Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan bằng kĩ thuật long PRC và so sánh quan hệ di truyền giữa chó có xoáy lưng Thái Lan và Phú Quốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Huỳnh Thị Bích Liễu

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI HỆ GEN TY THỂ CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN BẰNG KĨ THUẬT LONG-PCR VÀ SO SÁNH QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Huỳnh Thị Bích Liễu

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI HỆ GEN TY THỂ CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN BẰNG KĨ THUẬT LONG-PCR VÀ SO SÁNH QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu và các kết quả

nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình

nào khác.

Tác giả

Huỳnh Thị Bích Liễu

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm

ơn sâu sắc đến TS. Trần Hoàng Dũng – người Thầy đã tận tụy, hết lòng quan tâm,

hướng dẫn và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất. Trong suốt quá trình

làm đề tài Thầy luôn nhắc nhở, sửa chữa những sai sót, tạo điều kiện cho tôi hoàn

thành luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy TS. Chung Anh Dũng thuộc phòng

Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tình

hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này.

Xin trân trọng biết ơn quý Thầy, Cô thuộc Khoa Sinh học và Phòng Đào tạo Sau Đại

học – Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt

quá trình học tập.

Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam

và Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại Viện. Cảm ơn các

anh, chị, em, bạn bè thuộc phòng Genome & Bioinformatics - Viện Kĩ thuật Công

nghệ cao - Trường ĐH Nguyễn Tất Thành và Phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa

học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận

văn.

Cuối cùng tôi xin gởi đến ba mẹ - người luôn ở bên cạnh tôi trong những lúc khó khăn

nhất - lòng biết ơn sâu sắc. Ba mẹ cho con niềm tin, nghị lực trong cuộc sống cũng

như động viên và hỗ trợ cho con mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014

Tác giả

Huỳnh Thị Bích Liễu

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các từ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục hình ảnh

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 2

3.1. Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số của mẫu chó Thái Lan. ........................................................................................................................ 2

3.2. Nội dung 2: Xây dựng quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR............................................................................ 2

3.3. Nội dung 3: Giải và hiệu chỉnh trình tự năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan ........................................................................................................... 2

3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh chủng loài dựa vào trình tự các gen. ........................................................................................... 2

4. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 3

Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 5

1.1.Giới thiệu về giống chó Phú Quốc-Nguồn gốc giống chó Phú Quốc Việt Nam ... 5

1.1.1. Phân loại ...................................................................................................... 5

1.1.2. Đặc điểm chung của chó có xoáy Phú Quốc ............................................... 6

1.1.3. Nghi vấn về nguồn gốc của giống chó Phú Quốc Việt Nam ...................... 6

1.2. Đặc điểm chung của chó có xoáy Thái Lan ................................................... 8

1.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài dựa trên

trình tự hệ gen ty thể .................................................................................................. 10

1.3.1. Đặc điểm và cơ chế di truyền của hệ gen ty thể động vật hữu nhũ .......... 10

1.3.2. Ứng dụng của hệ gen ty thể trong nghiên cứu tiến hóa và phát sinh chủng ................................................................................................................... 11 loài

1.3.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài chó dựa trên toàn bộ trình tự hệ gen ty thể .................................................................... 12

Chương 2. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP .................................................................. 20

2.1. Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu ....................................................... 20

2.1.1. Vật liệu và hóa chất ................................................................................... 20

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 23

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 23

2.2.1. Phương pháp thu mẫu và tách DNA tổng số ............................................. 23

2.2.2. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................... 27

2.2.3. Khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................................................................................. 27

2.2.4. Phương pháp giải trình tự .......................................................................... 33

2.2.5. Hiệu chỉnh trình tự .................................................................................... 33

2.2.6. So sánh với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen ........................................... 35

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 37

3.1. Thu thập mẫu ...................................................................................................... 37

3.2. Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số .................................................... 37

3.3. Định loại kiểu đơn bội chó có xoáy Thái Lan bằng trình tự vùng kiểm soát .. 41

3.3.1. Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại vùng kiểm soát ................................ 41

3.3.2. Kết quả giải và phân tích trình tự DNA vùng kiểm soát ........................... 42

3.3.3. Định loại kiểu đơn bội cho chó có xoáy lưng Thái Lan ............................ 45

3.4. Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kĩ thuật

Long-PCR .................................................................................................................. 48

3.4.1. Xây dựng quy trình phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1 ........................... 49

3.4.2. Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại mảnh 2 và mảnh 3 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan ..................................................................................... 51

3.5. Giải và phân tích trình tự hệ gen ty thể chó Thái Lan mang kiểu đơn bội A11 ..

.......................................................................................................................... 54

3.5.1. Thu nhận và hiệu chỉnh kết quả giải trình tự ............................................... 56

3.5.2. Lắp ráp các trình tự đã hiệu chỉnh ............................................................... 58

3.5.3. Phân tích phát sinh loài ................................................................................ 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 64

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phương pháp hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự các gen của hệ gen ty thể

Phụ lục 2. Phương pháp sơ bộ xác định tên loài của các trình tự DNA vùng D-loop bằng thuật toán BLAST

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Microgram µg

Microlit µL

BLAST Local Alignment Search Tool

Base pair Bp

DNA Deoxyribonucleic acid

DNAse Deoxyribonuclease

Deoxyribonucleotide triphosphate dNTP

Ethylenediamine tetraacetate EDTA

Eppendorf Ep

Forward F

Federation Cynologique International FCI

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

Kb Kilo base

mtDNA Mitochondrial DNA

NCBI National Center for Biotechnology Information

Polymerase Chain Reaction PCR

Reverse R

Ribonuclease RNA

Ribonuclease RNAse

rRNA Ribosomal RNA

tRNA Transport RNA

SDS Sodium dodecyl sulfate

SSC buffer Sodium clorua NaCl, Sodium Citrate C6H5Na

TBE Tris Borate EDTA

TE Tris EDTA

Melting Temperature Tm

U Unit

UV Ultraviolet

V Volume

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Hóa chất tách chiết DNA .............................................................................. 20

Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng trong kĩ thuật PCR ........................................................... 21

Bảng 2.3. Hóa chất điện di ............................................................................................ 21

Bảng 2.4. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 22

Bảng 2.5. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D-

loop) ............................................................................................................................... 28

Bảng 2.6. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop) .... 29

Bảng 2.7. Chu trình nhiệt khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop) ................................... 29

Bảng 2.8. Các cặp mồi khuếch đại cho phản ứng PCR ................................................. 30

Bảng 2.9. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng

Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes .................................... 30

Bảng 2.10. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 1 hệ gen ty thể

chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes ....... 31

Bảng 2.11. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 1 .................................................... 31

Bảng 2.12. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2, mảnh 3 lần 1 ...................................... 31

Bảng 2.13. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 2 hệ gen ty thể

chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes ....... 32

Bảng 2.14. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 2 .................................................... 32

Bảng 2.15. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2 lần 2 .................................................... 32

Bảng 2.16. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 3 lần 2 .................................................... 33

Bảng 3.1. Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình FBI ............ 38

Bảng 3.2. Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình có hiệu chỉnh

....................................................................................................................................... 38

Bảng 3.3. Kết quả đo quang của 11 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu cho Thái Lan ..... 40

Bảng 3.4 Ba cặp mồi để khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan ..................... 49

Bảng 3.5. Thông tin về năm gen mã hóa protein trong nghiên cứu .............................. 55

Bảng 3.6. Chín cặp mồi dành để giải trình tự các vùng gen trong nghiên cứu ............. 55

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1. Chó có xoáy lưng Phú Quốc ............................................................................ 5

Hình 1.2. Các dạng xoáy lông trên sống lưng chó Phú Quốc ......................................... 6

Hình 1.3. Chó có xoáy lưng Thái Lan ............................................................................. 9

Hình 1.4. Cấu trúc ty thể ............................................................................................... 11

Hình 1.5 Các trình tự hệ gen ty thể chó được đăng ký trên NCBI ................................ 14

Hình 2.1. Vị trí bắt cặp của mồi 15412F và 16625R trên vùng kiểm soát (D-loop) ..... 28

Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 14 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu chó

Thái Lan ......................................................................................................................... 40

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của chó có xoáy lưng Thái Lan

....................................................................................................................................... 42

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của 8 mẫu chó có xoáy lưng

Phú Quốc ....................................................................................................................... 42

Hình 3.4. Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi

15412F ........................................................................................................................... 43

Hình 3.5. Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi

16625R ........................................................................................................................... 43

Hình 3.6. Đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát chó có xoáy lưng Thái Lan ........... 44

Hình 3.7. Đại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của 3/8 mẫu khảo sát

....................................................................................................................................... 44

Hình 3.8. Kết quả BLAST của mẫu Thái Lan trên NCBI ............................................. 45

Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loài sử dụng phương pháp Neighbor-Joining. Mô hình

tiến hóa là Kimura hai thông số với phân bố Gamma là 4. Phép phân tích dựa trên 181

trình tự bao gồm 531 nucleotides .................................................................................. 47

Hình 3.10. Sơ đồ hệ thống các cặp mồi khuếch đại các mảnh gen ty thể chó Thái Lan

và vị trí các gen cần giải trình tự ................................................................................... 49

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1 lần 1 hệ gen ty thể chó Thái Lan .. 50

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1lần 2 hệ gen ty thể chó Thái Lan ... 51

Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 1 .............................................. 52

Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 1 .............................................. 52

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 2 ............................................. 53

Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 2 .............................................. 54

Hình 3.17. Dữ liệu DNA ty thể chó thuộc kiểu đơn bội A11 ........................................ 55

Hình 3.18. Biểu đồ huỳnh quang với các đỉnh huỳnh quang nền ................................. 57

Hình 3.19. Biểu đồ huỳnh quang có base không rõ ràng .............................................. 58

Hình 3.20. Biểu đồ huỳnh quang có cường độ tín hiệu thấp ......................................... 58

Hình 3.21. Trình tự đồng nhất của chó có xoáy lưng Thái Lan trên phần mềm SeaView

....................................................................................................................................... 59

Hình 3.22. Cây tiến hóa dựng bằng thuật toán Maximum-Likehood từ trình tự 5 gen

ND1, ND2, ATP8, ND4 và CYTB có tổng chiều dài 4832 bp của 77 trình tự. ............ 61

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Trên thế giới hiện nay có khoảng hơn 400 loài chó, trong đó có ba giống chó có

xoáy lưng là: chó lông xoáy Rhodesia ở Nam Phi, chó lông xoáy Thái Lan và chó lông

xoáy Phú Quốc Việt Nam. Chó Phú Quốc là giống chó đặc hữu của vùng biển Phú

Quốc tỉnh Kiên Giang, Việt Nam, là giống chó đẹp, thông minh, trung thành và dũng

mãnh. Nó từ xa xưa đã giúp đỡ con người trong việc đi săn và canh gác. Tuy nhiên,

chó xoáy Phú Quốc vẫn chưa có nguồn gốc rõ ràng, có rất nhiều tranh cãi xung quanh

nguồn gốc của chó Phú Quốc

Các nhà khoa học nước ta có đưa ra những bằng chứng lịch sử để chứng minh

chó lông xoáy Phú Quốc là loài chó đặc hữu của Việt Nam, nhưng điều này không có

tính thuyết phục cao. Vì các bằng chứng được đưa ra chỉ dựa vào những đặc điểm hình

thái bên ngoài. Do đó, việc xác định nguồn gốc chó xoáy Phú Quốc được các nhà khoa

học rất quan tâm. Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã trở thành công cụ

hữu hiệu trong việc xác định nguồn gốc và mối quan hệ di truyền của các sinh vật.

Từ năm 2012, Phòng Genomics & Bioinformatic, Trường Đại học Nguyễn Tất

Thành đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể chó Phú Quốc để

đánh giá độ đa dạng di truyền chó Phú Quốc giống tại Tp. Hồ Chí Minh” cho ra nhiều

kết quả nổi bật. Theo đó Chó lưng xoáy Phú Quốc mang kiểu gen đơn bội (haplotype)

dạng E là dạng rất hiếm trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) phân bố hạn hẹp ở khu vực

Đông Á như ShiBa Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang

Triều tiên. Hơn nữa, nghiên cứu hệ gen ty thể của chó Phú Quốc, nhóm nghiên cứu

còn thấy, hệ gen ty thể chó Phú Quốc có mức độ tương đồng đến 98% với hệ gen ty

thể chó sói xám. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các tác giả chưa phân tích hệ gen ty

thể của chó lưng có xoáy Thái Lan để tìm hiểu quan hệ nguồn gốc giữa chó lưng có

xoáy Thái Lan và lưng có xoáy Phú Quốc.

Để có thêm những bằng chứng chứng minh sự phát triển song song của hai loài

chó này cần có những nghiên cứu sâu hơn về chó có xoáy Thái Lan. Do vậy chúng tôi

muốn giải trình tự hệ gen ty thể chó lưng có xoáy Thái Lan để so sánh với hệ gen ty

thể chó lưng có xoáy Phú Quốc, nhằm tìm quan hệ phát sinh chủng loài của hai loài có

hình thái bên ngoài tương cận nhau này.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình khuếch đại toàn bộ hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan

bằng kĩ thuật Long-PCR để thu thập dữ liệu phân tử nhằm phân tích quan hệ di truyền

giữa chó có xoáy lưng Thái Lan và Phú Quốc.

Nội dung nghiên cứu 3.

3.1. Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số của mẫu chó

Thái Lan.

3.2. Nội dung 2: Xây dựng quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể

chó Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR

- Nghiên cứu các cặp mồi phổ quát để khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó

có xóay Thái Lan.

- Nghiên cứu chuẩn hóa điều kiện phản ứng khuếch đại các mảnh của hệ gen ty

thể chó có xoáy Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR.

3.3. Nội dung 3: Giải và hiệu chỉnh trình tự năm gen của hệ gen ty thể chó có

xoáy Thái Lan

- Giải trình tự của năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan.

- Hiệu chỉnh kết quả giải trình tự.

- Tích hợp các kết quả giải trình tự.

3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan

hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh

chủng loài dựa vào trình tự các gen.

- Thiết lập bộ cơ sở dữ liệu gồm các trình tự hệ gen ty thể chó cho phân tích.

- Xác định tính đa hình dựa trên một nucleotide đơn lẻ (SNP) của các trình tự các

gen của hệ gen ty thể chó Thái Lan đã giải trình tự.

- Xây dựng cây phát sinh chủng loài bằng thuật toán Maximum-Likelihood, thuật

toán Neighbour-Joining, thuật toán Maximum Parsimony, thuật toán Bayes.

- Tổ hợp các kết quả phát sinh chủng loài và tính toán giá trị bootstrap.

- Phân tích khoảng cách di truyền và hình dạng của cây phát sinh loài, xác định

mối quan hệ di truyền giữa giống chó có xoáy Phú Quốc Việt Nam và giống

chó có xoáy Thái Lan.

Phạm vi nghiên cứu 4.

- Chó lưng có xoáy Thái Lan thu thập tại thành phố Hồ Chí Minh.

