác HMBC từ H-29 (δH 0.88) và H-30
(δH 0.91) tới C-19 (δC 47.6), C-20 (δC 31.7), C-21 (δC 34.7) cho thấy 2 nhóm
metyl tại C-20. Tương tác HMBC từ H-12 (δH 5.22) tới C-14 (δC 44.9) và từ H-
18 (δH 2.20) tới C-12 (δC 124.2)/ C-13 (δC 144.0)/ C-16 (δC 67.5)/ C-17 (δC 41.8)
cho thấy có nối đôi tại C-12 và C-13. Tương tác H-1′ (δH 4.32) tới C-3 cho thấy
đơn vị đường (H-1′ (δH 4.32)) nằm ở C-3. Tương tác H-1′′ (δH 4.38) tới C-6′ (δC
69.8) cho thấy đơn vị đường (H-1′′ (δH 4.38) nằm ở C-6′. Tương tác giữa H-1′′′
(δH 4.18) tới C-28 (δC 78.0) cho thấy đơn vị đường (H-1′′ (δH 4.18) nằm ở C-28.
Kết hợp các phân tích phổ 1 chiều, 2 chiều và so sánh với tài liệu tham khảo,
hợp chất GL1 được xác định là 16-β-hydroxy oleane-12-en-3-O-[β-D-
glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranoside, hay
còn gọi là gymnemoside-W1, một hợp chất được phân lập từ loài Gymnema
sylvestre bởi Xu và cộng sự [41].
Hình 3.2. Các tương tác HMBC chính của hợp chất GL1
28
Bảng 3.1. Số liệu phổ của hợp chất GL1 và hợp chất tham khảo
C
a,cδH (mult., J in Hz)
#δC
a,bδC
Aglycone
1 1.00 (m)/1.61 (m) 38.7 39.9
2 1.65 (m)/1.90 (m) 26.6 27.1
3 3.17 (m) 88.9 90.7
4 - 39.4 40.2
5 0.80 (m) 55.6 56.9
6 1.43 (m)/1.58 (m) 18.3 19.3
7 1.35 (m)/1.58 (m) 32.6 33.7
8 - 40.0 41.1
9 1.56 (m) 47.0 48.1
10 - 37.7 37.7
11 1.88 (m) 23.7 24.7
12 5.22 (br s) 123.0 124.2
13 - 143.3 144.0
14 - 43.8 44.9
15 1.38 (m)/1.81 (m) 36.8 36.9
16 4.20 (dd, 4.4, 11.6) 66.1 67.5
17 - 41.2 41.8
18 2.20 (m) 44.6 45.6
19 1.07 (m)/1.71 (m) 26.7 47.6
20 - 30.9 31.7
21 1.18 (m)/1.40 (m) 34.0 34.7
22 1.40 (m)/2.20 (m) 26.5 26.7
23 1.05 (s) 28.1 28.5
24 0.84 (s) 17.0 17.0
29
15.7 25 16.2 0.96 (s)
17.0 26 17.6 1.03 (s)
27.0 27 27.4 1.23 (s)
3.65 (m)/3.75 (m) 77.9 28 78.0
33.3 29 33.7 0.88 (s)
24.0 30 24.3 0.91 (s)
3-O-Glu
106.9 106.8 4.31 (d, 7.6) 1′
75.2 2′ 75.1 3.30 (m)
78.3 3′ 78.0 3.31 (m)
71.6 4′ 71.6 3.30 (m)
76.9 5′ 76.9 3.42 (m)
3.76 (m)/4.08 (m) 70.4 6′ 69.8
6′-Glu
105.3 104.8 4.37 (d, 8.0) 1′
75.5 2′′ 75.6 3.30 (m)
78.5 3′′ 78.1 3.31 (m)
71.7 4′′ 71.6 3.30 (m)
76.9 5′′ 78.0 3.32 (m)
62.7 6′′ 62.8 3.65 (m)/3.83 (m)
6′′-O-Glu
1′′′ 105.7 105.1 4.16 (d, 7.6)
74.9 2′′′ 74.9 3.12 (m)
78.3 3′′′ 78.3 3.31 (m)
71.7 4′′′ 71.6 3.30 (m)
76.9 5′′′ 78.0 3.22 (m)
6′′′ 3.65 (m)/3.83 (m) 62.7
62.7 #δC Số liệu phổ của chất tham khảo [41], đo trong a)methanol-d4, b)101 MHz, c)400 MHz
30
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL1
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL1
31
Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất GL1
Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất GL1
32
3.2. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL2: Alternoside XIX
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL2
Hợp chất GL2 phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất GL2 cho các tín hiệu khá tương đồng với hợp chất GL1
với sự xuất hiện của 7 nhóm methyl tại δH 0.85, 0.89, 0.91, 0.97, 1.04, 1.05 và
1.23; một proton olefin tại δH 5.22 (1H, br s), 3 proton anome tại δH 4.33 (1H, d,
J = 8.0 Hz), 4.37 (1H, d, J = 7.6 Hz) và 4.16 (1H, d, J = 8.0 Hz). Sự khác biệt dễ
nhận thấy là xuất hiện thêm 1 proton anome tại δH 4.29 (1H, d, J = 7.2 Hz) gợi ý sự xuất hiện thêm 1 đơn vị đường β trong phân tử. Tương ứng trên phổ 13C-
NMR là cacbon anome δC 105.5. Sự biến mất 1 nhóm CH2 (δC 62.7), thay vào đó
là xuất hiện thêm nhóm CH2 (HSQC) tại δC 70.1 dự đoán đơn vị đường mới này
được gắn vào ở vị trí C-6 của đường glucose. Đặc biệt, tín hiệu δC 66.8 (CH2 -
HSQC) gợi ý sự tồn tại của một gốc đường xylopyranosyl trong phân tử. So
sánh số liệu phổ của hợp chất GL2 với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất này
giống hợp chất alternoside XIX [42]. Cấu trúc của hợp chất GL2 được khẳng
định lại bằng phổ hai chiều HMBC tương tự như ở hợp chất GL1. Vị trí của đơn
vị đường β-D-xylopyranose gắn thêm ở hợp chất GL2 được xác định dựa vào
tương tác HMBC giữa H-1′′′ (δH 4.29) với C-6′′ (δC 70.1).
