1
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
****************
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TẦN SUẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM VÙNG
D – LOOP TRONG HỆ GEN TY THỂ Ở NGƯỜI VIỆT NAM
Chuyên ngành
: Sinh học thực nghiệm
Mã số
: 60 42 01 14
Người hướng dẫn khoa học
: PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN
Người thực hiện
: NGUYỄN THÙY LINH
Lớp
: Cao học K17
Hà Nội – 2015
2
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong vài năm trở lại đây, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể (ADN ty thể)
như một chỉ thị sinh học đang được phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau. Bên cạnh đó, những vấn đề về rối loạn ty thể liên quan đến bệnh ty thể, các bệnh
chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa….được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ
bản của di truyền học và y học.
Với nhiều phát minh cũng như các nghiên cứu mới về di truyền từ các thế kỷ
trước mà tiêu biểu là việc công bố trình tự hệ gen người hay còn gọi là “ trình tự tham
chiếu” (Cambridge Reference Sequencing – CRS) được Anderson và cộng sự công bố
đầu tiên vào năm 1981 và “trình tự tham chiếu sửa đổi” – rCRS (Andrew và cộng sự.
1991) đã tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà khoa học nghiên cứu sinh học mà đặc biệt
là những nghiên cứu về loài người. Sau khi có bản đồ gen người, người ta thấy rằng
các cá thể người giống nhau đến 99.9% và chỉ khác nhau rất nhỏ (0.1%) về cấu trúc hệ
gen. Trong 0.1% khác biệt giữa hai cá thể thì có đến hơn 80% là các đa hình nucleotit
đơn (Single Nucleotide Polymorphism và được viết tắt là SNP). Chính vì thế SNP
được sử dụng rộng rãi các mảng y dược học, hình sự và cung cấp những kiến thức hữu
ích trong quá trình tiến hóa loài người ở các vùng địa lý trong bối cảnh và lịch sử khác
nhau.
Việc tìm được danh sách các SNP của người Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ vào
nghiên cứu tiến hóa di truyền, đồng thời cũng cung cấp được thông tin về các đột biến
có liên quan đến các căn bệnh ung thư, rối loạn ở người. Nhận thức được tầm quan
trọng về việc tìm hiểu các dữ liệu di truyền về dân tộc Việt Nam chính vì thế trong
khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Xác định tần suất đột biến
điểm vùng D – Loop của hệ gen ty thể người Việt Nam”.
2. Mục tiêu:
- Lập được danh sách các SNP trong vùng D – Loop của AND ty thể đặc trưng
của người Việt Nam.
3. Nội dung đề tài:
- Tách chiết ADN từ các mẫu móng tay
3
- Giải trình tự gen vùng D – Loop
- Phân tích trình tự gen vùng D – Loop ở các mẫu và so sánh trình tự mẫu phân
tích với trình tự tham chiếu sửa đổi (rCRS) và tìm đặc trưng SNPs ở chủng người Việt
4
Nam.
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu chung về ty thể
Ty thể (Mitochondrion) là bào quan có thể tìm thấy trong gần như tất cả các tế
bào có nhân. Số lượng của ty thể trong mỗi tế bào ở mỗi loài là khác nhau. Ty thể là
trung tâm hô hấp của tế bào, là nơi sản sinh ra ATP một dạng năng lượng có thể sử
dụng cho các phản ứng của tế bào. Không có ty thể các tế bào sẽ phải dựa vào quá
trình đường phân kỵ khí để cung cấp tất cả adenosin triphotphat (ATP) cho hoạt động
của mình. Ty thể có hệ gen độc lập nên có khả năng tự sinh sản bằng cách phân đôi ty
thể mẹ để sinh ra các ty thể con (Alberts B, Johnson A, Lewis J và cộng sự. 2002).
Hình 1.1.
Hình 1.1. Ty thể
(Thepsychguru.com – 2012)
1.1. Cấu tạo và chức năng của ty thể
1.1.1. Cấu tạo
Ty thể là bào quan có hình tròn hoặc hình trụ dài, có kích thước đường kính 0.1
– 0.5 µm, chiều dài 1 – 2 μm. Ty thể có cấu trúc màng kép bao gồm màng ngoài (outer
membrane) và màng trong (inner membrane). Màng ngoài chứa các protein tạp kênh
lớn (gọi là porin) và cho phép tất cả các phân tử nhỏ hơn 5kDa thấm qua được. Màng
trong được cuộn gấp rất phức tạp tạo thành các cấu trúc gọi là mào hoặc răng lược
(cristate). Khác với màng ngoài, màng trong chỉ thấm chọn lọc một số ion. Vùng bề
mặt khá lớn của màng trong ty thể (intermembrane space) chứa các enzym tham gia
vào quá trình oxy hóa - photphoryl hóa và tổng hợp ATP. Phần chất nền (matrix space)
của ty thể chứa các enzym cần thiết cho sự oxy hóa pyruvat và các axit béo, các enzym
tham gia vào chu trình axit tricacboxylic (ATC) (Cooper. 2000). Khoang nền cũng 5
chứa nhiều bản sao của ADN ty thể, các ribosome của ty thể, RNA vận chuyển
(tRNA) và nhiều loại enzym cần thiết cho phiên mã và dịch mã của các gen ty thể.
Hình 1.2.
Hình 1.2. Cấu trúc ty thể
(hallcpbio.com)
1.1.2. Chức năng của ty thể
Ty thể là trung tâm giải phóng và chuyển hóa năng lượng của tế bào (photphoryl
hóa – oxy hóa). Phần lớn năng lượng được tích lũy trong các nguyên liệu hữu cơ được
giải phóng và chuyển thành dạng ATP sử dụng trong pha phân giải hiếu khí diễn ra ở
ty thể. Vì vậy ty thể được xem là “nhà máy năng lượng” của tế bào (Dahout, Gonzalez
. 2006).
Trong mỗi tế bào số lượng ty thể dao động từ 50 – 1.000. Các tế bào hoạt động
mạnh như tế bào cơ và tế bào gan có số lượng lớn ty thể. Ở nơi tế bào hoạt động nhiều
thì số vách ngăn lại tăng lên, ứng với số enzym tăng lên. Bên trong tế bào ty thể phân
bố ở nơi cần dùng nhiều năng lượng. Ví dụ trong tế bào gan, ty thể nằm chèn mạng
lưới nội chất hạt nơi cần nhiều năng lượng cho tổng hợp protein.
Tổng hợp năng lượng trong ty thể thông qua quá trình đường phân. Chỉ một phần
rất nhỏ năng lượng dự trữ của gluco được chuyển hóa (2ATP). Sự chuyển hóa
cacbohydrat được hoàn tất khi sản phẩm của quá trình đường phân (pyruvat) được
chuyển vào trong ty thể và bị oxy hóa từ O2 thành CO2, nước và 36 ATP.
Các protein liên quan trong quá trình oxy hóa – photphoryl hóa đều định vị ở
6
màng trong ty thể, bao gồm các thành phần trong chuỗi truyền điện tử (phức hệ 1 đến
4), enzym F0F1 ATP synthase. Quá trình truyền điện tử và tổng hợp ATP được tóm tắt
ở hình 1.3.
Hình 1.3. Sơ đồ tổng hợp ATP trong ty thể
Ty thể còn có khả năng tổng hợp các chất: photpholipit, axit béo và đặc biệt là
protein (protein cấu trúc và các enzym). ADN trong ty thể chịu trách nhiệm tổng hợp
phần protein ty thể.
Ty thể có khả năng di truyền độc lập đối với nhân. Tuy nhiên vẫn có sự phối hợp
giữa nhân, cơ chất của tế bào chất với cơ chất của ty thể trong quá trình biểu hiện của
gen (phiên mã và tổng hợp protein).
1.2. Đặc điểm của ADN ty thể người và ứng dụng trong nghiên cứu
Ty thể đóng vai trò quan trọng đối với sự tiến hóa của động vật. Những nghiên
cứu phổ biến hiện nay đối với di truyền ở người là trên ADN ty thể (mitochondrial
DNA – ADN ty thể). Mặc dù bộ gen ty thể người chỉ bằng 0.0005% so với toàn bộ
kích thước bộ gen trong nhân nhưng các SNP được tìm thấy trong gen ty thể có liên
quan đến nhiều bệnh chuyển hóa, rối loạn cũng như các đặc trưng ở người và đặc biệt
là các SNP ở vùng D – Loop.
1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ty thể người
Hệ gen ty thể người có chiều dài khoảng 16.569 bp, là một phân tử mạch vòng
kín nằm trong chất nền ty thể và có hàng ngàn bản sao trong một tế bào. Phân tử ADN
ty thể có hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotit:
7
Chuỗi nặng có chứa nhiều Guanin (H – strand), mã hóa cho 28 gen.