- Hệ gen ty thể của chó lưng có xoáy Thái Lan.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về giống chó Phú Quốc-Nguồn gốc giống chó Phú Quốc Việt

Nam

1.1.1. Phân loại

Trong hệ thống phân loại sinh giới, chó có vị trí phân loại như sau:

Giới: Animalia (Động vật)

Phân giới: Metazoa (Động vật đa bào)

Ngành: Chordata (Có dây sống)

Phân ngành: Vertebrata (Động vật có xương sống)

Lớp: Mammalia (Thú)

Bộ: Carnivora (Ăn thịt)

Họ: Canidae (Chó)

Phân họ: Caninae (Chó)

Giống: Canis Linnaeus, 1758 (Chó)

Loài: Canis lupus Linnaeus, 1758 (Chó)

Phân loài: Canis lupus familiaris Linnaeus, 1758 (Chó nhà)

Hình 1.1. Chó có xoáy lưng Phú Quốc (Nguồn: phongkhamthuyac.com)

1.1.2. Đặc điểm chung của chó có xoáy Phú Quốc

Chó Phú Quốc là một loại chó của đảo Phú Quốc thuộc tỉnh Kiên Giang Việt

Nam. Chó Phú Quốc là giống chó quý với nhiều đặc tính nổi bật mà những giống chó

khác không có như: thông minh, nhanh nhẹn,trung thành, dũng mãnh, có khả năng đi

săn và canh gác tốt. Ngoại hình có tầm vóc trung bình, dáng cao thon, lông ngắn, dày

và sát, thân thường nổi lên những bắp cơ ở vùng đùi trước và đùi sau, đuôi vót thon và

cong lên, chó có mõm dài, thường có màu đen, mắt sang, tai nhỏ và đứng. Bốn chân

cao, bàn chân có màng thích hợp cho việc bơi lội dưới nước.

Về màu lông, chó Phú Quốc có nhiều màu sắc khác nhau như: đen, nâu, vàng,

vện, xám và các màu khác. Nhưng màu phổ biến nhất là đen và vàng chiếm đến 60%.

Điểm nổi bật nhất của chó Phú Quốc là các xoáy lông trên sống lưng, có nhiều hình

dạng các xoáy lưng khác nhau như hình kim, hình mũi tên, hình quả lựu….(như hình

1.2).

Hình 1.2. Các dạng xoáy lông trên sống lưng chó Phú Quốc (http://dogsinvietnam.com/diendan/showthread.php?p=36847)

1.1.3. Nghi vấn về nguồn gốc của giống chó Phú Quốc Việt Nam

Chó Phú Quốc là một trong 3 dòng chó có xoáy lưng trên thế giới. Hai loại chó

có xoáy lưng còn lại là chó xoáy Rhodesia Châu Phi và chó xoáy Thái Lan. Tuy nhiên,

hiện nay chó có xoáy lưng trên thế giới chỉ có hai giống đó là Rhodesia Châu Phi và

chó xoáy Thái Lan được Liên đoàn Các hiệp hội nuôi chó giống quốc tế (Federation

Cynologique International - FCI) công nhận, trong đó chó Phú Quốc được đề cập

chung với chó xoáy Thái Lan, được xem là có nguồn gốc từ chó xoáy Thái Lan [1],

[39].

Giống chó có xoáy lưng gần nước ta nhất là chó xoáy Thái Lan. Chó xoáy Thái

Lan là giống chó đã có từ rất lâu đời, được ghi nhận xuất hiện từ 350 năm trước. Nó có

nguồn gốc xuất phát từ miền Đông Thái Lan và nó được dùng để đi săn thú, dẫn đường

và giữ nhà. Chó này cho đến nay vẫn giữ được kiểu hình gốc do điều kiện lưu thông ở

khu vực này một thời rất khó khăn, nên chúng rất ít có điều kiện lai với các giống chó

khác. Chó xoáy Thái Lan có tầm vóc vừa, lông ngắn và có một xoáy trên lưng, chó có

chiều dài dài hơn chiều cao, mũi đen, với chó màu lông nâu vàng thì có mõm đen, đuôi

vót và cong lên như cái liềm. Các cơ bắp phát triển tốt, cấu trúc cơ thể phù hợp cho

việc hoạt động. Chó có nhiều màu lông khác nhau như đỏ hạt dẻ, đen tuyền, bạc hay

nâu vàng. Khối lượng bình quân chó đực 25 kg, con cái 22 kg [1].

Chó Rhodesia có nguồn gốc từ Châu Phi, giống chó rất lớn con, khối lượng trung

bình 38 kg ở con đực, 31 kg ở con cái, người ta chưa thấy bằng chứng nào có liên hệ

giữa chó Rhodesian và chó Phú Quốc ngoài xoáy trên lưng [1].

Đối với chó Phú Quốc thì cho tới nay có rất ít tư liệu ghi chép lại. Đào Văn Tiến,

1977 cho rằng chó Phú Quốc (Canis dingo) có nguồn gốc của chó Dingo ở Châu Úc,

nhưng hiện nay có lẽ đã tuyệt chủng. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây của Oskarsson

năm 2012 [22] cho thấy chó hoang Dingo Úc và chó Polynesia có nguồn gốc từ chó ở

Châu Á du nhập vào, nên chó hoang Dingo không thể là tổ tiên của chó Phú Quốc. Hai

nhà khoa học người Mỹ là Merle Wood và Merle Hidinger cho rằng trong quá khứ chỉ

có chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Rhodesian của Nam Phi là có dải lông xoáy trên

lưng, vì vậy chó Phú Quốc phải có nguồn gốc từ có xoáy Thái Lan. Họ còn nói hơn

400 năm trước, các ngư dân Thái Lan đã mang chó xoáy Thái Lan đến đảo Phú Quốc

và đã trở thành tổ tiên của chó Phú Quốc ngày nay [40]. Giáo sư Dư Thanh Khiêm,

Viện trưởng Viện giáo dục Woluwe SaintPierre ở Brussel (Bỉ), một chuyên gia tìm

hiểu về chó xoáy Phú Quốc hơn 30 năm không đồng ý với giả thuyết này. Ông cho

biết tất cả các cuộc hành trình của người Thái Lan đều được mô tả lại trong cuốn sách

‘Abrégé del‘histoire Générale des Voyages’ bởi Jean-Francoise de la Harpe, một thành

viên của hội các học giả Pháp, xác nhận rằng việc các ngư dân Thái có đến đảo Phú

Quốc không thấy ghi chép trong quyển sách này.

Ngoài ra, khi so sánh về đặc điểm hình thái cho thấy có sự khác biệt giữa chó

xoáy Thái Lan và chó Phú Quốc. Chó Thái có khối lượng trung bình khoảng 23 kg,

cao 55 cm, trong khi chó Phú Quốc có khối lượng lớn nhất chỉ 18 kg và cao 48 cm.

Nếu suy luận theo giả thuyết nguồn gốc của chó Phú Quốc là từ những con có xoáy

Thái Lan do ngư dân Thái Lan mang đến và để lại trên đảo Phú Quốc, thì với điều kiện

tự nhiên của đảo Phú Quốc, một hòn đảo có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn

tài nguyên rừng nhiệt đới với nhiều giống loài đa dạng thì nguồn thức ăn cho chó xoáy

Thái Lan lưu lại trên Phú Quốc là dồi dào, và chó xoáy Thái Lan sẽ không có sự biến

đổi về hình dáng nhỏ gọn hơn để phù hợp với việc săn mồi trên đảo Phú Quốc như

hình dáng của chó Phú Quốc hiện nay. Vì vậy, giả thuyết trên là không phù hợp. Rất

có thể, với những nghiên cứu sâu hơn nữa, cho biết được chó Phú Quốc có thể có một

sự phát triển song song với chó xoáy Thái Lan, và muốn biết chính xác hơn thì phải

phân tích DNA mới có thể xác định được mối quan hệ của các giống chó này [40],

[41], [42].

1.2. Đặc điểm chung của chó có xoáy Thái Lan

Chó có xoáy lưng Thái Lan có kích thước trung bình, với lông ngắn và có một

dải lông mọc ngược trên lưng. Chúng có dáng cao, chiều dài thân dài hơn so với chiều

cao tới vai, cơ thể lực lưỡng, gọn gàng. Về kích thước, con đực cao khoảng 56 - 60

cm, nặng 23 - 34 kg, con cái cao từ 51 - 56 cm. Đây là giống chó rất khỏe mạnh, sống

lâu khoảng 12-13 năm.

Xương sọ phẳng ở khu vực giữa hai tai nhưng hơi cong nhẹ khi nhìn từ bên cạnh,

trán có nếp nhăn, điểm tiếp giáp giữa sống mũi và trán rõ ràng, gập vừa phải, mũi có

màu đen, sống mũi thẳng và dài, mõm có hình chữ V, hơi ngắn so với chiều dài sọ,

hàm trên và hàm dưới đều rất khỏe, răng trắng và khỏe, răng cắn hình cắt kéo, tai to

rộng, vểnh lên, hình tam giác và hướng về phía trước, mắt có hình quả hạnh, có màu

nâu tối. Chúng có lưng thẳng, hông rộng, ngực sâu tới khuỷu chân trước, xương sườn

rất sít. Cổ dài vừa phải, mạnh mẽ làm cho đầu ngẩng cao, đuôi hơi cong.

Hình 1.3. Chó có xoáy lưng Thái Lan

(http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%B3_l%C3%B4ng_xo%C3%A1y_Th%C3%A1i_ Lan) Chân trước thẳng, cổ chân thẳng khi nhìn từ phía trước và hơi gập khi nhìn từ

bên. Bàn chân hình oval. Bắp đùi phát triển và có đùi sau dốc. Khuỷu chân sau mạnh

mẽ và ngắn. Bước chạy giữ cho thân mình ổn định, không nhấp nhô. Bước chân chạy

song song ở ở tốc độ bình thường. Khi nhìn từ phía trước, chân trước chuyển động lên

xuống trên một đường thẳng, do đó bả vai, khuỷu chân trước và cổ chân dường như

thẳng hàng với nhau. Khi nhìn từ phía sau, đùi sau và xương hông gần như thẳng hàng.

Khi chuyển động, chân của chúng chạy theo một đường thẳng, bàn chân không đá vào

trong cũng như ra ngoài, do đó làm cho bước chạy dài và rất mạnh mẽ.

Da mềm, mượt và căng. Cổ không có diềm cổ. Lông ngắn và mượt. Có các màu:

đỏ, đen, xanh xám và vàng nhạt. Bờm lưng ở trên sống lưng được tạo thành từ dải lông

mọc ngược so với phần lông còn lại. Do đó nó nổi bật rất rõ trên lưng [44].

1.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài dựa

trên trình tự hệ gen ty thể

1.3.1. Đặc điểm và cơ chế di truyền của hệ gen ty thể động vật hữu nhũ

Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể

chiếm tỷ lệ từ 1 – 5% DNA của tế bào. Kích thước của hệ gen ty thể (mtDNA) ở phần

lớn động vật hữu nhũ vào khoảng 16 đến 17,5 kb. Người ta đã đưa ra nhiều giả thuyết

về nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể. Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất là hệ

gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ (α-proteobacterium), sống cộng

sinh bên trong tế bào sinh vật nhân chuẩn.

Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến

hàng triệu ty thể nên số lượng DNA ty thể là rất lớn. Với số lượng bản sao lớn như vậy

nên có thể thu được DNA ty thể có giá trị cho các phân tích quan hệ di truyền từ một

số lượng ít tế bào [24].

DNA ty thể có những đặc điểm cơ bản sau:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 10 - 25 lần so với hệ gen nhân

- Số lượng bản sao lớn

- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp

- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài

Hình 1.4. Cấu trúc ty thể (http://biology.tutorvista.com/animal-and-plant-cells/mitochondria.html)

Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 10 – 25 lần so với các gen nhân do

cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị DNA trong

ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài. Bên cạnh đó, các biến dị này

không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau.

MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có

nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo

dòng mẹ. Thêm vào đó, mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào. Các

đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do

có cấu trúc dạng vòng, nên mtDNA được sử dụng như một công cụ phân tử trong việc

phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có

nhiều thuận lợi [24].

1.3.2. Ứng dụng của hệ gen ty thể trong nghiên cứu tiến hóa và phát sinh chủng

loài

MtDNA của hầu hết các loài động vật được di truyền theo dòng mẹ thông qua tế

bào chất của noãn bào, không tái tổ hợp và tiến hóa nhanh chóng. Trong quá trình hình

thành hợp tử, tinh trùng cung cấp cho trứng hệ gen nhân của nó, không cung cấp hoặc

đóng góp rất ít tế bào chất, mtDNA vào hợp tử. Kết quả là hầu như tất cả ty thể trong

phôi đều có nguồn gốc từ trứng. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh trùng bị loại bỏ

ngay sau khi vào trứng. Một số cơ chế được đưa ra nhằm giải thích hiện tượng thú vị

này đó là: do sự phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin, do hiện tượng pha loãng, phân

hủy mtDNA của tinh trùng, do sự khác nhau về trao đổi chất giữa hợp tử và tinh trùng.

Tuy nhiên, những cơ chế này vẫn chưa phải là những lời giải thích thỏa đáng và thật

sự thuyết phục.

Ty thể là bào quan dưới mức độ tế bào của gần như tất cả các sinh vật nhân

chuẩn, nó có nguồn gốc từ α-Proteobacteria đã cư trú bên trong tế bào của một dòng

sinh vật nhân chuẩn đầu tiên nào đó [16]. Ty thể còn chứa bộ gen riêng biệt đã bị thu

nhỏ đi rất nhiều của chúng; chúng vẫn còn có hệ thống phiên mã, xử lý thông tin, và

dịch mã tách biệt với phần còn lại của tế bào chất. Đối với động vật, các bộ gen ty thể

hầu như luôn luôn ở dạng vòng. Chúng thường chứa một tập hợp gồm 37 gen mã hóa

13 gen protein, 2 rRNAs và 22 tRNA. Thông thường chúng có kích thước khoảng 16

kb, và vì thế có mật độ gen dày đặc và không có các intron ngoại trừ Canidarians có

thêm 1 gen ngoại lệ, tương đồng với gen mutS vi khuẩn. Ở một số loài tất cả các gen

đều nằm trên một mạch, ở một số hệ gen ty thể khác chúng phân bố ở cả hai mạch.

Trong vài trường hợp, người ta nhận thấy sự phiên mã tạo đã ra một bản sao cho mỗi

mạch DNA để sau đó chúng bị enzym cắt thành các gen RNA đặc biệt [10].

1.3.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài chó dựa

trên toàn bộ trình tự hệ gen ty thể

Kể từ năm 1998, khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể chó được giải mã và công bố

lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể chó đã và đang được phát triển tương đối

rộng rãi với hơn 250 trình tự được đăng ký trên GenBank (Hình 1.5). Trình tự hệ gen

ty thể chó đã được sử dụng thành công trong ngành khoa học pháp y, xác định nguồn

gốc của chó và nhiều ứng dụng khác. Những dữ liệu này góp phần giúp hiểu rõ hơn về

quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống chó. Dưới đây là một vài

nghiên cứu cụ thể được tiến hành trên một số loài thuộc Họ Chó (Caniae).

Trình tự toàn bộ hệ gen ty thể chó đầu tiên đã được Kim và cộng sự xác định và

công bố năm 1998 và được đăng ký trên GenBank với số đăng ký là NC-002008.

Chiều dài của hệ gen ty thể chó là 16.728 bp. Tuy nhiên, chiều dài này là không tuyệt

đối do biến thể (heteroplasmy) gây ra bởi số lần lặp lại khác nhau của motif 5’-

GTACACGT(A/G)C-3’ trong vùng điều khiển. Tổ chức bộ gen, thành phần gen và sự

sử dụng codon giống với những bộ gen ty thể của động vật có vú khác. Hai rRNA và

13 gen mã hóa protein từ mèo, chó và hải cẩu được so sánh để xác định sự khác biệt có

thể có giữa các mtDNA trong động vật ăn thịt. Những khác biệt trong sự kết hợp phân

tử trong hai gen rRNA cũng như trong các trình tự acid amine được suy đoán của 13

gen mã hóa protein của ty thể, cho thấy mối quan hệ giữa chó và hải cẩu gần hơn so

với mối quan hệ giữa một trong hai con này với mèo. Dựa trên sự khác biệt phân tử

của mtDNA, sự phân kỳ tiến hóa giữa mèo, chó và hải cẩu được xác định niên đại

khoảng 50 ± 4 triệu năm trước. Sự đa dạng về các đặc điểm như kích thước, cấu tạo và

bộ lông của chó nhà phản ánh không chỉ cường độ lựa chọn nhân tạo mà còn về cơ

bản là đa dạng di truyền trong cấu trúc quần thể.