33
Kết hợp phân tích phổ 1D, 2D của hợp chất GL2 và so sánh dữ kiện phổ
với chất 9 trong tài liệu tham khảo [42], cấu trúc của hợp chất GL2 được xác
định là 16-β-hydroxy oleane-12-en-3-O-[β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-
glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranoside, hay
còn gọi là alternoside XIX, lần đầu tiên được phân lập năm 1999 từ loài
Gymnema alternifolium [42].
Hình 3.8. Tương tác HMBC chính của hợp chất GL2
Bảng 3.2. Số liệu phổ của hợp chất GL2 và hợp chất tham khảo
C
#δC
a,cδH (mult., J in Hz)
a,bδC
Aglycone
1 38.7 0.99 (m)/1.62 (m) 39.9
2 26.5 1.64 (m)/1.92 (m) 27.1
3 89.0 3.18 (m) 90.7
4 39.4 - 40.2
5 55.6 0.77 (m) 56.9
6 18.5 1.45 (m)/1.58 (m) 19.3
7 32.6 1.39 (m)/1.58 (m) 33.8
8 40.4 - 41.2
9 47.0 1.56 (m) 48.1
34
10 - 36.7 37.7
11 1.90 (m) 23.7 24.7
12 5.22 (br s) - 124.2
13 - 143.3 143.9
14 - 43.8 44.8
15 1.39 (m)/1.82 (m) 36.9 36.9
16 4.20 (m) 66.1 67.5
17 - 41.2 41.8
18 2.18 (m) 44.6 45.6
19 1.06 (m)/1.71 (m) 46.7 47.6
20 - 30.9 31.7
21 1.39 (m)/1.71 (m) 34.0 34.7
22 1.41 (m)/2.21 (m) 26.5 26.7
23 1.05 (s) 28.1 28.5
24 0.85 (s) 16.9 17.0
25 0.97 (s) 15.7 16.2
26 1.04 (s) 16.9 17.6
27 1.23 (s) 27.6 27.5
28 3.66 (m)/3.75 (m) 78.3 77.9
29 0.89 (s) 33.3 33.8
30 0.91 (s) 24.0 24.3
3-O-Glu
1′ 106.9 106.6 4.33 (d, 8.0)
2′ 3.12 (m) 74.9 74.8
3′ 3.30 (m) 78.4 78.0
4′ 3.28 (m) 71.5 71.5
5′ 3.31 (m) 76.9 77.6
35
6′ 70.3 70.1 3.75(m)/4.08 (m)
6′- O-Glu
1′′ 105.3 104.9 4.37 (d, 7.6)
2′′ 75.5 3.18 (m) 75.6
3′′ 78.7 3.30 (m) 78.0
4′′ 71.5 3.28 (m) 71.5
5′′ 76.9 3.40 (m) 76.8
6′′ 69.8 3.69 (m)/4.08 (m) 69.8
6′′-O-Xyl
1′′′ 106.2 105.5 4.29 (d, 7.2)
2′′′ 74.8 3.12 (m) 74.8
3′′′ 78.0 3.30 (m) 77.8
4′′′ 71.1 3.46 (m) 71.1
5′′′ 67.0 3.17 (m)/3.84 (m) 66.9
28-O-Glu
1′′′′ 105.3 105.1 4.16 (d, 8.0)
2′′′′ 75.0 3.12 (m) 75.1
3′′′′ 78.5 3.30 (m) 78.1
4′′′′ 71.5 3.28 (m) 71.5
5′′′′ 78.7 3.20 (m) 78.1
#δC số liệu phổ của chất tham khảo [2], đo trong a)methanol-d4, b)101 MHz, c)400 MHz
6′′′′ 62.6 3.66 (m)/3.83 (m) 62.7
36
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL2
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL2
37
Hình 3.11. Phổ HSQC của hợp chất GL2
Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất GL2
38
3.3. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL3: 3-O-β-D-
xylopyranosyl(1→6)-β-D- glucopyranosyl(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic
acid 28-O-β-D- glucopyranosyl ester.
