VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----o0o----
NGUYỄN THỊ HỒNG MAI
ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hà Nội - 2018
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----o0o----
NGUYỄN THỊ HỒNG MAI
ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Thị Phương Trang
Hà Nội - 2018
LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành tại phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tận tình
của TS. Nguyễn Thị Phương Trang. Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc
tới sự hướng dẫn của cô.
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tác giả
đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình về nhiều mặt của Ban lãnh
đạo Viện ST & TNSV,cán bộ phụ trách đào tạo của Viện, của TS. Đặng Tất
Thế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn.
Chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS. Nguyễn
Giang Sơn, TS. Hồ Thị Loan, TS. Phạm Thế Cường, ThS. Lê Thị Mai Linh
đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo những bước đi ban đầu trong
lĩnh vực nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng, tác giả cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới những
người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ trong suốt
quá trình hoàn thành luận văn.
Luận văn được hoàn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tác song
phương của Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS. Nguyễn Thị
Phương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16.
Tác giả xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu thu
thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất
kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin tham khảo trong khóa
Ngày tháng năm 2018
Học viên thực hiện
( Ký và ghi rõ họ tên)
luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.
Nguyễn Thị Hồng Mai
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU ................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1.Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) .................................................................. 3
1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh ......................................................................... 3
1.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3
1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh ................................................ 5
1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh .............. 5
1.2.4. Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh ....................................... 7
1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam....................................... 9
1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận ........................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 16
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số ....................................................................... 16
2.3.2. Lựa chọn mồi SSR .................................................................................... 17
2.3.3. Phân tích số liệu SSR ........................................................................... 18
2.3.4. Thiết kế mồi đọc trình tự .................................................................... 19
2.3.5. PCR khuếch đại gen ........................................................................... 20
2.3.6. Điện di trên gel agarose ...................................................................... 21
2.3.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST .......................................... 21
2.3.8. Đọc trình tự gen .................................................................................. 21
2.3.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ................................................... 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 23
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ............................................................. 23
3.2. Lựa chọn mồi SSR .................................................................................... 23
3.3. Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh .... 25
3.4. Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu ................................ 30
3.5. Kết quả phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử của các vùng gen
rbcL, rpoB, ITS và 18S của loài sâm ngọc linh. .............................................. 32
3.6. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số
loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS -
sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng. ........................................................... 47
3.7. Kết quả so sánh khả năng phân loại sâm ngọc linh đối với các loài chi
Panax khác của ba vùng gen nghiên cứu. ....................................................... 50
3.8. Kết quả đăng ký mã số các vùng gen nghiên cứu trên ngân hàng gen .. 55
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 56
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 57
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
CỦA TÁC GIẢ .................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 59
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 65
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU
AFLP
Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified
Fragment Length Polymorphism)
bp base pair
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
CBOL Consortium for the Barcode of Life
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
ME Phương pháp Minimum Evolution Method
MP Phương pháp Maximum Parasimony Method
NJ Phương pháp Neighbor Joining
PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
RAPD Đa hình các đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên (Random
Amplified Polymorphic DNA)
RFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment
Length Polymorphism)
SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)
UPGMA Unweighted Pair Group Method Analysis
VQG Vườn Quốc Gia
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền ...... 17
Bảng 2.2. Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen . 20
Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu. .... 22
Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phân
tích 4 chỉ thị SSR.............................................................................................. 26
Bảng 3.2. Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa và
rbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax. ....................... 37
Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía trên
bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài
/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 44
Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền gen rpoB giữa loài sâm ngọc linh ( phía trên
bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài
/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ............................................................ 44
Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa loài sâm ngọc linh ......... 45
(phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh
với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ........................................... 45
Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền mồi 18S giữa loài sâm ngọc linh (phía trên
bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài
/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 46
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh 4
Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín 4
Hình 2.1. Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh 15
Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1% 22
23
Hình 3.2. Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4 mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481
30
Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di trên gel agarose 1%
30
Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.5. Ví dụ về hình ảnh các peak trong giải trình tự 31
35
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các loài Panax trên ngân hàng gen.
36
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các loài Panax trên ngân hàng gen.
39
Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các loài Panax trên ngân hàng gen
41
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài Panax trên ngân hàng gen
48
Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS và rbcL
Hình 3.11. Thứ tự ghép nối các đoạn gen nghiên cứu 50
53
Hình 3.12. Kết quả so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa trên so sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng.
54
Hình 3.13. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài thuộc chi Panax phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS.
MỞ ĐẦU
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được xác định
là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen, được
xếp vào một trong bốn cây sâm quý nhất trên thế giới do có chứa nhiều
thành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khoáng vi lượng hơn
hẳn những loài sâm khác. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức và phá hủy
vùng phân bố tự nhiên đã dẫn đến sự tuyệt chủng ngoài tự nhiên của sâm
ngọc linh. Hiện loài này chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảo
tồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Sâm ngọc linh đã được đưa vào sách
đỏ Việt Nam, danh lục của IUCN và Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính
phủ. Ngành Y tế đã hướng chọn sâm ngọc linh làm cây thuốc xây dựng sản
phẩm quốc gia về dược liệu. Ngày 18/7/2012, chính phủ đã có Quyết định số
936/QĐ-TT phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển kinh tế - xã hội vùng
Tây Nguyên đến năm 2020, trong đó phát triển cây sâm ngọc linh trở thành
cây đặc sản quốc gia. Những nghiên cứu về di truyền quần thể giúp các nhà
khoa học và các nhà chiến lược có cái nhìn tổng thể về thực trạng di truyền
của các quần thể sâm ngọc linh, từ đó có những chiến lược hợp lý trong
việc bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam.
Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử còn giúp xác định được những sai khác về
mặt di truyền của loài sâm ngọc linh so với các loài Panax khác, làm cơ sở
cho việc phân loại và giám định các mẫu sâm ngọc linh.
Xuất phát từ tình hình thực tế này, luận văn tập trung nghiên cứu đặc
điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kon
Tum, đồng thời kiểm tra sự sai khác di truyền của bốn vùng gen gồm hai
vùng gen nhân: 18S, ITS và hai vùng gen lục lạp: rbcL và rpoB của mẫu
sâm ngọc linh, so sánh với một số loài Panax khác.
Mục tiêu cụ thể:
- Xác định đặc điểm di truyền quần thể của hai quần thể sâm ngọc linh thu
tại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum.
1
- Đánh giá mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài Panax
khác trên cơ sở giải mã trình tự vùng gen rbcL, rpoB, 18S và ITS, đặc điểm
phân tử của các vùng gen này, đồng thời so sánh khả năng phân loại của
bốn vùng gen nói trên trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh với một số
loài Panax khác.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật
thông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng
Nam và Kon Tum.
Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn và
chọn giống có những chiến lược hợp lý trong công tác bảo tồn và phát triển
bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam.
Kết quả của luận văn góp phần chọn lọc được vùng gen hữu hiệu
(chỉ thị phân tử) cho công tác nghiên cứu khoa học và phân loại loài sâm
ngọc linh của Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
- Lựa chọn mồi SSR phù hợp với loài sâm ngọc linh của Việt Nam.
- Đánh giá đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại
tỉnh Quảng Nam và Kon Tum bằng kỹ thuật SSR.
- Kiểm tra đặc điểm phân tử của bốn vùng gen rpoB, ITS, rbcL và
18S, so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen này trong việc phân biệt
2
loài sâm ngọc linh của Việt Nam; đăng ký số hiệu genbank.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.)
Chi sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Toàn
bộ chi sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài
(thứ -var.) [21]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ
xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của
Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài Panax
quinquefolius và Panax trifoliatus). Vùng Đông Bắc Á có 2 loài Panax
ginseng và Panax japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ
vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực
chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và
Lào Cai (Việt Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn
toàn tự nhiên. Hai loài nhập trồng là Panax notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và
Panax pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có
nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài
gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi sâm (Panax L.)
của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (Panax notoginseng; Panax
quinquefolius và Panax trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi
Panax L. là loài sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) ở miền Trung của Việt
Nam, tại 14°15’ vĩ độ Bắc. Chính vì vậy sâm ngọc linh được coi là loài đặc
hữu hẹp của miền Trung Việt Nam [12].
1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)[36] là cây thân thảo,
sống nhiều năm. Thân rễ có đường kính 3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ,
đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến
5cm. Thân cao từ 40 cm – 60 cm, rỗng, lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5,
3
6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7 – 12 cm (ít khi 15 cm). Lá
chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 – 14 cm, rộng 3 – 5
cm, đầu lá thường nhọn, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có
răng cưa nhỏ đều [12], [14], [25] (Hình 1.1).
Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh
(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)
Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°C, ban đêm 15 - 18°C, sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm [25].
Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con [25].
Sinh học: Vào đầu tháng giêng hàng năm, cây sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành, từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả, tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Khi quả chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang vàng lục rồi đỏ cam với chấm đen lớn chiếm 1/4 đến 1/5 xuất hiện ở đỉnh quả (Hình 1.2).
Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín
4
(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac - ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)
Vào khoảng cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại
một vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Ngay
trong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đất hình
thành một chồi thân mới. Các chồi này tồn tại dưới dạng chồi ngủ trong suốt
3-4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa xuân năm sau để tiếp tục một
chu trình sinh trưởng phát triển mới. Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mà
người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi. Phải ít nhất từ 3 năm tuổi
tức trên củ có một sẹo mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi
[2], [12]. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm.
1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh
Cho đến nay, sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên trung
phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có và quan trọng nhất là núi
Ngọc Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã
Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà
Cang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam) [12]. Cây
sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm
1970 cũng là sâm ngọc linh. Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của
nó thì sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng
thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang). Cả 2 khối núi này
đều có độ cao trên 1.500 m. Điểm phát hiện có sâm ngọc linh mọc tự nhiên
đều vào khoảng 1.800 - 2.200 m [5], [25], [21].
1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh
1.2.3.1. Tầm quan trọng và giá trị của sâm ngọc linh
Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài
của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm
vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như nhân
sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất
(Panax notoginseng) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)
5
[6], [3], [9], [21]. Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống
Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng
Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần
dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm
nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu
vết thương,… [2], [3], [6], [11], [21]. Theo quan điểm hóa phân loại và
dược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế
giới đã chia các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính:
Nhóm 1: gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: nhân sâm
(Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax
notoginseng),… có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển
và chứa các Saponin có khung thuộc nhóm dammaran.
Nhóm 2: gồm các loài mọc hoang như Panax japonicas, Panax
zingiberensis, Panax stipuleanatus,… với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển
theo hướng nằm ngang, chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [3].
Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả,
đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm ngọc linh
có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu
trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với nhóm sâm
trồng (nhóm 1) có giá trị trên thế giới như nhân sâm (Panax ginseng), sâm
mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… thì thành phần
saponin của sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng
lại cao hơn nhiều [3], [11].
1.2.3.2. Thành phần hóa học của sâm ngọc linh
Từ năm 1974 – 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu nhân
sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm
Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium).
Kết quả là bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong
Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu
sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng [13]. Chi tiết hơn
6
nữa, trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane
(7.58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ
saponin của axit oleanolic[13]. Điều này trái với quy luật chung là thông
thường các cây nhân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin
của axit oleanolic và saponin nhóm damarane [8], [11]. Cũng là lần đầu tiên
trên thế giới, người ta chiết được một lượng lớn majonozit R2 và ocotillol
saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4.34%)
gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao nhất có trong các
loài chi Panax [16]. Ocotillol saponin đã trở thành một hợp chất cần chú ý có
thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học vì nó có thể ảnh hưởng đến một
số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis. Sự có mặt của
damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho sâm ngọc linh khác với
nhân sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong
nhân sâm Triều Tiên. Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân
sâm của Việt Nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so
với nhân sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với
26% trong nhân sâm triều tiên [9]. Ngoài những saponin nói trên, trong nhân
sâm của Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh
dầu và một số yếu tố vi lượng [11].
Như vậy, sâm ngọc linh không những đặc biệt về mặt phân bố (là loài duy
nhất có phấn bố tại 14°15’ vĩ độ Bắc, giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi
Panax L.) mà còn độc đáo về cấu tạo hoá học bởi tuy là loài sâm thuộc nhóm
2 với bộ phận thân rễ thuộc dạng khí sinh, phát triển theo hướng nằm ngang
nhưng thành phần hoá học lại chứa các saponin chủ yếu thuộc nhóm
dammaran (giống các loài sâm của nhóm 1), đặc biệt hơn lại có chứa một số
saponin đặc trưng mà các loài sâm khác trên thế giới không có.
1.2.4. Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh
Ở Việt Nam, cho đến nay, các công trình khoa học nghiên cứu về sâm
ngọc linh khá đa dạng, ngoài những nghiên cúu cơ bản tập trung vào điều
7
tra, phân loại, xác định vùng phân bố thì cũng đã có nhiều nghiên cứu về
thành phần hoá học, thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan, giải mã hệ gen lục
lạp…có thể liệt kê một số các công trình đáng chú ý như sau:
- Trần Lê Quân và cs (2002): tách chiết, majonoside R2, Triterpen
Saponin từ cây sâm việt nam (Panax vietnamensis) và thử nghiệm hoạt tính
bảo vệ gan. Nghiên cứu cho thấy cao chiết MeOH của củ sâm việt nam có
hoạt tính bảo vệ gan in vitro trên mô hình gây độc cho tế bào gan bằng D-
galactosamine (D-GaLN)/yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-anpha) .
Nguyễn Thị Thu Hương và cs (1999): nghiên cứu về tác dụng dược lý của
sâm việt nam, trong đó tập trung vào tác dụng kích thích miễn dịch chống
căng thẳng, trầm cảm [48], [5], [11], [18].
- Nguyễn Thới Nhâm và cs (1993) Nghiên cứu về dược liệu học và
hoá học cây sâm Việt Nam [16].
- Loạt công trình của PGS.TS. Dương Tấn Nhựt (2010, 2011, 2014,
2015) về nhân giống vô tính Sâm ngọc linh [13], [14].
- Cụm công trình của Viện Dược Liệu trong khuôn khổ chương trình
bảo tồn nguồn gen đã khoanh vùng được khu vực phân bố, đặc điểm sinh
thái, hình thái, lập bản đồ quy hoạch vùng trồng sâm (các tác giả, Lê Minh
Thảo [8], [18],…)
- Phan Kế Long và cs (2014) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh giá sự sai
khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh và mẫu sâm thu được tại Phong Thổ
Lai Châu, cũng dựa trên trình tự gen matK và ITS, mẫu sâm thu tại Lai Châu
đã được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis var. fuscidiscus, là một
thứ của loài Panax vietnamensis [9, 40].
- Nguyễn Thị Phương Trang và cs (2011) đã sử dụng vùng gen ITS để
đánh gía mối quan hệ di truyền của loài sâm việt nam, sâm lai châu với các
loài khác trong chi Panax [22]. Hay nhóm nghiên cứu của Đặng Tất Thế,
Nguyễn Thị Phương Trang (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật) thực
hiện một số hợp tác nghiên cứu với nhóm nghiên cứu của Viện sỹ Yuri
8
Zhuralev và TS. Galina D. Reunova (Viện Sinh học thỗ nhưỡng Viễn Đông,
Viện Hàn Lân khoa học Liên Bang Nga) về phân bố và di truyền của loài
sâm việt nam và sâm nga bằng kỹ thuật AFLP và SSR [34, 35].