Hình 1.5. Các trình tự hệ gen ty thể chó được đăng ký trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Chó nhà có lẽ là động vật được thuần hóa đầu tiên, và là động vật duy nhất lan

truyền sang tất cả các châu lục trong thời cổ đại. Chó là một trong những loài động vật

có kiểu hình đa dạng nhất, một kết quả của sự lựa chọn nhân tạo trong suốt chiều dài

lịch sử của nó. Những nghiên cứu về nguồn gốc di truyền và sự lan truyền ban đầu của

chó nhà không chỉ rất quan trọng để thu thập thông tin về cơ chế sinh học và văn hóa

sau thuần hóa mà còn để điều tra lịch sử ban đầu của nhân loại [22].

Năm 1999, Vila và cộng sự nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài, sự tiến hóa

và đa dạng di truyền của chó nhà. Ở nghiên cứu này, dữ liệu di truyền phân tử trong

quá khứ có liên quan được xem xét để tìm hiểu nguồn gốc và các mối quan hệ phát

sinh loài của con chó. Dữ liệu lai DNA – DNA cho thấy rằng họ chó Candidae tách ra

khoảng 50 triệu năm trước từ các loài động vật ăn thịt khác. Ngược lại, các Canid hiện

tại có liên quan chặt chẽ và phân tách từ một tổ tiên chung khoảng 10 triệu năm trước.

Các bằng chứng xác minh mối quan hệ thân thiết của con chó với con sói xám là rất

nhiều. Tuy vậy, con chó có sự khác nhau đáng kể trong gen ty thể và gen nhân của

chúng. Phân tích DNA ty thể cho thấy nguồn gốc của chó cổ xưa hơn so với thời điểm

được xác định bởi các hóa thạch. Ngoài ra, chó có nguồn gốc từ con sói hoặc giao phối

với những con sói trong lịch sử của chúng tại những thời điểm khác nhau và tại những

nơi khác nhau. Tiến hành phân tích sự đa dạng mtDNA trong quần thể chó

Xoloitzcuintli (một loài chó không lông có nguồn gốc Mêxicô) để kiểm tra khả năng

thuần hóa độc lập của giống chó này. Giống chó hiếm này được cho là đã được giữ

cách ly trong hàng ngàn năm và có thể là một trong những giống chó cổ xưa nhất ở

Bắc Mỹ. Kết quả thu được không ủng hộ sự một thuần hóa tại Châu Mỹ của chó

Xoloitzcuintli, cũng không ủng hộ một sự kết hợp giữa chó Xoloitzcuintli với những

giống chó không có lông khác. Mặc dù có kiểu hình giống nhau, quần thể chó

Xoloitzcuintli có một mức độ thay đổi trình tự mtDNA cao đáng ngạc nhiên. Các

giống chó khác cũng rất đa dạng về mặt di truyền, cho thấy các giống chó thường được

hình thành với một số lượng lớn các con chó từ các quần thể giao phối xa [33].

Nguồn gốc của chó nhà từ chó sói đã được xác định, nhưng số lượng các sự kiện

hình thành, cũng như ở đâu và khi nào những việc này xảy ra thì không được biết đến.

Để giải quyết những câu hỏi này, năm 2002, Savolainen và cộng sự đã kiểm tra những

biến đổi trình tự DNA ty thể (mtDNA) trong 654 con chó nhà đại diện cho tất cả các

quần thể chó lớn trên toàn thế giới. Các dữ liệu cho thấy nguồn gốc chó nhà bắt nguồn

từ vài con sói cái, hơn 95% của tất cả các trình tự mtDNA thuộc về ba nhóm phát sinh

loài phổ biến điển hình ở những tần số tương tự nhau, cho thấy tất cả các quần thể chó

đều có một nguồn gốc chung. Tính toán cho thấy, sự đa dạng di truyền của quần thể

chó ở Đông Á khá lớn so với các vùng khác và phân tích phát sinh loài cho thấy giả

thuyết là chó nhà có nguồn gốc từ Đông Á, cách đây 15.000 năm [29].

Năm 2005, Asch và cộng sự thực hiện nghiên cứu phân tích sự đa dạng mtDNA

giữa 4 giống chó bản địa Bồ Đào Nha gồm Chó Castro Laboreiro, Chó núi Serra da

Estrela, chó chăn cừu Bồ Đào Nha và chó chăn gia súc Azores. Với mong muốn thu

được một bức tranh chi tiết hơn về hình ảnh của sự đa dạng mtDNA của chó từ khu

vực lấy mẫu rộng nhưng với một số ít cá thể trong một khu vực hoặc giống, việc lấy

mẫu như vậy sẽ tiết lộ mối quan hệ địa lý yếu và mức độ chia sẻ kiểu gen đơn bội cao

giữa các giống rất xa nên việc lấy mẫu bốn giống chó bản địa Bồ Đào Nha được thực

hiện rộng rãi (n=143) và phân tích lại một các tương đối các dữ liệu đã được công bố

trên toàn thế giới. Kết quả có mười lăm kiểu gen đơn bội thuộc bốn haplogroup lớn đã

được tìm thấy trong các giống, trong đó năm kiểu gen đơn bội mới được báo cáo. Chó

Castro Laboreiro mang 95% kiểu gen đơn bội mới loại A, trong khi tất cả các giống

chó khác có một nguồn chung đa dạng của những dòng đang tồn tại, Chó núi Serra de

Estrela, giống chó không đồng nhất nhất trong bốn giống chó Bồ Đào Nha, chia sẻ

kiểu gen đơn bội với các giống chó ở đại lục khác, trong khi chó chăn gia súc Azores

không chia sẻ kiểu gen đơn bội với các giống Bồ Đào Nha khác. Xem xét các kiểu gen

đơn bội của mtDNA trong những con chó trên toàn thế giới cho thấy: (a) các giống có

xu hướng mang những kiểu gen đơn bội thuộc các haplogroup khác nhau, (b)

halogroup A hiện diện trong tất cả các giống và thậm chí các haplogroup không phổ

biến đang phân tán cao giữa các giống và các khu vực thuộc lục địa, (c) kiểu gen đơn

bội chia sẻ giữa các giống của cùng một khu vực thấp hơn giữa các giống của các vùng

khác nhau và (d) khoảng cách di truyền giữa các giống không tương quan với vị trí địa

lý. Kết luận được đưa ra là sự chia sẻ kiểu gen đơn bội mtDNA xảy ra giữa chó núi

Serre da Estrela (với giả định là nguồn gốc ở trung tâm của Bồ Đào Nha) và hai giống

ở phía bắc và phía nam của quốc gia với chó Castro Laboreiro (mà cách hoạt động, ở

cấp độ mtDNA, như một mẫu phụ của chó núi Serra de Estrela và chó chăn cừu Bồ

Đào Nha ở phía Nam. Ngược lại, chó chăn gia súc Azores không chia sẻ bất kỳ kiểu

gen đơn bội nào với các giống Bồ Đào Nha khác, nhưng lại chia sẻ với những con chó

lấy mẫu ở Bắc Âu. Điều này cho thấy những con chó chăn gia súc Azores được kế

thừa theo dòng mẹ từ những con chó Bắc Âu hơn là từ những con chó của lục địa Bồ

Đào Nha. Một sự đánh giá các kiểu gen đơn bội mtDNA được công bố đã xác định

mười ba giống chó này và bốn giống Bồ Đào Nha, đã chứng minh kiểu gen đơn bội

chia sẻ rộng rãi, với sự đa dạng lớn nhất trong những con chó Châu Á, theo vai trò

trung tâm của Châu Á trong việc thuần hóa chó [31].

Hiện nay, giống chó Ngao Tây Tạng là giống chó lâu đời nhất và dữ tợn nhất trên

thế giới. Tuy nhiên, nguồn gốc của giống chó Ngao Tây Tạng và mối quan hệ phát

sinh loài của nó với những giống chó kích thước lớn khác như Saint Bernard là không

rõ ràng. Năm 2008, Li và cộng sự tiến hành nghiên cứu phân tích nguồn gốc và sự

phát sinh loài của giống chó Ngao Tây Tạng dựa trên trình tự DNA ty thể. Trong

nghiên cứu này, các tác giả phân tích vùng hệ gen ty thể dài 2.525 bp, chứa toàn bộ

trình tự của Cytochrome b, tRNA-Thr, tRNA-Pro và vùng CR (Control Region) của

giống chó Ngao Tây Tạng đã thu được. Sử dụng con sói xám và chó sói bắc Mỹ như

những nhóm tham khảo. Kết quả cho thấy chó Ngao Tây Tạng, những giống chó nhà,

và con sói xám được nhóm lại thành một nhóm và chó sói Bắc Mỹ đã được nhóm

trong một nhóm riêng. Điều này cho thấy giống chó Ngao Tây Tạng và những con chó

nhà khác có nguồn gốc từ con sói xám, và giống chó Ngao Tây Tạng nằm trong nhóm

Carnivora, Canidae, Canis, Canis lupus và là Canis lupus familiaris [17]. Năm 2010,

nhóm tác giả tiếp tục tiến hành nghiên cứu sâu hơn với việc giải trình tự hoàn chỉnh hệ

gen ty thể. Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của mtDNA chó Ngao Tây Tạng là 16.710

bp, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, 13 gen mã hóa protein và một vùng không mã

hóa (vùng D-loop), tương tự như bộ gen ty thể động vật có vú khác. Các đặc tính của

các gen mã hóa protein, khu vực không mã hóa, các gen tRNA và rRNA trong

Canidae được phân tích chi tiết. Sử dụng các phương pháp neighbor – joining và

maximum parsimony tree dựa trên việc sử dụng 12 gen mã hóa protein của ty thể một

lần nữa chứng minh rằng chó Ngao Tây Tạng có nguồn gốc từ sói xám. Ngoài ra còn

xác định được chó Ngao Tây tạng thuộc nhóm A (là một trong bốn nhóm từ A đến D

của chó, ngụ ý có bốn nguồn gốc từ mẹ) và dường như có liên quan chặt chẽ với chó

Saint Bernard và chó chăn cừu Anh cổ [18].

Nhằm xác định nguồn gốc của các giống chó phía nam sông Dương Tử, năm

2009, Pang và cộng sự tiến hành phân tích toàn bộ mtDNA của 169 con chó để xây

dựng cây phát sinh loài với độ tin cậy tối đa và phân tích vùng điều khiển (control

region – CR) của 1.543 con chó trên toàn Cựu Thế giới (Châu Á, Châu Âu, Châu Phi)

để xác lập một bức tranh toàn diện về sự đa dạng địa lý. Các phân tích cho thấy các

con chó chia sẻ một nguồn gen đồng nhất chung chứa mười haplogroup lớn, nhưng sự

đa dạng di truyền giảm dần từ Á sang Âu: tất cả mười haplogroup được tìm thấy ở

Đông Nam Á về phía nam sông Dương Tử, giảm còn bảy haplogroup ở miền Trung

Trung Quốc và năm ở Bắc Trung Quốc và Tây Nam Á và chỉ còn bốn haplogroup ở

Châu Âu. Khoảng cách trung bình các nhánh kiểu gen đơn bội chỉ ra rằng chó nhà có

nguồn gốc ở miền Nam Trung Quốc từ ít hơn 16.300 năm trước, từ vài trăm con sói.

Địa điểm và thời gian trùng với nguồn gốc của nông nghiệp lúa nước, gợi ý rằng con

chó nhà có thể được bắt nguồn từ việc thuần hóa chó sói để phục vụ cho việc săn bắt

hái lượm của con người thời xưa [23].

Năm 2013, Đinh Trần Mỹ Đức đã thực hiện đề tài tốt nghiệp “Bước đầu nghiên

cứu tính đa dạng di truyền của Chó Phú Quốc ở khu vực thành phố Hồ Chí Minh dựa

trên trình tự 16S genome ty thể” trên chín mẫu chó Phú quốc và 10 mẫu chó không

phải Phú Quốc nhằm khảo sát tính đa dạng di truyền của chó Phú Quốc thuộc khu vực

thành phố Hồ Chí Minh để thiết lập cơ sở cho việc xây dựng hệ thống mã vạch DNA

có khả năng nhận biết nhanh các cá thể của loài dựa trên các marker phân tử đặc trưng

cho chó Phú quốc. Kết quả phân tích cho thấy vùng 16S chỉ đủ cơ sở để xác định các

mẫu đang nghiên cứu thuộc loài nào mà không đủ cơ sở để phân định các cấp độ dưới

loài, do vậy không đủ khả năng xây dựng hệ thống mã vạch DNA mang những trình tự

bảo tồn riêng của chó Phú Quốc [4].

Với mong muốn góp phần vào việc xác định lại nguồn gốc chó có xoáy lưng Phú

Quốc, năm 2013, Trương Nguyễn Thị Như Mai và cộng sự đã tiến hành đề tài “Định

dạng haplotype và truy tìm nguồn gốc chó Phú Quốc bằng trình tự vùng CR và bộ gen

ty thể”. Có thể nói đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về mặt di truyền của chó Phú

Quốc tại Việt Nam và cũng là đề tài đầu tiên giải thành công hệ gen ty thể chó Phú

Quốc. Trong nghiên cứu này tác giả đã giải thành công hệ gen ty thể các cá thể chó

Phú Quốc với chiều dài 16.760 bp ở chó PQ1 và 16.731 ở chó PQ2, riêng chó PQ8 đã

giải được 13.149 bp. Phân tích các SNP của vùng kiểm soát cho ra nhiều kết quả nổi

bật , các mẫu chó Phú Quốc trong nghiên cứu mang các kiểu đơn bội A (A19, A65), B

(B1) và E (E1, E4) cho thấy chó Phú Quốc có độ đa dạng di truyền cao. Trong đó, kiểu

đơn bội E là dạng rất hiếm trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) phân bố hạn hẹp ở khu vực

Đông Á như ShiBa Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang

Triều tiên. Hơn nữa, nghiên cứu hệ gen ty thể của chó Phú Quốc, nhóm nghiên cứu

còn thấy, hệ gen ty thể chó Phú Quốc có mức độ tương đồng đến 98% với hệ gen ty

thể chó sói xám [5].

Chương 2

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

Chương 2. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu và hóa chất

2.1.1.1. Nguyên liệu

Mẫu máu chó có xoáy lưng Thái Lan được thu thập tại 42/1 đường Hiệp Bình,

phường Hiệp Bình Chánh, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Chó Thái Lan

trong nghiên cứu này có nguồn gốc rõ ràng, có mã số chip và được hiệp hội chó quốc

tế công nhận.

Thu nhận 2 mL mẫu máu, cho vào ống EDTA vacutainer để bảo quản và trữ mẫu

ở nhiệt độ - 20 oC cho đến khi sử dụng.

2.1.1.2. Hóa chất

Tất cả các hóa chất và thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong việc: lấy mẫu, tách

chiết DNA tổng số, kĩ thuật PCR, điện di…đều đạt chuẩn trong sinh học phân tử thể

hiện cụ thể ở bảng 2.1 - 2.4.