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL3
Hợp chất GL3 phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Quan sát phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất GL3 dễ nhận thấy đây cũng là một
oleane glycoside với tín hiệu của 7 nhóm methyl tại δH 0.77, 0.82, 0.89, 0.91,
0.93, 1.03 và 1.14; một proton olefin tại δH 5.23 (1H, br s), 4 proton anome tại
δH 4.29 (1H, d, J = 7.6 Hz), 4.32 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.37 (1H, d, J = 7.6 Hz) và
5.37 (1H, d, J = 7.6 Hz). Ngoài 7 nhóm methyl [δC 16.1, 17.1, 17.7, 24.0, 26.4,
28.6 và 33.5], 2 cacbon olefin [δC 123.8 và 144.7], 4 cacbon anome [δC 95.6,
104.7, 105.4 và 106.6], 13 cacbon methilen [δC 19.3, 24.5, 28.8, 27.0, 33.0, 33.9,
34.8, 39.8, 47.2, 62.3, 66.8, 69.8 và 70.1], 1 cacbon oximetin [δC 90.7] và các cacbon vùng đường [ δC 71.3-78.1], phổ 13C-NMR của GL3 còn xuất hiện thêm
tín hiệu của một cacbon cacbonyl dạng ester ở δC 177.9. Theo các dữ kiện phổ
trên, hợp chất GL3 được dự đoán là một dạng oleane saponin đính 4 đường bị
ester hóa ở vị trí C-28. Vị trí của các nhóm thế trong hợp chất GL3 được gán
thông qua phổ tương tác 2 chiều HMBC tương tự như hợp chất GL1 và GL2.
39
Nhóm cacbonyl được xác định ở vị trí C-28 dựa vào tương tác HMBC giữa H-
18 (δH 2.82) với C-28 (δC 177.9). Tương tác giữa H-1′ (δH 4.32) và C-3 (δC 90.8),
H-1′′(δH 4.37) và C-6′(δC 70.1), H-1′′′ (δH 4.29) và C-6′′(δC 69.8), H-1′′′′ (δH 5.37) và
C-28(δC 177.9), xác định các gốc đường lần lượt được gán vào các vị trí C-3, C-6′,
C-6′′ và C-28 tương ứng. Qua tổng quan các saponin phân lập từ chi Gymnema, kết
hợp với phân tích các phổ 1D, 2D của hợp chất GL3 và so sánh với chất 5 [43],
Hợp chất GL3 được xác định là 3-O-β-D- xylopyranosyl(1→6)-β-D-
glucopyranosyl(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-
glucopyranosyl ester.
Hình 3.14. Tương tác HMBC chính của hợp chất GL3
Bảng 3.3. Số liệu phổ của hợp chất GL3 và hợp chất tham khảo
C
#δC
a,bδC
a,cδH (mult., J in Hz)
Aglycone
1 38.7 39.8 0.95 (m)/1.95 (m)
2 26.7 27.0 1.63 (m)/1.90 (m)
3 89.0 90.8 3.16 (m)
4 39.5 40.1 -
5 55.8 56.7 0.77 (m)
6 18.3 19.3 1.37 (m)/1.51 (m)
40
7 33.1 33.9 1.29 (m)/1.45 (m)
8 39.9 40.6 -
9 48.0 47.9 1.55 (m)
10 37.0 37.8 -
11 23.8 24.5 1.88 (m)
12 123.0 123.8 5.23 (br s)
13 144.0 144.7 -
14 42.1 42.8 -
15 28.2 28.8 1.08 (m)/1.76 (m)
16 23.4 24.5 1.69 (m)/2.01 (m)
17 47.0 47.2 -
18 41.7 42.5 2.82 (d, 12.0)
19 46.2 47.2 1.13 (m)/1.68 (m)
20 30.8 31.5 -
21 34.0 34.8 1.19 (m)/1.37 (m)
22 32.5 33.0 1.59 (m)/1.69 (m)
23 17.6 28.6 1.03 (s)
24 28.2 17.1 0.82 (s)
25 15.1 16.1 0.93 (s)
26 17.5 17.7 0.77 (s)
27 26.4 26.4 1.14 (s)
28 176.5 177.9 -
29 33.2 33.5 0.89 (s)
