Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thanh Hiền

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp. CÓ HOẠT TÍNH

PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO

SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------

Nguyễn Thanh Hiền

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp. CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa học thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học của mình, trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) đã tin tưởng, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Trong thời gian học tập tại trường em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học, Phòng Sinh học Nano và ứng dụng – KLEPT, Khoa Sinh học và Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ và giúp đỡ của các anh chị, các em sinh viên và bạn bè trong phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh môi trường trong suốt thời gian em thực hiện đề tài.

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, quan tâm, động viên và góp ý cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên

Nguyễn Thanh Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................i

i

MỤC LỤC.............................................................................................................ii

DANH MỤC BẢNG..............................................................................................v

DANH MỤC HÌNH..............................................................................................vi

MỞ ĐẦU...............................................................................................................1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3

1.1. Probiotic.......................................................................................................3

1.1.1. Khái niệm probiotic.............................................................................3

1.1.2. Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp................................................3

1.2. Vai trò của vi khuẩn probiotic......................................................................4

1.2.1. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa.....................................5

1.2.2. Khả năng chống ung thư và các yếu tố đột biến...................................6

1.2.3. Tác động trên biểu mô ruột..................................................................7

1.2.4. Kích thích hệ thống miễn dịch.............................................................8

1.2.5. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose............................................................................................................8

1.2.6. Làm giảm cholesterol trong huyết thanh và hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch.................................................................................................8

1.2.7. Khả năng chống dị ứng........................................................................8

1.2.8. Phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ.......................9

1.3. Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở phụ nữ khi sử dụng thực phẩm chức năng probiotics...............................................11

1.3.1. Sinh ra H2O2.......................................................................................11

1.3.2. Sinh ra axit lactic...............................................................................11

1.3.3. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn..............................................12

1.4. Tổng quan chung về sức khỏe sinh sản của phụ nữ....................................13

1.5. Một số loại thực phẩm chức năng probiotics thương mại dùng cho con người................................................................................................................. 14

1.5.1. Một số loại thực phẩm chức năng probiotics dành riêng cho phụ nữ được thương mại trên Thế giới....................................................................14

ii

1.5.2. Một số thực phẩm chức năng probiotics thương mại trong nước hỗ trợ sức khỏe cho con người...............................................................................15

1.6. Vi khuẩn probiotic trong sữa mẹ................................................................16

1.7. Bảo quản chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus spp. bằng phương pháp đông khô...........................................................................................................17

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................18

2.1. Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm..............................................18

2.1.1. Nguyên liệu........................................................................................18

2.1.2. Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ............................................................18

2.1.3. Thiết bị...............................................................................................18

2.1.4. Dụng cụ.............................................................................................19

2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................19

2.2.1. Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Lactobacillus spp. trong mẫu sữa mẹ..................................................................................................20

2.2.2. Đánh giá một số tính chất & hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro.................................................23

2.2.3. Nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi khuẩn được tuyển chọn..........................................................................................25

2.2.4. Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá trình đông khô của các chủng được tuyển chọn...........................................26

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................29

3.1. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và kết quả tuyển chọn chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic định hướng vào sản xuất chế phẩm probiotics giành riêng cho phụ nữ.....................................................................29

3.1.1. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam.....................................29

3.1.2. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. từ sữa mẹ................................................................................................................ 30

3.1.3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn được tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ. 32

iii

3.2. Kết quả đánh giá một số tính chất, hoạt tính và điều kiện nhân giống của chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro.......................................34

3.2.1. Kết quả đánh giá một số tính chất và hoạt tính probiotic của chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro.................................................34

3.2.2. Kết quả nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi khuẩn được tuyển chọn................................................................................43

3.3. Nghiên cứu các công thức phối trộn để nâng cao tỉ lệ sống của các chủng tuyển chọn sau khi đông khô............................................................................45

3.3.1. Mật độ tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trước khi đông khô....45

3.3.2. Mật độ sống của chủng vi khuẩn tuyển chọn sau khi đông khô.........46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................................50

TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................51

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Thử nghiệm các công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic................27 với các chất bảo vệ..................................................................................................27 Bảng 2. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri trong sữa mẹ ở khu vực thành thị và khu vực nông thôn tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam..................................29 Bảng 3. Lượng axit lactic sinh ra của các chủng L. reuteri và Lactobacillus spp....30 Bảng 4. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn.........................33 Bảng 5. Số đo vòng kháng khuẩn của chủng tuyển chọn với các loại kháng sinh...40 Bảng 6. Khả năng ức chế đối với các vi khuẩn và nấm có hại................................42 Bảng 7. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. rhamnosus SMH1.................46 Bảng 8. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. reuteri SMH2.......................47

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Hình thái các sinh vật Lactobacillus và tế bào biểu mô âm đạo...................4 (ảnh nhuộm Gram) [64].............................................................................................4 Hình 2. Tương tác của các vi sinh vật trong đường ruột [35]....................................5 Hình 3. Các chủng vi khuẩn probiotic và các cơ chế chống lại các bệnh ung thư [29]............................................................................................................................ 6 Hình 4. Cơ chế hoạt động của probiotic thúc đẩy cân bằng nội môi và liên quan đến khả năng ứng dụng trong bệnh viêm ruột [102].........................................................7 Hình 5. Thiết kế thí nghiệm....................................................................................19 Hình 6. Máy đông khô vi khuẩn.............................................................................28 Hình 7. Đường cong sinh trưởng và lượng axit lactic sinh ra theo thời gian của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng.........................34 Hình 8. Khả năng chịu muối mật của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087..........................................................36 Hình 9. Khả năng chịu axit của chủng chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087..........................................................37 Hình 10. Khả năng sinh H2O2 của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087..............................................................38 Hình 11. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của chủng ĐC L. reuteri VTCC 910087 (Hình 6A), chủng L. reuteri SMH2 (Hình 6B) và L. rhamnosus SMH1 (Hình 6C)................................................................................................................40 Hình 12. Khả năng tạo màng biofilm của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng ĐC L. reuteri VTCC 910087........................................................41 Hình 13. Khả năng phát triển của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087 trong điều kiện nuôi lắc và nuôi tĩnh....43 Hình 14. Khả năng phát triển trên các mức nhiệt độ khác nhau của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 91008744

vi

MỞ ĐẦU

Viêm nhiễm phụ khoa hay viêm phụ khoa là thuật ngữ dùng để chỉ các bệnh ở nữ giới gây ra tình trạng viêm nhiễm tại cơ quan sinh dục như: âm đạo, cổ tử cung, tử cung, buồng trứng, vòi trứng, phần phụ, và các vùng xung quanh. Tỉ lệ mắc bệnh viêm nhiễm phụ khoa ở nữ giới chưa quan hệ tình dục lần nào sẽ thấp hơn vì có lớp màng trinh bảo vệ giúp ngăn chặn vi khuẩn xâm nhập vào bên trong tử cung. Đối với nữ giới đã quan hệ tình dục, đặc biệt đang trong thời kì mang thai, sinh nở thì nguy cơ mắc các bệnh viêm phụ khoa sẽ rất cao. Viêm nhiễm phụ khoa được coi là bệnh nhiễm trùng phổ biến đặc biệt ở các nước nhiệt đới trong đó có Việt Nam. Nhiều thống kê từ 2004 đến nay cho thấy, tỉ lệ viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ vẫn ở mức cao, chiếm đến 90% [1]. Nếu không điều trị hoặc điều trị không đúng cách, không đầy đủ có thể gây nên các biến chứng như vô sinh, chửa ngoài tử cung, sảy thai, ung thư cổ tử cung và các biến chứng cho thai nhi như thai chết lưu, dị tật bẩm sinh, trì độn trí tuệ... đây được coi là một vấn đề rất lớn đã và đang rất được quan tâm vì những thiệt hại do bệnh gây ra là rất lớn. Mặc dù nhiễm trùng đường sinh dục có thể có các triệu chứng khác nhau, nhưng không phải lúc nào phụ nữ cũng dễ dàng nhận ra. Trên thực tế việc chẩn đoán thậm chí còn khó khăn đối với một bác sĩ có kinh nghiệm. Các trường hợp nhiễm trùng nặng được bác sĩ chỉ định điều trị bằng kháng sinh phổ rộng với liều khá cao nên gây ra các tác dụng phụ như chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới sinh hoạt tình dục… và nếu được điều trị tái lặp sẽ dẫn tới tình trạng kháng thuốc kháng sinh, một vấn đề nổi cộm và thách thức hiện nay.

Để phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh nhiễm trùng đường sinh sản, nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc sử dụng các chế phẩm probiotics chứa các chủng lợi khuẩn Lactobacillus spp. là hiệu quả. Các sản phẩm probiotics dành cho phụ nữ hiện nay bắt đầu được sử dụng khá phổ biến dưới dạng sản phẩm chức năng hỗ trợ điều trị cho các bệnh nhân nhiễm trùng đường âm đạo và tiết niệu. Các sản phẩm thương mại này được bán nhiều nhất trên thị trường Việt Nam phần lớn là hàng nhập khẩu từ Mỹ, Anh, Nhật Bản với giá thành rất cao và hiện tại Việt Nam chưa có một dòng sản phẩm nào nghiên cứu và phát triển dành riêng cho phụ nữ. Sản phẩm nhập ngoại chưa hoàn toàn phù hợp với điều kiện thu nhập thấp của người dân Việt Nam, đặc biệt là phụ nữ ở vùng nông thôn và miền núi. Trong khi đó, hơn 80% phụ nữ Việt Nam bị mắc bệnh phụ khoa. Chính vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất một số chế phẩm probiotics từ Lactobacillus spp. phân lập ở sữa mẹ của các bà mẹ đang cho con bú tại Việt Nam có các đặc tính ưu việt về việc ức chế các vi sinh vật gây

1

viêm nhiễm phụ khoa là việc làm hết sức cần thiết, có ý nghĩa cộng đồng và ý nghĩa thực tiễn cao. Dựa trên nhu cầu và tính cấp thiết của vấn đề nêu trên nên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ”.

Hiện nay, vẫn còn rất ít tài liệu công bố liên quan đến sự xuất hiện của Lactobacilli và Lactobacillus reuteri trong sữa mẹ ở Việt Nam. Chính vì thế, nghiên cứu này được thực hiện để điều tra sự xuất hiện của nhóm vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus spp. và loài L. reuteri trong sữa mẹ, xác định mối liên hệ có thể có giữa sự có mặt của L. reuteri trong sữa mẹ của các bà mẹ ở vùng nông thôn và thành thị tại miền Bắc Việt Nam và nghiên cứu các đặc tính probiotic của chủng Lactobacillus spp. được tuyển chọn để hướng tới việc sản xuất chế phẩm probiotics dành cho phụ nữ.

Mục tiêu của đề tài:

- Xác định được tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri có trong sữa mẹ của các bà mẹ sống tại khu vực nông thôn và thành thị ở một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và tuyển chọn được 2 chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic tốt nhất. - Xác định được công thức phối trộn để nâng cao mật độ sống sót sau quá trình đông khô của các chủng được tuyển chọn.

2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Probiotic

1.1.1. Khái niệm probiotic

Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “dành cho cuộc sống” và có một số nghĩa khác nhau theo thời gian. Khái niệm này được sử dụng lần đầu tiên bởi Lilley và Stillwell vào năm 1965 để mô tả các chất được tiết ra bởi một loại vi sinh vật kích thích sự phát triển của loại vi sinh vật khác. Do vậy, khái niệm này có nghĩa ngược lại hoàn toàn với “antibiotic – kháng sinh”. Tuy nhiên, việc sử dụng khái niệm probiotic này đã không tồn tại và sau đó được Sperti sử dụng để mô tả các chất chiết xuất từ mô kích thích sự phát triển của vi sinh vật năm 1971. Mãi đến năm 1974, Parker mới sử dụng probiotic để chỉ những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ. Định nghĩa này liên quan đến việc sử dụng probiotic vào hệ vi sinh đường ruột nhưng bao gồm “các chất phụ khác” đã cho probiotic nghĩa rộng bao gồm cả các kháng sinh. Trong việc nỗ lực cải thiện định nghĩa, năm 1989 Fuller đã định nghĩa lại probiotic là một chất (có bổ sung vi sinh vật sống) ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột của sinh vật chủ. Định nghĩa sửa đổi này nhấn mạnh sự cần thiết của một probiotic [38].

Hiện nay, chế phẩm probiotics được hiểu là những chế phẩm có chứa các vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ thì có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là hệ tiêu hóa [80], [48], [82]. Trên thực tế, cơ thể con người bao gồm cả vi khuẩn có lợi và có hại. Vi khuẩn có lợi thường không gây bệnh và có thể giúp kìm hãm các vi khuẩn có hại, giúp cải thiện tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng cũng như tăng cường khả năng miễn dịch. Probiotics được coi là an toàn để tiêu thụ nhưng cũng có thể gây ra tương tác giữa vi khuẩn & sinh vật chủ và tác dụng phụ không mong muốn trong những trường hợp hiếm gặp [31], [90], [32]. Khi vi khuẩn có hại trong cơ thể lấn át được vi khuẩn có lợi, đó là lúc cần sử dụng các chế phẩm sinh học probiotics để lấy lại sự cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong cơ thể.

1.1.2. Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp.

Lactobacillus spp. thường được xem là một trong các loại probiotics phổ biến. Lactobacilli là một chi của vi khuẩn Gram dương, kị khí hoặc vi hiếu khí, hình que, không hình thành bào tử [57]. Chúng là một phần chính của nhóm vi khuẩn lactic (tức là, chúng chuyển đổi đường thành axit lactic). Môi trường sống chủ yếu

3

có chứa carbohydrate (lớp chất nhầy của người và động vật, chất thải và thực phẩm lên men hay hư hỏng). Ở người, chúng tạo thành một phần quan trọng của hệ vi sinh vật tại một số vị trí cơ thể, chẳng hạn như hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống sinh dục. Ở phụ nữ châu Âu, các loài thuộc chủng Lactobacillus spp. thường là một phần chính của hệ vi sinh vật âm đạo [53], [36].

Hình 1. Hình thái các sinh vật Lactobacillus và tế bào biểu mô âm đạo (ảnh nhuộm Gram) [64]

L. reuteri là một loài vi khuẩn Gram dương, chúng được tìm thấy ở ruột của động vật có vú, chim, sữa mẹ và dịch âm đạo ở người. Chúng là một loài probiotic đã được ứng dụng từ rất lâu và có khả năng sinh ra reuterin - một chất có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn Gram âm và Gram dương có hại cùng với nấm men, nấm và động vật nguyên sinh [126]. L. reuteri có thể giúp cơ thể chống lại nhiều bệnh nhiễm trùng thông thường, thúc đẩy sức khoẻ tổng thể ở cả trẻ em và người lớn. Với những đặc tính hữu ích vốn có của loài này, việc tuyển chọn L. reuteri trong nghiên cứu này để sản xuất thực phẩm chức năng probiotics nhất định sẽ có tiềm năng trong việc bảo vệ sức khỏe con người nói chung và cho sức khỏe sinh sản của phụ nữ nói riêng.

1.2. Vai trò của vi khuẩn probiotic

Việc duy trì ổn định hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò quan trọng trong bảo vệ sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật. Vai trò chính của vi khuẩn probiotic là giúp cho hệ VSV đường ruột khỏe mạnh, ngăn cản sự thâm nhập và phát triển VSV gây bệnh, tăng cường đề kháng tự nhiên với các bệnh truyền nhiễm của đường tiêu hóa. Vai trò này được thể hiện ở một số biểu hiện cụ thể như sau.

4

1.2.1. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa

Sự sống sót của vi khuẩn probiotic ở những phần khác nhau của đường tiêu hóa thường khác nhau giữa các loài. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ chế phẩm probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của chủng vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên thì vi khuẩn probiotic định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ này thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều này đúng cho tất cả các loại vi khuẩn probiotic [115].

Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng gồm có các axit hữu cơ gồm các axit béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate và butyrate, nhất là axit lactic, hydrogen peroxide (H2O2) và các chất diệt khuẩn có thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-). Cụ thể những hợp chất này làm giảm pH trong khoang ruột gây ảnh hưởng đến quá trình điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn đường ruột thông qua việc cản trở hoạt động tiết ra enzyme và tạo ra các độc tố của vi khuẩn gây hại đường ruột [107], [93], [70], [119].

Hình 2. Tương tác của các vi sinh vật trong đường ruột [35]

Chú thích: Các mầm bệnh và độc tố của vi sinh vật gây hại kết dính vào màng nhầy, cụ thể là thụ thể của đường ruột và phá hủy nó. Khi cơ thể được bổ sung vi khuẩn probiotic, các phản ứng miễn dịch được kích thích và hoạt động của các kháng thể ở tế bào chủ được tăng lên. Vi khuẩn probiotic cạnh tranh các chất dinh dưỡng quan trọng với mầm bệnh. Loại trừ bằng cách cạnh tranh/ ngụy trang: vi khuẩn probiotic khóa các thụ thể bên trong đường ruột làm cho mầm bệnh không bám vào được, do đó loại trừ mầm bệnh. Sự tập hợp các vi khuẩn probiotic gây cản trở sự gắn kết và tăng sinh của mầm bệnh.

Các vi khuẩn probiotic ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của các VSV gây bệnh phổ biến như Salmonella và Shigella. Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường vi khuẩn có

5

lợi và giảm số lượng những vi khuẩn gây hại mang mầm bệnh. Cuối cùng điều chỉnh thành phần phân bố của vi khuẩn đường ruột [115].

1.2.2. Khả năng chống ung thư và các yếu tố đột biến

Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu. Cơ chế này đã được nghiên cứu và kết luận như sau [29]. + Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư. + Sản xuất các hợp chất kháng ung thư: sinh ra những axit yếu có lợi cho đường ruột như axit butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương màu lành và phục hồi chức năng. + Điều hòa những enzyme như nitroreductase, ß-glucuronidase (các enzyme này có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thành chất gây ung thư trong trực tràng). + Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in-vitro và in-vivo, việc mở rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn là vấn đề đang tranh cãi.

Hình 3. Các chủng vi khuẩn probiotic và các cơ chế chống lại các bệnh ung thư

[29]

6

1.2.3. Tác động trên biểu mô ruột

Vi khuẩn probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột. Cụ thể là đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng và cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón. Vi khuẩn probiotic giúp đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô; giảm việc kích thích bài tiết & những hậu quả khi bị viêm gây ra do lây nhiễm vi khuẩn và đẩy mạnh việc tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy [102] .

Hình 4. Cơ chế hoạt động của probiotic thúc đẩy cân bằng nội môi và liên quan đến

khả năng ứng dụng trong bệnh viêm ruột [102] Vi khuẩn probiotic hỗ trợ điều hòa cân bằng nội môi của tế bào chủ. Vi khuẩn probiotic gây ra một số phản ứng có lợi cho tế bào chủ, bao gồm: ngăn chặn tác động của vi khuẩn gây bệnh bằng cách sản xuất các chất kháng khuẩn (Anti- bacterial substance) và cạnh tranh với mầm bệnh để liên kết với các tế bào biểu mô; xác định sự cân bằng giữa khả năng miễn dịch cần thiết và khả năng miễn dịch phòng vệ quá mức bằng cách tăng khả năng miễn dịch bẩm sinh (innate immunity), điều chỉnh tăng sản xuất cytokine chống viêm và ức chế sản xuất cytokine tiền

7

viêm; thúc đẩy cân bằng nội môi của tế bào biểu mô ruột bằng cách tăng tỉ lệ sống, chức năng rào cản và phản ứng bảo vệ bên trong tế bào chất (survival, barrier function and cytoprotective responses). DC, dendritic cell; IL, interleukin; M, M- cell; Hsp, heat shock protein [102].