Bảng 2.1. Hóa chất tách chiết DNA

Tên Mã hàng hóa Hãng sản xuất

Bio Basic Inc – Canada Trung Quốc

1107NBUC21EZBI GB/T 16493-1996 1101SHLS1206B110L Bio Basic Inc – Canada Bio Basic Inc – Canada Bio Basic Inc – Canada Merck – Đức Bio Basic Inc – Canada Merck KGaA – Đức Chemsol –Việt Nam Merck KGaA– Đức VWR – Mỹ VWR – Mỹ

Đệm citrate tiêu chuẩn 1X (SSC 1X) pH 7.0 + NaCl 0.15M + Natri citrate 15mM EDTA 0.5M, pH 8.0 NaOAc(CH3COONa) 0.2M 1012NBTI27EAC NaOAc (CH3COONa) 2M 1012NBTI27EAC SDS 10% S6299850-129 Proteinase K (20mg/mL) 1103PE3271C508 Phenol 604001-00-2 Chloroform 67-66-3 Isoamyl alcohol 603-006-00-7 Ethanol tuyệt đối lạnh 07K270508 Ethanol 80% 07K270508

1009SHLS0708B1210L 1101SHLS1206B110L

Bio Basix Inc – Canada Bio Basix Inc – Canada

Đệm TE 10X + Tris – HCl 1M, pH 7.5 + EDTA 0.5M, pH 8.0

Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng trong kĩ thuật PCR

Mã hàng hóa Hãng sản xuất

MHF9220

Epicentre

Cat. # MHF925A Cat. # MHF925B Cat. # MHF925C Cat. # MHF925D Cat. # MHF925E Cat. # MHF925F Cat. # MHF925G Cat. # MHF925H Cat. # MHF925I Sigma-Mỹ Sigma-Mỹ

Tên MasterAmp™ Extra-Long DNA Polymerase Mix Control Lambda DNA Template/Primer MasterAmp™ Extra-Long PCR 2X Premixes PreMix 1 PreMix 2 PreMix 3 PreMix 4 PreMix 5 PreMix 6 PreMix 7 PreMix 8 PreMix 9 Mồi xuôi 10 µM Mồi ngược 10 µM Nước cất 2 lần

Bảng 2.3. Hóa chất điện di

Tên Mã hàng hóa

Nhà sản xuất Bio Basic Inc- Canada Bio Basic Inc- Canada GenOn – Đức Merck KGaA – Đức

Agarose 110830BB013 Đệm TBE 0,5X (Tris – Borate – EDTA) 111031BB024 Đệm nạp mẫu DNA: loading buffer 6X APOD007102 Ethidium Bromide 612-278-00-6

Bảng 2.4. Dụng cụ và thiết bị

Tên Mã hàng hóa Nhà sản xuất

Tủ đông lạnh -20 oC Tủ mát 4voC Máy ly tâm WiseSpin Tủ thao tác vô trùng Máy ủ ổn nhiệt WiseTherm Labortechnik Mỹ Đài Loan Úc Việt Nam Đức

Nồi hấp vô trùng Industrial Co., Đài Loan

Alaska Tatung CSK Climatek Huy Hoàng Witeg GmbH Sturdy Ltd Hanna Instruments Wisestir Heating Block Stuart Esco Micro Pte Ltd Đức Đức Hàn Quốc Anh Mỹ

Bỉ Bỉ Trung Quốc Đức Consort Consort Candy Eppendorf

Mỹ Axygen

Máy đo pH Máy khuấy từ Máy ủ nhiệt khô Máy lắc (vortex) BioCote Máy PCR Esco Swift Minipro Thermo Cycler Bể điện di và nguồn điện Máy chụp ảnh gel Lò vi sóng nấu gel Micropipette (100 – 1000 μL; 10 - 100 μL; 2 - 20 μL; 0,5 - 10 μL) Đầu típ ( 1000 µL, 100 µL, 10 µL) Eppendorf (2 mL; 1,5 mL; 0,2 mL)

2.1.1.3. Các phần mềm máy tính

Geospza’s FinchTV: phiên bản 1.4.0, là phần mềm miễn phí có tính năng mở,

chỉnh sửa và lưu các tập tin thuộc nhiều dạng khác nhau, đặc biệt là các trình tự được

giải bằng hệ thống ABI dưới dạng biểu đồ huỳnh quang.

Sea View: phiên bản 4.2.12 (Manolo Gouy), Sea View là phần mềm miễn phí có

các tính năng hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp xếp gióng cột các trình tự.

Tree View: phiên bản 1.6.6 (Roderic, 2001), phần mềm miễn phí dùng để xem và

hiệu chỉnh cây tiến hóa.

PAUP*: phiên bản 4.0b10 (Swofford, 2003), phần mềm có trả phí, dùng để xây

dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp tiết giảm tối đa (Maximum parsimony-

MP), khả năng tối đa (Maximum likehood-ML), kết nối-kế cận (Neighbor joining-NJ).

MEGA: phiên bản 5.05 (Kumar, 1993), phần mềm này miễn phí dùng để xây

dựng cây phát dinh loài theo các phương pháp tiết giảm tối đa, khả năng tối đa, kết nối

kế cận.

PhyML : phiên bản 3.0 (Guindon & Gascuel, 2009), là phần mềm miễn phí dùng

để xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp khả năng tối đa.

jModelTest: phiên bản 0.1.1 (Posada, 2008), là phần mềm miễn phí dùng để dò

tìm mô hình tiến hóa tối ưu.

MrBayes: phiên bản 3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003), là phần mềm miễn

phí, dùng để xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp xác suất hậu nghiệm

Bayes.

Adobe Photoshop: phiên bản CS4 Stonehenge (Adobe, 1990), là phần mềm trả

phí, dùng để xử lý hình ảnh đồ họa cho cây phát sinh loài, làm nổi bật các nhóm quan

tâm.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Tất cả các thí nghiệm của đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh

học phân tử của Phòng Genomics & Bioinformatic của trường Đại học Nguyễn Tất

Thành, và Phòng Công nghệ Sinh học của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền

Nam, từ ngày 1/1/2014 đến ngày 15/9/2014.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu mẫu và tách DNA tổng số

2.2.1.1. Phương pháp thu mẫu

Mẫu máu được thu nhận bởi bác sỹ thú y, trước khi lấy mẫu cần chuẩn bị các

dụng cụ sau: kéo, kim tiêm, cồn 70%, bông gòn, viết, ống EDTA vacutainer, thùng

xốp, đá khô. Quá trình thu nhận và bảo quản mẫu được thực hiện như sau:

- Sát trùng vùng lấy máu bằng bông có thấm cồn 70%.

- Dùng kim tiêm vô trùng rút 2 mL máu từ tĩnh mạch chân trước của chó, chuyển nhanh vào ống EDTA vacutainer, lắc đều để máu hòa tan hoàn toàn với EDTA để

tránh tình trạng máu bị đông.

- Ghi thông tin của mẫu lên thành ống EDTA vacutainer và chụp ảnh của các con

chó vừa lấy mẫu.

- Cho mẫu vào thùng xốp giữ nhiệt có túi đá khô để giữ lạnh mẫu trong quá trình vận chuyển, cần nhanh chóng chuyển mẫu vào tủ lạnh – 20 oC để mẫu được bảo quản

tốt nhất.

2.2.1.2. Phương pháp tách DNA tổng số

Nguyên tắc chung: Màng tế bào được phá vỡ bằng chất tẩy mạnh, DNA trong và

ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó protein được tinh sạch bằng

proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Cuối cùng

DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.

Yêu cầu: DNA tách chiết cần phải đảm bảo về độ tinh sạch và độ nguyên vẹn về

cấu trúc để thực hiện cho các thí nghiệm về sinh học phân tử.

DNA tổng số được tách chiết từ những mẫu máu đã chống đông bằng EDTA

theo quy trình của FBI (Roe, 1995). Mẫu máu thường được thu là 1 – 2 mL máu toàn bộ được lưu trữ trong ống EDTA vacutainer đông lạnh ở -20 oC. Quy trình tách chiết

DNA tổng số được thực hiện như sau:

Bước 1: Làm tan các mẫu đông lạnh và mỗi 1V mẫu thêm vào 0,8V dung dịch

đêm SSC 1X, trộn đều, ly tâm ở 12000 rpm trong 20 phút.

Bước 2: Loại bỏ 1V phần nổi và thêm vào dung dịch chất khử trùng.

Bước 3: Thêm vào 1V dung dịch đệm SSC 1X, vortex, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút và loại bỏ hoàn toàn phẩn nổi.

Bước 4: Thêm 0,375V NaOAc 0,2M vào mỗi kết tủa và vortex trong thời gian

ngắn. Thêm 0,025V dung dịch SDS 10% và 0,005 V proteinase K (20 mg/mL H2O), vortex trong thời gian ngắn, ủ ở 55 oC trong 1 giờ.

Bước 5: Thêm 0,12V dung dịch hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol

(25:24:1) và vortex trong 30 giây. Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút.

Bước 6: Chuyển lớp nước bên trên sang ống Ep 1,5 mL mới một cách cẩn thận. Thêm 1V dung dịch EtOH tuyệt đối lạnh (ethanol 100% lạnh), trộn đều và ủ ở -20 oC

trong 15 phút.

Bước 7: Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút, gạn bỏ phần nổi trên mặt và để ráo.

Bước 8: Thêm 0,18V dung dịch TE buffer 10:1, vortex, ủ ở 55 oC trong 10 phút.

Bước 9: Thêm 0,02V dung dịch NaOAc 2M và trộn đều, thêm 0,5V dung dịch

EtOH tuyệt đối lạnh, trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.

Bước 10: Gạn bỏ phần nổi và rửa phần tủa với 1V dung dịch EtOH 80%, ly tâm

12000 rpm trong 1 phút.

Bước 11: Gạn bỏ phần nổi và làm khô phần tủa.

Bước 12: Huyền phù phần tủa bằng cách thêm vào 0,2V dung dịch TE buffer 10:1. Ủ qua đêm ở 55 oC, vortexing định kỳ để làm tan toàn bộ DNA bộ gen. Trữ mẫu ở -20 oC

Quy trình tách chiết DNA tổng số hiệu chỉnh được thực hiện như sau:

Bước 1: Làm tan các mẫu đông lạnh và thêm 0,002V β-mercaptoethanol vào mỗi

1V mẫu. Thêm vào 0,8V dung dịch đêm SSC 1X, trộn đều, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút.

Bước 2: Loại bỏ 1V phần nổi và thêm vào dung dịch chất khử trùng.

Bước 3: Thêm vào 1V dung dịch đệm SSC 1X, vortex, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút và loại bỏ hoàn toàn phẩn nổi.

Bước 4: Thêm 0,375V NaOAc 0,2M vào mỗi kết tủa và vortex trong thời gian

ngắn. Thêm 0,025V dung dịch SDS 10% và 0,005V proteinase K (20 mg/mL H2O), vortex trong thời gian ngắn, ủ ở 55 oC trong 1 giờ.

Bước 5: Thêm hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) với thể

tích tương đương với thể tích dung dịch có trong ống và vortex trong 30 giây. Ly tâm

12000 rpm trong 20 phút. Chuyển lớp nước bên trên sang ống Ep 1,5 mL mới một

cách cẩn thận (lặp lại 2-3 lần).

Bước 6: Thêm 1V dung dịch EtOH tuyệt đối lạnh (ethanol 100% lạnh), trộn đều

và ủ ở -20 oC trong 60 phút.

Bước 7: Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút, gạn bỏ phần nổi trên mặt và để ráo.

Bước 8: Thêm 0,18V dung dịch TE buffer 10:1, vortex, ủ ở 55oC trong 10 phút.

Bước 9: Thêm 0,02V dung dịch NaOAc 2M và trộn đều, thêm 0,5V dung dịch

EtOH tuyệt đối lạnh, trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.

Bước 10: Gạn bỏ phần nổi và rửa phần tủa với 1V dung dịch EtOH 80%, ly tâm

12000 rpm trong 1 phút.

Bước 11: Gạn bỏ phần nổi và làm khô phần tủa ở nhiệt độ phòng.

Bước 12: Huyền phù phần tủa bằng cách thêm vào 0,2V dung dịch TE buffer

10:1, trộn đều. Trữ mẫu ở -20 oC.

2.2.1.3. Kiểm tra dịch chiết bằng quang phổ kế

Pha loãng dịch chiết DNA trong nước cất để đạt độ pha loãng 200 lần. Tiến hành

đo quang ở 3 bước sóng: 230nm (A230), 260nm (A260), và 280nm (A280).

Cách tính nồng độ DNA khi đo quang:

A260=1 tương ứng với 50 ng/µL.

Nồng độ DNA (ng/µL) = Số đơn vị A260 x 50 x độ pha loãng

Vậy: Nồng độ DNA (ng/µL) = A260 x 10000

DNA tinh sạch được bảo quản ở -20 oC đến khi dùng.

2.2.2. Phương pháp điện di trên gel agarose

Đổ gel: cân 0,5g agarose vào 50 mL đệm TBE 1X, đun đến khi tan hoàn toàn, lắc đều và làm nguội đến 50 oC, thêm Ethidium bromide đạt nồng độ cuối là 1 μg/mL, trộn

đều và đổ vào khuôn, gắn lược vào, để yên trong khoảng 30 phút cho thạch đông.

Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa TBE sao cho dung dịch đệm ngập trên

gel khoảng 1 cm, giếng lược của bản thạch đặt về phía cực âm.

Pha các mẫu DNA với lượng thích hợp dung dịch đệm tải loading dye 10X, nạp

mẫu vào các giếng, chạy song song với thang DNA chuẩn. Chạy ở dòng điện 120V, 20

- 60 phút. Quan sát các băng DNA trên hộp đèn cực tím bước sóng 254 nm.

2.2.3. Khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain

Reaction)

2.2.3.1. Phản ứng PCR khuếch đại trình tự vùng kiểm soát (D-loop)

Vùng kiểm soát có kích thước 1.270 bp, bắt đầu từ cặp base ở vị trí 15.458 và

kéo dài đến cặp base ở vị trí 16.727, được khuếch đại bằng cặp mồi 15412F và

16625R. Vị trí bắt cặp và các thông số của cặp mồi 15412F và 16625R được thể hiện

rõ qua hình 2.1 và bảng 2.5.

Hình 2.1. Vị trí bắt cặp của mồi 15412F và 16625R trên vùng kiểm soát (D-loop)

Bảng 2.5. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D- loop)

Tên Trình tự mồi Tổng số Nu Tm (oC) Nhà cung cấp Chiều dài đoạn khuếch đại

1,2 kb CCACTATCAGCACCCAAAG AGACTACGAGACCAAATGCG 19 20 60,7 64 Sigma Sigma

15412F 16625R

Hút các thành phần ExPrime Taq PreMix (2X): ExPrime Taq DNA polymerase

0.1 U/µL, 2X reaction buffer, 4mM MgCl2, enzyme stabilizer, sediment, loading dye,

pH 9.0, 0,5 mM mỗi dATP, dCTP, dGTP, dTTP, các cặp mồi, DNA khuôn và nước

cất hai lần cho vào các eppendorf 0,2 mL, nhẹ nhàng hút nhả để trộn đều các thành

phần phản ứng , sau đó ly tâm nhanh 15 giây rồi đặt các eppendorf vào các khuôn ủ

nhiệt của máy PCR.

Nồng độ ExPrime Taq PreMix (2X) và mồi được thực hiện theo quy trình của

GENT BIO. Trong đó chúng tôi tối ưu hóa nồng độ DNA khuôn bằng cách điều chỉnh

thể tích cho vào phản ứng theo bảng 2.6. Sau đó, chúng tôi tiến hành chạy với chu

trình nhiệt của từng giai đoạn theo bảng 2.7 để bắt đầu phản ứng khuếch đại trình tự

vùng D-loop (Barbara Elizabeth Goodson, 2007).