30 23.7 24.0 0.91 (s)
3-O-Glu
1′ 107.0 106.6 4.32 (d, 8.0)
2′ 75.0 74.9 3.21 (m)
41
3′ 78.3 77.7 3.23 (m)
4′ 71.5 71.3 3.34 (m)
5′ 77.0 78.5 3.34 (m)
3.80 (m)/4.08 (m) 6′ 70.4 70.1
6′-O-Glu
105.4 104.7 4.37 (d, 7.6) 1′′
2′′ 75.6 75.4 3.21 (m)
3′′ 78.5 77.9 3.34 (m)
4′′ 71.6 71.3 3.34 (m)
5′′ 76.9 76.7 3.42 (m)
3.71 (dd, 4.4, 10.8)/4.08 6′′ 69.8 69.8 (m)
6′′-O-Xyl
106.0 105.4 4.29 (d, 7.6) 1′′′
2′′′ 74.7 74.7 3.21 (m)
3′′′ 77.5 77.5 3.23 (m)
4′′′ 71.1 71.0 3.49 (m)
3.19 (d, 11.2)/3.86 (dd, 5′′′ 67.1 66.8 4.8, 11.2)
28-O-Glu
1′′′′ 95.8 95.6 5.37 (d, 8.0)
2′′′′ 74.1 73.8 3.31 (m)
3′′′′ 78.9 78.1 3.34 (m)
4′′′′ 71.1 71.1 3.49 (m)
5′′′′ 79.3 76.7 3.42 (m)
#δC Số liệu phổ của chất tham khảo [43], đo trong a)methanol-d4, b)101 MHz, c)400 MHz
6′′′′ 62.2 62.3 3.67 (m)/3.80 (m)
42
Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL3
Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL3
43
Hình 3.17. Phổ HSQC của hợp chất GL3
Hình 3.18. Phổ HMBC của hợp chất GL3
44
3.4. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất GL4: 3-O-β-D-glucopyranosyl
(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-β-D-glucopyranosyl (1→6)-
β-D-glucopyranosyl ester
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL4
Hợp chất GL4 phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất GL4 cho các tín hiệu khá tương đồng với hợp chất
GL3 với 7 nhóm methine,14 cacbon methilen, 4 cacbon anome, 2 cacbon olefin và nhóm cacbon vùng đường. Sự khác biệt dễ nhận thấy là trên phổ 13C-
NMR của GL4 không còn tín hiệu của nhóm methilene của đường
xylopyranose. Ngoài ra, tín hiệu nhóm methilen ở δC 62.7 xuất hiện với cường
độ cao cho thấy có thể có 2 gốc đường β-D-glucose ở cuối mạch. Qua phân
tích số liệu phổ và tham khảo tổng quan thành phần hóa học chính của chi
Gymnema, hợp chất GL4 được dự đoán là 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-
D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-
glucopyranosyl ester [43].
Cấu trúc của hợp chất GL4 được khẳng định lại bằng phổ hai chiều
HMBC tương tự như ở hợp chất GL3. Nhóm cacbonyl được xác định ở vị trí
C-28 dựa vào tương tác HMBC giữa H-18 (δH 2.82) với C-28 (δC 178.0).
Tương tác giữa H-1′ (δH 4.33) và C-3 (δC 90.8), H-1′′ (δH 4.38) và C-6′ (δC
69.8), H-1′′′ (δH 5.33) và C-28 (δC 178.0), H-1′′′′ (δH 4.33) và C-28 (δC 178.0)
45
xác định các gốc đường lần lượt được gán vào các vị trí C-3, C-6′, C-28 và C-
6′′′ tương ứng.
Qua phân tích phổ 1H, 13C-NMR, HSQC, HMBC, kết hợp so sánh với
tài liệu tham khảo, GL4 được xác định là 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-
D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-
glucopyranosyl ester [43].