1.2.4. Kích thích hệ thống miễn dịch

Thực phẩm chức năng probiotics có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, giúp tăng cường hàm lượng globulin. Sự hấp thụ thực phẩm chức năng probiotics đối với người ốm và trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng của cơ thể, giúp tăng cường hiệu quả của một số vắc xin như vắc xin thương hàn [113]. Những cải thiện hệ miễn dịch bởi vi khuẩn probiotic có thể được trình bày theo 3 cách sau: tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sinh vật hay hạt carbon; tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là IgM, IgA và interferon (nhân tố kháng vi rút không đặc hiệu); tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột thường là IgA [113].

1.2.5. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được

lactose

Sự không dung nạp đường lactose (có nhiều trong sữa) xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, gây đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu thực phẩm có chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng kháng đường lactose của cơ thể bằng cách cung cấp lactase cho dạ dày và đường ruột. Sử dụng các thực phẩm có chứa các chủng vi khuẩn probiotic này giúp cải thiện rõ rệt khả năng tiêu hóa đường lactose [88].

1.2.6. Làm giảm cholesterol trong huyết thanh và hạn chế các bệnh liên quan

đến tim mạch

Vi khuẩn probiotic được biết có vai trò sản xuất ra axit hữu cơ, làm giảm axit béo, có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao [73, 109]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng các vi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacterium không chỉ sinh ra các axit hữu cơ mà còn trực tiếp sử dụng lipid và các thành phần cholesterol trong máu [83].

1.2.7. Khả năng chống dị ứng

Thực phẩm chức năng probiotics góp phần chống lại một số dị ứng của cơ thể và cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể (ví dụ như axit folic, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12) [76], [75], [114].

8

1.2.8. Phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ

Việc sử dụng thực phẩm chức năng probiotics chứa các lợi khuẩn đã được phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới. Ngoài các vai trò kể trên, thực phẩm chức năng probiotics giành riêng cho phụ nữ còn góp phần phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa.

Các nghiên cứu in-vitro chỉ ra rằng một số chủng Lactobacillus spp. có thể ức chế sự gắn kết của Gardnerella vaginalis với biểu mô âm đạo và tạo ra H2O2, axit lactic và các chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây nhiễm trùng âm đạo. Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy đặt viên nén chứa L. acidophilus trong âm đạo trong 6 - 12 ngày hay uống L. acidophilus hoặc L. rhamnosus GR-1 và L. fermentum RC-14 trong 2 tháng có thể giúp chữa trị và làm giảm sự tái phát nhiễm khuẩn âm đạo đồng thời giúp gia tăng lượng Lactobacilli trong âm đạo và phục hồi một hệ vi sinh âm đạo khỏe mạnh một cách thường xuyên hơn là dùng thuốc tạm thời (axit axetic) hoặc không điều trị [34].

Mastromarino và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định hiệu quả của viên nén đặt âm đạo chứa Lactobacillus trong điều trị nhiễm khuẩn âm đạo và trong việc khôi phục hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh. 39 phụ nữ đã được ghi tên vào một thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả tác động của viên nén Lactobacillus lên vi sinh vật âm đạo và so sánh với nhóm sử dụng giả dược. Sản phẩm được chỉ định dùng liên tục trong 7 ngày. Các chỉ số lâm sàng, điểm số Gram âm đạo và các triệu chứng đã được so sánh với những người ở lần khám đầu tiên, những người đã hoàn thành điều trị và 2 tuần sau đó. Sau khi hoàn thành điều trị, tất cả bệnh nhân trong nhóm sử dụng Lactobacillus (n = 18) không còn nhiễm khuẩn âm đạo, cho thấy hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh (83%) hoặc ở ngưỡng trung gian (17%). Ngược lại, chỉ có 2 bệnh nhân không còn nhiễm khuẩn âm đạo, hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh (12%) trong số 16 phụ nữ được điều trị bằng giả dược (p < 0,001). Hai tuần sau khi hoàn thành điều trị, việc điều trị đã thành công với 61% số bệnh nhân được điều trị bằng Lactobacillus so với 19% số bệnh nhân điều trị thành công được điều trị bằng giả dược (p < 0,05). Trong nhóm điều trị, tổng số bệnh nhân có triệu chứng và cường độ của các triệu chứng nhiễm khuẩn âm đạo đặc biệt là viêm âm đạo đã giảm đáng kể ở cả hai lần theo dõi tiếp theo. Các dữ liệu cho thấy bổ sung các chủng Lactobacillus ngoại sinh được lựa chọn là có thể khôi phục lại hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh và được sử dụng trong điều trị viêm nhiễm âm đạo phụ khoa [60].

Chế phẩm probiotics chứa các loài L. rhamnosus và L. reuteri còn được bác sĩ chỉ định hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn âm đạo khi kê đơn dưới dạng thực phẩm chức năng sử dụng qua đường uống cùng với kháng sinh metronidazole

9

(thuốc thuộc về nhóm kháng sinh nitroimidazole, hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn và động vật nguyên sinh. Kháng sinh này rất có hiệu quả khi xử lý với nhiễm khuẩn và protozoa ở đường âm đạo). Kết quả cho thấy số lượng Lactobacillus được phát hiện nhiều hơn đáng kể ở các bệnh nhân được điều trị bằng metronidazole kết hợp với probiotic so với các bệnh nhân chỉ được điều trị với metronidazole trong 5 ngày [105].

Theo các nghiên cứu về vi khuẩn âm đạo ở phụ nữ thì các loài Lactobacillus chiếm đa số trong các vi sinh vật có lợi ở âm đạo những phụ nữ khỏe mạnh. Các loài G. vaginalis, Prevotella, Atopobium, Sneathia và Megasphaera thường được gặp ở những phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo và được điều trị bằng tinidazole (Tinidazole là một thuốc kháng sinh nhóm nitroimidazole. Thuốc hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn và sinh vật đơn bào). Khi kết hợp điều trị kháng sinh này kèm với chế phẩm probiotics có chứa 2 chủng L. reuteri RC-14 và L. rhamnosus GR-1 sử dụng qua đường uống, số lượng L. iners hoặc L. crispatus gia tăng mạnh ở âm đạo phụ nữ cùng với khả năng phục hồi cân bằng nội mô dẫn đến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics và kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn âm đạo đem lại hiệu quả cao. Điều đó chứng tỏ khả năng khôi phục cân bằng nội môi có liên quan đến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics với điều trị kháng sinh trong việc nhiễm khuẩn âm đạo [55].

Trong một nghiên cứu khác về “Tác động của chế phẩm Probiotic SYNBIO đặt âm đạo trong việc thúc đẩy sức khỏe âm đạo của phụ nữ” đã cho thấy việc sử dụng chế phẩm probiotics Lactobacillus dạng viên nang đặt âm đạo làm gia tăng các vi khuẩn có lợi, giúp chúng chiếm và tồn tại trong âm đạo. Việc sử dụng chế phẩm sinh học probiotics dạng thuốc đặt âm đạo đã được thực hiện trên 35 phụ nữ khỏe mạnh trong nghiên cứu của Maria cùng cộng sự. Mỗi phụ nữ được kiểm tra ba lần trong quá trình nghiên cứu. Người tình nguyện được hướng dẫn nhận và sử dụng thuốc đặt SYNBIO (L. rhamnosus IMC 501 và L. paracasei IMC 502) mỗi ngày và duy trì trong 7 ngày. Các miếng gạc âm đạo được thu thập 3 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày sau khi sử dụng SYNBIO để xác định số lượng lactobacilli có mặt, giá trị pH và chẩn đoán viêm nhiễm phụ khoa dựa vào thang điểm Nugent phụ thuộc hình thái vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram (quan sát trên 10 hiển vi trường) và chẩn đoán xác định viêm nhiễm phụ khoa khi đạt từ 7 đến 10 điểm [69]. Khi đánh giá khả năng dung nạp trong điều trị được dựa trên phân tích các loại và sự xuất hiện của các tác dụng bất lợi, kết quả cho thấy thuốc đặt âm đạo probiotic được dung nạp tốt và không có tác dụng phụ nào đã được báo cáo. Điểm số Nugent ở ngưỡng trung gian đã được ghi chép lại ở 40% phụ nữ tại lần khám thứ nhất và các điểm ở

10

ngưỡng trung gian này trở lại bình thường vào ngày thứ 7 (kết thúc điều trị) ở 20% phụ nữ tham gia. SYNBIO đã góp phần làm tăng đáng kể lượng Lactobacilli tại lần khám thứ 2. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã cho thấy sự hiện diện của hai chủng có nguồn gốc từ SYNBIO ở 100% phụ nữ khám lần 2 và 34% khi đến thăm khám lần 3. Không có thay đổi đáng kể nào được ghi nhận về độ pH giữa các lần thăm khám. Sản phẩm SYNBIO an toàn cho việc sử dụng hàng ngày ở phụ nữ khỏe mạnh và có thể sẽ rất hữu ích để khôi phục và duy trì một hệ vi khuẩn âm đạo khỏe mạnh [103].

1.3. Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở phụ

nữ khi sử dụng thực phẩm chức năng probiotics

1.3.1. Sinh ra H2O2

H2O2 là một chất oxy hóa mạnh. Các nghiên cứu đã cho thấy chất này cũng - hay OH- có khả năng gây tổn thương cao khi tham gia vào phản ứng giống như O2 Fenton. Chúng gây tổn thương cấu trúc và chức năng các đại phân tử trong tế bào như protein, ADN, lipid…dẫn đến gây chết mạnh các vi khuẩn [86]. Một số chủng Lactobacillus được tìm thấy có tác dụng ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh ở âm đạo trong ống nghiệm bằng cách sản xuất tạo ra H2O2. Mastromarino và nhóm cộng sự đã nghiên cứu L. salivarius FV2 và L. gasseri 335 được phân lập từ âm đạo của người và phát hiện thấy chúng có thể sản xuất ra một lượng lớn H 2O2 cũng như ức chế sự tăng trưởng của G. vaginalis [60]. McLean và Rosenstein đã chứng minh L. acidophilus 48101 được phân lập từ âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh đã sản xuất lượng lớn H2O2 và ức chế sự tăng trưởng của Bacteroides spp., Prevotella bivia và G. vaginalis được lập từ gạc âm đạo của phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo [62]. Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu chứng minh Lactobacilli sản xuất H2O2 bảo vệ cho đường sinh dục nữ khỏi nhiễm trùng và quan điểm cho rằng H2O2 là yếu tố kháng khuẩn chính được sản xuất bởi Lactobacillus vẫn là phổ biến nhất nhưng một nghiên cứu in-vitro khác lại chứng minh rằng H2O2 được tạo ra do Lactobacillus không phải là nguyên nhân chính gây ức chế các tác nhân gây bệnh. Các Lactobacillus này sản xuất H2O2 có thể làm tăng khả năng hoạt động của các chuỗi peptide kháng khuẩn của vật chủ (muramidase và lactoferrin) cũng như hoạt tính kháng khuẩn của các tế bào biểu mô [11].

1.3.2. Sinh ra axit lactic

Không giống với H2O2, tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường âm đạo của axit lactic được chứng minh rõ ràng. Axit lactic ở nồng độ sinh lý (ví dụ: 110 mM) thậm chí ở pH 4,5 làm giảm 106 lần khả năng tồn tại của 17 loại vi khuẩn

11

khác nhau gây viêm nhiễm âm trong khi đó lại không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của bốn loài Lactobacillus spp. âm đạo trong nghiên cứu in-vitro. Đáng chú ý là hoạt tính kháng khuẩn của axit lactic có cường độ lớn hơn các chất được axit hóa đến pH 4,5 như axit chlohydric hoặc axit axetic [70]. Ngoài ra, ở gần điều kiện ex- vivo, axit lactic sử dụng đơn lẻ không kết hợp với bacteriocin vẫn có hiệu quả kháng vi khuẩn gây viêm nhiễm ở đường sinh dục nữ [30]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng axit lactic có tác dụng chính trong chống lại các bệnh do vi khuẩn gây ra bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục (Sexually Transmitted Infections- STIs) chứ không phải là H2O2. Axit lactic sinh ra bởi L. crispatus và L. gasseri đã làm bất hoạt Chlamydia trachomatis [67] và Neisseria gonorrhoeae [45]. Axit lactic sản xuất bởi L. crispatus đã được chứng minh có tác dụng ức chế N. gonorrhoeae và G. vaginalis trong mô hình niêm mạc âm đạo ở lợn [20]. Tóm lại, những nghiên cứu in-vitro và ex-vivo đều cho thấy rằng axit lactic được sản sinh ở các chủng probiotic thuộc chi Lactobaciilus có khả năng duy trì hệ vi sinh vật âm đạo và bảo vệ vi khuẩn chống lại bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục.

1.3.3. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn

Bacteriocin có bản chất là protein hoặc các chuỗi peptide được sản xuất bởi vi khuẩn để ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn tương đồng hoặc các chủng vi khuẩn có liên quan chặt chẽ với chủng đó. Chúng tương tự như các yếu tố diệt nấm men và paramecium, chúng đa dạng về cấu trúc, chức năng và về sinh thái học. Các ứng dụng của bacteriocin đang được thử nghiệm để đánh giá ứng dụng của chúng như các kháng sinh phổ hẹp [28].

Bacteriocin lần đầu tiên được André Gratia phát hiện năm 1925, cho đến nay có hàng ngàn loại bacteriocin đã được nghiên cứu. Ông đã tham gia vào quá trình tìm kiếm các cách để tiêu diệt vi khuẩn, điều này cũng dẫn đến sự phát triển của kháng sinh và phát hiện ra bacteriophage, tất cả chỉ trong một vài năm. Ông ấy đã gọi chất kháng khuẩn phát hiện đầu tiên của mình là colicine vì chất này có khả năng giết chết E. coli [44].

Việc sản xuất các chất kháng khuẩn bởi một số Lactobacillus cũng đã được tìm thấy với vai trò ức chế tăng trưởng của G. vaginalis, ít nhất là trong ống nghiệm. Aroutcheva cùng các cộng sự đã kiểm tra 22 chủng Lactobacillus và nhận thấy rằng 80% số chủng sản xuất một loại độc tố ức chế sự phát triển của G. vaginalis [15]. Trong một nghiên cứu khác, Simoes và cộng sự đã phát hiện thấy sự tăng trưởng của 28 trường hợp (78%) trong số 36 trường hợp lâm sàng nhiễm G. vaginalis bị ức chế bởi vi khuẩn L. acidophilus do các chủng này nhạy cảm với bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn này [89].

12

1.4. Tổng quan chung về sức khỏe sinh sản của phụ nữ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), sức khỏe sinh sản (SKSS) là trạng thái khỏe mạnh về thể chất, về tinh thần và hòa hợp xã hội về tất cả các phương diện liên quan đến quá trình sinh sản trong suốt cuộc đời. Chăm sóc SKSS là tập hợp các phương pháp, kỹ thuật và dịch vụ nhằm giúp cho con người có tình trạng SKSS khỏe mạnh thông qua việc phòng chống và giải quyết những vấn đề liên quan đến SKSS. Điều này cũng bao gồm cả sức khỏe tình dục với mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống và mối quan hệ giữa con người với con người mà không chỉ dừng lại ở chăm sóc y tế và tư vấn một cách đơn thuần cho việc sinh sản cùng các nhiễm trùng đường sinh dục. Các nghiên cứu về SKSS được tiến hành rất sớm trên thế giới, chủ yếu là các nước phát triển như Mỹ và các nước châu Âu.

Hiện nay, tỉ lệ phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ mắc viêm nhiễm phụ khoa là rất cao (trên 80%) [1], đây được coi là một vấn đề lớn đã và đang rất được quan tâm vì những thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra là rất lớn bao gồm những gánh nặng về y tế cũng như các vấn đề về gia đình và xã hội. Nếu bệnh không được điều trị kịp thời hoặc điều trị không đúng, không đầy đủ có thể gây ra những biến chứng như: vô sinh, mang thai ngoài tử cung, sảy thai, ung thư cổ tử cung, các biến chứng cho thai nhi như thai chết lưu, dị tật bẩm sinh, trì độn trí tuệ. Viêm nhiễm phụ khoa là bệnh lý nhiễm trùng đường sinh sản ở phụ nữ gây ra chủ yếu bởi G. vaginalis, Mycoplasma hominis và một số vi khuẩn kị khí. Bệnh gây ra do nhóm vi khuẩn có lợi ở âm đạo Lactobacillus spp. bị thay thế dẫn đến tình trạng phát triển quá mức của vi khuẩn kị khí có hại. Trên thế giới và ở Việt Nam, viêm nhiễm phụ khoa là bệnh lý nhiễm trùng phổ biến ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản. Viêm nhiễm phụ khoa gặp ở tất cả các chủng tộc người, tỉ lệ mắc bệnh cao chiếm 40% đến 80% tùy theo vùng miền [10], [4], [2].

Ở Hoa Kỳ, theo khảo sát của Bộ Y tế Quốc gia thì tỉ lệ mắc viêm nhiễm phụ khoa chiếm 29% ở phụ nữ từ 14 đến 49 tuổi và 50% ở người Mỹ gốc Phi [13]. Nghiên cứu của Gavin và cộng sự về sức khỏe sinh sản và tình dục từ 2002 đến 2007 cho thấy riêng năm 2006, có khoảng 1 triệu người ở tuổi vị thành niên và thanh niên tuổi từ 10 đến 24 tuổi ở 33 bang đã bị lậu do nhiễm Chlamydia hoặc xoắn khuẩn giang mai [40]. Ở các quốc gia đang phát triển, có nhiều nghiên cứu đã được báo cáo với tỉ lệ mắc viêm nhiễm phụ khoa cũng rất cao. Theo Aggarwal và cộng sự nghiên cứu trên 2325 phụ nữ có chồng trong độ tuổi sinh đẻ tại vùng nông thôn Harryana, Ấn Độ có tới 61% có ít nhất một triệu chứng của viêm nhiễm phụ khoa trong đó viêm âm đạo là 32%, viêm cổ tử cung là 21%, bệnh lý viêm khung

13

chậu là 19%, xét nghiệm dịch âm đạo có 48% viêm âm đạo do vi khuẩn, 9% do trùng roi âm đạo và 0,8% do nấm Candida albicans [12].

Nghiên cứu của Bùi Thị Thu Hà ở 380 phụ nữ từ 18 đến 49 tuổi ở nội thành Hà Nội (2005) cũng cho kết quả tỉ lệ mắc viêm nhiễm phụ khoa rất cao lên tới 62,1%, trong đó viêm âm đạo do vi khuẩn chiếm chủ yếu với tỉ lệ 50,0%, do C. trachomatis là 45,8%, do nấm C. albicans là 31,8% và thấp nhất do T. vaginalis là 3,8% [3].

Tác giả Lê Hoài Chương (2011) khảo sát 960 phụ nữ 18 - 49 tuổi đến khám tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2011 và phát hiện thấy có 83,1% phụ nữ có ít nhất một hình thái tổn thương đường sinh dục dưới, trong đó viêm âm đạo chiếm tỉ lệ cao nhất (66,6%), viêm âm đạo kết hợp viêm CTC chiếm 33,8%, tỉ lệ nhiễm nấm chiếm 35,3%, nhiễm Gardnerella chiếm 15,9% [7].

