Luận văn Thạc sĩ Hóa học phân tích: Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của Polysaccharide Sulfate được phân lập từ rong nâu Sargassum microcystum

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân và tham khảo thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn này.

Nha Trang, ngày 25 tháng 12 năm 2020

Tác giả luận văn

Trần Nữ Ngọc Minh

Lời cảm ơn

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè.

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân đã gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành đề tài này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tổ chức công tác giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện luận văn và các thủ tục cần thiết.

Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh chị em công tác tại phòng Hóa Phân tích đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên, giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Sở Y tế Ninh Thuận, Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Ninh Thuận đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thời gian học tập và nghiên cứu, hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.

Nha Trang, ngày 25 tháng 12 năm 2020

Xin chân thành cảm ơn!

Trần Nữ Ngọc Minh

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

13C-NMR

Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN Carbon 13

Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân COSY

Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid DMSO

Axit 4,4-dimethyl-4- silapentane-1-sulfonic

4,4-dimethyl-4- silapentane-1-sulfonic acid DSS

Ethanol Ethanol EtOH

Electron Spray Ionization - Mass Phổ khối ion hóa bằng nguồn mù electron ESI-MS

Electron Spray Ionization - Mass/Spray Ionization - Mass Phổ khối ion hóa bằng nguồn mù electron hai lần ESI-MS/MS

Fucose Đường fucose Fuc

Fucofuranose Fucofuranose Fucf

Fucopyranose Fucopyranose Fucp

Galactose Đường galactose Gal

GlaNA N-Acetylgalactosamine

Đường N- Acetylgalactosamine

Gel permeation chromatography Sắc ký lọc gel GPC

Glucose Đường glucose Gluc

Glucuronic Axit Axit glucuronic GlucA

Sắc ký lỏng cao áp HPLC

High Performance Liquid Chromatography

HSQC

1H-NMR

Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị nhân qua một liên kết

Phổ CHTHN proton

Proton NMR Spectroscopy

Phổ hồng ngoại IR

Infrared Spectroscopy desorption/ionization

Mannose Đường mannose Man

Methanol Methanol MeOH

NMR

Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN)

Trifluoroacetic axit Axit trifluoroacetic TFA

Tetra metyl silan Tetra metyl silan TMS

Xylose Đường xylose Xyl

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. ...................... 11

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số Fucoidan .................................... 18

Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lượng phân tử của Fucoidan .............................. 25

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các Fucoidan từ một số loài rong nâu…….. 30

Bảng 1.5. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu Fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam …………………………….36

Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu Fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD ……………………………38

Bảng 2.1. Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm…………………………………...47

Bảng 3.1. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực biển khác nhau…………………………………………………………..50

Bảng 3.2. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 06 loài rong nâu Việt Nam……51

Bảng 3.3. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 07 loài rong nâu thế giới...……52

Bảng 3.4. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực biển khác nhau..........................................................................................54

Bảng 3.5. Thành phần hóa học mẫu Fucoidan chiết từ rong S.microcystum..55

Bảng 3.6. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu Fucoidan phân lập từ 6 loài cùng chi với S.microcystum rong nâu Việt Nam………………………………………………………………………….56

Bảng 3.7. Hàm lượng thu nhận các phân đoạn Fucoidan…………………...59

Bảng 3.8.Thành phần hóa học các phân đoạn chiết từ rong S.microcystum...62

Bảng 3.9. Một số mảnh đặc trưng trên phổ ESI-MS của Fucoidan………….72

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Biểu đồ so sánh các ngành rong trên Thế giới……………………..8

Hình 1.2. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh Hòa ...................................................................................................... 14

Hình 1.3. Cấu trúc của Fucoidan từ F.vesiculosus được mô tả vào năm 1950 ......................................................................................................................... 19

Hình 1.4. Cấu trúc của Fucoidan có sunfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome được mô tả vào năm 1991 ........................................... 20

Hình 1.5. Cấu trúc Fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme..........................................................................................................21

Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A.nodusum ....................................................................................................... 21

Hình 1.7. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus ................................................................................ 22

Hình 1.8. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Chorda filum ................................................................................................... 23

Hình 1.9. Cấu trúc Fucoidan từ Fucus serratus. ............................................. 24

Hình 1.10. Cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum polycystum. ....................... 34

Hình 1.11. Mảnh cấu trúc cơ bản Fucoidan chiết tách từ rong Turbinaria decurrens ......................................................................................................... 37

Hình 1.12. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium .39

Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum microcystum ................................................. 40

Hình 2.2. Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) ........... 41

Hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của k thuật ion hóa ESI-MS .......................45

Hình 2.4. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate……………………………...46

Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate……………………………46

Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn…………………53

Hình 3.2. Phân đoạn Fucoidan được chiết từ rong S.microcystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose……………………………………...59

Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F1…………………………………………………………………………….60

Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F3…………………………………………………………………………….61

Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F4…………………………………………………………………………….61

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F5..61

Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu Fucoidan thô được chiết tách từ rong Sargassum microcystum……………………………………………………..65

Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4 S.microcystum....................66

Hình 3.9a. Phổ 1H-NMR của F4......................................................................67

Hình 3.9b. Phổ 13C-NMR của F4....................................................................68

Hình 3.10. Phổ HSQC phân đoạn F4..............................................................70

Hình 3.11. Phổ ESI-MS của phân đoạn F4....................................................72

Hình 3.12. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]-, m/z 243……………………74

Hình 3.13. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]-, m/z 389…………………...75

Hình 3.14. Phổ ESIMS/MS của ion [FucGalSO3]-, m/z 405………………..76

Hình 3.15. Sự phân mảnh của Fucoidan từ rong nâu Sargassum microcystum dựa vào phổ ESI-MS/MS……………………………………………………78

Hình 3.16. Cấu trúc của Fucoidan F4 từ rong nâu Sargassum microcystum..79

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 7

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU ............................................................. 7

1.1.1. Giới thiệu về rong biển ...................................................................... 7

1.1.2. Giới thiệu về rong nâu ..................................................................... 12

1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới ............................... 12

1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam ................................. 12

1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu .................................................. 15

1.1.3.1. Polysaccharide ............................................................................. 15

1.1.3.2. Một số hợp chất khác ................................................................... 16

1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN ........................................................... 17

1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan ......................................................... 17

1.2.2. Thành phần hóa học của Fucoidan trong một số loài rong nâu ...... 17

1.2.3. Cấu trúc hóa học của Fucoidan ....................................................... 19

1.2.4. Tính chất hóa lý của Fucoidan ........................................................ 24

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của Fucoidan ................................ 25

1.2.5.1. oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối ...................... 25

1.2.5.2. oạt t nh chống virus ................................................................... 26

1.2.5.3. oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch .................................... 26

1.2.5.4. oạt t nh chống ox hóa .............................................................. 27

1.2.5.5. Giảm lipid máu ............................................................................. 27

1.2.5.6. Kháng viêm ................................................................................... 27

1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan ........................................................... 28

1.2.5.8. oạt t nh kháng khuẩn ................................................................. 28

2

1.2.5. . ác d ng giảm l ợng ng hu ết trong máu. ............................ 28

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ................. 29

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................. 29

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ................................................... 32

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................................................................................. 40

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 40

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 40

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn Fucoidan ............................. 40

2.2.1.1. Ph ơng pháp chiết tách Fucoidan từ rong nâu ........................... 40

2.2.1.2. Ph ơng pháp phân oạn Fucoidan .............................................. 40

2.2.2. Phương pháp phân tích cấu trúc của Fucoidan ............................... 41

2.2.2.1. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate ................ 41

2.2.2.2. Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide ................... 41

2.2.2.3. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate ................................... 42

2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axit ............................ 42

2.2.2.5. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR ................................................. 42

2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR ........................ 42

2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ MS ................................................................... 45

2.3. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 47

2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế Fucoidan từ rong nâu ................. 47

2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate.......................................... 48

2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide ............................................ 48

2.3.4. Phân tích hàm lượng sulfate ............................................................ 49

3

2.3.5. Phân tích hàm lượng uronic axit ..................................................... 49

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 50

3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU ........ 50

3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................... 53

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn ................................................................... 53

3.2.2. Phân tích thành phần hóa học của Fucoidan ................................... 54

3.2.3. Tách phân đoạn và thành phần hóa học các phân đoạn Fucoidan .. 58

3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE ..... 64

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 80

4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 80

4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 82

4

MỞ ĐẦU

Theo các tài liệu thống kê, Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong 25 quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới với dự tính có thể có tới 20.000-30.000 loài thực vật. Việt Nam được xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học (chiếm 6,5% số loài có trên thế giới). Với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong biển đa dạng và phong phú[1,2,3].

Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn, dài và có sinh lượng lớn. Vì vậy, rong nâu được coi là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu, thực phẩm chức năng và m phẩm. Trong các ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng làm nguồn nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao gồm Fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,… với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [4,5,6].

Trong số đó, Fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Fucoidan là tên gọi chung cho các polysaccharide sulfate có trong thành phần của rong nâu. Từ hơn 100 năm qua kể từ lần đầu tiên Fucoidan được phát hiện trong thành phần của rong nâu bởi Kylin và cộng sự vào năm 1913, cho tới nay Fucoidan vẫn đang là hợp chất đặc biệt thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nhờ sự đa dạng về cấu trúc cũng như phổ rộng các hoạt tính sinh học như: kháng ung thư, kháng viêm, chống đông máu, kháng virut, chống tạo mạch (antiangiogenic), chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, [6].... Chính vì vậy, Fucoidan đã trở thành một nguồn dược liệu đầy tiềm năng cho các ứng dụng làm thực phẩm chức năng, m phẩm, thực phẩm bổ dưỡng và thuốc.

5

Fucoidan rong nâu là một polymer dị thể có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng về thành phần đường đơn, khả năng phân nhánh cũng như các vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường biến đổi không theo quy luật. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một số các gốc đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose..., bên cạnh đó trong một số trường hợp còn phát hiện thấy sự có mặt của các nhóm uronic axit và acetyl. Ngoài ra, các nghiên cứu trước đây còn chỉ ra rằng sự biến đổi về cấu trúc của Fucoidan phụ thuộc vào loài rong, mùa vụ thu hoạch, vùng địa lý thu mẫu cũng như các k thuật chiết tách.

Việt Nam có nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú với hơn 100 loài đã được phát hiện gồm nhiều chi rong khác nhau, trong đó riêng chi Sargassum chiếm khoảng hơn 60 loài, ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [4,5]. Đây được coi là nguồn tiềm năng rất lớn cho các nghiên cứu về Fucoidan theo hướng phát triển thành các sản phẩm có giá trị cao ứng dụng trong lĩnh vực y dược. Fucoidan đã được nghiên cứu ở Việt Nam trong hơn một thập kỷ qua, các kết quả mà các nhà khoa học trong nước thu được là rất có ý nghĩa, bước đầu đã đưa được sản phẩm Fucoidan từ rong nâu Việt Nam vào phục vụ cuộc sống... Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan từ rong nâu nói chung và chi rong Sargassum nói riêng ở Việt Nam vẫn còn rất ít, theo các tài liệu tham khảo cho thấy tại Việt Nam chưa có công trình nào nghiên cứu về polysaccharide sulfate được phân lập từ loài rong Sargassum microcystum. Trong khi đó, đây là một trong số các loài rong tương đối phổ biến và có trữ lượng tự nhiên lớn so với một số loài rong khác trong cùng chi Sargassum, có khả năng khai thác để sử dụng làm nguyên liệu cho việc sản xuất Fucoidan vào mục đích làm thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc. Vì vậy, thực hiện đề tài “Xác định thành phần hóa

học và đặc điểm cấu trúc của Polysaccharide Sulfate được phân lập từ rong nâu Sargassum microcystum” là cần thiết nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về Fucoidan từ rong nâu ở Việt Nam theo hướng phát triển các hoạt chất mới cũng như khả năng ứng dụng hiệu quả Fucoidan trong lĩnh vực y dược.

6

Mục tiêu của đề tài:

- Nghiên cứu chiết tách và phân đoạn Fucoidan từ rong nâu Sargassum

microcystum Việt Nam.

- Phân tích thành phần hóa học mẫu Fucoidan thô sau khi được chiết tách và các phân đoạn sau khi được tách bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion.

- Phân tích một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn Fucoidan đại diện

thu nhận được.

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Thu thập rong nâu Sargassum microcystum tại một số nơi ở vùng biển

Nha Trang.

- Tách chiết và phân đoạn Fucoidan từ rong nâu thu được.

- Phân tích thành phần hóa học của Fucoidan và các phân đoạn của chúng.

- Xác định các đặc trưng cấu trúc của phân đoạn Fucoidan có đặc điểm

quan tâm.

7

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU

1.1.1. Giới thiệu về rong biển

Rong biển là một nhóm thực vật thủy sinh bậc thấp, có kích thước và hình dạng rất phong phú. Chúng còn được gọi là seaweed, marine algae hay marine plant. Rong biển sống thành quần thể ở biển hoặc vùng nước lợ ven biển, mọc trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, hoặc có thể mọc dưới tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. Rất đặc biệt so với nhóm thực vật bậc cao, toàn bộ cơ thể của rong có chung một chức năng tự dưỡng, có khả năng quang hợp, hô hấp, trao đổi khí và hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường. Do có sinh khối lớn nên rong biển đã tạo ra nguồn vật chất dồi dào cho hệ sinh thái biển và lượng lớn oxygen cho sự hô hấp của con người và động vật trên cạn.

Sản lượng rong biển hàng năm cuả thế giới ước tính đạt khoảng 15

triệu tấn và dự tính khoảng 22 triệu tấn vào năm 2020[5].

Thành phần Alga alkane mannitol có trong rong biển là loại đường có hàm lượng calo thấp, bổ máu, giúp tiêu hoá nhanh và loại bỏ nhanh các các chất cặn bã có trong cơ thể. Dưới góc độ y học, rong biển là một thực phẩm dưỡng sinh tốt, thường được dùng phối hợp trong thực đơn của người bị béo phì, người đái tháo đường, làm thực phẩm cho người bị tăng huyết áp nhờ khả năng chống vón tiểu cầu. Gần đây nhiều nhà khoa học Nhật Bản cho rằng rong biển có khả năng chống phóng xạ và thải độc. Rong biển ở Nhật Bản được biết đến như là một thực phẩm giúp con người có thể trường thọ.

Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới. Trong số các ngành rong lục, rong nâu, rong đỏ và rong lam thì rong nâu là ngành rong có trữ lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại.

Tại các vùng biển ở Việt Nam, tổng số loài rong biển ước tính khoảng 1.000 loài, trong đó có khoảng 639 loài có trữ lượng lớn với 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta),

8

269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [6]. Trong tất cả các loài này, 310 loài phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 loài hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố ở cả hai vùng [3,4,5].

 Thành phần hóa học có trong rong biển

(fucoxanhthin), các sắc tố xanthophyll khác

Tùy thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trưởng và phát triển của rong mà hàm lượng của các chất có trong rong biển khác nhau. Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã được nghiên cứu, thành phần trong rong biển gồm có : nước chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lượng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino axit thiết yếu, hàm lượng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lượng ( K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…). Có nhiều quan điểm khác nhau về cách phân loại rong biển. Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành nhiều ngành khác nhau. Trong đó, ba ngành rong chính có giá trị kinh tế cao

Ngành rong lục (Chlorophyta): 900 loài

Ngành rong nâu (Phaeophyta): 1800 loài

Ngành rong đỏ (Rhodophyta): 4000 loài

Hình 1.1. Biểu đồ so sánh các ngành rong trên Thế giới [7].

Trong số các ngành rong trên loài rong biển màu nâu có khá nhiều hợp chất, các axit amin và khoáng chất. Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng được chia thành 2 nhóm : monosaccharide và

9

polysaccharide. Nhóm monosaccharide gồm các đường đơn như : mannitol, fucose, galactose, mannose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol. Chúng được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh . Nhóm polysaccharides gồm có : Fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan. Trong đó, hợp chất Fucoidan được đặc biệt chú ý nhiều hơn cả do chúng sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị với tiềm năng lớn trở thành nguồn dược liệu quý .

+ Fucoidan có khả năng tăng cường miễn dịch, chống đông tụ máu, chống viêm nhiễm, kháng virus, điều trị rối loạn đường huyết và hỗ trợ trong điều trị ung thư [7,8,9].

+ Laminaran đóng vai trò như chất dự trữ trong rong nâu. Laminaran là chất tạo hệ miễn dịch ở động vật có vú, laminaran sulfate hóa đã được chứng minh là có đặc tính giống heparin… Laminaran có hoạt tính chống đông tụ máu và chống ung thư [7,8,9].

+ Agar và alginate được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm làm chất ổn định trong bánh kẹo, kem, nước ngọt hay làm chất làm đông đặc và tạo gel trong sản xuất thịt đông lạnh; trong công nghệ sinh học được dùng làm môi trường nuôi cấy, trong y học dùng làm vải băng bó vết thương truyền thống, lấy dấu răng, pha thuốc, pha huyết thanh, trong một số công thức chống chảy máu dạ dày, trong việc cấy ghép tế bào, tác động vào các tế bào sản xuất insulin để điều trị bệnh tiểu đường loại 1.