Hình 3.20. Tương tác HMBC chính của hợp chất GL4
C
Bảng 3.4. Số liệu phổ của hợp chất GL4 và hợp chất tham khảo a,cδH (mult., J in Hz) a,bδC
#δC
Aglycone
1 38.7 39.8 0.95 (m)/1.60 (m)
2 26.7 27.0 1.65 (m)/1.90 (m)
3 89.0 90.8 3.16 (m)
4 39.5 40.2 -
5 55.8 57.0 0.77 (m)
6 18.5 19.4 1.37 (m)/1.51 (m)
7 33.1 33.9 1.29 (m)/1.45 (m)
8 39.9 40.7 -
46
9 1.55 (m) 48.0 48.0
10 - 37.0 37.9
11 1.88 (m) 23.7 24.6
12 5.23 (br s) 122.9 123.9
13 - 144.1 144.8
14 - 42.1 42.9
15 1.08 (m)/1.76 (m) 28.2 28.9
16 1.69 (m)/2.03 (m) 23.4 24.0
17 - 47.0 47.2
18 2.82 (d, 12.0) 41.7 42.5
19 1.13 (m)/1.68 (m) 46.3 47.2
20 - 30.8 31.5
21 1.19 (m)/1.37 (m) 34.0 34.9
22 1.59 (m)/1.69 (m) 32.5 33.2
23 0.83 (s) 28.3 28.5
24 1.03 (s) 17.6 17.1
25 0.94 (s) 15.1 16.3
26 0.77 (s) 17.5 17.8
27 1.14 (s) 26.4 26.3
28 - 176.5 178.0
29 0.89 (s) 33.2 33.5
30 0.92 (s) 23.7 24.1
3-O-Glu
1′ 106.9 106.7 4.33 (d, 7.6)
2′ 3.21 (m) 75.2 75.1
3′ 3.23 (m) 78.4 77.7
4′ 3.34 (m) 71.5 71.5
47
3.34 (m) 5′ 77.0 78.1
3.76 (m)/4.08 (dd, 6.4, 10.4) 6′ 70.5 69.8
6′-O-Glu
105.4 104.8 4.38 (d, 7.6) 1′′
3.21 (m) 2′′ 75.6 75.5
3.34 (m) 3′′ 78.6 77.9
3.34 (m) 4′′ 71.7 71.5
3.42 (m) 5′′ 78.5 76.8
3.65 (dd, 4.8, 12.0)/3.83 (m) 6′′ 62.6 62.7
28-Glu
5.33 (d, 8.0) 1′′′ 95.7 95.7
3.31 (m) 2′′′ 73.9 73.8
3.34 (m) 3′′′ 78.7 78.1
3.49 (m) 4′′′ 70.9 71.6
3.42 (m) 5′′′ 78.0 78.1
6′′′ 69.3 69.5 3.76 (m)/4.08 (dd, 6.4, 10.4)
6′′′-O-Glu
4.31 (*) 1′′′′ 105.3 104.6
3.21 (m) 2′′′′ 75.2 75.6
3.23 (m) 3′′′′ 78.5 77.9
3.49 (m) 4′′′′ 71.7 71.6
3.41 5′′′′ 78.4 76.8
#δC số liệu phổ của chất tham khảo [43], đo trong a)methanol-d4, b)101 MHz, c)400 MHz
6′′′′ 62.7 62.7 3.65 (dd, 4.8, 12.0)/3.83 (m)
48
Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL4
Hình 3.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL4
49
Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất GL4
Hình 3.24. Phổ HMBC của hợp chất GL4
50
3.5. Tổng hợp cấu trúc hóa học của một số hợp chất saponin phân lập được
từ loài G. latiflolium và đánh giá sơ bộ hàm lượng
Bằng các phương pháp chiết, sắc ký, đã nhận được phân đoạn giàu hợp
chất saponin và phân lập được bốn hợp chất steroidal saponin (GL1-GL4) từ
cây dây thìa canh lá to. Phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất này bằng kết
hợp các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã xác định được đó là
gymnemoside-W1 (GL1), alternoside XIX (GL2), 3-O-β-D- xylopyranosyl
(1→6)-β-D- glucopyranosyl(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-
D- glucopyranosyl ester (GL3), và 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-
glucopyranosyl oleanolic acid-28-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-
glucopyranosyl ester (GL4). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này như sau:
51
Hình 3.25. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất saponin (GL1-GL4)
từ loài G. latifolium
Đánh giá sơ bộ về hàm lượng cho thấy phân đoạn giàu hợp chất saponin
(saponin tổng) chiếm khoảng 19.15% về khối lượng so với dịch chiết tổng và
chiếm 3,59% về khối lượng trong mẫu khô. Các hợp chất GL1-GL4 phân lập
được với tỉ lệ khối lượng trong phân đoạn giàu hợp chất saponin là 0.042%,
0.035%, 0.051%, và 0.046%.
52
Bảng 3.5. Đánh giá sơ bộ về hàm lượng của các hợp chất saponin
trong mẫu dây thìa canh lá to
Khối lượng Tỉ lệ % về khối lượng
Mẫu khô 4 kg
Cặn chiết tổng 750 g
Saponin tổng 143.6 g
60.7 mg GL1
50.3 mg GL2
73.5 mg GL3
66.4 mg - 18.75a 3.59a 0.042b 0.035b 0.051b 0.046b GL4
Phần trăm khối lượng so với: a)mẫu khô, b)saponin tổng
53
KẾT LUẬN
1. Đã tiến hành chiết để thu dịch chiết tổng loài G. latifolium; phân đoạn
để nhận được phân đoạn saponin tổng; và phân lập được 04 hợp chất GL1-GL4
từ phân đoạn này. Đánh giá sơ bộ cho thấy phân đoạn saponin tổng chiếm
3.59% tổng khối lượng mẫu khô. Các hợp chất GL1-GL4 phân lập được với tỉ
lệ khối lượng so với phân đoạn saponin tổng là 0,042%, 0,035%, 0,051 % và
0,046%.
2. Phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất GL1-GL4 bằng phổ cộng
hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, và so sánh với các số liệu phổ đã được
công bố trên tài liệu tham khảo cho thấy bốn hợp chất phân lập được là
Gymnemoside-W1 (1), alternoside XIX (2), 3-O-β-D- xylopyranosyl(1→6)-β-D-
glucopyranosyl(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-
glucopyranosyl ester (3) và 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl
oleanolic acid-28-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ester (4).