Bảng 2.6. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop)

Thành phần

ExPrime Taq DNA polymerase 0,1 U/µL

STT 1 2 Mồi xuôi (10 μM) 3 Mồi ngược (10 μM) 4 DNA khuôn 5 H2O

Tổng thể tích Thể tích (µL) 12,5 0,5 0,5 Điều chỉnh Vừa đủ 25

Bảng 2.7. Chu trình nhiệt khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop)

Chu kỳ 1 25

Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kết thúc Làm mát Nhiệt độ 95 oC 95 oC 55 oC 72 oC 72 oC 4 oC Thời gian 5 phút 15 giây 30 giây 1 phút 15 giây 7 phút ∞ 1

Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% có

nhuộm với Ethidium bromide 1 mg/mL. Điện di được thực hiện trong 20 phút, ở hiệu

điện thế 120V, trong dung dịch TBE 0,5X, sử dụng thang chuẩn 100bp của Bio Basis

Inc. Bản gel được quan sát trên bàn ánh sáng UV và chụp hình để lưu trữ kết quả.

2.2.3.2. Phản ứng PCR khuếch đại các mảnh gen ty thể

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy

lưng Thái Lan dài 16,7 kb, để khuếch đại toàn bộ kích thước này chúng tôi chia làm ba

mảnh nhỏ, mỗi mảnh chồng lấp lên nhau ít nhất là 200 bp.

Thực hiện các phản ứng PCR cho từng mảnh này để khuếch đại toàn bộ hệ gen ty

thể. Các phản ứng PCR khuếch đại các mảnh gen ty thể được thực hiện ở thể tích 25

µL cho một phản ứng. Các cặp mồi khuếch đại, thành phần phản ứng và chương trình

chạy PCR được thể hiện ở bảng 2.8 - 2.16.

Hút các thành phần MasterAmp Extra-Long DNA polymerase Mix 2,5 U/µL:

50% glycerol bao gồm 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.5%

Tween® 20, 0.5% NP-40, và 1 mM DTT; MasterAmp Extra-Long DNA 2X PreMix

(1-9) bao gồm: Extra-Long PCR 2X Buffer và 400 µM cho mỗi dNTP; các cặp mồi,

DNA khuôn và nước cất hai lần cho vào các eppdorf 0,2 mL, nhẹ nhàng hút nhả để

trộn đều các thành phần phản ứng, sau đó ly tâm nhanh 15 giây rồi đặt các eppendorf

vào các khuôn ủ nhiệt của máy PCR.

Nồng độ của MasterAmp Extra-Long DNA polymerase Mix, MasterAmp Extra-

Long DNA 2X PreMix (1 - 9) và mồi được thực hiện theo quy trình của Epicentre.

Bảng 2.8. Các cặp mồi khuếch đại cho phản ứng PCR

Cặp mồi khuếch đại Kích thước (bp)

STT 1 2 3 Mảnh 1 Mảnh 2 Mảnh 3 1191F và 5871R 5583F và 10886R 10625F và 1418R 4680 5303 7418

Bảng 2.9. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes

Thành phần

DNA Extra-Long Nồng độ 2,5 U/µL Thể tích 0.5 µL

12,5 µL

10 µM 10 µM 100 ng/µL MasterAmp polymerase Mix MasterAmp Extra-Long DNA 2X PreMix (1 - 9) Mồi xuôi Mồi ngược DNA khuôn H2O Tổng thể tích 1,5 µL 1,5 µL Điều chỉnh Cho vừa đủ 25 µL

Bảng 2.10. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 1 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes

Nồng độ 2,5 U/µL 10 µM 10 µM 100ng/ µL Thành phần MasterAmp Extra-Long DNA polymerase Mix MasterAmp Extra-Long DNA 2X PreMix (1- 9) Mồi xuôi Mồi ngược DNA khuôn H2O Tổng thể tích Thể tích 0.5 µL 12,5 µL 1,5 µL 1,5 µL 2 µL 7 µL 25 µL

Bảng 2.11. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 1

Chu kỳ 1 20

Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài sau cùng Làm mát Nhiệt độ 94 oC 98 oC 56 oC 69 oC 69 oC 4 oC Thời gian 1 phút 20 giây 1 phút 5 phút 5 phút ∞ 1

Bảng 2.12. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2, mảnh 3 lần 1

Chu kỳ

1 20

Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài sau cùng Làm mát Nhiệt độ 94 oC 98 oC 55 oC 69 oC 69 oC 4 oC Thời gian 1 phút 20 giây 1 phút X phút Y giây 5 phút ∞ 1

Bảng 2.13. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 2 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes

Thể tích 0.5 µL

Nồng độ 2,5 U/ µL 12,5 µL

10 µM 10 µM 100ng/ µL Thành phần MasterAmp Extra-Long DNA polymerase Mix MasterAmp Extra-Long DNA 2X PreMix (1&5) Mồi xuôi Mồi ngược DNA khuôn H2O Tổng thể tích 1,5 µL 1,5 µL 1 µL 8 µL 25 µL

Bảng 2.14. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 2

Chu kỳ

1 25

Bảng 2.15. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2 lần 2

Chu kỳ 1 25

Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài sau cùng Làm mát Nhiệt độ 94 oC 98 oC 55 oC 69 oC 69 oC 4 oC Thời gian 1 phút 20 giây 1 phút 5 phút 18 giây 5 phút ∞ 1

Bảng 2.16. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 3 lần 2

Chu kỳ 1 25

Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài sau cùng Làm mát Nhiệt độ 94 oC 98 oC 55 oC 69 oC 69 oC 4 oC Thời gian 1 phút 20 giây 1 phút 7 phút 24 giây 5 phút ∞ 1

Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% có

nhuộm với Ethidium bromide 1 mg/mL. Điện di được thực hiện trong 45 phút, ở hiệu

điện thế 120V, trong dung dịch TBE 0,5X, sử dụng thang chuẩn 1 kb của Bio Basis

Inc. Bản gel được quan sát trên bàn ánh sáng UV và chụp hình để lưu trữ kết quả.

2.2.4. Phương pháp giải trình tự

Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng kĩ thuật điện di trên gel agarose 1%, ở

hiệu điện thế 120 V, trong 45 phút có kết quả vạch DNA sáng, rõ sẽ được gửi đi giải

trình tự. Mỗi sản phẩm PCR đều được giải trình tự hai chiều (chiều xuôi và chiểu

ngược) bằng phương pháp tự động tại Công ty Nam Khoa ở quận 7, TP Hồ Chí Minh.

Một số yêu cầu cần chuẩn bị để gửi mẫu đi giải trình tự:

• Sản phẩm PCR: ít nhất 5 µL sản phẩm PCR đối với mỗi chiều giải trình tự. Sản

phẩm PCR có nồng độ tối thiểu là 20 ng/µL.

• Mồi: vì kích thước sản phẩm PCR tương đối lớn (4680 - 7418 bp), chúng tôi sử

dụng các cặp mồi trung gian để giải các trình tự cần thiết cho nghiên cứu, các

mồi được chọn cách nhau khoảng 800 bp. Các mồi được pha trong nước cất 2

lần, không có muối, EDTA hay các tạp nhiễm khác. Nồng độ của mồi là 10 µM

với thể tích tối thiểu là 5 µL cho mỗi mồi giải trình tự.

2.2.5. Hiệu chỉnh trình tự

Sau khi có được kết quả giải trình tự, các trình tự sẽ được hiệu chỉnh qua các bước sau:

• Loại bỏ những tín hiệu không chính xác ở hai đầu trình tự khảo sát

Đối với các tín hiệu ở đầu trình tự, tín hiệu thường lớn và có biên độ không ổn

định, các đỉnh tín hiệu không rõ ràng. Với các tín hiệu gần cuối trình tự, tín hiệu rất

thấp và không thể phân biệt rõ ràng các đỉnh tín hiệu. Việc đọc base ở vùng này hoàn

toàn không bảo đảm được độ tin cậy và cần phải được loại bỏ.

• Kiểm tra các sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự

Thông thường, đoạn DNA khảo sát sẽ được giải trình tự hai chiều bởi mồi xuôi

và mồi ngược. Việc này giúp giảm thiểu việc đọc sai base, những tín hiệu không rõ

ràng trong trình tự khi đọc với mồi xuôi có thể được giải quyết trong khi đọc kết quả

với mồi ngược và ngược lại. Do được đọc theo hai chiều nên kết quả của mồi ngược

cần được chuyển đổi lại (reverse-complement) bằng phần mềm FinchTV trước khi tiến

hành so sánh. Mức độ tương đồng và tìm sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự (mồi

xuôi và mồi ngược) được thực hiện bằng công cụ Dot plot trên phần mềm Sea View.

Hai trình tự sau khi được sắp gióng cột cần phải tương đồng nhau, những sai lệch thu

được cho thấy các sai sót trong khi đọc base bằng máy tự động và cần được kiểm tra

trực tiếp lại trên biểu đồ phát huỳnh quang (hiển thị nhờ phầm mềm FinchTV).

So sánh tín hiệu huỳnh quang ngay tại vị trí sai lệch giữa hai kết quả giải trình tự

có thể xác định được đúng loại base nào tương ứng ở vị trí đó. Trong một vài trường

hợp, các tín hiệu vẫn không thể phân biệt, những vị trí này sẽ được ghi nhận và xác

nhận lại hoặc viết dưới dạng kí hiệu chung theo chuẩn IUPAC (IUPAC-ambiguous

nuclotide code).

Với những kết quả mà sự khác biệt khi sắp gióng cột quá lớn (sự tương đồng

dưới 50%) do tín hiệu huỳnh quang ở rất nhiều vị trí không thể phân biệt được (thường

là do mẫu bị nhiễm các DNA khác, làm cho nhiều trình tự được xác định cùng trên

một thí nghiệm) khi đó các trình tự không được sử dụng để phân tích, việc hiệu chỉnh

các trình tự này không còn có ý nghĩa và độ tin cậy.

2.2.6. So sánh với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen

Sau khi hiệu chỉnh các sai lệch, trình tự đồng nhất (consensus) được rút ra từ hai

kết quả giải trình tự đã kiểm tra các sai lệch. Trình tự đồng nhất là trình tự chính xác

cho đoạn DNA khảo sát. Tuy nhiên, kết quả này cần được kiểm tra một lần nữa trên

các dữ liệu nucleotide như ngân hàng gen bằng BLAST. Các sai lệch nếu có giữa trình

tự trên cơ sở dữ liệu và trình tự truy vấn cần được xem xét và kiểm tra tín hiệu huỳnh

quang ở các vị trí này một lần nữa để xác nhận kết quả giải trình tự. Ngoài ra, việc

thực hiện BLAST còn giúp kiểm tra sự nhiễm mẫu và đánh giá quá trình thu nhận, bảo

quản mẫu.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thu thập mẫu

Chó có xoáy lưng Thái Lan tại thành phố Hồ Chí Minh rất hiếm. Các trại chó chỉ

chuộng nuôi chó có xoáy lưng Phú Quốc, rất ít người nuôi chó có xoáy lưng Thái Lan.

Chúng tôi không có điều kiện để qua Thái Lan thu mẫu máu chó Thái Lan. Do đó,

trong quá trình tìm kiếm và xin mẫu chúng tôi chỉ thu nhận được một mẫu máu chó

Thái Lan, tại quận Thủ Đức. Chó Thái Lan trong nghiên cứu này có nguồn gốc rõ

ràng, có mã số chip và có giấy chứng nhận của hiệp hội chó Quốc tế. Ngoài ra chúng

tôi còn thu thập được 11 mẫu máu chó Phú Quốc để thực hiện các thí nghiệm đối

chứng và lưu trữ dành cho các nghiên cứu về sau. Mẫu máu chó được lấy từ tĩnh mạch

chân, được bảo quản trong ống EDTA vacutainer chống đông và bảo quản ở -20 ºC

cho đến khi sử dụng.

3.2. Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số

Theo nguyên tắc chung, màng tế bào được phá vỡ càng nhiều càng tốt nhưng

phải giữ được DNA càng nguyên vẹn về cấu trúc càng tốt. Do đó việc lựa chọn và tối

ưu hóa phương pháp tách chiết DNA tổng số sao cho phù hợp với điều kiện của phòng

thí nghiệm là điều cần thiết và quan trọng.

Trong nghiên cứu này , tách chiết DNA tổng số của mẫu máu chó được tách theo

quy trình của FBI (Roe, 1995). Kết quả tách chiết DNA tổng số được kiểm tra bằng đo

quang ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Kết quả đo quang cho thấy hàm lượng DNA

rất thấp (51-55 ng/µL) nhưng hai mẫu DNA có độ tinh sạch tốt (tỉ lệ OD 260/OD280)

nằm trong khoảng 1,8 – 2 thể hiện ở bảng 3.1. Điều này cho thấy rằng khả năng DNA

bị phân hủy một phần trong quá trình tách chiết hoặc DNA chưa tủa hết trong giai

đoạn thu tủa là rất cao.

Bảng 3.1. Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình FBI

Mẫu 260 nm 280 nm 260/280 nm Nồng độ DNA (ng/µL)

Mẫu 1 0,051 0,0272 1,875 51

55 Mẫu 2 0,055 0,029 1,897

Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành chỉnh sửa một số bước trong quá trình tách

chiết trên, nhằm tăng hiệu quả thu được DNA tổng số bằng việc bổ sung chất β-

mercaptoethanol vào mẫu máu trước khi tiến hành quy trình tách chiết, đồng thời ở

bước tinh sạch DNA loại bỏ protein bằng Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol

(24:25:1) chúng tôi lặp lại 2 đến 3 lần nhằm tận dụng tối đa lượng DNA có chứa trong

dịch trong suốt và tăng thời gian tủa DNA bằng cồn tuyệt đối lạnh lên 60 phút.

Kết quả đo quang phổ cho thấy các mẫu DNA có độ tinh sạch tốt (tỉ lệ

OD260/OD280) từ 1,8-2. Nồng độ DNA tăng lên đáng kể 358 ng/µL và 469 ng/µL thể

hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2. Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình có hiệu chỉnh

Mẫu 260 nm 280 nm 260/280 nm Nồng độ DNA (ng/µL)

Mẫu 1 0,469 0,248 1,889 469

Mẫu 2 0,358 0,188 1,897 358

Do đó từ kết quả này chúng tôi nhận thấy quy trình tách chiết DNA hiệu chỉnh có

hiệu quả. Vì vậy chúng tôi quyết định sử dụng quy trình này để tách chiết cho mẫu chó

Thái Lan và 11 mẫu chó Phú Quốc làm đối chứng và sử dụng các mẫu DNA này để

thực hiện các phản ứng PCR sau này. DNA tổng số được pha loãng bằng dung dịch

đệm TE 10X sao cho nồng độ DNA khuôn trong phản ứng PCR là 100 ng/µL. Tất cả các mẫu sau khi pha loãng được lưu trữ ở nhiệt độ -20 oC đến khi sử dụng.

Quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu chỉnh được thực hiện như sau:

Bước 1: Làm tan các mẫu đông lạnh và thêm 2 µL β-mercaptoethanol vào mỗi

1V mẫu. Thêm vào 0,8V dung dịch đêm SSC 1X, trộn đều, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút.

Bước 2: Loại bỏ 1V phần nổi và thêm vào dung dịch chất khử trùng.

Bước 3: Thêm vào 1V dung dịch đệm SSC 1X, vortex, ly tâm ở 12000 rpm trong

20 phút và loại bỏ hoàn toàn phẩn nổi.

Bước 4: Thêm 0,375V NaOAc 0,2M vào mỗi kết tủa và vortex trong thời gian

ngắn. Thêm 0,025V dung dịch SDS 10% và 0,005V proteinase K (20 mg/mL H2O), vortex trong thời gian ngắn, ủ ở 55 oC trong 1 giờ.