- Trong đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền chi sâm, nhóm nghiên
cứu của Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu, và cs (2016) đã thực hiện “Đánh giá
di truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) bằng chỉ
thị ISSR. Nhóm nghiên cứu của GS. Nông văn Hải (2017) (Viện nghiên cứu
hệ gen-Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu về giải
mã hệ gen lục lạp sâm ngọc linh. Nhóm nghiên cứu của TS. Lê Hùng Lĩnh
(2017)-(Viện Di truyền Nông nghiệp) thực hiện nghiên cứu nuôi cấy mô và
xác định gen lục lạp đặc hiệu của một số loài trong chi Panax.
1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài,
trong đó có 2 loài nhập trồng là tam thất (Panax notogineng) và nhân sâm
(Panax ginseng) [5]. Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là sâm
vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), tam thất hoang (Panax stipuleanatus
Tsai et Feng) và đặc biệt sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)
là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các
huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), huyện Nam Trà My,
huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên
1500 m. Tuy nhiên, hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên do
tình trạng khai thác cạn kiệt trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy
nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp. Hiện, sâm ngọc linh đã được đưa vào
danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử
dụng vì mục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006
về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo Sách đỏ
Việt Nam (2007), sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI + 2b, c,
e [1]. Sâm ngọc linh chủ yếu tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã
Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh
9
(xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng
khoảng 10 hecta [6]. Tuy nhiên, với quyết định số 936/QĐ-TT ngày
18/7/2012 của thủ tướng chính phủ thì kế hoạch đến năm 2020, diện tích trồng
sâm ngọc linh sẽ được tăng lên đến khoảng 200ha.
1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận
Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng
rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền
quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA, đặc
biệt đối với lĩnh vực phân loại học và di truyền phân tử. Việc sử dụng các chỉ
thị DNA để định danh loài đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập
trung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp, phát hiện đáng kể [10], [17], [22],
[24], [27], [30], [40], [41], [42], [53]. Xác định loài bằng chỉ thị DNA có độ
chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi mà những quan sát
hình thái, sinh trưởng, phát triển chưa đủ cơ sở để phân biệt. Vì thế chỉ trong
vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) của thế giới đã lưu giữ trên 70
triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotide. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị
trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là: (1) số liệu
về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn
giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu
trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất
cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (population
genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể,
giữa các cá thể, giữa các cha mẹ và con cái...; (3) kết quả phân tích DNA cho
phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không
còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần
thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ
yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra [10].
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là
công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài
mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa
10
dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực
vật và vi sinh vật [37]. Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp
phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và
khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở
Việt Nam. Sâm ngọc linh là loài dược liệu quý có tác dụng tăng cường hệ miễn
dịch và ngăn ngừa ung thư… Đến nay quần thể sâm ngọc linh tự nhiên bị khai
thác mạnh mẽ, dẫn tới có nguy cơ cạn kiệt do nhu cầu sử dụng loại dược liệu
này ngày càng cao. Công tác bảo tồn và phát triển bền vững loại dược liệu này
ở Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách. Vì vậy, nghiên cứu đánh giá tính đa
dạng di truyền, làm cơ sở cho công tác bảo tồn nguồn gen cho loài sâm ngọc
linh cần được tập trung thực hiện. Bên cạnh đó, việc phát triển bộ mã vạch phân
tử cũng cần được nghiên cứu để giúp góp phần phân loại/giám định chính xác
sâm ngọc linh và các loài sâm khác thuộc chi nhân Sâm.
1.3.1 Phương pháp phân loại học phân tử
1.3.1.1. Ưu điểm của việc ứng dụng nghiên cứu phân tử trong phân loại học
Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất hiện nay trong việc xác
định mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự DNA, bởi vật liệu di truyền
là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh
hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và
chế biến. DNA chiết từ bất cứ bộ phận nào đều mang cùng thông tin di truyền.
DNA chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20°C trong thời gian dài (khoảng 3-5
năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích, đặc biệt chỉ cần sử
dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả [8], [12], [26].
1.3.1.2. Sử dụng hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật
Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae), chúng có chứa DNA riêng. DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi tế
bào. Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyl) và là nơi thực hiện quá trình
quang hợp của cây. Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực
vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế
11
hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao. Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại
học phân tử đánh giá chúng là sự tích lũy của các đột biến theo thời gian, do
vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hóa giữa các loài. Hệ gen lục lạp (cpDNA)
thực chất là một phân tử DNA dạng vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp
lại. Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hóa cho các
protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein
này. Vùng DNA không mã hóa trên hệ gen lục lạp là rất ít.
Hệ gen lục lạp có kích thước từ 120 kb – 220kb, kích thước này thay đổi
do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau, tách hệ gen lục lạp thành
2 vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC). Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều
mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNA
nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp
hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng 3 lần so với
DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân
loại [45]. Các nghiên cứu cấu trúc phân tử hệ gen lục lạp ở hầu hết các loài
thực vật bậc cao cho thấy tỷ lệ thay thế trong hệ gen lục lạp thấp hơn rất nhiều
so với hệ gen nhân và chúng cũng có mức tái tổ hợp rất thấp, di truyền theo
một dòng [54]. Một số vùng gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên
cứu hệ thống học phân tử thực vật hiện nay bao gồm: matK, rbcL, psbA –
trnH, rpoB,… tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi
không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận [29].
1.3.1.3. DNA barcoding và ứng dụng của nó
DNA barcoding là đoạn DNA ngắn (thường từ 200-500 bp) đặc trưng cho
loài/nhóm loài, dễ khuếch đại và bền vững. Hiện nay DNA barcoding đã được
sử dụng rất nhiều trong phân loại và giám định các loài động thực vật. Phương
pháp này dựa trên nguyên tắc so sánh các vùng trình tự DNA ngắn có tốc độ
tiến hóa nhanh để định loại các loài. Phương pháp này có thể áp dụng cho tất
cả các đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật…
12
Ở thực vật, các vùng DNA mã vạch được sử dụng để phân loại thường là
các trình tự thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen nhân…[39]; [55]; [10]. Trên thế giới
việc sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân biệt các loài đã phổ biến và
thông dụng từ những thập niên 90 của thế kỷ trước. Một số vùng gen nhân và
lục lạp thường dùng trong phân loại/giám định thực vật gồm ITS, 18S, matK,
rbcL, rpoB, psbA – trnH …[29]; [38], [40]; [42].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 vùng gen lục lạp gồm rbcL,
rpoB và 2 vùng gen nhân gồm 18S và ITS để đánh giá khả năng phân biệt
loài sâm ngọc linh với một số loài Panax khác.
- RbcL là vùng gen đệm trong lục lạp dài khoảng 1500 bp mã hoá cho
protein Rubico. Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ
(12 kDa) giống nhau. Các tiểu phần lớn được mã hóa bằng gen lục lạp
(rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hóa bằng gen nhân. Riêng đối với tảo nâu
và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hóa cho tiểu phần nhỏ. Các gen
rbcL ở thực vật bậc cao không có intron. Các gen này được dùng nhiều
trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại [29].
- rpoB là một vùng gen nhỏ nằm trong lục lạp, đây được coi là vùng
gen mang nhiều vị trí Nu dễ biến đổi. Nghiên cứu của nhóm CBOL gợi ý
dùng gen rpoB cho các phân biệt ở cấp độ loài và dưới loài [29].
- 18S-rDNA là vùng gen giải mã cho tiểu phần RNA ribosome, vùng gen
nằm trong nhân tế bào, có kích thước khoảng 1900 Nu. Các gen DNA
ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích
hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các
đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S
và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers)
nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo
tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng
nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong
13
những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa
gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách
phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác
biệt giữa các loài khác nhau [29].
1.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể bằng kỹ thuật phân tử
Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa
dạng di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài trong tự nhiên
có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn
loài một cách hữu hiệu. Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm
tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến
quá trình phân cắt nơi sống [27]; [28]; [26]; [33]; [29]. Các tác giả này đã
chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng
cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt. Hệ số thụ phấn
cao giữa các cá thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính
đa dạng di truyền. Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di
truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau
giữa chúng. Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự
phát triển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự
sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng
được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh
vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn. Để nghiên cứu
đa dạng di truyền quần thể và loài bằng kỹ thuật DNA có các phương pháp
chủ yếu như RAPD, AFLP, RFLP, ISSR,...
Một trong những kỹ thuật mới nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền ở cấp
độ loài và quần thể là kỹ thuật SSR vì các chỉ thị SSR có tính đa hình cao, đặc
hiệu cho từng loài nghiên cứu. Kỹ thuật này đã được áp dụng nhiều trong các
nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền và mối quan hệ sinh sản
trong các quần thể [20], [26].
Kỹ thuật SSR
14
Kỹ thuật SSR hay còn gọi là kỹ thuật microsatellite là những trình tự
nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide
ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh. Phương pháp truy tìm các phân đoạn
DNA đơn giản lặp lại do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị
phân tử năm 1989 [37]. Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp
lại, các đoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài. Các chuỗi lặp lại này
thường từ 1- 6 nucleotide. Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh
ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ
với trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại. Giá trị của SSR là do nó sinh ra đa
hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có bản chất
đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Cho đến nay kỹ thuật này đang
được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật;
thực vật [30].
Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện. SSR
là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao. Đây là chỉ thị
phân tử giúp tránh được các nhầm lẫn trong phân tích genome và là một
loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và
phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài.
Nhược điểm của chỉ thị SSR là quá trình thiết kế mồi tốn kém và hầu
15
như mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Tổng số 60 mẫu lá sâm ngọc linh thu ngẫu nhiên từ 25 cây sâm tại vườn
sâm Tăc-ngo, xã Trà Linh, tỉnh Quảng Nam và 35 mẫu sâm thu tại Măng ri,
Kon Tum (Hình 2.1). Các mẫu thu được được giữ trong phòng bì giấy và
bảo quản trong silicagel cho đến khi sử dụng.
Hình 2.1. Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 12/2016 - 07/2018.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
Các mẫu lá sâm ngọc linh được thu tại Quảng Nam và Kon Tum được bảo quản trong silicagen cho đến khi thực hiện các nghiên cứu phân tử. Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle (1987) [32], có cải tiến thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và di truyền bảo tồn gồm các bước sau:
16
Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá thu được. Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, cho vào ống eppendorf 2ml.
Bước 2: Bổ sung 800 l đệm rửa (Tris-HCl 100mM, EDTA 5mM, NaH2PO4 0,5 %) vào ống eppendorf chứa mẫu, vortex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần).
Bước 3: Bổ sung 800l đệm tách chiết (NaCl 1,5M, Tris-HCl 100mM, EDTA
20mM, CTAB 4 %) wotex tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ 30 phút ở 650C thỉnh thoảng trộn đều. Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Bước 4: Bổ sung 800l chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 12000v/p trong 10 phút ở 40C, hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml mới (lặp lại bước này 2 lần).
Bước 5: Bổ sung 1 lần thể tích isopropanol đảo đều để ở tủ -200C 1 giờ. Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa.
Bước 6: Rửa tủa bằng ethanol 70 %. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C.
Bước 7: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hoà tan DNA trong 50-100 l TE.
Bước 8: Bổ sung 3l RNase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 1 giờ.
Bước 9: Bổ sung 2 lần thể tích ethanol 100% (lạnh), đảo nhẹ để trong tủ -200C trong 30 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
Bước 10: Rửa tủa bằng ethanol 70%. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C.
Bước 11: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hoà tan DNA trong 50-100 l
TE. DNA tổng số được kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA bằng điện di
trên gel agarose 1%. Sau đó pha loãng về nồng độ 10ng/l để bảo quản và
thực hiện PCR.
2.3.2. Lựa chọn mồi SSR
Nhóm nghiên cứu của GS. Kim Joonki tại trường đại học Kongju, Hàn
Quốc đã phát hiện được 642 vùng lặp microsatellite trên toàn bộ vùng gen loài
Nhân sâm hàn quốc (Panax ginseng), đã chọn được 251 vùng khác nhau và đã
thiết kế được 90 cặp mồi SSR để nhân những vùng microsatellite này. Kết quả
nghiên cứu đã chọn ra 11 cặp mồi SSR cho kết quả đa hình [42] (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền
17
STT Locus Trình tự mồi (5’ – 3’) Nhiệt độ bắt cặp
1 PG-22 58
2 PG-29 60
3 PG-281 60
4 PG-287 60
5 PG-668 60
6 PG-770 60
7 PG-946 56
8 PG-1319 58
9 PG-1419 56
10 PG-1481 58
11 PG-1663 60 F: CTGTCTATGCAAGTTGCGGCTG R: ATCAAGTTGGAAATCAGGTGGG F: AATCAGAAACAAAGAAAGCTAAAAC R: CTCTCTCATCTCTCTCTCTTCC F: GTAGTAGTAGTAAAACTTTGCTAACG R: ATTTACAACTCTCTTCTTCCTCTAC F: GTGGGACTGGTATACAATAAGA R: GTGTTCTTAGTTGCCCATTTG F: CTGGCATCGAAGTTTCTCCATTC R: TGCATAGCACAGAGAGGAGG F: CCTCTTTGGGGCAGGGATATTTG R: CCAGCAAACCCAAACCCTCCTC F: GAATCGAAGTGTTAAGTTGAT R: CTTAAATCGATGATAACACC F: GCATGAACGGATACACCTTGAGG R: GGTATGCACCAGAAACGGACTGG F: ACTCAAAATTCTACAGCTTCCTC R: GATACCCCAGGCAGTCTGATGAC F: GGAGGTGATTGATGTAGTGGAATCC R: GGCTCTCCTATACTCACTATTTCCC F: CTACACGCTTTTTCATAGCTTACA R: TGTCTGCATAAAAGAGTTCGAGGC
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 11 cặp mồi SSR này để nghiên cứu tính đa dạng di truyền cho 2 quần thể sâm ngọc linh của Việt Nam. Phản ứng nhân dòng các đoạn microsatellite có kích thước trong khoảng 100 –300 bp được thực hiện với cặp mồi đánh dấu huỳnh quang một chiều xuôi.
2.3.3. Phân tích số liệu SSR
Dẫn liệu di truyền được ghi nhận trên cơ sở sự có mặt hoặc vắng mặt của các đỉnh (peak) DNA thu được hoặc băng vạch DNA trên bản điện di. Các thông số xác định đa dạng di truyền trong quần thể bao gồm tần số allen cho một lô cút (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) và hệ số giao giao phấn cận noãn (Fis) được tính toán bằng phần mềm GenAlex. Đặc điểm di truyền quần thể được phân tích dựa trên các số liệu thu được.
18
Các chỉ số thống kê F của Wright (1969) được dùng để đánh giá sự phân bố allen trong và giữa các quần thể, trong đó Fis là hệ số dư thừa gen đồng hợp tử trong quần thể, Fit là hệ số sai khác trong quần thể và Fst là hệ
số sai khác giữa các quần thể trong loài. Giá trị trao đổi di truyền giữa các quần thể (Nm) được xác định theo công thức: Nm = (1 – Fst) / 4Fst.