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hội nghị đánh giá hoạt động của Dự án phòng chống đái tháo đường, các
rối loạn thiếu hụt i-ôt năm 2010 và triển khai kế hoạch hoạt động năm
2011 (khu vực phía Bắc) - Bắc Ninh, 3/2011.
2. F. J. Alarcon-Aguilara, R. Roman-Ramos, S. Perez-Gutierrez, A. Aguilar-
Contreras, C. C. Contreras-Weber, J. L. Flores-Saenz. Study of the anti-
hyperglycemic effect of plants used as antidiabetics. Journal of
Ethnopharmacology, 61, 101-110 (1998).
3. V. V. Chi. Dictionary of Medicinal Plants in Vietnam. Medical Publishing
House, Hanoi, 776-777 (2012).
4. S. S. Gupta. Inhibitory effect of Gymnema sylvestris on adrenalineinduced
hyperglycemia in rats. Indian Journal of Mecinal Sciene, 15, 883-887
(1961).
5. K. Miyatake, S. Takenaka, T. Fujimoto, G. Kensho, S. Priya Upadhaya, M.
Kirihata, I. Ichimoto, Y. Nakano. Isolation of conduritol A from Gymnema
sylvestre and its effects against intestinal glucose absorption in rats.
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 57, 2184-2185 (1993).
6. K. Miyatake, G. Kensho, T. Fujimoto, E. Noguchi, M. Shinohara, S.
Takenaka, T. Taira, S. Priya Upadhaya, I. Ichimoto, Y. Nakano. Effect of
Conduritol A, a Polyol from Gymnema sylvestre, on the development of
diabetic cataracts in streptozotocin-treated rats and on aldose reductase.
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 58, 756-757 (1994).
7. K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura. Structure studies of
new antisweet constituents from Gymnema sylvestre. Tetrahedron Letters,
30, 1103-1106 (1989).
8. K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura. Gymneic acid V, VI
and VII from gurma, the leaves of Gymnema sylvestre R. Br. Chemical and
Pharmaceutical Bulletin, 37, 852-854 (1989).
55
9. K. Yoshikawa, M. Nakagawa, R. Yamamoto, S. Arihara, K. Matsuura.
Antisweet natural products. V. Structures of gymnemic acids VIII-XII from
Gymnema sylvestre R. BR. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40,
1779-1782 (1992).
10. N. P. Sahu, S. B. Mahato, S. K. Sarkar, G. Poddar. Triterpenoid saponins
from Gymnema sylvestre. Phytochemistry, 41, 1181-1185 (1996).
11. M. Yoshikawa, T. Murakami, H. Matsuda. Medicinal Foodstuffs. X.
Structures of new triterpene glycosides, Gymnemosides-c, -d, -e, and -f,
from the leaves of Gymnema sylvestre R. BR. : influence of gymnema
glycosides on glucose uptake in rat small intestinal fragments. Chemical
and Pharmaceutical Bulletin, 45, 2034-2038 (1997).
12. W.-C. Ye, Q.-W. Zhang, X. Liu, C.-T. Che, S.-X. Zhao. Oleanane
saponins from Gymnema sylvestre. Phytochemistry, 53, 893-899 (2000).
13. W. Ye, X. Liu, Q. Zhang, C.-T. Che, S. Zhao. Antisweet Saponins from
Gymnema sylvestre. Journal of Natural Products, 64, 232-235 (2001).
14. X. Liu, W. Ye, B. Yu, S. Zhao, H. Wu, C. Che. Two new flavonol
glycosides from Gymnema sylvestre and Euphorbia ebracteolata.
Carbohydrate Research, 339, 891-895 (2004).
15. X.-M. Zhu, P. Xie, Y.-T. Di, S.-L. Peng, L.-S. Ding, M.-K. Wang. Two
new triterpenoid saponins from Gymnema sylvestre. Journal of Integrative
Plant Biology, 50, 589-592 (2008).
16. M.-Q. Zhang, Y. Liu, S.-X. Xie, T.-H. Xu, T.-H. Liu, Y.-J. Xu, D.-M. Xu.
A new triterpenoid saponin from Gymnema sylvestre. Journal of Asian
Natural Products Research, 14, 1186-1190 (2012).
17. A. Zarrelli, M. DellaGreca, A. Ladhari, R. Haouala, L. Previtera. New
triterpenes from Gymnema sylvestre. Helvetica Chimica Acta, 96, 1036-
1045 (2013).
18. A. Zarrelli, A. Ladhari, R. Haouala, G. Di Fabio, L. Previtera, M.
DellaGreca. New acylated oleanane and lupane triterpenes from
Gymnema sylvestre. Helvetica Chimica Acta, 96, 2200-2206 (2013).
56
19. D. Wang, G. Li, Y. Feng, S. Xu. Two new oleanane triterpene glycosides
from Gymnema inodorum. Journal of Chemical Research, 655-657 (2008).