+ Carrageenan là một ionic polysaccharide, mạch thẳng được sulfate hóa, chúng mang đầy đủ tính chất đặc trưng của polysaccharide. Carrageenan là polysaccharide có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch, chúng tồn tại trong một số loài rong đỏ thuộc họ Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thường được chiết từ một số loài rong như Gigartina, Chondrus, Iridea, Eucheuma. Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc cũng như khả năng tạo gel khác nhau.

10

Ngoài ra, rong biển còn được sử dụng để làm thức ăn cho nuôi tôm, thức ăn gia súc, được dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn điện, lọc và hấp thụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong k thuật nuôi cấy vi sinh. Rong biển cũng là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp nước giải khát, đồ hộp, socola, m phẩm cao cấp. Rong biển cũng được sử dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác. Polyphenol trong rong nâu cũng được dùng làm trà chống lão hóa. Năm 2007, tại M đã có quy trình sản xuất biodiesel từ rong biển. Thực tế còn cho thấy rong biển có tiềm năng sử dụng trong xử lý nước thải. Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng như : Zn và Cd từ nước bị ô nhiễm. Do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lượng có trong rong khá cao nên rong được dùng làm thức ăn bổ sung để phòng bệnh thiếu một số chất như sắt, iod…

11

Bảng 1.1. Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển [8].

Porpha Ulva

Laminaria digitata Alariaes culenta Palmaria palmata Porphyra yezoensis sp. sp.

Ascophyl m nodosum

Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục Ngành rong

Nước 70 - 85 73 - 90 73 - 86 79 - 88 86 70 78

Tro 15 - 25 10 - 25 14 - 27 15 - 30 8 - 16 13 - 22 7,8

15 - 30 20 - 45 21 - 42 0 0 0 0

Alginic axít

Xylan 0 0 0 29 - 45 0 0 0

0 - 10 0 - 18 0 - 34 0 0 0 0

Laminara n

Mannitol 5 - 10 4 - 16 4 - 13 0 0 0 0

nd Fucoidan 4 - 10 2 - 4 0 0 0 0

0 0 0 2 - 20 nd nd 0

Floridosi d

Protein 5 - 10 8 - 15 9 - 18 8 - 25 33 - 47 43,6 15 - 25

Chất béo 2 - 7 1 - 2 1 - 2 0,3 - 0,8 0,7 0,6 - 0,7 2,1

nd nd nd Tannin 2 - 10 0,1 0,5 - 6,0 nd

nd 3,3 2,4 0,7 Kali 2 - 3 1,3 - 3,8 7 - 9

nd 0,6 3,3 Natri 3 - 4 0,9 - 2,2 2,0 - 2,5 Nd

nd nd nd Magie 0,5 - 0,9 0,5 - 0,8 0,4 - 0,5 2,0

nd nd Iod 0,01 - 0,1 0,3 - 1,1 0,05 0,0005

0,01 - 0,1

Nd : Không phát hiện thấy

12

1.1.2. Giới thiệu về rong nâu

Rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, chi Turbinaria, chi Dictyota, chi Padina, sản lượng tự nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác. Đặc biệt chi rong Sargassum, chúng hình thành các thảm rong biển rộng từ vài hecta cho đến cả vài chục hecta, các chi còn lại mật độ vừa phải, chúng mọc trên các bãi triều và rạn ngầm có nền đáy đá hoặc san hô. Chúng phân bố rộng, chiếm ưu thế ở các bãi triều ven biển ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới. Đặc biệt, những vùng có nền đáy cứng, nước trong, sóng mạnh, những bãi triều có độ dốc 5-25% rong phát triển tốt nhất [1,2,3,4,5].

1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới

Việc phân loại tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học...người ta chia rong thành một số ngành riêng biệt. Con số các ngành rong hiện nay vẫn chưa thống nhất tùy theo các tác giả khác nhau.

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ai-len, M , Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chi Lê, Argentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn.

1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam

Có bờ biển dài 3260km với diện tích mặt nước khoảng 1 triệu km2, Việt Nam rất thích hợp cho việc phát triển ngành rong biển, đặc biệt là vùng miền Trung có bờ biển đá và dải biến thiên nhiệt độ hẹp[11,12].

13

Đối với rong nâu Việt Nam, các tác giả trong nước và nước ngoài đã nghiên cứu tương đối đầy đủ về mặt phân loại. Việc phân loại được thực hiện theo phương pháp hình thái so sánh, trong đó các tiêu chí phân loại là đặc điểm của cơ quan sinh sản vì đây là cơ quan ít biến đổi theo các điều kiện sinh thái, được sử dụng phổ biến ở Việt Nam và trên thế giới.

Hiện nay, một số chi rong nâu được thống kê bao gồm: Chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài, chi Sargassum 68 loài trong đó ở Khánh Hòa hiện nay khảo sát có 39 loài [11,12].

Năm 2013, theo công bố của Nguyễn Văn Tú, Lê Như Hậu và cộng sự đã có tổng số 827 loài được công bố, trong đó chi rong nâu Chlorophyta (180 loài). So với các nước Philippin, Đài Loan, Thái Lan hay Malaysia, rong biển Việt Nam rất đa dạng về số lượng loài [12].

Nguồn lợi rong nâu được tập trung phân bố trên 4 khu vực ven biển

Khánh Hòa theo trình tự từ Bắc đến Nam (Hình 1.1)

+ Khu vực 1: Vịnh Vân Phong (Hòn Bịp, Hòn Ó, Hòn Dút, Cù Meo, Rạn Trào, Rạn Tướng, Mũi Dù, Mũi Đá Son, Sủng Rong, Lạch Cổ Cò, Sủng Ké..).

+ Khu vực 2: ven biển xã Ninh Thuỷ, xã Ninh Phước, xã Ninh Vân, Đầm Nha Phu (Bãi Đá lát, M Giang, Hòn khô, Bãi Đá nọc, Bãi Cây Tra, Bãi Cỏ, Bãi Cây Bàn, Bãi Vũng Tàu, Hòn Thị, Đảo Khỉ... và vài bãi cạn ngầm Bãi Cỏ - Thị xã Ninh Hòa.

+ Khu vực 3: Vịnh Nha Trang (Mũi Kê Gà, Bãi tiên Đường Đệ, Hòn Chồng, khu vực Hòn Đỏ, Hòn Rùa, Đảo Hòn Tre - Mũi Nam Bãi Trủ, Bãi Rạn, Bãi Ngéo, Hòn Một, Hòn Mun, Bãi rạn ngầm Lớn, Mũi Cá sấu Trí Nguyên, Sông Lô, Mũi Cầu.

+ Khu vực 4: Đảo Bình Ba, xã Cam Lập ( dọc theo bờ Đông bán đảo

Cam Lập, từ mũi Sốp đến mũi Cà Tiên) – Thành phố Cam Ranh.

14

Hình 1.2. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh Hòa [4].

15

1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu

1.1.3.1. Polysaccharide

Polysaccharide là thành phần chính và có nhiều ứng dụng quan trọng nhất trong rong nâu, bao gồm Fucoidan, alginate, laminaran và dẫn xuất của chúng. Một số thành phần khác như porphyran, axít alginic và ascophyllan đã được tìm thấy ở một số loài rong nâu [8,9,10]. Ascophyllan đã được tách chiết từ rong nâu Ascophyllum nodosum ức chế sự phát triển và tiêu diệt tế bào ung thư.

*Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa dị thể nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được Kylin mô tả đầu tiên vào năm 1913 từ loài rong nâu Laminaria digitata. Thành phần cấu tạo rất phức tạp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7% đến 32,9%, ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose ,..và uronic axit.

*Alginate: Thành phần hóa học của alginate gồm 2 thành phần chính là axít β-D-mannuronic (M) và axít α-L-guluronic axit (G) liên kết với nhau bởi liên kết (1→4) glycoside. Axít β-D-mannuronic (M) và axít α-L-guluronic axit (G) có cấu hình khác nhau. Chính sự khác nhau về mạch cấu trúc này nên hai uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [8,9].

*Laminaran là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thường gọi là laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là : 1,3 – β – D – glucan. Laminaran là một polysaccharide dự trữ của rong nâu, hàm lượng từ 1 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của từng loại rong. Laminaran được hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết β-(1→3) và một ít liên kết β-(1→6), gốc đường cuối mạch của một số phân tử có thể có các gốc mannitol hay vẫn là glucose. Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của các liên kết β-(1→3) và liên kết β-(1→6) cũng như cách thức nối của các liên kết này trong chuỗi glucan[8,9].

16

1.1.3.2. Một số hợp chất khác

*Hợp chất phenolic : Hợp chất phenolic là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của thành phần hóa học rong nâu, là hợp chất chứa các nhóm - OH gắn trực tiếp vào nhân bezen, bao gồm các hợp chất flavonoid, lignnin, tannin và phlorotannin. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính khác nhau. *Hợp chất Carotenoid : Carotenoid là các hợp chất màu tự nhiên được tìm thấy ở nhiều loài thực vật và động vật. Trong thành phần hóa học của rong nâu có chứa các hợp chất catatonic bao gồm lutein, zeaxanthin và fucoxanthin. Rong nâu được coi là giàu có hợp chất chuyển hóa thứ cấp đặc biệt như carotenoid có nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thư, chống viêm và chống virus. Các hợp chất a-carotene, b- carotene, chlorophyll a và phaeophytin a đều có những hoạt tính sinh học vô cùng quý giá.

*Hợp chất Terpenoid: Một số terpenoid được tách từ rong nâu Sargassum fallax, sargaquinone, axít sargaquinoic, axít sargahydroquinoic, axít fallachromonoic, fallahydroquinone, fallaquinone, sargachromenol . Các hợp chất này có họat tính chống oxi hóa và ngăn ngừa ung thư. Các hợp chất atomarianone A , và atomarianone B đã được tách từ Taonia atomania có hoạt tính gây độc tế bào ung thư.

Hợp chất diterpenoid tách từ rong nâu Cystoseira mediterranea như taondiol , isoepitaondiol , stypodiol , stypoldione và sargaol , các hợp chất này có hoạt tính chống oxi hóa và chống ung thư. Hợp chất 2β,3α-epitaondiol, flabellinol đã được tách từ rong nâu Styporodium flabelliforme có hoạt tính gây một số tế bào ung thư.

Ngoài các hợp chất được nêu trên đây, một số nhà khoa học còn tiến hành nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein được nghiên cứu tách chiết từ một số loài rong nâu. Các aminoaxit đã được nghiên cứu nhiều gồm : Deoxylapachol a 1,4 - Naphthoquinone và dẫn xuất đã được tách từ rong nâu Landsburgia quercifolia hay Sargachromanol E tách từ rong Sargassum siliquastrum, các hợp chất này có khả năng gây độc tế bào ung thư. Hợp chất ergosterol tách từ rong nâu Lyengaria stellata, Fucosterol tách

17

từ rong nâu Pelvetia siliquosa, Cystoseira foeniculacea và Sargassum angustifolium. Các hợp chất axít α-linolenic, axít γ-linolenic và axít docosahexaenoic ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư.

1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN

1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan

Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [6], khi đó nó được đặt tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính cấu tạo nên polysaccharide này. Các polysaccharide như vậy trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm. Ngược lại, thành phần và cấu trúc của các polysaccharide rong nâu phức tạp hơn nhiều. Ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của Fucoidan còn có thể chứa thêm các đường đơn khác như: galactose, xylose, mannose, glucuronic axít , đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần. Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà Fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v... Chính vì vậy, Fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu.

1.2.2. Thành phần hóa học của Fucoidan trong một số loài rong

nâu

Lần đầu tiên thành phần của Fucoidan trong dịch chiết nước được xác định là một polysaccharide có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D- galactose và uronic axit được xem như là tạp chất [8].

Theo Percival và Ross thì thành phần Fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea là 38% ester sulfate, 56,7% fucose, 4% galactose, 1,5% xylose, 3%

18

uronic axit và 8% khoáng [13,14]. Fucoidan chiết từ loài rong khác nhau thì có tỉ lệ fucose/galactose cũng khác nhau [13,14]. Cụ thể như sau Fucoidan từ loài rong A. nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [14], trong khi Fucoidan chiết từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [13,14]. Ngoài ra, các thành phần đường khác (như xylose) cũng được xác nhận là thành phần của Fucoidan . Thành phần của Fucoidan từ rong F. vesiculosus là 44.1% fucose, 26.3% sulfate, 31.1% tro và một lượng nhỏ amino-glucose [13,14]. Do vậy, thành phần của Fucoidan có thể biến đổi theo các loài rong (bảng 1.2) và phương pháp chiết khác nhau.

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số Fucoidan [7].

Rong nâu Thành phần hóa học

F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1.20)

F. evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1.23/0.36)

F. distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1.21/0.08)

F. serratus L. Fucose/sulfate/acetate (1/1/0.1)

Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1.12)

Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1), sulfate

Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1), sulfate

Undariapinnatifida Fucose/galactose (1/1.1), sulfate (10.4 %)

(Mekabu)

Fucose/xylose/GlcA (4.9/1/1.1), sulfate (12%)

Ascophyllum nodosum

Himanthalia lorea Fucose/xylose/GlcA (2.2/1.0/2.2), sulfate (13%)

và Bifurcaria bifurcate

Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose

19

(1.5/1.5/1.2/1.2/1), sulfate (17.6 %)

Fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose

Laminaria angustata

1.2.3. Cấu trúc hóa học của Fucoidan

Cấu trúc của Fucoidan được chiết xuất từ rong biển vô cùng phức tạp và không đồng nhất với những thay đổi trong trật tự liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đường khác nhau trong polysaccharide, phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Chính vì vậy việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các k thuật quang phổ NMR phân giải cao mới nhất. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của Fucoidan đã được công bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của Fucoidan.

Hình 1.3. Cấu trúc của Fucoidan từ Fucus vesiculosus được mô tả vào năm 1950 [13].

Năm 1950 Percival, Ross và cộng sự đã mô tả cấu trúc Fucoidan từ rong nâu thường gặp Fucus vesiculosus là một polysaccharide có bộ khung chính là α -L-fucose(1→2), vị trí nhánh là α -L-fucose(1→3) và các nhóm sulfate ở vị trí 4 của gốc đường L-fucospyranose. Mô hình cấu trúc này của Fucoidan đã tồn tại 43 năm [13,14]. Đến năm 1993, cấu trúc Fucoidan của chính loài rong này đã được nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả

20

cho thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của Fucoidan này với mạch chính là α -L-fucose(1→3) thay vì α - L-fucose(1→2), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí C4, phù hợp với mô hình đã công bố trước. Sự khác nhau về cấu trúc Fucoidan so với công bố của Percival và Ross được Pantakar giải thích bởi việc sử dụng dung môi chiết khác nhau và sự đưa sử dụng k thuật phân tích hiện đại là GC-EI/MS đã xác định sự có mặt các nhóm acetyl (axetyl) tại vị trí khác nhau của vòng pyranose trong phương pháp methyl hoá.

Cấu trúc Fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo mới chỉ đưa ra đặc điểm chung của cấu trúc là sự có mặt của gốc α -L-fucose(1→3) với các nhóm sulfate ở C-4, không loại trừ sự có mặt của các nhóm sulfate khác hoặc các nhánh ở vị trí 2 [15]. Trong -)(1→3)fuc(1→ có mặt trong Fucoidan khi đó disaccharide →3)fuc(2-OSO3 chiết Sargassum binderi [16].

Hình 1.4. Cấu trúc của Fucoidan có sunfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome được mô tả vào năm 1991 [16].

Cấu trúc tinh vi của phân đoạn Fucoidan F32 phức tạp chiết từ rong nâu Hizikia fusiforme đã được công bố [17]. Cấu trúc của phân doạn F32 bao gồm →2)-α-D-Man(1→ và →4)-β-D-GlcA(1→ luân phiên nhau, một lượng ít →4)-β-D-Gal(1→ đã được trộn lẫn. Nhóm sulfate ở vị trí C-6 của →2,3)Man(1→, C4 và C6 của →2)Man(1→, C3 của →6)Gal(1→, C2, C3 hoặc C4 của fucose.

21

Hình 1.5. Cấu trúc Fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu

Hizikia fusiforme [17].

Phần lớn các nghiên cứu về cấu trúc Fucoidan chỉ đưa ra vị trí liên kết, kiểu liên kết và vị trí nhóm sulfate . Cấu trúc của oligo Fucoidan chiết từ rong nâu Ascorphylum nodosum được nghiên cứu bằng 02 phương pháp thủy phân hóa học và bằng enzym đều có cấu trúc là cấu thành bởi các liên kết luân phiên α- (1→3) và α- (1→4) tương ứng vói các gốc α -L-fucose(1→3) và α -L-fucose(1→4) [18,19].

-)-(1→4)-α-L-Fucp (2,3SO3

-)-1→]n

[→3)-α-L-Fucp (2SO3

Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A.nodusum [18].