Chuỗi nhẹ chứa nhiều Cytosin (L – strand), mã hóa cho 9 gen trong tổng số 37
gen của hệ gen ty thể.
Trong 37 gen này có 13 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ
thống photphoryl hóa – oxy hóa, bao gồm 7 tiểu đơn vị của phức hệ I (complex I), một
tiểu đơn vị của phức hệ III (complex III), 3 tiểu đơn vị cửa phức hệ VI (complex VI)
và hai tiểu đơn vị của phức hệ V (complex V). Số gen còn lại mã hóa cho 22 tRNA, 2
rRNA (12S và 16S) phục vụ quá trình dịch mã của ty thể (Anderson S. 1981). Các
chuỗi polypeptit khác cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể được mã hóa bởi
gen nhân và được tổng hợp trong ribosom của tế bào chất.
Một đặc điểm đáng chú ý là hệ gen ty thể người có rất ít phần trình tự không mã
hóa. Chỉ có khoảng 7% gen ty thể người không mã hóa các protein, rRNA, tRNA
trong khi phần lớn hệ gen nhân là các vùng ADN không mã hóa (intron). Đoạn ADN ở
giữa các gen ty thể hoặc là không có hoặc là ngắn hơn 10 bp. Ở một vài gen thay vì có
mã kết thúc mRNA cần được polyadenin hóa để tạo thành mã kết thúc. Khoảng 90%
số gen ty thể không mã hóa lại nằm trong vùng điều khiển hay D – Loop. Phần lớn các
trình tự liên quan tới quá trình nhân đôi của ADN ty thể hay quá trình phiên mã đều
nằm trong hoặc gần vùng D – Loop. Đoạn D – Loop có kích thước khoảng 1.1 kb
ADN ty thể có một số vùng bất biến nằm trong vùng D – Loop bao gồm vùng
promoter và vùng CSB (Conserved Sequence Block) I, II và III. Vì các trình tự bất
biến này đều nằm ở D – Loop và được bảo tồn ở rất nhiều loài động vật có xương sống
nên chúng được cho rằng có vai trò quan trọng trong quá trình nhân đôi của ADN ty
thể. Ví dụ, CSB I có vị trí ngay gần vùng khởi đầu của quá trình nhân đôi chuỗi nặng
(Wallberg and Clayton. 1981). Thêm nữa, vùng D – Loop còn chứa các vùng siêu biến
(hypervariable regions) HVI, HVII và HVIII. Những vùng này có tần suất đột biến cao
8
hơn đáng kể so với các vùng khác của hệ gen ty thể (Greenberg. 1983).
Hình 1.4. Cấu trúc ty thể người
(Innovitaresearch – 2003)
1.2.2. Vị trí và độ dài vùng gen điều khiển D – Loop
Như đã giới thiệu ở trên, vùng gen điều khiển D – Loop có chiều dài xấp xỉ 1.100
bp và chứa các trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản hệ gen ty thể và các đoạn điều
khiển cho quá trình phiên mã của các gen chức năng trong vùng được mã hóa
(Anderson. 1981, Lightowlers. 2001). Hệ thống đánh số bazơ bắt đầu tại điểm gần
giữa vùng điều khiển và đi về hai phía, vì thế vùng điều khiển trải dài từ vị trí 16024
đến 16569, sau đó tiếp tục từ vị trí bazơ 1 cho đến 576. Đây là vùng xuất hiện nhiều
đột biến nhất với tần số đột biến cao hơn so với các vùng khác của hệ gen ty thể
(Horai. 1995, Sorenson, Fleischer. 1996). Hình 1.5
Hình 1.5. Vùng điều khiển D – Loop của ty thể người
9
(http://www.alphabiolab.com)
Vùng siêu biến 1 (HV1) kéo dài từ vị trí 16024 đến 16365.
Vùng siêu biến 2 (HV2) kéo dài từ vị trí 73 đến 340.
Vùng siêu biến 3 (HV3) kéo dài từ nucleotit 438 đến 574.
1.3. Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs)
1.3.1. Đa hình nucleotit đơn là gì?
Đa hình nucleotit đơn hay còn gọi là SNPs, được định nghĩa là biến thể trình tự
ADN xảy ra khi một nucleotit đơn A, T, G hay C trong hệ gen khác biệt so với các cá
thể khác trong cùng một loài.
Hình 1.6. Đa hình nucleotit đơn
(learn.genetics.utah.edu)
Ở cá thể người, có 99.9% là giống nhau, chỉ 0.1% là khác biệt. Sự khác biệt này
có thể là các đặc trưng tính trạng. Ví dụ như các sự phát triển bệnh nào đó ở người
hoặc kiểu hình …
Những biến đổi này có thể không có hại (những thay đổi về kiểu hình), có hại
(gây bệnh ung thư, bệnh tim, Huntington’s, bệnh tan huyết bẩm sinh), hoặc phát triển
sau khi về già (đây là những biến đổi được tìm thấy trong vùng mã hóa và điều hòa
gen).
1.3.2. Các vị trí SNP trên gen
SNP có thể nằm trong vùng mã hóa các gen, vùng không mang mã hoặc trong
vùng xen giữa các gen. Các SNP trong trình tự mã hóa không nhất thiết sẽ làm thay
10
đổi trình tự các axit amin.
Các SNP xuất hiện ở ngoài gen thì thường không ảnh hưởng đến chức năng và
sản phẩm của protein.
Các SNP xảy ra trong vùng gen không mã hóa làm thay đổi hàm lượng protein
được tạo ra.
Các SNP xuất hiện trong vùng gen mã hóa (từ đó dẫn đến thay đổi biểu hiện gen
như hình 1.7.
Hình 1.7. Vị trí SNPs trong gen
(http://www.cell.com)
Tuy nhiên trong một số trường hợp, SNP không nằm trong vùng mã hóa protein
vẫn có thể gây ảnh hưởng đến sự nối ghép các gen, tác động lên các yếu tố phiên mã,
làm suy thoái RNA thông tin…. Sự biểu hiện gen bị ảnh hưởng bởi dạng này được gọi
là một eSNP (sự biểu hiện SNP) và có thể biểu hiện tăng hoặc giảm trong gen.
1.3.3. Ứng dụng và tầm quan trọng
Ứng dụng đầu tiên của SNPs phải kể đến đó là chìa khóa tiềm năng trong việc
tiến hành y học cá nhân. Các biến thể trong trình tự ADN của con người có thể ảnh
hưởng đến cách cơ thể phát triển bệnh, cách cơ thể đáp ứng với các tác nhân gây bệnh,
các hóa chất, thuốc, vacxin và các loại tác nhân khác. Tuy nhiên, vai trò quan trọng
nhất của chúng trong các nghiên cứu y học là để so sánh các vùng của hệ gen giữa các
nhóm người (có thể là giữa bệnh nhân và người khỏe mạnh trong các nghiên cứu ở
mức toàn bộ hệ gen (Genome Wide Association studies – GWAS)).
Một SNP có thể là nguyên nhân gây ra một bệnh di truyền. Đối với các bệnh
11
phức tạp, các SNP thường không hoạt động đơn lẻ, chúng thường hoạt động trong một
sự kết hợp với các SNP khác để biểu hiện một trình trạng bệnh như ta thấy ở bệnh
loãng xương.
Các nghiên cứu về SNP không những tạo ra điều kiện thuận lợi trong quá trình
phát hiện các biến thể di truyền và bệnh di truyền mà còn phát triển nghiên cứu nhằm
tìm ra cách phòng ngừa và chữa bệnh trong tương lai. Các SNP có thể mang lại các
phản ứng khác nhau đối với thuốc điều trị. Ngoài ra nhiều SNP được sử dụng làm chỉ
thị giúp cho việc lập bản đồ gen liên quan đến bệnh hoặc một đặc điểm nào đó. Những
SNP có liên hệ với các bệnh ở người như ung thư, các bệnh truyền nhiễm, các bệnh tự
miễn, bệnh thần kinh có thể được sử dụng để tìm ra đích tác dụng của thuốc và các liệu
pháp chữa trị(John M. Butler và cộng sự., 2004).
Năm 2004, John M.Butler và cộng sự cũng đã chỉ ra một vai trò khác của SNP đó
là đặc trưng cho dân tộc người nào đó, những dân tộc phân bố ở các khu vực địa lý,
không gian, thời tiết khác nhau thường có những đặc trưng riêng.