Tham số thống kê của Nei’s (1972) [40] dùng để phân tích mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể đối với mỗi lô cút đa hình, trong đó Ht là giá trị đa dạng di truyền tổng số, Hs là giá trị đa dạng di truyền trong mỗi quần thể, Dst và Gst là giá trị khác nhau về di truyền giữa các quần thể và hệ số đa dạng di truyền được xác định bởi công thức:
Dst = Ht – Hs và Gst = Dst/Ht. [41]
Sự sai khác di truyền giữa các quần thể được đánh giá theo tần số alen sử dụng chỉ số khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền của Nei’s (1972)
Xác định cấu trúc di truyền ở cả hai mức độ quần thể và loài của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại hai điểm Quảng Nam và Kon Tum trên cơ sở phân tích bốn lô cút gen bằng chỉ thị SSR. Các thông số đa dạng di truyền sẽ được xác định bằng phần mềm GenAlex và FSTAT bao gồm số alen cho mỗi lô cút, tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình, tần số gen dị hợp tử quan sát và lý thuyết dưới điều kiện cân bằng Hardy-Weinberg. Kiểm định giả thiết 2 được sử dụng để đánh giá sự sai khác giữa tần số gen dị hợp tử quan sát và lý thuyết. Các chỉ số thống kê F của Wright (1969) cũng được sử dụng để đánh giá sự phân bố alen trong và giữa các quần thể. Mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể sử dụng các tham số thống kê của Nei (1987) để phân tích đối với mỗi lô cút đa hình. Nghiên cứu mối quan hệ sinh sản giữa các cá thể trong quần thể và giữa các quần thể của loài trên cơ sở xác định hệ số thụ phấn cận noãn. Chỉ số thụ phấn chéo trong mỗi quần thể cũng được xác định. Nghiên cứu không gian phân bố di truyền trong quần thể liên quan đến khoảng cách di truyền, hệ số di truyền tương đồng và mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể. Điện di phân tách trên máy điện di mao quản ABI Prizm 3100. Các phân đoạn SSR sau đó được phân tích bằng phần mềm Genscan v 3.7. Tất cả các thông số trên được tính toán và phân tích bằng phần mềm GenAlex và FSTAT. Phân tích mức độ tiến hoá và mối quan hệ giữa các loài bằng phần mềm MEGA 7, Clustal W và PAUP*.
19
2.3.4. Thiết kế mồi đọc trình tự
Trình tự các cặp mồi sử dụng được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ nằm ở hai đầu của vùng gen nghiên cứu. Các mồi được thiết kế sao cho đạt được tỷ lệ phổ biến cho các loài thuộc chi Panax. Gen rbcL dài khoảng 1500 bp được chia thành 2 đoạn gen gồm rbcLa và rbcLc, mỗi đoạn gen dài khoảng 600 bp. Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trên cơ sở trình tự rbcLa; rbcLc; rpoB; 18S; ITS của các loài trong chi Panax trên Genbank [29]. Trình tự 5 cặp mồi đặc hiệu được dùng để khuếch đại gen được thể hiện bảng 2.2.
Bảng 2.2. Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen
Trình tự mồi
T T
Vùng gen
Độ dài (bp)
1 rbcLa 600
2 rbcLc 600
3 ITS 700
4 18S 600
5 rpoB 500 F: 5’- TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT- 3’ R:5’-CTTCGGCACAAAATACGAAACGATCTCTCCA-3’ F: 5’-TGAAAACGTGAATTCCCAACCGTTTATGCG-3’ R:5’- GCAGCAGCTAGTTCCGGGCTCCA - 3’ F: 5’- GCAATTCACACCAAGTATCGC- 3’ R: 5’- GCGATACTTGGTGTGAATTGC -3’ F: 5’- TCAAAGATTAAGCCATGCATGTCT - 3’ R: 5’ - TACGAGCTTTTTAACTGCAACAAC -3’ F: 5’-GCC ACC ATC GAA TAT CTG GT- 3’ R: 5’- ACA CGA TCT CGT CGC TAA CC -3’
2.3.4. PCR khuếch đại gen
Nhân bản vùng gen rbcLa; rbcLc; rpoB; 18S; ITS dài khoảng từ 500 bp đến 700 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế trên cơ sở trình tự rbcLa; rbcLc ; rpoB; 18S; ITS của các loài trong chi Panax trên Genbank [29]. Phản ứng nhân gen được thực hiện trong thể tích là 25µl với các thành
phần gồm có: Master Mix Dream Taq Green 2X: 12,5l; MgCl2 25mM: 1l; Taq polymerase 5u/l: 0,5l; 10 ng/l DNA mẫu: 2l; primer (10pmol mỗi
20
mồi xuôi hoặc ngược): 1,25l, H2O khử ion: 7µl. Chu trình nhiệt của mỗi phản ứng PCR: (1) 950C 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 950C 30 giây; 540C 1phút; 720C 1phút. Cuối cùng là 720C 10 phút để kết thúc phản ứng và giữ mẫu ở 40C. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR system 9700.
2.3.5. Điện di trên gel agarose
DNA tổng số sau khi được tách và các sản phẩm PCR thu được được
điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.3.6. Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST
Trình tự DNA thu được sau khi được hiệu chỉnh ở định dạng file fasta (.fas) sẽ được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ BLAST [57]. Công cụ này cho phép bước đầu định danh đến mức độ loài của các trình tự thu được bằng cách xác định các trình tự tương đồng với trình tự này trong cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen. Bằng cách tìm kiếm những trình tự có điểm số bắt cặp cao giữa chuỗi truy vấn và các chuỗi trong cơ sở dữ liệu sử dụng phương pháp tìm kiếm đơn giản, trên cơ sở phương pháp phỏng đoán, công cụ BLAST tìm những trình tự tương đồng thông qua phát hiện các đoạn bắt cặp ngắn theo từng bộ 3 nulceotide gối lên nhau giữa trình tự cần truy vấn và trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệu. Tiếp đó, nếu mỗi bộ 3 này đạt tới một ngưỡng T tối thiểu được tính toán bằng ma trận điểm (scoring matrix), chúng sẽ được đưa vào sắp xếp thẳng hàng (alignment) bởi thuật toán được sử dụng trong công cụ BLAST. BLAST sẽ cho ra kết quả các trình tự tương đồng được thể hiện ở dạng bảng đi kèm với thông tin của trình tự trên ngân hàng gen cùng với các chỉ số tương đồng (ident), độ dài của chuỗi trình tự được bắt cặp ở dạng phần trăm (query cover), điểm số bắt cặp giữa 2 trình tự. Trình tự nào có điểm số tương đồng cao hơn sẽ có mức độ giống nhau cao hơn. Dựa vào chỉ số tương đồng của các trình tự, chúng tôi sẽ đưa ra kết quả giám định loài cho các mẫu vật nghiên cứu.
2.3.7. Đọc trình tự gen
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp với các mồi rbcLa, rbcLc; rpoB; 18S, ITS, sử dụng Bigdye terminator cycler và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer. Hình ảnh các đỉnh (peak) của trình tự DNA các mẫu nghiên cứu được phân tích và ghép nối bằng phần mềm chromasPro [58], so sánh bằng phần mềm MEGA7 [51].
2.3.8. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
21
Mối quan hệ di truyền của các loài được thể hiện bằng cây phát sinh chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và khác nhau của các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể. Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về cấu trúc DNA giữa các loài. Các taxon được nối với nhau trên cây thể hiện mối quan hệ di truyền. Phương pháp Neighbor – Joining (NJ) là phương pháp tạo cây thường được sử dụng. Phương pháp NJ do Naruya Saitou và Masatoshi Nei đưa ra vào năm 1987 [54]. Kiểm tra và ghép nối các đoạn gen và so sánh sự khác nhau về vị trí các nucleotide giữa các loài/thứ thuộc chi Panax và 01 loài ngoài nhóm (Bảng 2.3) trên cơ sở trình tự nucleotide của gene rbcLa; rbLc;18S; rpoB; ITS được thực hiện bởi phần mềm ChromasPro (Technelysium Pty Ltd) [58]. Thành phần base (%) vùng gen rbcLa;rbcLc;18S; rpoB; ITS của các loài nghiên cứu, sự khác nhau giữa các cặp loài trên cơ sở phân tích theo mô hình Kimura 2 tham số và sơ đồ hình cây mối quan hệ di truyền theo hai phương pháp: NJ và MP được tiến hành trên phần mềm MEGA7 [51] và Paup [53].
Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu.
TT Tên loài/thứ rbcL ITS rpoB 18S
KT194325 MH238445 KT194324 KX768320
1 P.vietnamensis var. fuscidiscus
2 P. japonicas KM210141 AY233325 HQ112595 AB044901
var. bipinnatifidus
KF208380 KT380920 HQ112579 KT380921 GQ436706 KT380921 HQ112577 KT380920
3 P. japonicus 4 P. notoginseng 5 P. pseudoginseng KJ667625 AY271911 HQ112592
6 P. quinquefolius 7 P. ginseng 8 P. stipuleanatus 9 P. trifoliatus GQ436709 KM036297 HQ112593 KM036297 KM210143 KM207670 KF412449 KM207669 KM210157 JX680330 HQ112578 HQ112614 HQ112445 HQ112591
22
10 E.sessiliflorus AY233320 11 Polyscias javanica AY753252 DQ007383 12 Hedera hibernica JN995078 KT380924
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Lá của các mẫu sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kom Tum được
nghiền trong nitơ lỏng (-196°C) thành dạng bột mịn. Khoảng 100 mg bột
nghiền được dùng để tách DNA tổng số. Kết quả sau đó được điện di kiểm
tra trên gel agarose 1% (Hình 3.1).
Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1%
Kết quả điện di (hình 3.1) cho thấy vạch DNA thu được khá rõ,
vạch DNA thể hiện trên bảng gel điện di sắc gọn, chứng tỏ chúng tôi đã
thực hiện tách chiết DNA tổng số của sâm ngọc linh khá tốt, DNA tổng
số thu được ít bị đứt gãy.
3.2. Lựa chọn mồi SSR
Mười mẫu sâm ngọc linh trong số 60 mẫu thu được được thử
nghiệm tính đa hình đối với 11 cặp mồi SSR đặc hiệu thiết kế cho sâm
hàn quốc (Panax ginesng) (bảng 2.1). Phản ứng nhân dòng các đoạn
microsatellite được thực hiện với cặp mồi đánh dấu huỳnh quang một chiều xuôi. Chu trình phản ứng được thực hiện ở 95oC trong 30’’, 54 - 59oC trong 30’’, 72oC trong 40’’; 72oC trong 10’ với tổng số 35 chu
23
trình. Kiểm tra kết quả bằng phần mềm Gene Marker.
Kết quả thử nghiệm cho thấy trong số 11 mồi thử nghiệm, chỉ có 4
mồi gồm PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG -1481 cho kết quả đa
hình, các mồi còn lại hoặc không xuất hiện băng vạch, hoặc xuất hiện
băng nhiễu, không đặc hiệu. Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn 4 cặp
mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481 để phân tích tính đa
hình di truyền cho 60 mẫu sâm thu được từ 2 quần thể sâm ngọc linh
của Việt Nam tại Quảng Nam và Kon Tum.
Một vài hình ảnh các peak thu được khi phân tích 4 cặp mồi SSR được
trích dẫn ở hình 3.2.
Hình 3.2. Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4 mồi
24
PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481
3.3. Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh
Các thông số xác định đa dạng di truyền trong quần thể bao gồm
tần số allen cho một lô cút (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ
số gen dị hợp tử mong đợi (He) và hệ số giao giao phấn cận noãn (Fis)
được tính toán bằng phần mềm GenAlex (Bảng 3.1).
Kết quả phân tích 60 mẫu sâm ngọc linh thu từ 2 quần thể sâm
ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum cho thấy 25 mẫu sâm ngọc linh
từ quần thể Quảng Nam phân tích trên 4 cặp mồi SSR đã thu được
tổng số 525 alen, trung bình mỗi mẫu cho 21 alen. Mồi PG - 29 cho 8
alen với kích thước lần lượt là 91, 97, 100, 103, 106, 112, 115 và 118
bp. Mồi PG - 668 cho tổng số 5 alen với kích thước các băng lần lượt
là 89, 95, 104, 107 và 110 bp. Mồi PG - 1419 cho tổng số 6 alen với
các kích thước là 95, 97, 103, 105, 107 và 111 bp. Mồi PG - 1481 cho
2 alen với kích thước là 101 bp và 105 bp, tuy nhiên alen 101 bp xuất
hiện với tần suất áp đảo (85%), alen 105 bp chỉ xuất hiện ở 9 mẫu trên
tổng số 25 mẫu của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam.
Như vậy, tần số phân bố của các allen thu được ở 4 locus (PG - 29;
PG- 688; PG - 1419; PG - 1481) là không đồng đều. Trong đó locus
PG - 29 có tính đa hình cao nhất và locus PG - 1481 có tính đa hình
thấp nhất thể hiện ở 2 vạch (101 bp và 105 bp) (Bảng 3.1).
Tất cả 4 lô cút SSR đều là đa hình cho quần thể sâm ngọc linh ở
tỉnh Quảng Nam. Như vậy, quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam
đang duy trì mức độ đa dạng di truyền khá tốt, có giá trị bảo tồn cao.
Đối với quần thể sâm tại Kon Tum, 35 mẫu sâm ngọc linh thu
được đã cho tổng số 665 alen. Trong 4 mồi là PG - 29; PG - 688; PG -
1419; PG - 1481 số alen (A) nhận được lần lượt là 8 alen; 5 alen; 6
alen và 1 alen. Mồi PG - 29 cho nhiều alen nhất (8 alen), mồi PG -
25
1481 cho kết quả đơn hình với một vạch duy nhất; trung bình mỗi
locus có 5 alen. Tần số alen (Allele frequency) xuất hiện ở nhiều nhất
là ở locus PG - 29 là 0,0119; 0,0357; 0,6786; 0,0476; 0,0357; 0,1190;
0,0238; 0,0476 và thấp nhất ở locus PG - 1481 là 1,000. Mồi PG - 668
và PG - 1419 có kích thước băng dao động trong khoảng 89 bp đến
110 bp, tần số allen dao động từ 0,0114 tới 0,6705. Ở locus PG - 668
quan sát được mức độ đồng hợp tử khá cao nhưng chưa hoàn toàn lấn
át các tổ hợp gen dị hợp tử. Số lượng alen quan sát được ở locus PG -
668 cũng thấp hơn so với 3 locus PG - 29; PG - 1419 và PG - 1481.
Điều này có thể sự cách ly và phiêu bạt di truyền phần nào đã làm
giảm tỉ lệ các tổ hợp gen dị hợp. Các phân tích chỉ ra rằng ở bốn locus
nghiên cứu có sự đa hình khá lớn, tuy nhiên tần số phân bố của các
allen không đồng đều, số lượng allen có tần số xuất hiện có ý nghĩa
chỉ ở mức trung bình thấp. Đây có thể là kết quả của quá trình cách ly
và chọn lọc không đều đã làm giảm tần số xuất hiện của một số allene
hiếm hay không có ưu thể trong tiến hóa.
Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên
phân tích 4 chỉ thị SSR
Locus Allele A Fis ne Alleles Ho He
(bp) frequency
PG - 29 8 2,073 91 0,0119 0,548 0,518
0,0357 0,6786 97 100
0,0476 103
0,0357 0,1190 106 112
0,0238 115
0,0476 118
26
0,0341 0,6705 89 95 PG - 668 5 1,944 0,432 0,485
104 0,2500
107 0,0114
110 0,0341
PG - 1419 6 2,821 0,2442 0,884 0,645 95
97 0,0116
103 0,5233
105 0,1279
107 0,0349
111 0,0581
101 0,85 PG - 1481 2 1,00 0,000 0,000
105 0,15
21 0,621
Tổng số QT Quảng 21 2,27 0,49 0,42 -0,12
Nam
QT Kon 20 2,05 0,43 0,40 -0,09
Tum
Ghi chú: A: Số alen; ne: Số allen hiệu quả; Ho : hệ số dị hợp tử; He: Hệ số dị hợp tử mong đợi; Fis là giá trị giao phối cận huyết
Trung bình 2,16 0,46 0,41 -0,105
Chỉ số số alen có ý nghĩa (Ne) của bốn locus PG - 29; PG - 688; PG -
1419; PG - 1481 lần lượt là 2,073; 1,944; 2,821; 1.000, như vậy số alen
có ý nghĩa (Ne) dao động từ 1,0 đến 2,821 (trung bình là 1,959), trong
đó hơn một nửa là các alen hiếm với tỷ lệ rất thấp (0,05). Tiếp theo là tần
số di hợp tử quan sát (Ho) trung bình mỗi locus là 0,466 (dao động từ 0
đến 0,884 tuỳ theo từng locus) cao nhất là cao nhất ở locus PG - 1419 là
0,645. Ở 4 locus PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG - 1481 tần số dị hợp
tử quan sát (Ho) có trùng bình mỗi locus đa hình là 0,621. Tần số dị hợp
27
tử mong đợi (He) của bốn locus PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG -
1481 cao nhất ở locus PG - 1419 là 0,645 và thấp nhất ở locus PG - 1481
là 0,000, tần số dị hợp trung bình của mỗi locus là 0,412. Như vậy trung
bình tần số dị hợp tử mong đợi (He) mỗi locus thấp hơn tần số dị hợp tử
quan sát (Ho) mỗi locus (He = 0,412 < Ho = 0,466). Điều đó chứng tỏ
hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon Tum đều đang duy trì
được tần số dị hợp tử tương đối khả quan.