22

Năm 1999, cấu trúc Fucoidan của 3

filum (Chordariales)

loài rong Cladosiphon (Laminariales) và [20], Chorda Okamuranus Ascophyllum nodosum (Fucales) [18,19] đã được công bố. Cấu trúc Fucoidan của rong Cladosiphon Okamuranus và Chorda filum được tạo thành bởi các gốc α-L-fucose(1→3) lặp lại đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C2 (2-O-sulfateation) hoặc vị trí C4 (4- O-sulfateation) [20]. Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử Fucoidan càng làm tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng.

R R

Hình 1.7. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus

23

- hoặc H

-, H hoặc COCH3

R1 : SO3 R2 : SO3

Hình 1.8. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Chorda filum [20].

-)-(1→]n

Năm 2002, cấu trúc Fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ rong Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, cấu trúc của Fucoidan này tương đồng với cấu trúc Fucoidan của rong A.nodosum [21]. Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc Fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và C2,4 [22,23].

-)-(1→4)- α -L-Fucp-(2SO3

-)-(1→

[→3)- α -L-Fucp-(2,4 SO3

→3)- α -L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)- α -L-Fucp(2SO3

24

Trong đó:

-, R2 = H chiếm 50%

-)-

-)-(1→3) α -L-fucp(2SO3

R1 = SO3

R1 = H, R2 = α -L-fucp-(1→4)- α -L-fucp(2SO3 (1→ chiếm 50%

Hình 1.9. Cấu trúc Fucoidan từ Fucus serratus [23].

Trải qua năm thập kỷ, kể từ bài báo công bố về cấu trúc Fucoidan đầu tiên vào năm 1950 cho đến nay, đã có rất nhiều công bố về cấu trúc Fucoidan tách chiết từ các loài rong nâu sinh trưởng tại các vùng biển trên thế giới, tuy nhiên các công bố chủ yếu là đưa ra cấu trúc chi tiết một phân đoạn của Fucoidan dạng fucan sulfate. Đặc điểm cấu trúc chung của Fucoidan dạng fucan sulfate là cấu trúc bao gồm các gốc fucopyranosyl liên kết với nhau qua liên kết α (1→3), α (1→4), mạch nhánh (1→2) và nhóm sulfate ở vị trí C2, C3 và C4 trong vòng pyrannose. Trong khi đó các nghiên cứu về cấu trúc của Fucoidan dạng fucogalactan sulfate không nhiều. Chúng có cấu trúc phức tạp bởi sự có mặt đồng thời của 02 gốc đường fucopyranosyl và galactopyranosyl liên kết với nhau dạng α hoặc dạng β(1→3), α (1→4), liên kết mạch nhánh có thể là (1→2), (1→6) và nhóm sulfate có thể ở các vị trí khác nhau của 02 gốc đường. Chính vì vậy mà việc nghiên cứu cấu trúc của Fucoidan dạng fucogalactan sulfate là thách thức không nhỏ đối với các nhà hóa học hữu cơ.

1.2.4. Tính chất hóa lý của Fucoidan

Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate, có độ nhớt thấp và tính hút ẩm cao, Fucoidan tan tốt trong nước và trong dung môi axít. Nhìn chung, Fucoidan có trọng lượng phân tử không cao. Trọng lượng phân tử của Fucoidan chiết từ loài rong A.nodosum là từ 417-1.323 kDa, trong khi đó với loài rong F. vesiculosus là 529-887 kDa, nhưng Patankar và cộng sự (1993) [18,19] lại cho rằng trọng lượng phân tử của Fucoidan từ loài rong này là 100 kDa. Rupérez và cộng sự (2002) đã chiết hai phân đoạn Fucoidan với trọng lượng phân tử khác nhau là 1.600 kDa và 43 kDa. Thêm vào đó, Fucoidan được phân lập từ loài rong Saccharina longicruris có trọng lượng phân tử là 765 kDa và 1,529 kDa biến đổi tùy thuộc vào thời điểm thu hoạch rong. Nhìn

25

chung trọng lượng phân tử của Fucoidan thay đổi tùy thuộc vào loài rong (bảng 1.3), phương pháp chiết và điều kiện môi trường.

Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lượng phân tử của Fucoidan [24].

Trọng lượng phân tử (kDa) Nguồn rong

Ascophyllum nodosum

Ascophyllum nodosum

Hizikia fusiforme

13 16 25

Fucus vesiculosus (Sigma)

Fucus vesiculosus

Laminaria japonica

Cladosiphon okamuranus

100-180 160 189 200 950 Hizikia fusiforme

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của Fucoidan

1.2.5.1. oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối

Trong số hoạt tính sinh học của Fucoidan thì hoạt tính chống đông tụ máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất. Lần đầu tiên, Nishino và cộng sự, đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu của Fucoidan được phân lập từ chín loài rong nâu. Trong số các Fucoidan thử nghiệm, Fucoidan từ E. kurome thể hiện hoạt tính cao nhất đối với APTT (38 đơn vị/mg) và TT (35 đơn vị/mg), với Fucoidan từ H.fusiforme hoạt tính APTT (activated partial thromboplastin time) và TT (thromboplastin time) tương ứng là 25 đơn vị/mg và 22 đơn vị/mg. Hoạt tính chống huyết khối của phân đoạn F4 của Fucoidan từ L.angustata var. longissima là 200 đơn vị/mg, so với heparin (140 đơn vị/mg) [24,25].

26

Các nghiên cứu về hoạt tính chống đông tụ máu của Fucoidan từ một số loài rong (E.kurome, H.fusiforme, vv…) đã chỉ ra rằng hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống đông tụ máu, hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính chống đông tụ máu càng lớn. Đáng chú ý là công bố của Qiu và cộng sự chứng minh rằng Fucoidan sulfate hóa toàn phần cho thấy hoạt tính chống đông tụ máu cao gấp bốn lần so với Fucoidan tự nhiên [26]. Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất quan trọng với hoạt tính chống đông tụ của Fucoidan. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng Fucoidan sulfate hóa nếu ở vị trí C-2 hoặc C-3 thể hiện hoạt tính chống đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này [26,27,28].

1.2.5.2. oạt t nh chống virus

Fucoidan được tách chiết từ các loài rong Adenocytis utriculari, Undaria pinnatifida(Mekabu), Stoechospermum marginatum, Undaria pinnatifida, Cystoseira indica và Undaria pinnatifida cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây độc cho tế bào Vero. Hơn nữa, các Fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của người và cytomegalovirus [29,30,31,32].

Dohura và cộng sự, công bố rằng sử dụng Fucoidan từ rong nâu có hoạt tính antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị nhiễm trùng prion đường ruột [29,30,31,33,34].

1.2.5.3. oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch

Hoạt tính kháng u của nhiều polysaccharide đã được công bố trong những năm gần đây. Fucoidan từ Eisenia bicyclics và L. japonica có tác dụng chống u báng 180. Fucoidan của L. japonica có thể ức chế tế bào gan QGY7703 đến phase Log, theo đó kiềm chế sự tăng trưởng của khối u [35,36,37,38,39]. Fucoidan đã được phát hiện ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của người. Fucoidan từ L. saccharina, L. digitata, F. serratus, F. distichus và F. vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính với các tiểu cầu,

27

một hiệu ứng mà có thể có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u [40,41,42,43,44].

1.2.5.4. oạt t nh chống ox hóa

Bằng các thí nghiệm in vitro,các nhà khoa học đã chứng minh rằng Fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất quan trọng. Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên tuyệt vời và có khả năng ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do rất cao. Fucoidan từ L. japonica có thể ngăn chặn sự tăng peroxide lipid (LPO) trong huyết thanh, gan và lá lách của chuột bị tiểu đường một cách rõ ràng [45,46,47]. Micheline và cộng sự công bố rằng Fucoidan (homofucan) từ F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã có một tác dụng ức chế sự hình thành các gốc tự do hydroxyl và gốc peoxit. Fucan cho thấy hoạt tính chống oxy hóa thấp so với Fucoidan.

1.2.5.5. Giảm lipid máu

Tương tự như axit sialic, Fucoidan là hợp chất có thể làm tăng các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh. Fucoidan của L. japonica giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-C, làm tăng HDL-C trong huyết thanh của chuột với sự tăng cholesterol (hypercholesterolemia) và thỏ với tăng mỡ máu (hyperlipidaemia), ngăn chặn hiệu quả sự hình thành của tăng cholesterol (hypercholesterol) trong máu ở chuột thí nghiệm [48,49]. Sulfate fucan có trọng lượng phân tử thấp (trung bình Mw = 8.000 Da) được phân lập từ L.japonica có khả năng làm giảm rõ rệt lipít máu của những con chuột có lipít cao. Fucoidan oligosaccharide cho thấy tác dụng hạ huyết áp tốt trên chuột cao huyết áp và một trong những cơ chế tác dụng hạ huyết áp cơ bản là chúng có thể ức chế sự sản xuất angiotensin II trong huyết tương (anti angiotensin II) [48,49].

1.2.5.6. Kháng viêm

Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của Fucoidan thu nhận được từ chín loài rong nâu. Kết quả cho thấy tất cả Fucoidan của 9 loài rong đều có khả năng ức chế sự tăng số lượng bạch cầu

28

trên mô hình chuột bị viêm, hiệu quả chống viêm của Fucoidan trong mô hình này không bị ảnh hưởng nhiều bởi hàm lượng của gốc fucose và sulfate cũng như các đặc tính cấu trúc khác của bộ khung mạch polysaccharide của chúng [50].

1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan

Bằng việc gián tiếp sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm (proinflammatory cytokine) ở chuột, Fucoidan ngăn chặn tổn thương gan gây ra bởi concanavalin A [45,49,51]. Các chất xơ trong rong nâu (Laminaria sp., Sargassum fulvellum và Eisenia bicyclis) có tác dụng chống lại bệnh gan gây ra bởi D-galactosamine (D- GalN) và tác dụng bảo vệ này được gây ra ít nhất một phần nhờ Fucoidan. Sự có mặt của Fucoidan làm giảm suy gan cấp tính và mãn tính gây ra bởi CCl4. Gan xơ hóa gây ra bởi CCl4 cũng giảm bớt bằng cách tiêm Fucoidan. Nguyên nhân chính gây ra xơ gan là do những thương tổn tế bào gan và sự kích hoạt các tế bào gan hình sao và điều thú vị là Fucoidan có khả năng ngăn chặn tế bào chết do CCl4 gây ra và ức chế các tế bào gan phát triển. Vì vậy, Fucoidan có thể là một chất chống xơ có tiềm năng nhờ sở hữu chức năng kép, cụ thể là: bảo vệ tế bào gan và ức chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao [37,44,49].

1.2.5.8. oạt t nh kháng khuẩn

Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, Fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não, một biến chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra. Fucoidan tăng khả năng sản xuất các dạng interferon kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để phòng nhiễm trùng và bệnh tật [6,30,32].

1.2.5.9. ác d ng giảm l ợng ng hu ết trong máu.

Các nhà nghiên cứu đã công bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong biển tác động dương tính lên phản ứng insulin và đường huyết trong các động vật thí nghiệm. Việc đưa thêm các polysacharide này vào cơ thể động vật đã dẫn đến giảm một cách đột ngột cân bằng hấp thụ đường. Điều này giả thiết rằng các hợp chất polysaccharide giống Fucoidan làm chậm việc truyền

29

glucose vào máu từ ruột, nhờ vậy giúp giữ mức đường máu ổn định và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức [6,43,44,45].

Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm Fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, Fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua Fucoidan và nước yến Fucoidan của Công ty Sannet Khánh Hòa.

Như vậy có thể thấy, Fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Mặc dù đã có rất nhiều công trình công bố về cấu trúc của Fucoidan, nhưng chỉ có một số công bố đưa ra được cấu trúc một cách rõ ràng nhưng phần lớn chỉ đưa ra cấu trúc của một phân đoạn có độ lặp lại cao của chúng. Một số cấu trúc chi tiết của Fucoidan tách chiết từ một số loài rong nâu trên thế giới được dẫn ra trên bảng 1.4

30

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các Fucoidan từ một số loài rong nâu

Loài rong nâu Cấu trúc hóa học của các Fucoidan TLTK

-)

Analipus japonicus Bilan et al.,2007 3(4Fucp) và 1 (2Fucp) /10 (1→3)-α-L- Fucp(2/4SO3

-)-(1→4)-α-L-

[51]

-)-(1→]n

Ascophyllum nodosum Chevolot etal.,2011[52] [→3)-α-L-Fucp(2SO3 Fucp(2,3-điSO3

A.nodosum

(1→3)-α-L-Fucp và một ít (1→4)-α-L-Fucp cùng (1→3)-α-L-(2 và hoặc 4 Fucp) Mariais etal.,[53]

Chorda filum

-)-(1→4)-α-L-

-[→3)-α-L-Fucp-(1-]3→3)-α-L- Fucp(2Fucp)-(1→ Chizhov et al.,1999[54]

-)-(1→

-)-(1→4)-α-L-

Bilan et al.,[23] Fucusdistichus L →3)-α-L-Fucp-(2,4-diSO3 Fucp-(2SO3

F.evanescens →3)-α-L-Fucp(2SO3

-)-(1→

Bilan et al.,[22] Fucp(2SO3

F.serratus L →3)-α-L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)-α-L-

-)-(1→

- , R2 = H

Bilan et al.,2006

-)-(1→

Fucp(2SO3 a. (~50%): R1 = SO3 b. (~50%): R1 = H, R2 = α-L-Fucp-(1→4) )- α-L-

-)-(1→3)-α-L-Fucp(2SO3

-)-(1→ và thêm →3) )-

Fucp(2SO3

-hoặc 2Fucp)-(1→

-)-(1→ và →4-α-L-

Laminaria sacharina Usov et al.,1998 [55] →3)-α-L-Fucp(4SO3 α-L-Fucp(4SO3

-)-(1→

Stoechosperm ummarginatum Adhikari et al.,2006 [56] →3)-α-L-Fucp(2/4SO3 Fucp(2SO3

31

Trong thành phần của các Fucoidan ngoài fucose và sulfate còn có một lượng nhỏ các monosaccharide như galactose, glucose, mannose, xylose, uronic axit. Cùng với sự xuất hiện của nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử Fucoidan càng tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. Một số Fucoidan mà thành phần chủ yếu là galactose, fucose và sulfate hay còn gọi là galactofucan sulfate được tách từ một số loài rong nâu như Laminaria angustata, Laminaria longissima, Alaria fistulosa, Undaria pinnatifida, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Laminaria gurjanovae và Sargassum patens. Trong khi đó có rất nhiều Fucoidan có cấu trúc rất phức tạp được tách chiết và phân lập từ một số loài rong nâu Dictyota menstrualis, Padina gymnospora, Spatoglossum schroederi, Hizikia fusiforme, Sargassum fusiforme, Kjellmaniella crassifolia. Thành phần hóa học của chúng chứa rất nhiều các đường đơn như fucose, galactose, glucose, mannose, xylose, còn có uronic axit và sulfate, ngoài ra có thể có nhóm acetyl hóa. Vì vậy việc xác định cấu trúc của chúng gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, các nhà khoa học phải sử dụng nhiều k thuật khác như phân tích methyl hóa, đề sulfate hóa, tự thủy phân, enzyme thủy phân Fucoidan,… kết hợp cùng các phương pháp hóa lý hiện đại như NMR 2D, 3D, MALDI-TOF/MS/MS, SAXS để giải quyết bài toán cấu trúc phức tạp của Fucoidan.

Việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI- TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và Fucoidan nói riêng đã tạo ra một bước đột phá mới trong phân tích cấu trúc phức tạp của polysaccharide rong biển. Ưu điểm của phương pháp này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng như trật tự giữa các gốc đường trong phân tử Fucoidan. Trên cơ sở phương pháp MS, Anastyuk và CS tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương-Liên bang Nga đã xác định thêm 03 loại cấu trúc Fucoidan mới từ các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii [57,58]. Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1D và hai chiều 2D kết hợp với biến đổi hóa học, Usov và CS tại Viện Hóa Hữu cơ -Nga đã xác định cấu trúc chi tiết của 04 loại cấu trúc của Fucoidan từ các loài rong

32

nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus [59]

Trong thập kỷ trở lại đây, đã có các công bố đưa ra cấu trúc của phân đoạn Fucoidan dạng fucogalactan sulfate từ một số loài rong như Sargassum duplicatum, Padina boryana [60] . Roza V. Usoltseva và các CS người Nga đã đưa ra cấu trúc của Fucoidan từ rong Sargassum duplicatum như sau: mạch chính được tạo ra từ các đơn vị lặp lại {→4)-α-L-Fuc-(1→4)-β-D-Gal- 1→}n, ), với các nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2, C4 và ít hơn ở C3 trên gốc đường fucose, nhóm sulfate chủ yếu tại vị trí C2, C3 và ít hơn ở C4, C6 trên gốc đường glactose [60]. Trong khi với cấu trúc Fucoidan từ rong Padina boryana nhóm tác giả trên mới chỉ đưa ra một vài đặc điểm cấu trúc là bao gồm bởi các gốc 1,4-α-L-fucopyranose và 1,3-β-D-Galactopyranose và các nhóm sulfate đính vào các vị trí C2,C3 và C4 trên cả 2 gốc đường fucose và galactose [61].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Fucoidan mới chỉ được biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.

Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập Fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch Fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học tự nhiên vốn có của chúng.

Các nghiên cứu công bố về Fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra các đặc điểm về cấu trúc như thành phần đường, vị trí nhóm sulfate và

33

phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu Fucoidan chiết thô. Năm 2008, NCS Nguyễn Duy Nhứt đã công bố thành phần và cấu trúc của phân đoạn Fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đường đơn khác như rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81 -22,07%), tác giả đã đưa ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic axít và fucose, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [62,63].

Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố Fucoidan từ rong Turbina ornata có hàm lượng sulfate cao và thành phần đường rất đơn giản chỉ gồm fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhóm sulfate cũng được phát hiện thấy chiếm ưu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh được tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [64]. Hàm lượng Fucoidan trong rong Nâu Việt Nam chiếm từ 0,5-2,7 % khối lượng khô và chúng thuộc về nhóm galactofucan sulfate. Các Fucoidan chiết từ 05 loài rong S. polycystum, S. microcystum, S. swatzii, S. denticarpum và Turbinaria ornata có hoạt tính chống ung thư gan (Hep-2), ung thư màng tim (RD) và Fucoidan chiết từ rong S.mcclurei có hoạt tính chống ung thư vú cả 06 loại Fucoidan này đều có hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính chống kháng trực khuẩn mủ xanh là P. Aeruginosa. Trong số Fucoidan đem thử hoạt tính thì Fucoidan từ rong S.polycystum và Turbinaria ornata có hoạt tính cao nhất. Sử dụng các phương pháp phân tích hóa học, GLC, IR, NMR và ESI-MS nhóm tác giả đã bước đầu đưa ra được đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn Fucoidan từ loài rong S.polycystum; S.swartzii và Turbina ornata [64].

Vị trí nhóm sulfate trong Fucoidan chiết từ 03 loài rong thuộc chi rong Sargassum và loài rong Turbina ornata nằm ở vị trí C4 của vòng pyranosse và chỉ một phần H4 bị sulfate hóa. Nhóm sulfate ở vị trí C4 của cả 02 monome: fucose và galactose đối với Fucoidan từ rong Turbina ornata. Liên kết glycoside chính trong mạch là liên kết (1→3) và có thể có mạch nhánh. Tuy nhiên các cấu trúc đưa ra trên vẫn chỉ là dự đoán và còn một số vấn đề

34

chưa giải quyết thỏa đáng đó là các dữ liệu phổ về các kiểu liên kết và các chuỗi oligosaccharide trong mạch chính và mạch nhánh của Fucoidan.

Năm 2013, các tác giả Bùi Minh Lý, Thành Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Usov và cộng sự đã tìm ra được cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum polycystum Việt Nam :

Hình 1.10. Cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum polycystum

Phạm Đức Thịnh và cộng sự [65] đã chiết tách Fucoidan từ 05 loài rong S. denticapum, S. polycystum, S. swartzii, S. mcclurei và Turbina ornata và nghiên cứu đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn đại diện cho Fucoidan của mỗi loài rong. Tất cả Fucoidan chiết từ 05 loài rong nói trên đều thuộc fucogalactan sulfate với liên kết chủ yếu trong mạch chính là 1-3.

Lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L- Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong Sargassum.

35

Trong luận án của Hồ Đức Cường [66] Fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum henslowianum đã được xác định với thành phần đường chính là fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của Fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α-(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C2, C4 và một phần của C3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C4 và liên kết với mạch chính qua liên kết glycoside (1 - 4). Đã xác định Fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thước cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng các phương pháp hiện đại như tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của Fucoidan được nghiên cứu . Hồ Đức Cường và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm nhưng không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày đã có tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh hoá mỡ máu, khối lượng mỡ trên mô hình chuột béo phì.

Đến năm 2017, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã chiết tách, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lượng phân tử trung bình của các Fucoidan từ 06 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss), và T. ornata (Fto)[67].

36

Bảng 1.5. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu Fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam [67].

Thành phần đường trung bình Tên loài HS Sulfate MW

Gluc A (%) (% mol) (%) kDa

(%) Fuc Man Gal Xyl Glc

S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 52

S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 26

S. 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 38

oligocystum

2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 41

S. denticarpum

S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 41

T. ornata 2,75 30,3 vết 9,0 vết vết 7,8 25,6 88

Điểm nổi bật nhất và mới nhất cho đến hiện nay trong luận án của tác giả Bùi Văn Nguyên là đã nghiên cứu và mô tả được đặc điểm cấu trúc của Fucoidan từ hai loài rong Sargassum duplicatum và Sargassum binderi.

Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS chothấy phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một galactofucan tạo thành từ 2 loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C2 và β -D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C6. Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N được đề xuất như sau:

37

-)-1→]n

-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3

[→3-α-L-Fucp2(OSO3

Hình 1.11. Mảnh cấu trúc cơ bản Fucoidan chiết tách từ rong

Turbinaria decurrens [67].

Ngoài ra, Bùi Văn Nguyên và cộng sự [67] đã tiến hành nghiên cứu hình dáng và kích thước của các mẫu Fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu Fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính toán cho các mô hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đường.

Tác giả Bùi Văn Nguyên đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu Fucoidan trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu α đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7 µg/mL).

38

Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu Fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD [67].

Hep-G2 RD

Mẫu Fucoidan

CS% IC50 (µg/mL) CS% IC50 (µg/mL)

S. polycystum 29,7 5,5 11,8 5,7

S. mcclurei 39,3 14,2 64,8 > 20

S. oligocystum 35,3 15,8 11,2 11,4

S. denticarpum 37,5 7.3 27.9 15.9

S. swatzii 31,1 5,8 16,5 18,7

T. ornata 21,8 3,1 4,5 1,6

Năm 2017, nhóm tác giả do Bilan đứng đầu và các cộng sự tại các viện nghiên cứu của Việt Nam đã công bố cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum aquifolium thu nhận tại vùng biển Việt Nam, bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp phổ NMR các tác giả này đã xác định được 03 polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sulfate deS-2, deS-4, deS-6.

Ngoài ra, nhóm các nhà khoa học này đã sử dụng thêm phương pháp đo phổ NMR, HSQC và chứng minh được rằng Fucoidan thu nhận từ rong Sargassum aquifolium là một polysaccharide sulfate có cấu trúc vô cùng phức tạp. Thành phần mạch chính được bắt đầu với fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, mức độ phân nhánh cao và bất thường. Trong thành phần cấu trúc có chưa các gốc đường mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic axit và một số lượng lớn nhóm sulfate đính tại các vị trí khác nhau.

39

Hình 1.12. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium

Kết luận:

Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú [1,2,3,4,5]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về Fucoidan từ rong nâu Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các công bố về thành phần, cấu trúc của Fucoidan phân lập từ các loài rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Do vậy, tôi chọn đề tài “ Xác định thành

phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của Polysaccharide Sulfate được phân lập từ rong nâu Sargassum microcystum ” là cần thiết nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về Fucoidan từ rong nâu Việt Nam theo hướng phát triển các hoạt chất mới cũng như khả năng ứng dụng hiệu quả của Fucoidan trong lĩnh vực y dược.

40

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Thu thập mẫu rong : Mẫu rong nâu Sargassum microcystum được thu từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2020 tại các vùng ven biển tỉnh Khánh Hòa. Các mẫu rong được thu thập bằng phương pháp thủ công và phân loại bởi PGS.TS. Nguyễn Hữu Đại (chuyên gia phân loài rong biển thuộc Viện Hải Dương học Nha Trang). Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.

Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum microcystum

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn Fucoidan

2.2.1.1. Ph ơng pháp chiết tách Fucoidan từ rong nâu

Dựa trên cơ sở tham khảo tài liệu đã công bố về các phương pháp chiết tách Fucoidan cho mục đích nghiên cứu cấu trúc, chúng tôi tiến hành phương pháp chiết theo Patent của Nga (Patent WO 2005/014657). Sơ đồ chiết được trình bày trên hình 2.2.

2.2.1.2. Ph ơng pháp phân oạn Fucoidan

Fucoidan được tiến hành phân đoạn tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion

41

trên cột DEAE-cellulose (hình 2.2). Mẫu bột Fucoidan thô (gồm Fucoidan, laminaran và polyuronan) được hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần không tan (polyuronan), phần dịch trong được cho chạy qua cột sắc ký DEAE-cellulose. Hợp chất laminaran (hợp chất không có nhóm mang điện tích) không bị hấp thụ trên cột sẽ được rửa giải đầu tiên bằng dung dịch HCl loãng (0,04N) hoặc nước cất. Tiếp theo các phân đoạn Fucoidan sẽ được rửa giải bằng dung dịch muối NaCl ở các nồng độ khác nhau.

Hình 2.2. Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657)

2.2.2. Phương pháp phân tích cấu trúc của Fucoidan

2.2.2.1. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate

Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: Hàm lượng đường tổng được

xác định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [68].

2.2.2.2. Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide

Phân tích thành phần đường đơn của Fucoidan: Thành phần đường đơn

42

được xác định bằng phương pháp HPLC, sau khi Fucoidan được thủy phân axít về các monomer [68].

2.2.2.3. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate

Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với

BaCl2/gelatine, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [69].

2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axit

Hàm lượng uronic axít được xác định sử dụng phương pháp Carbazole,

sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [70].

2.2.2.5. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR

Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ngày nay là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích các ionic polysaccharides nói riêng. Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharides như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển.

Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (phụ lục 8). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này.

Mẫu Fucoidan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của Fucoidan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga), trong vùng số sóng 4000- 400 cm-1.

2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR

Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR ( phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H, 13C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học.

43

Phổ 1H-NMR

Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử [71].

Phổ 13C-NMR

Phổ 13C-NMR cho tín hiệu vạch phổ carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm, với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton ( từ 0-240 ppm).

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharides. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharides thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1H-NMR còn dùng để định lượng các polysaccharides có trong mẫu phân tích.

Phổ NMR được tín hiệu thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Trong phổ proton tất cả độ chuyển dịch hóa học của carbonhydrate bao gồm monosaccharide, oligosaccharide và polysaccharides có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6ppm trong chất chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học anomeric proton của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình α hay β. Như với α-anomeric proton sẽ xuất hiện tại δ 5-6ppm trong khi đó với β-anomeric proton là tại vùng δ 4- 5ppm. Mặc dù phổ 13C-NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng cũng có những lợi thế so với phổ 1H NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharides bởi vì độ chuyển dịch hóa học trong phổ 13C-NMR được trải rộng trên thang đo. Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C-NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1H-NMR. Trên phổ 13C-NMR các tín hiệu anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 90-110ppm trong khi đó các tín hiệu của nonamoreic carbon xuất hiện tại vùng δ 60 và 80ppm. Với polysaccharides có nhóm deoxygen như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15-20ppm). Với hai loại anomeric proton, tín hiệu α-anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 100-105ppm. Với polysaccharides có chứa nhóm uronic acid, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170-

44

180ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60- 64ppm), trong khi độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2,3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65-85ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển dịch về phía trường yếu 5-10ppm[71].

Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharides chưa xác định được ngay cấu trúc mà cần so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc phổ 2D NMR và một số kĩ thuật khác. Phổ 1H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharides. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton(1H- NMR) có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt các tín hiệu oligonucleotide, protein hay lipid).

Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4ppm đến 5,8ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng monomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hóa học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn chung kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hóa học.

Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C HSQC.

Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hóa. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharides được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính xác cần xác định thu được từ các loại phổ hai chiều như HSQC, HMBC và COSY.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn

45

Đông, L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu Fucoidan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/mL, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt độ 35oC.

2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ MS

K thuật ESI/MS: Nguyên lý chung của k thuật ESI (hình 2.3): trong k thuật phun mù điện tử, sự ion hóa được thực hiện bằng cách sử dụng điện trường để tạo các giọt tích điện, tiếp theo các ion phân tử sẽ được tạo ra thông qua sự ion hóa hơi dung môi từ các giọt đó. Ion hóa phun mù điện là quá trình mà các ion được tạo nên từ pha lỏng và phát sinh từ sự co các giọt tích điện. Luồng khí N2 được phun cùng với dung dịch để tạo mù, các giọt ban đầu được hình thành là nhờ vào điện trường, sự giới hạn tốc độ dòng và % nước trong dung dịch,... Luồng khí trơ nóng được thổi vào các giọt tích điện, làm bay hơi dần dung môi, khi đó diện tích bề mặt của các giọt sẽ bị co lại. Khi tỷ lệ điện tích/thể tích giọt vượt quá giới hạn Rayleigh sẽ dẫn đến sự nổ Coulomb tạo thành các giọt tích điện mới bé hơn và dần dần là ion phân tử [58,64,72].

Hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của k thuật ion hóa ESI-MS

Theo cơ chế này các mảnh tạo thành khi nhóm sulfate trong vòng đường chiếm vị trí C2, C3, C4 sẽ xuất hiện một số mảnh đặc trưng tương ứng. Trong chế độ đo ion âm (negative mode), các gốc đường chứa nhóm sulfate thường bị cắt đến monomer trước khi vòng đường bị phá vỡ. Tùy theo vị trí các gốc sulfate trong phân tử đường mà cơ chế phân mảnh các gốc đường xảy ra như sau (hình 2.4, 2.5).

46

Hình 2.4. Cơ chế phân mảnh của carbohydrat.

Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate.

47

Bảng 2.1. Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate

ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm

Vị trí

0,2A 0,3A 0,4A 0,2X 0,3X 0,4X

sulfate

2-O- 103 43 199

3-O- 183 43 199

4-O- 183 43 199

n,mA, n,mX: cắt theo liên kết n,m của vòng đường như hình

73 73 153 139 59 59 169 169 89

2.3. THỰC NGHIỆM

2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế Fucoidan từ rong nâu

* Chiết tách Fucoidan từ rong nâu Sargassum microc stum trong dung môi

HCl 0,01N

Các mẫu rong được cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 : 10) theo tỉ lệ w/v = 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) được tiến hành chiết 3 lần với 15 lít dung dịch HCl 0,01N (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc tách thô qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nước của 3 lần chiết được gộp lại và trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hòa được loại bớt nước bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 50-60oC. Sau đó, chúng tôi lại tiến hành cô đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa để thẩm tách loại muối, các hợp chất màu và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp trong thời gian kéo dài (48 giờ). Dịch chiết sau khi được làm sạch và cô đặc tới

48

1/10 thể tích ban đầu và được kết tủa bằng EtOH 98% theo tỉ lệ thể tích Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô bằng cách sử dụng máy đông khô chân không ta thu được bột polysaccharide dạng thô chứa Fucoidan.

* Phân oạn tinh chế Fucoidan bằng sắc ký trao ổi anion

Cân 0,5g bột polysaccharide thô gồm (Fucoidan, laminaran và polyuronan) hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần tủa không tan ta loại được polyuronan (PA) dưới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đưa lên cột DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch HCl 0,04N đến khi thử âm tính với hydrate cacbon bằng phương pháp phenol-axít sulfuric ta thu được phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn Fucoidan (F1, F2, F3, F4, F5) được tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu được cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa trong nước cất sau thời gian 24h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn Fucoidan dạng bột.

2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate

Cân 5 (mg) bột Fucoidan thô hòa tan vào nước cất thành 1mL. Lấy 200 µL dung dịch cần xác định có hàm lượng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200µL thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Sử dụng D- glucose làm chất chuẩn [68].

2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide

Mẫu Fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung tích 5mL, thêm 1mL TFA (Triflorua acetic axít) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 mL nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C-R2 AX. Các đường đơn fucose,

49

glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng các đường đơn được tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn.

2.3.4. Phân tích hàm lượng sulfate

Cân 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5mL, thêm vào 2 mL HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, trong thời gian 6 giờ. Lấy 10 μL dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 μL TCA (Trichlorua acetic axít ) và 100μL hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ= 360 nm. Hàm lượng sulfate được tính dựa vào đường chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 0,25-1 μg/mL [69].

2.3.5. Phân tích hàm lượng uronic axit

Cân 5 (mg) bột Fucoidan thô hòa tan vào nước cất thành 1mL. Lấy 250 μL dung dịch mẫu (mẫu Fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic axit)) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 mL dung dịch A (0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 mL nước cất, thêm vào từ từ 90 mL dung dịch axít sulfuric 98% đã được làm lạnh), phản ứng được tiến hành ở 100oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μL dung dịch B (100 mg Carbazole được hòa tan trong 100 mL cồn tuyệt đối) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 525 nm. Sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [70].

50

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết Fucoidan bằng dung dịch HCl 0,01N từ loài rong Sargassum microcystum, thu cùng một thời điểm nhưng thu ở 2 địa điểm khác nhau nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của môi trường đến hàm lượng Fucoidan. Kết quả được dẫn ra trên bảng 3.1.