20. M. Atsuchi, C. Yamashita, Y. Iwasaki. EP636633A1; 1995, 15 pp.
21. K. Yoshikawa, K. Matsuchika, S. Arihara, H.-C. Chang, J.-D. Wang. Pregnane
glycosides, gymnepregosides A-F from the roots of Gymnema alternifolium.
Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 46, 1239-1243 (1998).
22. K. Yoshikawa, K. Matsuchika, K. Takahashi, M. Tanaka, S. Arihara, H.-
C. Chang, J.-D. Wang. Pregnane glycosides, gymnepregosides G-Q from
the roots of Gymnema alternifolium. Chemical and Pharmaceutical
Bulletin, 47, 798-804 (1999).
23. J. Tian, Q.-G. Ma, J.-B. Yang, A.-G. Wang, T.-F. Ji, Y.-G. Wang, Y.-L.
Su. Hepatoprotective Phenolic Glycosides from Gymnema tingens. Planta
Medica, 79, 761-767 (2013).
24. S. Srisurichan, S. Puthong, S. Pornpakakul. Pregnane-type steroidal
glycosides from Gymnema griffithii Craib. Phytochemistry, 106, 197-206
(2014).
25. Y. Sugihara, H. Nojima, H. Matsuda, T. Murakami, M. Yoshikawa, I.
Kimura. Antihyperglycemic effects of gymnemic acid IV, a compound
derived from Gymnema sylvestre leaves in streptozotocin-diabetic mice.
Journal of Asian Natural Products Research, 2, 321-327 (2000).
26. A. B. A. Ahmed, A. S. Rao, M. V. Rao. Role of in vivo leaf and in vitro
callus of Gymnema sylvestre in maintaining the normal levels of blood
glucose and lipid profile in diabetic Wistar rats. Biomedicine, 28, 134-138
(2008).
27. P. Daisy, J. Eliza, K. A. M. Mohamed Farook. A novel dihydroxy
gymnemic triacetate isolated from Gymnema sylvestre possessing
normoglycemic and hypolipidemic activity on STZ-induced diabetic rats.
Journal of Ethnopharmacology, 126, 339-344 (2009).
57
28. A. B. A. Ahmed, A. S. Rao, M. V. Rao. In vitro callus and in vivo leaf
extract of Gymnema sylvestre stimulate β-cells regeneration and anti-
diabetic activity in Wistar rats. Phytomedicine, 17, 1033-1039 (2010).
29. A. Al-Romaiyan, B. Liu, H. Asare-Anane, C. R. Maity, S. K. Chatterjee,
N. Koley, T. Biswas, A. K. Chatterji, G. C. Huang, S. A. Amiel, S. J.
Persaud, P. M. Jones. A novel Gymnema sylvestre extract stimulates
insulin secretion from human islets in vivo and in vitro. Phytotherapy
Research, 24, 1370-1376 (2010).
30. K. Shimizu, M. Ozeki, A. Iino, S. Nakajyo, N. Urakawa, M. Atsuchi.
Structure-activity relationships of triterpenoid derivatives extracted from
Gymnema inodorum leaves on glucose absorption. The Japanese Journal
of Pharmacology, 86, 223-229 (2001).
31. M. Atsuji, K. Hikimoto, C. Yamashita, Y. Iwasaki. JP06128161A; 1994, 7
pp.
32. R. M. Reddy, P. B. Latha, T. Vijaya, D. S. Rao. The saponin-rich fraction
of a Gymnema sylvestre R. Br. aqueous leaf extract reduces cafeteria and
high-fat diet-induced obesity. Zeitschrift fur Naturforschung C: Journal of
Biosciences, 67, 39-46 (2012).
33. V. Kumar, U. Bhandari, C. D. Tripathi, G. Khanna. Anti-obesity effect of
Gymnema sylvestre extract on high fat diet-induced obesity in Wistar rats.
Drug Res 63, 625-632 (2013).
34. J. K. Malik, F. V. Manvi, B. R. Nanjware, D. K. Dwivedi, P. Purohit, S.
Chouhan. Anti-arthritic activity of leaves of Gymnema sylvestre R.Br.
leaves in rats Der Pharmacia Lettre, 336-341 (2010).
35. J. R. Nakkala, R. Mata, E. Bhagat, S. R. Sadras. Green synthesis of silver
and gold nanoparticles from Gymnema sylvestre leaf extract: study of
antioxidant and anticancer activities. Journal of Nanoparticle Research,
17, 1-15 (2015).
58
36. K. Yasukawa, S. Okuda, Y. Nobushi. Inhibitory effects of Gymnema
(Gymnema sylvestre) leaves on tumour promotion in two-stage mouse skin
carcinogenesis. Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine, 2014, 5 (2014).
37. V. Gopiesh khanna, K. Kannabiran. Antimicrobial activity of saponin
fractions of the leaves of Gymnema sylvestre and Eclipta prostrata. World
Journal of Microbiology and Biotechnology, 24, 2737 (2008).