Ở mức độ quần thể, quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam cho thấy
tần số alen cao hơn so với quần thể sâm ngọc linh ở Kom Tum (AR = 2,27 >
AR = 2,05). Tần số alen di hợp tử quan sát được (Ho) của quần thể sâm
ngọc linh ở Quảng Nam là 0,49 và ở Kon Tum là 0,43. Tần số dị hợp tử
mong đợi (He) ở hai quần thể này lần lượt là 0,42 và 0,4. Như vậy quần
thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam có tần số dị hợp tử mong đợi (He) cao
hơn tần số dị hợp tử mong đợi của quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum
(0,42 > 0,4). Tần số alen di hợp tử quan sát được (Ho) của quần thể sâm
ngọc linh ở Quảng Nam cũng cao hơn tần số dị hợp tử mong đợi so với
quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum (0,49 > 0,43). Như vây, có thể kết
luận cả hai quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum đều đang
duy trì được tần số dị hợp tử tương đối cao, hiện tượng tự thụ phấn chưa
ảnh hưởng đến cấu trúc di truyền quần thể của cả hai quần thể này, tuy
nhiên quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam thể hiện mức độ đa dạng và
tần số dị hợp tử cao hơn so với quần thể sâm ngọc linh tại Kon Tum.
Tuy vậy, các kết quả phân tích thu được cũng cho thấy mặc dù có
sự đa hình khá lớn ở bốn locus nghiên cứu nhưng tần số phân bố của
các alen không đồng đều, số lượng alen có tần số xuất hiện có ý nghĩa
chỉ ở mức trung bình thấp. Đây có thể là kết quả của quá trình cách ly
và chọn lọc không đều đã làm giảm tần số xuất hiện của một số alen
hiếm hay không có ưu thể trong tiến hóa, điều này cho thấy rất có thể
28
quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon tum thực chất ban đầu
có nguồn gốc từ một quần thể chung, sau đó bị phân ly tạo thành hai
quần thể riêng biệt nên vẫn tồn tại một số alen hiếm nhưng với tần số
rất nhỏ.
Về chỉ số tự thụ phấn Fis, khi giá trị Fis > 0.1 thì khả năng quần
thể đã có hiện tượng giao phấn cận noãn xảy ra, khi giá trị Fis < 0 thì
khả năng quần thể chưa xảy ra hiện tượng giao phấn cận noãn; còn khi
giá trị 0 < Fis < 0,1 thì quần thể chưa xảy ra hiện tượng thoái hóa hay
tỷ lệ tần số alen di hợp tử quan sát được là tương đối cân bằng. Kết
quả phân tích chỉ số Fis của hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam
và Kon Tum ở nghiên cứu này đều cho giá trị hệ số cận noãn (Fis) nhỏ
hơn 0 (cụ thể, giá trị Fis của 2 quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam
và Kon Tum lần lượt là - 0,12 và – 0,09). Kết quả này phản ánh hệ số
gen đồng hợp tử ở các quần thể này đều thấp hơn so với tỷ lệ alen dị
hợp tử quan sát được, nghĩa là chưa xuất hiện hiện tượng thoái hóa di
truyền hay nói cách khác chưa xảy ra sự tự thụ phấn trong quần thể
hay việc tự thụ phấn giữa một số cá thể trong quần thể chưa làm ảnh
hưởng đến tần số alen dị hợp tử tổng số của quần thể. Quần thể sâm
ngọc linh ở Quảng Nam có hệ số cận noãn (Fis) nhỏ hơn hệ số cận
noãn (Fis) ở quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum (- 0,12 < - 0,09), điều
đó cho thấy tỷ lệ tự thụ phấn ở các cá thể trong quần thể sâm ngọc linh
ở Quảng Nam thấp hơn so với Kon Tum, kết quả phân tích alen dị hợp
và tần số đa dạng alen ở quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam cũng
cao hơn so với quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum.
Nhìn chung, các kết quả thu được trong nghiên cứu này đều cho thấy
các giá trị Ho, He của hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon
Tum đều cao hơn so với các kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền
quần thể của loài sâm mỹ (Panax quinquefollius) và loài nhân sâm
29
(Panax ginseng) [48]. Điều đó chứng tỏ loài sâm ngọc linh của Việt
Nam đang có được một nguồn gen phong phú với tỷ lệ locus đa hình cao.
Kết quả thu được từ phân tích AMOVA cũng đã chỉ ra rằng mức độ
sai khác di truyền trung bình được tìm thấy ở hai quần thể sâm ngọc linh
ở Quảng Nam và Kon Tum trung bình là 85,175 %. Sự khác biệt di
truyền xảy ra trong quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon Tum
có thể là kết quả của sự khai thác, mua bán và sử dụng tràn lan với số
lượng lớn trong nhiều năm, việc khai thác quá mức đã dẫn đến sự mất
mát alen trong quần thể gây ra sự khác biệt di truyền cao trong quần thể
sâm. Sự khác biệt di truyền lớn nếu xảy ra trong quần thể cũng là một
trong những nguyên nhân quan trọng gây ra sự phân ly di truyền. Để
khắc phục hiện tượng này thì một trong những biện pháp đưa ra là cần
phải có những biện pháp bổ sung alen nhằm nâng cao tính đa dạng trong
di truyền, rút ngắn khoảng cách khác biệt di truyền giữa các cá thể trong
quần thể.
Tuy đây mới là những phân tích bước đầu nhưng kết quả cho thấy tỷ
lệ dị hợp trong 2 quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum đủ
đảm bảo cho quần thể sâm ngọc linh phát triển. Tuy nhiên trong nghiên
cứu này, hai quần thể sâm ngọc linh mà chúng tôi thực hiện thu mẫu là
hai quần thể sâm thuộc sự quản lý của UBND xã Trà Linh, huyện Nam
Trà My và UBND xã Măng ri, huyện Tu Mơ Rông, các cây sâm ở đây
hầu hết đều là những cây được di thực từ tự nhiên, quy tập về trồng tại
đây nên hầu như vẫn giữ được tính đa dạng cao. Tuy nhiên nếu sau thời
gian dài trồng tập trung như hiện nay mà không có sự bổ sung thêm cây
mới hay nói cách khác là bổ sung nguồn gen mới thì khả năng mất đi
tính đa dạng của quần thể này là chắc chắn xảy ra.
3.4. Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu
Bốn vùng gen chúng tôi sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền
30
của loài sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax cũng như
đánh giá khả năng phân loại loài sâm ngọc linh của Việt Nam là 2
vùng gen lục lạp gồm rbcL, rpoB và 2 vùng gen nhân là 18S và ITS.
Vùng gen rbcL có kích thước khoảng 1500 bp được chia thành 2
đoạn gen gồm rbcLa và rbcLc có kích thước mỗi vùng là 600 bp. Phản
ứng PCR khuếch đại gen rbcLa; rbcLc; rpoB; 18S; ITS được nhân bản
bằng các cặp mồi đặc hiệu (bảng 2.2), tiến hành trên máy PCR system 9700, bắt cặp ở 520C-540C, kéo dài mỗi chuỗi trong 1 phút, phản ứng
PCR được thực hiện trong tổng số 35 chu kỳ. Các sản phẩm PCR sau
đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1%
cho thấy chúng tôi đã thu được 5 vạch với kích thước lần lượt là 600 bp
tương ứng với đoạn gen rbcLa, 600 bp tương ứng với đoạn gen rbcLc;
700 bp tương ứng với gen ITS; 500 bp tương ứng với đoạn gen rpoB và
600 bp tương ứng với gen 18S đúng như dự kiến (hình 3.3; hình 3.4)
Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di trên gel agarose 1% Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di trên gel agarose 1%.
M: DNA ladder 1kb Thermo M: DNA ladder 1kb Thermo
1: SNL đoạn gen rbcLa 1: SNL đoạn gen ITS
2: SNL đoạn gen rbcLc 2: SNL đoạn gen rpoB
31
3:SNL đoạn gen 18S
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được giải trình tự trực tiếp trên máy
ABI 3100 Avant, với các mồi đọc trình tự là mồi xuôi của các vùng gen
tương ứng gồm rbcLa, rbcLc; rpoB; 18S, ITS. Hình ảnh các peak của
trình tự DNA các mẫu nghiên cứu được phân tích và ghép nối bằng phần
mềm chromas-Pro (hình 3.5)
Hình 3.5. Ví dụ về hình ảnh các peak trong giải trình tự
Kết quả giải trình tự sau đó được kiểm tra bằng chức năng Blast của
NCBI để đánh giá tính chính xác của 5 vùng gen nhân bản được cũng như
khả năng phân loại bước đầu của 5 vùng gen này.
3.5. Kết quả phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử của các vùng
gen rbcL, rpoB, ITS và 18S của loài sâm ngọc linh.
Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp các vùng gen tương đồng bằng Blast
Hai đoạn gen rbcLa và rbcLc sau khi giải trình tự thì được ghép nối
32
với nhau thành một đoạn gen rbcL dài khoảng 1200 bp. Kết quả so sánh
trình tự bằng BLAST trên cơ sở dữ liệu genbank cho thấy các đoạn gen
đã được khuếch đại chính xác. Theo đó, tỷ lệ tương đồng giữa các cặp
trình tự so sánh với các loài trên genbank như sau: đoạn gen 18S có độ
tương đồng cao nhất (99,9 %); tiếp theo là đến vùng gen rbcL (độ tương
đồng đạt 99 %), rpoB có độ tương đồng đạt 95 % và độ tương đồng gen
ITS đạt 89%. Vùng gen ITS trong DNA ribosome đã được chứng minh
là hiệu quả nhất trong việc đánh giá mối quan hệ phát sinh giữa các loài
nghiên cứu về mã vạch phân tử DNA. Zuo el at., (2011) sau khi nghiên
cứu các vùng gen rpoB; trnH-psbA; rpoC1, rbcL, ITS, matK;…. trên
quần thể chi Nhân Sâm đã chỉ ra rằng vùng gen ITS có mức độ đa dạng
di truyền cao nhất, có khả năng phân biệt loài từ 87,5% và dưới loài đến
84,21%. Sau đó đến các đoạn gen rbcL; rpoB [45].
Kết quả phân tích cấu trúc 4 vùng gen 18S, rbcL, rpoB và ITS cho
thấy:
- Đoạn gen 18S dài 600 bp của sâm ngọc linh đã mã hóa cho 188
acid amin, tỷ lệ Guanine chiếm 26,4 %; Thymine chiếm 24,8%; Adenine
chiếm 27,3%; Cytosine chiếm 21,5%. Thành phần G và thành phần C
không có sự dao động lớn, không phát hiện vị trí nucleotide sai khác
(Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen 18S với các loài
#KT154684.1_Panax_vietnamensis TTC AGA CTG TGA AAC TGC GAA TGG CTC ATT AAA TCA GTT ATA GTT TGT TTG ATG GTA TCT [ 60]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 60]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis GCT ACT CGG ATA ACC GTA GTA ATT CTA GAG CTA ATA CGT GCA ACA AAC CCC GAC TTC TGG [120]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
33
Panax trên ngân hàng gen
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... [120]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [120]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis AAG GGA TGC ATT TAT TAG ATA AAA GGT CGA CGC GGG CTT CTG CCC GTT GCT GCG ATG ATT [180]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [180]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- A.. .T. ... ... ... ... ... [180]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis CAT GAT AAC TCG ACG GAT CGC ACG GCC CTC GTG CCG GCG ACG CAT CAT TCA AAT TTC TGC [240]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis CCT ATC AAC TTT CGA TGG TAG GAT AGT GGC CTA CTA TGG TGG TGA CGG GTG ACG GAG AAT [300]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [300]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis TAG GGT TCG ATT CCG GAG AGG GAG CCT GAG AAA CGG CTA CCA CAT CCA AGG AAG GCA GCA [360]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [360]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis GGC GCG CAA ATT ACC CAA TCC TGA CAC GGG GAG GTA GTG ACA ATA AAT AAC AAT ACC GGG [420]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [420]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis CTC AGT GAG TCT GGT AAT TGG AAT GAG TAC AAT CTA AAT CCC TTA ACG AGG ATC CAT TGG [480]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
34
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ..G .T. C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [480]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis AGG GCA AGT CTG GTG CCA GCA GCC GCG GTA ATT CCA GCT CCA ATA GCG TAT ATT TAA GTT [540]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [540]
#KT154684.1_Panax_vietnamensis GTT GCA GTT AAA AAG CTC GTA GTT [564]
#KT380922.1:1-1808_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#AB033635.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#KX768319.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#KX768320.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#AB044901.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#KM036297.1:1-1808_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#KM207669.1:1-1810_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#KT380920.1:1-1808_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#KT380921.1:1-1808_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
#KT380924.1:3947-5753_Eleutherococcus_sessiliflorus ... ... ... ... ... ... ... ... [564]
- Đoạn gen rbcL dài 1200 bp mã hoá cho 444 acid amin, tỷ lệ
Guanine chiếm 25,6 %; Thymine chiếm 28,3%; Adenine chiếm 26,3%;
Cytosine chiếm 20,1%. Thành phần G; C dao động trong khoảng từ 20,6
tới 23,3 %. Thành phần A và thành phần T không có sự dao động lớn.
Thành phần T; A dao động trong khoảng từ 27,6 tới 28,5 %. Đã phát
hiện thấy vị trí 11 biến đổi khi so sánh với sâm lai châu (Panax
vietnamensis var. fuscidiscus) tương ứng ở các vị trí 1 (TC); số 39
(GA); số 73 (GT); số 120; 274; 284; 336; 467; 568 (GA); số 310
(TC); số 637 (TG), có 13 vị trí nucleotide sai khác khi so sánh với
#P.SNL AGC AAG TGT TGG ATC CAA AGC TGG TGT TAA AGA TTA CAA ATT GAC TTA TTA TAC TCC TGA CTA TGA CCC CAA AGA TAC TGA TAT CTT GGC AGC ATT CCG [ 99]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Polyscias_javanica_AY753252 .AT G.T C.. C.A ..T ... .AT AAA ... CC. ... .AG ... G.. ..T CGG ... ATT CAA .A. GA. ..G GAG TT. GC. CG. AAT .TC A.. ..T .C. ... ..A [ 99]
#P.SNL AGT AAC TCC TCA ACC TGG AGT TCC AGC TGA AGA AGC AGG GGC CGC GGT AGC TGC CGA ATC TTC TAC TGG TAC ATG GAC AAC TGT GTG GAC CGA TGG ACT [198]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
35
sâm hàn quốc (Hình 3.6; Hình 3.7; Bảng 3.3).