1.4. Đột biến ty thể và bệnh ty thể
Do hệ gen ty thể chỉ mã hóa cho một số lượng rất ít protein/enzym. Chính vì vậy
chức năng ty thể còn được thực hiện nhờ vào hàng loạt các protein/enzym do gen nhân
quyết định và được tổng hợp trong tế bào chất rồi được vận chuyển đến ty thể. Chính
vì vậy, các rối loạn ty thể (hay bệnh do ty thể có thể phát sinh do những đột biến ở gen
nhân hoặc gen ty thể (ADN ty thể). Một số rối loạn ảnh hưởng đến một cơ quan như
bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber. Nhưng cũng có những rối loạn ảnh hưởng đến
rất nhiều cơ quan và thường có những đặc điểm nổi trội về thần kinh – cơ.
Hiện nay người ta đã biết đến có trên 150 bệnh di truyền khá nhau theo mẫu hệ
do ty thể quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường rất đa dạng. Chúng có
thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột
biến điểm thay đổi các nucleotit (Sevidei et al. 2002).
1.4.1. Đột biến ty thể trong vùng D – Loop
Đột biến điểm
Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú (Tan và cộng sự. 2002) đã giải
trình tự hệ gen ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của bệnh nhân và đã
cho thấy 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81.5% đột biến thuộc vùng
12
D – Loop.
Với bệnh ung thư buồng trứng (Liu và cộng sự. 2004) đã xác định được 60% đột
biến ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột
biến điểm T – C hoặc G – A. Bốn vùng có đột biến điểm này là D – Loop, 12sRNA,
16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có tần suất
đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng.
Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày (Wu và cộng sự. 2001) đã xác định được 48%
mang đột biến soma ở vùng D – Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc
mất bazơ tại vị trí nucleotide 303 – 309 (Vị trí D310).
Trong các nghiên cứu khác (Burgart và cộng sự. 2001) đã tìm thấy đột biến mất đoạn
nhỏ (50 bp) trong vùng D – Loop ở 4/32 (12.5%) ở bệnh nhân ung thư dạ dày.
Thêm đoạn
(Wu và cộng sự. 2001) đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈ 260 bp và ≈
520 bp) trong vùng D – Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của một bệnh nhân
ung thư dạ dày. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau.
1.4.2. Đột biến ty thể nằm ngoài vùng D – Loop
Các bệnh như liệt mắt tăng tiến kinh niên (Chronic Progressive External
Ophthalmoplegia, CPRO), hội chứng Kearn – Sayre (Kearn – Sayre syndrome, KSS),
đái đường và câm điếc (Diabetes and deafness) đều do mất đoạn hoặc sắp xếp lại trong
gen tại vị trí 1555G. Các đột biến G1177A, T14484C, G3460A, 14459A, cũng làm
biến đổi protein, dẫn đến liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (Leber hereditary optic
neuropathy, LHON). Đột biến trong gen cytb gây bệnh không dung nạp vận động và
myoglobin niệu (Chia-Chi Hsu và cộng sự. 2013)
Cho đến nay nhiều dạng đột biến ADN ty thể được xác định, các đột biến này
bao gồm: đột biến điểm, đột biến thêm hoặc mất bazơ, đột biến lặp đoạn, mất đoạn hay
thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể.
Đột biến điểm
Tan và cộng sự. 2002 phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú và chỉ ra
18.5% bệnh nhân mang đột biếnđược xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và
ATPase 6. Trong số các đột biến trên đột biến thêm hoặc mất bazơ chiếm 42% thuộc
13
vùng D – Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng mã hóa và không mã hóa.
Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng (Polyak và cộng sự.
1998) đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng mã hóa ND1, ND4, ND5,
cytochrome b, COXI, COXII và COXIII cũng như các gen rRNA 12S và 16S.
Mất đoạn
ADN ty thể bị mất một đoạn lớn như mất đoạn 4977 bp đã được xác định ở ung
thư vú, ung thư đại trực tràng.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thư.
Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp, ung thư phổi, ung thư đại trực tràng.
Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác định thấy ở bệnh nhân ung
thư vú, ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư buồng trứng. Như vậy biến đổi về hàm
lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung thư.
Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể phụ
thuộc vào vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong vùng
D – Loop điều khiển sự sao chép ADN ty thể sẽ làm giảm số bản sao. Mặt khác đột
biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi photphoryl hóa – oxy hóa
lại có thể làm tăng số bản sao như là một cách để đáp ứng lại sự mất chức năng của ty
14
thể.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu sinh phẩm được dùng để tách chiết ADN là móng tay hoặc móng chân của
những người khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống, kích cỡ mẫu (n=200). Quy
trình thu thập mẫu được tiến hành theo các bước như trong hình 2.1 .
(A) (B) (C) (D) (E)
Hình 2.1. Các bước tiến hành thu thập mẫu sinh phẩm
(A) Móng tay/móng chân được rửa sạch bằng xà phòng và nước trước khi lấy mẫu
(B) Đeo găng tay để tránh nhiễm ADN từ người này sang người khác
(C) Sử dụng cắt móng tay mới hoặc đã được khử trùng hoàn toàn bằng cách đun
trong nước 5 phút. Mẫu được lấy ít nhất là 1 bên bàn tay, nếu có thể sẽ lấy ở cả 2
bàn tay/chân để thu được nhiều mẫu hơn.
(D) Mẫu móng tay/chân được đựng trong dụng cụ chứa mẫu đã được khử trùng
như túi nhựa hoặc phong bì để dễ dàng gửi đi.
(E) Đóng gói và chuyển mẫu đi theo hướng dẫn.
2.1.2. Hóa chất
Agarose (Sigma)
Bộ kit tinh sạch DNA tổng số (Fermentas)
Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas)
Bộ kit dùng cho phản ứng PCR (Roche)
Các mồi cho phản ứng PCR đặt của (Sigma)
Proteinase K (Fermentas)
Dung dịch: Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1)
Dung dịch : Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)
Etanol (Fermentas)
RNase A (Fermentas)
15
H2O vô trùng (Fermentas), Marker 1 kb (Fermentas)
2.2. Trang thiết bị
Các thiết bị khác phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1.
Ứng dụng Thiết bị Hãng sản xuất
Ly tâm nhanh Eppendorf CHLB Đức
Ly tâm Avanti TM 30 centifuge Ly tâm lạnh Beckman
Hewlett Packard, Mỹ So màu Đo OD
Metter Toledo Đo pH S20
Cân Cân 10-4 Ohaus
Điện di Điện di Agarose Bio-rad
10µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, Eppendorf Pipetman 1ml
Khử trùng HVE-50 Hirayama, Nhật Bản
Giải trình tự ABI 3100 Avant (Applied, Biosystem). DNA
PCR 9700 (Applied, Biosystem). PCR
Máy khuấy từ RotoLab, OSI
Vortex Rotolab, OSI
Bể ổn nhiệt Techne, OSI Ổn/gia nhiệt Lò vi sóng Samsung
Tủ lạnh sâu – 750C, Tủ lạnh Sanyo, Nhật Bản -200C Tủ lạnh
Tủ lạnh thường Sanyo, Nhật Bản
Chụp ảnh Máy soi chụp ảnh gel Phamarcia
Tủ cấy Sanyo, Nhật Bản
Bảng 2.1. Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
2.3. Phần mềm tin sinh học
Các phần mềm tin sinh học được sử dụng trong nghiên cứu này và chức năng của
16
chúng được liệt kê theo Bảng 2.2.
Phần mềm Chức năng Địa chỉ
Kiểm tra chất lượng trình tự và so http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bi BioEdit sánh trình tự oedit.html
So sánh trình tự với gen chuẩn BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ công bố trên ngân hàng gen
SOFTGEN Bao gồm các phần mềm bổ trợ tìm http://www.softgenetics.com/ ETICS đột biến điểm
Bảng 2.2. Phần mềm sử dụng
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN từ móng tay
Dựa theo phương pháp tách ADN từ móng tay sử dụng Phenol: Chroloform
(Sambrook và cộng sự. 1989) và quy trình được tóm tắt như sau:
- Mẫu móng tay được cho vào ống Eppendorf 1.5 ml, rửa 5 – 10 lần bằng nước
khử trùng
- Rửa lại bằng cồn 70%
- Bổ sung 200 µl EDTA (pH 8, 0.5M)
- Đảo nhẹ, ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng
- Loại dịch, bổ sung 200 µl SDS trong EDTA + proteinase K (5 µl)
- Ủ trong 1h
- Rửa lại bằng nước khử trùng
- Bổ sung 400 µl NaOH 2N rồi ủ qua đêm
- Chỉnh pH về 6 – 7
- Bổ sung dung dịch 25:24:1 theo tỉ lệ 1:1
- Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút
- Thu dịch trong
- Bổ sung Etanol 100% + Natri Axetat NaOAc 3M
- Để trong tủ -200C trong 30 phút
- Ly tâm thu tủa
- Rửa lại tủa bằng cồn Etanol 700
- Ly tâm
17
- Làm khô và hòa tan lại bằng nước
2.4.2. Định lượng ADN tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế
Phương pháp quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng độ ADN
đồng thời kiểm tra được độ tinh sạch của mẫu ADN tách chiết.
Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ cực đại ánh sáng tử ngoại ở bước sống 260 nm
(OD260) đối với axit nucleic và ở bước sóng 280 nm (OD280) đối với protein.
Mức độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm của mẫu đó cho phép xác định
nồng độ axit nucleic trong mẫu theo tương quan: Một đơn vị OD260 tương ứng với
nồng độ 50 µg/ml ADN sợi kép. Do vậy, nồng độA sẽ được tính theo công thức:
CDNA = OD260 x 50 x d
Trong đó: d = Độ pha loãng mẫu khi đo; CADN =Nồng độ ADN
Tuy vậy, cách tính trên chỉ chính xác khi dung dịch axit nucleic là sạch, nếu dung
dịch chứa ADN còn có lẫn protein hoặc 1 số dung môi, hóa chất tách chiết thì protein
cũng sẽ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm và 230 nm do đó làm sai lệch giá trị thật
của nồng độ ADN trong mẫu. Để khẳng định cho kết quả chính xác hơn, chúng tôi đo
thêm giá trị OD280 để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch ADN. Nếu tỷ lệ
OD260/OD280> 1,8 thì mẫu ADN tách chiết được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ
tinh sạch cho các thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.
2.4.3. Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc
nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự tham gia của một loại
enzym DNA polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng
các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy
để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài
từ 6 – 30 nucleotit). Đoạn này gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép, và
được enzym DNA polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù. Các
sợi ADN mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên
900C (92 – 980C) mà thường là 940C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra (Lê Thanh Hoà
và cộng sự. 2001b).
Cả 2 sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn
mồi (gọi là oligonucleotit hay primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho
cả 2 sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở 2 đầu đoạn ADN cần
18
nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài
về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục
ngàn cặp nucleotit. Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất
hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ
lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó
được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắn mồi, tổng hợp
ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý
thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi (Hình
2.2). Như vậy, kết quả là một đoạn ADN định trước được “nhân lên” với một lượng rất
lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao ADN của PCR sẽ là 230 = 1.073.741.824.
Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm đa năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi.
Vật liệu khởi đầu cho PCR là ADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn ADN.
Không phải lúc nào cũng cần thiết phải tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã
được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu ADN làm khuôn tinh
khiết thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lượng ADN khuôn cần cho phản
19
ứng PCR rất nhỏ. Trong các thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1 –
100 ng DNA tổng số của hệ gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trường hợp,
phản ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ.
Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:
- ADN làm khuôn
- Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN (primer)
- Enzym chịu nhiệt DNA - polymerase (hiện nay được dùng phổ biến nhất là Taq,
chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus).
- Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotit (ở dạng dNTP).
- Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++).
- Nước tinh khiết (không có DNAase; RNase v.v...)
- Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR là 50 l hoặc 25 l.
Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ (Hình 2.3).
Bung liên kết của ADN (Denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 90C - 98C
trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra
tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym RNA
Polymerase xúc tác tổng hợp.
Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi – Annealing). Sau bước 1, ngay lập tức, nhiệt
độ được hạ xuống 37 – 68°C để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương
ứng trên các phân tử ADN làm khuôn.
Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài – Extension): Nhiệt độ ngay lập tức được nâng
lên 68°C – 72°C (thông thường 72C) trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi
ADN vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm
PCR.
20
Hình 2.3. Các bước của một chu kỳ PCR
Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 – 40 chu kỳ và tiếp tục cho đến chu kỳ
cuối cùng. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72C trong 5 – 10 phút sao cho tất
cả các sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng,
nhiệt độ hạ xuống 4C để bảo quản sản phẩm.
Sản phẩm của phản ứng PCR là đoạn ADN mà ta cần nhân lên. Sản phẩm được
kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose (nồng độ 0,8% - 2%), và ADN của
PCR sẽ được nhìn thấy rõ dưới tác dụng của tia cực tím (ultra – violet) sau khi được
nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám và làm hiển thị
ADN. Độ dài của ADN sản phẩm được tính bằng cách so sánh với chỉ thị ADN (DNA
Marker).
2.4.4. Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F. Sanger
Sau khi thu sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định trình tự dựa trên phương
pháp tổng hợp Sanger trên máy giải trình tự ABI PRISM tại Singapore.
Giải trình tự bằng phương pháp Sanger
Vào năm 1975, F. Sanger và A.R.Coulson lần đầu tiên giới thiệu phương pháp giải
trình tự ADN, công trình hữu ích này đã giúp cho sinh học phân tử có những bước đi
mới. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những nucleotide thông thường còn sử
dụng thêm 4 loại dideoxynucleotit (mất nhóm - 3’OH). Điều này khiến các
dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành các cầu nối photphodieste với các
21
nucleotit tiếp theo dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợp ADN. Hình 2.4.
Hình 2.4. Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger
(esciencecentral.org)
2.4.5. Phương pháp phân tích chất lượng dữ liệu trình tự
Các thông số và dữ liệu thu nhận sau khi đọc trình tự (Hình 2.5) được kiểm tra
bằng phần mềm BioEdit. Phần mềm này cho phép xem xét độ phân tách các đỉnh tín
22
hiệu và các phần nhiễu tín hiệu (background noise).
Mẫu đọc trình tự chấtlượng tốt
Mẫu đọc trình tự có nhiễu tín hiệu nhưng ở mức chấp nhận được
Mẫu đọc trình tự có nhiều nhiễu tín hiệu, chất lượngkhông tốt
Hình 2.5. Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự
Mặc dù là một phương pháp tiên tiến xong việc đọc trình tự bằng máy vẫn có
những lỗi mà các phần mềm không thể tự động sửa, vì vậy dựa trên các biểu đồ hiển
thị tín hiệu, chúng tôi thực hiện kiểm tra thủ công độ phân định của tín hiệu một lần
nữa bằng mắt thường và thay thế các nucleotit mà máy đọc không thể xác định hoặc
23
gọi nhầm (Hình 2.6).
Lỗi nhận biết tínhiệu sai
Hình 2.6. Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông
2.4.6. Phương pháp tìm đột biến gen
Các trình tự được đưa so sánh với trình tự tham chiếu sửa đổi Revised
Cambridge Reference Sequence (rCRS) (NC_012920.1) trên chương trình BLAST và
một vài chương trình tìm kiếm đột biến điểm khác nhau như GeneMarker, NovoSNP
và MutationSurveyor. Dựa trên kết quả tổng hợp phân tích từ tất cả các phần mềm, đột
biến đặc trưng được xác định dựa trên phần trăm các điểm đột biến xuất hiện ở các cá
24
thể đã được lấy mẫu để phân tích trình tự.
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu sinh phẩm
ADN tổng số là nguyên liệu cơ bản của phản ứng PCR, vì vậy chất lượng của nó
quyết định đến chất lượng của phản ứng PCR và các kết quả thí nghiệm sau này. ADN
tổng số có độ tinh sạch cao, trạng thái không bị đứt gãy và có nồng độ hợp lý cần thiết
cho quá trình thực hiện phản ứng PCR hiệu quả và tạo cơ sở tốt cho các công việc tiếp
theo.
Sau khi tách chiết được ADN tổng số, chúng tôi tiến hành kiểm tra nồng độ ADN
trong mẫu bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm.
Bảng 3.1. Kết quả đo kiểm tra giá trị hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại 2 bước sóng
260 nm và 280 nm
3.2. Nhân gen bằng phương pháp PCR
Vùng D – Loop được chọn nghiên cứu. Cặp mồi dùng cho phản ứng PCR bao
gồm mồi xuôi: định vị trên RNA vận chuyển Proline (RNAvPro) và mồi ngược: định
vị trên vùng bảo tồn D – Loop, nhân đoạn ADN cho độ dài xấp xỉ 1000 cặp nucleotit .
Chúng tôi dùng trình tự hệ gen ty thể người được công bố tại Ngân hàng Gen
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để thực hiện các bước thiết kế mồi và so sánh trình tự.
Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn nucleotit mạch đơn có kích thước từ 6 – 100 bp, có trình tự
bắt cặp bổ sung với trình tự khuôn ở 2 đầu mạch đơn. Có 2 loại mồi là mồi xuôi
(primer forward) và mồi ngược (primer reverse) tham gia vào PCR.
Mồi xuôi bắt cặp và gắn vào đầu 5’ của mạch khuôn, mồi ngược bắt cặp bổ sung và
25
gắn vào đầu 3’ của mạch khuôn. Mồi ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả của PCR. Để
đảm bảo kết quả PCR tốt nhất, mồi xuôi và mồi ngược phải có trình tự không bổ sung
với nhau nhằm tránh xảy ra hiện tượng tự bắt cặp giữa các mồi với nhau. Các mồi có
Tm (Melting Temperature) gần giống nhau thì hiệu quả phản ứng được tăng cường,
khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược nhỏ hơn 1 kb là thích hợp nhất.
Để nhân đoạn gen, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi dựa trên trình tự gen ty thể đã
được công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế (GeneBank), số đăng ký J01415, trình tự
này cũng được gọi là trình tự Anderson.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
361 acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac H408 421 ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat
481 ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata
541 ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa
601 ccactcacgg gagctctcca tgcatttggt attttcgtct ggggggtgtg cacgcgatag
661 cattgcgaga cgctggagcc ggagcaccct atgtcgcagt atctgtcttt gattcctgcc
721 tcatcctatt atttatcgca cctacgttca atattacagg cgaacatact tactaaagtg
781 tgttaattaa ttaatgcttg taggacataa taataacaat tgaatgtctg cacagccgct
841 ttccacacag aaaaaatttc acatcataac caccaaaccc cccccctccc cccgcttctg
910 gccacagcac ttaaacacat ctctgccaaa ccccaaaaac aaagaaccct aacaccagcc
15901 aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga
15961 gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct L15977
16021 ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca
16081 accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat.
Theo tính toán trên, cặp mồi thiết kế sẽ nhân bản đoạn DNA trong vùng D –
Loop với kích thước khoảng 1000 bp.
Cặp mồi thiết kế như sau:
Primer forward (LF): 5’ - cac cattagcacc caaagct - 3’
Primer reverse (LR): 5’ – ctgttaaaagtgcataccgcca - 3’
Để nhân đoạn ADN đặc hiệu, có số lượng lớn thì ngoài việc thiết kế cặp mồi đặc
hiệu còn phải có các thành phần hỗn hợp của PCR và chu trình nhiệt tối ưu. Chúng tôi
đã thử các điều kiện khác nhau để tìm ra điều kiện PCR tối ưu. Bảng 7 và 8 dưới đây
26
là thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phù hợp để nhân đoạn ADN liên quan.
Bảng 3.2. Thành phần dùng cho một phản ứng PCR
Thể tích (μl) Thành phần
Master Mix 2X 12.5
Mồi xuôi 1
Mồi ngược 1
ADN khuôn 1
Nước 9.5
Tổng 25
Các ống phản ứng này sau đó sẽ được đặt vào máy chạy PCR với chu trình nhiệt
như bảng 3.3.
Bước
Phản ứng
Nhiệt độ
Thời gian
Chu kỳ
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Bắt cặp 57 1 phút ×30
4 Kéo dài 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.1).
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D – Loop
Các giếng từ 1 đến 14: Sản phẩm PCR mẫu sinh phẩm
27
M: Marker 1kb (Fermentas)
Kết quả điện di ở hình 3.1 cho thấy bản gel sản phẩm PCR có dạng 1 băng ADN
duy nhất, đậm và rõ nét, có kích thước là 1000 bp phù hợp với kích thước của đoạn
ADN cần nhân.
3.3. Kết quả giải trình tự gen
Sản phẩm PCR đặc hiệu sau khi đã tinh sạch được đọc trình tự gen trên máy đọc
tự động, sử dụng hai mồi đọc trình tự là mồi L15977 xuôi và mồi H408 ngược.
Trình tự các đoạn gen đặc hiệu được xác định theo phương pháp của Sanger bằng máy
giải trình tự gen trên máy ABI Prism 3100 Avant của hãng First Base tại Singapore
(tốc độ 2,5 giờ/4 mẫu ~ 4000 nucleotit).
Kết quả được phân tích sử dụng chương trình phần mềm Genedoc và phần mềm
BioEdit. Các trình tự có tín hiệu nhiễu được kiểm tra lại hoặc loại bỏ khỏi các phân
tích tiếp theo. Trình tự nucleotit được so sánh với trình tự nucleotit của các đoạn ADN
khác trong Ngân hàng Gen (http://www.ebi.ac.uk) bằng chương trình EMBL FASTA.
Hình 3.2 trình bày một số ví dụ điển hình của các mẫu đọc trình tự.
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự trên một số mẫu sinh phẩm
3.4. Kết quả phân tích đột biến
Để tìm điểm đột biến, chúng tôi lần lượt tiến hành so sánh trình tự D – Loop của
28
mẫu bệnh với trình tự tham khảo rCRS công bố tại Ngân hàng Gen. Để đảm bảo loại
trừ hoặc tập hợp các đột biến, chúng tôi sử dụng phương pháp so sánh trình tự hoặc
dùng phần mềm chuyên dụng cho việc xác định đột biến NovoSNP.
3.4.1. Các SNPs được công bố trên Ngân hàng Gen
Chúng tôi đã tiến hành tìm các vị trí đa hình (SNPs) của HV1 trong vùng D –
Loop của hệ gen ty thể người đã được công bố trên Ngân hàng Gen từ trang web
http://mitomap.org. Bảng danh sách này liệt kê 76 SNPs từ vị trí 16192 đến 16368
được sử dụng như danh sách tham chiếu để so sánh với danh sách SNPs ở nhóm người
Việt Nam trong nghiên cứu này. Các thông tin về SNPs được thống kê trên website
trên gồm nhiều vùng khác nhau trong gen ty thể. Tuy nhiên trong khuôn khổ luận văn
này, chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu vùng HV1 của D – Loop, chính vì thế bảng 3.4
này chỉ có thông tin về: Vị trí SNP, locus, vùng gen, nucleotit thay đổi của vùng siêu
biến HV1, còn các SNP ở vùng khác thì tham khảo thêm ở http://mitomap.org.
Bảng 3.4. Vị trí đa hình HV1 trong vùng D – Loop được công bố trên Ngân hàng
29
Gen
3.4.2. Các vị trí đa hình (SNPs) ở HV1 trong vùng D – Loop của người Việt Nam
Sau khi việc giải trình tự các mẫu sinh phẩm có kết quả, việc tiếp theo là chúng
tôi phân tích và tìm kiếm các SNPs của người Việt Nam sử dụng phần mềm NovoSNP
(Bỉ) http://www.molgen.ua.ac.be/bioinfo/novosnp. NovoSNP là một phần mềm dễ sử
dụng và có tính hiệu quả cao, cho kết quả đáng tin cậy đối với sự phát hiện các biến
thể trình tự ở cả các SNP và INDELS, cũng như trong việc chọn lọc các biến thể trình
tự đối với đột biến gây bệnh hoặc là phát hiện SNP. Người ta cũng đã so sánh các đột
biến được phát hiện ở phần mềm này với 2 phần mềm PolyPhred và PolyBayes, kết
30
quả cho thấy các giá trị chọn lọc cao có thể dùng để xây dựng bản đồ SNP.
Hình 3.3. Phần mềm NovoSNP khi phân tích mẫu
Dựa trên kết quả phân tích thông qua phần mềm NovoSNP đã tìm được 44 vị trí
đa hình từ 16194 đến 16359 trong vùng HV1 của người Việt Nam. Xem bảng 3.5.
Bảng 3.5. SNPs được tìm thấy trong HV1 ở mẫu sinh phẩm Việt Nam
31
(NovoSNPS)
Ở bảng 3.5 dễ nhận thấy giá trị Score và Fscore càng cao thì khả năng đa hình
càng chính xác. Theo kết quả nêu tại Bảng 3.5 dựa trên thuật toán của phần mềm
NovoSNP thì tại vị trí 16194, giá trị Score: 66 và Fscore: 51 là tương đối cao. Điều
này cho thấy khả năng chèn Nucleotit C (Insert C) vào vị trí này là rất cao trong các
đối tượng người Việt Nam tham gia nghiên cứu này. Điều này còn được thể hiện rõ
hơn qua hình 3.3 sau khi so sánh với trình tự rCRS sử dụng NovoSNP. Điểm chèn
Nucleotit C ở vị trí 16194 xảy ra ở hầu hết các trình tự của những mẫu tham gia (vị trí
được đánh dấu màu đỏ trong hình 3.4). Tuy nhiên ở đây chúng tôi không liệt kê ra hết
các trình tự mà chỉ đưa ra một số trình tự tiêu biểu kể cả những trình tự có giá trị
Score: 16 và Fscore: 16, thấp hơn rất nhiều so với vị trí 16194 nhưng NovoSNP cũng
đã đưa ra được tính đa hình cao và đảm bảo độ tin cậy như tại vị trí 16381 thay đổi
Nucleotit T →A (vị trí được đánh dấu màu đỏ như trong hình 3.5). (Stefan Weckx và
cộng sự. 2005).