Bước 5: : Thêm hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) với thể

tích tương đương với thể tích dung dịch có trong ống và vortex trong 30 giây. Ly tâm

12000 rpm trong 20 phút. Chuyển lớp nước bên trên sang ống Ep 1,5 mL mới một

cách cẩn thận (lặp lại 2-3 lần).

Bước 6: Thêm 1V dung dịch EtOH tuyệt đối lạnh (ethanol 100% lạnh), trộn đều

và ủ ở -20 oC trong 60 phút.

Bước 7: Ly tâm 12000 rpm trong 20 phút, gạn bỏ phần nổi trên mặt và để ráo.

Bước 8: Thêm 0,18V dung dịch TE buffer 10:1, vortex, ủ ở 55 oC trong 10 phút.

Bước 9: Thêm 0,02V dung dịch NaOAc 2M và trộn đều, thêm 0,5V dung dịch

EtOH tuyệt đối lạnh, trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.

Bước 10: Gạn bỏ phần nổi và rửa phần tủa với 1 mL dung dịch EtOH 80%, ly

tâm 12000 rpm trong 1 phút.

Bước 11: Gạn bỏ phần nổi và làm khô phần tủa ở nhiệt độ phòng.

Bước 12: Huyền phù phần tủa bằng cách thêm vào 0,2V dung dịch TE buffer

10:1, trộn đều. Trữ mẫu ở -20 oC.

Kết quả tách chiết DNA tổng số của 11 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu chó Thái

Lan được thể hiện ở hình 3.1 khi kiểm tra kết quả bằng kĩ thuật điện di các mẫu trên

gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide và bảng kết quả đo quang của các mẫu ở

bảng 3.3.

Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 14 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu chó Thái Lan

Bảng 3.3. Kết quả đo quang của 11 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu chó Thái Lan

Mẫu 260 nm 280 nm 260 nm/280 nm

PQ20 PQ21 PQ22 PQ23 PQ24 PQ25 PQ26 PQ27 PQ28 PQ29 PQ30 Thái Lan 0,291 0,361 0,324 0,374 0,345 0,421 0,378 0,393 0,467 0,381 0,367 0,354 Nồng độ DNA(ng/µL) 291 361 324 374 345 421 378 393 467 381 367 354 1,8710 1,8067 1,8486 1,8421 1,8466 1,8910 1,8802 1,8857 1,8434 1,8462 1,9552 1,8867 0,155 0,199 0,175 0,203 0,187 0,182 0,201 0,208 0,253 0,206 0,187 0,187

Định loại kiểu đơn bội chó có xoáy Thái Lan bằng trình tự vùng kiểm soát 3.3.

3.3.1. Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại vùng kiểm soát

Chúng tôi sử dụng cặp mồi 15412F và 16625R để tiến hành khuếch đại vùng

kiểm soát (D-loop). Khi sử dụng cặp mồi này, sản phẩm dự tính có kích thước khoảng

1270 bp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với nồng độ

ExPrime Taq PreMix (2X) và mồi được thực hiện theo quy trình của GENT BIO với

các thành phần phản ứng theo bảng 2.7.

Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% có

nhuộm với ethidium bromide 1 mg/mL. Điện di được thực hiện trong 20 phút, ở hiệu

điện thế 120V, trong dung dịch TBE 0,5X, sử dụng thang chuẩn 100 bp của Bio Basis

Inc. Bản gel được quan sát trên bàn ánh sáng UV và chụp hình để lưu trữ kết quả.

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.2 và hình 3.3) cho

thấy các băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí giữa băng 1.500bp và

1.000 bp, như vậy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1.200 bp phù hợp với dự tính

ban đầu. Vì vậy, quá trình khuếch đại vùng kiểm soát trên một mẫu chó có xoáy lưng

Thái Lan và tám mẫu chó có xoáy Phú Quốc đối chứng được thực hiện thành công và

sử dụng sản phẩm PCR này để tiến hành giải trình tự.

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của chó có xoáy lưng Thái Lan

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của 8 mẫu chó có xoáy lưng Phú Quốc

3.3.2. Kết quả giải và phân tích trình tự DNA vùng kiểm soát

3.3.2.1. Hiệu chỉnh trình tự

Sản phẩm khuếch đại vùng kiểm soát được gửi đi giải trình tự với cặp mồi

15412F và 16625R tại công ty Nam Khoa quận 7. Kết quả giải trình tự được hiển thị

trên phần mềm FinchTV gồm có chuỗi trình tự các nucleotides và phần đồ thị phát

huỳnh quang đặc trưng màu sắc cho từng loại nuclotide.

Hình 3.4. Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi 15412F

Hình 3.5. Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi 16625R

3.3.2.2. Lắp ráp trình tự

Các mẫu sau khi hiệu chỉnh bằng phần mềm FinchTV, cắt bỏ các tín hiệu có biên

độ không ổn định và khó phân biệt với tín hiệu nền ở hai đầu đoạn mồi, hai mạch

DNA được giữ lại có các đỉnh khá đều, khoảng cách các đỉnh không chồng lấn lên

nhau và phân biệt rõ ràng với tín hiệu nền. So sánh sự tương đồng của hai mạch DNA,

truy xuất trình tự đồng nhất của mẫu chó Thái Lan khảo sát. Trình tự đồng nhất là

đoạn tương đồng nhất của hai mạch (hình 3.6).

Hình 3.6. Đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát chó có xoáy lưng Thái Lan

Các mẫu còn lại của tám mẫu chó có xoáy lưng Phú Quốc thực hiện truy xuất

trình tự đồng nhất tương tự như mẫu chó có xoáy Thái Lan. Chi tiết đồng nhất của 3/8

mẫu được thể hiện ở hình 3.7.

Hình 3.7. Đại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của 3/8 mẫu khảo sát

3.3.2.3. So sánh trình tự truy vấn của các mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên

ngân hàng gen

Trình tự truy xuất từ đoạn gen vùng kiểm soát của mẫu chó Thái Lan được đem

BLAST trên ngân hàng gen để đánh giá mức độ tương đồng của cùng kiểm soát với

nguồn cơ sở dữ liệu trình tự gen lớn của thế giới, nhằm mục đích cho kết quả tham

khảo của nhóm loài tương đồng nhất của trình tự truy vấn. Sau khi so sánh trình tự

mẫu chó Thái Lan nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen, chúng tôi có kết

quả sau:

Hình 3.8. Kết quả BLAST của mẫu Thái Lan trên NCBI

Các mẫu còn lại thực hiện BLAST trên NCBI tương tự như mẫu Thái Lan. Kết

quả so sánh truy vấn của vùng kiểm soát trên ngân hàng gen NCBI cho kết quả đáng

tin cậy (mức độ tương đồng cao 99% đến 100% trên tám mẫu khảo sát) và đều thuộc

nhóm chó nhà (Canis lupus familiaris). Điều này cho thấy mẫu máu thu thập không bị

tạp nhiễm các mẫu khác, quá trình bảo quản mẫu tốt và đạt độ tin cậy cao.

3.3.3. Định loại kiểu đơn bội cho chó có xoáy lưng Thái Lan

Tính đa hình đơn nucleotides (Single nucleotide polymorphism-SNP) được sử

dụng trong phân tích di truyền để xác định mối quan hệ di truyền giữa các cá thể cùng

loài, hoặc loài gần. Dựa trên các đa hình đơn nucleotide của vùng kiểm soát, các nhà

nghiên cứu đã xác định được 6 nhóm kiểu đơn bội là A, B, C, D, E và F [27]. Điều đó

cho thấy sự khác biệt về hình thái của các giống chó trên thế giới không phải là kết quả

của quá trình thuần hóa chó sói ở từng khu vực địa lý khác nhau. Điều này lý giải vì

sao các giống cho khác nhau có thể mang nhiều kiểu đơn bội khác nhau và một kiểu

đơn bội có thể tìm thấy ở nhiều giống chó khác nhau. Có đến 71,3% chó mang kiểu

đơn bội A; 95,9% mang kiểu đơn bội A, B hoặc C. Cả ba nhóm đều phân bố trên toàn

thế giới (trừ nhóm C không có ở Châu Mỹ) với tần suất ngang nhau. Ngược lại, ba

nhóm kiểu đơn bội D, E và F là nhóm kiểu đơn bội hiếm, chỉ chiếm chưa đến 5% cá

thể chó trên thế giới và chúng chỉ phân bố giới hạn ở Thổ Nhĩ Kỳ, Tây Ban Nha và

vùng Scandinavia (nhóm D); ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc (nhóm E); Nhật

Bản và Siberia (nhóm F) [7],[21], [27].

Để xác định kiểu đơn bội (haplotype) của chó Thái Lan dùng trong nghiên cứu,

chúng tôi sử dụng vùng HV1 (dài 582 bp) nằm trong vùng D-loop để phân tích. Trình

tự vùng HV1 được nhập vào bộ dữ liệu chứa sẵn 180 trình tự vùng D-loop của các

mẫu chó lân cận khu vực Việt Nam, Đông Nam Á và Châu Á. Kết quả phân tích phát

sinh chủng loài bằng thuật toán Neighbor-Joining, bằng phầm mềm Mega6 cho cây

phát sinh chủng loài như dưới hình vẽ. Chó Thái Lan trong nghiên cứu này mang

haplotype A11, có quan hệ di truyền dần với một chó Thái Lan lưng xoáy đã phân tích

trước đó (AF531664).

Nhóm chó khác

A12 (AF531665)

A65 (KF757308) Cho Phu Quoc VietNam PQ11

A65 (D83635) Phu Quoc

THAI-Consensus

A11 (AF531664) Phu Quoc + Thai Ridgeback

04TP (KF757303)

A89 (EU816462)

A20 (AF531672)

A91 (EU816464)

A226 (HQ452457)

A51 (AF531702)

A93 (EU816466)

0.005

Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loài sử dụng phương pháp Neighbor-Joining. Mô hình tiến hóa là Kimura hai thông số với phân bố Gamma là 4. Phép phân tích dựa trên 181 trình tự bao gồm 531 nucleotides

3.4. Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kĩ

thuật Long-PCR

Hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan dài 16,7 kb, để khuếch đại toàn bộ kích

thước này theo kĩ thuật Primer Walking cần phải chia ra làm từ 8 đến 10 mảnh nhỏ,

mỗi mảnh có kích thước từ 1,5 đến 2,5 kb. Việc sử dụng kĩ thuật Primer Walking để

khuếch đại các mảnh hệ gen ty thể tốn nhiều thời gian, cũng như tốn nhiều các thành

phần trong phản ứng PCR như: mồi, DNA khuôn, enzyme.

Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kĩ thuật Long-PCR để khuếch đại và

thu nhận toàn bộ mtDNA để làm nguyên liệu cho việc giải trình tự về sau. Chúng tôi

sử dụng bộ sản phẩm MasterAmp™ Extra-Long PCR Kit của hãng Epicentre (mã

hang hóa MHF9220, MHF925A→ I) nó có thể khuếch đại sản phẩm có kích thước từ

5 đến 40 kb. Để khuếch đại toàn bộ kích thước này chúng tôi chia làm 3 mảnh nhỏ có

kích thước từ 4,7 - 7,4 kb, mỗi mảnh chồng lấp lên nhau ít nhất là 200 bp. Mồi khuếch

đại sử dụng trong nghiên cứu này được kế thừa từ các công trình về hệ gen ty thể trước

đó của Webb và cộng sự (2009) được thể hiện ở bảng 3.4.

Thiết lập điều kiện phản ứng PCR: việc ứng dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại hệ gen mtDNA đòi hỏi phải tối ưu hóa một số điều kiện, đặc biệt là nồng độ Mg2+, nhiệt

độ bắt cặp và enzyme DNA polymerase. Ngoài ra thời gian dùng trong bước mở rộng,

đặc biệt ở những chu kỳ sau cũng được chúng tôi chú ý. Thông thường người ta cài đặt

theo công thức 1 kb/1 phút trong 15 chu kỳ đầu; sau đó sử dụng đặc tính tự mở rộng

của máy PCR người ta thêm vào “15 giây/chu kỳ”. Nhiệt độ bắt cặp được tính bằng

công thức sau: (2x A/T) + (4x G/C) – 5.

Bảng 3.4. Ba cặp mồi để khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan

Kích thước (bp)

4680 1

5303 2

7418 3 Cặp mồi Vị trí 1191F 5871R 5583F 10886R 10625F 1418R Trình tự mồi (5’-3’) GGAGCGATAGAGATAGTACC AGTTTGATACTGGGATATTGC GGAAACTGACTAGTGCCGTT GGAGTACAGCGGCAAGTACTA GACTAAACGCAGGACTCTAC CACCAGGCTCGTTAGGCTT

Hình 3.10. Sơ đồ hệ thống các cặp mồi khuếch đại các mảnh gen ty thể chó Thái Lan và vị trí các gen cần giải trình tự

3.4.1. Xây dựng quy trình phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1

Ban đầu chúng tôi thực hiện phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1 có kích thước

4680 bp với thành phần hóa chất và chu trình nhiệt được thể hiện ở bảng 2.10 và 2.11.

Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên

gel agarose 1% có nhuộm với ethidium bromide 1 mg/mL. Điện di được thực hiện

trong 45 phút, ở hiệu điện thế 120V, trong dung dịch TBE 0,5X, sử dụng thang chuẩn

1 kb của Bio Basis Inc.

Kết quả nhận được là Premix từ 1 đến 6 cho kết quả dương tính, ba Premix 7, 8,

9 không cho kết quả (hình 3.11).

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1lần 1hệ gen ty thể chó Thái Lan

Kết quả diện di sản phẩm PCR cho thấy các băng hơi mờ, không sáng rõ nhưng

vị trí các băng nằm giữa vị trí 4,5 - 5 kb phù hợp với kích thước dự tính ban đầu. Do

đó chúng tôi tiến hành thay đổi thành phần phản ứng là giảm nồng độ DNA khuôn

xuống còn 1 µL và trong chu trình nhiệt chúng tôi tăng số chu kỳ lên là 25 được thể

hiện ở bảng 2.14 và 2.15. Trong lần khuếch đại này chúng tôi chỉ sử dụng PreMix 1 và

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.12) lần này cho thấy

các băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí giữa băng 4,5 kb và 5 kb, như

vậy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 4,7 kb phù hợp với dự tính ban đầu. Vì vậy,

quá trình khuếch đại mảnh 1 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan được thực hiện

thành công và có thể sử dụng sản phẩm PCR này để tiến hành giải trình tự.

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1lần 2 hệ gen ty thể chó Thái Lan

3.4.2. Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại mảnh 2 và mảnh 3 hệ gen ty thể

chó có xoáy lưng Thái Lan

Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại mảnh 2 có kích thước

5303 bp và mảnh 3 có kích thước 7418 bp của hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái

Lan với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt thể hiện bảng 2.10 và 2.12.

Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên

gel agarose 1% có nhuộm với Ethidium bromide 1 mg/mL. Điện di được thực hiện

trong 45 phút, ở hiệu điện thế 120V, trong dung dịch TBE 0,5X, sử dụng thang chuẩn

1 kb của Bio Basis Inc.

Kết quả nhận được là mảnh 2 thì Premix 3, 5, 6 cho kết quả dương tính, mảnh 3

chỉ PreMix 2, 5, 6 cho kết quả dương tính, các PreMix còn lại không có kết quả (hình

3.13 và 3.14).

Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 1

Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 1

Kết quả điện di sản phẩm PCR của mảnh 2 và mảnh 3 cho kết quả không được

sáng rõ, không thể đem giải trình tự, do đó chúng tôi tiến hành khuếch đại lại mảnh 2

và mảnh 3 với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt thay đổi so với lần khuếch đại

ban đầu được thể hiện ở bảng 2.13, 2.15 và 2.16. Trong lần khuếch đại mảnh 2 lần 2

chúng tôi chỉ sử dụng PreMix 3, khuếch đại mảnh 3 lần 2 chúng tôi sử dụng PreMix 5

và 6.

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.15 và 3.16) cho thấy

băng DNA sáng, rõ nét, có kích thước phù hợp với dự tính ban đầu. Vì vậy, quá trình

khuếch đại mảnh 2 và mảnh 3 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan được thực

hiện thành công và có thể sử dụng sản phẩm PCR này để tiến hành giải trình tự.

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 2

Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 2

3.5. Giải và phân tích trình tự hệ gen ty thể chó Thái Lan mang kiểu đơn bội

A11 Dựa trên kết quả phân tích vùng kiểm soát, mẫu chó có xóay Thái Lan trong

nghiên cứu này thuộc kiểu đơn bội A11, không nằm trong dòng chó hiếm của thế giới.

Cũng như thông tin về hệ gen ty thể chó nhà thuộc kiểu đơn bội A11 đã được giải

hoàn chỉnh và không có sự khác nhau nhiều về tính đa hình đơn nucleotides (Single

nucleotide polymorphism-SNP) giữa các cá thể (hình 3.17). Do đó việc giải toàn bộ hệ

gen ty thể chó Thái Lan không có nhiều ý nghĩa, chúng tôi tập trung giải những vùng

mang gen mã hóa protein.

Các gen thuộc hệ gen ty thể mã hóa cho các protein tham gia vào các quá trình

tổng hợp năng lượng, trao đổi chất … của tế bào.

Gen Cyt b mã hóa cho protein tham gia vào quá trình vận chuyển electron trong

chuỗi hô hấp ở ty thể. Izeni P. Farias và cộng sự năm 2001 đã tiến hành phân tích 78

trình tự DNA Cyt b của các đại diện chính thuộc họ Cichlidae.

Gen Cyt b được sử dụng rộng rãi trong phân tích nguồn gốc tiến hóa cũng như sự

đa hình của các quần thể khác nhau trong cùng một loài vì:

- Tốc độ tiến hóa trong vùng silent (silent position) tương đối nhanh.

- Cơ sở dữ liệu về gen Cyt b rất phong phú nên việc so sánh giữa các đối

tượng nghiên cứu hết sức thuận lợi.

- Trình tự DNA của Cyt b chứa đầy đủ thông tin cần thiết để nghiên cứu sâu

hơn về mối quan hệ phát sinh chủng loài giữa các loài [3].

Hệ gen ty thể thường chứa một tập hợp gồm 37 gen mã hóa 13 gen protein, 2

rRNAs và 22 tRNA (Clayton, 1992). Trong nghiên cứu này chúng tôi giải trình tự của

năm gen mã hóa cho protein là: ND1, ND2, ND4, ATP8 và CYTB. Thông tin của năm

gen trên được thể hiện ở bảng 3.5 và chín cặp mồi trung gian để giải trình tự được thể

hiện ở bảng 3.6.

Hình 3.17. Dữ liệu DNA ty thể chó thuộc kiểu đơn bội A11

Bảng 3.5. Thông tin về năm gen mã hóa protein trong nghiên cứu

STT Tên Kích thước (bp) Vị trí Protein mã hóa

1 ND1 956 2748-3703 NADH dehydrogenase subnit 1

2 ND2 1042 3915-4956 NADH dehydrogenase subnit 2

3 ATP8 204 7804-8007 ATP synthase FO subnit 8

4 ND4 1342 10240-11581 NADH dehydrogenase subnit 4

5 CYTB 1140 14175-15314 Cytochrome b

Bảng 3.6. Chín cặp mồi dành để giải trình tự các vùng gen trong nghiên cứu

Vị trí Trình tự mồi (5’-3’) Sản phẩm PCR Kích thước (bp) Cặp mồi

1209 1 Mảnh 1

973 2 Mảnh 1

848 3 Mảnh 1

1290 4 Mảnh 1

1039 5 Mảnh 2

1855 6 Mảnh 2

1095 7 Mảnh 3

1079 8 Mảnh 3

980 9 Mảnh 3 2436F 3645R 3220F 4193R 3945F 4793R 4581F 5871R 7642F 8681R 9031F 10886R 10625F 11720R 13268F 14347R 14253F 15233R ACATCCTAATGGTGCAGCAG GGCAACATGTCATATGCATA GTCATTTACACTATCCACGC GTGGTTATCATGATGGATGCG CAACTATCATGACAGGAACC GTGCTATATGTGAGTCGCAG TCATCCACCACGACCCTATC AGTTTGATACTGGGATATTGC CCACAGCTTTATACCCATTG TGTCAGCGGTCATGGGCTTG GCCTCTACTCAACACCTCAG GGAGTACAGCGGCAAGTACTA GACTAAACGCAGGACTCTAC CCAACGGATTACTTCTATCC TTTCATCCTGGCACTAGAAC TCAGCCGTAGTTAACGTCTC CGTCTAACATCTCTGCTTGA AAGATTGAAGCGACTTGTCC

Trong nghiên cứu này, các sản phẩm PCR thu được từ mtDNA có chiều dài từ

4,7 đến 7,4 kb được chúng tôi giải trình tự trực tiếp. Theo nguyên tắc, phản ứng đọc

trình tự chỉ cho kết quả tối ưu ở khoảng 600-800 bp. Do vậy, chúng tôi sử dụng các

mồi trung gian gắn vào các vùng gen cần giải trình tự.

3.5.1. Thu nhận và hiệu chỉnh kết quả giải trình tự

Sau khi thu nhận kết quả giải trình tự, các chuỗi DNA giải trình tự đầu tiên được

chỉnh sửa bằng phần mềm FinchTV. Những trình tự xấu được cắt bỏ hai đầu của tất cả

các trình tự thu được. Sau đó, tất cả các trình tự được chuyển vào phần mềm Sea view.

Trong các kết quả giải trình tự quan sát được các trường hợp: các đỉnh huỳnh quang

nền, các base không rõ ràng và cường độ tín hiệu thấp.

3.5.1.1. Trường hợp các đỉnh huỳnh quang nền

Các đỉnh huỳnh quang nền là các đỉnh không xác định nằm bên dưới các đỉnh

huỳnh quang quan tâm, nó có thể gây trở ngại cho khả năng đọc trình tự quan tâm

(Automated DNA Sequencing Chemistry Guide, 2000) như hình 3.18. Các tín hiệu

nền gây nhiễu thường hiện diện trong các trình tự nhưng không ảnh hưởng đến khả

năng đọc trình tự nếu đỉnh huỳnh quang thực sự của trình tự có biên độ cao. Các đỉnh

huỳnh quang nền có thể là do lượng DNA khuôn dư thừa, thiếu hoặc bị nhiễm. Hầu

hết các kết quả giải trình tự trong nghiên cứu này đều bị nhiễu. Các tín hiệu nền gây

nhiễu được cho là do lượng DNA khuôn không đủ.

Hình 3.18. Biểu đồ huỳnh quang với các đỉnh huỳnh quang nền

3.5.1.2. Trường hợp các base không rõ ràng

Trong các kết quả giải trình tự, một số biểu đồ huỳnh quang có chứa các base

không rõ ràng. Ở hình 3.19, base T ở vị trí 447 không rõ ràng do có một đỉnh huỳnh

quang của base C nằm ngay bên dưới. Các base mập mờ được tìm thấy cùng với các

tín hiệu nền gây nhiễu làm cản trở việc đọc kết quả của trình tự. Để đọc được các base

mập mờ này cần kiểm tra bằng mắt biểu đồ huỳnh quang và so sánh trình tự bổ sung

được giải bằng mồi ngược chiều.

Hình 3.19. Biểu đồ huỳnh quang có base không rõ ràng

3.5.1.3. Trường hợp cường độ tín hiệu thấp

Biểu đồ huỳnh quang ở hình 3.20 thể hiện cường độ tín hiệu thấp. Các đỉnh

huỳnh quang có cường độ tín hiệu thấp được cho là do có sự hiện diện của muối còn

dư và các protein trong DNA khuôn (Automated DNA Sequencing Chemistry

Guide,2000). Để hạn chế trường hợp cường độ tín hiệu thấp, sản phẩm PCR cần phải

được tinh sạch để loại bỏ muối và protein trước khi tiến hành giải trình tự.

Hình 3.20. Biểu đồ huỳnh quang có cường độ tín hiệu thấp

3.5.2. Lắp ráp các trình tự đã hiệu chỉnh

Tất cả các trình tự sau khi được hiệu chỉnh được chuyển vào phần mềm

SeaView. Một trình tự đồng nhất được thành lập từ tất cả các chuỗi trình tự được giải

bằng chức năng tạo trình tự đồng nhất (consensus sequence) của SeaView tạo thành

một chuỗi thống nhất (hình 3.21).

Hình 3.21. Trình tự đồng nhất của chó Thái Lan trên phần mềm SeaView

3.5.3. Phân tích phát sinh loài

Để xây dựng cây tiến hóa dựa trên trình tự năm gen ty thể chó Thái Lan, chúng

tôi sử dụng bộ dữ liệu gồm 77 trình tự mtDNA của các loài thuộc họ Chó nổi tiếng

trên thế giới. Sử dụng chó hoang (Canis latrans) làm nhóm ngoại. Trong đó có hai

trình tự mtDNA PQ1 (haplotype E4) và PQ2 (haplotype B1) đã được giải hoàn chỉnh

trong luận văn “Định dạng haplotype và truy tìm nguồn gốc chó Phú Quốc bằng trình

tự vùng CR và bộ gen ty thể” của Trương Nguyễn Thị Như Mai và sử dụng năm trình

tự mtDNA chó thuộc kiểu đơn bội A11 được lấy từ ngân hàng gen. Sau đó, chúng tôi

tích hợp trình tự chó Thái Lan đã giải với bộ dữ liệu có sẵn.

Cây tiến hóa được suy luận từ thuật toán Neighbor-Joining. Mô hình tiến hóa tối

thích có tổng chiều dài nhánh = 0.12390421. Cây phát sinh chủng loài được vẽ theo tỉ

lệ, với chiều dài nhánh tương đương khoảng cách tiến hóa được dùng để suy luận cây

phát sinh chủng loài. Khoảng cách tiến hóa được ước tính sử dụng thuật toán

Maximum-Likelihood và được biểu thị bằng số base thay thế ở mỗi vị trí. Phép phân

tích bao gồm 77 trình tự với 4832 vị trí base được phân tích, toàn bộ khoảng trống

được loại bỏ trước khi phân tích. Phân tích tiến hóa được xử lý bằng phần mềm

MEGA6

Kết quả phân tích cho thấy chó lưng có xoáy Thái Lan mang kiểu đơn bội A11

nằm chung với nhóm chó có độ tiến hóa cao. Chó Thái Lan có độ tiến hóa xa hơn so

với nhóm chó mang kiểu đơn bội A11. Điều này được giải thích do có sự sai khác về

một nucleotide đơn lẻ (SNP) giữa các trình tự. Trong khi đó nhóm chó Phú Quốc đã

phân tích nằm trong nhóm chó ít tiến hóa, nằm ở vị trí chị em với chó sói Tây Tạng

(mã số GQ374438.1). Điều này gợi ý có thể chó có xoáy Phú Quốc và chó có xoáy

Thái Lan không cùng một tổ tiên.

Để có những kết luận chính xác hơn về mặt quan hệ di truyền giữa chó lưng

xoáy Phú Quốc và chó lưng xoáy Thái Lan cần có thêm nhiều dữ liệu chó có xoáy

lưng Thái Lan. Cũng như cần phải giải hết toàn bộ hệ gen ty thể để có nhiều thông tin

di truyền hơn.

EU789731.1 no comment

Cho Thai Lan no comment

EU789770.1 no comment

EU789735.1 no comment

Viszla VI1 EU408305

Rottweiler RO2 EU408295

Newfoundland NE1 EU408287

Rottweiler RO1 EU408296

English Springer Spaniel AY656744.1

Great Pyrenees GP1 EU408277

Australian Shepherd AU2 EU408248

Australian Shepherd AU1 EU408249

Irish Setter IR2 AY656753

Sapsaree AY656755.1

EU789740.1 no comment

EU789730.1 no comment

Old English Sheepdog AY656742.1

Nhóm A

Nhóm B

Tibetan Mastiff TM1 EU408300

Nhóm Tây t?ng

Grey wolf W07 DQ480503

Black Russian Terrier BL1 DQ480493

Swedish Elkhound from Sweden DQ480501.1

German Shepherd GE1 DQ480489

Canis lupus chanco GQ374438.1

Nhóm Phú Qu?c

Husky102 AB499817.1

Kisyu25 AB499816.1

Grey wolf W03 DQ480507

Grey wolf W04 DQ480506

Jamthund JA1 DQ480502

Jamthund JA2 DQ480492

Tibetan wolf T01 NC 011218

Tibetan wolf T02 FJ032363

laniger FJ032363.2

Coyote C03 DQ480510

Coyote C04 DQ480511

Coyote C01 NC 008903

Coyote C02 DQ480509

0.005

Hình 3.22. Cây tiến hóa dựng bằng thuật toán Maximum-Likehood từ trình tự 5 gen ND1, ND2, ATP8, ND4 và CYTB có tổng chiều dài 4832 bp của 77 trình tự

KẾT LUẬN

VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

 Kết luận

Từ những kết quả trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Quy trình tách chiết DNA tổng số sau khi hiệu chỉnh cho hiệu quả cao. DNA có

độ tinh sạch tốt, được sử dụng cho các phản ứng PCR sau này.

2. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu này hoạt động tốt, sử dụng hiệu

quả trong phản ứng PCR và trong phản ứng giải trình tự.

3. Xây dựng thành công quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó có

xoáy Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR.

4. Giải được trình tự năm gen: ND1, ND2, ATP8, ND4 và CYTB thuộc hệ gen ty

thể chó có xoáy Thái Lan.

5. Phân tích các SNP của vùng kiểm soát (D-loop), chúng tôi xác định mẫu chó

Thái Lan trong nghiên cứu của chúng tôi mang kiểu đơn bội A11.

6. Kết quả phân tích nguồn gốc tiến hóa dựa trên trình tự của năm gen của hệ gen

ty thể chó Thái Lan cho thấy chó Thái Lan nằm trong nhóm có độ tiến hóa cao.

Trong khi đó chó có xoáy Phú Quốc nằm trong nhóm ít tiến hóa. Điều này gợi ý

chó có xoáy lưng Phú Quốc và chó có xoáy lưng Thái Lan không cùng thuộc

một tổ tiên.

 Kiến nghị

Nghiên cứu này chỉ mới khảo sát trên một mẫu chó Thái Lan, chúng tôi kiến

nghị cần tăng thêm số mẫu khảo sát và mở rộng khu vực địa lý thu thập mẫu để

tránh tình trạng thiên lệch do số lượng mẫu quá ít.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Hữu Chiếm, Nguyễn Văn Biện, Võ Công Thành, Nguyễn Hữu Thiện,

Trần Thị Kim Hồng, Nguyễn Văn Được, Lâm Thành Quốc, Lý Thị Liên

Khai, Bùi Thị Mai Phụng, Nguyễn Đình Truyên (2004), Điều tra nghiên

cứu bảo tồn gen động vật: chó Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang, Báo cáo tổng

kết, Trường Đại học Cần Thơ.