38. N. Q. Tiến, P. T. H. Minh, N. Q. An, T. T. T. Nga, N. N. Tuấn, V. Đ. Doanh, P.
H. Điển. Một số kết quả nghiên cứu mới về thành phần hóa học của cây dây
thìa canh Gymnema sylvestre. Tạp chí Dược liệu, 16, 230-234 (2011).
39. Đ. T. Ái. Nghĩa. "Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ đường
huyết của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. Ex Wight)" Đại
Học Dược Hà Nội, luận văn thạc sỹ 2014.
40. H. T. B. Ngọc. "Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác
dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân
đái tháo đường type 2". Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, luận án tiến
sỹ, 2012.
41. Niranjan P. Sahu, Kazuo Koike, Zhonghua Jia, Sukdeb Banerjee, Nirup B.
Mandal and Tamotsu Nikaido, Triterpene glycosides from the bark of
Anthocephalus cadamba, Journal of Integrative Plant Biology, 50, 589-
592 (2008)
42. Kazuko Yoshikawa, Kimiko Takahashi, and Jen-Der Wang, Antisweet
Natural Products. XIV 1) Structures of Alternosides XI-XIX from
Gymnema alterniflolium, Chemical & Pharmaceutical Bulletin 47 (11),
1598-1603, (1999).
43. Wen-Cai Ye, Qing-Wen Zhang, Xin Liu, Oleanane saponins from Gymnema
sylvestre, Phytochemistry, 53, 2000, 893-899
59
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL1 ......................................... 1 Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL1 ......................................... 1 Phụ lục 3. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL1 ........................................ 2 Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL1 ........................................ 2
Phụ lục 5. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL1............................................ 3
Phụ lục 6. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL1............................................ 3
Phụ lục 7. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL1............................................ 4
Phụ lục 8. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL1 ............................................. 4
Phụ lục 9. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL1 ............................................. 5
Phụ lục 10. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL1 ............................................. 5 Phụ lục 11. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL2 ......................................... 6 Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL2 ......................................... 6 Phụ lục 13. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL2 ......................................... 7 Phụ lục 14. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL2 ........................................ 7 Phụ lục 15. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL2 ........................................ 8 Phụ lục 16. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL2 ........................................ 8
Phụ lục 17. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL2............................................ 9
Phụ lục 18. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL2............................................ 9
Phụ lục 19. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL2 ........................................... 10
Phụ lục 20. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL2 ........................................... 10
Phụ lục 21. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL2 ........................................... 11 Phụ lục 22. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL3 ....................................... 11 Phụ lục 23. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL3 ....................................... 12
Phụ lục 24. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL3 ...................................... 12 Phụ lục 25. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL3 ...................................... 13 Phụ lục 26. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL3 ...................................... 13
1
Phụ lục 27. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL3.......................................... 14
Phụ lục 28. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL3.......................................... 14
Phụ lục 29. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL3 ........................................... 15
Phụ lục 30. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL3 ........................................... 15
Phụ lục 31. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL3 ........................................... 16 Phụ lục 32. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL4 ....................................... 16 Phụ lục 33. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL4 ....................................... 17 Phụ lục 34. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL4 ...................................... 17 Phụ lục 35. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL4 ...................................... 18
Phụ lục 36. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL4.......................................... 18
Phụ lục 37. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL4.......................................... 19
Phụ lục 38. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL4 ........................................... 19
Phụ lục 39. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL4 ........................................... 20
Phụ lục 40. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL4 ........................................... 20
2
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL1
Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL1
1
Phụ lục 3. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL1
Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL1
2
Phụ lục 5. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL1
Phụ lục 6. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL1
3
Phụ lục 7. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL1
Phụ lục 8. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL1
4
Phụ lục 9. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL1
Phụ lục 10. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL1
5
Phụ lục 11. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL2
Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL2
6
Phụ lục 13. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL2
Phụ lục 14. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL2
7
Phụ lục 15. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL2
Phụ lục 16. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL2
8
Phụ lục 17. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL2
Phụ lục 18. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL2
9
Phụ lục 19. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL2
Phụ lục 20. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL2
10
Phụ lục 21. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL2
Phụ lục 22. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL3
11
Phụ lục 23. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL3
Phụ lục 24. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL3
12
Phụ lục 25. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL3
Phụ lục 26. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL3
13
Phụ lục 27. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL3
Phụ lục 28. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL3
14
Phụ lục 29. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL3
Phụ lục 30. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL3
15
Phụ lục 31. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL3
Phụ lục 32. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL4
16
Phụ lục 33. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất GL4
Phụ lục 34. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL4
17
Phụ lục 35. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất GL4
Phụ lục 36. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL4
18
Phụ lục 37. Phổ HMBC giãn của hợp chất GL4
Phụ lục 38. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL4
19
Phụ lục 39. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL4
Phụ lục 40. Phổ HSQC giãn của hợp chất GL4
20