Nghiên cứu của Nông Thị Thu Trang (2015) tại Thái Nguyên cho thấy, tỉ lệ viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ nông thôn là 35,4%; căn nguyên hàng đầu là do vi khuẩn (43,3%), tiếp theo là do nấm Candida (28,0%) [9].

Mặc dù viêm nhiễm phụ khoa có thể có các triệu chứng khác nhau, nhưng không phải lúc nào phụ nữ cũng dễ dàng nhận ra. Trên thực tế, việc chẩn đoán thậm chí còn khó khăn đối với một bác sĩ có kinh nghiệm. Các trường hợp nhiễm trùng nặng được bác sĩ chỉ định điều trị bằng kháng sinh phổ rộng với liều khá cao nên gây ra các tác dụng phụ như chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới sức khoẻ và sinh hoạt tình dục và nếu được điều trị tái lặp sẽ dẫn tới tình trạng kháng thuốc kháng sinh, một vấn đề nổi cộm và thách thức hiện nay. Ngoài ra, việc lạm dụng kháng sinh cũng dẫn tới mất cân bằng hệ vi sinh có lợi ở âm đạo, dẫn tới khả năng tái nhiễm cao hơn người bình thường. Do đó, việc sử dụng chế phẩm probiotics như một liệu pháp thay thế kháng sinh trong việc phòng và điều trị các bệnh phụ khoa là một lựa chọn lý tưởng.

1.5. Một số loại thực phẩm chức năng probiotics thương mại dùng cho con

người

1.5.1. Một số loại thực phẩm chức năng probiotics dành riêng cho phụ nữ được

thương mại trên Thế giới

Sản phẩm Optibac probiotics for women của Anh, giúp điều trị viêm nhiễm phụ khoa, đặc biệt là viêm âm đạo và đường tiết niệu ở phụ nữ có chứa tới 2,3 tỷ vi khuẩn, gồm 2 chủng L. rhamnosus GR-1® và L. reuteri RC-14. Hai chủng vi khuẩn đặc hiệu này đã được thử nghiệm lâm sàng với hơn 2500 phụ nữ trên khắp thế giới và cho kết quả tích cực. Điều đặc biệt, hai chủng vi khuẩn đặc hiệu L. rhamnosus

14

GR-1® và L. reuteri RC-14 sống sót đến tận vùng kín phụ nữ, hạn chế khả năng gây ra vi khuẩn gây bệnh nấm men giúp ngăn ngừa và điều trị những vấn đề viêm âm đạo và viêm tiết niệu. Sản phẩm này được nhập nhiều nhất về Việt Nam so với các sản phẩm probiotics khác dành cho phụ nữ với giá thành khoảng 400.000 đồng/hộp/30 viên.

Sản phẩm ReNew Life Ultimate Flora Vaginal Support Probiotic của Mỹ, với giá thành $57,79/hộp/60 viên. Sản phẩm có tác dụng hỗ trợ sức khoẻ âm đạo, đường tiêu hoá, chứa hàng tỷ vi khuẩn trong 1 viên, gồm 10 loại vi khuẩn hữu ích.

Sản phẩm Fem-Dophilus® của Mỹ chứa hơn 1 tỷ vi khuẩn gồm 2 chủng L. rhamnosus GR-1® và L. reuteri RC-14®, 60 viên với giá thành $83,91, hỗ trợ sức khoẻ âm đạo, đường tiết niệu cho phụ nữ.

Sản phẩm Jarro-Dophilus probiotics for women của Mỹ có giá thành $30,9/hộp/60 viên dạng uống. Sản phẩm chứa 5 tỷ vi khuẩn gồm 4 loài Lactobacilli thường có mặt trong âm đạo phụ nữ: L. crispatus LbV88, L. gasseri LbV150, L. jensenii LbV116, L. rhamnosus LbV96.

Nhìn chung các sản phẩm kể trên đều có tác dụng duy trì khu hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh ở phụ nữ, giúp giảm bớt sự kết dính của vi khuẩn vào đường tiết niệu, giúp giảm tần suất viêm bàng quang tái phát và hỗ trợ hệ thống miễn dịch khỏe mạnh. Đây hoàn toàn là các sản phẩm nhập ngoại về Việt Nam với giá thành tương đối cao, chưa hoàn toàn phù hợp với điều kiện thu nhập thấp của người dân Việt Nam, đặc biệt là phụ nữ ở vùng nông thôn và miền núi.

1.5.2. Một số thực phẩm chức năng probiotics thương mại trong nước hỗ trợ

sức khỏe cho con người

Trên thị trường hiê ên đang có hàng nghìn sản phẩm probiotics dùng cho con người để tăng cường tiêu hoá và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan tới tiêu hoá, tăng cường miễn dịch... Có thể kể đến một số sản phẩm probiotics trong nước dùng cho con người được thị trường quan tâm hiện nay như sau: - Sản phẩm trong nước phải kể đến đầu tiên là BioLactoMen, Biolactovin do PGS.TS Đinh Duy Kháng và cô êng sự tại Viện Công nghệ Sinh học nghiên cứu và chế tạo ở dạng dạng đông khô từ chủng vi khuẩn lactic dược dụng L. acidophilus 108 CFU/g, với giá 55.000 vnđ/hộp/10 lọ, ngày uống 2 lọ để điều trị các bệnh rối loạn tiêu hóa, loạn khuẩn do sử dụng kháng sinh, ngộ độc thực phẩm, viêm đại tràng, táo bón… - Bio-acimin Gold do công ty dược phẩm Việt Đức sản xuất giúp bổ sung gồm nhiều chủng lợi khuẩn có lợi như L. acidophilus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis. Ngoài ra, sản phẩm còn cung cấp chất xơ và 21 loại axit amin thiết yếu

15

được chiết xuất từ men bia có tác dụng cải thiện tình trạng biếng ăn ở trẻ sau khoảng 2 tuần sử dụng, làm giảm các triệu chứng của bệnh rối loạn tiêu hóa do sử dụng thuốc kháng sinh kéo dài hoặc do ăn phải thức ăn kém vệ sinh, được bán với giá là 180.000 vnđ/hộp/30 gói. - Spobio CL, Spobio Guard, Bespo SpoCure SOS BABY, Spobio Chemo… do công ty ANABIO R&D sản xuất giúp bổ sung gồm nhiều chủng lợi khuẩn có lợi như B. subtilis, B. clausii, B. coagulans…ở cả dạng bô êt, dạng viên nang và dạng hỗn dịch. Ngoài ra, sản phẩm còn cung cấp các chất xơ hòa tan oligosaccharide (Bespo SpoCure SOS BABY) để phòng ngừa rối loạn tiêu hoá, hỗ trợ điều trị viêm đại tràng, tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng, tăng cân... Sản phẩm gồm các bào tử bền nhiệt nên khả năng sống sót được duy trì ổn định, chất lượng không thay đổi theo thời gian bảo quản. Công ty cũng đang hướng đến phát triển sản phẩm probiotic phục vụ sức khoẻ sinh sản cho phụ nữ dựa trên chủng B. coagulans, tuy nhiên sản phẩm mới ở giai đoạn nghiên cứu phát triển và không phải là các chủng đặc thù được phân lập và tuyển chọn ở phụ nữ khoẻ mạnh tại Việt Nam nên chưa được thương mại hoá rộng rãi.

Như vậy có thể thấy rằng, mặc dù hiện nay đã có khá nhiều chế phẩm probiotics ở Việt Nam nhưng chưa có chế phẩm nào phát triển để phục vụ riêng cho việc chăm sóc sức khoẻ sinh sản của phụ nữ. Ý tưởng sản xuất sản phẩm probiotic để hỗ trợ điều trị bệnh phụ khoa cho phụ nữ Việt Nam là hoàn toàn mới, sáng tạo và có ý nghĩa ứng dụng cao.

1.6. Vi khuẩn probiotic trong sữa mẹ

Sữa mẹ được coi là có tầm quan trọng hàng đầu đối với sức khỏe, sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ [79]. Bên cạnh những giá trị dinh dưỡng của nó, sữa mẹ cũng chứa một số yếu tố hoạt tính sinh học giúp tăng cường khả năng phòng tránh của trẻ sơ sinh [79], [25] và bảo vệ nó chống lại các mầm bệnh xâm nhập [41], [47]. Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng các thành phần của những vi khuẩn có hoạt tính sinh học tiềm năng xuất hiện trong sữa mẹ cũng có thể liên quan đến sự phát triển của các mô niêm mạc đường tiêu hóa ở trẻ sơ sinh và việc thu nhận một hệ vi khuẩn đường ruột khỏe mạnh [25], [54]. Các loài vi khuẩn thường được tìm thấy ở sữa của các bà mẹ người khỏe mạnh thuộc các chi Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Micrococcus, Enterococcus và Bifidobacterium [47], [54], [59]. Một số chi này bắt nguồn từ bề mặt của núm vú & vùng da xung quanh và có thể thích nghi với sự sống sót trong các ống dẫn sữa ở vú [79], [54].

16

Lactobacilli chiếm một phần quan trọng của hệ vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh ở con người và được cho là có liên quan đến việc kiểm soát và duy trì hệ vi sinh vật này [81]. L. reuteri là một vi sinh vật bản địa của đường tiêu hóa ở người và động vật [81], [22]. L. reuteri đã được chứng minh là có đặc tính probiotic [81], [22], [99], [85], [87], [111] và trước đây đã được tìm thấy trong sữa của phụ nữ Phần Lan [22]. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy việc xâm chiếm Lactobacilli sớm có thể bảo vệ trẻ khỏi bị dị ứng [50], từ đó cho thấy vai trò trong việc cung cấp Lactobacilli tự nhiên trong sữa mẹ là yếu tố có lợi cho trẻ nhỏ trong thời gian bú mẹ.

Bên cạnh đó, cách tiếp cận nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có lợi ở sữa mẹ của các bà mẹ cho con bú ở miền Bắc Việt Nam, do đó chủng sử dụng làm thực phẩm chức năng probiotics sẽ thân thiện và dễ cư trú hơn so với với các chủng có nguồn gốc khác. Đây chính là tính mới, tính độc đáo của nghiên cứu.

1.7. Bảo quản chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus spp. bằng phương pháp

đông khô Lactobacillus là một chi vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí, hình que và không hình thành bào tử [56]. Chính vì đặc điểm không hình thành bào tử nên chúng ta không thể bảo quản Lactobacillus bằng phương pháp sấy khô vì chúng rất dễ chết dưới nhiệt độ cao. Do vậy, tại Việt Nam các sản phẩm probiotics nghiên cứu cho phụ nữ hầu hết đều chuyển sang chi Bacillus vì đặc điểm của chi này là có hình thành bào tử và chúng không bị chết sau quá trình sấy khô [98]. Đây cũng là một trong các lý do khiến chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số vi rút và được chúng tôi sử dụng để bảo quản chế phẩm probiotics có chứa Lactobacillus spp. [6].

17

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.1.1. Nguyên liệu

60 mẫu sữa mẹ được thu thập từ các bà mẹ sống ở cả nông thôn (30 mẫu) và

thành thị (30 mẫu) tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam.

Các chủng vi sinh vật kiểm định: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, C. albicans JCM 2070 (Được lưu giữ ở 4oC tại Green Lab - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống).

Chủng vi sinh vật đối chứng: L. reuteri VTCC 910087 (Được lưu giữ ở 4oC

tại Green Lab - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống).

Các hóa chất khác như thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kit tinh sạch DNA và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này được sản xuất từ các hãng có uy tín về sinh học phân tử như Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Mỹ), Thermo Scientific (Mỹ), Anabio R&D (Việt Nam), ...

2.1.2. Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ

Các mẫu sữa cho nghiên cứu được thu thập từ những bà mẹ cho con bú khỏe mạnh không sử dụng kháng sinh trong vòng 2 tuần trước đó. Các bà mẹ tình nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu này được kí vào bản thỏa thuận (Consent form – Phụ lục 1) và được yêu cầu tránh ăn uống bất kỳ thực phẩm nào bổ sung thêm vi khuẩn axit lactic trong 2 tuần trước khi thu thập mẫu sữa. Thu thập mẫu sữa từ những bà mẹ trong độ tuổi từ 16 đến 30 và các mẫu sữa được thu thập sau khoảng 0 - 6 ngày tính cả thời vận chuyển. Các bà mẹ được yêu cầu không cho con bú trong vòng 1 đến 2 giờ trước khi lấy mẫu sữa và lấy mẫu vào buổi sáng. Mẫu sữa được thu thập và được làm sạch bề mặt vú & núm vú mà không cần sát trùng trước khi lấy mẫu. Trong mỗi trường hợp, sữa mẹ được thu thập vô trùng bằng máy hút sữa, 10 - 15 mL sữa đầu tiên được thu thập và chuyển vào ống falcon vô trùng. Các mẫu sữa mẹ sau đó được đông lạnh ngay lập tức và được lưu trữ ở -20oC trong tối đa 1 tháng. Các mẫu được đóng gói với đá khô trong hộp cách nhiệt và được gửi đến phòng thí nghiệm của chúng tôi nếu ở xa. Mẫu sữa đông lạnh được rã đông qua đêm trong tủ lạnh và sau đó duy trì ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi được pha loãng và cấy trải [91].

2.1.3. Thiết bị - Máy lắc ổn nhiệt (Model: WSB – 30; Serial No: 0398272117PO10; Hàn Quốc); - Bình khí N2 và dây dẫn khí (Model: Tornado LS/B – He; Việt Nam);

18

- Cân điện tử (Model: precisa 310M, Thụy Sĩ); - Box cấy kị khí (Model: Whitley VA 500 workstation, Anh); - Máy PCR (Mastercycler, Eppendorf, Đức); - Hệ thống điện di gel agarose (NixTechnik, Pháp); - Kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật); - Máy đo OD (Model: Biomate 3; Serial No: 2KBK 138001; Mỹ); - Máy đông khô (Modulyod Freeze Dryer, Thermo electron corporation); - Tủ ấm 37oC.

2.1.4. Dụng cụ

Pipet, đầu côn, đĩa Petri, ống falcol, ống eppendorf, bình tam giác, ống đong,

ống nghiệm, bình lên men,…

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Hình 5. Thiết kế thí nghiệm

19

2.2.1. Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Lactobacillus spp. trong

mẫu sữa mẹ

2.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. trong mẫu sữa mẹ

Xác định tổng số Lactobacilli (CFU/mL) xuất hiện trong mỗi mẫu sữa theo phương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): mỗi mẫu sữa được pha loãng 10 lần trong dung dịch NaCl 0,15 M. Sau đó cấy trải 100 µL mẫu từ mỗi nồng độ pha loãng lên trên đĩa thạch MRS và đĩa thạch LBS. Các đĩa thạch này sau đó được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37oC dưới điều kiện kị khí [91]. Thành phần môi trường MRS và LBS được liệt kê dưới đây: - Môi trường thạch MRS

Thành phần

Khối lượng hoặc thể tích

Đường

20 g/L

Pepton

10 g/L

Cao nấm men

5 g/L

Cao thịt

5 g/L

2 g/L

K2HPO4.3H3O

Tween 80

1 mL/L

0,2 g/L

MgSO4.7H2O

0,05 g/L

MnSO4

5 g/L

CH3COONa

10 g/L

CaCO3

Agar

15 g/L

1 lít

H2O

- Môi trường MRS lỏng không có CaCO3 và agar. Chuẩn pH 6,2 – 6,5. Khử trùng ướt môi trường 110oC trong 20 phút. - Môi trường LBS

Thành phần

Khối lượng/Thể tích (gam/lít)

Casein enzymic hydrolysate

10,0

Yeast extract

5,0

Dextrose

20,0

Thành phần

Khối lượng/Thể tích (gam/lít)

20

Sodium acetate

25,0

Monopotassium hydrogen phosphate

6,0

Ammonium citrate

2,0

Polysorbate 80

1,0

Magnesium sulphate

0,575

Manganese sulphate

0,12

Ferrous sulphate

0,034

Agar

15,0

Chuẩn pH 5.5 ± 0.2 (ở 25 oC). Khử trùng ướt môi trường 121oC trong 15 phút.

Làm giàu môi trường để tăng sinh L. reuteri trong các mẫu sữa mẹ theo phương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): Cứ 1 mL sữa mẹ đã voltex đều được thêm vào 10 mL môi trường (bao gồm 20 mM arabinose; 20 mM ribose; 1 mM MgSO4; 0,1 mM MnSO4; 5 mM FeSO4). Hỗn hợp làm giàu được ủ ở 37oC trong 6 đến 8 giờ. Các mẫu sữa mẹ sau khi làm giàu được cấy trải trên môi trường thạch MRS cải tiến chứa 0,05 mg/mL vancomycin để xác định sự có mặt của L. reuteri. Các đĩa thạch được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37oC trong điều kiện kị khí [91]. Các khuẩn lạc L. reuteri được xác định và đếm bằng cách sử dụng phương pháp của Chung và đồng tác giả (1989) dựa trên việc sản xuất reuterin đặc trưng của L. reuteri từ glycerol trong điều kiện kị khí tại 37oC và pH 6-8 [24].

Các chủng Lactobacillus spp. sau phân lập được thử hoạt tính sơ bộ về khả năng sinh axit lactic và sau đó tuyển chọn ra các chủng có khả năng sinh axit lactic cao nhất để nghiên cứu sâu hơn, định danh bằng phân tích PCR và đặt tên chủng tuyển chọn.

2.2.1.2. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử

Khuẩn lạc riêng rẽ của các chủng được tuyển chọn được sử dụng để tách

chiết ADN bằng Kit Anapure Bacterial DNA mini kit theo các bước sau:

- Thêm 150 L dịch chứa mẫu vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 mL vô trùng sau đó thêm vào 20 µL Proteinase K.

- Thêm 250 L Binding Buffer. Trộn đều bằng cách pipet lên xuống 10 lần hoặc vortex 10-15 giây. Ủ mẫu ở 70oC trong 15 phút. - Thêm 150 L Ethanol 96o. Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần. - Chuyển mẫu ở bước 3 sang cột lọc SC01 (ANAPURE filter spin column) đặt trên ống thu dịch CT01 (ANAPURE collection tube).

21

- Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12 000 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột.

- Thêm 500 L Washing Buffer 1 vào cột lọc SC01. Lặp lại bước 5.

- Thêm 500 L Washing Buffer 2 vào cột lọc SC01. Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 2 phút. Chú ý cần loại bỏ hoàn toàn WB2 vì WB2 ảnh hưởng tới việc chiết đẩy ADN. - Nhấc cột lọc SC01 chuyển sang ống thu mẫu eppendorf 1,5 mL vô trùng mới.