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Polyscias_javanica_AY753252 .CC G.A ... .TC .AT ..T TTA CTT .AT .C. .T. TT. .AT .AG T.A AT. TT. AAT .A. CCA AC. C.T .TT C.A .AT AT. ..G .A. AA. A.T T.. AA. T.. [198]
#P.SNL TAC CAG CCT TGA TCG TTA CAA AGG GCG ATG CTA CAA AAT AGA GCC CGT TGC TGG AGA AGA AAC TCA ATT TAT TGC TTA TGT AGC TTA CCC ATT AGA CCT [297]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_japonicus_KP089453 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Polyscias_javanica_AY753252 .T. ATT TG. CT. ..A ... T.G .CA A.T ..A T.. TCC ... .TT AT. .A. G.T .C. .AC CTG ... ..T ... ..C GAT .C. .A. TT. .AT .T. ..C G.C T.. [297]
#P.SNL TTT TGA AGA AGG TTC TGT TAC TAA CAT GTT TAC TTC CAT TGT AGG TAA TGT ATT TGG GTT CAA AGC CCT GCG TGC TCT ACG TCT GGA AGA TCT GCG AAT [396]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Polyscias_javanica_AY753252 .C. ..C .T. TC. A.T .AC GT. ..G .C. ... .G. A.T TT. .C. TTT .T. .AC C.. .TC A.A ... .TT ..A TA. ATT .TC ..A ... A.G .TT .AC ATA T.C [396]
#P.SNL CCC TGT TGC TTA TGT TAA AAC TTT CCA AGG CCC GCC TCA TGG CAT CCA AGT TGA GAG AGA TAA ATT GAA CAA GTA TGG TCG TCC CCT GTT GGG ATG TAC [495]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_trifoliatus_KM210159 T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Polyscias_javanica_AY753252 AA. ATA .A. CAC ... C.. ..T ..C TT. TTA TTT AGG .T. ... T.. TTC .A. .C. A.A .A. GT. .AA A.T T.. .A. ... .T. CG. .A. A.. AT. .AA G.G [495]
#P.SNL TAT TAA ACC TAA ATT GGG GTT ATC TGC TAA AAA CTA CGG TAG AGC GGT TTA TGA ATG TCT CCG TGG TGG ACT TGA TTT TAC CAA AGA CGA TGA GAA CGT [594]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Polyscias_javanica_AY753252 ... AC. .TA ATG ..G TAT T.G GCG AAT C.. .T. .C. T.. ..A ... AT. ..G ... TAA .A. TA. ..T ... GA. ... ... .GT G.. ... .TG ... A.. GT. [594]
#P.SNL GAA CTC ACA ACC ATT TAT GCG TTG GAG AGA TCG [627]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Polyscias_javanica_AY753252 TC. T.A ..G C.T .A. ..C AT. .C. AGT ... C.. [627]
#P.SNL AGC AAG TGT TGG ATC CAA AGC TGG TGT TAA AGA TTA CAA ATT GAC TTA TTA TAC TCC TGA CTA TGA CCC CAA AGA TAC TGA TAT CTT GGC AGC ATT CCG [ 99]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#Polyscias_javanica_AY753252 .AT G.T C.. C.A ..T ... .AT AAA ... CC. ... .AG ... G.. ..T CGG ... ATT CAA .A. GA. ..G GAG TT. GC. CG. AAT .TC A.. ..T .C. ... ..A [ 99]
#P.SNL AGT AAC TCC TCA ACC TGG AGT TCC AGC TGA AGA AGC AGG GGC CGC GGT AGC TGC CGA ATC TTC TAC TGG TAC ATG GAC AAC TGT GTG GAC CGA TGG ACT [198]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
36
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các loài Panax trên ngân hàng gen.
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#Polyscias_javanica_AY753252 .CC G.A ... .TC .AT ..T TTA CTT .AT .C. .T. TT. .AT .AG T.A AT. TT. AAT .A. CCA AC. C.T .TT C.A .AT AT. ..G .A. AA. A.T T.. AA. T.. [198]
#P.SNL TAC CAG CCT TGA TCG TTA CAA AGG GCG ATG CTA CAA AAT AGA GCC CGT TGC TGG AGA AGA AAC TCA ATT TAT TGC TTA TGT AGC TTA CCC ATT AGA CCT [297]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_japonicus_KP089453 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#Polyscias_javanica_AY753252 .T. ATT TG. CT. ..A ... T.G .CA A.T ..A T.. TCC ... .TT AT. .A. G.T .C. .AC CTG ... ..T ... ..C GAT .C. .A. TT. .AT .T. ..C G.C T.. [297]
#P.SNL TTT TGA AGA AGG TTC TGT TAC TAA CAT GTT TAC TTC CAT TGT AGG TAA TGT ATT TGG GTT CAA AGC CCT GCG TGC TCT ACG TCT GGA AGA TCT GCG AAT [396]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#Polyscias_javanica_AY753252 .C. ..C .T. TC. A.T .AC GT. ..G .C. ... .G. A.T TT. .C. TTT .T. .AC C.. .TC A.A ... .TT ..A TA. ATT .TC ..A ... A.G .TT .AC ATA T.C [396]
#P.SNL CCC TGT TGC TTA TGT TAA AAC TTT CCA AGG CCC GCC TCA TGG CAT CCA AGT TGA GAG AGA TAA ATT GAA CAA GTA TGG TCG TCC CCT GTT GGG ATG TAC [495]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_trifoliatus_KM210159 T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#Polyscias_javanica_AY753252 AA. ATA .A. CAC ... C.. ..T ..C TT. TTA TTT AGG .T. ... T.. TTC .A. .C. A.A .A. GT. .AA A.T T.. .A. ... .T. CG. .A. A.. AT. .AA G.G [495]
#P.SNL TAT TAA ACC TAA ATT GGG GTT ATC TGC TAA AAA CTA CGG TAG AGC GGT TTA TGA ATG TCT CCG TGG TGG ACT TGA TTT TAC CAA AGA CGA TGA GAA CGT [594]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#Polyscias_javanica_AY753252 ... AC. .TA ATG ..G TAT T.G GCG AAT C.. .T. .C. T.. ..A ... AT. ..G ... TAA .A. TA. ..T ... GA. ... ... .GT G.. ... .TG ... A.. GT. [594]
#P.SNL GAA CTC ACA ACC ATT TAT GCG TTG GAG AGA TCG [627]
#Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus_KT194325.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_japonicus_KP089453 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_japonicus_var._bipinnatifidus_HQ112619 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_trifoliatus_KM210159 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_notoginseng_KP089452 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_stipuleanatus_KP089455 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_ginseng_HQ112596 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Panax_pseudoginseng_KM210152 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [627]
#Polyscias_javanica_AY753252 TC. T.A ..G C.T .A. ..C AT. .C. AGT ... C.. [627]
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các loài Panax trên ngân hàng gen.
1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 3 3 2 3 3 4 4 7 7 0 0 2 5 5 8 4 4 6 7 8 9 9 0 1 1 3 1 9 8 9 1 3 6 8 0 2 5 3 1 2 1 4 4 7 8 6 0
T G T G C C C G A T G G A C G G T G G A T G T
C
.
. A .
. T
.
. A .
.
. A .
. A A .
.
. C
.
P. vietnamensis (KT154685.1) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KT194325.1) P. japonicas var. bipinnatifidus
.
.
. A .
. T
.
. A .
.
. A .
. A A .
.
.
.
.
37
Bảng 3.3. Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa và rbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax.
.
.
.
. A .
. T
.
. A .
.
. A .
. A A .
.
.
.
.
.
.
. A .
. T
.
. A .
.
. A .
. A A .
.
.
.
C
. A A .
. A T
.
. A .
.
. A .
. A A .
.
. C
.
.
. A .
.
. T
.
. A .
. T A .
. A A .
.
.
.
.
.
. A . T
. T
.
. A .
. T A .
. A A .
.
.
.
.
.
.
. A .
. T
. C A .
. T C .
. A A .
.
.
.
.
.
.
. A .
. T
.
. A .
.
. C .
. A A .
.
.
.
(KM210141.1) P. japonicus (KF208380.1) P. notoginseng (GQ436706.1) P. pseudoginseng (KJ667625.1) P. quinquefolius (GQ436709.1) P. ginseng (KM210143.1) P. stipuleanatus (KM210157.1) P. trifoliatus (HQ112614.1) Polyscias javanica (AY753252.1)
. A A A T G G C G . T T T A A T C T . C C T .
3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 1 3 4 5 5 5 1 1 6 6 0 2 4 6 6 0 0 1 3 3 3 3 6 4 0 6 7 1 5 7 8 9 4 4 4 8 1 6 7 1 4 7
T G A A G G A A G T T A T G G A G T T G T T
. A .
.
.
.
.
. A .
.
.
.
. A .
.
.
.
. G .
.
.
. A .
.
.
. A .
.
.
. A .
.
. T .
.
.
.
.
.
. A . G .
. A .
.
.
. A .
.
. T .
.
.
.
.
. A .
.
.
. A .
. G .
. A .
.
. T .
.
.
.
.
.
. A . G .
. A .
.
.
. A .
.
. T .
.
.
.
.
.
. A .
.
.
. A .
. G . A .
.
. T .
.
.
.
.
.
. A .
.
.
. A .
. G . A .
.
. T .
.
.
.
. A .
.
.
. A A .
.
.
. A C .
.
. T .
.
.
.
G A .
.
.
. A .
.
.
.
. A C .
. A T . G
.
.
P. vietnamensis (KT154685.1) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KT194325.1) P. japonicas var. bipinnatifidus (KM210141.1) P. japonicus (KF208380.1) P. notoginseng (GQ436706.1) P. pseudoginseng (KJ667625.1) P. quinquefolius (GQ436709.1) P. ginseng (KM210143.1) P. stipuleanatus (KM210157.1) P. trifoliatus (HQ112614.1) Polyscias javanica (AY753252.1)
A T T C T A C T A A A .
. T C . A C . T G A
38
- Đoạn gen rpoB dài 500 bp, mã hóa cho 164 acid amin, tỷ lệ Guanine
chiếm 21,7%; Thymine chiếm 25,4%; Adenine chiếm 33,3%; Cytosine
chiếm 21,7%. Kết quả so sánh trên Mega 7.0 cho thấy đã tìm thấy 02 vị trí
biến đổi (variable) khi so sánh với sâm lai châu ở vị trí số 11 (GA) và 13
(AG). Hệ số trung bình của cặp Si (Transition) và Sv (transversion) của
sâm ngọc linh và sâm lai châu là 1,0. Hệ số này đối với vị trí codon thứ
nhất, thứ hai và thứ ba tương ứng là 1. Có 4 vị trí sai khác giữ Sâm ngọc
linh (Panax vietnamensis) với Panax ginseng và Panax pseudoginseng
#KT94686.1_Panax_vietnamensis ... ... ... .A. G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 78]
#KF412449.1_Panax_ginseng T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#HQ112595.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#HQ112577.1_Panax_notoginseng T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#HQ112592.1_Panax_pseudoginseng T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#HQ112591.1_Panax_trifoliatus T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#HQ112593.1_Panax_quinquefolius T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#HQ112579.1_Panax_japonicus T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#HQ112578.1_Panax_stipuleanatus T.. A.T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... [ 78]
#JN995078_Hedera_hibernica TT. GGT A.. T.. T.. TT. C.. A.. TAA AG. AAA .AC ... A.C ... .AA A.A AAA AAA .T. ... ATT TTT T.. TAC TTA [ 78]
#KT94324.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ATC ATT TAT ACC GAT ACT GAC AAG ATC CTT TTA TCA GGT AAT GGA AAT ACT CTA AGC ATT CCA TTA GTT ATA TAT CAA [156]
#KT94686.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#KF412449.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#HQ112595.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#HQ112577.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#HQ112592.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C [156]
#HQ112591.1_Panax_trifoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#HQ112593.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#HQ112579.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#HQ112578.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [156]
#JN995078_Hedera_hibernica .C. CCC .T. .TA ... T.C ATT GTT ..A GA. .CC ATT .T. C.A AA. GGG .T. .GC ..A GAA GAG AA. AA. T.T ..C .T. [156]
#KT94324.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus CGC TCC AAC AAA AAT ACT TGT ATG CAT CAA AAA CCC CAG GTT CAG CGG GGT AAA TGC ATA AAA AAG GGA CAA ATT TTA [234]
#KT94686.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#KF412449.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#HQ112595.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#HQ112577.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#HQ112592.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#HQ112591.1_Panax_trifolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#HQ112593.1_Panax_quinquefoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#HQ112579.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#HQ112578.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [234]
#JN995078_Hedera_hibernica TTT .TT .TT TG. ... GT. ..A ... ..C G.. ..T TT. .T. ACC .TA TA. .CA .C. .AT ... ..T ... AA. .C. ... AG. [234]
#KT94324.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus GCC CAT GGC GCC GCT ACA GTT GGT GGC GAA CTC GCT TTG GGG AAA AAC GTA TTA GTA GCT TAT ATG CCA TGG GAA GGT [312]
#KT94686.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [312]
#KF412449.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [312]
#HQ112595.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [312]
#HQ112577.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [312]
#HQ112592.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... [312]
#HQ112591.1_Panax_trifoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... [312]
#HQ112593.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [312]
#HQ112579.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [312]
#HQ112578.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... [312]
#JN995078_Hedera_hibernica TAT ... AT. TGT .TA ... A.. TT. .TT .GG G.T TAC A.A TAC TC. T.T A.. ..G T.. TAA .GG .AA TAG A.A AGG AT. [312]
#KT94324.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus TAC AAT TTT GAA GAT GCA GTA CTC ATT AGC GAG CGC TTG GTA TAT GAA GAT ATT TAT ACT TCT TTT CAC ATA CGA AAA [390]
#KT94686.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#KF412449.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#HQ112595.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#HQ112577.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#HQ112592.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
39
(Hình 3.8; Bảng 3.4).
#HQ112591.1_Panax_trifoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#HQ112593.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#HQ112579.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#HQ112578.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [390]
#JN995078_Hedera_hibernica .TT T.. .GA A.. ..A AA. A.. ..G .A. .AA C.C ..A ..A ... ... .T. TCA ... .T. TT. ... .A. GT. ... G.. ... [390]
#KT94324.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus TAT GAA ATT AAG ACT CAT GTG ACA AGC CAA GGC CCC GAA AGG GTC ACT AAT GAA ATA CCG CAT TTA GAA GCC CAT TTA [468]
#KT94686.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#KF412449.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#HQ112595.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#HQ112577.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#HQ112592.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#HQ112591.1_Panax_trifoliatus ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#HQ112593.1_Panax_quinquefolius ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#HQ112579.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#HQ112578.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... C.A ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [468]
#JN995078_Hedera_hibernica C.. ..G ... ... G.. .G. TCA TG. .TT .GT A.T .AA A.G CCA A.A GT. ... ... ..T TGT ... C.G A.. AT. ... .G. [468]
#KT94324.1_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus CTC CGC AAT TTA GAC AAA AAC GGA A [493]
#KT94686.1_Panax_vietnamensis ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#KF412449.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#HQ112595.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#HQ112577.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#HQ112592.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#HQ112591.1_Panax_trifoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#HQ112593.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#HQ112579.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#HQ112578.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... . [493]
#JN995078_Hedera_hibernica ..T TT. ... A.. A.G GTG .GG ... . [493]
Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các loài Panax trên ngân hàng gen
Bảng 3.4. Kết quả so sánh các Nu sai khác trên gen rpoB giữa sâm ngọc
1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 1 1 1 5 6 5 5 6 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 4 5 6 0 1 3 9 0 6 9 0 1 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5
C G T T G G G
A C
A A
G
G C
C
C A
T
G
G A
A G
A C T
.
.
.
.
. A G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
.
. . A . T
.
.
. T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
. A . T
. T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T C A . T
. T
. C
.