Bảng 3.1. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực biển khác nhau

Nơi thu hái rong Các kết quả

thu nhận Hòn Rùa Bãi Trù - Vinpearland

500 500

Khối lượng rong khô đã chiết(g)

7,25 9,03

Khối lượng fuoidan thô thu được(g)

Hàm lượng thu nhận(%) 1,80 1,45

Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng Fucoidan thô đối với những địa điểm thu khác nhau sẽ khác nhau. Fucoidan thô được chiết tách thu nhận từ rong nâu Sargassum microcystum trong dung môi HCl 0,01N tại Hòn Rùa (1,80%) cao hơn rong thu tại Bãi Trù - Vinpearland (1,45%) so với trọng lượng rong khô đã được xử lý loại bỏ các hợp chất màu và lipid. Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng thu nhận Fucoidan có thể là do ở mỗi khu vực sống khác nhau, điều kiện môi trường khác nhau dẫn đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trong rong cũng khác nhau.

51

1 Bảng 3.2. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 06 loài rong nâu Việt Nam[62,65]

Stt Loài rong

Hàm lượng Fucoidan %

1 S.swartzii 0,82

2 S.oligocystum 1,80

3 S.denticapum 2,00

4 S.mcclurei 2,37

5 S.polycystum 2,57

6 S.binderi 1,13

So với các kết quả về hàm lượng Fucoidan đã được công bố trước đó của các loài rong sinh trưởng tại Việt Nam, trong cùng chi Sargasum như S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum, S.binderi lần lượt là 0,82 %, 1,80 %, 2,00 %, 2,37 %, 2,57 %, 1,13 % có thể thấy hàm lượng Fucoidan trong cùng một chi rong lại khác nhau. Kết quả bảng 3.2 cho thấy hàm lượng thu nhận Fucoidan thô từ rong S. microcystum thấp hơn Fucoidan chiết từ các loài S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum và cao hơn một số rong S.binderi, S.swartzii trong cùng chi.

52

Bảng 3.3. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 07 loài rong nâu thế giới

TLTK

Stt Loài rong Nơi thu mẫu

Hàm lượng Fucoidan %

1 Brazil 0,14 [73]

Sargassum stenophyllum

2 Brazil 0,13 [74]

Sargassum ringgoldianum

3 Brazil 0,88 [75]

Sargassum ringgoldianum

4 Nhật Bản 1,3 [76]

Sargassum fusiformis (Hizikia fusiformis)

5 Nhật Bản 5,34 [77]

Sargassum myriocystum

6 Ấn Độ 6,72 [78]

Sargassum wightii

7 Mexico 4,3 [78]

Sargassum horneri

So với các loài rong nâu thuộc chi Sargassum của các nước khác trên thế giới như Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc,… hàm lượng Fucoidan của rong nâu S. microcystum thu nhận tại Việt Nam cao hơn so với loài rong Sargassum stenophyllum (Brazil) 0,4% và các loài rong Sargassum ringgoldianum

53

0,13%, Sargassum thunbergii 0,88 %, Sargassum fusiformis (Hizikia fusiformis) 1,30 % của Nhật Bản và thấp hơn các loài rong, Sargassum myriocystum 5,34 %, Sargassum wightii 6,72% (Ấn Độ), Sargassum horneri 4,3 % (Mexico). Sự khác biệt về hàm lượng Fucoidan trong các loài rong rất khó để đưa ra so sánh, bởi hàm lượng Fucoidan thu được nhìn chung thay đổi rất nhiều (0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trưởng và phát triển, cũng như phương pháp chiết tách để thu nhận Fucoidan.

3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn

Chúng tôi phân tích thành phần Fucoidan bao gồm : carbohydrate, sulfate và uronic acid bằng phương pháp truyền thống là xây dựng đường chuẩn và xác định mật độ quang của các chất cần phân tích. Kết quả xây dựng đường chuẩn các chất được dẫn ở phụ lục 1, phụ lục 2 và phụ lục 3.

Phân tích thành phần monosaccharide trong fuocidan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xây dựng đường chuẩn dựa trên diện tích peak tương ứng. Sử dụng điều kiện phân tích mẫu trên hệ thống sắc kí ion ICS – 6000 (Thermoscientific), sử dụng cột phân tích trao đổi anion CarboPac MA1(50mm x 4); đầu dò điện hóa (Electrochemical Detector – ED), pha động NaOH 1M, tốc độ dòng 0,4mL/ phút, thể tích tiêm mẫu 500 µL, thời gian phân tích là 30 phút, chúng tôi thu được sắc lý đồ trên hình 3.1 cho thấy các mẫu chuẩn bao gồm (Fucose, Arabinose, Glucose, Galactose) các peak có đỉnh nhọn hoàn toàn tách biệt nhau.

Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn

54

Trên cơ sở thời gian lưu và diện tích peak chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn để xác định hàm lượng các thành phần monosaccharide theo các phụ lục 4,5,6,7.

3.2.2. Phân tích thành phần hóa học của Fucoidan

Để lựa chọn mẫu Fucoidan cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học của 02 mẫu Fucoidan chiết từ loài rong S.microcystum thu tại 02 địa điểm khác nhau.

2 Bảng 3.4. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực biển khác nhau

Nơi thu hái rong Các kết quả

thu nhận Hòn Rùa Bãi Trù - Vinpearland

36,06 24,4

Hàm lượng carbohydrate tổng(%)(**)

Hàmlượng sulfate 19,16 25,54

(%)(**)

9,00 10,98

Hàm lượng uronic axit(%)(**)

** Hàm lượng tính theo khối lượng mẫu Fucoidan thô phân tích

Theo kết quả phân tích bảng 3.4 , mẫu Fucoidan thu nhận tại Hòn Rùa có hàm lượng carbohydrate cao hơn gần 1,5 lần so với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Tuy nhiên hàm lượng sulfate của mẫu rong này lại thấp hơn so với mẫu Fucoidan được chiết tách với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Sự khác biệt này rất đáng kể. Hàm lượng uronic axit của cả 2 mẫu Fucoidan cũng có sự khác nhau tuy nhiên không đáng kể. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây cho thấy sulfate và uronic axit là hai trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học của Fucoidan vì vậy chúng tôi đã tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về mẫu Fucoidan

55

thô được tách chiết với mẫu rong được thu hái tại Bãi Trù - Vinpearland. Phương pháp chiết Fucoidan bằng dung môi axit loãng cũng là phương pháp được lựa chọn trong nhiều nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan đã được công bố.

Sau khi lựa chọn được Fucoidan chiết tách từ rong nâu S.microcystum thu hái tại Bãi Trù, chúng tôi tiến hành phân tích thành phần polysaccharide , kết quả dẫn ra trên bảng 3.5.

Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 cho thấy hàm lượng carbohydrate, sulfate và uronic axit của mẫu Fucoidan được chiết tách từ rong S.microc stum lần l ợt tương ứng là 24,40 %; 25,54 % và 10,98%.

Kết quả bảng 3.5 cho thấy mẫu Fucoidan thô được thu nhận từ rong nâu Sargassum microcystum trước khi chạy sắc kí phân đoạn ngoài ba thành phần chính là fucose (36,10%) và galactose (22,40%), glucose (40,80%), còn có thêm các đường đơn khác với hàm lượng rất nhỏ Arabinose (0,6%), không chứa N- Acetyl-galactosamine.

2-

3 Bảng 3.5. Thành phần hóa học mẫu Fucoidan chiết từ rong S.microcystum

Uronic SO4 Kí hiệu mẫu Thành phần đường đơn của Fucoidan (mol %) Cacbo hydrate axit

Fuc Gal

Glu

N-Acetyl

Arabinose

% % w/w* *

galactosamine

% w/w** w/w**

36,10 22,04 40,80 nd 0,60 24,40 25,54 10,98

PS- S.micro cystum

** Hàm lượng tính theo khối lượng của Fucoidan;

56

4 Bảng 3.6. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu Fucoidan phân lập từ 6 loài cùng chi với S.microcystum rong nâu Việt Nam [67].

Thành phần đường trung bình Tên loài HS Sulfate

Gluc A (%) (% mol) (%)

(%) Fuc Man Gal Xyl Glc

S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7

S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5

1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9

S. oligocystum

2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2

S. denticarpum

S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4

S.binderi 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 0

Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 và 3.6 cho thấy mẫu Fucoidan thu nhận từ rong Sargassum microcystum do chúng tôi tiến hành khảo sát so với kết quả đã được công bố về Fucoidan của các loài rong trong cùng chi do tác giả Bùi Văn Nguyên, Phạm Đức Thịnh và các cộng sự [65,66,67] thu nhận chúng ta có thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đường giữa các loài rong trong cùng chi khác nhau rất nhiều. Theo nhóm tác giả này, thành phần đường của mẫu Fucoidan được chiết tách từ các loài rong cùng chi Sargassum chứa chủ yếu đường fucose và galactose với tỉ lệ 1:1, gốc đường glucose chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ. Trong khi đó, thành phần đường đơn từ mẫu Fucoidan của loài rong Sargassum microcystum tôi đã thu nhận và nghiên cứu ngoài hai thành phần chính đường Fucose (36,1%) và Galactose (22,4%) giống như các tác giả trước đó đã nghiên cứu với tỉ lệ 3:2 thì điểm khác biệt đặc trưng nhất là gốc đường Glucose chiếm một tỉ lệ rất lớn (40,80%), cao hơn rất nhiều so với hàm lượng glucose trong mẫu Fucoidan được chiết tách từ các loài

57

rong cùng chi đã được nghiên cứu trước đó (S. oligocystum với hàm lượng glucose 7,1%,S. denticarpum với hàm lượng glucose 2%,S. swatzii với hàm lượng glucozo 6,5%, S.binderi kh ng chứa glucose...) . Như vậy, hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng thời điểm, vị trí địa lí thu rong, trong từng chi rong và từng loài rong khác nhau. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của Fucoidan. Kết quả phân tích thành phần đường chỉ ra rằng Fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của Fucoidan, nhưng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của Fucoidan trở nên vô cùng phức tạp. Đó chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới mới chỉ có một vài công bố về cấu trúc hoàn chỉnh của Fucoidan, nhưng không một công bố nào đưa ra được mối liên hệ có tính quy luật cho cấu trúc Fucoidan với các bộ rong.

Sự khác nhau này có thể được giải thích do sự khác nhau về vị trí và thời gian thu mẫu. Điều này cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của Fucoidan vô cùng phức tạp.

Theo các công bố [63,64,65,66,67] thì các Fucoidan của các loài rong tại các vùng biển Việt Nam đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfate cao, hai gốc đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các galactofucan sulfate hóa.

So với Fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc,... thì Fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn. Fucoidan phân lập từ một số loài rong nâu của vùng Viễn Đông, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như Fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica và Laminaria cichorioides có hàm lượng fucose (tính theo carbohydrate) lần lượt là 88%, 86% và 100% [37,53], hay Fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis (Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80%, Fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brazil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay loại Fucoidan duy

58

nhất được bán thương mại bởi hãng hóa chất Sigma (M ) được chiết từ rong Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm 100%. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của Fucoidan trong các loài rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brazil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung Fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác. Trong khi đó Fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của Fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong nâu.

3.2.3. Tách phân đoạn và thành phần hóa học các phân đoạn Fucoidan

Fucoidan là polymer tự nhiên có cấu trúc phức tạp mà trong thành phần hóa học của chúng luôn chứa các nhóm điện tích như gốc sulfate, gốc acetyl. Sự có mặt của chúng là một trong những yếu tố quan trọng xác định tính chất hóa lý cũng như sinh học của Fucoidan. Sự phân bố hàm lượng carbonhydrate theo nhóm điện tích (nhóm sulfate, nhóm acetyl) thường được nghiên cứu bằng phương pháp tách phân đoạn trên nhựa trao đổi ion (dạng anion hoặc cation) dùng dung dịch rửa giải là chất điện ly. Kết quả nhận được của quá trình tách phân đoạn này là các phân đoạn rửa giải sẽ chứa các polymer tự nhiên có cấu trúc tương tự nhau về hàm lượng cũng như vị trí sắp xếp của các nhóm điện tích.

Trong luận văn này chúng tôi dùng nhựa trao đổi anion trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2 x 32 cm), rửa giải gradient với dung dịch NaCl từ 0,1M đến 2,0M và thu lấy 5 phân đoạn. Quá trình sắc ký được biểu diễn trên hình 3.2.

59

5 Hình 3.2. Phân đoạn Fucoidan được chiết từ rong S.microcystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose.

Bảng 3.7. Hàm lượng thu nhận các phân đoạn Fucoidan

Kí hiệu mẫu Khối lượng mẫu Công thức tính

Hàm lượng thu nhận(%) thu nhận

20,5(mg) 4,12 (20,5x100):500 F1

22,4(mg) 4,48 (22,4x100):500 F2

78,15(mg) 15,63 (78,15x100): 500 F3

54,68(mg) 10,94 (54,68x100):500 F4

45,80(mg) 9,16 (45,80x100):500 F5

60

Kết quả tách phân đoạn Fucoidan từ rong S. microcystum (hình 3.2) ta thấy có 05 phân đoạn F1, F2, F3, F4 và F5 được tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lượt là 0,3N; 0,5N; 0,8N; 1,0N và 1,5N. Với 05 phân đoạn thu được sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.microcystum sinh tổng hợp nên 5 dạng loại Fucoidan khác nhau. So với kết quả phân đoạn thu được của Fucoidan từ các loài rong khác thuộc chi Sagassum có thể thấy mỗi loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại Fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn Fucoidan được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích (nhóm sulfate). Điều này có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE- Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, vì vậy để giải phóng phân đoạn Fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Chính vì lý do này mà các phân đoạn Fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau tùy thuộc vào mật độ nhóm sulfate sẽ được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau.

6 Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F1

61

7 Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F3

8 Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F4

9 Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F5

62

Bảng 3.8 : Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong

Sargassum microcystum.

Thành phần monosaccharide (mM)

Uronic SO3Na (tỷ lệ mol) Phân đoạn % Axit % Hiệu suất (%)

Fucose Galactose GalN Arabinose Gluco

Fucoidan 25,5 10,98 0,62 - 0,16 1,13 1 thô

F1 4,12 13,54 5,04 0,78 0,07 0,072 0,76 1

F2 4,48 19,40 4,28 0,63 0,03 - 0,62 1

F3 15,63 22,80 14,86 0,31 - - 0,51 1

F4 10,94 28,94 5,22 0,31 - - - 1

F5 9,16 32,94 14,8 0,34 - - - 1

Kết quả bảng 3.8 cho thấy hiệu suất tách phân đoạn là 44,33% và hiệu suất tách phân đoạn từ F1 đến F5 lần lượt là 4,12%; 4,48%; 15,63%; 10,94% và 9,16%. Cao nhất là phân đoạn F3 và thấp nhất nhất là phân đoạn F1 và F2. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn F1 đến phân đoạn F5, chúng dao động từ 13,54% - 32,94%. Điều này có thể được giải thích khi hàm lượng gốc sulfate trong các phân đoạn càng cao thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh nên cần rửa giải các phân đoạn sau cần nồng độ rửa giải của muối cao hơn. Tuy nhiên hàm lượng uronic acid thay đổi không theo sự thay đổi của nhóm sulfate là theo sự tăng dần nồng độ chất điện ly của dung dịch rửa giải mà thay đổi không theo quy luật. Hàm lượng uronic cao nhất trong phân đoạn F3 và F5 và thấp nhất trong các phân đoạn F1, F2 và F4.

63

Điều này có thể được giải thích bởi sự có mặt một vài dạng uronic acid khác nhau trong Fucoidan thô chiết từ rong Sargassum microcystun.

Thành phần đường của Fucoidan và các phân đoạn bao gồm fucose, galactose, glucose, arabinose. Trong đó thành phần chính của Fucoidan thô là fucose, galactose, glucose, arabinose, sulfat với tỷ lệ mol là 1 : 0,62 : 0,16 :0,72 và lượng nhỏ hợp chất N-Acetylgalactosamine. Ngoài thành phần đường Fucoidan còn có 02 thành phần mang điện tích là nhóm sulfate và nhóm acetyl (axit uronic). Fucose có trong thành phần của tất cả các phân đoạn và đặc biệt là sự có mặt đường galactose trong trong tất cả các phân đoạn với hàm lượng biến đổi từ 0,31 đến 0,78 Mmol chứng tỏ rằng Fucoidan chiết từ loài rong Sargassum microcystum là dạng sulfate galactofucan. Phân đoạn F1, F2 và F3 ngoài 2 thành phần chính chủ yếu là fucose và galactose còn chứa một lượng tương đối lớn glucose và một lượng nhỏ các gốc đường khác như arabinose hoặc N-Acetyl galactosamine trong khi các phân đoạn F4 và F5 chỉ có 02 thành phần đường chính là fucose và galatose. Từ dữ liệu trên có thể cho rằng phân đoạn F4 và F5 có cấu trúc đơn giản hơn các phân đoạn còn lại. Tỷ lệ mol giữa các đường fucose : galactose của các phân đoạn từ F1 đến F5 tương ứng với các giá trị sau : F1 (1:0,78), F3 ((1:0,63), F3 là (1:0,31), F4 (1:0,31) và F5 là (1:0,34). Tỷ lệ này gần giống nhau đối với 03 phân đoạn là F3, F4 và F5, tuy nhiên với phân đoạn F3 còn thêm thêm thành phần đường glucose và có tỷ lệ mol Fucose : galactose : glucose là (1 :0,31 :0,51). Vì vậy cấu trúc của Fucoidan phân đoạn F3 khác với cấu trúc phân đoạn F4 và F5. Không chỉ có tỷ lệ mol fucose : galactose gần như nhau mà hàm lượng sulfate khác nhau không đáng kể, nên có thể phân đoạn F4, F5 có bộ khung cấu trúc và vị trí nhóm sulfate gần như nhau. Sự khác nhau về cấu trúc của 2 phân đoạn trên chỉ là hàm lượng uronic acid khác nhau F4 (5,22 %), F5 (14,8%). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phân đoạn F4 để phân tích sâu hơn các đặc điểm cấu trúc.