32
Hình 3.4. SNP tại vị trí 16194
Hình 3.5. SNP tại vị trí 16381
3.4.3. So sánh danh sách SNPs người Việt Nam và danh sách SNPs thống kê trên
GenBank
Để so sánh tìm ra điểm đa hình chung và riêng của nhóm người Việt Nam trong
nghiên cứu này và danh sách các điểm đa hình công bố trên Ngân hàng Gen, chúng tôi
đã lập bản đồ Venn để thể hiện rõ rệt. Kết quả là có 33 vị trí đa hình là giống nhau, 43
SNP của trình tự người được công bố trên Ngân hàng Gen (J và 11 SNP đặc trưng của
33
nhóm người Việt Nam trong nghiên cứu. Hình 3.6.
Hình 3.6. Bản đồ Venn tìm điểm đặc trưng và riêng của người Việt Nam
Danh sách các SNP đặc trưng của nhóm người Việt Nam được tìm thấy trong
nghiên cứu, thống kê trong bảng 3.6 dưới đây.
Bảng 3.6. Các SNP đặc trưng ở người Việt Nam
Các SNP trong vùng HV1 của người Việt Nam
Số thứ tự Vị trí Số thứ tự Vị trí
1 16194 7 16312
2 16195 8 16314
3 16206 9 16359
4 16232 10 16366
5 16240 11 16381
6 16302
3.5. Các vị trí đa hình đặc trưng ở người Việt Nam và bệnh ty thể
11 SNPs được liệt kê ở bảng trên không chỉ giúp chúng ta xác định được đột biến
đặc trưng ở người Việt Nam, ngoài ra còn mang lại các thông tin các đột biến này có
liên quan gì đến các bệnh di truyền ty thể như ung thư dạ dày, ung thư bàng quang,
Huntington v..v…để dùng làm tài liệu nghiên cứu đóng góp cho lĩnh vực y học, phát
hiện sớm các bệnh di truyền và điều trị kịp thời. Dưới đây là bảng liệt kê các bệnh liên
quan đến đột biến ty thể nằm trong vùng HV1 đặc trưng ở người Việt Nam.
Năm 2014, Mousavizadeh K và cộng sự đã công bố bài báo về ảnh hưởng của
các đột biến liên quan đến bệnh Huntington xảy ra trong vùng điều khiển D – Loop
trên 30 bệnh nhân Huntington và 463 người khỏe mạnh sử dụng phương pháp giải
trình tự sản phẩm PCR. Kết quả sau khi phân tích trình tự và so sánh với trình tự tham
chiếu Cambridge cho thấy các đa hình tại các điểmC16069T, T16126C, T16189C,
34
T16519C và C16223T có liên quan đến mối đe dọa tăng khả năng mắc bệnh
Huntington, trong khi các SNP tại các vị trí C16150T, T16086C và T16195Ccó liên
quan đến khả năng giảm bệnh Huntington.
Nasser Shakhssalim và cộng sự. 2013 đã nghiên cứu về SNP tại vị trí 16194 ở
HV1 trong vùng D – Loop, kết quả cho thấy đột biến điểm này có liên quan đến căn
bệnh ung thư bàng quang.
Đột biến điểm tại vị trí 16312 có ảnh hưởng lớn đến Hội chứng đột tử ở trẻ và
công trình này đã được Opdal và cộng sự công bố vào năm 1998.
Bảng 3.7. Một số bệnh ty thể liên quan đến đột biến điểm trong vùng HV1
STT Vị trí Bệnh liên quan PMID Tác giả Tạp chí, năm
1 16194 Ung thư bàng 3930351 Nasser Cancer cell int
quang Shakhssalim December2013
và cộng sự
2 16195 Huntington 24471944 Mousavizadeh K Mitochondrial
và cộng sự DNA
Epub 2014 Jan
19
3 16206 Chưa có thông tin
liên quan
4 16232 Chưa có thông tin
liên quan
5 16240 Chưa có thông tin
liên quan
6 16302 Chưa có thông tin
liên quan
7 16312 SIDS 9825969 Opdal SH Acta Paediatr
và cộng sự 1998 Oct
8 16314 Chưa có thông tin
liên quan
9 16359 Chưa có thông tin
liên quan
35
10 16366 Chưa có thông tin
liên quan
11 16381 Chưa có thông tin
liên quan
*Chú thích: SIDS – Sudden Infant Death Syndrome: Hội chứng đột tử ở trẻ em.
3.6. Phần trăm đa hình trong mẫu phân tích
Hình 3.7. Kết quả phân tích đột biến trên nhóm người Việt Nam nghiên cứu
Dựa vào kết quả phân tích như trong hình 3.6, chúng tôi đưa ra được bảng phần
trăm các vị trí đa hình của 11 điểm SNP đặc trưng ở nhóm người Việt Nam trong
nghiên cứu này. Bảng 3.8.
36
Bảng 3.8. Phần trăm đa hình của 11 SNP đặc trưng của người Việt Nam
Từ bảng 3.8 có thể thấy rằng tại một số điểm có thể xảy ra đột biến thay đổi từ
nucleotit này thành 1 nucleotit khác hoặc cũng có thể có 2 vị trí thay thế như tại điểm
37
16312, 16359, 16381, 16194 hoặc 16195.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Tách thành công ADN tổng số từ móng tay.
2. Nhân thành công đoạn gen vùng D – Loop có kích thước khoảng 1000bp với
cặp mồi L15977 và H408.
3. Từ 76 SNP đã công bố trên Ngân hàng Gen so sánh với SNPs của nhóm người
Việt Nam trong nghiên cứu cho thấy có 33 SNP chung và 11 SNP đặc trưng của nhóm
người Việt Nam, trong số đó có một vài SNP có liên quan đến các bệnh ty thể đã được
công bố trên thế giới.
KIẾN NGHỊ
1. Kết quả trên mới chỉ là nghiên cứu trong phạm vi HV1 của vùng D – Loop, tuy
nhiên trong vùng điều khiển có cả vùng HV2, HV3 cũng là các vùng có tần suất đột
biến cao, nhiều “hotspot” chính vì thế có thể mở rộng nghiên cứu thêm các vùng trên.
Ngoài ra vùng mã hóa của ADN ty thể cũng có một số SNP liên quan đến y học cần
được mở rộng nghiên cứu.
38
2. Tăng thêm kích cỡ mẫu để có thể tìm thêm các vị trí đa hình.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol
4:289-333.
2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.Molecular Biology of the Cell. 4th edition,
Garland Science; 2002.
3. Barthelemy, C., de Baulny, H. O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in
mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):479-
87.
4. Berger, K. H., and Yaffe, M. P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance,
Experientia 52(12):1111-6.
5. Bowmaker, M., Yang, M. Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H. T., Huberman, J. A.,
and Holt, I. J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an
initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9.
6. Brown, T. A., Cecconi, C., Tkachuk, A. N., Bustamante, C., and Clayton, D. A., 2005,
Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-
strand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76.
7. Butler, J.M., McCord, B.R., Jung, J.M., Wilson, M.R., Budowle, B., Allen, R.O.
(1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser
fluorescence. J. Chromatogr. B 658: 271-280
8. Butler, J.M. and Levin, B.C. (1998) Forensic applications of mitochondrial
DNA. Trends in Biotechnology 16: 158-162
9. Chen, X. J., and Butow, R. A., 2005, The organization and inheritance of the
mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25.
10. Cheng, Y. L., Chang, W. L., Lee, S. C., Liu, Y. G., Chen, C. J., Lin, S. Z., Tsai, N. M.,
Yu, D. S., Yen, C. Y., and Harn, H. J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits
proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci
39
75(13):1579-94.
11. Clayton, D. A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life
55(4-5):213-7.
12. Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland.
13. Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G. J., Pebay-Peyroula, E.,
and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the
mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9.
14. Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3
Pt 2):227s-255s.
15. Evan, G. I., and Vousden, K. H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in
cancer, Nature 411(6835):342-8.
16. Fliss, M. S., Usadel, H., Caballero, O. L., Wu, L., Buta, M. R., Eleff, S. M., Jen, J.,
and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and
bodily fluids, Science 287(5460):2017-9.
17. Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M. C., 1992, Identifying individuals by
sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8.
18. Goldstein, S., and Shmookler Reis, R. J., 1984, Genetic modifications during cellular
aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30.
19. Greenberg, B. D., Newbold, J. E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide
sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA,
Gene 21(1-2):33-49.
20. Hanahan, D., and Weinberg, R. A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70.
Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):1367-
80.
21. Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013,
40
Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets 14(5):586-600.
22. IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO
Press Release.
23. Lu, J., Sharma, L. K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA
mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15.
24. Majamaa, K., Moilanen, J. S., Uimonen, S., Remes, A. M., Salmela, P. I., Karppa, M.,
Majamaa-Voltti, K. A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K. J., and Hassinen, I. E.,
1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy,
lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population,
Am J Hum Genet 63(2):447-54.
25. McFarland, R., Elson, J. L., Taylor, R. W., Howell, N., and Turnbull, D. M., 2004,
Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is
not good enough, Trends Genet 20(12):591-6.
26. McKinney, E. A., and Oliveira, M. T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA,
Genet Mol Biol 36(3):308-315.
27. Miyazono, F., Schneider, P. M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S. E.,
Dienes, H. P., Aikou, T., and Hoelscher, A. H., 2002, Mutations in the mitochondrial
DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus,
Oncogene 21(23):3780-3.
28. Mootha, V. K., Lindgren, C. M., Eriksson, K. F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar,
J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M. J.,
Patterson, N., Mesirov, J. P., Golub, T. R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E. S.,
Hirschhorn, J. N., Altshuler, D., and Groop, L. C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes
involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes,
Nat Genet 34(3):267-73.
29. Moraes, C. T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C.,
Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev
41
Neurobiol 53:3-23.
30. Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and
diaphragm of man without muscular disease: an age-related alteration, J Neurol Sci 100(1-
2):14-21.
31. Nass, M. M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics.
I. Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611.
32. Parkin, D. M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of
eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606.
33. Petersen, K. F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D. L.,
DiPietro, L., Cline, G. W., and Shulman, G. I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the
elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2.
34. Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J. K., Markowitz, S. D., Trush, M.
A., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial
genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3.
35. Ralph, S. J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez,
R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced
oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects
Med 31(2):145-70.
35. Reed, J. C., and Green, D. R., 2002, Remodeling for demolition: changes in
mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3.
36. Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C
Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta
81:448-61.
37. Shoubridge, E. A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum
Mol Genet 10(20):2277-84.
38. Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures. V. Le
42
systeme des cytochromes des mutants ‘petite colonie’, Annales de l'Institut Pasteur:47-63.
39. Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the ADN ty thể control region are
mutational hotspots, Am J Hum Genet 67(4):1029-32.
Taylor, R. W., and Turnbull,
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ....................................................................... Error! Bookmark not defined.
Đặt vấn đề ......................................................... Error! Bookmark not defined. 1.
Mục tiêu ............................................................ Error! Bookmark not defined. 2.
Nội dung đề tài ................................................. Error! Bookmark not defined. 3.
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................... Error! Bookmark not defined.
43
Giới thiệu chung về ty thể .................................. Error! Bookmark not defined. 1.
1.1. Cấu tạo và chức năng của ty thể ........................... Error! Bookmark not defined.
1.1.1. Cấu tạo .............................................................. Error! Bookmark not defined.
1.1.2. Chức năng của ty thể ........................................ Error! Bookmark not defined.
Đặc điểm của ADN ty thể người và ứng dụng trong nghiên cứu ......... Error!
1.2. Bookmark not defined.
1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ty thể người .................... Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Vị trí và độ dài vùng gen điều khiển D – Loop Error! Bookmark not defined.
Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs) ...... Error!
1.3. Bookmark not defined.
1.3.1. Đa hình nucleotit đơn là gì? ............................. Error! Bookmark not defined.
1.3.2. Các vị trí SNP trên gen ..................................... Error! Bookmark not defined.
1.3.3. Ứng dụng và tầm quan trọng ............................ Error! Bookmark not defined.
1.4. Đột biến ty thể và bệnh ty thể ............................ Error! Bookmark not defined.
1.4.1. Đột biến ty thể trong vùng D – Loop ............... Error! Bookmark not defined.
1.4.2. Đột biến ty thể nằm ngoài vùng D – Loop ....... Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... Error! Bookmark not defined.
2.1. Vật liệu ................................................................. Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Phương pháp lấy mẫu ....................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Hóa chất ............................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2. Trang thiết bị ...................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3. Phần mềm tin sinh học ....................................... Error! Bookmark not defined.
2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................... Error! Bookmark not defined.
2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN từ móng tay ...... Error! Bookmark not defined.
2.4.2. Định lượng ADN tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế ................ Error! Bookmark not defined.
2.4.3. Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR ................ Error! Bookmark not defined.
2.4.4. Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F. Sanger Error! Bookmark not defined.
2.4.5. Phương pháp phân tích chất lượng dữ liệu trình tự ........ Error! Bookmark not defined.
2.4.6. Phương pháp tìm đột biến gen .......................... Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......... Error! Bookmark not defined.
Tách chiết ADN tổng số từ mẫu sinh phẩm ..... Error! Bookmark not defined. 3.1.
44
Nhân gen bằng phương pháp PCR ................... Error! Bookmark not defined. 3.2.
3.3. Kết quả giải trình tự gen .................................... Error! Bookmark not defined.
3.4. Kết quả phân tích đột biến ................................ Error! Bookmark not defined.
3.4.1. Các SNPs được công bố trên Ngân hàng Gen .. Error! Bookmark not defined.
3.4.2. Các vị trí đa hình (SNPs) ở HV1 trong vùng D – Loop của người Việt Nam Error! Bookmark not defined.
3.4.3. So sánh danh sách SNPs người Việt Nam và danh sách SNPs thống kê trên GenBank ........................................................................ Error! Bookmark not defined.
Các vị trí đa hình đặc trưng ở người Việt Nam và bệnh ty thể ........... Error!
3.5. Bookmark not defined.
Tỉ lệ đa hình các vị trí đa hình xuất hiện trong mẫu phân tích ........... Error!
3.6. Bookmark not defined.
CHƯƠNG IV – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN .................................................................. Error! Bookmark not defined.
KIẾN NGHỊ ................................................................. Error! Bookmark not defined.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 3
1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 3
2. Mục tiêu:............................................................................................................ 3
3. Nội dung đề tài: ................................................................................................. 3
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 5
1. Giới thiệu chung về ty thể ................................................................................ 5
Hình 1.1. Ty thể ............................................................................................................... 5
1.1. Cấu tạo và chức năng của ty thể ..................................................................... 5
1.1.1. Cấu tạo ..................................................................................................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc ty thể ............................................................................................... 6
1.1.2. Chức năng của ty thể................................................................................................. 6
Hình 1.3. Sơ đồ tổng hợp ATP trong ty thể .................................................................... 7
1.2. Đặc điểm của ADN ty thể người và ứng dụng trong nghiên cứu ................. 7
1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ty thể người ............................................................................... 7
Hình 1.4. Cấu trúc ty thể người ....................................................................................... 9
1.2.2. Vị trí và độ dài vùng gen điều khiển D – Loop ............................................................ 9
Hình 1.5. Vùng điều khiển D – Loop của ty thể người ................................................... 9
1.3. Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs) ............ 10
1.3.1. Đa hình nucleotit đơn là gì? ..................................................................................... 10
Hình 1.6. Đa hình nucleotit đơn ................................................................................. 10
1.3.2. Các vị trí SNP trên gen ............................................................................................ 10
1.3.3. Ứng dụng và tầm quan trọng ................................................................................. 11
Hình 1.7. Vị trí SNPs trong gen .................................................................................. 11
1.4. Đột biến ty thể và bệnh ty thể ........................................................................ 12
1.4.1. Đột biến ty thể trong vùng D – Loop ........................................................................ 12
1.4.2. Đột biến ty thể nằm ngoài vùng D – Loop ................................................................. 13
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 15
2.1.1.
Phương pháp lấy mẫu ................................................................................................ 15
2.1. Vật liệu ............................................................................................................. 15
2.1.2. Hóa chất .................................................................................................................. 15
Hình 2.1. Các bước tiến hành thu thập mẫu sinh phẩm ................................................ 15
46
2.2. Trang thiết bị .................................................................................................. 16
Bảng 2.1. Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ............................. 16
2.3. Phần mềm tin sinh học ................................................................................... 16
Bảng 2.2. Phần mềm sử dụng ........................................................................................ 17
2.4.1.