- Thêm 50-200 L Elution Buffer vào trung tâm của cột lọc SC01. Ly tâm cột lọc ống eppendorf ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 1 phút. - Thu dịch chảy qua cột chứa ADN trong ống eppendorf. Bảo quản sản phẩm ADN tinh sạch ở -20oC hoặc sử dụng ngay cho ứng dụng mong muốn. ADN tinh sạch được phân tích kích thước và độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% (100V - 30 phút), nhuộm bởi EtBr và được quan sát dưới ánh sáng UV. ADN sau tinh sạch được dùng làm khuôn của PCR khuếch đại đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu 27F: 5’- AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ và 1527R: 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC- 3’ và chu trình nhiệt 95°C/10 phút - 30 chu kỳ 94°C/30 giây + 60°C/30 giây + 72°C/1 phút 30 giây - 72°C/5 phút - 4°C/∞. Thành phần của mỗi phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA được liệt kê dưới đây:

Thể tích cho mỗi phản ứng (µL)

Thành phần

Nước cất

15,75

dNTP mix

2,5

10x Buffer

2,5

Forward primer (27F – 10 pmol)

1,0

Reverse primer (1527R – 10 pmol)

1,0

Enzyme mix (Taq polymerase)

0,25

ADN

2,0

Tổng thể tích

25

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm EtBr và được quan sát dưới ánh sáng UV để kiểm tra kết quả. Sản phẩm PCR dương tính được tinh sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất sử dụng Anapure PCR purification mini kit (ANABIO R&D). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và quan sát dưới ánh sáng UV. Băng có kích thước khoảng 1500 base pair được gửi đi 1st BASE DNA Sequencing Services để giải trình tự ADN. Các trình tự ADN sau đó được phân tích bằng phần mềm Geneious Prime

22

và so sánh với dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỉ lệ tương đồng. Tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả BLAST. Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại.

2.2.2. Đánh giá một số tính chất & hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn

được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro

2.2.2.1. Khả năng sinh trưởng

Chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi lắc trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa môi trường MRS lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc. Đo mật độ vi khuẩn ở mỗi mẫu bằng máy đo quang phổ ở OD620 và vẽ đường cong sinh trưởng tại các mốc thời gian [8].

2.2.2.2. Khả năng sinh axit lactic

Thí nghiệm này được thực hiện song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng. Sau khi tiếp giống, chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng tiếp tục được nuôi lắc ở 37oC ở 200 vòng/ phút trong môi trường MRS chuẩn pH 6,5. Tại mỗi mốc thời gian, hút ra 10 mL dịch nuôi lắc, ly tâm và cho vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 20 mL nước cất và 1-2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90o). Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích dung dịch NaOH đã dùng để chuẩn độ [68]. Độ axit tính theo độ Therner: oT = VNaOH tiêu tốn x 10, % axit lactic = oT x 0,009; trong đó: oT là độ Therner, 1oT tương ứng với 9 mg axit lactic.

2.2.2.3. Khả năng chịu muối mật

Dựa theo phương pháp của Todorov và đồng tác giả (2011); Colombo và đồng tác giả (2018), phương pháp thử khả năng chịu muối mật của chủng tuyển chọn được thực hiện như sau: Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa môi trường muối mật 0,3% và 3,0% lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,3) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên. Chủng vi khuẩn nuôi trong môi trường MRS không chứa muối mật được dùng làm đối chứng. Đo OD620 lúc 0 giờ và sau 4 giờ nuôi lắc

23

ở 37oC để xác định khả năng chịu muối mật của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [97], [26].

2.2.2.4. Khả năng chịu axit

Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang các bình chứa môi trường MRS đã chuẩn pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và 6 (chuẩn pH bằng dung dịch HCl 1M) sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên. Đo OD620 tại 0 giờ và sau 3 giờ để xác định khả năng chịu axit của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [97], [26].

2.2.2.5. Khả năng sinh H2O2

Chủng tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi cấy trong môi trường thạch MRS có bổ sung thêm 250 µg/mL 3-3’-5-5’ tetramethylbenzidine và 0,01 mg/mL horse radish peroxidase. Quan sát cường độ màu được phân loại giúp xác định khả năng sinh H2O2 [19].

2.2.2.6. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh

Các kháng sinh được sử dụng là (C) Chloramphenicol 30 µg, (E) Erythromycin 15 µg, (TE) Tetracycline 30 µg, (CTX) Cefotaxine 30 µg, (AMP) Ampicillin 10 µg, (CN) Gentamicin 10 µg, (CIP) Ciprofloxacin 5 µg. Sử dụng khoanh giấy kháng sinh đặt trên môi trường đã cấy trải các chủng vi khuẩn nghiên cứu, đường kính vòng ức chế được đo sau khi ủ đĩa ở 37 oC trong 48 giờ dưới điều kiện kị khí [107], [106].

2.2.2.7. Khả năng tạo màng biofilm

Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một số

chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể.

Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% được thực hiện như sau: khuẩn lạc các chủng vi sinh vật tuyển chọn được nuôi cấy kích hoạt trong bình tam giác chứa 10 mL môi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37 oC trong điều kiện kị khí

và chỉnh mật độ tế bào OD620 khoảng ~ 0,6. Hút 100 L dịch nuôi cấy vi khuẩn đã

nuôi lắc bổ sung vào 700 L môi trường MRS lỏng trong các ống eppendorf (2 mL hoặc 1,5 mL) đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống

24

trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở OD620 trong dịch nuôi cấy vi khuẩn [72].

Quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật theo phương pháp sau: mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung thêm 1 mL dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh. Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tan trong 1 mL ethanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo OD620 [65].

2.2.2.8. Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại

Sau khi nuôi lắc qua đêm chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở 37 oC trong môi trường MRS lỏng, chỉnh dịch nuôi lắc về pH 7 rồi nhỏ 150 µL dịch nuôi lắc vào mỗi lỗ thạch trên đĩa môi trường đã được cấy trải các chủng vi sinh vật gây hại: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 và nấm C. albicans JCM 2070.

Quan sát đĩa thạch sau 24 - 48 giờ và đo đường kính vòng ức chế xung quanh lỗ thạch tại thời điểm 48 giờ nếu có (D – d, mm; trong đó: D là đường kính vòng ức chế, mm; d là đường kính lỗ thạch, mm) [8].

2.2.3. Nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi khuẩn

được tuyển chọn

Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ.

2.2.3.1. So sánh sinh khối tế bào ở chế độ nuôi lắc và chế độ nuôi tĩnh

Chuẩn bị môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5) đã khử trùng, sau đó tiếp giống (10%) các chủng vi khuẩn (với cùng số đo OD620) vào các bình môi trường đó và nuôi cấy ở 2 điều kiện tĩnh và lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ ở 37 oC. Đo OD620 sau 24 giờ ở các điều kiện và nhận xét sự chênh lệch [8].

2.2.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng vi khuẩn

lactic

Chuẩn bị môi trường MRS lỏng (pH 6,5) đã khử trùng, sau đó tiếp giống (10%) các chủng vi khuẩn (với cùng số đo OD) vào các bình môi trường đó và nuôi nuôi lắc 200 vòng/phút mỗi bình ở một mức nhiệt độ khác nhau là 25 oC, 30oC, 37oC, 45oC và 50oC dưới điều kiện kị khí. Đo OD620 sau 24 giờ và so sánh kết quả, tìm nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [8].

25

2.2.4. Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá

trình đông khô của các chủng được tuyển chọn

2.2.4.1. Thu sinh khối chủng vi khuẩn tuyển chọn

Từ kết quả thí nghiệm ở mục 2.2.3 và 2.2.4, các điều kiện nhân giống tối ưu của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng đã được chúng tôi đưa ra. Tiến hành nuôi chủng tuyển chọn và chủng đối chứng trong 5 lít môi trường MRS lỏng với các điều kiện tối ưu kể trên, ly tâm thu sinh khối chủng vi khuẩn ở gần cuối pha log (10 – 12 giờ) để đảm bảo các chủng đó có tỉ lệ sống cao nhất trước khi phối trộn cùng các chất bảo vệ và đông khô.

2.2.4.2. Xác định mật độ sống CFU/g (mL) của chủng vi khuẩn được tuyển chọn

trước khi phối trộn chất bảo vệ

Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn sau đó xác định mật độ sống trước khi đông khô của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp xác định số khuẩn lạc CFU/g (mL). Tiến hành pha loãng thập phân mỗi mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% và bằng dung dịch muối đệm phốt phát PBS [110]; cấy trải 100 µL trên đĩa thạch MRS (đường kính 10 cm) ở 3 nồng độ pha loãng 10-6, 10-7 và 10-8; nuôi cấy kị kí trong 24 - 48 giờ và đếm số lượng khuẩn lạc sau đó tính ra CFU/g (mL) theo công thức sau:

CFU/g (mL) = a x 1/k x 1/V [23]

Trong đó: + a – số khuẩn lạc trên các đĩa có cùng nồng độ pha loãng (lấy số khuẩn lạc trung bình); + k – độ pha loãng của dịch lắc nuôi cấy; + V – thể tích dung dịch pha loãng được cấy trên đĩa (đổi ra đơn vị mL). Lưu ý chọn đĩa nuôi cấy có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25 đến 300. Nếu 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng thì số khuẩn lạc đếm được chỉ được chênh nhau khoảng 10%. Khi pha loãng xuống 10 lần thì số khuẩn lạc cũng giảm xuống 10 lần.

2.2.4.3. Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá

trình đông khô của các chủng được tuyển chọn

Bảng 1. Thử nghiệm các công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic với các chất bảo vệ

Tỉ lệ phối trộn (không chất độn) TLTK Lô TN

Sữa gầy [43] 1 Thêm Glycerol

70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (1) 2 Không thêm Glycerol

26

3 Thêm Glycerol [117] 70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và vitamin C) (2) 4 Không thêm Glycerol

5 92,8% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (3) Không thêm Glycerol [43], [117] 6 91,5% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và vitamin C) (4)

7 Thêm Glycerol 70% sinh khối, 30% mannitol (5) 8 Không thêm Glycerol

9 Thêm Glycerol

Mannitol 81,5% sinh khối và 18,5% chất bảo vệ (gồm mannitol và vitamin C) (6) 10 Không thêm Glycerol [84], [43], [117] 11 84% sinh khối, 16% mannitol (7)

Không thêm Glycerol 12 82,8% sinh khối và 18,5% chất bảo vệ (gồm mannitol và sucrose) (8)

13 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và mannitol) (9)

14 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (maltodextrin và microcrystalline cellulose) (10) Chế phẩm Optibac probiotics for women - Anh

15 ĐC (-) Không phối trộn

2.2.4.4. Đông khô và xác định mật độ sống sót sau đông khô

10 gam hỗn hợp sau phối trộn được dàn lên đĩa petri nhựa (mỗi một công thức phối trộn làm 2 đĩa), các đĩa được để đông lạnh sau đó đem đi đông khô. Cài đặt chương trình cho quá trình đông khô: nhiệt độ -50oC trong 20 - 30 giờ.

27

Hình 6. Máy đông khô vi khuẩn

Các lô thí nghiệm cùng đối chứng được xác định mật độ sống sót CFU/g ngay sau khi đông khô để tìm ra công thức hiệu quả nhất. Sau khi đông khô, hỗn hợp được trộn thêm cùng một số chất độn và tiếp tục được nghiên cứu.

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các kết quả được xử lý thống kê.

28

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và kết quả tuyển chọn chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic định hướng vào sản xuất chế phẩm probiotics giành riêng cho phụ nữ

3.1.1. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực

thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam

Trong tổng số 60 mẫu sữa mẹ thu thập được từ các bà mẹ ở vùng nông thôn và thành thị, các chủng thuộc về Lactobacillus spp. được tìm thấy trên 25 mẫu, chiếm tỉ lệ 41,67% và các chủng L. reuteri được tìm thấy trên 7 mẫu, chiếm tỉ lệ 11,67%. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị được biểu diễn ở Bảng 2. Bảng 2. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri trong sữa mẹ ở khu vực thành thị

và khu vực nông thôn tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam

Vi khuẩn Khu vực thành thị Khu vực nông thôn

Lactobacillus spp. 40% (12/30) 43,33% (13/30)

L. reuteri 13,33% (4/30) 10% (3/30)

Kết quả từ Bảng 2 cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri trong sữa mẹ ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri xuất hiện trong sữa mẹ ở khu vực thành thị lần lượt chiếm 40% và 13,33% trong khi đó tỉ lệ này ở khu vực nông thôn lần lượt là 43,33% và 10%. Tuy nhiên, tổng số Lactobacilli trung bình trong sữa của các bà mẹ khu vực nông thôn cao hơn khu vực thành thị (1,1x103 so với 3,0x102 CFU/mL). Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi mới chỉ dừng lại ở 60 mẫu sữa mẹ được thu thập từ các bà mẹ sống ở cả nông thôn (30 mẫu) và thành thị (30 mẫu) tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam (việc thu thập và phân lập trên mẫu sữa mẹ vẫn tiếp tục được tiến hành). Có thể nói đây là một trong các nghiên cứu đầu tiên về việc phân lập Lactobacillus spp. và đặc biệt chứng minh sự có mặt của L. reuteri trong sữa mẹ ở phụ nữ cho con bú tại Việt Nam. Mặc dù số mẫu vẫn còn hạn chế (n = 60), kết quả cho thấy sự có mặt của loài L. reuteri chiếm tỉ lệ là ~ 12% (7/60). Tỷ lệ này thấp hơn khoảng 3% so với một nghiên cứu tương tự của Gabriela và Ljunggren năm 2008 trên đối tượng sữa mẹ được thu thập từ 7 nước khác nhau: Thụy Điển, Israel, Nam Phi, Nhật Bản, Peru, Hàn Quốc và Đan Mạch với tỉ lệ ~ 15% (32/220) [91]. Tỉ lệ của Lactobacillus spp. và L. reuteri ở 2 nghiên cứu này

29

tương đối như nhau và không có sự khác biệt ở 2 khu vực nông thôn và thành thị. Bên cạnh đó, tổng số Lactobacilli trung bình trong sữa của bà mẹ khu vực nông thôn vẫn cao hơn khu vực thành thị.

3.1.2. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. từ sữa mẹ

Từ 7 mẫu sữa mẹ có sự xuất hiện của L. reuteri đã phân lập được 8 chủng thuộc loài L. reuteri, 8 chủng này được đặt tên SMH2, SMH3, SMH4, SMH5, SMH6, SMH7, SMH8, SMH9.

Từ 25 mẫu có sự xuất hiện của các chủng Lactobacillus spp. đã phân lập được 27 chủng Lactobacillus spp. Các chủng này được đặt tên SMH1 và lần lượt từ SMH10 đến SM35.

Lactobacilli đã được chứng minh là ức chế sự tăng trưởng in-vitro của các vi sinh vật gây bệnh ở âm đạo như Bacteroides fragilis, E. coli, G. vaginalis, Mobiluncus spp., Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, P. bivia, Staphylococcus aureus và Candida. Điều này đạt được chủ yếu thông qua hoạt động của axit lactic [45], [61], [92], [94]. Hơn nữa, đây là các chủng vi khuẩn gây bệnh nên chúng tôi không thể nuôi cấy trực tiếp để nghiên cứu về khả năng ức chế các chủng này trong điều kiện phòng thí nghiệm hiện có. Do đó chúng tôi lựa chọn thử hoạt tính sơ bộ về khả năng sinh axit lactic để tuyển chọn ra chủng Lactobacillus spp. với mục đích đưa chủng tuyển chọn định hướng vào sản xuất thực phẩm chức năng dành cho phụ nữ. Kết quả sinh axit lactic của 8 chủng L. reuteri và 27 chủng Lactobacillus spp. được biểu diễn tại Bảng 3.

Bảng 3. Lượng axit lactic sinh ra của các chủng L. reuteri và Lactobacillus spp. (Các giá trị trong Bảng 3 là giá trị trung bình sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, giá trị độ lệch chuẩn được thống kê tại Phụ lục 2)

Lượng axit lactic (g/100 mL)

STT 0 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 36 giờ Ký hiệu các chủng thuộc loài L. reuteri 24 giờ 28 giờ 32 giờ

1 SMH2 0,03 0,321 0,333 0,372 0,765 1,192 1,396 1,227

2 SMH3 0,03 0,312 0,324 0,429 1,161 1,182 1,218 1,133

3 SMH4 0,03 0,285 0,288 0,321 0,422 0,552 0,396 0,320

4 SMH5 0,03 0,270 0,274 0,336 0,762 0,597 0,474 0,430

5 SMH6 0,03 0,240 0,258 0,330 0,670 0,587 0,435 0,432

6 SMH7 0,03 0,231 0,237 0,325 0,460 0,577 0,440 0,421

7 SMH8 0,03 0,250 0,264 0,268 0,410 0,597 0,472 0,413

8 SMH9 0,03 0,211 0,252 0,323 0,560 0,497 0,414 0,230

30

Lượng axit lactic (g/100 mL)

STT 0 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 36 giờ 24 giờ 28 giờ 32 giờ Ký hiệu các chủng Lactobacillus spp.

9 SMH1 0,03 0,303 0,351 0,384 1,014 1,181 1,287 1,210

10 SMH10 0,03 0,124 0,205 0,303 0,667 0,583 0,501 0,381

11 SMH11 0,03 0,118 0,125 0,247 0,356 0,702 0,483 0,211

12 SMH12 0,03 0,202 0,229 0,335 0,478 0,776 0,347 0,186

13 SMH13 0,03 0,106 0,112 0,361 0,469 0,332 0,257 0,164

14 SMH14 0,03 0,158 0,223 0,307 0,409 0,557 0,651 0,320

15 SMH15 0,03 0,213 0,224 0,486 0,502 0,702 0,603 0,221

16 SMH16 0,03 0,262 0,314 0,429 0,484 0,550 0,405 0,331

17 SMH17 0,03 0,104 0,228 0,373 0,550 0,567 0,682 0,318

18 SMH18 0,03 0,289 0,430 0,447 0,580 0,707 0,754 0,521

19 SMH19 0,03 0,115 0,260 0,404 0,500 0,531 0,544 0,323

20 SMH20 0,03 0,208 0,317 0,400 0,455 0,477 0,389 0,157

21 SMH21 0,03 0,204 0,345 0,401 0,534 0,553 0,429 0,336

22 SMH22 0,03 0,177 0,241 0,369 0,559 0,600 0,619 0,243

23 SMH23 0,03 0,222 0,286 0,318 0,415 0,522 0,703 0,301

24 SMH24 0,03 0,110 0,123 0,380 0,449 0,589 0,389 0,215

25 SMH25 0,03 0,224 0,286 0,312 0,475 0,687 0,531 0,204

26 SMH26 0,03 0,105 0,217 0,235 0,458 0,691 0,273 0,219

27 SMH27 0,03 0,216 0,220 0,335 0,673 0,435 0,211 0,003

28 SMH28 0,03 0,238 0,243 0,362 0,699 0,712 0,308 0,115

29 SMH29 0,03 0,254 0,312 0,318 0,267 0,583 0,689 0,210

30 SMH30 0,03 0,210 0,225 0,468 0,504 0,531 0,372 0,206

31 SMH31 0,03 0,372 0,428 0,429 0,508 0,714 0,313 0,251

32 SMH32 0,03 0,122 0,256 0,337 0,577 0,423 0,308 0,207

33 SMH33 0,03 0,297 0,315 0,446 0,554 0,650 0,682 0,240

34 SMH34 0,03 0,104 0,343 0,412 0,524 0,564 0,326 0,105

35 0,03 0,157 SMH35 0,237 0,426 0,525 0,342 0,206

0,111 Chủng SMH1 và SMH2 do có khả năng sinh axit lactic cao nhất (số liệu ở Bảng 3) nên được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính probiotic ở điều kiện in-vitro.