. G .
. C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
. A . T
. T
.
. T
.
. G .
. C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
. A . T
. T
.
.
.
.
. C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
. A . T
. T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
. A . T
. T
.
. G .
. C
. A
.
. C
.
.
.
.
.
.
.
.
T
. A . T
. T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
P. vietnamensis var. fuscidiscus KT194324 P. vietnamensis KT154686 P. ginseng KF412449 P. japonicus var. bipinnatifidus HQ112595 P. pseudoginseng HQ112592 P.trifoliatus HQ112591 P. quinquefolius HQ112593 P. japonicus HQ112579 P. stipuleanatus HQ112578 P. notoginseng HQ112577 Hedera hibernica JN995078
T T G G T G
. T T
.
. T T T A G A
. A
. G
.
.
.
.
.
40
linh và các loài khác thuộc chi Panax.
- Đoạn gen ITS có độ tương đồng thấp nhất khi so sánh với 11 loài
thuộc chi Panax. Điều này cũng có nghĩa đây là vùng gen có độ biến đổi
cao. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen ITS cho thấy đoạn ITS dài
700bp đã mã hoá cho 226 acid amin tỷ lệ Guanine chiếm 29,1%;
Thymine chiếm 18,2%; Adenine chiếm 21,8%; Cytosine chiếm 30,9%.
Khi so sánh với trình tự đoạn gen ITS của sâm lai châu đã phát hiện ra 7
vị trí nucleotide sai khác ở các vị trí số 61 (AG), 73 (TC), 245
(AG), 412(GA), 487(CT), 494(CT), 627(TC) trong đó
nucleotide ở vị trí số 412 có ý nghĩa Parsimony. Hệ số trung bình của
cặp Si (Transition) và Sv ( transversion) của sâm ngọc linh và sâm lai
châu là 2,1. Hệ số này đối với vị trí codon thứ nhất, thứ hai và thứ ba
tương ứng là 1,9; 3,2; 1,6. (Hình 3.9; Bảng 3.5).
#KT380922.1_Panax_vietnamensis TAG GTG AAC CTG CGG AAG GAT CAT TGT CGA AAC CTG CAT AGC AGA ACG ACC CGC GAA CAC ATT AC- --A ATA TCG GGT GAG GGA CGA GGG GTG CGC AAG [ 99]
#MH238445_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ..- --. ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#KM207670.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ..- --. ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#KT380921.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ..A G.. ..- --. ... C.. ... ... ... T.. ... ... ..T .G. [ 99]
#KM887432.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ..- --. C.. C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#HQ112445.1_Panax_trifoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... G.. T.- --. .C. C.. ... ... ... ... A.. ... ... ... [ 99]
#KM036297.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ..- --. ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#KT380920.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ..- --. C.. C.. ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#JX680330.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ..- --. .C. C.. ... ... ... ... A.. ... ... ... [ 99]
#AY233325.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ..- --. C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 99]
#DQ007383.1_Polyscias_javanica ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... G.. ..C GC. .C. C.. ... ... ... ... A.. ... ... ... [ 99]
#KT380922.1_Panax_vietnamensis CTC CCC AAG TTG CAA ACC CAT GGT CGG GGA CCG CCC TTG GGT GGC TCT CGT CCG AAC AAC GAC CCC CCG GCG CGG AAT GCG CCA AGG AAA TCA AAC TGA [198]
#MH238445_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#KM207670.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#KT380921.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... [198]
#KM887432.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#HQ112445.1_Panax_trifoliatus .C. ... ... ..C .G. ... ... ... ... ..G ... ... CC. ... ..T CT. ... ... ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#KM036297.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#KT380920.1_Panax_japonicus ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ..T ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#JX680330.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... .TA ... ... ... .TT C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#AY233325.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [198]
#DQ007383.1_Polyscias_javanica ... ... ... .C. TG. G.. ... ..C ... ... .TA ... .CA ... .TT C.. ..A ... G.. ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. [198]
#KT380922.1_Panax_vietnamensis ACT GCG CGC GTC CCC CCC GTT TGC GGG CGG CGG AAG CGT CTT TCT AAA ACA CAA ACG ACT CTC GGC AAC GGA TAT CTC GGC TCT CGC ATC GAT GAA GAA [297]
#MH238445_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#KM207670.1_Panax_ginseng ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#KT380921.1_Panax_notoginseng ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#KM887432.1_Panax_pseudoginseng ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#HQ112445.1_Panax_trifoliatus ..A .AA ... ... .-- --- ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .CG ... ... ... ... ... ... [297]
#KM036297.1_Panax_quinquefolius ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#KT380920.1_Panax_japonicus ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#JX680330.1_Panax_stipuleanatus ... ..A ... ... ... .T. ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#AY233325.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#DQ007383.1_Polyscias_javanica ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [297]
#KT380922.1_Panax_vietnamensis CGT AGC GAA ATG CGA TAC TTG GTG TGA ATT GCA GAA TCC CGT GAA CCA TCG AGT CTT TGA ACG CAA GTT GCG CCC GAA GCC ATT AGG CCG AGG GCA CGT [396]
#MH238445_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#KM207670.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#KT380921.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#KM887432.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#HQ112445.1_Panax_trifoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#KM036297.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#KT380920.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#JX680330.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#AY233325.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [396]
#DQ007383.1_Polyscias_javanica ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... T.. ... ... ... [396]
#KT380922.1_Panax_vietnamensis CTG CCT GGG CGT CAC GCA TCG CGT CGC CCC C-C AAC TCA TCA CTC CCT CAC GGG AGT CGA GGC GGA GGG GCG GAT AAT GGC CTC CCG TGT CTC ACC GCG [495]
#MH238445_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... .T. [495]
#KM207670.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ... C.. ... ... ... TG. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
41
#KT380921.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ... C.. ... T.. ... .G. ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#KM887432.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ... C.. ... ... ... TG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#HQ112445.1_Panax_trifoliatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. .G. C.C G.. ... ... ... C.. ... ..G ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ..C ..A ... ... [495]
#KM036297.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ... C.. ... ... .T. TG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#KT380920.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ... C.G ... ... ... TG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#JX680330.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ... C.C G.. ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... [495]
#AY233325.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ... C.. ... ... ... TG. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [495]
#DQ007383.1_Polyscias_javanica ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... C.C G.. T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... [495]
#KT380922.1_Panax_vietnamensis CGG TTG GCC CAA ATG CGA GTC CTT GGC GAT GGA CGT CAC GAC AAG TGG TGG TTG TAA AAA GCC CTC TTC TCA TGT CGT GCG GTG ACC CGT CGC CAG CAA [594]
#MH238445_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#KM207670.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#KT380921.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#KM887432.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#HQ112445.1_Panax_trifoliatus ... C.. ... ... ... ... ... ..C ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... .G. ... [594]
#KM036297.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#KT380920.1_Panax_japonicus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [594]
#JX680330.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A .G. [594]
#AY233325.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... [594]
#DQ007383.1_Polyscias_javanica ... ... ... ... ... T.. ... A.. ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..T .G. ..T ... ... ... ..C ... ... ... ..A ... ... ..T .T. ... [594]
#KT380922.1_Panax_vietnamensis AAG CTC TCA TGA CCC TGT TGC GCC GTC CTC GAT GCG CGC TCC GAC CGC GAC CCC AGG TCA GGC GGG ACT ACC CGC TGA GTT TAA [678]
#MH238445_Panax_vietnamensis_var._fuscidiscus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#KM207670.1_Panax_ginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#KT380921.1_Panax_notoginseng ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#KM887432.1_Panax_pseudoginseng ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#HQ112445.1_Panax_trifoliatus .G. ... ... C.. ... ... ... ... ... .C. ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#KM036297.1_Panax_quinquefolius ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#KT380920.1_Panax_japonicus .G. ... ... A.. ... ... ... ... ..A ..A ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#JX680330.1_Panax_stipuleanatus ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... A.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#AY233325.1_Panax_japonicus_var._bipinnatifidus ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [678]
#DQ007383.1_Polyscias_javanica ... ... ..G C.. ... .TC ... ... ... ..G C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- [678]
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài
Panax trên ngân hàng gen
Trong 5 chỉ thị nghiên cứu này được dùng làm mã vạch phân tử sử dụng
phân loại chi Nhân Sâm, có thể thấy vùng gen ITS là chỉ thị cho ta thấy
nhiều đa hình đơn nucleotide hơn cả và có thể dùng để xác định loài và phân
42
loại nhóm cho chi Nhân Sâm ( Zhu et al., 2003; Zuo et al., 2011)[52]; [53].
6 1
6 0
7 0
1 9 5
1 4 6
1 1 3
8 5
1 3 1
1 1 0
9 8
7 3
7 1
1 2 9
1 0 1
1 3 6
6 4
1 1 1
8 8
9 6
1 4 4
2 0 1
1 4 5
1 4 3
2 0 3
2 4 3
2 4 5
2 6 3
2 7 9
1 3 7
2 0 4
2 7 8
2 3 3
3 1 3 3 3 1 2 9 T C A A A T T C G C A T T G A A C G T T G C T C C T C G A T A G G C G
1 P. vietnamensis P.vietnamensis var. fuscidiscus
. . . .
. . . .
. . . .
. . . A . A . A
. . G . . . . G . C A G . G . . . G T C . . G . . . G . . . G .
. . . C . . . C . . . . C T . . C . . C . A . C C . . . C . . C . . C . A . C C
. . . . . . . . . . . . . T G . T . . . . C G G . C . . . . . . T . C . . . . . .
. . . A
. . .
. . . A . . . A . . . A . A T A
. . . . . . . . C C . . . . . .
. . . . . . . A . . C . . . . . T C T . . . . . . . . . . T T C
. G . . . . . . . T . . . . . A A A T . . . . C . . .
. A . A . A G
. . A . . . . . . . . . . . .
. . .
. . . . . . . . C G . . . . . .
. . . . . . T .
2 3 P.ginseng 4 P. notoginseng 5 P. pseudoginseng 6 P. trifoliatus 7 P. quinquefolius 8 P. japonicus 9 P. stipuleanatus P. japonicus var. bipinnatifidus
10
.
. G
.
C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. A
.
.
.
.
.
.
.
.
. A
.
.
.
.
.
.
.
4 3 1
4 1 2
5 3 8
5 9 3
5 9 1
5 9 0
4 9 9
4 4 6
4 5 7
4 8 6
4 3 3
4 9 4
4 8 9
4 4 5
4 4 8
4 8 7
4 5 6
4 4 7
4 3 5
4 4 3
4 3 9
4 5 4
4 7 3
4 3 6
6 2 3
6 2 1
5 5 1
5 9 6
5 7 7
5 6 8
6 0 4
6 1 8
5 2 5
5 1 9
6 3 2 4 9 3 C G A T A T C C C A C G C A G A T C C C T T T A A T G A G A A T C C T C
1 P. vietnamensis P.vietnamensis var. fuscidiscus
2 3 P.ginseng 4 P. notoginseng
. A . . . T
. . .
. C C
. . .
. . .
. . T
. . .
. . T G . G
. . .
. . .
. T .
. . .
. . T
. . .
. . .
T . .
. . .
T . .
. . .
. . .
. . .
. . .
. . T
. . .
. . .
. . .
. . .
. . .
. . .
. . .
. . T
. . .
. . .
. T .
P. pseudoginseng
.
.
.
.
. . . . .
. . C . G C C G . . C . C G . . C C G .
. . .
T G . . . . T T G T G . . . .
. . . C . . . . . T
. . . G . . . . . .
. . C C . . . . . T
. . . A . . . . . .
. . . . . C C C . . . . . . . . . C T .
. . .
. . . A . . . . . .
. . . . . G . . . . . . . A G .
. . . . G C . . . . G A . .
. . . . . . . A T .
. C . . .
. . T . .
. . . . .
. . . . .
5 6 P. trifoliatus 7 P. quinquefolius 8 P. japonicus 9 P. stipuleanatus P. japonicus var. bipinnatifidus
10
.
.
.
C
.
.
.
T G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
43
Bảng 3.5. Kết quả so sánh các Nu sai khác trên gen ITS giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax
Giá trị khoảng cách di truyền của sâm ngọc linh với một số loài
Panax khác dựa trên kết quả phân tích vùng gen ITS; rbcL; 18S; rpoB
được thể hiện ở bảng 3.6; bảng 3.7; bảng 3.8; bảng 3.9.
Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía
trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
P. vietnamensis
0.000
2
P. vietnamensis var. fuscidiscus
0,011
3
P. japonicus
0,012 0,004
P. japonicus var.
4
bipinnatifidus
0,011 0,003 0,001
5
P. notoginseng
0,014 0,003 0,002 0,001
6
P. pseudoginseng 0,016 0,005 0,003 0,004 0,005
7
P. quinquefolius
0,018 0,005 0,003 0,002 0,003 0,006
8
P. ginseng
0,018 0,004 0,003 0,004 0,007 0,001
9
P. stipuleanatus
0,014 0,009 0,006 0,005 0,006 0,010 0,005 0,006
10 P. trifoliatus
0,028 0,010 0,007 0,006 0,007 0,011 0,009 0,010
0,007
Polyscias javanica
11
0,649 0,641 0,639 0,639 0,641 0,636 0,642 0,642
0,645
0,651
sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax.
Bảng 3.7. Khoảng cách di truyền gen rpoB giữa loài sâm ngọc linh
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 P. vietnamensis
0.000
P.vietnamensis
2
var. fuscidiscus
0.004
3 P.ginseng
0.012 0.008
44
( phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax
P.japonicus
4
var. bipinnatifidus 0.012 0.008 0.000
5 P.notoginseng
0.012 0.008 0.000 0.000
6 P.pseudoginseng
0.013 0.014 0.006 0.006 0.006
7 P.trifoliatus
0.013 0.014 0.006 0.006 0.006 0.004
8 P.quinquefolius
0.014 0.010 0.002 0.002 0.002 0.004 0.004
9 P.japonicus
0.012 0.008 0.000 0.000 0.000 0.006 0.006 0.002
10 P.stipuleanatus
0.013 0.016 0.008 0.008 0.008 0.006 0.006 0.006 0.008
11 Hedera hibernica
0.984 0.978 0.955 0.955 0.955 0.966 0.951 0.963 0.955 0.969
Bảng 3.8. Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa loài sâm ngọc linh
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 P.vietnamensis
0.000
P.vietnamensis
0.013
2
var. fuscidiscus
3 P.ginseng
0.018
0.020
4 P.quinquefolius
0.015
0.017
0.006
0.024
5 P.notoginseng
0.027
0.029
0.027
6 P.pseudoginseng
0.015
0.017
0.009
0.006
0.024
7 P.japonicus
0.027
0.029
0.021
0.018
0.037
0.023
P.japonicus
0.014
0.018
0.010
0.007
0.026
0.012
var. bipinnatifidus
8
9 P.stipuleanatus
0.038
0.040
0.037
0.035
0.048
0.042
0.035
10 P.trifoliatus
0.061
0.063
0.063
0.061
0.068
0.066
0.060
0.060
0.078
0.080
0.076
0.075
0.080
0.083
0.075
0.078
0.079
Polyscias javanica
11
45
(phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax
Bảng 3.9. Khoảng cách di truyền mồi 18S giữa loài sâm ngọc linh
(phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên
1
2
3
4
5
6
7
8
1 P.vietnamensis
0.000
P.vietnamensis
2
var. fuscidiscus
0.000 0.000
P.japonicus
3
var. bipinnatifidus 0.002 0.002 0.002
4 P quinquefolius
0.000 0.000 0.000 0.000
5 P ginseng
0.005 0.005 0.005 0.005
0.005
6 P japonicus
0.002 0.002 0.002 0.002
0.002 0.000
7
P notoginseng
0.002 0.002 0.002 0.002
0.002 0.004 0.002
Eleutherococcus
8
sessiliflorus
0.005 0.005 0.005 0.005
0.005 0.005 0.005 0.009
phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax.