64

3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE

Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate bao gồm các thông tin sau:

- Thành phần hóa học

- Vị trí nhóm thế

- Vị trí liên kết và kiểu liên kết

Thành phần hóa học chính của phân đoạn F4 (bảng 3.7) gồm 02 loại đường là fucose, galactose, nhóm điện tích sulfate và lượng nhỏ uronic acid theo tỷ lệ mol như sau 1: 0,31: 0,3. Như vậy để đưa ra vị trí nhóm sulfate cũng như kiểu liên kết α hay β và vị trí liên kết của 02 thành phần đường, chúng tôi tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối (MS).

* Phổ Hồng ngoại (IR).

Theo các tài liệu đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của Fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường,... trong đó hàm lượng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của Fucoidan. Sulfate là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định hoạt tính sinh học của Fucoidan, theo các nhà khoa học [45,46,47,48] hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng ung thư của Fucoidan phụ thuộc vào mật độ và vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường. Vì vậy, việc phân tích hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường trong phân tử Fucoidan sẽ giúp ta làm sáng tỏ về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và đặc trưng cấu trúc của chúng. Phổ hồng ngoại IR là một trong những phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng để xác định vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường .

Phổ hồng ngoại là phương pháp phân tích nhanh và thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vạch phổ dao động tương ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử. Trong phân tích cấu trúc của polysaccharide, phương pháp phổ IR cho biết các thông tin về vị trí nhóm sulfate tồn tại trong phân tử Fucoidan, từ đó cho biết về đặc trưng cấu trúc của chúng.

65

Theo các công trình nghiên cứu đã được công bố, các dao động hấp thụ ở vùng số sóng 820-828 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-S ở vị trí equatorial C2 hoặc/và C3, vùng 840-848 cm-1 đặc trưng cho liện kết C-O-S ở vị trí axial C4, vùng 1240-1272 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của S = O, vùng 1610-1625 cm-1 và 1410 cm-1 đặc trưng cho dao động đối xứng và không đối xứng của nhóm cacboxylat[78].

Khi khảo sát phổ IR mẫu Fucoidan thô và phân đoạn F4 chúng tôi nhận thấy tương tự như phổ hồng ngoại của Fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới và ở Việt Nam, phổ hồng ngoại của mẫu Fucoidan thô và các phân đoạn chiết từ rong nâu Sargassum microcystum tại Bãi Trù thuộc vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa cũng chứa những tín hiệu hấp thụ ở vùng 1240-1272 cm-1 (vùng dao động đặc trưng của liên kết S = O) và vùng 800-848 cm-1 (vùng dao động của liên kết C - O - S) khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate.

C4

-OH

C=O C2

S=O

Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu Fucoidan thô được chiết tách từ rong Sargassum microcystum

Trên phổ IR của mẫu Fucoidan thô (hình 3.7) xuất hiện các tín hiệu hấp thụ tại 3418,32 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ rộng tại 1263,55 cm-1 thuộc về các dao động hóa trị S=O của nhóm sulfate (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1635,80 cm−1 xác nhận sự có mặt của các axit uronic [81]. Dải hấp

66

thụ tại 840,96 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C4 và và vân phổ nhỏ tại vùng 805 cm-1 thuộc về sulfate tại vị trí C2 của vòng -1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C

pyranose [28]. Dải hấp thụ ở 1042,11 cm hay có sự hiện diện của hemiacetal.

C4

C=O

S=O

C2 S=O -OH

Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4(Sargassum microcystum)

Phổ IR của phân đoạn F4 (hình 3.9): Dải hấp thụ tại 3445,05 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ tại 1266,36 cm-1 (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1635,18 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic axit [81]. Dải hấp thụ tại 840,71 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C4 và vân phổ nhỏ tại vùng 805 cm-1 thuộc về sulfate tại vị trí C2 của vòng pyranose [28]. Dải hấp thụ ở 1098,18 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O- C hay có sự hiện diện của hemiacetal.

Qua kết quả phân tích phổ hồng ngoại một lần nữa khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử Fucoidan, điều này cũng phù hợp với các kết quả phân tích thành phần monosaccharide ở bảng 3.7. Tuy nhiên phổ IR cũng chỉ cho biết một phần thông tin về vị trí nhóm sulfate chiếm ưu thế tại vị trí C4 và lượng nhỏ nhóm sulfate tại vị trí C2 hoặc C3 trên gốc đường pyranose, để xác định chính

67

xác vị trí của các nhóm sulfate trong gốc đường galactose và fucose chúng ta cần thêm những thông tin từ phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ khối (MS).

Kết luận: Phổ Hồng ngoại xác nhận sự có mặt sulfate và vị trí nhóm sulfate

tại vị trí C4 và tại vị trí C2 trên gốc đường pyranose (galactose và fucose).

*Phổ Cộng hưởng từ hạt nhân.

Vì Fucoidan là một polymer có cấu trúc phức tạp, để thu được phổ NMR và MS có độ phân giải tốt mẫu Fucoidan được tiến hành thủy phân nhẹ với điều kiện đưa ra trong phần phương pháp nghiên cứu.

Hình 3.9 a. Phổ 1H - NMR của phân đoạn F4.

68

Hình 3.9 b. Phổ 13C- NMR của phân đoạn F4.

Phổ 1H-NMR của phân đoạn F4 (Hình 3.9 a) chúng tôi thấy có các tín hiệu sau. Tín hiệu 1,2-1,5 ppm là vùng H6 của fucose với cường độ mạnh, vùng 3,5-4,5 ppm là vùng H của các gốc đường pyranosyl và vùng 5,2-5,5 là vùng H1 của anomer dạng . Điều này cho thấy trong phân đoạn F4 có mặt chủ yếu là -L-

fucose. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích thành phần monosacharide trong mẫu phân đoạn F4.

So sánh phổ 1H-NMR của fucan sulfat hóa ở C4 thì phổ 1H-NMR của galactofucan sulfat hóa ở C4 còn xuất hiện thêm 02 nhóm tín hiệu 4,5 -4,9 ppm tại vùng H1 của anomer dạng β. Điều này được giải thích bởi sự có mặt của gốc đường galactose trong phân tử galactofucan. Kết quả này chứng tỏ rằng galactose có mặt trong galactose là dạng β-D-galactose.

Như vậy phổ 1H-NMR xác nhận sự có mặt 02 kiểu liên kết khác nhau đó là

-L-fucose và β-D-galactose.

Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 (Hình 3.9b) có độ phân giải khá tốt. Trên phổ chỉ thấy xuất hiện 03 nhóm tín hiệu như sau : Nhóm tín hiệu rõ ràng nhất ở vùng trường cao tương ứng với độ chuyển dịch hóa học trong vùng 17 ppm, nhóm tín hiệu ở vùng trường thấp tương ứng với độ dịch chuyển hóa học trong vùng 100 ppm và nhóm tín hiệu trong vùng 60-80 ppm. Theo các công bố [80,81]

69

đây là nhóm tín hiệu đặc trưng của nhóm methyl trong gốc fucopyranosyl, tín hiệu của C1 anomer và những tín hiệu của cacbon trong vòng hexopyranose từ C2 đến C5. Sự có mặt tín hiệu tại 80ppm chứng tỏ rằng trong phân tử F4 có tồn tại liên kết (1→4)-fucose và/hoặc (1→4)-galactose. Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy F4 chỉ có 2 loại đường là fucose và galactose. Tuy nhiên vùng anomeric của cả 2 phổ 1H và 13C-NMR đều nhiều hơn 2 peak, điều đó chứng tỏ, 2 thành phần này tham gia các liên kết glycoside khác nhau. Để xác nhận các liên kết trong vùng anomer, chúng tôi tiến hành phân tích phổ HSQC của phân đoạn F4. Như vậy trên phổ 13C-NMR xác nhận sự có mặt của fucose, galactose và có sự tồn tại của liên kết (1→4)-fucose và/hoặc (1→4)-galactose.

* Phổ HSQC

Vùng anomeric có 3 tín hiệu, tín hiệu tại H1/C1 tại 4,54/96,28 ppm được quy cho -D-galactose ; 2 tín hiệu tại 5,22/92,35 ppm và 5,37/99,1 ppm là của α-L-

fucose tồn tại ở mạch chính và mạch nhánh của phân tử Fucoidan F4; 2 tín hiệu mạnh tại 16,01/1,20 và 15,3/1,28 ppm ứng với nhóm CH3 của fucose. Trên phổ 1H- NMR trong vùng anomeric có 4 tín hiệu tuy nhiên trên phổ HSQC chỉ xuất hiện 03 tín hiệu thuộc về H1 như vậy tín hiệu còn lại 4,8 ppm thuộc về tín hiệu của proton trong gốc đường. Vùng tín hiệu của proton trong gốc đường (trừ vùng tín hiệu H1) luôn luôn nhỏ hơn 4,6 ppm, vì vậy có thể cho rằng đây là tín hiệu của proton có gắn với nguyên tử C có mang nhóm thế có độ âm điện cao. Theo các công trình [82] đây là vị trí H4 có nhóm thế sulfate. Theo kết quả bảng 3.7 thành phần của Fucoidan và phổ hồng ngoại có thể cho rằng tín hiệu này thuộc về proton H4 của 2 monomer là galactose và fucose. Mặc dù vậy, trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu vùng 3,7 là vùng tín hiệu H4 của các gốc đường fucopyranosyl chứng tỏ rằng chỉ một phần nhóm OH ở vị trí số 4 bị thế bởi nhóm sulfate.

70

Hình 3.10. Phổ HSQC phân đoạn F4

Trên phổ hồng ngoại và phổ 1H-NMR đã xác nhận nhóm sulfate ở vị trí C4 và C2 trong gốc đường. Vì vậy các liên kết glycoside tồn tại trong mạch chính

71

polymer Fucoidan chỉ có thể là liên kết (1→3). Điều này thấy rất rõ trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR vùng tín hiệu H6 là 1,2 ppm-1,3 ppm [83].

Để dự đoán các dạng anomer có thể tồn tại trong phân đoạn F4, chúng tôi phân tích phổ 1H-NMR và phổ HSQC, kết quả cho thấy có 02 tín hiệu của α-L- fucose và 01 tín hiệu -D-galactose. Như vậy trong phân đoạn F4 có tồn tại ít nhất

3 loại anomer có độ lặp lại cao tương ứng với 3 tín hiệu trên.

Từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng

từ hạt nhân, chúng tôi dự đoán có thể có các dạng anomer sau:

1. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết chủ

yếu là (1→3) và một phần liên kết (1→2)/( (1→4)

2. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết mạch

chính (1→3) có liên kết mạch nhánh (1→2)/(1→4)

3. Anomer -D galactose-4-sulfate có liên kết (1→3) hoặc (1→2/(1→4)

Theo các tài liệu [83] nếu fucose có liên kết glycoside (1→2) không có nhóm thế và có nhóm thế sulfate thì tín hiệu H1 dao động trong vùng 5,0 ppm và Beagle`re Tissot [84] cho rằng Fucoidan có nhóm thế sulfate ở vị trí số 4 ít khi có liên kết glycoside (1→2) vì không thuận lợi về mặt năng lượng và cấu hình. Mặt khác trên phổ 1H-NMR không xuất hiện tín hiệu 5,0 ppm. Chính vì lý do nêu trên chúng tôi cho rằng Fucoidan này không có khả năng liên kết (1→2) trong mạch chính mà chủ yếu là liên kết (1→3) trong mạch chính.

Để xác nhận sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí C2 và C4 trong 2 vòng galactopyranose và fucogalactose cũng như sự tồn tại, chúng tôi tiến hành phân tích phổ khối (MS) của phân đoạn F4.

*Phổ Khối (MS).

Phổ ESI-MS của F4 được đưa ra trên hình 3.11 và một số mảnh đặc trưng được đưa ra trên bảng 3.9. Pic cơ sở tại m/z 243,07 là của monosulfate fucose [FucSO3]-. Tín hiệu tại m/z 225,03 đươc gán cho [FucSO3-H2O]-. Tín hiệu tại m/z 389,09 là của [Fuc2SO3]-. Hai tín hiệu ở m/z 405 và 507 là của [FucGalSO3]− và [FucGal(SO3)2]−[58,72].

72

Hình 3.11. Phổ ESI-MS của phân đoạn F4

Bảng 3.9.Một số mảnh đặc trưng trên phổ ESI-MS của Fucoidan.

m/Z ion

243,07 [FucSO3]-

225,03 [FucSO3-H2O]-

389,09 [Fuc2SO3]-

405 [FucGalSO3]−

507 [FucGal(SO3)2]−

73

Để xác nhận vị trí nhóm sulfate

tại gốc đường fucopyranose, galactopyranose cũng như vị trí liên kết của các gốc đường, chúng tôi tiếp tục thực hiện phép phân tích phổ khối 2 lần một số ion cơ sở sau:

-Mảnh m/z 243,07 của ion [FucSO3]- để xác nhận vị trí nhóm sulfate tại gốc đường fucopyranose. Phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 243 đưa ra trên hình 3.12.

- Mảnh m/z 389,09 của ion [Fuc2SO3]- để xác định liên kết fucose-fucose.

Phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 389,09 đưa ra trên hình 3.13.

- Mảnh m/z 405 của ion [FucGalSO3]− để xác định vị trí nhóm sulfate tại gốc đường galactopyranose và xác định liên kết fucose-galactose. Phổ ESI- MS/MS của ion tại m/z 389,09 đưa ra trên hình 3.14.

Bérangère Tissot và cộng sự [58,72,84] đã nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí nhóm sulfate lên phổ MS, các tín hiệu tại m/z 183,02 chỉ ra sự có mặt của nhóm sulfate ở vị trí C4 và tín hiệu tại m/z 138,86 là do nhóm sulfate tại vị trí C2 của α-L-Fucose. Trên phổ ESI-MS/MS (hình 3.11), thấy xuất hiện các tín hiệu 183,03 và tín hiệu 138,86 do sự cắt mạch 0,2A và 0,2X (hình 3.11), theo [58,72] thì đây là 02 tín hiệu thuộc về sulfate tại vị trí C2 và C4 trong gốc fucose. Tín hiệu tại 138,86 có cường độ lớn chứng tỏ gốc đường fucose bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C2. Như vậy, phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 243,0 xác nhận vị trí nhóm sulfate là C2 và C4 trong vòng fucopyranose.

74

Hình 3.12. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]-, m/z 243

Phổ ESI-MS/MS của mảnh tại m/z 389,09 được đưa ra trên hình 3.13. Mảnh 243 hình thành do sự cắt liên kết glycoside (dạng Y) có cường độ mạnh. Hai mảnh khác cũng có cường độ mạnh tại m/z 139 (0,2X), 225 (B1) và 1 mảnh cường độ yếu tại m/z 183 (0,2A). Các kết quả này chứng tỏ rằng phân đoạn F4 đang nghiên cứu bị sulfate hóa tại vị trí C2 và C4 của fucose. Ngoài ra trên phổ còn có các mảnh tại m/z 371 là do mảnh 389 bị loại nước. Các tín hiệu tại 285 và 315 là do sự cắt mạch 0,2X1 and 0,3X1 (Hình 3.15), chứng tỏ sự có mặt của α(1→3)- L-fucose. Mặt khác trên phổ không thấy sự tồn tại của các mảnh dạng 0,2A (m/z 204, 329, 431), là các mảnh biểu hiện cho sự có mặt của (1→4)-α-L- fucose, các mảnh này đặc trưng cho Fucoidan tách ra từ rong nâu Ascophyllum nodosum và Fucus evanescens [18,19,22]. Như vậy phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- xác nhận liên kết giữa 2 gốc fucose là liên kết α(1→3)- L-fucose và khẳng định nhóm sulfate tại vị trí C2 và C4 của gốc đường fucose.

75

Hình 3.13. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]-, m/z 389

Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGluSO3]- tại m/z 405 (Hình 3.14) là rất phức tạp. Các tín hiệu mạnh nhất là sự cắt mạch Y1 tại m/z 243 và 259 từ phân cắt của fucose monosulfate và glucose. Ion dạng B1 tại m/z 225 là do sự mất nước của monosulfate α-L-Fucp và tại m/z 241 từ sự mất nước của monosulfate galactose, cả 2 tín hiệu này đều có cường độ khá mạnh. Liên quan đến các nghiên cứu về liên kết glycoside, một nghiên cứu trước đây của các phân mảnh của disaccharide của heparin [72] cho thấy cơ chế hình thành các ion 0,2A2 yêu cầu hydro tự do ở nhóm hydroxyl C3, để hỗ trợ việc cắt mạch tại liên kết C2-C3. Bên cạnh đó ion 0,2A2 tại m/z 345 và 0,2X0 ion có cường độ lớn có thể là bằng chứng của liên kết (1-4). Các ion dạng 0,2A1 và 3,5A1 tại m/z 199 và 153, có thể là do sulfate tại vị trí số 4 của galactose. Như vậy, trên phổ ESIMS/MS của ion [FucGalSO3]−, xác nhận liên kết giữa 2 gốc đường fucose và galactose là liên kết (1→4) và nhóm sulfate tại vị trí C4 trong vòng galactopyranose.