31

3.1.3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn được tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ

Dựa vào kết quả giải trình tự gen 16S rRNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu trên GenBank, chủng SMH1 có độ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA 99,5% với loài Lactobacillus rhamnosus NCTC13764 nên được đặt tên là Lactobacillus rhamnosus SMH1 với mã số đăng ký trên Genbank là MK791735; chủng SMH2 có độ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA 99,3 % với loài Lactobacillus reuteri DSM 20016 nên được đặt tên là Lactobacillus reuteri SMH2 với mã số được đăng ký trên Genbank là MK791734. Trình tự gen 16S rRNA và các đặc điểm của 2 chủng vi khuẩn tuyển chọn (Bảng 4) được trình bày dưới đây. + Lactobacillus rhamnosus SMH1

CCGGCCCAAACTTCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGATTCTTCCACAATGGACGC AAGTTTGAAGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAAC TCTGTTGTTGGAGAAGAATGTTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTAT CCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTA AGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGA AACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT AGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGAC GCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT GCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAG CTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAA AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC AACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGG TTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCC AGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTAC ATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCC ATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATAGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG CCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTA GGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCG

+ Lactobacillus reuteri SMH2

TAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGA ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA CACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAA CCTTTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGGAAGT

32

Bảng 4. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn

Ảnh SEM (độ phóng đại 104x) Ảnh nhuộm Gram (độ phóng đại 100x) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS Chủng tuyển chọn – Mã số trên NCBI

Điểm số tương đồng (%)

Chủng chuẩn tương đồng nhất trên ngân hàng Genbank NCBI – Mã số trên NCBI

99,5

Lactobacillus rhamnosus SMH1 - MK791735 Lactobacillu s rhamnosus NCTC13764 - NZ_LR134331

99,3

Lactobacillus reuteri SMH2 - MK791734 Lactobacillu s reuteri DSM 20016 - NR_075036

3.2. Kết quả đánh giá một số tính chất, hoạt tính và điều kiện nhân giống của

chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro

3.2.1. Kết quả đánh giá một số tính chất và hoạt tính probiotic của chủng vi

khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro

Hệ vi sinh vật âm đạo được chi phối bởi Lactobacilli ở phụ nữ khỏe mạnh [55]. Lactobacilli đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật âm đạo [93], [70]. Vai trò bảo vệ của Lactobacilli được dựa trên một số cơ chế: bám dính đặc hiệu vào biểu mô âm đạo và và ức chế mầm bệnh bám vào bề mặt biểu mô âm đạo, cạnh tranh các chất dinh dưỡng với một số vi khuẩn niệu sinh dục, sản xuất các chất chuyển hóa hoạt động bao gồm axit hữu cơ - chủ yếu là axit lactic góp phần duy trì pH âm đạo thấp (pH 4-4,5), H 2O2 thường sinh ra bởi Lactobacilli có trong âm đạo khỏe mạnh, sản xuất ra bacteriocin kháng lại các vi

33

sinh vật gây hại [107], [93], [70], [119]. Mặc dù vậy lại có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Lactobacillus spp. trong việc bảo vệ hệ vi sinh vật khỏe mạnh ở âm đạo [74]. Chính vì vậy, trong khuôn khổ của nghiên cứu này các đặc tính probiotic của chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 đã được chúng tôi nghiên cứu sâu hơn, đó là khả năng sinh axit lactic, khả năng sinh H 2O2, khả năng tạo màng biofilm, khả năng kháng với các vi sinh vật và nấm có hại. Ngoài ra, với mục đích sản xuất chế phẩm probiotics cho phụ nữ chứa chủng tuyển chọn dạng viên nang đường uống, chúng tôi nghiên cứu thêm khả năng chịu muối mật, khả năng chịu axit và khả năng nhạy cảm với kháng sinh của các chủng tuyển chọn.

3.2.1.1. Khả năng sinh trưởng

Kết quả thử nghiệm khả năng sinh trưởng của chủng L. rhamnosus SMH1, L.

reuteri SMH2 và chủng đối chứng được thể hiện ở Hình 7.

Chú thích: - Chủng đối chứng: Lactobacillus reuteri VTCC 910087 (Viết tắt: ĐC); - Chủng nghiên cứu: Lactobacillus rhamnosus SMH1 (Viết tắt: SMH1); Lactobacillus reuteri SMH2 (Viết tắt: SMH2).

Hình 7. Đường cong sinh trưởng và lượng axit lactic sinh ra theo thời gian của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng

Kết quả cho thấy cả 3 chủng đều có pha sinh trưởng (pha log) từ khoảng 2 giờ đến 12 giờ. Giá trị OD620 trung bình của 2 chủng tuyển chọn luôn cao hơn so với chủng đối chứng và cao nhất đạt ~ 1,84 (SMH1) và ~ 1,87 (SMH2) sau 12 giờ. Pha suy vong của 2 chủng tuyển chọn bắt đầu sau 32 giờ nuôi cấy trong khi đó pha suy vong của chủng đối chứng bắt đầu sớm hơn sau 28 giờ nuôi cấy. Qua đây, khoảng thời gian chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 sinh trưởng tốt nhất đã được xác định với mục đích nhân giống chủng.

3.2.1.2. Khả năng sinh axit lactic

Kết quả kiểm tra lượng axit lactic sinh ra cũng được biểu diễn ở Hình 7. Kết quả trên cho thấy lượng axit lactic sinh ra tại tất cả các mốc thời gian của 2 chủng tuyển chọn đều cao hơn so với chủng đối chứng. Trong vòng 12 giờ đầu lượng axit

34

sinh ra của 2 chủng này tăng chậm và không có sự chênh lệch nhiều nhưng từ sau 12 giờ, lượng axit lactic sinh ra của 2 chủng tuyển chọn tăng nhanh với lượng axit lactic cao nhất đạt xấp xỉ 14 g/L (L. reuteri SMH2) và 13 g/L (L. rhamnosus SMH1) tại 32 giờ. Sau 32 giờ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy chủng 2 chủng tuyển chọn có pH giảm xuống ở khoảng 3-4.

Chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 với khả năng sinh ra lượng axit lactic cao làm giảm pH môi trường (giảm xuống pH 3-4, đây là mức pH bình thường của môi trường âm đạo) do đó có khả năng ức chế các vi khuẩn và nấm có hại trong âm đạo phụ nữ, pH cho sinh trưởng của vi khuẩn và nấm có hại là pH > 4,5 và cũng chính là nguyên nhân gây ra viêm nhiễm âm đạo [66]. Với định hướng sản xuất chế phẩm probiotics dạng viên nang đường uống, 2 chủng tuyển chọn thuộc 2 loài lợi khuẩn còn hỗ trợ sức khỏe đường ruột một cách hiệu quả. Axit lactic mà chúng sinh ra giúp ngăn chặn sự sống sót của vi khuẩn và nấm có hại trong đường tiêu hóa. Chẳng hạn, L. rhamnosus có thể ngăn chặn C. albicans có hại xâm chiếm thành ruột [104]. L. rhamnosus không chỉ ngăn chặn vi khuẩn xấu xâm nhập mà còn khuyến khích sự phát triển của các vi khuẩn có lợi, chẳng hạn như Bacteroides, Clostridia và Bifidobacteria [37]. Hơn nữa, L. rhamnosus còn giúp tăng cường sản xuất các axit béo chuỗi ngắn, chẳng hạn như acetate, propionate và butyrate [52]. Các axit béo chuỗi ngắn được tạo ra khi vi khuẩn đường ruột khỏe mạnh lên men chất xơ bên trong đường tiêu hóa. Chúng là nguồn nuôi dưỡng cho các tế bào lót đại tràng của bạn [63]. Điều này cũng tương tự như đặc tính của chủng L. reuteri RC-14® đã được thử nghiệm lâm sàng do có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh ở cả ruột và vùng sinh dục bằng cách sản xuất ra axit lactic [51], [21], [77].

3.2.1.3. Khả năng chịu muối mật

Kết quả thử nghiệm khả chịu muối mật của chủng L. rhamnosus SMH1, L.

reuteri SMH2 và chủng đối chứng được thể hiện ở Hình 8.

35

Hình 8. Khả năng chịu muối mật của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2

và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087

Kết quả cho thấy cả chủng L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng đều phát triển kém trong môi trường có chứa muối mật. Ở môi trường muối mật 0,3% chủng L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng đều phát triển và tăng sinh sinh khối sau 4 giờ nuôi cấy trong khi đó điều này lại ngược lại đối với môi trường muối mật 3%, 2 chủng đều phát triển yếu với số đo OD620 giảm sau 4 giờ nuôi cấy từ ~ 0,3 xuống ~ 0,26 đối với chủng L. reuteri SMH2 và từ ~ 0,3 xuống ~ 0,18 đối với chủng đối chứng. Tuy nhiên, điều này lại ngược lại với chủng L. rhamnosus SMH1, ở môi trường muối mật 0,3% chủng này phát triển mạnh nhất trong 3 chủng và phát triển mạnh hơn nữa khi tăng nồng độ muối mật trong môi trường lên 3% (số đo OD 620 từ ~ 0,64 lên ~ 0,87). Điều này chứng tỏ chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 đều có khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt. Khả năng chịu muối mật có liên quan tới khả năng sống sót của vi khuẩn trong đường tiêu hóa của con người do muối mật là một thành phần có trong ruột, giúp tiêu hóa thức ăn. Vi khuẩn lactic sống trong ruột của con người có khả năng chịu được muối mật sẽ sống sót và tiếp tục sinh trưởng. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Balasingham và đồng tác giả khi nghiên cứu trên L. acidophilus và L. plantarum [17].

3.2.1.4. Khả năng chịu axit

Kết quả kiểm tra khả năng chịu axit của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng biểu diễn ở Hình 9. Cả 3 chủng đều phát triển tương đối tốt trong môi trường MRS pH 5 và pH 6 nhưng phát triển tốt nhất ở môi trường pH 6. Ở môi trường pH 2 - 4, chủng L. reuteri SMH2 đều phát triển kém, số đo OD620 đều giảm sau 3 giờ, tuy nhiên điều này lại ngược lại với chủng L. rhamnosus SMH1, ở điều kiện pH rất thấp chủng này vẫn có khả năng sinh trưởng tốt với số đo OD620 luôn tăng sau 3 giờ nuôi cấy.

36

Hình 9. Khả năng chịu axit của chủng chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2

và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087

Hai chủng tuyển chọn có khả năng chịu axit, sống sót được ở môi trường pH từ 2 đến 4 nhất là chủng L. rhamnosus SMH1 còn phát triển tốt trong môi trường pH thấp, giúp chúng không bị tiêu diệt như các vi khuẩn và nấm có hại trong âm đạo. Nếu sản xuất thực phẩm chức năng probiotics cho phụ nữ dạng uống, 2 chủng này vẫn có khả năng tồn tại và sinh trưởng trong dạ dày người (có pH 2-3). Nói cách khác chúng có khả năng chống chịu với điều kiện axit của dạ dày để đi đến ruột non và sống sót đến khi xuống âm đạo. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Đào Thị Lương và đồng tác giả khi nghiên cứu khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic [5].

Ngoài ra, ở một nghiên cứu khác, ba chủng L. rhamnosus phân lập từ phô mai Parmigiano Reggiano, L. rhamnosus ATCC 7469T và chủng thương mại L. rhamnosus GG cũng đã được thử nghiệm để nghiên cứu khả năng chống chịu trước các yếu tố khắc nghiệt khác nhau khi sinh trưởng in-vitro, đó là một số điều kiện của môi trường đường ruột như pH thấp và lượng muối mật và axit khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy các chủng L. rhamnosus phân lập từ phô mai Parmigiano Reggiano cho kết quả tương tự như L. rhamnosus GG [95]. Chủng L. rhamnosus GG và chủng L. rhamnosus ATCC 53103 đáp ứng các đặc điểm cần thiết sau đây cho một probiotic lý tưởng: chống chịu với axit dạ dày và muối mật để nó có thể sống sót qua đường tiêu hóa, khả năng nhân lên liên tục và bám vào các tế bào biểu mô ruột của con người và xâm chiếm ruột, sản xuất một chất chống khuẩn, tốc độ tăng trưởng nhanh và các ảnh hưởng tích cực cho sức khỏe. Đây là một trong những

37

chủng vi khuẩn có lợi được nghiên cứu rộng rãi nhất và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người đã được kiểm tra trong nhiều thử nghiệm lâm sàng [42]. Chủng L. reuteri Pg4 (T-Pg4) thể hiện tính chống chịu trong các điều kiện axit, khi tiếp xúc với muối mật; bám dính hiệu quả vào các tế bào biểu mô ruột của gà. Phát hiện này đã chứng minh rằng L. reuteri PG4 có thể sống sót khi vận chuyển qua dạ dày và ruột do đó, chủng này có khả năng đưa vào sản xuất chế phẩm probiotics cho gia cầm [116].

Hai chủng tuyển chọn vừa có khả năng sinh lượng axit lactic cao, vừa có khả năng sống sót dưới điều kiện pH thấp, vừa có khả năng chịu muối mật cũng như sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kị khí nên chúng rất có tiềm năng khi đưa vào sản xuất thực phẩm chức năng probiotics giành riêng cho phụ nữ ở Việt Nam. Việc nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng probiotics chứa L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 được phân lập từ sữa mẹ giúp duy trì khu hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh cho phụ nữ là việc làm thiết thực và có ý nghĩa cao cho cộng đồng.

3.2.1.5. Khả năng sinh H2O2

H2O2 là một chất oxy hóa mạnh và được coi là chất kháng khuẩn tốt do vi sinh vật có lợi tiết ra để chống lại các vi khuẩn có hại khi gặp điều kiện sống bất lợi.

Hình 10. Khả năng sinh H2O2 của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và

chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087

Dựa trên Hình 10, có thể thấy vùng cấy chủng L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng xuất hiện màu xanh nhưng với 2 cường độ màu khác nhau. Vùng cấy chủng L. reuteri SMH2 xuất hiện màu xanh đậm nhưng với lượng ít, sinh ra lượng H 2O2 trung bình. Bên cạnh đó, vùng cấy chủng đối chứng xuất hiện màu xanh dương nhạt, qua đó có thể thấy chủng đối chứng sinh ra lượng ít H2O2. Vùng cấy chủng L.

38

rhamnosus SMH1 không xuất hiện màu xanh chứng tỏ chủng này không có khả năng sinh H2O2.

Nghiên cứu của McLean và Rosenstein đã chứng minh chủng L. acidophilus 48101 được phân lập từ âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh đã sản xuất lượng lớn H2O2 và ức chế sự tăng trưởng của Bacteroides spp., Prevotella bivia và G. vaginalis được phân lập từ gạc âm đạo của phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo [62]. H2O2 được sản xuất từ Lactobacilli đã được chứng minh là làm bất hoạt HIV-1, vi rút herpes simplex type 2 (HSV-2), Trichomonas vaginalis, G. vaginalis, P. bivia và E. coli. O'Hanlon [71] và Baeten [16] đã phát hiện ra rằng 96% các loài Lactobacillus từ hệ sinh thái âm đạo khỏe mạnh đã tạo ra H2O2 [112], [58] trong khi chỉ có 6% Lactobacilli được phục hồi từ những phụ nữ viêm nhiễm phụ khoa có khả năng sản - hay OH- có xuất H2O2 [33]. Các nghiên cứu đã cho thấy H2O2 cũng giống như O2 khả năng gây tổn thương cao khi tham gia vào phản ứng Fenton. Chúng gây tổn thương cấu trúc và chức năng các đại phân tử trong tế bào như protein, ADN, lipit, … dẫn đến gây chết mạnh các vi khuẩn gây hại xung quanh môi trường nó sinh sống [86]. Khả năng sinh H2O2 giải thích việc bổ sung L. reuteri SMH2 được phân lập từ sữa mẹ cho âm đạo của phụ nữ sẽ giúp tiêu diệt các vi khuẩn có hại trong âm đạo theo cơ chế tự nhiên mà không ảnh hưởng gì đến sức khỏe của họ.

3.2.1.6. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh

Kết quả thử khả năng nhạy cảm với kháng sinh của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng cho chúng tôi thấy cả 3 chủng đều nhạy cảm với kháng sinh chloramphenicol, erythromycin và cefotaxine với đường kính vòng kháng khuẩn của 2 chủng tuyển chọn luôn cao hơn so với chủng đối chứng (Hình 11). Cả 3 chủng đều kháng lại 2 loại kháng sinh là tetracycline, ciprofloxacin và ức chế đối với kháng sinh gentamicin. Trong khi chủng đối chứng và chủng L. rhamnosus SMH1 kháng lại kháng sinh ampicillin thì ngược lại chủng L. reuteri SMH2 lại ức chế đối với loại kháng sinh này, không kháng ampicillin hoàn toàn (Số liệu ở Bảng 5).

39

Bảng 5. Số đo vòng kháng khuẩn của chủng tuyển chọn với các loại kháng sinh R: kháng kháng sinh, S: nhạy cảm với kháng sinh, I: kháng không hoàn toàn Chủng đối chứng (ĐC): L. reuteri VTCC 910087

C

AMP

TE

CN

CIP

Kháng sinh E CTX Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

Ký hiệu chủng

S R I R R SMH1 S (16,0±4,3) S (17,7±0,6) (0,0) (16,3±0,6) (0,0) (7,5±2,1) (0,0)

R I R SMH2 S (23,3±1,) I (5,0±0,0) S (17,0±2,0) S (16,7±3,8)

(0,0) R (6,3±0,6) I (0,0) R R ĐC S (15,2±0,4) S (14,1±1,9) S (8,2±1,1) (0,0) (0,0) (3,9±1,2) (0,0)

Việc thử tính nhạy cảm của 2 chủng tuyển chọn với kháng sinh là điều rất quan trọng. Chúng ta phải biết được độ nhạy cảm của nó để hiểu tác động của nó đối với các kháng sinh trong dược phẩm được sử dụng để điều trị bệnh. Các chủng vi khuẩn probiotic kháng kháng sinh có thể là một lợi thế trong trường hợp được sử dụng phối hợp cùng nhau, nhưng không phải tất cả các vi khuẩn Lactobacilli đều có khả năng đề kháng nội sinh [49].

Hình 11. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của chủng ĐC L. reuteri VTCC

910087 (Hình 6A), chủng L. reuteri SMH2 (Hình 6B) và L. rhamnosus SMH1 (Hình 6C)

40

3.2.1.7. Khả năng tạo màng biofilm

Sau khi tiến hành nuôi cấy mỗi chủng trong ống eppendorf 24 giờ, tiến hành làm các bước nhuộm tím kết tinh, quan sát sự bắt màu trên thành ống và sau đó đo OD tại bước sóng 620 nm. Kết quả thu được ở Hình 12 cho thấy chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 có lượng tế bào đo được cao hơn so với chủng đối chứng, chứng tỏ rằng 2 chủng này có mức độ bám dính tốt hơn.

Hình 12. Khả năng tạo màng biofilm của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri

SMH2 và chủng ĐC L. reuteri VTCC 910087

Như đã nói ở trên, vai trò bảo vệ của Lactobacilli được dựa trên cơ chế bám dính đặc hiệu vào biểu mô âm đạo và ức chế mầm bệnh bám vào bề mặt biểu mô âm đạo. Điều này thường làm giảm mầm bệnh lây nhiễm sang biểu mô âm đạo [18]. Theo nghiên cứu của Boris cùng các cộng sự, ba chủng L. acidophilus, L. gasseri và L. jensenii được chọn trong số 70 chủng phân lập từ âm đạo của phụ nữ tiền mãn kinh khỏe mạnh vì các đặc tính liên quan đến sự xâm chiếm niêm mạc hoặc sự đối kháng. Cả ba chủng này đều tự kết tập lại và bám vào các tế bào biểu mô âm đạo dẫn đến loại bỏ các mầm bệnh âm đạo thường xuyên biết đến chẳng hạn như G. vaginalis, và ức chế sự tăng trưởng in-vitro của E. coli và Streptococcus agalactiae. Các thành phần bề mặt liên quan đến quá trình tự kết tập là glycoprotein (L. acidophilus và L. gasseri) và carbohydrate (L. jensenii). Các thụ thể glycolipid của các tế bào âm đạo là mục tiêu của sự cạnh tranh giữa các vi khuẩn Lactobacilli và các vi khuẩn gây bệnh [119].

Chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 có khả năng tạo màng biofilm tốt giúp chúng tồn tại được trong âm đạo của phụ nữ và ức chế các vi khuẩn và nấm gây hại theo cơ chế cạnh tranh chỗ bám dính. Đây là một trong những đặc tính ưu việt của chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 với định hướng sản xuất thực phẩm chức năng giành riêng cho phụ nữ.

41

3.2.1.8. Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại

Kết quả ở Bảng 6 cho thấy chủng L. rhamnosus SMH1 và chủng L. reuteri SMH2 đều ức chế 3 chủng vi khuẩn và nấm có hại là E. coli, S. aureus và nấm C. albican. Tuy nhiên khả năng ức chế đối với nấm C. albicans mạnh hơn hẳn so với 2 loài còn lại. Bên cạnh đó đường kính vòng ức chế của 2 chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 với các chủng vi khuẩn và nấm có hại kiểm định luôn cao hơn so với chủng đối chứng. Chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 kháng lại cả 3 chủng vi sinh vật có hại được thử nghiệm là E. coli ATCC 25922 (đại diện cho vi khuẩn Gram âm), S. aureus ATCC 25923 (đại diện cho vi khuẩn Gram dương) và nấm C. albicans JCM 2070 (thường có ở âm đạo khi bị viêm nhiễm), đây là các chủng thuộc các loài vi sinh vật gây hại cho đường tiêu hóa và âm đạo của phụ nữ. Kết quả này cũng trùng với nghiên cứu trước đây, Lactobacilli đã được chứng minh là ức chế sự tăng trưởng in-vitro của các vi sinh vật gây bệnh ở âm đạo như B. fragilis, E. coli, G. vaginalis, Mobiluncus spp., N. gonorrhoeae, P. anaerobius, P. bivia, S. aureus và Candida [45], [61], [92], [94].

Bảng 6. Khả năng ức chế đối với các vi khuẩn và nấm có hại Chủng đối chứng (ĐC): L. reuteri VTCC 910087

Đường kính vòng ức chế (D – d, mm)

Chủng

E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923 C. albicans JCM 2070

L. rhamnosus SMH1 23,0±2,1 18,1±2,2 52,2±1,4

L. reuteri SMH2 21,1±1,3 19,3±3,1 39,4±2,1

ĐC 17,4±2,2 16,2±1,3 34,3±3,2

Coman cùng các cộng sự đã đánh giá hoạt động kháng nấm của hai chủng vi khuẩn probiotic gồm L. rhamnosus IMC 501® và L. paracasei IMC 502® và sự kết hợp 1:1 của chúng, được đặt tên là SYNBIO®, sử dụng phương pháp khuếch tán agar và xét nghiệm nuôi cấy lỏng. Họ đã thử nghiệm 2 chủng vi khuẩn probiotic trên 8 chủng nấm Candida thuộc các loài C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. parapsilosis và C. tropicalis. Tất cả các chủng Candida bị ức chế mạnh, ngoại trừ C. glabrata và C. tropicalis [27]. Một số nghiên cứu in-vivo cũng cho thấy hiệu quả của probiotics trong nhiễm trùng Candida. Wagner và cộng sự đã chứng minh rằng việc tiêm probiotics (có chứa L. acidophilus, L. reuteri, L. casei GG và B. animalis) vào chuột suy giảm miễn dịch đã làm giảm mật độ của C. albicans trong đường tiêu hóa, làm giảm tỉ lệ nhiễm nấm Candida toàn thân và kéo dài sự sống sót của chuột trưởng thành và sơ sinh [108].

42

Người ta đã thử nghiệm hoạt tính chống lại 11 mầm bệnh vi khuẩn khác nhau được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của L. reuteri, đó là S. aureus, MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus), S. pneumoniae và Enterococcus spp., E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Salmonella typhi, Shigella dysentriae và Vibrio cholera [96]. Kết quả cho thấy các chủng L. reuteri hiện tại có hoạt động kháng khuẩn chống lại 10 mầm bệnh vi khuẩn trên trừ S. pneumoniae. Một báo cáo khác về hoạt động kháng khuẩn của hai chủng Lactobacillus hiện có trên thị trường là L. rhamnosus HN001 và L. acidophilus GLA-14 và sự kết hợp của chúng (Respecta® probiotic blend) đã chống lại bốn mầm bệnh khác nhau gây ra nhiễm khuẩn âm đạo (G. vaginalis, Atopobium vaginae, S. aureus và E. coli) bằng xét nghiệm đồng nuôi cấy. Sự kết hợp này đã chứng minh hiệu quả điều trị kết hợp của các chủng Lactobacillus.

Việc đưa chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SM2 vào sản xuất thực phẩm chức năng probiotics dạng uống hay dạng đặt đều có ý nghĩa thực tiễn, giúp tiêu diệt vi khuẩn và nấm gây hại ở đường tiêu hóa và âm đạo của phụ nữ mà không phải lo lắng về các tác dụng phụ cũng như vấn đề kháng kháng sinh nổi cộm khi được điều trị chống nhiễm khuẩn và nấm bằng kháng sinh hiện nay.

3.2.2. Kết quả nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi

khuẩn được tuyển chọn

3.2.2.1. So sánh sinh khối tế bào ở chế độ nuôi lắc và chế độ nuôi tĩnh

Kết quả từ Hình 13 cho thấy không có sự chênh lệch nhiều giữa 2 điều kiện

nuôi lắc và nuôi tĩnh ở mỗi chủng.

Hình 13. Khả năng phát triển của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087 trong điều kiện nuôi lắc và nuôi tĩnh

Số đo OD620 của chủng L. reuteri SMH2 ở điều kiện nuôi tĩnh cao hơn không đáng kể so với ở điều kiện nuôi lắc, đối với chủng L. rhamnosus SMH1 chỉ số này là xấp xỉ bằng nhau, gần như không có sự chênh lệch còn đối với chủng đối chứng 43

thì kết quả lại ngược lại nhưng sự chênh lệch giữa nuôi lắc và nuôi tĩnh cũng không đáng kể. Qua đây có thể kết luận rằng nuôi cấy 2 chủng tuyển chọn ở điều kiện tĩnh hay lắc đều không ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh sinh khối của chúng.

3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng L.

rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2

Từ kết quả thu được ở Hình 14 chúng tôi nhận thấy cả 3 chủng đều phát triển tương đối tốt trong khoảng từ 30oC đến 45oC. Chủng L. rhamnosus SMH1 phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45oC trong khi đó chủng L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng phát triển tốt nhất ở 37oC. Đặc biệt ở điều kiện 50oC, 2 chủng tuyển chọn hầu như không phát triển, lượng OD620 đo được rất thấp, dịch nuôi lắc không có thay đổi nhiều về màu sắc độ đục trong khi đó chủng đối chứng vẫn phát triển với lượng sinh khối khá thấp.

Hình 14. Khả năng phát triển trên các mức nhiệt độ khác nhau của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087

Điều kiện sinh trưởng và phát triển tối ưu của L. reuteri SMH2 là ở 37oC, pH 6 và vẫn phát triển tương đối tốt ở nhiệt độ 25oC trong khi đó ở một nghiên cứu khác của Habeb cùng cộng sự đã đưa ra kết luận về điều kiện sinh trưởng và phát triển tối ưu của L. reuteri ATCC 23272 là ở 30oC, pH 6,5 nhưng phát triển rất kém ở 25oC [46]. L. rhamnosus SMH1 sinh trưởng và phát triển tối ưu ở 45oC. 40,5oC là nhiệt độ tối ưu cho việc sản xuất axit và 44,5oC là nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của chủng L. rhamnosus GG trong sữa [101], [100] trong khi đó phổ nhiệt hoạt động của chủng này kéo dài từ 2,7oC đến 52 oC. Hiểu rõ nhiệt độ hoạt động tối ưu của các chủng tuyển chọn là tiền đề và là điều rất quan trọng cho việc nhân giống chủng trong việc sản xuất chế phẩm probiotics.

44

3.3. Nghiên cứu các công thức phối trộn để nâng cao tỉ lệ sống của các chủng

tuyển chọn sau khi đông khô

3.3.1. Mật độ tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trước khi đông khô

Các đĩa thạch MRS có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25 đến 300 được chọn. Đếm số khuẩn lạc tại các đĩa, lấy số khuẩn lạc trung bình và tính theo công thức ở mục 2.3.2. Tỉ lệ sống trước khi đông khô của 2 chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 lần lượt là 1,5x109 CFU/g và 2,8x109 CFU/g khi pha loãng bằng dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% trong khi đó khi pha loãng bằng dung dịch PBS thì mật độ sống trước khi đông khô của 2 chủng này lên tới 2x1012 CFU/g. Điều này chứng tỏ rằng các chủng tuyển chọn có mật độ sống cao hơn khi được pha loãng bằng dung dịch PBS. PBS là dung dịch đẳng trương và không độc đối với hầu hết các tế bào nên được sử dụng để pha loãng nhiều chất và rửa tế bào vi khuẩn [78]. Chúng tôi lựa chọn sử dụng dung dịch PBS cho việc pha loãng phân tích CFU/g của mỗi chủng sau quá trình đông khô.

45

3.3.2. Mật độ sống của chủng vi khuẩn tuyển chọn sau khi đông khô

Kết quả nghiên cứu mật độ sống của chủng L. rhamnosus SMH1 và L.

reuteri SMH2 sau quá trình đông khô được thống kê lần lượt ở Bảng 7 và Bảng 8.

Bảng 7. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. rhamnosus SMH1

CFU/g Tỉ lệ phối trộn các chất bảo vệ với chủng L. rhamnosus SMH1 (không chất độn)

Lô TN 1 4x1011 – 5x1011

70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (1) 2 3x1010 – 4x1010

3 3x108 – 5x108

Sữa gầy 70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và vitamin C) (2) 4 4x109 – 6x109 Thêm Glycerol Không thêm Glycerol Thêm Glycerol Không thêm Glycerol

5 5x109

Không thêm Glycerol 6 2x109 92,8% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (3) 91,5% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và vitamin C) (4)

7 5x1010

70% sinh khối, 30% mannitol (5) 8 2x108

9 109

Mannitol 81,5% sinh khối và 18,5% chất bảo vệ (gồm mannitol và vitamin C) (6) 10 108 Thêm Glycerol Không thêm Glycerol Thêm Glycerol Không thêm Glycerol

11 5x109

Không thêm Glycerol 12 4x109 – 6x109 84% sinh khối, 16% mannitol (7) 82,8% sinh khối, 18,5% chất bảo vệ (gồm mannitol và sucrose) (8) 13 1x1010 – 2x1010

14 2x1010 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và mannitol) (9) 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (maltodextrin và microcrystalline cellulose) (10)

15 ĐC (-) Không phối trộn

5x108 – 6x108 Từ kết quả ở Bảng 7 cho thấy các công thức sử dụng sữa gầy có mật độ sống sót sau đông khô cao hơn các công thức sử dụng mannitol. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. rhamnosus SMH1 cao nhất đạt 4x1011 – 5x1011 CFU/g khi phối trộn 70% sinh khối với 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) và thêm Glycerol theo lô TN1 của Bảng 7. Các công thức sử dụng glycerol hiệu quả hơn các công thức không sử dụng glycerol ngoại trừ ở lô TN3 và lô TN4. Các công thức sử dụng vitamin C cho hiệu quả kém.

Bảng 8. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. reuteri SMH2

CFU/g Lô TN Tỉ lệ phối trộn các chất bảo vệ với chủng L. reuteri SMH2 (không chất độn)

46

1 1x1010 – 2x1010

70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (1) 2 2x1011 – 4x1011

3 1x1010 – 2x1010

Sữa gầy 4 6x1010 – 7x1010 70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và vitamin C) (2) Thêm Glycerol Không thêm Glycerol Thêm Glycerol Không thêm Glycerol

5 9x1011 - 10 1011

Không thêm Glycerol 6 4x109 92,8% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (3) 91,5% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và vitamin C) (4)

7 108 – 109

70% sinh khối, 30% mannitol (5) 8 3x108 – 4x108

9 4x108– 5x108 Mannitol 81,5% sinh khối và 18,5% chất bảo vệ (gồm mannitol và vitamin C) (6) 10 3x108 – 4x108 Thêm Glycerol Không thêm Glycerol Thêm Glycerol Không thêm Glycerol 11 4x109

12 2x109 – 3x109 Không thêm Glycerol 84% sinh khối, 16% mannitol (7) 82,8% sinh khối, 18,5% chất bảo vệ (gồm mannitol và sucrose) (8) 13 5x109 – 7x109

14 1x1010 – 4x1010 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và mannitol) (9) 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (maltodextrin và microcrystalline cellulose) (10)

15 ĐC (-) Không phối trộn

2x1010 – 4x1010 Kết quả từ Bảng 8 cho thấy các công thức chứa sữa gầy có hiệu quả hơn hẳn các công thức chứa mannitol. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. reuteri SMH2 cao nhất đạt 9x1011-10x1011 CFU/g khi phối trộn 92,8% sinh khối với 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) và không thêm Glycerol theo lô TN5 của Bảng 8. Các thí nghiệm phối trộn L. reuteri SMH2 cùng với Glycerol không có hiệu quả, kết quả này hoàn toàn trái ngược so với L. rhamnosus SMH1 ở trên. Không có sự khác biệt đáng kể giữa sử dụng vitamin C và sucrose để phối trộn.

Đông khô là phương pháp được sử dụng rộng rãi để bảo quản và lưu trữ các mẫu sinh học dài hạn. Tuy nhiên, trong quá trình đông khô, các tế bào vi khuẩn phải đối mặt với các điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ thấp cũng như hoạt độ nước thấp gây nên tổn thương cấu trúc và sinh lý cho các tế bào vi khuẩn dẫn đến mất khả năng sống sót của nhiều loài [122]. Do đó, để ngăn ngừa hoặc giảm các tác dụng phụ không mong muốn này, các chất bảo vệ thường được thêm vào các mẫu trước khi đông lạnh hoặc đông khô [125], [121], [118]. Hơn nữa, mật độ sống sót của các chủng vi khuẩn chắc chắn sẽ giảm theo thời gian nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng. Do vậy việc tìm được công thức phối trộn phù hợp để mật độ vi khuẩn sống cao sau khi đông khô là điều vô cùng quan trọng. Các chất bảo vệ được chúng 47

tôi tham khảo và lựa chọn để phối trộn cùng với sinh khối các chủng vi khuẩn tuyển chọn trước quá trình đông lạnh và đông khô bao gồm: sữa gầy, mannitol, sucrose, vitamin C, glycerol, maltodextrin và microcrystalline [84], [43], [117]. Trong nghiên cứu này, chất bảo vệ phối trộn với sinh khối 2 chủng vi khuẩn tuyển chọn L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 cho mật độ sống sót cao nhất sau quá trình đông khô đều bao gồm sữa gầy và đường sucrose. Kết quả của chúng tôi cũng giống với các nghiên cứu khác về khả năng sống sót của các loài vi khuẩn khác nhau sau quá trình đông lạnh, đông khô và bảo quản lạnh [122], [121], [118], [123]. Một số giả thuyết đã được đưa ra để giải thích các cơ chế bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô. Người ta cho rằng sữa thúc đẩy sự sống của vi khuẩn ở nhiệt độ thấp bằng cách ổn định các thành phần màng tế bào và hình thành lớp phủ bảo vệ trên các protein thành tế bào [14]. Đường sucrose cũng giống như lactose có thể hoạt động như một chất bảo vệ hiệu quả do sự hiện diện của các nhóm hydroxyl cung cấp sự bảo vệ chống lại các gốc tự do và bởi khả năng liên kết nước của chúng ngăn chặn sự đóng băng nội bào [39]. Chính vì vậy, các thành phần sữa và đường đã được chứng minh là những chất bảo vệ hiệu quả cho các loài Lactobacillus trong quá trình đông lạnh và bảo quản [125], [118]. Ngoài ra việc bổ sung glycerol cũng đã được chứng minh là góp phần tăng số lượng tế bào Lactobacillus sau quá trình đông khô [120]. Mặc dù việc bổ sung glycerol vào môi trường huyền phù không ngăn chặn được những tổn thương do sự đóng băng nhưng những tổn thương do sự làm khô đã được giảm thiểu [124].

Theo nghiên cứu của Zárate cùng cộng sự, ngay sau quá trình đông khô, khả năng sống sót của ba chủng L. acidophilus CRL 1259, L. paracasei subsp. paracasei CRL 1289 và L. salivarius CRL 1328 được thử nghiệm giảm từ 100,05 đến 102 CFU/g ở tất cả các điều kiện phối trộn. Mật độ sống sót sau đông khô của 2 chủng L. acidophilus CRL 1259, L. paracasei subsp. paracasei CRL 1289 đều nhỏ hơn 1011 CFU/g, điều này trái ngược với mật độ sống sót của chủng L. salivarius CRL 1328, đạt xấp xỉ 1011,7 CFU/g [117]. Trong khi đó, mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 đạt cao nhất đều lớn hơn 1011 CFU/g. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng trùng với nghiên cứu của Zayed và cộng sự, kết quả cho thấy việc phối trộn các chất bảo vệ với nhau dẫn đến mật độ sống sót của vi khuẩn tốt hơn so với việc các chất bảo vệ được sử dụng riêng lẻ [118]. Việc xác định mật độ sống sót của các chủng vi khuẩn được bảo quản ở nhiệt độ phòng theo thời gian cần kiểm tra định kì theo tháng, do thời gian có hạn nên trong khuôn khổ của luận văn này chúng tôi đã thu thập và phân tích số liệu đến thời điểm sau quá trình đông khô.

48

49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra các kết luận sau:

- Không có sự khác biệt đáng kể giữa tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri trong sữa mẹ ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri xuất hiện trong sữa mẹ ở khu vực thành thị lần lượt chiếm 40% và 13,33% trong khi đó tỉ lệ này ở khu vực nông thôn lần lượt là 43,33% và 10%. Tuy nhiên, tổng số Lactobacilli trung bình trong sữa của các bà mẹ khu vực nông thôn cao hơn khu vực thành thị (1,1x103 so với 3,0x102 CFU/mL).

- Phân lập được 35 chủng Lactobacillus spp. và tuyển chọn ra 2 chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 có hoạt tính probiotic tốt từ sữa mẹ được định hướng đưa vào sản xuất thực phẩm chức năng giành riêng cho phụ nữ.

- Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. rhamnosus SMH1 cao nhất đạt 4-5x1011CFU/g khi phối trộn 70% sinh khối với 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) và thêm Glycerol. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. reuteri SMH2 cao nhất 9-10x1011 CFU/g khi phối trộn 92,8% sinh khối với 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) và không thêm Glycerol.

KIẾN NGHỊ

- Nghiên cứu các điều kiện lên men chủng tuyển chọn ở quy mô công

nghiệp.

- Xác định mật độ sống sót của chủng vi khuẩn tuyển chọn theo thời gian và

hạn sử dụng của chế phẩm probiotics.