Kết quả cho thấy, chỉ số biến thiên của vùng gen ITS là cao nhất
(dao động trong khoảng từ 0,000 - 0,061, thấp nhất là vùng gen 18S
(dao động trong khoảng 0,00 - 0,002). Sự khác nhau giữa các cặp loài
trên cơ sở phân tích theo mô hình Kimura 2 thông số của đoạn gen rbcL
cũng đã chỉ ra mức độ sai khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh với
sâm lai châu là 1%; với nhân sâm (Panax ginseng) là 1,4%; với sâm mỹ
(Panax quinquefolius) là 1,3%. Vùng gen nhân ITS chứa nhiều ví trị
biến đổi và thể hiện khả năng phân biệt khá tốt ở cấp độ dưới loài. Cụ
46
thể, tỷ số khoảng cách di truyền giữa sâm ngọc linh khi so sánh với một
số loài Panax khác dựa trên trình tự gen ITS đã cho khoảng cách di
truyền với sâm lai châu là 1,2%, với tam thất hoang là 3,8 %; với
Panax trifoliatus là 6,1 %; đối với sâm mỹ là 2,7 %; với giả nhân sâm
là 1,5%. (Bảng 5 -Phụ lục). Tiếp theo đối với đoạn gen rpoB, mức độ
sai khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh với sâm lai châu là 0,4 %;
với Panax ginseng là 1,2 %; với sâm mỹ (Panax quinquefolius) là 1,4%
(Bảng 4 -Phụ lục). Với gen 18S, không phát hiện sai khác giữa sâm
ngọc linh và sâm lai châu. Mức độ sai khác di truyền giữa sâm ngọc
linh với Panax ginseng trên cơ sở phân tích gen 18S là 0,5 %.
Như vậy, có thể thấy hai vùng gen ITS và rbcL có khả năng phân
loại tốt nhất cho các loài của chi Panax. Kết quả này cũng phù hợp với
các nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Trang và cộng sự (2011) [22],
Phạm Quang Tuyến và cộng sự (2018) [23], Zuo el at., (2011) [52].
3.6. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với
một số loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen
rbcL, ITS - sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng.
Trong số 4 vùng gen nghiên cứu thì hai vùng gen ITS và rbcL đã
chứng minh là có khả năng phân loại tốt hơn cho các loài của chi
Panax. Hai vùng gen này sau đó được chúng tôi sử dụng để xây dựng
mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với các loài Panax. Sơ đồ hình
cây (phương pháp Neighbor Joining) mối quan hệ di truyền của sâm
ngọc linh với một số loài Panax khác dựa trên kết quả phân tích trình tự
47
vùng gen rbcL và vùng gen ITS được thể hiện ở hình 3.6a và 3.6b
Hình 3.10a. Mối quan hệ di Hình 3.10b. Mối quan hệ di truyền của
truyền của một số loài trong chi một số loài trong chi Panax dựa trên
Panax dựa trên phân tích trình phân tích trình tự vùng gen rbcL
tự vùng gen ITS
Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc
linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng
gen ITS và rbcL
Kết quả phân tích cuả chúng tôi cho thấy vùng ITS và vùng gen
rbcL cho kết quả tương đối giống nhau, tuy nhiên giá trị bootstrap ở sơ
đồ hình cây dựa trên phân tích vùng gen ITS cho giá trị cao hơn, chứng
tỏ các kết quả dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS có độ tin cậy
cao hơn. Tuy nhiên kết quả PCR khuếch đại gen ITS so với các vùng
gen còn lại có hệ số không cao, cụ thể tỷ lệ nhân gen và đọc trình tự
thành công ở gen ITS chỉ là 89% so với vùng gen rbcL là 99% và vùng
48
gen rpoB là 95%. Lý do được đưa ra có thể đây là vùng gen nhân, tỷ lệ
tách chiết DNA ở vùng nhân thường cho chất lượng không tốt bằng so
với DNA được tách từ tế bào chất (lục lạp).
Hiện nay, do nhu cầu sử dụng thuốc bào chế từ dược liệu là rất lớn
cộng việc sự khai thác một cách không hiệu quả dẫn tới nguồn Sâm
ngọc linh tự nhiên đang bị giảm sút nguyên trọng và gần như cạn kiệt
nên việc trà trộn làm giả Sâm ngọc linh hay các sản phẩm của sâm
ngọc linh. Vì vậy, việc cần thiết xây dựng giống gốc cây sâm ngọc linh
có sức chống chịu tốt, sinh trưởng nhanh, năng suất cao phục vụ cho
việc nhân giống, bảo tồn. Do đó, câu hỏi đặt ra ở đây là làm thế nào để
phân biệt sâm ngọc linh là giả hay thật hay việc phân biệt Sâm ngọc
linh với các loài sâm khác thuộc chi Nhân Sâm trên thế giới và Việt
Nam. Để trả lời câu hỏi này, xây dựng bộ chỉ thị phân tử DNA dựa trên
giải trình tự hệ gen gồm gen lục lạp và gen nhân sẽ được sử dụng trong
nghiên cứu di truyền phân tử và xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu nhằm
phân biệt sâm ngọc linh phục vụ nhu cầu sản xuất và đảm bảo nhu cầu
tiêu dùng của con người. Từ đó có thể đưa ra các biện pháp để quản lý
và khai thác loài sâm ngọc linh một cách hợp lý và bền vững. Cụ thể là
việc dùng chỉ thị phân tử giúp cho phân loại chính xác sâm ngọc linh
giúp việc đưa ra các biện pháp kiểm soát tình trạng Sâm ngọc linh giả
trên thị trường, giúp cho việc tỉnh Quảng Nam có biện pháp phát triển
vùng trồng, ngăn chặn việc khai thác buôn lậu sâm ngọc linh. Mặt khác,
số lượng cá thể sâm ngọc linh đang bị suy giảm nghiêm trọng do nhu
cầu sử dụng được liệu làm thuốc, bồi bổ cơ thể của con người trên thể
giới là rất lớn nhưng việc bất cập trong khâu bào chế sâm ngọc linh còn
thiếu và yếu ( chưa đạt yêu cầu tiêu chuẩn theo khuyến cáo của Tổ chức
Y tế thế giới). Trong khi việc trồng vườn ươm sinh trưởng khá chậm
nên đây là việc giúp các nhà nghiên cứu quy hoạch phát triển sâm ngọc
49
linh theo hướng nhân rộng đại trả để đáp ứng số lượng nguyên liệu
phục vụ nhu cầu người tiêu dùng. Một trong những nội dung chính để
xây dựng một quy trình kỹ thuật đạt chuẩn quốc tế cho việc phân loại
và kiểm định Sâm ngọc linh ở mức độ phân tử chính là việc thiết kế bộ
chỉ thị phân tử.
Việc trà trộn và làm giả sâm ngọc linh đang ngày càng gia tăng đến
mức đáng báo động, do vậy việc phát triển chỉ thị để giám định nhanh
và chính xác loài sâm ngọc linh là cần thiết. Trong nghiên cứu này của
chúng tôi, với 4 vùng gen được thực hiện thì 2 vùng gen ITS và rbcL
cho kết quả tương đối tốt, có thể sử dụng để đánh giá, phân loại các sản
phẩm sâm ngọc linh ở cấp độ loài và dưới loài.
3.7. Kết quả so sánh khả năng phân loại sâm ngọc linh đối với các loài
chi Panax khác của ba vùng gen nghiên cứu.
Do vùng gen 18S không đặc hiệu cho loài sâm ngọc linh nên chúng
tôi chỉ sử dụng 3 vùng gen gồm ITS, rbcL, rpoB để so sánh khả năng
phân loại các loài Panax.
Trình tự 3 vùng gen ITS, rbcL và rpoB được ghép nối thành một
đoạn gen dài 2473 bp (hình 3.7). Đoạn tổ hợp gen này được dùng để
kiểm tra và so sánh khả năng phân loại với các vùng gen riêng lẻ.
50
Hình 3.11. Thứ tự ghép nối các đoạn gen nghiên cứu
Đoạn DNA dài 2473 bp của sâm ngọc linh sau đó được tiến hành so
sánh kiểm tra sự sai khác bằng phần mềm MEGA 7.0. Khoảng cách di
truyền của sâm ngọc linh với 8 loài Panax khác được thể hiện ở Bảng 3.2.
Khoảng cách di truyền của sâm ngọc linh so với các loài Sâm
khác thuộc chi Panax ta thấy trong ba vùng gen gồm gen lục lạp là
rbcL; rpoB và gen nhân là ITS đều là các vùng gen đã được chứng
minh là hiệu quả cho việc phân loại ở cấp độ loài [29]. Riêng chỉ thị
18S đã được Komatsu và đồng tác giả (2001) đã giải trình tự các gen
18S và matK nhằm nghiên cứu so sánh đặc điểm di truyền giữa sâm
ngọc linh (Panax vietnamensi) và Sâm mỹ (Panax quinquefolius) cho
thấy 18S là vùng gen bảo thủ nên khả năng phân loại giữa các loài chi
Panax không cao. Các nghiên cứu của Zhu et al., 2003 và Zuo et al.,
2011 hay của Nguyen Thi Phuong Trang và cộng sự đã đưa ra các mã
vạch phân tử được sử dụng để phân loại loài và phân loại nhóm của loài
Sâm ngọc linh với các loài sâm khác thuộc chi Nhân Sâm như gen lục
lạp và gen nhân bao gồm rbcL; rpoB; rpoC; matK; trnH-psbA; trnL-
trnF; ITS;….. Từ bảng khoảng cách đa dạng di truyền ta thấy ở Sâm
ngọc linh (Panax vietnamensis ) so với Sâm lai châu (Panax
vietnamensis ) chỉ thi rpoB; rbcL; ITS; rpoB+ rbcL ; rbcL+ ITS; rpoB+
ITS; rpoB+ITS + rbcL lần lượt là 0.004 (0,4%); 0.012 (1,2%);
0,01(1%); 0,01(1%); 1,1%. Tiếp theo, khoảng cách đa dạng di truyền
của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis ) so với Sâm nga (P.ginseng )
là 1,2%; 1,4%; 1,8%; 1,6%; 1,8%; 1,6%; 1,7%. Khoảng cách đa dạng di
truyền của Sâm ngọc linh Panax vietnamensis ) so với Nhân Sâm
(P.quinquefolius) chỉ thị rpoB; rbcL; ITS; rpoB+ rbcL ; rbcL+ ITS;
rpoB+ ITS; rpoB+ITS + rbcL lần lượt là 1,4%; 1,3%; 1,5%; 1,6%;
1,5%; 1,5% và 1,6 %. Sự kết hợp 4 chỉ thị rbcL và rpoB; ITS cho kết
51
quả vùng trình tự ITS cho kết quả độ tin cao nhất, tiếp đến vùng gen
rbcLa và rpoB. Vùng gen ITS của Sâm ngọc linh cho thấy nhiều đa
hình đơn nucleotide hơn cả và có thể dùng để xác định loài và phân
loại nhóm giữa loài Sâm ngọc linh với các loài sâm thuộc chi Nhân
Sâm. Còn vùng gen rbcL; rpoB phục vụ cho phân biệt sâm ngọc linh ở
cấp độ loài. Kết quả so sánh phân loại của từng vùng gen và sựa kết
hợp cặp đôi của chúng cho thấy hai vùng gen rpoB và rbcL có khả năng
phân loại tốt. Cả hai vùng gen này đều chỉ ra được sự sai khác
nucleotide giữa các loài, tuy nhiên với kích thước 700bp và hiệu suất
PCR là 100%, vùng gen ITS đã chứng tỏ là hữu hiệu hơn so với vùng
gen rbcL dài 700bp và hiệu suất PCR là 85,7%. Kết quả này cũng phù
hợp với nhóm nghiên cứi barcoding trên chi Nhân Sâm của Zuo el at.,
(2011) sau khi nghiên cứu các vùng gen lục lạp và gen nhân đã chỉ ra
rằng vùng gen ITS là vùng gen có mức độ đa dạng di truyền cao nhất,
có khả năng phân biệt loài 87,5 % và dưới loài đến 84,21 %. Sự kết hợp
ba chỉ thị rbcL; ITS; rpoB thành 4 cặp là rpoB+ rbcL ; rbcL+ ITS;
rpoB+ ITS; rpoB+ITS + rbcL cho ta thấy khoảng cách di truyền của
sâm ngọc linh (Panax vietnamensis ) so với sâm lai châu (Panax
vietnamensis ) lần lượt là1,1%; 1%; 0.8%; 1,1%; sâm ngọc linh (Panax
vietnamensis ) so với sâm nga (P.ginseng ) lần lượt là 1,6%; 1,8%;
1,6%; 1,7%. Từ kết quả bảng 3.2 và sự kết hợp của 4 chỉ thị (rbcLa+
rbcLc+ rpoB+ITS) cho kết quả về khoảng cách di truyền giữa Sâm
ngọc linh và 09 loài sâm khác thuộc chi Nhân Sâm là tốt nhất. Khoảng
cách đa dạng di truyền giữa sâm ngọc linh và sâm lai châu là 1,1 %;
giữa sâm ngọc linh (P. vietnamensis ) so với sâm nga (P.ginseng ) là
1,7 %; giữa P. vietnamensis với P.notoginseng là 2%; giữa P.
vietnamensis với P.pseudoginseng là 1,9 %; giữa P. vietnamensis với
P.trifoliatus là 3,6%; giữa P. vietnamensis với P.quinquefolius là
52
1,6%. (Bảng 3.10)
Bảng 3.10: Khoảng cách di truyền của sâm ngọc linh so với 8 loài Panax khác được tính toán dựa trên trình tự riêng lẻ và kết hợp đôi một của các vùng gen nghiên cứu
rpoB
rbcL
ITS
rpoB+ rbcL
rbcL+ ITS
rpoB+ ITS
rpoB+ ITS+ rbcL
1 P. vietnamensis
2
0,004 0,011 0,013 0,011
0,010
0,008
0,011
P.vietnamensis var. fuscidiscus
3 P.ginseng 0,012 0,018 0,018 0,016 0,012 0,014 0,027 0,014 4 P.notoginseng 5 P.pseudoginseng 0,013 0,016 0,016 0,018 0,013 0,028 0,012 0,021 6 P.trifoliatus 0,014 0,018 0,014 0,016 7 P.quinquefolius 0,012 0,009 0,015 0,014 8 P.japonicus 0,013 0,014 0,038 0,021 9 P.stipuleanatus
0,016 0,021 0,017 0,028 0,015 0,021 0,021
0,018 0,027 0,015 0,061 0,015 0,027 0,038
0,017 0,018 0,019 0,021 0,016 0,020 0,028 Kết quả đánh giá khả năng phân loại của 3 vùng gen nghiên cứu cũng như sự kết hợp của chúng được tính toán trên excel, được thể hiện ở hình 3.8.
53
Hình 3.12. Kết quả so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa trên so sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng.
Kết quả cho thấy sự kết hợp giữa hai vùng gen rbcL và ITS đã thể hiện
khả năng phân loại tốt nhất cho 9 loài Panax (hình 3.8).
Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 9 loài Panax dựa trên
sự kết hợp của 2 vùng gen này cũng cho kết quả thấy rõ vị trí phân loại của
sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) là cùng nhóm với sâm
lai châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) và hoàn toàn tách nhóm
riêng so với các loài nhân sâm (Panax ginseng), sâm mỹ (Panax
quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng), nhân sâm nhật bản (Panax
japonicus)…, hệ số bootstrap cũng cao hơn hẳn so với khi sử dụng riêng lẻ
một gen (hình 3.9).