76

Hình 3.14. Phổ ESIMS/MS của ion [FucGalSO3]-, m/z 405

77

78

Hình 3.15. Sự phân mảnh của Fucoidan từ rong nâu Sargassum microcystum dựa vào phổ ESI-MS/MS.

Theo kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ hồng ngoại, phổ cộng

hưởng từ hạt nhân và phổ khối xác nhận sự có mặt 03 anomer là:

1. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết chủ

yếu là (1→3)

2. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết mạch

chính (1→3) có liên kết mạch nhánh (1→4) -D galactose

79

3. Anomer -D galactose-4-sulfate có liên kết (1→4) trong mạch chính

Tất cả các kết quả trên chỉ ra rằng phân đoạn Fucoidan F4 chiết tách từ rong nâu Sargassum microcystum có cấu trúc gồm mạch chính chủ yếu là α(1→3)-L-

fucopyranose và một phần nhỏ là-(1→4)-D galactose, mạch nhánh là α-L-

fucopyranosyl-(1→4) và/hoặc β-D-galactopyranosyl-(1→4), nhóm sulfate thế tại vị trí C2, C4 của đường fucose và C4 của gốc đường galactose. Cấu trúc được đưa ra trong hình 3.16.

R = α-l-fucopyranosyl-(1→4) và/hoặc β-D-galactopyranosyl-(1→4)

Nhóm sulfate gắn vào vị trí C2 và C4 của fucose và galactose

Hình 3.16. Cấu trúc của Fucoidan F4 từ rong nâu Sargassum microcystum

80

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên chúng tôi đã được được một số kết quả như sau:

1. Fucoidan đã được phân lập và tách phân đoạn từ loài rong nâu Sargassum microcystum thu hoạch ở vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Hàm lượng Fucoidan thu nhận được theo phương pháp chiết với dung môi axit nhẹ (pH = 2) là 1,8%. Kết quả tách phân đoạn bằng k thuật sắc ký trao đổi ion cho ra 05 phân đoạn Fucoidan theo gradient tăng dần nồng độ của dung môi rửa giải NaCl (0-2N) lần lượt là F1 (NaCl 0,3N), F2 (NaCl 0,5N), F3 (NaCl 0,8N), F4 (NaCl 1,0N) và F5 (NaCl 1,5N). Trong đó, các phân đoạn chiếm hàm lượng lớn nhất là F3 (15,63%), F4 (10,94%) và F5 (9,16%).

2. Thành phần monosaccharide chính của Fucoidan tổng là fucose (36,10%) và galactose (22,04%), glucose (40,8%), bên cạnh đó còn có một lượng nhỏ không đáng kể arabinose (0,6%). Hàm lượng carbohydrate, sulfate và uronic axit lần lượt là 24,40%, 25,54%; 10,98%. Kết quả phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan đại diện F3, F4, F5 so với Fucoidan tổng cho thấy tỉ lệ giữa gốc đường fucose tăng lên so với các gốc đường còn lại, hàm lượng sulfate cũng có sự tăng lên tuy nhiên tại 2 phân đoạn F3 và F5 hàm lượng uronic axit vẫn còn chiếm tỉ lệ lớn tương ứng là 14,86% và 14,8%.

3. Một số đặc trưng cấu trúc của phân đoạn Fucoidan đại diện F4 đã được xác định, phân đoạn Fucoidan F4 này thuộc nhóm galactofucan sulfate, Tất cả các kết quả trong phạm vi nghiên cứu của luận văn chỉ ra rằng phân đoạn Fucoidan F4 chiết tách từ rong nâu Sargassum microcystum có cấu trúc gồm mạch chính chủ

yếu là liên kết α(1→3)-L-fucopyranose và một phần nhỏ là-(1→4)-D galactose,

mạch nhánh là α-L-fucopyranosyl-(1→4) và/hoặc β-D-galactopyranosyl-(1→4), nhóm sulfate thế chủ yếu ở C2 và 1 phần ở C4 của gốc đường fucose và nhóm thế sulfate tại vị trí C4 của gốc đường galactose.

81

4.2. KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu phân tích chi tiết cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của Fucoidan từ rong S.microcystum và từ các loài rong nâu khác của Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính kháng ung thư và các hoạt tính sinh học khác từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên rong nâu của Việt Nam.

2. Nghiên cứu chuyển hóa Fucoidan bằng con đường xúc tác sinh học (chuyển hóa bằng enzyme) để tạo ra các sản phẩm oligo-Fucoidan mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu hơn và mạnh hơn sử dụng cho mục đích làm thuốc hoặc thực phẩm chức năng.

82

10 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Hữu Dinh và Huỳnh Quang Năng, 2001, Năm loài mới thuộc chi rong Mơ - Sargassum ở ven biển Việt Nam. ạp ch Sinh học, 23 (1), tr. 1- 10.

2. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí, 2003, Một số loài rong biển mới bổ sung cho Việt Nam - Phần II, u ển tập Nghiên cứu biển, 13, tr. 95-114.

3. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí , 2002, Một số loài rong biển mới bổ sung cho khu hệ rong biển Việt Nam - Phần I, u ển tập Nghiên cứu biển, 12, tr. 149-158 .

4. Phạm Hoàng Hộ, 1969, Rong biển Việt Nam - Phần III. Phaeophyceae,

NXB rung tâm học liệu Sài Gòn.

5. Nguyễn Hữu Đại, 1997, Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam: Nguồn lợi và

sử dụng, NXB N ng nghiệp P ồ Ch Minh, tr. 198.

6. Kylin, H, 1913, Zur biochemie der Meersalgen, Z. Physiol, Chem, 83, pp.

171 -197.

7. Usov. A. I, Bilan. M. I, 2009, Fucoidans-sulfated polysaccharides of brown

algae, Russian Chemical Reviews, 78 (8), pp. 785-799.

8. Park, Y.H., Jang D.S. and Kim S.B, 1997a, Utilization of marine products (2nd edition); Chapter 4, Seaweed composition, Hyoungsul press, pp. 283- 336.

9. Micheline, R.S.; Cybelle, M.; Celina, G.D.; Fernando, F.S.; Hugo, O.R.;Edda, L, 2007, Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds, J. Appl. Phycol. 19, pp.153-160.

10. Wijesinghea W.A.J.P., Jeon Y. J, 2012, Biological activities and potential indusppial applications of fucose rich sulfated polysaccharides and Fucoidans isolated from brown seaweeds: A review, Carbohydrate Polymers, 88, pp. 13–20.

83

11. Nguyễn Hữu Đĩnh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến,

1993, Rong biển miền Bắc Việt Nam, Nhà XB KHKT, Hà Nội.

12. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh, 2004, Tiềm năng rong biển Việt Nam,

NXBKHKT, Hà Nội.

13. Percival, E. and McDowell, R.H, 1967, Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides, Academic Press, London and NEW YORK, pp. 6-28 & 73-96 &157-174.

14. Percival, E.G.V. and Ross, A.G, 1950, Fucoidin Part I: The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds. Journal of the Chemical Society, pp. 717-720.

15. Nishino, T., Aizu, Y., & Nagumo, T, 1991, The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity, Thrombosis Research, 64(6), pp. 723- 731.

16. Seng Joe Lim, Wan Mustapha, Wan AidaMohamad, Yusof Maskat Jalifah, Latip Khairiah, Haji Badri, Osman Hassan, Bohari M.Yamin, 2016, Characterisation of Fucoidan extracted from Malaysian Sargassum binderi, Food Chemistry, 209(15), pp. 267-273.

17. Li, B.; Xu, S.Y, 2007, Structural investigation of oligosaccharides in partial acid hydrolyzed products of Fucoidan isolated from Hizikia fusiforme, Nat. Prod. Res. Dev, 19, pp. 550-553.

18. Daniel, R., Berteau, O., Chevolot, L., Varenne, A., Gareil, P. and Goasdoue, N, 2001, Regioselective desulfateion of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten maximus: Application to the structural study of algal Fucoidan (Ascophyllum nodosum), European Journal of Biochemistry, 268, pp. 5617-5626.

19. Daniel, R.; Chevolot L.; Carrascal M.; Tissot, B.; Mourão, P.A.S.; Abian, J, 2007, Electrosprayionization mass spectrometry of oligosaccharides derived

84

from Fucoidan of Ascophyllum nodosum, Carbohydrate Research. 342, pp. 826-834.

20. Nagaoka, M., Shibata, H., Kimura-Takagi, I., Hashimoto, S., Kimura, K., Makino, T., Aiyama, R., Ueyama, S., and Yokokura, T, 1999, Structural study of Fucoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida, Glycoconj. J. 16 (1), pp. 19-26.

21. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Ustuzhanina, N.E.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.; Usov, A.I, 2004, A Highly regular fraction of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L, Carbohydrate Research, 339, pp. 511- 517.

22. Bilan, M.I, Grachev A.A., Ustuzhanina N.E, 2002, Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C. Ag, Carbohydrate Research, 337, pp. 719-730.

23. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.; Usov, A.I, 2006, Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L. Carbohydrate Research, 341, pp. 238-245.

24. Li Bo, Fei Lu, Xinjun Wei and Ruixiang Zhao, 2008, Fucoidan: Structure

and Bioactivity, Molecules, 13, pp. 1671-1695.

25. Ejaz Hussain, Li-Jun Wang, Bo Jiang, Saba Riaz, Ghazala Yasmeen Buttd and Da-Yong Shia, 2015, Components of brown seaweeds are potential candidate for cancer therapy - a review, RSC Advances, pp. 1-22.

26. Qiu, X.D.; Amarasekara, A.; Doctor, V, 2006, Effect of oversunphation on the chemical and biological properties of Fucoidan, Carbohydrate Polymers, 63, pp. 224-228.

27. Hemmingson, J.A.; Falshaw, R.; Furneaux, R.H.; Thompson, K, 2006, Structure and antiviral activity of the galactofucan sunphates exppacted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol, 18, pp. 185-193.

28. Mandal, P.; Mateu, C.G.; Chattopadhyay, K.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B.; Ray, B, 2007, Structural features and antiviral activity of sulphated fucans

85

from the brown seaweed Cystoseira indica. Antivir, Chem. Chemother, 18, pp. 153-162.

29. Silva, T.M.A.; Alves, L.G.; Queiroz, K.C.S.; Santos, M.G.L.; Marques, C.T.; Chavante, S.F.; Rocha, H.A.O.; Leite, E.L, Partial characterization and anticoagulant activity of a heterofucan from the brown seaweed Padina gymnospora, Braz. J. Med. Biol. Res, 38, pp. 523-533.

30. Dohura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.; Iha, M, 2007, Prophylactic effect of dietary seaweed Fucoidan against enteral prion infection, Antimicrob. Agents Chemother, 51, pp. 2274-2277.

seaweed Hizikia activity

31. Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M, 1989, Isolation and preliminary characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides with fusiforme, from blood-anticoagulant Carbohydrate Research, 194, pp. 315-320.

32. Nishino, T.; Yokoyama, G.; Dobahi, K, 1989, Isolation, purification and characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities, Carbohydrate Research, 186, pp. 119-129.

33. Hemmingson, J.A., Falshaw, R, Furneaux, R.H, Thompson, K, 2006, Structure and antiviral activity of the galactofucan sunphates exppacted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol, 18, pp. 185-193.

34. Doh-ura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.; Iha, M, 2007, Prophylactic effect of dietary seaweed Fucoidan against enteral prion infection, Antimicrob, Agents Chemother, 51, pp. 2274-2277.

35. Mandal, P.; Mateu, C.G.; Chattopadhyay, K.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B.; Ray, B, 2007, Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica, Antivir, Chem. Chemother, 18, pp. 153-162.

36. Hayashi, K.; Nakano, T.; Hashimoto, M.; Kanekiyo, K.; Hayashi, T, 2008, Defensive effects of a Fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida

86

against herpes simplex virus infection, Int, Immunopharmacol, 8, pp. 109- 116.

37. Shi, Z.Y.; Guo, Y.Z.; Wang, Z, 2000, Pharmacological activity of Fucoidan

from Laminaria japonic, J. Shanghai Fish. Univ, 9, pp. 268-271.

38. Aisa, Y.; Miyakawa, Y.; Nakazato, T.; Shibata, H.; Saito, K.; Ikeda, Y.; Kizaki, M, 2004, Fucoidan induces apoptosis of human HS-Sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways, Am. J. Hematol. 78, pp. 7-14.

39. Cumashi, A.; Ushakova, N.A.; Preobrazhenskaya, M.E.; D'Incecco, A.; Piccoli, A.; Totani, L.; Tinari, N.; Morozevich, G.E.; Berman, A.E.; Bilan, M.I.; Usov, A.I.; Nadezhda E.; Grachev, A.A.; Sanderson, C.J.; Kelly, M.; Rabinovich, G.A.; Iacobelli, S, 2007, A comparative study of the anti- inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different Fucoidans from brown seaweeds, Glycobiology, 17, pp. 541- 552.

40. Haneji, K.; Matsuda, T.; Tomita, M.; Kawakami, H.; Ohshiro, K.; Uchihara, J.; Masuda, M.; Takasu, N.; Tanaka, Y.; Ohta, T.; Mori, N, 2005, Fucoidan exppacted from Cladosiphon okamuranus Tokida induces apoptosis of human T-Cell leukemia virus type 1-infected T-Cell lines and primary adult T-Cell leukemia cells, Nuppit, Cancer, 52, pp. 189-201.

41. Maruyamaa, H.; Tamauchib, H.; Iizuka, M.; Nakano, T, 2006, The role of NK cells in antitumor activity of dietary Fucoidan from Undaria pinnatifida Sporophylls (Mekabu), Planta Med, 72, pp. 1415-1417.

42. Wijesinghe, W. A. J. P., & Jeon, Y. J, 2011b, Biological activities and potential cosmeceutical applications of bioactive components from brown seaweeds: a review, Phytochemisppy Reviews, 10, pp. 431–443.

43. Wu, X.W.; Yang, M.L.; Huang, X.L.; Yan, J.; Luo, Q, 2004, Effect of japonica polysaccharides on radioprotection and splenic

Laminaria lymphocyte apoptosis, Med. J. Wuhan Univ, 25, pp. 239-241.

87

44. Shimizu, J.; Wada-Funada, U.; Mano, H.; Matahira, Y.; Kawaguchi, M.; Wada, M, 2005, Proportion of murine cytotoxic T cells is increased by high molecular-weight Fucoidan exppacted from Okinawa mozuku (Cladosiphon okamuranus), J. Health Sci,51, pp. 394-397.

45. Kima, M.H.; Joo, H.G, 2008, Immunostimulatory effects of Fucoidan on bone marrow-derived dendritic cells, Immunol. Lett, 115, pp. 138-143.

46. Li, D.Y.; Xu, Z.; Huang, L.M.; Wang, H.B.; Zhang, S.H, 2001, Effect of Fucoidan of L. japonica on rats with hyperlipidaemia, Food Sci, 22, pp. 92-95.

47. Li, D.Y.; Xu, Z.; Zhang, S.H, 1999, Prevention and cure of Fucoidan of L. japonica on mice with hypercholesterolemia, Food Sci, 20, pp. 45-46.

48. Saito, A., Yoneda, M.,Yokohama, S, Okada, M, Haneda, M, Nakamura, K, 2006, Fucoidan prevents concanavalin A-induced liver injury through induction of endogenous IL-10 in mice, Hepatol Research, 35(3), pp. 190- 198.

49. Kawano, N.; Egashira, Y.; Sanada, H, 2007, Effect of dietary fiber in the development of D-galactosamine-induced

edible seaweeds on hepatopathy in rats, J. Nupp. Sci. Vitaminol. (Tokyo), 53, pp. 446-450.

50. Cumashi, A.; Ushakova, N.A.; Preobrazhenskaya, M.E.; D'Incecco, A.; Piccoli, A.; Totani, L.; Tinari, N.; Morozevich, G.E.; Berman, A.E.; Bilan, M.I.; Usov, A.I.; Nadezhda E.; Grachev, A.A.; Sanderson, C.J.; Kelly, M.; Rabinovich, G.A.; Iacobelli, S, A comparative study of the anti- inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different Fucoidans from brown seaweeds, Glycobiology, 2007, 17, 541-552.

51. M.I.Bilan, E.V.Vinogradova, E.A.Tsvetkova, A.A.Grachev, A.S.Shashkov, N.E, A.I.Usov, 2008, A sulfated glucuronofucan containing both fucofuranose and fucopyranose residues from the brown alga Chordaria flagelliformis. Carbohydrate Research, 343 (15), pp. 2605-2612.