- Thử nghiệm lâm sàng chế phẩm sinh học probiotics chứa chủng vi khuẩn

tuyển chọn trong điều kiện in-vitro và in-vivo.

50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng việt 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

An San (2018), "Tỷ lệ phụ nữ viêm phụ khoa không giảm sau một thập niên." In. (VnExpress sức khỏe). Bùi Đình Long (2017), "Thực trạng và một số yếu tố liên quan tới viêm nhiễm đường sinh dục dưới ở phụ nữ 18 - 49 tuổi có chồng tại hai công may tỉnh Nghệ An và hiệu quả can thiệp." In. (Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương). Bùi Thị Thu Hà (2007), "Nhiễm khuẩn đường sinh sản ở phụ nữ từ 18 đến 49 tuổi phường Mai Dịch, Hà Nội 2005", Tạp chí Y học thực hành. 12, pp. 93-96. Cấn Hải Hà (2014), "Thực trạng viêm nhiễm đường sinh dục dưới ở phụ nữ 15 – 49 tuổi có chồng tại xã Kim Quan – Thạch Thất – Hà Nội và một số yếu tố liên quan." In. (Trường Đại học Y Thái Nguyên). Đào Thị Lương (2010), "Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại", Di truyền học và ứng dụng, chuyên san Công nghệ sinh học. 6, pp. 1-4. Dương Văn Hợp và Nguyễn Lân Dũng (2007), "Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật". Lê Hoài Chương (2013), "Khảo sát những nguyên nhân gây viêm nhiễm đường sinh dục dưới ở phụ nữ đến khám phụ khoa tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương", Journal of Practical Medicine. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu và Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, (Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật). Nông Thị Thu Trang (2015), "Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học viêm nhiễm đường sinh dục dưới ở phụ nữ nông thôn miền núi tỉnh Thái Nguyên và hiệu quả giải pháp can thiệp." In. Trần Thị Đức và Cao Ngọc Thành (2007), "Tình hình viêm nhiễm đường sinh dục dưới ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (15-49) tại một số xã của huyện Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa", Tạp chí Phụ sản. Số đặc biệt, pp. 181 - 193.

Tài liệu tiếng nước ngoài 11.

12.

V Sgibnev A., and A Kremleva E. (2015), "Vaginal Protection by H2O2-Producing Lactobacilli", Jundishapur journal of microbiology. 8(10), pp. e22913-e22913. Aggarwal A.K., Kumar R., Gupta V., and Sharma M. (1999 ), "Community based study of reproductive tract infections among ever married women of reproductive age in a rural area of Haryana, India", The Journal of communicable diseases. 31(4), pp. 223-228.

51

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

Allsworth J., and Peipert J. (2007), "Prevalence of bacterial vaginosis: 2001–2004 national health and nutrition examination survey data", 109(1), pp. 114-120. Ana S. Carvalhoa, Joana Silvaa, Peter Hob, Paula Teixeiraa, F.Xavier Malcataa, and Gibbsa P. (2004), "Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria", International Dairy Journal.(14), pp. 835-847. Aroutcheva A., Gariti D., Simon M., Shott S., Faro J., Simoes J.A., Gurguis A., and Faro S. (2001), "Defense factors of vaginal lactobacilli", American Journal of Obstetrics & Gynecology. 185(2), pp. 375-379. Baeten J.M., Hassan W.M., Chohan V., Richardson B.A., Mandaliya K., Ndinya- Achola J.O., Jaoko W., and McClelland R.S. (2009), "Prospective study of correlates of vaginal & lt Lactobacillus colonisation among high-risk HIV-1 seronegative women", Sexually Transmitted Infections. 85(5), p. 348. Balasingham K., Valli C., Radhakrishnan L., and Balasuramanyam D. (2017), "Probiotic characterization of lactic acid bacteria isolated from swine intestine", Veterinary world. 10(7), pp. 825-829. Boris S., and Barbés C. (2000), "Role played by lactobacilli in controlling the population of vaginal pathogens", Microbes and Infection. 2(5), pp. 543-546. Bouridane H., Sifour M., Idoui T., Annick L., and Thonard P. (2016), "Technological and Probiotic Traits of the Lactobacilli Isolated From Vaginal Tract of the Healthy Women for Probiotic Use", Iranian journal of biotechnology. 14(3), pp. 192-201. Breshears L.M., Edwards V.L., Ravel J., and Peterson M.L. (2015), "Lactobacillus crispatus inhibits growth of Gardnerella vaginalis and Neisseria gonorrhoeae on a porcine vaginal mucosa model", BMC Microbiology. 15(1), p. 276. Burton J.P., Cadieux P.A., and Reid G. (2003), "Improved understanding of the bacterial vaginal microbiota of women before and after probiotic instillation", Applied and environmental microbiology. 69(1), pp. 97-101. Casas I.A., and Dobrogosz W.J. (2000), "Validation of the Probiotic Concept: Lactobacillus reuteri Confers Broad-spectrum Protection against Disease in Humans and Animals", Microbial Ecology in Health and Disease. 12(4), pp. 247- 285. "CFU: Colony Forming Unit & Calculation." In (2011). (Technical resources in biotechnology). Chung T.C., Axelsson L., Lindgren S.E., and Dobrogosz W.J. (1989), "In Vitro Studies on Reuterin Synthesis by Lactobacillus reuteri", Microbial Ecology in Health and Disease. 2(2), pp. 137-144. Collins M.D., and Gibson G.R. (1999), "Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut", The American Journal of Clinical Nutrition. 69(5), pp. 1052s-1057s.

52

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38. Colombo M., Castilho N.P.A., Todorov S.D., and Nero L.A. (2018), "Beneficial properties of lactic acid bacteria naturally present in dairy production", BMC Microbiology. 18(1), p. 219. Coman M.M., Verdenelli M.C., Cecchini C., Silvi S., Orpianesi C., Boyko N., and Cresci A. (2014), "In vitro evaluation of antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus IMC 501®, Lactobacillus paracasei IMC 502® and SYNBIO® against pathogens", Journal of Applied Microbiology. 117(2), pp. 518-527. Cotter P.D., Ross R.P., and Hill C. (2013), "Bacteriocins - a viable alternative to antibiotics?", Nature Reviews Microbiology. 11(2), pp. 95-105. Dasari S., Kathera C., Janardhan A., Praveen Kumar A., and Viswanath B. (2017), "Surfacing role of probiotics in cancer prophylaxis and therapy: A systematic review", Clinical Nutrition. 36(6), pp. 1465-1472. DeLong K. (2017), "How Lactobacilli dominate the vaginal microbiota, thereby protecting against polymicrobial communities and other vaginal infections." In. ( Johns Hopkins University). Doron S., and Snydman D.R. (2015), "Risk and Safety of Probiotics", Clinical Infectious Diseases. 60(2), pp. S129-S134. Durchschein F., Petritsch W., and Hammer H.F. (2016), "Diet therapy for inflammatory bowel diseases: The established and the new", World journal of gastroenterology. 22(7), pp. 2179-2194. Eschenbach D.A., Davick P.R., Williams B.L., Klebanoff S.J., Young-Smith K., Critchlow C.M., and Holmes K.K. (1989), "Prevalence of hydrogen peroxide- producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis", Journal of Clinical Microbiology. 27(2), p. 251. Falagas M.E., Betsi G.I., and Athanasiou S. (2007), "Probiotics for the treatment of women with bacterial vaginosis", Clinical Microbiology and Infection. 13(7), pp. 657-664. Fefana (2005), "Microbiological interactions in the intestine." In, P.i.A. Nutrition, ed. (EU feed additives and Premixtures Association). Fettweis J.M., Brooks J.P., Serrano M.G., Sheth N.U., Girerd P.H., Edwards D.J., Strauss J.F., The Vaginal Microbiome C., Jefferson K.K., and Buck G.A. (2014), "Differences in vaginal microbiome in African American women versus women of European ancestry", Microbiology (Reading, England). 160(Pt 10), pp. 2272-2282. Flach J., van der Waal M.B., Kardinaal A.F.M., Schloesser J., Ruijschop R.M.A.J., and Claassen E. (2018), "Probiotic research priorities for the healthy adult population: A review on the health benefits of Lactobacillus rhamnosus GG and Bifidobacterium animalis subspecies lactis BB-12", Cogent Food & Agriculture. 4(1), p. 1452839. Fuller R. (1992), Probiotics - The scientific basis, (Chapman & Hall).

53

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

Gagne´ J R.D. (1993), Production of frozen and freeze dried concentrates of Bifidobacterium infantis by membrane filtration., Volume 48, ( Milchwissenchaft), p.^pp. 501-505. Gavin L., Mackay A., Brown K., Harrier S., Ventura S., Kann L., Rangel M., Berman S., Dittus P., Liddon N., et al. (2009), "Sexual and reproductive health of persons aged 10-24 Years - United States, 2002-2007", Morbidity and mortality weekly report. Surveillance summaries (Washington, D.C. : 2002). 58, pp. 1-58. Goldman A.S. (2000), "Modulation of the Gastrointestinal Tract of Infants by Human Milk. Interfaces and Interactions. An Evolutionary Perspective", The Journal of Nutrition. 130(2), pp. 426S-431S. Gorbach S., Doron S., and Magro F. (2017), "Chapter 7 - Lactobacillus rhamnosus GG". In The Microbiota in Gastrointestinal Pathophysiology, M.H. Floch, Y. Ringel and W. Allan Walker, eds, (Boston: Academic Press), pp. 79-88. Govender M., Choonara Y.E., Kumar P., du Toit L.C., van Vuuren S., and Pillay V. (2014), "A review of the advancements in probiotic delivery: Conventional vs. non- conventional formulations for intestinal flora supplementation", AAPS PharmSciTech. 15(1), pp. 29-43. Gratia A. (1925), "Sur un remarquable example d’antagonisme entre deux souches de colibacille", Compt. Rend. Soc. Biol. 93, pp. 1040–1042. Graver M.A., and Wade J.J. (2011), "The role of acidification in the inhibition of Neisseria gonorrhoeae by vaginal lactobacilli during anaerobic growth", Annals of clinical microbiology and antimicrobials. 10, pp. 8-8. Habeb K.A., and Seddiq S.H. (2016), "Influence of temperature and pH on the growth of Lactobacillus reuteri ATCC 23272 using optical density assay", Journal of Microbial & Biochemical Technology. 5th International Conference on Microbial Physiology and Genomics. Heikkilä M.P., and Saris P.E.J. (2003), "Inhibition of Staphylococcus aureus by the commensal bacteria of human milk", Journal of Applied Microbiology. 95(3), pp. 471-478. Hill C., Guarner F., Reid G., Gibson G.R., Merenstein D.J., Pot B., Morelli L., Canani R.B., Flint H.J., Salminen S., et al. (2014), "The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic", Nature Reviews Gastroenterology &Amp; Hepatology. 11, p. 506. Kaewnopparat S., Dangmanee N., Kaewnopparat N., Srichana T., Chulasiri M., and Settharaksa S. (2013), "In vitro probiotic properties of Lactobacillus fermentum SK5 isolated from vagina of a healthy woman", Anaerobe. 22, pp. 6-13.

54

50.

51.

52.

Kalliomäki M., Salminen S., Arvilommi H., Kero P., Koskinen P., and Isolauri E. (2001), "Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo- controlled trial", The Lancet. 357(9262), pp. 1076-1079. Laughton J.M., Devillard E., Heinrichs D.E., Reid G., and McCormick J.K. (2006), "Inhibition of expression of a staphylococcal superantigen-like protein by a soluble factor from Lactobacillus reuteri", 152(4), pp. 1155-1167. LeBlanc J.G., Chain F., Martín R., Bermúdez-Humarán L.G., Courau S., and Langella P. (2017), "Beneficial effects on host energy metabolism of short-chain fatty acids and vitamins produced by commensal and probiotic bacteria", Microbial Cell Factories. 16(1), p. 79.

53. Ma B., Forney L.J., and Ravel J. (2012), "Vaginal microbiome: rethinking health

and disease", Annual review of microbiology. 66, pp. 371-389.

54. Mackie R.I., Sghir A., and Gaskins H.R. (1999), "Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract", The American Journal of Clinical Nutrition. 69(5), pp. 1035s-1045s.

55. Macklaim J.M., Clemente J.C., Knight R., Gloor G.B., and Reid G. (2015), "Changes in vaginal microbiota following antimicrobial and probiotic therapy", Microbial Ecology in Health and Disease. 26, pp. 27799-27799.

56. Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B., Koonin E., Pavlov A., Pavlova N., Karamychev V., Polouchine N., et al. (2006), "Comparative genomics of the lactic acid bacteria", Proceedings of the National Academy of Sciences. 103(42), p. 15611.

57. Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B., Koonin E., Pavlov A., Pavlova N., Karamychev V., Polouchine N., et al. (2006), "Comparative genomics of the lactic acid bacteria", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103(42), pp. 15611-15616.

58. Martín R., and Suárez J.E. (2010), "Biosynthesis and Degradation of H2O2 by Vaginal Lactobacilli", Applied and environmental microbiology. 76(2), p. 400. 59. Martín R., Olivares M., Marín M.L., Fernández L., Xaus J., and Rodríguez J.M. (2005), "Probiotic Potential of 3 Lactobacilli Strains Isolated From Breast Milk", Journal of Human Lactation. 21(1), pp. 8-17.

60. Mastromarino P., Macchia S., Meggiorini L., Trinchieri V., Mosca L., Perluigi M., and Midulla C. (2009), "Effectiveness of Lactobacillus-containing vaginal tablets in the treatment of symptomatic bacterial vaginosis", Clinical Microbiology and Infection. 15(1), pp. 67-74.

61. Matu M.N., Orinda G.O., Njagi E.N.M., Cohen C.R., and Bukusi E.A. (2010), "In vitro inhibitory activity of human vaginal lactobacilli against pathogenic bacteria associated with bacterial vaginosis in Kenyan women", Anaerobe. 16(3), pp. 210- 215.

55

62. McLean N.W., and Rosenstein I.J. (2000), "Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis", 49(6), pp. 543-552.

63. McNabney S.M., and Henagan T.M. (2017), "Review: Short Chain Fatty Acids in the Colon and Peripheral Tissues: A Focus on Butyrate, Colon Cancer, Obesity and Insulin Resistance", Nutriens. 9(12).

64. Miller M. (1982), "Lactobacillus sp 01.png", Centers for Disease Control and

Prevention's Public Health Image Library (PHIL).

66.

67.

68. 69.

70.

71.

72.

73.

74.

75.

65. Morikawa M., Kagihiro S., Haruki M., Takano K., Branda S., Kolter R., and Kanaya S. (2006), "Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces γ- polyglutamate", 152(9), pp. 2801-2807. Nall R. (2018), "Vaginal pH balance: Symptoms, remedies, and tests." In Medical news today. Nardini P., Ñahui Palomino R.A., Parolin C., Laghi L., Foschi C., Cevenini R., Vitali B., and Marangoni A. (2016), "Lactobacillus crispatus inhibits the infectivity of Chlamydia trachomatis elementary bodies, in vitro study", Scientific reports. 6, pp. 29024-29024. Nielsen S.S. (2017), Food Science (Springer). Nugent R.P., Krohn M.A., and Hillier S.L. (1991), "Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation", Journal of Clinical Microbiology. 29(2), p. 297. O'Hanlon D.E., Moench T.R., and Cone R.A. (2011), "In vaginal fluid, bacteria associated with bacterial vaginosis can be suppressed with lactic acid but not hydrogen peroxide", BMC infectious diseases. 11, pp. 200-200. O'Hanlon D.E., Moench T.R., and Cone R.A. (2011), "In vaginal fluid, bacteria associated with bacterial vaginosis can be suppressed with lactic acid but not hydrogen peroxide", BMC infectious diseases. 11(1), p. 200. O'Toole G.A., and Kolter R. (1998), "Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development", Molecular Microbiology. 30(2), pp. 295-304. Ooi L.-G., and Liong M.-T. (2010), "Cholesterol-lowering effects of probiotics and prebiotics: a review of in vivo and in vitro findings", International journal of molecular sciences. 11(6), pp. 2499-2522. Osset J., Bartolomé R.M., García E., and Andreu A. (2001), "Assessment of the Capacity of Lactobacillus to Inhibit the Growth of Uropathogens and Block Their Adhesion to Vaginal Epithelial Cells", The Journal of Infectious Diseases. 183(3), pp. 485-491. Ouwehand A.C. (2007), "Antiallergic Effects of Probiotics", The Journal of Nutrition. 137(3), pp. 794S-797S.

56

76.

77.

78. 79.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

87.

88.

89.

90.

Özdemir Ö., and Erol A.Y.G. (2013), "Preventative and therapeutic probiotic use in allergic skin conditions: experimental and clinical findings", BioMed research international. 2013, pp. 932391-932391. P.A C. (2006), " Identification of anti-infective signals from lactobacilli." In. (University of Western Ontario, Canada). "Phosphate buffered saline." In ( 2008). Picciano M.F. (2001), "Nutrient Composition of Human Milk", Pediatric Clinics of North America. 48(1), pp. 53-67. "Probiotics: In Depth." In (2018). (National Center for Complementary and Integrative Health). Reuter G. (2001), "The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession", Current issues in intestinal microbiology. 2, pp. 43-53. Rijkers G.T., de Vos W.M., Brummer R.-J., Morelli L., Corthier G., and Marteau P. (2011), "Health benefits and health claims of probiotics: bridging science and marketing", British Journal of Nutrition. 106(9), pp. 1291-1296. Saikusa T., Horino T., and Mori Y. (1994), "Distribution of Free Amino Acids in the Rice Kernel and Kernel Fractions and the Effect of Water Soaking on the Distribution", Journal of Agricultural and Food Chemistry. 42(5), pp. 1122-1125. Savini M., Cecchini C., Verdenelli M.C., Silvi S., Orpianesi C., and Cresci A. (2010), "Pilot-scale production and viability analysis of freeze-dried probiotic bacteria using different protective agents", Nutrients. 2(3), pp. 330-339. Savino F., Pelle E., Palumeri E., Oggero R., and Miniero R. (2007), "Lactobacillus reuteri (American Type Culture Collection Strain 55730) Versus Simethicone in the Treatment of Infantile Colic: A Prospective Randomized Study", Pediatrics. 119(1), p. e124. Schieber M., and Chandel N.S. (2014), "ROS function in redox signaling and oxidative stress", Current biology : CB. 24(10), pp. R453-R462. Shornikova A.-V., Casas I.A., Isolauri E., Mykkänen H., and Vesikari T. (1997), "Lactobacillus reuteri as a Therapeutic Agent in Acute Diarrhea in Young Children", 24(4), pp. 399-404. Sieber R., Stransky M., and Vrese M.d. (1997 Dec), "Lactose intolerance and consumption of milk and milk products", Z Ernahrungswiss. 36(4), pp. 375-393. Simoes J.A., Aroutcheva A., Heimler I., Shott S., and Faro S. (2001), "Bacteriocin susceptibility of Gardnerella vaginalis and its relationship to biotype, genotype, and metronidazole susceptibility", American Journal of Obstetrics & Gynecology. 185(5), pp. 1186-1190. Singhi S.C., and Kumar S. (2016), "Probiotics in critically ill children", F1000Research. 5, pp. F1000 Faculty Rev-1407.

57

91.

92.

‐

93.

94.

95.

96.

97.

98.

99.