Phương pháp tách chiết ADN từ móng tay ................................................................... 17
2.4.2. Định lượng ADN tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế ........................................ 18
2.4.3. Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR ............................................................................ 18
2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 17
Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR .................................................................... 19
2.4.4.
Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F. Sanger .................................................. 21
Hình 2.3. Các bước của một chu kỳ PCR ...................................................................... 20
2.4.5.
Phương pháp phân tích chất lượng dữ liệu trình tự ........................................................ 22
Hình 2.4. Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger ......................... 22
Hình 2.5. Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự................................... 23
2.4.6.
Phương pháp tìm đột biến gen .................................................................................... 24
Hình 2.6. Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông ............. 24
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 25
3.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu sinh phẩm ................................................. 25
Bảng 3.1. Kết quả đo kiểm tra giá trị hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại 2 bước sóng 260 nm và 280 nm ...................................................................................................................... 25
3.2. Nhân gen bằng phương pháp PCR ............................................................... 25
Bảng 3.2. Thành phần dùng cho một phản ứng PCR .................................................... 27
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ..................................................................... 27
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D – Loop ............................................ 27
3.3. Kết quả giải trình tự gen ................................................................................ 28
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự trên một số mẫu sinh phẩm .......................................... 28
3.4. Kết quả phân tích đột biến ............................................................................ 28
3.4.1. Các SNPs được công bố trên Ngân hàng Gen ........................................................... 29
Bảng 3.4. Vị trí đa hình HV1 trong vùng D – Loop được công bố trên Ngân hàng Gen 29
3.4.2. Các vị trí đa hình (SNPs) ở HV1 trong vùng D – Loop của người Việt Nam ............... 30
Hình 3.3. Phần mềm NovoSNP khi phân tích mẫu ....................................................... 31
Bảng 3.5. SNPs được tìm thấy trong HV1 ở mẫu sinh phẩm Việt Nam (NovoSNPS) . 31
Hình 3.5. SNP tại vị trí 16381 ....................................................................................... 33
3.4.3.
So sánh danh sách SNPs người Việt Nam và danh sách SNPs thống kê trên GenBank 33
Hình 3.6. Bản đồ Venn tìm điểm đặc trưng và riêng của người Việt Nam ................... 34
Bảng 3.6. Các SNP đặc trưng ở người Việt Nam .......................................................... 34 47
3.5. Các vị trí đa hình đặc trưng ở người Việt Nam và bệnh ty thể ................. 34
3.6. Phần trăm đa hình trong mẫu phân tích ...................................................... 36
Hình 3.7. Kết quả phân tích đột biến trên nhóm người Việt Nam nghiên cứu ............. 36
Bảng 3.8. Phần trăm đa hình của 11 SNP đặc trưng của người Việt Nam .................... 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 38
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 38
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 39
1. Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol 4:289-333. ...................................................................................................................... 39
2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.Molecular Biology of the Cell. 4th edition, .... 39
Garland Science; 2002. .................................................................................................. 39
3. Barthelemy, C., de Baulny, H. O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):479- 87. 39
4. Berger, K. H., and Yaffe, M. P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance, Experientia 52(12):1111-6. ............................................................................................. 39
5. Bowmaker, M., Yang, M. Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H. T., Huberman, J. A., and Holt, I. J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9. ................................................................ 39
6. Brown, T. A., Cecconi, C., Tkachuk, A. N., Bustamante, C., and Clayton, D. A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light- strand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76. ........... 39
7. Butler, J.M., McCord, B.R., Jung, J.M., Wilson, M.R., Budowle, B., Allen, R.O. (1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser fluorescence. J. Chromatogr. B 658: 271-280 ............................................................. 39
8. Butler, J.M. and Levin, B.C. (1998) Forensic applications of mitochondrial DNA. Trends in Biotechnology 16: 158-162 ................................................................ 39
9. Chen, X. J., and Butow, R. A., 2005, The organization and inheritance of the mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25....................................................... 39
10. Cheng, Y. L., Chang, W. L., Lee, S. C., Liu, Y. G., Chen, C. J., Lin, S. Z., Tsai, N. M., Yu, D. S., Yen, C. Y., and Harn, H. J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci 75(13):1579-94. .............................................................................................................. 39
11. Clayton, D. A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life 55(4-5):213-7. ................................................................................................................. 40
48
12. Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland. ............................. 40
13. Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G. J., Pebay-Peyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9. ................................. 40
14. Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3 Pt 2):227s-255s. .............................................................................................................. 40
15. Evan, G. I., and Vousden, K. H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer, Nature 411(6835):342-8. .................................................................................... 40
16. Fliss, M. S., Usadel, H., Caballero, O. L., Wu, L., Buta, M. R., Eleff, S. M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science 287(5460):2017-9. ........................................................................ 40
17. Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M. C., 1992, Identifying individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8. ................................. 40
18. Goldstein, S., and Shmookler Reis, R. J., 1984, Genetic modifications during cellular aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30. ............................................................................ 40
19. Greenberg, B. D., Newbold, J. E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA, Gene 21(1-2):33-49. ....................................................................................................... 40
20. Hanahan, D., and Weinberg, R. A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70. 40
Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):1367- 80. 40
21. Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013, Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets 14(5):586-600. ......... 40
22. IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO Press Release. ................................................................................................................. 41
23. Lu, J., Sharma, L. K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15. ........ 41
24. Majamaa, K., Moilanen, J. S., Uimonen, S., Remes, A. M., Salmela, P. I., Karppa, M., Majamaa-Voltti, K. A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K. J., and Hassinen, I. E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population, Am J Hum Genet 63(2):447-54. ...................................................................................... 41
25. McFarland, R., Elson, J. L., Taylor, R. W., Howell, N., and Turnbull, D. M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is not good enough, Trends Genet 20(12):591-6. ................................................................ 41
26. McKinney, E. A., and Oliveira, M. T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA, Genet Mol Biol 36(3):308-315. ....................................................................................... 41
49
27. Miyazono, F., Schneider, P. M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S. E., Dienes, H. P., Aikou, T., and Hoelscher, A. H., 2002, Mutations in the mitochondrial
DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus, Oncogene 21(23):3780-3. ............................................................................................... 41
28. Mootha, V. K., Lindgren, C. M., Eriksson, K. F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M. J., Patterson, N., Mesirov, J. P., Golub, T. R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E. S., Hirschhorn, J. N., Altshuler, D., and Groop, L. C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes, Nat Genet 34(3):267-73. ................................................................................................. 41
29. Moraes, C. T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C., Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev Neurobiol 53:3-23. .......................................................................................................... 41
30. Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: an age-related alteration, J Neurol Sci 100(1- 2):14-21. ......................................................................................................................... 42
31. Nass, M. M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics. I. Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611. .............................. 42
32. Parkin, D. M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606. ......................................... 42
33. Petersen, K. F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D. L., DiPietro, L., Cline, G. W., and Shulman, G. I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2. ............................ 42
34. Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J. K., Markowitz, S. D., Trush, M. A., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3. ........................................ 42
35. Ralph, S. J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects Med 31(2):145-70. .......................................................................................................... 42
35. Reed, J. C., and Green, D. R., 2002, Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3. ................................... 42
36. Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta 81:448-61. ...................................................................................................................... 42
37. Shoubridge, E. A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum Mol Genet 10(20):2277-84. ............................................................................................. 42
38. Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures. V. Le systeme des cytochromes des mutants ‘petite colonie’, Annales de l'Institut Pasteur:47-63. 42
50
39. Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the ADN ty thể control region are mutational hotspots, Am J Hum Genet 67(4):1029-32. .................................................... 43
Taylor, R. W., and Turnbull, ........................................................................................... 43
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ........................................ 16
Bảng 2.2. Phần mềm sử dụng ................................................................................................ 17
Bảng 3.1. Kết quả đo kiểm tra giá trị hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại 2 bước sóng 260 nm và 280 nm ................................................................................................................................. 25
Bảng 3.2. Thành phần dùng cho một phản ứng PCR ......................................................... 27
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ........................................................................... 27
Bảng 3.4. Vị trí đa hình HV1 trong vùng D – Loop được công bố trên Ngân hàng Gen 29
Bảng 3.5. SNPs được tìm thấy trong HV1 ở mẫu sinh phẩm Việt Nam (NovoSNPS)...... 31
Bảng 3.6. Các SNP đặc trưng ở người Việt Nam ................................................................. 34
Bảng 3.7. Một số bệnh ty thể liên quan đến đột biến điểm trong vùng HV1 .................... 35
Bảng 3.8. Phần trăm đa hình của 11 SNP đặc trưng của người Việt Nam ....................... 36
51
52
53
.