88

52. Bilan. M.I., Grachev. A.A., Shashkov. A.S, Thuy. T.T.T, Van. T.T.T, Ly. B.M, Nifantiev. N.E, Usov. A.I, 2013, Preliminary investigation of a highly sulfateed galactofucan fraction isolated from the brown alga Sargassum polycystum, Carbohydrate Research, 377, pp. 48-57.

53. Chevolot, L.; Mulloy, B.; Racqueline, J, 2001, A disaccharide repeat unit is the structure in Fucoidans from two species of brown algae, Carbohydrate Research, 330, pp. 529-535.

54. Chizhov, A.O.; Dell, A; Morris, H.R, 1999, A study of Fucoidan from the brown seaweed Chorda filum, Carbohydrate Research, 320, pp. 108-119.

55. Usov A. I. ; Smirnova G. P. ; Bilan M. I., 1998, Polysaccharides of brown alga Laminaria Saccharina (l.) lam. asa source of Fucoidan, Bioorganic chemisppy, 24 (6), pp. 437-445.

56. Adhikari Utpal Cecilia, G.Mateu, KausikChattopadhyay, Carlos A.Pujol, Elsa B.Damonte, BimalenduRay, 2006, Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum Marginatum, Phytochemisppy, 67(22), pp. 2474-2482.

57. Anastyuk, S. D., Imbs, T.M., Shevchenko, N.M., Dmitrenok, P.S., Zvyagintseva, T.N, ESIMS analysis of Fucoidan preparations from Costaria costata, Chem. Nat. Comp, 2009, 45, 79-86.

58. Anastyuk, S.D.; Shevchenko, N.M.; Nazarenko, E.L.; Imbs, T.I.; Gorbach, V.I.; Dmitrenok, P.S.; Zvyagintseva, T.N, Structural analysis of a highly sunphated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides by tandem MALDI and ESI mass spectrometry, Carbohydr. Res, 2010, 345, 2206- 2212.

59. A.I. Usov, G.P. Smirnova, M.I. Bilan, A.S. Shashkov, Polysaccharides of Algae: 53. Brown Alga Laminaria saccharina (L.) Lam. as a Source of Fucoidan, Russ. J. Bioorg. Chem, 1998, 24, 382-389.

60. Roza V. Usoltseva, Stanislav D. Anastyuk, Natalia M. Shevchenko, Valerii V. Surits, Artem S. Silchenko, Vladimir V. Isakov, Tatiana N. Zvyagintseva,

89

Pham Duc Thinh, Svetlana P. Ermakova, 2017, Polysaccharides from brown algae Sargassum duplicatum: The structure and anticancer activity in vitro, Carbohydrate Research.

61. Roza V. Usoltseva, Stanislav D. Anastyuk, Irina A. Ishina, Vladimir V. Isakov, Tatiana N. Zvyagintseva , Pham Duc Thinh, Pavel A. Zadorozhny, Pavel S. Dmitrenok, Svetlana P. Ermakova, 2017, Structural characteristics and anticancer activity in vitro of Fucoidan from brown alga Padina boryana, Carbohydrate Research.

62. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung, 2009, Nghiên cứu Fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tách từ rong nâu Sargasum swartzii bằng phương pháp phổ khối nhiều lần, ạp ch óa học ,47 (3), tr. 300 - 307.

63. Nguyễn Duy Nhứt, 2008, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt t nh sinh học của pol saccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh òa, Luận án tiến s Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.

64. Thuy Thi Thanh Thu, Van Thi Thanh Tran, Yoshiaki Yuguchi, Ly Minh Bui and Tai Tien Nguyen, 2013, Structure of Fucoidan from brown seaweed Turbina ornata as Studied by Elecppospray ionization Mass spectrometry (MSIMS) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) Techniques, Mar.Drugs, 11, pp. 2431-2443.

65. Phạm Đức Thịnh, 2015, Nghiên cứu phân t ch thành phần, cấu tr c hóa học của Fucoidan có hoạt t nh sinh học từ một số loài rong nâu ở Vịnh Nha Trang, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

66. Hồ Đức Cường, 2014, Nghiên cứu cấu tr c và khảo sát hoạt t nh sinh học của Fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianun và Sargassum swartzii của Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

90

67. Bùi Văn Nguyên, 2019, Nghiên cứu c iểm cấu pp c và hoạt t nh sinh học của Fucoidan từ một số loài rong nâu ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

68. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., and Smith, F. 1956, Colorimeppic method for determination of sugars and related substances, Anal. Chem, 28, pp. 350-356.

69. Dodgson, K. S.; Price, R. G. A, 1962, Note on the Determination of the Ester Sulfate Content of Sulfated Polysaccharides, Biochem. J. 84, pp. 106 - 110.

70. Bitter, T.; Muir, H.M, 1962, A modified uronic acid carbazole reaction.

Anal. Biochem, 4, pp. 330–334.

71. Cheng H. N. And Thomas G. Neiss (2012), “Solution NMR Spectroscopy of

Food Polysaccharides”, Polymers Reviews, 52 (2), pp. 8 – 114.

72. Tissot, B., Salpin, J. Y., Martinez, M., Gaigeota M. P. & Daniel, R. (2006). Differentiation of the Fucoidan sulfated L-fucose isomers constituents by CE-ESIMS and molecular modeling. Carbohydrate Research, 341, 598–609.

73. Duarate, M.; Cardoso, M.; Noseda, M, 2001, Structural studies on Fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum, Carbohydrate. Research, 333, pp. 281-293.

74. Hiroe Mori and Kazutosi Nisizawa, 1982, Sugar Constituents of Sulfated Polysaccharides from the Fronds of Sargassum ringgoldianum, Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries. 48 (7), pp. 981-986.

75. Cun Zhuang, Hiroko Itoh, Takashi Mizuno, and Hitoshi Ito, 1995, the Brown Seaweed, Umitoranoo

Antitumor Active Fucoidan from (Sargassum thunbergii), Biosci, Biotech, Biochem. 59 (4), pp. 563-567.

76. Riki Shiroma, Teruko Konishi, Shuntoku Uechi and Masakuni Tako, 2008, Structural Study of Fucoidan from the Brown Seaweed Hizikia fusiformis, Food Sci, Technol Research, 14 (2), pp. 176 - 182.

91

77. Eluvakkal. T, Sivakumar. S.R and Arunkumar. K, 2010, Fucoidan in Some Indian Brown Seaweeds Found along the Coast Gulf of Mannar, Inter Journal of Botany, 6 (2), pp. 176-181.

78. Virginia García-Ríos, Elvira Ríos-Lea, Daniel Robledo and Yolanda Freile- from Tropical brown

Pelegrin, 2012, Polysaccharides composition seaweeds, Phycological Research, 60, pp. 305-315.

79. Peter N. Pusey, Dennis E. Koppel, Dale E. Schaefer, Rafael D. Camerini- Otero, and Seymour H. Koenig, Intensity fluctuation spectroscopy of laser light scattered by solutions of spherical viruses, R17, Q.beta., BSV, PM2, and T7. I. Light-scattering technique, Biochemistry, 1974, 13 (5), 952–960.

80. Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Nadezhda E. Ustuzhanina, Alexander S. Shashkov, Nikolay E. Nifantiev and Anatolii I. Usov (2002), “Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag”, Carbohydrate Research, Volume 337, Issue 8,17April Pages 719-730.

81. Lionel Chevolot, Barbara Mulloy, Jacqueline Ratiskol, Alain Foucault, Sylvia Colliec-Jouaultb (2001), “A dissaccharide repeat unit is the major structure in Fucoidan from two species of brown algae”, Carbohydrate Research-330, pp 529-535.

82. Maria E.R. Duarte,a Marc A. Cardoso,a Miguel D. Noseda,a,1 Alberto S. Cerezo (2001), “Structural studies on Fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenoph llum”, Carbohydrate Research 333, pp 281–293.

83. Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E. Nifantiev and Anatolii I. Usov (2006), “Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L”, Carbohydrate Research-314, pp 238- 245.

84. Be´range`re Tissot,a,_ Jean-Yves Salpin,a Michael Martinez,b, Marie- Pierre Gaigeota,b and Re´gis Daniela (2006), “The Synthesis and NMR and Conformational Studies of Fucoidan Fragments”, Carbohydrate Research 341, pp598–609.

92

PHỤ LỤC 1

SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN CARBOHYDRATE

BẢNG GIÁ TRỊ MẬT ĐỘ QUANG TƯƠNG ỨNG VỚI NỒNG ĐỘ CHUẨN

λ=490nm

Nồng độ carbohydrate (µg/ml)

A1 A2 Atb

50 0,19 0,19 0,19

100 0,42 0,43 0,42

200 0,81 0,81 0,81

250 1,08 1,08 1,08

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN CARBOHYDRATE (µg/mL)-MẬT ĐỘ QUANG

Phương trình có dạng: y = 0,004x - 0,015 Với giá trị R2= 0,996

Trong đó: x : nồng độ (µg/mL) và y : mật độ quang.

93

PHỤ LỤC 2

SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN SULFATE

BẢNG GIÁ TRỊ MẬT ĐỘ QUANG TƯƠNG ỨNG VỚI NỒNG ĐỘ CHUẨN

λ =360nm

Nồng độ sulfate (µg/ml)

A2 Atb A1

100 0,18 0,18 0,18

250 0,25 0,25 0,24

500 0,32 0,33 0,33

750 0,40 0,40 0,40

1000 0,49 0,49 0,49

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN SULFATE (µg/mL)-MẬT ĐỘ QUANG

Phương trình có dạng: y = 0,0003x + 0,155 Với giá trị R2= 0,997

Trong đó: x : nồng độ (µg/mL) và y : mật độ quang.

94

PHỤ LỤC 3

SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN URONIC ACID

BẢNG GIÁ TRỊ MẬT ĐỘ QUANG TƯƠNG ỨNG VỚI NỒNG ĐỘ CHUẨN

λ =525nm

Nồng độ uronic acid (µg/ml)

A2 Atb A1

10 0,12 0,12 0,12

20 0,27 0,27 0,26

30 0,40 0,40 0,40

40 0,54 0,54 0,54

50 0,67 0,67 0,67

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN URONIC ACID (µg/mL)-MẬT ĐỘ QUANG

Phương trình có dạng: y = 0,013x - 0,016 Với giá trị R2= 0,999

Trong đó: x: nồng độ (µg/mL) và y : mật độ quang.

95

PHỤ LỤC 4

SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN FUCOSE

BẢNG GIÁ TRỊ DIỆN TÍCH PEAK TƯƠNG ỨNG VỚI NỒNG ĐỘ FUCOSE

Diện tích peak

Nồng độ fucose (µmol/L)

250 56,95

500 113,32

1000 223,72

2000 437,31

5000 1001,16

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN URONIC FUCOSE (µmol/mL)

Phương trình có dạng: y = 0,1979x + 20,203 Với giá trị R2= 0,9987

Trong đó: x: nồng độ (µmol/mL) và y : Diện tích peak.

96

PHỤ LỤC 5

SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN GALACTOSE

BẢNG GIÁ TRỊ DIỆN TÍCH PEAK TƯƠNG ỨNG VỚI NỒNG ĐỘ GALACTOSE

Diện tích peak

Nồng độ galactose(µmol/L)

250 124,09

500 247,87

1000 494,48

2000 984,46

5000 2308,25

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN GALACTOSE (µmol/mL)

Phương trình có dạng: y = 0,4587x + 29,042 Với giá trị R2= 0,9993

Trong đó: x : nồng độ (µmol/mL) và y: Diện tích peak.

97

PHỤ LỤC 6

SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE

BẢNG GIÁ TRỊ DIỆN TÍCH PEAK TƯƠNG ỨNG VỚI NỒNG ĐỘ GLUCOSE

Diện tích peak

Nồng độ glucose(µmol/L)

250 103,85

500 206,57

1000 408,00

2000 800,49

5000 1812,17

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE (µmol/mL)

Phương trình có dạng: y = 0,358x + 39,759 Với giá trị R2= 0,9983

Trong đó: x: nồng độ (µmol/mL) và y: Diện tích peak.

98

PHỤ LỤC 7

SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN N-AXETYL GALACTOSAMINE

BẢNG GIÁ TRỊ DIỆN TÍCH PEAK TƯƠNG ỨNG VỚI NỒNG ĐỘ

N-AXETYL GALACTOSAMINE

Diện tích peak

Nồng độ N-axetyl galactosamine (µmol/L)

250 128,61

500 224,08

1000 351,64

2000 508,35

5000 1100,00

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CHUẨN N-AXETYL GALACTOSAMINE

(µmol/mL)

Phương trình có dạng: y = 0,1977x + 116,59 Với giá trị R2= 0,9951

Trong đó: x : nồng độ (µmol/mL) và y : Diện tích peak.

99

PHỤC LỤC 8 CÁC ĐỈNH PHỔ ĐẶC TRƯNG CỦA FUCOIDAN TRÊN PHỔ HỒNG NGOẠI

Đỉnh Dao động

Dao động dãn vòng của - anomer 775

802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6

Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial 822

845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial

Dao động của liên kết C1-H của -anomer 847

Dao động của liên kết C1-H của anomer 893

Dao động vòng của -anomer 917

1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal

1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C

1255-1264 Dao động hoá trị của S=O

Dao động hoá trị đối xứng của COO 1420

Dao dộng gấp của C-H 1430

Dao động hoá trị của C=O 1730

3300-3440 Dao động hoá trị của O-H

100

PHỤ LỤC 9

ĐỘ DỊCH CHUYỂN HÓA HỌC CỦA C VÀ H TRONG MỘT SỐ GỐC ĐƯỜNG KHI ĐO PHỔ NMR

H-6a H-6b

Vị trí H 3--Man-1

H1 5.2 H2 4.2 H3 3.96 H4 3.92 H5 4.04

3--L-fuc-4-SO3

- -1

4--GlucpA-1

2--Glap-1

3.74 C6 61.9

H-6a H-6b

Vị trí H

Vị trí C

3--D-man-1

3,2--D-man-1

2--D-man-1

3--L-rha-1

2--L-rha-1

5.15 4.15 4.72 C1 105 H1 C1 5.14 103.1 5.26 101.8 5.26 101.8 5.03 103 101.9 3.91 3.44 3.67 C2 73 H2 C2 4.21 71 4.24 78.5 4.1 78.5 4.12 71.3 79.2 4.07 3.63 3.84 C3 74.5 H3 C3 3.99 79.7 4.05 79.3 3.95 79.3 3.89 79.1 71.2 4.76 3.82 3.94 C4 89.7 H4 C4 3.82 67.5 3.93 68.1 3.71 68.1 3.57 72.6 73.6 4.55 3.76 3.60 C5 75.6 H5 C5 3.81 74.8 3.75 74.7 3.71 74.7 3.86 70.4 70.4 C6 62.3 62.3 62.3 1.3 17.9 17.8

101

2,3--L-rha-1

3--D-glucp-1

4.07 4.26 76.1 3.94 3.99 77.3 3.48 3.65 72.2 3.82 3.09 70.6 1.30 1.36 18.0

3.431 3.654 3.563 3.466 3.915 3.727

3.928 3.712

-D-galp-16

3.590 3.43

3--D-glucp-1

2,3--D-galp-1

3--D-galp-13

-D-glucp-1

-D-glucpA-1

72.74 74.49 70.66 70.21

-

5.19 5.24 102.1 4.791 4.419 105.4 4.55 102.9 4.98 100.1 4.64 105.2 4.47 103.7 101.1 5.03 3.35 73.5 3.99 73.7 3.59 72.5 3.38 73.9 73.2 3.61 3.55 75.9 3.99 81.6 3.64 74.6 3.48 76.9 73.8 3.88 3.45 69.8 4.24 70.3 3.99 70.1 3.51 70.5 73.2 3.56 3.53 76.5 3.78 76.1 3.69 76.5 3.37 77.6 72.8 4.78 3.81 63.1 3.77 60.9 3.78 62.15 3.77 62.4 3.96 62.1 74.4 3.95 3.78 3.77 3.82

3--L-fuc-2-SO3

4--D-gal-1

5.30 101.4 5.29 4.62 76 3.85 4.26 76 3.95 4.17 71. 8 4.22 4.5 69.4 4.16 1.31 18.2 3.78

102

3--D-gal-1

-L-fuc

70.9 3.75 82.7 3.86 71.5 3.78 72.3 3.77 73.9 3.73 77.5 4.20 63.0 3.78 63.0 1.21

-

102.9 4.40 105.3 5.20(3.9) 93.12 80.9 4.12 70.4 3.81 69.09 70.29 72.79 67.10 16.33

-L-fuc-2-SO3

4.00 4.41 4.27 1.22

-

5.49(3.6) 93.22 3.89 78.62 70.21 75.00 69.03 18.36

-L-fuc-3-SO3

4.54 3.94 4.27 1.23

-

5.26(4.0) 95.11 4.17 69.00 80.82 73.05 69.03 18.36

-L-fuc-4-SO3

3.81 3.98 4.62 4.34

2,3--L-fuc-1

71.26 71.26 83.66 68.46

5.22(3.7) 95.11 5.34 101.4 4.65 76 4.26 76 4.17 72.1 4.5 69.4 1.27 1.3 18.2