Sinkiewicz G., and Ljunggren L. (2008), "Occurrence of Lactobacillus reuteri in human breast milk", Microbial Ecology in Health and Disease. 20(3), pp. 122-126. Skarin A., and Sylwan J. (1986), "Vaginal Lactobacilli inhibiting growth of Gardnerella vaginalis, Mobiluncus and other bacterial species cultured from vaginal content of women with bacterial vaginosis", Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Series B Microbiology. 94B(1 6), pp. 399-403. Strus M., Kucharska A., Kukla G., Brzychczy-Włoch M., Maresz K., and Heczko P.B. (2005), "The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida. Infect Dis Obstet Gynecol", Infect Dis Obstet Gynecol. 13, pp. 69- 75. Strus M., Malinowska M., and Heczko P.B. (2002), "In vitro antagonistic effect of Lactobacillus on organisms associated with bacterial vaginosis", The Journal of reproductive medicine. 47(1), pp. 41-46. Succi M., Tremonte P., Reale A., Sorrentino E., Grazia L., Pacifico S., and Coppola R. (2005), "Bile salt and acid tolerance of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese", FEMS Microbiology Letters. 244(1), pp. 129- 137. Todorov S.D., Vaz-Velho M., and Gibbs P. (2004), "Comparison of two methods for purification of plantaricin ST31, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum ST31", Brazilian Journal of Microbiology. 35, pp. 157-160. Todorov S.D., Furtado D.N., Saad S.M.I., Tome E., and Franco B.D.G.M. (2011), "Potential beneficial properties of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from smoked salmon", Journal of Applied Microbiology. 110(4), pp. 971- 986. "Turn Up the Heat: Bacterial Spores Can Take Temperatures in the Hundreds of Degrees". Valeur N., Engel P., Carbajal N., Connolly E., and Ladefoged K. (2004), "Colonization and Immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the Human Gastrointestinal Tract", Applied and environmental microbiology. 70(2), p. 1176.

100. Valík Ľ., Medveďová A., and Liptakova D. (2008), "Characterization of the growth of Lactobacillus rhamnosus GG in milk at suboptimal temperatures", Journal of food and nutrition research. 47, pp. 60-67.

101. Valík Ľ., Medveďová A., Čižniar, and Liptáková D. (2013), "Evaluation of temperature effect on growth rate of Lactobacillus rhamnosus GG in milk using secondary models", Chemical Papers. 67, pp. 737-742.

102. Vanderpool C., Yan F., and Polk B.D. (2008), "Mechanisms of probiotic action: Implications for therapeutic applications in inflammatory bowel diseases", Inflammatory Bowel Diseases. 14(11), pp. 1585-1596.

58

103. Verdenelli M.C., Cecchini C., Coman M.M., Silvi S., Orpianesi C., Coata G., Cresci A., and Renzo G.C. (2016), "Impact of Probiotic SYNBIO® Administered by Vaginal Suppositories in Promoting Vaginal Health of Apparently Healthy Women", Current Microbiology. 73(4), pp. 483-490.

104. Verdenelli M.C., Ghelfi F., Silvi S., Orpianesi C., Cecchini C., and Cresci A. (2009), "Probiotic properties of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei isolated from human faeces", European Journal of Nutrition. 48(6), pp. 355-363.

105. Vigneshwari R. S. , Rambabu, Jeyaseelan Senthinath T. , Revathi P., and S. D.A.U. (2014), "Role Of Probiotics In The Treatment Of Bacterial Vaginosis", International Journal of Science and Research. 3(4).

106. Vlková E., Rada V., Popelářová P., Trojanová I., and Killer J. (2006), "Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria isolated from gastrointestinal tract of calves", Livestock Science. 105(1), pp. 253-259.

107. Voravuthikunchai S.P., Bilasoi S., and Supamala O. (2006), "Antagonistic activity against pathogenic bacteria by human vaginal lactobacilli", Anaerobe. 12(5), pp. 221-226.

108. Wagner R.D., Pierson C., Warner T., Dohnalek M., Farmer J., Roberts L., Hilty M., and Balish E. (1997), "Biotherapeutic effects of probiotic bacteria on candidiasis in immunodeficient mice", Infection and Immunity. 65(10), p. 4165.

109. Wang L., Guo M.-J., Gao Q., Yang J.-F., Yang L., Pang X.-L., and Jiang X.-J. (2018), "The effects of probiotics on total cholesterol: A meta-analysis of randomized controlled trials", Medicine. 97(5), pp. e9679-e9679.

110. Weese J.S., and Martin H. (2011), "Assessment of commercial probiotic bacterial contents and label accuracy", The Canadian veterinary journal = La revue veterinaire canadienne. 52(1), pp. 43-46.

111. Weizman Z., Asli G., and Alsheikh A. (2005), "Effect of a Probiotic Infant Formula on Infections in Child Care Centers: Comparison of Two Probiotic Agents", Pediatrics. 115(1), p. 5.

112. Wilks M., Wiggins R., Whiley A., Hennessy E., Warwick S., Porter H., Corfield A., and Millar M. (2004), "Identification and H2O2 Production of Vaginal Lactobacilli from Pregnant Women at High Risk of Preterm Birth and Relation with Outcome", Journal of Clinical Microbiology. 42(2), p. 713.

113. Yan F., and Polk D.B. (2011), "Probiotics and immune health", Current opinion in

gastroenterology. 27(6), pp. 496-501.

114. Yang G., Liu Z.-Q., and Yang P.-C. (2013), "Treatment of allergic rhinitis with probiotics: an alternative approach", North American journal of medical sciences. 5(8), pp. 465-468.

59

115. Yirga H. (2015), "The Use of Probiotics in Animal Nutrition", Journal of

Probiotics & Health. 03.

117.

118.

116. Yu B., J. R. Liu, F. S. Hsiao, T. T. Lee, and P. W. S. Chiou (2008), "The Probiotic and Adherence Properties of Lactobacillus reuteri Pg4 Expressing the Rumen Microbial β-Glucanase ", Asian-Australasian Journal of Animal Science. 21, pp. 1324-1329. Za´rate G., and Nader-Macias M.a.E. (2006), "Viability and biological properties of probiotic vaginal lactobacilli after lyophilization and refrigerated storage into gelatin capsules", Process Biochemistry. 41(8), pp. 1779-1785. Zayed G., and Roos Y.H. (2004), "Influence of trehalose and moisture content on survival of Lactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage", Process Biochemistry. 39(9), pp. 1081-1086.

119. Boris S., Suárez J.E., Vázquez F., and Barbés C. (1998), "Adherence of Human Vaginal Lactobacilli to Vaginal Epithelial Cells and Interaction with Uropathogens", Infection and Immunity. 66(5), p. 1985.

120. Bozoglu T.F., and Guraka G.C. (1989), "Freeze-Drying Injury of Lactobacillus

acidophilus", Journal of Food Protection. 52, pp. 259-260.

121. Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X., and Gibbs P. (2004), "Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria", International Dairy Journal. 14, pp. 835-847.

122. Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X., and Gibbs P. (2002), "Survival of freeze-dried Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus during storage in the presence of protectants", Biotechnology Letters. 24(19), pp. 1587-1591.

123. Castro H., Teixeira P., and Kirby R. (1996), "Changes in the membrane of Lactobacillus bulgaricus during storage following freeze-drying", Biotechnology Letters. 18, pp. 99-104.

125.

126.

124. Ray B., and Johnson M.C. (1986), "Freeze-drying injury of surface layer protein and its protection in Lactobacillus acidophilus", CryoLetters. 7, pp. 210-216. Selmer-Olsen E., Birkeland S.E., and Sørhaug T. (1999), "Effect of protective solutes on leakage from and survival of immobilized Lactobacillus subjected to drying, storage and rehydration", Journal of Applied Microbiology. 87(3), pp. 429- 437. Talarico T.L., and Dobrogosz W.J. (1989), "Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri", Antimicrobial agents and chemotherapy. 33(5), p. 674.

60

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Bản thỏa thuận cung cấp mẫu cho nghiên cứu – Consent form BỘ Y TẾ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU HỆ VI SINH VẬT TRONG SỮA MẸ

Họ tên của người tham gia nghiên cứu: ……………………………………………........

Địa chỉ: ………………………………………………………………………………….

Quận/huyện: …………………………………………………………………………

Xã/phường: …………………………………………………………………..............

Thôn/khu phố: ……………………………………………………………….............

Tổ dân phố/xóm ……………………………………………………………..............

Tôi là người tự nguyện tham gia vào nghiên cứu này. Tôi đã được giải thích về bản chất, quá trình tiến hành và mục đích của nghiên cứu cũng như những phương pháp, phương tiện mà qua đó nghiên cứu được tiến hành; và những rủi ro, nguy cơ, lợi ích đã được thông báo cho tôi biết trước. Những câu hỏi của tôi về việc tham gia vào nghiên cứu này đã được trả lời đầy đủ và thỏa mãn những thắc mắc của tôi.

Tôi cho phép nhóm nghiên cứu sử dụng phân tích và báo cáo dữ liệu của tôi sau khi đã được mã hóa. Tôi hiểu rằng tôi có quyền nhận lại thông tin của mình để xem xét và thực hiện bất kỳ thay đổi nào nếu cần thiết. Tôi cho phép cán bộ nghiên cứu liên hệ với tôi theo số điện thoại của tôi là:……………………………………………………...

[ ] Chấp thuận tham gia nghiên cứu này.

[ ] Chấp thuận lấy mẫu cho nghiên cứu.

[ ] Chấp thuận cho phép sử dụng mẫu của tôi cho nghiên cứu này và các nghiên cứu trong tương lai.

Chữ ký của người tham gia nghiên cứu:………………………………………………...

Ngày:____/____/201 Vào hồi:____:____

Tuyên bố của cán bộ nghiên cứu lấy phiếu chấp thuận:

Tôi đã trình bày về bản chất, nội dung và các yêu cầu của chương trình nghiên cứu cho người tham gia nghiên cứu ghi ở trên, trả lời đầy đủ các câu hỏi của người tham gia nghiên cứu và chứng kiến việc hoàn thành phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu này.

Chữ ký của cán bộ nghiên cứu lấy phiếu chấp thuận:…………………………………..

Họ tên:…………………………………………………………………………………..

Chức vụ:…………………………………………………………………………………

Ngày:____/____/201 Vào hồi:____:____

ID: ______________

BỘ CÂU HỎI PHỎNG VẤN BÀ MẸ CUNG CẤP MẪU SỮA MẸ

phỏng

điểm

điều

Ngày vấn ................................................................................................................. Địa tra ................................................................................................................ Ghi chú: Điều tra viên hỏi trực tiếp, khoanh tròn vào đáp án mà đối tượng trả lời (chú ý có câu hỏi một lựa chọn hoặc nhiều lựa chọn)

STT

Câu hỏi

Trả lời

Phần I: Thông tin chung

Chị sinh ngày tháng năm nào?

1

Chị là người dân tộc nào?

Kinh

2

Khác (ghi rõ) …………….…………………..

Nghề nghiệp

3

Đã kết hôn

4

Tình trạng hôn nhân hiện tại của chị là gì?

Ly thân

Ly dị

Góa

Khác (ghi rõ) ...………………………………..

5

Hiện nay, chị đang sống với ai?

Chồng

Người yêu/bạn tình

Một mình

Sống với bạn

Không cố định/lang thang

Khác (ghi rõ):………………………………….

Nơi ở của chị

Nhà riêng

6

Nhà thuê/trọ

7

Chị đã sinh mấy cháu và cháu gần đây nhất cách đây bao lâu?

Ghi rõ : ………………………………………

Phần II: Hành vi sức khỏe và lối sống

Có hút

Chị đã bao giờ hút thuốc chưa?

1

Không hút

2

Nếu có hút, thì chị hút thuốc từ khi nào?

Rất thường xuyên (hàng ngày)

3

Thường xuyên (3-5 lần/tuần)

Thỉnh thoảng (1-2 lần/tuần)

Trong quá trình mang thai và sau khi sinh con, chị có thường xuyên hút thuốc không? (Chỉ khoanh một lựa chọn)

Hiếm khi (1-2 lần/tháng)

Không hút thuốc

4

Có

Không

Trong quá trình mang thai và sau khi sinh con chị có sống/ làm việc cùng với người hút thuốc lá không?

Hàng ngày

Hầu hết các ngày

Thỉnh thoảng (1-2 lần)

Trong quá trình mang thai và sau khi sinh con, chị có thường xuyên uống rượu bia không? (Chỉ khoanh một lựa chọn)

5

Hiếm khi 1-2 lần/tháng

Không uống rượu/bia

Có

Không

Trong quá trình cho con bú, chị có sử dụng thuốc kháng sinh không (có thì ghi rõ)

6

Khác (ghi rõ):………………………………..

Có

Không

Trong quá trình cho con bú, chị có sử dụng các chế phẩm sinh học probiotics không (có thì ghi rõ)

7

Khác (ghi rõ):………………………………..

Có

8

Không

Khác (ghi rõ): ………………………………..

Trong quá trình mang thai hoặc cho con bú, chị có từng bị mắc các bệnh có khả năng lây qua sữa ( HIV, lao, thủy đậu, mẹ Herpes Cytomegalo virus, simplex,….) không?

Phần III. Kiến thức về hệ vi sinh vật trong sữa mẹ trước khi tham gia nghiên cứu

Có

1

Chưa

Trước khi tham gia nghiên cứu này, chị đã từng bao giờ nghe nói về hệ vi sinh vật trong sữa mẹ chưa?

Gồm các loại vi rút

Theo chị, hệ vi sinh vật trong sữa mẹ gồm những thành phần nào?

Gồm các loại vi khuẩn

(Có thể khoanh nhiều lựa chọn)

Gồm các loại ký sinh trùng

Gồm các loại nấm.

2

Khác (ghi rõ): …………………………………

Không biết

Có

3

Không

Theo chị, hệ vi sinh vật trong sữa mẹ có gây ra nguy hiểm không?

Không biết

Có

Không

Theo chị, hệ vi sinh vật trong sữa mẹ có lợi ích không?

4

Không biết

Do cơ thể mẹ tự tiết ra

Do các yếu tố môi trường tác động

Theo chị, các vi sinh vật trong sữa mẹ có từ đâu?

Do nhiễm trùng từ vi sinh vật môi trường

(Có thể khoanh nhiều lựa chọn)

Do tác động của các thực phẩm chức năng và sản phẩm hỗ trợ

Khác (ghi rõ): ………………………………...

5

Không biết

Trân trọng cảm ơn sự tham gia của chị!

Đánh giá mức độ hoàn thành bộ câu hỏi:

Hoàn toàn hợp tác

Không hợp tác

Khác (ghi rõ) …………………….

NGÀY PHỎNG VẤN: ____/____ / 201…

GIÁM SÁT VIÊN ĐÃ KIỂM TRA:

Tên giám sát viên:

_______________________________

Chữ ký:

_______________________________

Phụ lục 2. Lượng axit lactic sinh ra của các chủng L. reuteri và Lactobacillus spp. (Giá trị độ lệch chuẩn)

Lượng axit lactic (g/100 mL)

STT 0 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 24 giờ 28 giờ 32 giờ 36 giờ Ký hiệu các chủng thuộc loài L. reuteri

0,0027

0,0406

0,0156

0,0227

0,0156

0,0104

SMH2

1

0,0025

0,0403

0,0150

0,0240

0,0160

0,0109

0,0138 0,0140

0,0142 0,0145

SMH3

2

SMH4

0,0024

0,0410

0,0210

0,0260

0,0180

0,0107

0,0145

0,0143

3

SMH5

0,0032

0,0410

0,0230

0,022

0,0170

0,0120

0,0128

0,0124

4

SMH6

0,0227

0,0156

0,0104

0,0138

0,0142

0,0027

0,0406

0,0156

5

SMH7

0,0240

0,0160

0,0109

0,0140

0,0145

0,0025

0,0403

0,0150

6

SMH8

0,0260

0,0180

0,0107

0,0145

0,0143

0,0024

0,0410

0,0210

7

SMH9

0,0220

0,0170

0,0120

0,0128

0,0124

0,0032

0,0410

0,0230

8

Lượng axit lactic (g/100 mL)

STT 0 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 24 giờ 28 giờ 32 giờ 36 giờ

Ký hiệu các chủng Lactobacillu s spp.

0,0017

0,0401

0,0126

0,0129

0,0135

0,0101

9

SMH1 SMH10

0,0019

0,0302

0,0104

0,0242

0,0116

0,0123

0,0123 0,0143

0,0122 0,0155

10

SMH11

0,0021

0,0401

0,0221

0,0246

0,0118

0,0107

0,0155

0,0153

11

SMH12

0,0030

0,0411

0,0213

0,0222

0,0137

0,0112

0,0121

0,0134

12

SMH13

0,0207

0,0126

0,0103

0,0141

0,0132

0,0017

0,0416

0,0136

13

SMH14

0,0241

0,0162

0,0108

0,0142

0,0138

0,0029

0,0423

0,0157

14

SMH15

0,0261

0,0185

0,0117

0,0125

0,0133

0,0014

0,0412

0,0215

15

SMH16

0,0223

0,0171

0,0121

0,0118

0,0104

0,0025

0,0409

0,0231

16

SMH17

0,0017

0,0433

0,0167

0,0212

0,0106

0,0114

0,0128

0,0112

17

SMH18

0,0015

0,0413

0,0135

0,0234

0,0176

0,0119

0,0149

0,0140

18

SMH19

0,0011

0,0412

0,0218

0,0263

0,0185

0,0107

0,0145

0,0142

19

SMH20

0,0002

0,0416

0,0233

0,0227

0,0157

0,0123

0,0118

0,0121

20

21

SMH21

0,0223

0,0155

0,0104

0,0138

0,0112

0,0027

0,0406

0,0156

22

SMH22

0,0242

0,0160

0,0109

0,0143

0,0125

0,0025

0,0403

0,0215

23

SMH23

0,0261

0,0182

0,0107

0,0145

0,0113

0,0024

0,0241

0,0121

24 25 26 27

SMH24 SMH25 SMH26 SMH27

0,0220 0,0022 0,0013 0,0021

0,0173 0,0416 0,0413 0,0412

0,0120 0,0146 0,0135 0,0211

0,0128 0,0227 0,0241 0,0260

0,0104 0,0106 0,0160 0,0183

0,0032 0,0104 0,0109 0,0107

0,0141 0,0138 0,0114 0,0145

0,0023 0,0142 0,0145 0,0143

28

SMH28

0,0012

0,0410

0,0233

0,0223

0,0171

0,0121

0,0128

0,0124

29

SMH29

0,0217

0,0145

0,0114

0,0138

0,0112

0,0027

0,0406

0,0156

30

SMH30

0,0246

0,0161

0,0109

0,0142

0,0135

0,0025

0,0403

0,0015

31

SMH31

0,0260

0,0157

0,0127

0,0145

0,0123

0,0024

0,0201

0,0121

32

SMH32

0,0223

0,0110

0,0112

0,0128

0,0114

0,0032

0,0331

0,0223

33

SMH33

0,0242

0,0161

0,0109

0,0141

0,0105

0,0025

0,0403

0,0215

34

SMH34

0,0261

0,0118

0,0107

0,0145

0,0131

0,0024

0,0312

0,0121

35

SMH35

0,0220

0,0107

0,0112

0,0128

0,0126

0,0032

0,0418

0,0023

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thanh Hiền, Nguyễn Phương Anh, Trần Thị Thanh Huyền, Mai Thị Đàm Linh, Phạm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Thị Việt Hà (2019), “Đặc tính probiotic của chủng Lactobacillus reuteri SMH2 phân lập từ sữa mẹ”. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2019.