Hình 3.13. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài thuộc chi Panax
54
phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS.
Chỉ thị phân tử (DNA barcoding) là công cụ công nghệ sinh học
chính xác, đáng tin cậy và đã được sử dụng rất nhiều trong phân loại các
loài động thực vật. Việc sử dụng một hay kết hợp nhiều chỉ thị phân tử
để phân loại đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và tiến
hành nghiên cứu [39]; [48]; [29].
Trong nghiên cứu này của chúng tôi đã chứng minh gen ITS là gen
nhân có khả năng phân biệt tốt ở cấp độ loài và dưới loài đối với các loài
thuộc chi Panax, gen rbcL cũng chứng minh khả năng phân biệt tốt ở
cấp độ loài, đặc biệt sự kết hợp giữa 2 vùng gen rbcL và ITS đã chứng
minh tính chính xác và tin cây cao trong việc phân loại các loài của chi
Panax.
3.8. Kết quả đăng ký mã số các vùng gen nghiên cứu trên ngân hàng
gen
Trình tự nucleotide các gen rpoB, rbcLa; rbcLc, ITS và 18S của sâm
ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được đăng ký trên
Genbank với số hiệu lần lượt là KT154686; KT154685; KT154683;
55
MH238443; KT154684.
KẾT LUẬN
1/ Bốn cặp mồi SSR gồm PG - 29; PG - 668; PG - 1419 và PG - 1481 của
sâm hàn quốc là đặc hiệu và sử dụng được cho sâm ngọc linh của Việt
Nam.
2/ Hai quần thể sâm giống tại Quảng Nam và Kon Tum đều đang duy trì
được tính đa dạng di truyền tương đối ổn định, hiện tượng tự thụ phấn chưa
ảnh hưởng đến cấu trúc di truyền của quần thể, phát hiện có sự có mặt của
các alen hiếm, đặc biệt trong quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam.
Cần có những biện pháp bảo tồn để duy trì tính được đa dạng cũng như bảo
vệ được những alen hiếm của quần thể.
3/ Vùng gen nhân ITS và vùng gen lục lạp rbcL là hai vùng gen có khả
năng phân loại tốt với các loài Panax, đặc biệt sự kết hợp của hai vùng gen
56
này cho kết quả tốt và đáng tin cậy.
KIẾN NGHỊ
1. Cần thu thập thêm mẫu và có thêm nghiên cứu về các quần thể khác của
sâm ngọc linh để có một cái nhìn toàn diện hơn về thực trạng di truyền
quần thể của loài sâm ngọc linh của Việt Nam.
2. Hiện nay đã phát hiện được thêm hai mẫu được cho là phân loài của sâm
ngọc linh gồm sâm Nghệ An (puxailaileng) và sâm Lâm Đồng
(langbianesis), do vậy cần thu được mẫu này và kiểm tra khả năng phân loại
57
các mẫu này của các chỉ thị phân tử nói trên.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
VĂN CỦA TÁC GIẢ
1. Nguyen T. P. Trang, Nguyen T. H. Mai, Yuri N.Zhuravlev (2017).
‘‘Application of DNA Barcoding to Authentic Panax Vietnamensis’’;
American Scientific Research Journal for Engineering, Technology, and
Sciences (ASRJETS). 29(1). 2313-4402.
2. Nguyễn Thị Phương Trang, Nguyễn Thị Hồng Mai, Zhuravlev Yury N,
Reunova Galina (2017). ‘‘Giải mã trình tự gen rbcL, rpoB của sâm lai
châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S. Q.
Cai) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv .)’’. Tạp chí
58
sinh học 39(1) 15-23.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Bộ khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007), Sách Đỏ Việt Nam. Phần II. Thực vật (2007), Nxb Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
2. Bộ y tế (2003), Hội thảo Bảo tồn và phát triển cây sâm Việt Nam, Tam Kì - Quảng Nam.
3. Đỗ Tất lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr. 808 – 810.
4. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải (2003), Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, tr. 256-260, Nxb KH&KT, Hà Nội.
5. Nguyễn Tiến Bân - Chủ biên (2003), “ Danh lục các loài thực vật Việt Nam”, tập 2, tr. 1078-1079, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 2, tr.425-426, NXB Y học
7. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2008), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội
8. Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh, Vũ Tiến Chính, Phan Kế Long, Hoàng Lê Tuấn Anh, (2017). Chi Sâm-Panax L (họ Ngũ Gia Bì-Araliaceae) ở Việt Nam, Hội nghị toàn quốc về Sinh thái và tài nguyên Sinh vật năm 2017, tr: 106-111. 9. Nguyễn Minh Đức và cộng sự (1973), Nghiên cứu về kháng sinh thảo mộc. Một số đề tài nghiên cứu về đông y, Nxb Y học, Hà Nội.
10. Lê Thị Thu Hiền, Hugo de Boer, Nông Văn Hải, Lê Thanh Hương, Nguyễn Mai Hương, Lars Bjork (2012) “ Mã vạch phân tử DNA và hệ thống dự liệu mã vạch sự sống”. Tạp chí Công nghệ sinh học, 10(3): 393-405.
11. Nguyễn Thị Thu Hương, (2003). “Kết quả nghiên cứu về tác dụng dược lý Sâm Việt Nam”. Hội thảo bảo tồn và phát triển cây Sâm Việt Nam, Tam Kỳ, tr. 76-90.
59
12.Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang (1991), “Sơ lược quá trình phát hiện cây sâm đốt trúc ở vùng núi Ngọc Linh (Kon Tum)”, Tập bài viết về lịch sử ngành Dược khu 5 và tỉnh Quảng Nam - Đà Nẵng, Liên chi hội Dược học tỉnh Quảng Nam – Đà
Nẵng xuất bản, tr. 138-146.
13. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thị Mai Linh, Lê Thanh Sơn, 2014. “Mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng matK và ITS –rDNA”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(2): 327-337.
14.Trần Công Luận (2003), “Kết quả nghiên cứu về hoá học sâm Việt Nam 1978 – 2002”, Hội thảo bảo tồn và phát triển cây sâm Việt Nam, Tam Kỳ, tr. 62-75. 15. Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hương (2013) “Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) Nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam”. Hội nghị khoa học toàn quốc về Sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 1152-1158.
16. Nguyễn Thới Nhâm, Phan Văn Đệ, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (1993), “Sâm Việt Nam-Kết quả nghiên cứu từ 1978-1992” - Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học cấp Nhà nước thuộc chương trình 64C, chủ biên: Trung Tâm Sâm Việt Nam-Bộ Y tế 1-97.
17. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Thanh Trăng, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Yăn Phượng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân của loài Mỡ Hải Nam (Manglietỉa hainanensis Dandy) bằng chỉ thị RAPD và cpSSR”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 2, tr. 918-925.
18.Dương Tấn Nhựt, 2010, Nghiên cứu nhân giống vô tính và sản xuất sinh khối rễ cây Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.), Phân viện Sinh học Đà Lạt 19. Dương Tấn Nhựt, 2011. Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu chương trình phát sinh hình thái và bảo tồn cây Sâm ngọc linh, (đề tài Quỹ phát triển khoa học và Công nghệ Quốc Gia). 20. Khuất Hữu Thanh (2005), Kỹ thuật gen -Nguyên lý và ứng dụng, tr. 36-40 NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
60
21. Nguyễn Tập (2005), “Các loài chi Panax L. ở Việt Nam ”, Tạp chi Dược liệu, 10(3),71-76.29
22. Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Giang Sơn, Phan Kế Long, 2011. Phát hiện về một loài sâm mới Panax sp. (Araliaceae) ở Việt Nam. Tạp chí Dược học, 10: 59-63.
23. Phạm Quang Tuyến, và cộng sự (2018). “Đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu giống sâm thu thập tại Lai Châu”, Tạp chí Khoa học và công nghệ Việt Nam 60(2) 2.2018.
24 Lê Minh Thảo, 2014, Xây dựng chỉ dẫn địa lý “Ngọc Linh” cho sản phẩm Sâm củ của hai tỉnh Quảng Nam và Kontum, Trung tâm ứng dụng và Thông tin KHCN tỉnh Quảng Nam. 25. Lê Thanh Sơn và Nguyễn tập (2006), “Những đặc điểm sinh thái cơ bản của sâm ngọc linh”, Tạp chí Dược liệu, 14 (4), 145-147.
Tài liệu Tiếng Anh
26.Avise CJ (1992), Molecular population structure and the biogeographic history of regional fauna: a case history with lessons for conservation biology. Oikos No. 63: pp: 62-76.
27. Bahulikar R. A., Lagn M. D., Kulkarrnu B. G., Pandit S. S., Suresh H. S., Rao M. K. V., Ranjekar P. K., Gupta V. S. (2004), “Genetic diversity among spatially isolated populations of Eurya nitida Korth (Theaceae) based on inter-single sequence repeats“, Current Science, 86(6): 824-831.
28. Cascante A., Quesada M., Lobo J. J.,Fuchs E. A.(2002), “Effects of dry tropical forest fragmentation on the reproductive success and genetic structure of the tree Samanea saman“, Journal of Society of Conservation Biology, pp. 137-147.
29. CBOL (2009), Plant Working Group, DNA barcode for land plants, PNAS 106(31), 12794-97.
61
30. Choi I.J., Kim H., Kim N.H., Choi B.S., Ahn I.O., Lee J.S., and Yang T.K., 2011. Development of reproducible EST-derived SSR markers and assessment of genetic diversity in Panax ginseng cultivars and related species. Journal of Ginseng
reseach, vol.35 399-412.
31.Chen X, Liao B, Song J, Pang X, Han J, Chen S (2013) A fast SNP identification and analysis of intraspecific variation in the medicinal Panax species based on DNA barcoding. Gene 530(1): 39-43.
32.Doyle J. J. and Doyle J. L. (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small qualities of fresh leaf material”. Phytochemical Bull. 19: 11-15.
33.Godt M. J. W., Johnson B. R., Hamrick J. L. (1996), “Genetic diversity and population for multiple size of four southern Appalachian plant specie“. Cons. Biol., 10: 796-805.
34. Galina D. Reunova, I.L.Kat, T.I.Muzarok, T.T.P.Nguyen, T.T.Dang, E.V.Brenner and Yu.N.Zhuravlev, (2011). Diversity of Microsatellite loci in the Panax vietnamensis Ha & Grushv. (Araliaceae) population. Doklady Biological Sciences, vol. 441, 408-411. 35. Galina D. Reunova, Olga G. Koren, Tamara I. Muzarok, Yury N. Zhuravlev, (2014). Microsatellite analysis of Panax ginseng natural populations in Russia. Chinese medicine, vol. 5, 231-243. 36. Ha, T. D. and Grushvitzky, I.V.,(1985). “New species in Panax (Araliaceae) in Việt Nam”, J. Botany, vol.70, pp. 518 – 522
37. Hillis DM, Moritz C & Mable BK (1996) Molecular Systematics. 2 edition. Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc.
38. Komatsu K., Zhu S., Fushimi H., Qui T.K., Cai S., Kadota S., (2001). Phylogenetic analysis based on 18S-rDNA gene and MatK gene sequences of Panax vietnamensis and five related species. Planta Med, 67 (5): 461-465 39. Kress W. J., Wurdack K. J., Zimmer E. A., Weight L. A., Janzen D. H. (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 102: 8369–8374.
62
40. Kress W. J. and Erickson D. L. (2007), “A two-locus global DNA barcodefor plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region”. PLoS-ONE 2(6):e508.
41.Keller L. F. and Waller D. M. (2002), “Inbreeding effects in wild population”, Trends in Trends in Ecology and Evolution, 11, pp. 424-429.
42. Kim J., Jo B.H., Lee K.L., Yoon e.S., Ryu G.H., Chung K.W., (2007). Identification of new microsatellite markers in Panax ginseng. Molecules and Cell, vol. 24, 60-68.
43. Komatsu K, Zhu S, Fushimi H, Qui T, Cai S, Kadota S (2001) Phytogenetic analysis based on 18S rRNA gene and matK gene sequences of Panax vietnamensis and five related species. Planta Med 67(5): 461-465.
44. Litt, M. and Luty, J.A. (1989) A Hypervariable Microsatellite Revealed by in Vitro Amplification of a Dinucleotide Repeat within the Cardiac Muscle Actin Gene. American Journal of Human Genetics, 44, 397-401.
45. Lahaye R., van der Bank M., Bogarin D., Warner J., Pupulin F., Gigot G., Maurin O., Dathoit S., Barraclough T.G., Savolainen V. (2008), “DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots”. PNAS, 105(8), 2923-2928.
46. Lee C, Wen J (2004) Phylogeny of Panax using chloroplast trnC–trnD intergenic region and the utility of trnC–trnD in interspecific studies of plants. Mol Phylogenet Evol 31: 894-903.
47. Hollingsworth PM (2008).DNA barcoding plants in biodiversity hot spots: progress and outstanding questions. Heredity (Edinb) 101(1): 1-2..
48. Lahaye R., van der Bank M., Bogarin D., Warner J., Pupulin F., Gigot G., Maurin O., Dathoit S., Barraclough T.G., Savolainen V. (2008), “DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots”. PNAS, 105(8), 2923-2928.
63
49. Nguyen Thu Huong, Matsumoto K., Kasai R., Yamasaki K., Watanable H., 1999. Effects of Vietnam ginseng on psychological stress-induced changes in pharmacological respones. Pharmacological reseach on traditional medicines, (editors: Watanable H. And Shibuya T. Harwood Academic publisher), pp. 77-92. 50. Swofford D. L. (1993), PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony, version 3.1.1. Champaign, IL: Illinois Natural History Survey.
51. Sudhir Kumar Glen Stecher Koichiro Tamura (2016), MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution, Volume 33, Issue 7, 1 July 2016, Pages 1870–1874
52. Zuo Y, Chen Z, Kondo K, Funamoto T, Wen J, Zhou S (2011) DNA barcoding of Panax species. Planta Med 77(2): 182-187.
53. Zhu S, Fushimi H, Cai S, Komatsu K (2003) Phylogenetic relationship in the genus Panax: Inferred from choloroplast trnK gene and nuclear 18S rDNA gene sequences. Planta Med 69(7): 647-653.
54. Wolfe KH, Li WH, Sharp PM (1987) Rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochrondial. Chloroplast, and nuclear DNAs. Proc Natl Acad Sci USA 84: 9054-9058.
55. Pennisi E (2007) Taxonomy. Wanted: A barcode for plants. Science 318(5848): 190-191.
56. Yurry Um, Mei Lan Jin, Ok Tae Kim, Young Chang Kim, Seong Cheol Kim, Seon Woo Cha, Ki Wha Chung, Serim Kim, Chan Moon Chung, Yi Lee, 2016. Identification of Korean Ginseng (Panax ginseng) cultivars using Simple sequence repeat markers. Plant Breed. Biotech. 4 (1): 71-78
57. https://www.ncbi.nlm.nih.gov.
.
64
58. http://www.technelysium.com.au/.ChromasPro.html.
PHỤ LỤC
65
Hình 1. Sơ đồ các peak trong giải trình tự gen rbcLa của sâm ngọc linh
66
Hình 3. Sơ đồ các peak trong giải trình tự gen rbcLc của sâm ngọc linh
Hình 5. Sơ đồ các peak trong giải trình tự gen rpoB của sâm ngọc linh
Hình 7. Mối quan hệ di truyền của một số loài trong chi Panax (phương
67
pháp Neighbor Joining) vùng gen rpoB
68
Hình 4: Sơ đồ các peak trong giải trình tự gen ITS của sâm ngọc linh
69
Hình 5. Sơ đồ các peak trong giải trình tự gen 18S của sâm ngọc linh