2. Hoàng Tuấn Thành, Nguyễn Quốc Đạt, Võ Văn Sự, Hoàng Văn Tiệu (2009),

Khả năng sinh trưởng và sinh sản của chó Phú Quốc nuôi tại Thành phố

Hồ Chí Minh, Báo cáo khoa học, Viện Chăn Nuôi.

3. Lê Thị Thúy (2010), Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội, Báo

cáo tổng kết, Viện Chăn Nuôi.

4. Đinh Trần Mỹ Đức (2013), Bước đầu nghiên cứu tính đa dạng di truyền của Chó

Phú Quốc ở khu vực thành phố Hồ Chí Minh dựa trên trình tự 16S genome

ty thể.

5. Trương Nguyễn Thị Như Mai (2013), Định dạng haplotype và truy tìm nguồn

gốc chó Phú Quốc bằng trình tự vùng CR và bộ gen ty thể.

Tiếng Anh

6. Ana E.P., Lahoussine O., Mohsen K., Jose´ M., Francisco P.-F. and Michael

W.B. (2006) “Mitochondrial DNA sequence variation in Portuguese native

dog breeds: Diversity and phylogentic affinities”. Journal of Heredity,

97(4), 318 - 330.

7. Ardalan A., Kluetsch C.F., Zhang A.B., Erdogan M., Uhlen M., Houshmand M.,

Tepeli C., Ashtiani S.R. and Savolainen P. (2011) “Comprehensive study of

mtDNA among Southwest Asian dogs contradicts independent

domestication of wolf, but implies dog-wolf hybridization”. Ecology and

Evolution, 1(3), 373-385.

8. Bannasch D., Bannasch M., Ryun J., Famula T. and Pedersen N. (2005) “Y

chromosome haplotype analysis in purebred dogs”. Mammalian Genomes,

16(4), 273-280.

9. Bjornerfeldt S., Webster M.T. and Vila C. (2006) “Relaxation of selective

constraint on dog mitochondrial DNA following domestication”. Genomes

Research, 16(8), 990-994.

10. Clayton, D.A. (1992) “Transcription and replication of animal mitochondrial

DNAs”. International Review Cytology, 141, 217-232.

11. Ding Z.-L., Oskarsson M., Ardalan A., Angleby H., Dahlgren L.-G., Tepeli C.,

Kirkness E., Savolainen P. and Zhang Y.-P. (2012) “Origins of domestic

dog in Southern East Asia is supported by analysis of Y-chromosome

DNA”. Heredity, 108(5), 507-514.

12. GÖKÇK Çigdem. (2005), Mitochondrial DNA (mtDNA) sequence analyses of

Kangal dogs in Turkey, Master Thesis, Middle East Technical University.

13. Gundry R.L., Allard M.W., Moretti T.R., Honeycutt R.L., Wilson M.R., Monson

K.L. and Foran D.R. (2007) “Mitochondrial DNA analysis of the domestic

dog: Control region variation within and among breeds”. Journal of

Forensic Sciences, 52(3), 562-572.

14. Kim K.S., Lee S.E., Jeong H.W. and Ha J.H. (1998) “The complete nucleotide

sequence of the domestic dog (Canis familiaris) mitochondrial genome”.

Molecular Phylogentics and Evolution, 10(2), 210-220.

15. Klütsch C.F.C., Seppälä E.H., Fall T., Uhlén M., Hedhammar Å., Lohi H. and

Savolainen P. (2011) “Regional occurrence, high frequency but low

diversity of mitochondrial DNA haplogroup d1 suggests a recent dog-wolf

hybridization in Scandinavia”. Animal Genetics, 42(1), 100-103.

Lang B.F., Gray M.W., Burger G., (1999) “Mitochondrial genome 16.

evolution and the origin of eukaryotes”. Annual Review Genetics, 33, 351 –

397.

17. Li Q., Liu Z., Li Y., Zhao X., Dong L., Pan Z., Sun Y., Li N., Xu Y. and Xie Z.

(2008) “Origin and phylogentic analysis of Tibetan Mastiff based on the

mitochondrial DNA sequence”. Journal of Genetics and Genomics, 35(6),

335-340.

18. Li Y., Li Q., Zhao X., Xie Z. and Xu Y. (2010), “Complete sequence of the

Tibetan Mastiff mitochondrial hệ gen and its phylogentic relationship with

other Canids (Canis, Canidae)”. Animal, 5(1), 18-25.

19. Li Y. and Zhang Y. (2012) “High genetic diversity of Tibetan Mastiffs revealed

by mtDNA sequences”. Chinese Science Bulletin, 57(13), 1483-1487.

20. Magda Sindičić, Tomislav Gomerčić, Ana Galov, Haidi Arbanasić, Josip Kusak,

Alen Slavica and Huber a.D. (2011) “Mitochondrial DNA control region as

a tool for species identification and distinction between wolves and dogs

from Croatia". Veterinarski Arhives, 81, 249-258.

21. Okumura N., Ishiguro N., Nakano M., Matsui A. and Sahara M. (1996) “Intra-

and interbreed genetic variations of mitochondrial DNA major non-coding

regions in Japanese native dog breeds Canis familiaris”. Animal Genetics,

27(6), 397-405.

22. Oskarsson M.C., Klutsch C.F., Boonyaprakob U., Wilton A., Tanabe Y. and

Savolainen P. (2012) “Mitochondrial DNA data indicate an introduction

through Mainland Southeast Asia for Australian dingoes and Polynesian

domestic dogs”. Proceedings. Biological sciences/The Royal Society,

279(1730), 967-974.

23. Pang J.F., Kluetsch C., Zou X.J., Zhang A.B., Luo L.Y., Angleby H., Ardalan A.,

Ekstrom C., Skollermo A., Lundeberg J., Matsumura S., Leitner T., Zhang

Y.P. and Savolainen P. (2009) “mtDNA data indicate a single origin for

dogs south of Yangtze River, less than 16,300 years ago, from numerous

wolves”. Molecular Biology and Evolution 26(12), 2849-2864.

24. Pereira F., Carneiro J. and Asch B.v. (2010) “A guide for mitochondrial DNA

analysis in non-human forensic investigations”. The Open Forensic Science

Journal, 33-44.

25. Pereira L., Van Asch B. and Amorim A. (2004) “Standardisation of

nomenclature for dog mtDNA D-loop: a prerequisite for launching a Canis

familiaris database”. Forensic Science International, 141(2–3), 99-108.

26. Roe Bruce A., Crabtree Judy S., Khan Akbar S. (1995), Protocols for

recombinant DNA isolation, cloning and sequencing, University of

Oklahoma.

27. Salmon Hillbertz N.H.C., Isaksson M., Karlsson E.K., Hellmen E., Pielberg

G.R., Savolainen P., Wade C.M., von Euler H., Gustafson U., Hedhammar

A., Nilsson M., Lindblad-Toh K., Andersson L. and Andersson G. (2007)

“Duplication of FGF3, FGF4, FGF19 and ORAOV1 causes hair ridge and

predisposition to dermoid sinus in Ridgeback dogs”. Nature Genetics,

39(11), 1318-1320.

28. Savolainen, B. Rosen, A. Holmberg, T. Leitner, M. Uhlen,J. Lundeberg.

(1997),“Sequence analysis of domestic dog mitochondrial DNA for forensic

use”, Journal of Forensic Sciences. 42(4), 593–600.

29. Savolainen P., Zhang Y.P., Luo J., Lundeberg J. and Leitner T. (2002) “Genetic

evidence for an East Asian origin of domestic dogs”. Science, 298(5598),

1610-1613.

30. Tsuda K., Kikkawa Y., Yonekawa H. and Tanabe Y. (1997) “Extensive

interbreeding occurred among multiple matriarchal ancestors during the

domestication of dogs: Evidence from inter- and intraspecies

polymorphisms in the D-loop region of mitochondrial DNA between dogs

and wolves”. Gens & Genetic Systems, 72(4), 229-238.

31. Van Asch B., Pereira L., Pereira F., Santa-Rita P., Lima M. and Amorim A.

(2005) “MtDNA diversity among four Portuguese autochthonous dog

breeds: a fine-scale characterisation”. BMC Gentics, 6, 37.

32. Vila, P. Savolainen, J.E. Maldonado, I.R. Amorim, J.E.Rice, R.L. Honeycutt,

K.A. Crandall, J. Lundeberg, R.K.Wayne (1997), “Multiple and ancient

origins of the domestic dog”, Science 276: 1687–1689.

33. Vila C., Maldonado J.E. and Wayne R.K. (1999) “Phylogenetic relationships,

evolution, and genetic diversity of the domestic dog”. Journal of Heredity,

90(1), 71-77.

34. Webb K.M. and Allard M.W. (2009) “Identification of forensically informative

SNPs in the domestic dog mitochondrial control region”. Journal of

Forensic Sciences, 54(2), 289-304.

35. Webb K.M. and Allard M.W. (2009) “Mitochondrial genome DNA analysis of

the domestic dog: identifying informative SNPs outside of the control

region”. Journal of Forensic Sciences, 54(2), 275-288.

Internet

36. http://www.dogbreedinfo.com/thairidgeback.htm

37. http://www.bigdogbreeds101.com/dogs/2013/04/15/rhodesian-ridgeback/

38. http://m.english.vietnamnet.vn/fms/special-reports/13408/seeking-the-origin-of-

phu-quoc-ridgeback.html

39. http://petsvietnam.com/vietnam-pet-industry-blog/phu-quoc-ridgeback

dogs/seeking-the-origins-of-the-phu-quoc-ridgeback-dog-of-vietnam/

40. http://m.nguoiduatin.vn/chuyen-ky-bi-ve-loai-khuyen-vuong-o-phu-quoc-ky-3-

nhung-cau-chuyen-chua-loi-giai-ve-khuyen-vuong-tren-dao-ngoc-a77396.html

41. http://phuquocconservation.com/vi/tiem-nang-du-lich/80-gioi-thieu-chung-ve-phu-

quoc

42. http://khoahoc.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=1171&articleId=18225

43. http://dogsinvietnam.com/diendan/showthread.php?p=36847

44. http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%B3_l%C3%B4ng_xo%C3%A1y_Th%C3%A1

i_Lan

45. www.ncbi.nlm.nih.gov/

46. http://core.biotech.hawaii.edu/download/DNASequencingGuide.pdf

47. http://biology.tutorvista.com/animal-and-plant-cells/mitochondria.html

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phương pháp hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự các gen của hệ gen ty thể

Kết quả giải trình tự các gen của hệ gen ty thể được nhận dưới dạng biểu đồ huỳnh quang. Kết quả giải trình tự hai chiều được nhận dưới dậng file ABI (.abi). Sử dụng phần mềm FinchTV 1.4 để mở file với các trình tự được giải bằng mồi xuôi và mồi ngược.

Các cửa sổ sẽ hiện ra các sóng sắc phổ sau:

• Màu xanh lục: nucleotide loại A • Màu xanh dương: nucleotide loại C • Màu đen: nucleotide loại G • Màu đỏ: nucleotide loại T

Ở những kết quả giải trình tự tốt chúng ta sẽ thấy các đỉnh rõ ràng, không mập mờ thể hiện cho từng loại nucleotide. Sử dụng thanh Horizontal Scale và Vertical Scale để tăng hoặc giảm chiều rộng và chiều cao các sóng nhìn chưa rõ. Quan sát và xóa bỏ các đoạn đầu và đoạn cuối của kết quả giải trình tự (những đoạn có các đỉnh sóng mập mờ).

Hình 1. Các vị trí mập mờ ở phần đầu và phần cuối của kết quả giải trình tự

Hình 2. Kết quả sau khi xóa bỏ các vị trí mập mờ ở hai đầu trình tự

Đối với kết quả giải trình tự bằng mồi ngược, sau khi tiến hành xóa bỏ các vị trí

mập mờ, chọn Reverse Complement trên thanh công cụ.

Hình 3. Kết quả giải trình tự trước khi Reverse Complement

Hình 4. Kết quả giải trình tự sau khi Reverse Complement

Sau khi hiệu chỉnh hai trình tự mồi xuôi và mồi ngược, dùng tổ hợp phím nhanh “Ctrl + C” để sao chép trình tự của kết quả giải trình tự mồi xuôi (mồi ngược). Mở phần mềm SeaView 4.2, vào menu “Edit” chọn “Load sequence”. Cửa sổ mới hiện ra, dùng tổ hợp phím nhanh “Ctrl + V” để dán trình tự đã sao chép vào. Tiến hành đặt tên cho trình tự vừa được dán vào ô “Seq. name” trong cửa sổ, xong chọn “ Add to alignment”.

Lưu lại file dưới dạng FASTA (.fst) và đặt tên cho phù hợp. Làm tương tự với trình tự ngược lại.

Sau khi đã thêm vào, chọn hai trình tự của cùng một mẫu, vào menu “Edit” chọn “Dot plot” để sắp thẳng hàng hai trình tự. Hoặc vào menu “Align” chọn “Align selected sequences”.

Tiếp theo tiến hành kiểm tra các điểm sai khác giữa trình tự mồi xuôi và mồi ngược. Mỗi điểm sai khác giữa hai trình tự mồi xuôi và mồi ngược sẽ được chỉnh sửa dựa theo trình tự có sóng sắc phổ rõ ràng và đáng tin cậy hơn. Đối với các đoạn chỉ có trình tự mồi xuôi hoặc mồi ngược, việc hiệu chỉnh trình tự dựa trên việc quan sát các sóng sắc phổ. Nếu những điểm trong đoạn này không rõ ràng thì cần được loại bỏ hoặc phải tiến hành giải trình tự lại.

Hình 5. Trình tự xuôi và ngược sau khi được sao chép vào phần mềm SeaView và sắp thẳng hàng

Tạo trình tự thống nhất từ hai trình tự xuôi và ngược: trong cửa sổ SeaView chọn hai trình tự mồi xuôi và ngược, vào menu “Edit” chọn “Consensus sequence”. Kết quả tạo thành một trình tự kết hợp, có thể đổi tên bằng cách chọn trình tự consensus và vào menu “Edit”, chọn “Rename sequence”, đặt tên trình tự cho phù hợp.

Hình 6. Trình tự liên ứng hai trình tự xuôi và ngược

Phụ lục 2. Phương pháp sơ bộ xác định tên loài của các trình tự DNA vùng D- loop bằng thuật toán BLAST

Để xác định các trình tự DNA vùng D-loop sau khi giải trình tự và hiệu chỉnh có phải thuộc loài Canis lupus không ta sử dụng BLAST.

 Bước 1: Vào trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/  Bước 2: Chọn nucleotide blast  Bước 3: sao chép và dán trình tự cần phân tích vào cửa sổ “Entẻ Query Sequence”. Trong tùy chọn “Database” chọn “nucleotide collection” (nr/nt). Các tùy chọn khác đặt như mặc định.

Hình 7. Giao diện của ứng dụng nucleotide blast và trình tự vùng D-loop của chó Thái Lan được dán vào chuẩn bị cho phân tích

 Bước 4: Chọn BLAST để phân tích. Sau khi phân tích xong nhận được kết quả

như hình 3.8

Hình 8. Kết quả phân tích nhờ thuật toán BLAST đối với mẫu chó Thái Lan

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan bằng kĩ thuật long PRC và so sánh quan hệ di truyền giữa chó có xoáy lưng Thái Lan và Phú Quốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Huỳnh Thị Bích Liễu

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI HỆ GEN TY THỂ CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN BẰNG KĨ THUẬT LONG-PCR VÀ SO SÁNH QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Huỳnh Thị Bích Liễu

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI HỆ GEN TY THỂ CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN BẰNG KĨ THUẬT LONG-PCR VÀ SO SÁNH QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu và các kết quả

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về giống chó Phú Quốc-Nguồn gốc giống chó Phú Quốc Việt

Chương 2

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

Chương 2. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN

VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo