Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng Enzym Cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH KHÖU PHÖÔNG YEÁN ANH

Chuyeân ngaønh : Vi sinh vaät Maõ soá : 60 42 40

LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC

NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC:

TS. TRAÀN THANH THUÛY

TS. VOÕ THÒ HAÏNH

Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2007

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thanh Thủy, TS. Võ

Thị Hạnh- Người đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận

lợi cho tôi thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy Cô trong Bộ môn Vi sinh

đặc biệt là cô Tuyến và Ths. Phương phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh

trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô trong khoa

Sinh học, cùng toàn thể quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy trong suốt khóa

học.

Tôi xin gởi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục đào tạo tỉnh An Giang, Trường

THPT Vĩnh Trạch – An Giang, những người thân trong gia đình, bạn bè, đã

giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học.

Tác giả luận văn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMP : Adenozin mono photphat

CAP : Cataleolite gene Activator Protein

CMCase : Carbomexymethyl cellulase

CMC : Carboxymethyl cellulose

CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase

CBHI : Exoglucanase I

CBH II : Exoglucanase II

DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic

Enzym : Enzyme

EG : Endoglucanase

EGI : Endoglucanase I

EGII : Endoglucanase II

IU : Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ)

KHV : Kính hiển vi

KL : Khuẩn lạc

MT : Môi trường

PTN : Phòng thí nghiệm

PGA : Potato glucose agar

RNM : Rừng ngập mặn

VSV : Vi sinh vật

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Sự hiện hữu của rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ là kết quả của hơn 25

năm phục hồi và phát triển bằng các nổ lực to lớn của chính quyền và nhân

dân Thành phố Hồ Chí Minh. Vào ngày 21 tháng 1 năm 2000, Ủy ban MAB/

UNESCO đã công nhận RNM Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên tại

Việt Nam [55].

RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm và bền

vững, có khả năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt. Là nơi

có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ

khuẩn…., trong đó nấm sợi chiếm số lượng rất lớn. Nấm sợi đóng vai trò rất

quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái

RNM, nhờ có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase, protease,

kitinase, amylase, enzym phân giải dầu…..Đặc biệt, enzym cellulase do nấm

sợi sống trong RNM sinh ra là rất lớn. Do thảm thực vật dày đặc ở RNM Cần

Giờ là nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm

sợi có khả năng sinh enzym này.

Enzym cellulase là hệ enzym bao gồm các loại enzym: C1, Cx, β-

glucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành

glucose. Enzym cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp để chế biến thức

ăn chăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá

trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu

cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ

lượng enzym công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzym cellulase,

hemicellulase và pectinase. Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp

trên thế giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD.

Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn

enzym cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm MT. Việt

Nam là nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang

trên đà phát triển. Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào, cùng với sự

công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ô nhiễm MT đang trở thành nguy cơ

thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm

nghiệp là cellulose.

Trong khi đó, RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng VSV có hoạt

tính enzym cao chưa được khai thác. Các công trình khoa học nghiên cứu về

khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ cho

đến nay vẫn còn bỏ ngõ.

Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài: “Nghiên

cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ

rừng ngập mặn Cần Giờ”.

2. Lịch sử vấn đề nghiên cứu

 Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase

Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi

Trichoderma và Aspergillus.

Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học

Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất

cellulase đầu tiên. Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng

QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74].

Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột

cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68].

Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym

như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên

nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán

rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật [61].

Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger

trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE

(chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng

phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton [67].

Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và

một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men

bán rắn [40].

Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp

enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC [40].

Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với

nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22].

Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và

đặc điểm cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu

thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương

pháp lên men bán rắn [24], [57].

Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym

cellulase từ T. reesei và A. niger trên MT lên men bán rắn [40].

Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng

pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [27].

 Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM

Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu

về phân lập và phân loại nấm sợi trong hệ sinh thái RNM. Nhưng kết quả

nghiên cứu còn sơ sài, chưa đáp ứng được nhu cầu hiểu biết về sự đa dạng

của nấm sợi cũng như vai trò của chúng trong hệ sinh thái RNM [64].

Trước đây, người ta cho rằng điều kiện MT RNM quá khắc nghiệt,

không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Tuy nhiên, các

nghiên cứu gần đây cho thấy trong điều kiện sống đặc biệt như vậy, thì con

đường trao đổi chất của nấm sợi cũng khác hơn con đường trao đổi chất của

các VSV trên đất liền. Vì vậy, sẽ có những sản phẩm trao đổi chất có tính chất

đặc biệt hơn, khác lạ hơn trong đó có các enzym, chất kháng sinh mới …[18].

Nhưng đến nay cũng chưa có công trình đi sâu nghiên cứu về hoạt tính

sinh học của các chủng nấm sợi từ RNM.

Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị

Hằng và cs về nấm sợi RNM. Năm 2002, tác giả này tiếp tục nghiên cứu sự

đa dạng, nghiên cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbua

hydro của nấm sợi từ RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình. Riêng ở RNM

Cần Giờ chỉ có một số ít nghiên cứu về phân lập. Cho đến nay, vẫn chưa có

nghiên cứu nào về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở

RNM Cần Giờ [19], [20], [21].

3. Mục đích nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym

cellulase từ RNM Cần Giờ.

Đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được.

4. Đối tượng nghiên cứu

- Hệ sinh thái RNM Cần Giờ.

- Nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase ở RNM Cần Giờ.

- Enzym cellulase sinh ra từ nấm sợi.

5. Phạm vi nghiên cứu

Do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ nghiên cứu phân lập các chủng

nấm sợi ở 6 xã của huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đông, xã

Tam Thôn Hiệp, xã Long Hòa, xã Thạnh An, xã Lý Nhơn. Sau đó, chỉ nghiên

cứu một số chủng nấm sợi có khả năng sinh một loại enzym cellulase trong hệ

enzym này.

Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư

phạm Thành phố Hồ Chí Minh và PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới

Thành phố Hồ Chí Minh.

6. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ.

- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase

cao.

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và phân loại các

chủng nấm sợi được tuyển chọn.

- Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển

và sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng được chọn.

- Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào

việc phân hủy các chất phế thải, góp phần hạn chế ô nhiễm MT.

7. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ.

- Phương pháp vi sinh.

- Phương pháp hóa sinh.

- Phương pháp thực nghiệm.

- Phương pháp thống kê toán học.

8. Dự kiến cấu trúc

Luận văn gồm phần mở đầu, 3 chương và phần kết luận kiến nghị được

trình bày như sau:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Kết luận và kiến nghị.

Chương 1:

TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ

RNM chiếm một phần đáng kể trong các kiểu rừng ngập nước, thường

tồn tại ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trên thế giới hiện nay còn khoảng

15 triệu ha RNM phân bố ở các vùng bờ biển có bùn, các cửa sông lớn, các

vịnh cạn và các đầm mặn giáp với biển.

RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, là “lá phổi xanh”

của thành phố. Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế

xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sông, điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi và

tạo MT phát triển ngành thủy sản. Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ còn là nơi

cung cấp thức ăn, là nơi cư trú, sinh sản của các loài thủy sinh vật và động vật

có xương sống ở cạn. Hiện nay, Cần Giờ còn là địa điểm du lịch hấp dẫn với

3.000 - 5.000 du khách đến tham quan mỗi tuần [83].

RNM Cần Giờ hiện nay có diện tích khoảng 29,380 ha chiếm 41,18 %

đất huyện Cần Giờ [87]. Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió

mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11

đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm. Nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ nhiệt dao động trong ngày từ 5-70C. Chế độ bán nhật triều không đều. Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1].

Một nghiên cứu mới đây cho biết RNM Cần Giờ đã có 157 loài thực

vật; 63 loài phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc 3 ngành: Tảo khuê, Tảo giáp,

Tảo lam; 100 loài động vật đáy không xương sống như tôm, cua, sò ốc. Ngoài

ra, còn có 120 loài cá, trong đó có các loài có giá trị kinh tế cao như cá Ngát,

cá Dứa, cá Chẽm; 31 loài bò sát như cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu

nhũ như khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim [83]. Đây là các

nguồn thức ăn tốt nhất cho hệ nấm sợi sống trong RNM. Nấm sợi có khả năng

tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân

cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngoài ra, nấm sợi còn có thể sinh các

loại enzym khác như protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tôm, cua,

ốc, xác chết các loài động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể

hấp thu [1].

Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ [83]

Vậy, hệ nấm sợi là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một

nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ.

Chúng sử dụng chất hữu cơ từ thảm thực vật và hệ động vật phong phú làm

thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ.

1.2. Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase

Rất ít VSV có khả năng sinh tất cả các loại enzym cần thiết để phân

giải cellulose ở dạng tinh thể. Chúng phải tiết ra hệ enzym phức tạp, có khả

năng phân hủy cellulose theo phương thức khác nhau như thủy phân, oxy hoá

[51], [52].

Cellulose bị phân rã dưới tác dụng của vi khuẩn háo khí và kỵ khí.

Song khả năng phân hủy cellulose không bằng nấm, do vi khuẩn thường tạo

ra enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp hơn 0,1g/l [51]. Cellulase được

sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn trong dạ cỏ Ruminococcus albus (Berger

1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí

Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], các loài xạ khuẩn Streptomyces,

Thermomonospora …[51].

Nấm sợi là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy

cellulose. Các enzym cellulase sản sinh từ nấm sợi được tạo ra với nồng độ

rất cao, không có các dạng vật lý phức tạp như cellulase bắt nguồn từ vi

khuẩn và có tác dụng phân hủy rất mạnh cellulose. Các chi nấm có khả năng

sinh cellulase phổ biến là: Aspergillus, Alternaria tenuis, Celluvirio gilvus,

Clasdosporium, Penicillium, Fusarium, Myrotheticum, Trichoderma … [39].

1.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm sợi

Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ

kitin-glucan, kitozan. Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha)

không vách ngang hoặc có vách ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát triển

theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm

(mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể (hình 1.2). Hệ sợi nấm phát triển

thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3).

KL nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn. Bề mặt KL có thể mượt,

nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía

xuyên tâm, hoặc lồi lõm không đều. Mép KL trơn, răng cưa….

Hình 1.2. Bào tử mọc ra khuẩn ty [78] Hình 1.3. KL nấm [78]

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh

trên bề mặt sợi nấm.

Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm,

giọt tiết, sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng loài [78].

Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, không có cơ

quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh,

một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật [18].

Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo

kiểu vô tính hoặc hữu tính.

Bào tử vô tính. Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào

tử trần là dạng bào tử phổ biến nhất.

Hình 1.4. Các dạng bào tử trần của nấm sợi [78]

Sinh sản hữu tính. Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như:

đẳng giao, dị giao, và tiếp hợp.

Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [78]

Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi

(ascospores) và bào tử đảm (basidiospores).

1.2.2. Đặc điểm phân loại của nấm sợi

Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới

định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được

40.000 loài. Phân loại vi nấm vẫn đang ở thời kỳ phân loại học hình thái

(Phenetic classifications) dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc

điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản. Trong những năm gần đây,

tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một

diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm.

Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với

nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973),

V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996),

Robert A. samson (1989), Saccardo P.A (1880-1886), Barron G.L (1968),

Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984) …[78].

Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa

phân loại: Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng Hồng

Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại [8],

[9], [10], [12] [14], [27], [74].

1.2.3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi

Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả

năng sinh các chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh

tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có

khả năng phân giải nguồn cacbonhydro được ứng dụng trong xử lý ô nhiễm

MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất ….[5], [6], [40], [43].

 Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào

Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học

trong và ngoài cơ thể [29]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng

3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. Nấm sợi

có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym ngoại bào mạnh, phân giải và

chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym

đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase,

protease, amylase, pectinase và kitinase [6].

 Enzym cellulase. Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose

thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực

vật gồm cellulose (30-40%), hemi-cellulose và lignin (15-30%). Các chủng

nấm sợi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus….có khả năng sinh enzym

cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất

thải hữu cơ chứa cellulose…[19], [20], [21].

 Enzym protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên

kết nhau bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid

ngắn. Nấm sợi có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi

Aspergillus, Penicillium,… Được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột

giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da,

công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…[5], [6], [29].

 Enzym amylase. Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ

chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase

(α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-

glucoside và α-1,6-glucoside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối

cùng là glucose. Nấm sợi có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là

những tác nhân không thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium,

Trichoderma, Rhizopus, Mucor….. Được ứng dụng trong sản xuất sirô, sản

xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia

súc, trong công nghiệp dệt…[29], [30].

 Enzym kitinase. Kitin là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl-

glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM,

lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc…rất nhiều. Nấm sợi Trichoderma,

Glycladium, Chaetomium,… sinh enzym kitanase phân giải kitin, đồng thời

tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin,

chống các loài côn trùng có vỏ kitin.

Như vậy, nấm sợi còn có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống

các VSV gây bệnh và côn trùng có hại trong nông-lâm- ngư nghiệp [18], [19].

Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả

năng sinh enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp

và khó phân giải, góp phần xử lý ô nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu.

Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ lượng dầu tràn vào từ biển gây ô nhiễm và độc

hại đối với sinh vật sinh sống ở RNM Cần Giờ, các loài nấm sợi có khả năng

phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó.

Hình 1.6. Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch [78]

 Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi

Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện

tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm

hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác.

Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn. Chất

kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C,

Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh

viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật

chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương. Những vấn đề về chất kháng sinh

được sinh ra từ VSV đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ

trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [10].

 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng

Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều. Các axit hữu

cơ như axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng

nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong

y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm

sợi A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì [17]. Ngoài ra, các nhà khoa học

Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng

nấm sợi F. monoforme và F. oxysporum [29].

Tuy nhiên, có rất nhiều loài nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ

dùng, thực phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số nấm

sợi tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc

tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số gây bệnh cho người và động vật như

hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng

lùn, thối cổ bông ở lúa…[29].

1.3. Enzym cellulase từ nấm sợi

Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease,

kitinase…được chú ý nhiều nhất do có những ưu điểm: Có hoạt tính cao; khối

lượng enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu

rẻ tiền; có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp …[29].

1.3.1. Khái quát về enzym

 Cấu trúc

Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào

các phản ứng sinh học [30].

Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo

từ L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia

phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzym.

Enzym gồm 2 nhóm: Nhóm enzym một cấu tử gồm những enzym có

thành phần hóa học duy nhất là protein và nhóm enzym hai cấu tử gồm những

enzym có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzym có vai trò xúc

tác, phần thứ hai là coenzym gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc

đẩy quá trình xúc tác. Ngoài ra, có một số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn,

…đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và

coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử [30].

 Cơ chế hoạt động

Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt

động. Trung tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc không gian tương ứng

với cơ chất (S) mà chúng tham gia. Phản ứng không có sẳn mà được hình

thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ

khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S).

Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết

yếu tạo thành phức enzym - cơ chất (E-S).

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu

hình không gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và

tạo ra sản phẩm. Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra.

Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản

phẩm và tách khỏi enzym.

Phản ứng tổng quát:

E + S  E-S  E + P

E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products)

1.3.2. Cellulose và enzym cellulase

1.3.2.1. Cellulose

Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima, 2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm.

Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành

nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được

tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết

đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi,

giấy vụn, mùn cưa…[5], [6]. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực

vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông

và 40-50% trong gỗ [52].

Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là

cellobiose có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết

β-D-1,4-glucoside. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành

những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có cấu trúc không đồng nhất. Có những

phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình.

Hình 1.7. Cấu trúc đơn vị cellulose [84]

Hình 1.8. Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose [84]

Hình 1.9. Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian [84]

1.3.2.2. Enzym cellulase

 Cấu trúc

Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn

tại ở dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase,

pentozanase thành hệ enzym gọi là Citolase [39]. Cellulase là một phức hệ

enzym bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidase tham gia những phản

ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose [29].

Hình 1.10. Cấu trúc enzym cellulase trong không gian [86]

 Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự

nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình).

 Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thủy phân cellulose

phản ứng thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại: -

- Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác

dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử

cellulose. Được chia làm hai loại EGI, EGII. Cả hai loại enzym này có thể

hoạt động ở nhiệt độ khá cao.

Hình 1.11. Cấu trúc tinh thể của endoglucanase [81]

- Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải

chuỗi trên thành disaccarit gọi là cellobiose từ đầu không khử. Bao gồm hai

loại CBHI và CBHII:

* CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit

amin. Enzym này tác động lên cellulose vô định hình, ưu tiên liên kết với

vùng tinh thể của cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC.

* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin.

CBHII liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vô định hình, không tác động lên

cellulose biến tính [52].

Hình 1.12 . Cấu trúc CBH [80] Hình 1.13. Vị trí cắt exoglucanase [80]

 β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose

thành glucose. Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất

rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt

độ cao.

 Cơ chế hoạt động

Cx β-Glucosidase C1

Cellobiose Glucose Cellulose Cellulose phản ứng

Hình 1.14. Cơ chế tác động của enzym cellulase [39]

Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết

hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng.

Sau đó Cx tiếp tục thủy phân cellulose phản ứng thành các phân tử

cellobiose. Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.

 Điều hòa sinh tổng hợp enzym cellulase

Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các loài nấm sợi được điều hòa

ở mức độ phiên mã, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI luôn cao nhất (Pettila,

1993). Tỷ lệ enzym CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp

cellulase được tiết ra bởi T. reesei (theo Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã

hóa các thành phần khác của enzym cellulase luôn ở trạng thái ổn định [40]

Quá trình sản sinh enzym cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm

ứng và ức chế bởi glucose. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng

trên MT có chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose, lactose. Còn trên MT có

chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không tạo thành enzym

cellulase (Biaria và Mishra, 1989).

Hơn nữa, hoạt tính cellulase còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất

ức chế trong MT nuôi cấy. Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là có

tác dụng kìm hãm sự phát sinh cellulase ở S. commune [52].

Khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase. Chẳng

hạn, hai loại proteaza axit được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có

khả năng làm tăng 10 lần hoạt tính endoglucanase của P. chrysosporium [52].

Quá trình tổng hợp enzym cellulase cảm ứng còn chịu tác động của

AMP vòng (AMPv). Chất này có tác dụng kích thích quá trình sao chép mã

của các operon phân giải nhờ một loại protein đặc biệt làm trung gian gọi là

protein nhận AMPv (CAP). Khi AMPv kết hợp với CAP tạo thành phức hợp

có tác dụng hoạt hóa gen operator làm cho RNA-polymerase dễ dàng kết hợp

với chúng để bắt đầu sao chép mã [30].

Nấm sợi chịu tác động trực tiếp của các yếu tố bên ngoài rất mạnh và

phản ứng lại với tác động đó rất nhanh. Vì thế, có thể sử dụng pH, nhiệt độ và

đặc biệt là cơ chất mà chúng tham gia phân hủy để điều khiển tổng hợp

enzym. Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp

enzym cảm ứng sẽ tăng dần. Nếu cứ tiếp tục tăng liều lượng cơ chất thì sẽ đến

một mức nào đó quá trình này sẽ chựng lại và giảm do tăng áp suất thẩm thấu

bởi cơ chất [30].

1.3.3. Các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành

enzym cellulase của nấm sợi trên MT lên men bán rắn

1.3.3.1. Thành phần MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase

 Nguồn dinh dưỡng cacbon

Trong MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase nhất thiết phải có

cellulose là chất cảm ứng và nguồn cacbon. Nấm sợi có khả năng đồng hóa

rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất,

trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba

chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và

Entner Doudoroff. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase

thường là giấy lọc, bông, bột cellulose, cám, lõi ngô, mùn cưa, bã mía, trấu,

rơm, than bùn, CMC, ….Các chủng Trichoderma nuôi trên MT có nguồn

cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất [38].

Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh

enzym cellulase. Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu

tấn/năm. Ở Việt Nam, bã mía phần lớn dùng để đốt lò hơi, làm phân bón hữu

cơ, bột giấy, trồng nấm ăn….Tuy nhiên, không sử dụng hết và đã gây ô nhiễm

MT xung quanh. Bã mía có hàm lượng cellulose rất cao 46% (theo

A.G.Keller, 1964), ngoài ra còn chứa hemicellulose, lipid và sáp, chất

khoáng, lignin, silic nên là một cơ chất cảm ứng tuyệt vời cho nấm sợi sinh

enzym. Ngoài ra, cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6 : 4) do nó có chứa

đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp

enzym của nấm sợi, có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết

dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng dinh dưỡng cần thiết.

 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là

muối nitrat. Natri nirat làm cho MT kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự

tạo thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh

tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính sinh lý của từng chủng. Cao nấm men có

tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngô có khả năng sinh tổng hợp

exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men. Nước chiết nấm men

chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, còn cao ngô kích thích CHBI

và CBHII. Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt của các

axit amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố kích thích sinh trưởng

[38], [39], [40].

 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trò quan trọng như

tham gia vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm

sợi, tham gia vào thành phần cấu tạo prôtêin, enzym, điều hòa pH MT nuôi

cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase. Nồng độ tối thích của Zn

là 0,11- 2,2 mg/l, Fe 2 - 10 mg/l, Mn 3,4 - 27,2 mg/l. Biotin và Tiamin không

có ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzym này [38].

1.3.3.2. Yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase

Ảnh hưởng của độ ẩm

Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất

rắn. Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30- 80%

(Moo-Young, 1983). Trong quá trình nuôi cấy nấm sợi thu enzym cellulase

độ ẩm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym và hoạt tính của enzym.

Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm sợi là 50-60%, nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo

điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều

bào tử ở nấm sợi, hoạt tính của enzym sẽ giảm. Kim (1985) cho biết tốc độ

sinh trưởng tối ưu của T. reesei ở độ ẩm 60%, nhưng khả năng sinh tổng hợp

cellulase ở độ ẩm thấp hơn xấp xỉ 50% [38], [40].

Ảnh hưởng của pH

Sự sinh trưởng của nấm sợi sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ

chất. Cơ chất bị oxy hóa không hoàn toàn sẽ sinh ra acid, hoặc hấp thụ ion

amonium sẽ làm giảm pH. Ngược lại, sự giải phóng ammonia qua sự loại

nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH. pH tối ưu cho các

loài nấm sợi khác nhau được sử dụng trong lên men bán rắn có giá trị từ thấp

nhất là 3 đến cao nhất là 8 (Prior, 1992) tùy vào từng chủng nấm sợi khác

nhau. Nấm sợi Aspergillus, Penicillium và Rhizopus có thể giảm pH của MT

xuống dưới 3, Đối với các chủng nấm Trichoderma, Sporotrichum, Pleurotus,

pH ổn định hơn ở khoảng 4 và 5 [40].

Trong suốt quá trình nuôi cấy nấm sợi ta có thể điều chỉnh pH của MT

bằng axit HCl, H2SO4, NaOH, KOH. Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong

nuôi cấy T. viride ở qui mô pilot trên MT hạt cà phê-đường bằng cách phun

dung dịch urea, do hoạt động của urease của nấm sợi làm tăng pH qua việc

tạo ammonia [29].

Ngoài ra, việc điều chỉnh pH thích hợp trong quá trình nuôi cấy nấm

sợi hạn chế sự tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [73].

 Ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh

enzym cellulase. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 280C-320C, tối đa dưới 500C [40], [73]. Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp

có thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình

tổng hợp enzym sẽ bị ức chế. Theo Raimbaut & Alazard (1989) cho biết nhiệt

độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A. niger trên MT bột khoai mì là 35- 400C, ngược lại ở 450C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả năng sinh enzym

giảm [40].

 Ảnh hưởng của MT khí

MT không khí quan trọng nhất là khoảng không gian giữa các tiểu phần

cơ chất, vì đây là nơi mà sinh khối nấm sợi sinh trưởng. Oxygen phải khuếch

tán từ khoảng không giữa các hạt cơ chất vào sinh khối, và CO2 phải khuếch

tán từ sinh khối vào khoảng không giữa các hạt cơ chất. Trong nuôi cấy người

ta thường thiết kế dụng cụ nuôi cấy sao cho sự lưu thông không khí dễ dàng

và cao nhất. Nuôi trên khay thì phía dưới đáy các khay có đục lỗ để không khí

dễ lưu thông, nuôi trong hộp thì thiết kế xung quanh hộp có đục lỗ vừa nhỏ

sao cho MT không bị thoát ra ngoài, đồng thời có tác dụng thông khí, nấm sợi

sẽ phát triển đều ở tất cả các mặt có tiếp xúc với không khí….

Trong nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase, để tạo khả năng thoáng

khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20- 25% sẽ làm

tăng độ xốp của MT, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu

thông trong lòng MT, đồng thời trấu còn là cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp

của enzym cellulase [38].

 Ảnh hưởng của cơ chất và các chất kìm hãm

Ở giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng,

nhưng khi tốc độ phản ứng đạt cực đại, dù ta có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ

phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo [39]. Nguồn cacbon

và nitrogen ảnh hưởng mạnh đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzym. Do

đó, nếu cơ chất không chứa đủ các thành phần dinh dưỡng thì phải bổ sung

thêm kịp thời.

Các chất kìm hãm là những chất hóa học có thể làm giảm hoặc mất

hoạt tính enzym, thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ… Các chất

kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của

cơ chất nên sẽ kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, kết quả là enzym

không thể kết hợp được với cơ chất. Các chất kìm hãm không cạnh tranh kết

hợp với enzym ở vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzym làm giảm tốc độ

phản ứng của enzym [30].

1.3.4. Ứng dụng của enzym cellulase

 Một số chế phẩm enzym cellulase trên thế giới và Việt Nam

Ngày nay, trên thế giới và cả Việt Nam, các chế phẩm sinh học chứa

các VSV có khả năng sinh các loại enzym được sản xuất và sử dụng ngày

càng rộng rãi và phổ biến trong các lĩnh vực chăn nuôi, trồng trọt,…. Điều

này giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế được tình trạng ô nhiễm MT.

Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma

reesei, Aspergillus niger…và gần đây là các chủng vi khuẩn [30].

Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dùng trong

thức ăn gia súc [40].

Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T. reesei và từ A. niger trong

công nghiệp thực phẩm [40].

Ở Nhật, hãng Amano hàng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm

enzym các loại để dùng trong nông nghiệp. Enzym “Panxenlase” chứa

cellulase, hemicellulase, protease và amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuôi.

Chế phẩm “Cellubrix”, “Cellusoft”, “Onozuka” dùng trong công nghiệp làm

mềm vải, trong thức ăn gia súc [40].

Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, công

nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol [77].

Ở Liên Xô, chế phẩm “Cellolignorin” được sử dụng trong chăn nuôi,

hoạt tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase [77].

Ngoài ra, còn có các chế phẩm cellulase khác được tạo ra bởi các nhà

sản xuất: Cellulaset và Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament

CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase

TAP [AM], Cytolase [GR] [74].

Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI,

BioII, BioIII … có dạng bột, chứa các enzym amylase, protease, cellulase và

các VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho bò, heo, cá. Chế phẩm có tác dụng

phòng chống các chứng rối loạn tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao

thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[78]

Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm

Trichotech chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm này có dạng rắn, tơi xốp,

nhẹ, màu xám nâu đậm, giúp cây trồng chống được các loại nấm bệnh….[82].

Công ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (TP. Hồ Chí Minh) sản xuất

chế phẩm TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, có dạng bột. Có tác dụng

hạn chế nấm hại, cải tạo đất, ủ phân bón cho cây trồng.

Công ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng

(Bình Dương) đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh

enzym cellulase, dùng xử lý nước ao nuôi tôm cá, kích thích tiêu hóa, ở gia

súc…như: MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin, Biolaczym…..

 Ứng dụng của enzym cellulase

Enzym cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà công nghệ vì chúng

có thể được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau:

 Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose

Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy.

Trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu (trên 8 tháng), ở điều kiện

khí hậu nhiệt đới. Thời gian phân hủy các chất thải này càng lâu càng gây ô

nhiễm đất, nước, không khí. Các chất thải này cũng khó tham gia vào dây

chuyền chuyển hoá vật chất của thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái. Để

khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ chế phẩm VSV

giàu cellulase, kết quả là các chất thải bị phân hủy trong thời gian dưới 1

tháng, góp phần hạn chế MT [38].

 Ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm gia súc

Các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật

chứa nhiều cellulose gây ra hiện tượng khó tiêu hóa ở người. Người và những

động vật không nhai lại thường thiếu VSV phân giải cellulose trong đường

tiêu hóa. Do đó, việc chế biến thực phẩm nhất là một số sản phẩm đồ hộp

bằng chế phẩm cellulase có ý nghĩa làm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn. Nhiều

nghiên cứu cho thấy việc thêm chế phẩm cellulase vào thực phẩm gia súc làm

tăng trọng đàn lợn và tăng chất lượng thịt [38].

 Ứng dụng làm phân bón VSV

Các chế phẩm VSV có khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được

bón vào đất trồng có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các

chất hữu cơ tạo thành mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh [29], [38].

 Ứng dụng trong kỹ thuật di truyền

Enzym cellulase sẽ phá vỡ thành tế bào thực vật để tạo tế bào trần, rất

cần thiết trong quá trình chuyển gen của tế bào thực vật [38].

 Ứng dụng trong công nghệ bột cellulose và giấy, công nghệ sợi dệt,

công nghiệp chất tẩy rửa

Đây là hướng được các nhà sản xuất quan tâm nhiều trong những năm

gần đây. Sử dụng enzym cellulase để tách mực khỏi giấy báo và tạp chí cũ,

cải thiện tính chất quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất từ bột

khử mực. Ở Mỹ, hơn 40%, ở Nhật Bản khoảng 55% tổng lượng giấy sử dụng

là bắt nguồn từ giấy loại.

Trong công nghệ sợi dệt, enzym này được sử dụng để xử lý quần áo bò,

làm bóng vải bông, vải sợi nhân tạo giúp vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng

lên, bề mặt vải đẹp hơn.

Trong công nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzym cellulase

làm sạch các chất bẩn trong lòng xơ bông tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy

rửa thông thường [54].

Chương 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

 Đối tượng nghiên cứu

- Nấm sợi sinh enzym cellulase phân lập từ RNM Cần Giờ.

- Các VSV kiểm định: E. coli, Bacilllus subtilis được cung cấp từ

Viện Pasteur.

 Hóa chất

- Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: Glucose, dầu DO, pepton,

cazêin, kitin, tinh bột tan, agar, cồn đốt, nước cất, nước biển.

- Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4 , KH2PO4., KCl,

NaCl, NaOH, NaNO3, MgSO4. 7H2O, FeSO4.7H2O, HgCl2, Na-acetate, lugol,

lactophenol, xanh metylen Loeffler….

- Hóa chất có nguồn gốc từ Đức: thuốc thử DNS, Yeast extract, ….

- Hóa chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối Tartrat K Natri…

 Cách pha chế thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid) [32].

- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic: Cân 10g DNS cho vào

becher (cốc thủy tinh) 1000ml, thêm 400ml nước cất, đặt becher vào nước 800C, khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150 ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C.

Thêm 300g muối Tartrat K Natri vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C, làm lạnh đến nhiệt độ phòng vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất

đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp.

- Dung dịch lactose: Hòa tan 0,12g lactose với 80ml nước cất và

chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều.

- Dung dịch DNS-lactose: Trộn 150ml DNS với 50ml dung dịch lactose.

 Thiết bị, dụng cụ

 Các thiết bị

Nồi hấp vô trùng Autoclave (Đài Loan)

Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

Tủ sấy Memmert (Đức)

Tủ ấm Sanyo (Nhật)

Tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật)

Kính hiển vi Olympus (Nhật Bản)

Tủ lạnh National (Tokyo, Nhật Bản)

Máy đo pH Hana (Nhật)

Máy li tâm Heraeus (Đức)

Cân điện Sartorius (Đức)

Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ)

Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus (Nhật)

Máy nghiền mẫu (Đức)

Máy đo độ ẩm Sartorius (Đức)

Máy lắc Gerhardt (Đức)

Máy li tâm Hettich (Đức)

Máy đo quang phổ UV/ Visible Spectrophometer (Nhật)

 Các dụng cụ thí nghiệm

Thước đo KL, lò điện, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa

petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy báo cũ,

lame, lammel, bông mỡ, bông thấm nước….

 Môi trường

 MT phân lập, nuôi cấy và giữ giống, định danh nấm sợi

 MT1: MT Czapek- Dox cải tiến [29], [58]

: 3,5 g - NaNO3

1,5 g : - K2HPO4

0,5 g : - MgSO4.7H2O

- KCl 0,5 g :

0,01 g (vết) : - FeSO4.7H2O

- Glucoza 20 g :

- Agar 20 g :

- Nước biển 1000ml :

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút

 MT 2: MT D [20], [58]

- Glucoza 0,05 g :

- Peptone 0,05 g :

- Yeast extract 0,05 g :

- Agar 30 g :

- Nước biển 1000 ml :

- pH = 6,5. Khử trùng 1atm trong 30 phút

 MT 3: MT cao men agar-Yeast extract agar (YEA) [20], [58]

- Cao nấm men 4 g :

- Glucoza 20 g :

- Agar 20 g :

- Nước biển 1000 ml :

- pH = 5,5 – 6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút

 MT 4: MT Potato glucose agar (PGA) [7]

- Nước chiết khoai tây 200 ml :

- Glucoza : 20g

- Agar : 20 g

- Nước biển : 1000 ml

- pH = 5,5- 6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút

* Cách chế nước chiết khoai tây

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 200g, xắt lát, thêm 1 lít nước cất, đun

sôi trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong.

 MT thử hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

 MT 5: MT thử hoạt tính cellulase [47]

: 3,5 g - NaNO3

: 1,5 g - K2HPO4

: 0,5 g - MgSO4.7H2O

- KCl : 0,5 g

0,01 g (vết) : - FeSO4.7H2O

- CMC : 10 g

- Agar : 20 g

- Nước biển 1000ml :

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút

 MT 6: MT thử hoạt tính protease [10]

: 3,5 g - NaNO3

: 1,5 g - K2HPO4

: 0,5 g - MgSO4.7H2O

- KCl : 0,5 g

: 0,01 g (vết) - FeSO4.7H2O

- Cazêin : 15 g

- Agar : 20 g

: - Nước biển 1000ml

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút

 MT 7: MT thử hoạt tính amylase [47]

: 3,5 g - NaNO3

: 1,5 g - K2HPO4

: 0,5 g - MgSO4.7H2O

- KCl : 0,5 g

0,01 g (vết) : - FeSO4.7H2O

- Tinh bột tan : 15 g

- Agar : 20 g

- Nước biển 1000ml :

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút

 MT 8: MT thử hoạt tính kitinase [22]

: 3,5 g - NaNO3

: 1,5 g - K2HPO4

: 0,5 g - MgSO4.7H2O

- KCl : 0,5 g

: 0,01 g (vết) - FeSO4.7H2O

- Bột kitin : 10 g

- Agar : 20 g

: - Nước biển 1000ml

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút

* Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tôm

- Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô. - Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-750C/ 4 giờ, sau đó

rửa sạch bằng nước cất.

- Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26- 300C/ 16 giờ, rửa sạch.

- Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.

 MT 9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [29]

: 0,3 g - KH2PO4

: 0,4g - MgSO4

: 3 g - KNO3

: 0,7 g - Na2HPO4

- Nước biển : 1000ml

- Dầu DO : 5ml

- pH = 5,5- 6,0. Khử trùng ở 1atm/ 30 phút

 MT nuôi cấy nấm sợi tạo enzym

 MT 10: MT xốp cơ sở [18], [30]

60% - Cám :

: 30% - Bột đậu nành

: 10% - Bột ngô

- Trấu : bổ sung thêm 25%

- Độ ẩm : 60%

- pH = 5,0 – 5,5. Khử trùng 1atm/ 60 phút

 MT nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định

 MT 11 : MT Meat pepton agar (MPA) [27]

: - Pepton 5g

: - NaCl 5g

: - Cao thịt 5g

: - Agar 20g

- Nước cất : 1000 ml

- pH= 7,5. Khử trùng 1atm/ 30 phút

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ [58]

Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã

Tam Thôn Hiệp, xã An Thới Đông, xã Long Hòa, xã Bình Khánh, Lâm

Viên….Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2 km, các điểm lấy mẫu

cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ

(hình 2.1). Lấy mẫu phân lập trong 3 tháng (tháng 7, 8, 9), mỗi tháng lấy mẫu

nhiệt độ khoảng

một lần. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn 30 ‰ , 290C, pH 7,6.

Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu ở RNM Cần Giờ

Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5- 10 cm, lá vàng sắp rụng, lá

rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân

hủy trên mặt đất.

Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi

nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu

được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ.

2.2.2. Phương pháp vi sinh

2.2.2.1. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo

Uyenco, 1988 [58], [78]

a- Lấy mẫu và pha loãng mẫu

Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển

Cần Giờ vô trùng.

Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/

phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1.

Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml

nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2.

Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5.

b- Cấy mẫu

Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa MT1, MT2,

MT3. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó

trải tiếp hai đĩa tiếp theo.

c- Ủ mẫu

Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 – 7

ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.

d- Làm thuần

Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước biển vô

trùng, trải lên đĩa lần hai. Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau,

soi dưới KHV đều có một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết.

Sau đó chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo

quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hóa.

2.2.2.2 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên MT thạch có

lớp dầu khoáng [6]

Dầu khoáng là parafin hay vaselin, hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi

sấy khô ở 1700C trong 1- 2 giờ, để nguội.

Chuẩn bị 3 ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp.

Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt. Hàn kín ống nghiệm bằng parafin bảo quản ở nhiệt độ 40C.

Phương pháp này có thể bảo quản trong 1- 3 năm.

2.2.2.3. Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi [5], [6], [11]

Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo khuẩn

lạc (KL) khổng lồ theo các bước sau:

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng.

- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào

ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù.

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm

điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2,3 hộp.

- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát.

Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:

+ Kích th ước KL để biết tốc độ phát triển của nó.

+ Hình dạng KL.

+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc.

+ Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra.

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT.

+ Đặc điểm của mép KL.

+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL…….

2.2.2.4. Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi [6]

Phương pháp cấy khối thạch của J.T.Dunean

- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong

các đĩa petri.

- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8 mm, khoan các khối thạch.

- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước,

nước cất vô trùng.

- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề

xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch.

- Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong

các hộp petri có sẳn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô

trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày.

- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc

nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất.

- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt

lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai.

- Dùng kính hiển vi (KHV) quan sát, vẽ và mô tả các đặc điểm:

+ Hình dạng cuống sinh bào tử.

+ Hình dạng thể bình.

+ Hình dạng các thể bọng.

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn.

+ Đặc điểm bào tử đính.

+ Màu sắc, kích thước bào tử…

- Chụp hình trên KHV quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần.

2.2.2.5. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase

[3], [22], [29], [34],[36], [40], [42]

a. Nguyên tắc

Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẳn trong MT để sinh trưởng tạo

thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối

nấm sợi lẫn enzym thô.

b. Cách tiến hành

Nấm sợi được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa MT PGA

ủ trong tủ ấm trong thời gian 4-5 ngày. Rửa bào tử từ bề mặt thạch nghiêng

với dung dịch chứa Tween 80 0,1%, thu được huyền phù bào tử của từng

chủng.

Cho vào bình tam giác chứa 30g MT 11 đã làm ẩm và hấp khử trùng ở

1atm trong 60 phút. Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 3- 4 ngày.

Sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem sấy nhẹ, có quạt gió ở nhiệt độ 400C để đạt độ ẩm 8- 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ thuỷ

tinh. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô [40], [29], [14].

2.2.2.6. Phương pháp ly trích enzym cellulase [29]

a. Nguyên tắc

Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym trong nước cất

tạo thành dịch enzym.

b. Cách tiến hành Chế phẩm enzym thô thu được đem sấy khô ở 400C, nghiền mịn, cho

nước cất vào với tỉ lệ 1: 3, lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng /phút/ 1 giờ.

Sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút/ 15 phút, thu dịch trong, làm lạnh.

Để giảm ảnh hưởng của đường tự do có trong môi trường lên men, đem tủa dịch lọc bằng cồn 960 đã làm lạnh theo tỉ lệ (1:3). Thu tủa và hòa lại bằng

dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH5, ta được dịch enzym sử dụng dần.

2.2.3. Phương pháp hóa sinh

2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym carboxymethyl

cellulase (CMCase) [28], [40]

a. Nguyên tắc

Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzym cần thiết để giải phóng

ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC ở tốc độ 1µmol/phút dưới

các điều kiện phản ứng.

Phương pháp này dựa vào sự thủy giải cơ chất carboxymethyl

cellulose (CMC) bằng enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) ở pH 5,0 và 400C. Sau phản ứng sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng

với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid tạo thành phức màu đỏ sậm và được

xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540nm.

b. Cách tiến hành

Các hóa chất cần chuẩn bị:

- Dung dịch cơ chất CMC 1%: Cân chính xác 1,0g CMC, hòa tan

trong 80 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định

mức 100 ml, thêm dung dịch đệm đến vạch và lắc đều.

- Dung dịch enzym: Pha loãng dịch enzym với dung dịch đệm Na-

acetate 50 mM, pH 5,0 đến độ pha loãng thích hợp.

- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS).

- Dung dịch lactose.

- Dung dịch DNS-lactose.

* Dựng đường glucose chuẩn

Hòa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định

mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịch glucose

nồng độ 1mg/ml.

Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:

Số thứ tự các ống/

nồng độ glucose 1/0 2/0,1 3/0,2 4/0,3 5/0,4 6/0,5 7/0,6

(mg/ml)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - dd glucose

) l

m

1 1 1 1 1 1 1 - dd CMC

1%

2 2 2 2 2 2 2 - dd DNS-

lactose

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 - Nước cất

( g n u s ổ b t ấ h c c á C

Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút.

Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy

quang phổ UV/Visible Spectrophometer, bước sóng 540 nm.

Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và độ hấp thụ OD

dựng đường biểu diễn sự biến thiên của OD và nồng độ glucose chuẩn.

Đường này là một đường thẳng đi qua gốc tọa độ.

* Tiến hành phản ứng

- Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm thử thật (ống TN),

thay 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5 đối với ống đối chứng (ĐC) - Đặt vào bể ổn nhiệt 400C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa

lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400C/5 phút.

- Sau đó, thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzym

và lắc đều. Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút.

- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều để phản ứng enzym.

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng

trong một chậu nước mát.

- So màu ở bước sóng 540nm, dựa theo đường glucose chuẩn tính được

nồng độ glucose của mẫu thí nghiệm.

c. Tính kết quả

- Giá trị hệ số glucose trung bình (F):

F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +….+0,6/AG0,6)/6

- Hoạt tính enzym :

CMCase (IU/g) = ( AT – AB) x F x (1.000/180) x (1/10phút) x (1/1.0 ml) x (1/C)

Trong đó:

F : Hệ số glucose (mg/ml)

AG : Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn.

AT : Độ hấp thụ của dung dịch có phản ứng enzym (ống TN)

AB : Độ hấp thu của dung dịch không có phản ứng enzym (ống ĐC).

1.000: Hệ số chuyển đổi mg thành µg.

180 : Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ µg sang µmol.

10 phút: Thời gian phản ứng.

1.0 : Thể tích dung dịch enzym (ml).

C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml).

2.2.3.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi

bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [47]

a. Nguyên tắc

Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy,

độ đục MT giảm, MT trở nên trong suốt. Độ lớn của phần MT trong suốt

phản ánh hoạt động của enzym.

Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa

nghiên cứu sâu.

b. Tiến hành thí nghiệm

* Phương pháp cấy chấm điểm

- Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thử hoạt tính

enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT 6, MT7, MT8, MT9, MT10.

- Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi (3 điểm) lên bề mặt MT. - Ủ trong tủ ấm 300C trong 3-4 ngày.

* Phương pháp khuếch tán trên MT thạch

- Thu dịch nuôi cấy: Lấy 10g MT nuôi cấy nấm sợi trên MT11 đã ủ 3

ngày trong tủ ấm, sấy khô, nghiền với 100ml nước cất, ly tâm 10 phút, tốc độ

quay 5000 vòng/ phút. Thu được dịch enzym thô.

- Dùng khoan nút chai (d=8mm) vô trùng, khoan các lỗ thạch trên MT

thử hoạt tính các enzym cellulase, protease, amylase, kitinase trên các đĩa

petri. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 1- 2 giờ, sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm

trong 24 giờ. Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol, HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch và

đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo KL.

c. Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, kitinase. Cả ba loại enzym này

đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:

 Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL

hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải.Vùng cellulose chưa

bị phân giải có màu tím hồng nhạt.

 Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt xung

quanh KL hoặc lỗ khoan có chứa dịch enzym.Vùng tinh bột chưa bị phân giải

có màu xanh tím đậm.

 Nếu nấm sợi có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giải có

màu nâu đỏ nhạt.

- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu

nấm sợi sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL hoặc quanh lỗ

khoan, do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2.

Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng vớI

HgCl2 protein bị kết tủa.

d. Đánh giá khả năng tạo enzym

Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và

đo đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d=8mm).

Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các

chủng nấm sợi. Nếu giá trị (D-d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của nấm

sợi càng cao.

- Quy ước:

 D-d ≥ 25mm : hoạt tính enzym mạnh.

: hoạt tính enzym khá mạnh  D-d ≥ 20mm

 D-d ≥ 15mm : hoạt tính enzym trung bình.

 D-d ≤ 10mm : hoạt tính enzym yếu.

2.2.3.3. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh [21]

a. Nguyên tắc

Chất kháng sinh do nấm sợi sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV

kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa

dịch kháng sinh hay khối thạch chứa nấm tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt.

b. Cách tiến hành

- Cấy nấm sợi trên MT YEA không có thạch, rồi ủ ba ngày ở nhiệt độ

phòng. Ly tâm 3000 vòng/ 10 phút, thu dịch kháng sinh.

- Dùng khoan nút chai khoan các khối thạch của MT có chứa VSV

kiểm định (E.coli, Bacillus subtilis).

- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch kháng sinh vào các lỗ khoan. - Để trong tủ lạnh 40C trong 8 giờ để dịch kháng sinh khuếch tán vào

trong thạch. Sau đó chuyển sang tủ ấm 300C. Kiểm tra vòng ức chế sau 24h.

c. Kiểm tra kết quả

Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất kháng sinh sẽ có một vòng trong suốt

xung quanh khối thạch do các chất kháng sinh đã ức chế sự phát triển của

VSV kiểm định tạo thành vòng tròn trong suốt (vòng vô khuẩn) xung quanh

lỗ khoan. Khả năng sinh kháng sinh được đáng giá bằng hiệu số (D-d, mm).

Quy ước:

 D-d ≥ 25mm : hoạt tính kháng sinh rất mạnh.

 D-d ≤ 20mm : hoạt tính kháng sinh mạnh.

 D-d= 15 ÷18mm : hoạt tính kháng sinh trung bình.

 D-d < 15mm : hoạt tính kháng sinh yếu.

2.2.3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng phân giải dầu [29]

Cấy nấm sợi trong bình tam giác 100 ml có chứa 50 ml MT khoáng

(MT 10). Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó đo sinh khối của

nấm sợi, quan sát sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng

phân giải dầu của nấm sợi.

Cách đo sinh khối nấm sợi: Khi cho bào tử nấm sợi vào bình tam giác,

đo khối lượng của bình tam giác bằng cân phân tích điện tử. Sau khi nuôi cấy

15 ngày, cân lại bình tam giác để biết được sinh khối của nấm sợi.

2.2.3.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố MT đến sinh

trưởng và phát triển của nấm sợi

 Phương pháp thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ [21]

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự sinh trưởng của nấm

sợi nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 trong nước biển, glucose lần lượt

được thay bằng các nguồn cacbon: lactose, sucrose, maltose, sorbitol,

galactose. Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng

cacbon trong MT1. Mẫu đối chứng là MT1.

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ, dùng MT1. Nguồn NaNO3

lần lượt được thay bằng các nguồn nitơ khác: Bột đậu, cao thịt, cazêin,

gelatin, urea, NH4NO3 với hàm lượng tương tự.

Mẫu đối chứng là MT 1.

Cấy chấm điểm các nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT tương ứng,

sau đó để trong tủ ấm trong 3 ngày, đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon,

nitơ bằng mức độ phát triển của các KL bằng cách đo đường kính KL d (mm).

Quy ước:

* d = 0 mm : không mọc

* d =1÷ 2mm : mọc yếu

* d = 2,1 ÷ 5mm : mọc trung bình

* d = 5,5 ÷ 10mm : mọc tốt

* d = 11 ÷ 30mm : mọc rất tốt

 Phương pháp thử khả năng chịu mặn của nấm sợi [21] -

Chuẩn bị MT YEA (MT3), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 3%,

5%, 7%, 10%.

- Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên trên bề mặt các MT

nghiên cứu có nồng độ muối khác nhau.

- Nuôi trong tủ ấm trong 3 ngày.

- Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng nấm sợi nghiên cứu

để đánh giá khả năng chịu mặn.

- Mẫu đối chứng nuôi trên MT không có nước biển.

 Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH [21]

Sử dụng MT1 trong nước biển, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hoặc

HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0. Thanh

trùng MT rồi cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu, sau đó để trong

tủ ấm trong 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của các chủng nấm sợi dựa

vào đường kính KL d (mm) theo quy ước như 2.2.3.3.

 Phương pháp thử khả năng chịu nhiệt của nấm sợi [21]

Sử dụng MT 1, cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu. sau đó ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 400C, 500C trong 3 ngày. Đánh giá

mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào đường kính KL d (mm).

 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian [21]

Sử dụng MT 1, cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu. Sau đó

ủ trong tủ ấm. Mỗi ngày đo đường kính KL để biết tốc độ sinh trưởng của nó.

2.2.3.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến

khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi [3], [22].

 Ảnh hưởng nguồn cacbon

Để xác định ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đóng vai trò là

chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, ta tiến hành nuôi

các chủng nấm sợi trên MT bán rắn với tỉ lệ cacbon khác nhau như sau:

- 6 cám: 4 trấu (6C:4T)

- 6 cám: 4 bã mía (6C:4BM)

- 6 cám : 4 giấy lọc (6C:4GL)

- 6 cám : 4 mạt dừa (6C:4MD)

- 6 giấy lọc : 4 cám (6GL:4C)

Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở (MT 11).

 Ảnh hưởng nguồn nitơ

Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ đến quá trình

sinh tổng hợp cellulase, ta tiến hành nuôi trên MT 11 có bổ sung thêm 0,5%

Urê. 0,5% (NH4)2SO4, 0,5% NaNO3, 0,5% pepton, 0,5% cao thịt, 0,5% cao

nấm men, 0,5% cao malt [3].

 Ảnh hưởng pH

Để xác định ảnh hưởng pH đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase

của các chủng nấm sợi nghiên cứu, tiến hành nuôi trên MT 11. Dùng HCl 5%

NaOH 5% điều chỉnh pH MT về các độ pH 3, 4, 5, 6, 7, 8.

 Ảnh hưởng độ ẩm

Để xác định ảnh hưởng độ ẩm đến sinh tổng hợp enzym cellulase ta

cũng nuôi trên MT 11 điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độ

ẩm 50%, 55%, 60%, 65%, 70%.

 Ảnh hưởng độ mặn

Để xác định ảnh hưởng của độ mặn đến quá trình sinh tổng hợp enzym

cellulase, ta cũng nuôi trên MT 11 với các nồng độ muối khác nhau 0%, 3%,

5%, 10%, 20%.

 Ảnh hưởng nhiệt độ

Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ ta cũng nuôi trên MT 11 và ủ ở các

nhiệt độ khác nhau 250C, 300C, 400C, 500C.

 Ảnh hưởng thời gian

Để xác định ảnh hưởng thời gian ta cũng nuôi trên MT 11 ở các thời

gian khác nhau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ.

Sau khi nuôi ủ, ly trích enzym cellulase theo phương pháp 2.2.2.6 và

đánh giá khả năng sinh enzym cellulase theo phương pháp 2.2.3.1.

2.2.4. Phương pháp thực nghiệm

2.2.4.1. Phương pháp xác định khả năng đường hóa giấy in, giấy báo

cũ đã qua sử dụng của enzym cellulase [40]

Giấy in đã qua sử dụng được xay vụn bằng máy xay sinh tố, cho khoảng

0,6g lượng giấy vào ống nghiệm có chứa dịch 6ml enzym cellulase thu được. Cho phản ứng ở 500C, pH 4,8 trong 24 giờ. Định lượng đường khử bằng

thuốc thử DNS dựa vào đường chuẩn theo phương pháp 2.2.3.1. Khả năng

đường hoá giấy loại của enzym được tính như sau:

Hiệu suất (%) = lượng đường khử (g) x 0,9 x (100/lượng giấy (g))

2.2.4.2. Phương pháp đánh giá độ chín của phân ủ

(Subrao- indian, 1980) [48]

a. Nguyên tắc

Dựa trên khả năng phân giải cellulose có trong rơm rạ của dịch enzym

cellulase thô tạo thành mùn.

b. Cách tiến hành

Mẫu thí nghiệm (TN): Tiến hành ủ đống rơm rạ bằng phương pháp ủ

quy mô nhỏ:

- Ủ trong hộp xốp nhỏ.

- Rơm rạ lấy từ ruộng lúa mới thu hoạch.

- Bổ sung thêm: 0,5% NH4NO3, 0.5% ure và 5% dịch chiết enzym

cellulase thô đã nuôi từ nấm sợi trên MT xốp cơ sở (MT11) trong 4 ngày.

- Điều chỉnh độ ẩm về 60- 65%, pH 6-7. - Ủ 1 tháng ở nhiệt độ 300C.

Mẫu đối chứng (ĐC): Ủ rơm rạ ở điều kiện tự nhiên không bổ sung

thêm dịch nuôi cấy.

Sau 1 tháng tiến hành so sánh lô ĐC với lô thí nghiệm (TN) ở các chỉ

tiêu:

- Nhiệt độ đống ủ trong tuần đầu.

- Nhiệt độ đống ủ trong tuần cuối.

- Nước chảy ra.

- Độ giảm chiều cao của đống ủ.

- Màu sắc của rơm rạ.

- Độ dai của rơm.

Sau đó, đánh giá độ chín của phân ủ còn gọi là độ “hoai” của phân ủ

bằng phương pháp thử nghiệm đối với cây trồng. Gieo hạt đậu xanh trên khay

chứa lượng phân sau khi đã ủ 1 tháng. Sau 7 ngày thu hoạch kiểm tra trọng

lượng tươi, tỉ lệ hạt nảy mầm của cây đậu. Mức độ chín của phân ủ được đánh

giá thông qua tỷ lệ nảy mầm, trọng lượng tươi trên mỗi khay. Nếu tỉ lệ nảy

mầm trên 60% / 5g hạt đậu xanh/ khay và trọng lượng từ 60-100 g/ 5g hạt đậu

xanh/ khay thì phân ủ đã “chín”.

Chương 3:

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym

cellulase từ RNM Cần Giờ

3.1.1. Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ

Qua 3 tháng tiến hành lấy mẫu theo phương pháp ở phần 2.2.2.1 từ đất

mặt, đất sâu 5-10cm, lá vàng còn trên cây, lá mục, thân, cành khô, mục,

chúng tôi đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau như bảng 3.1.

Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng nấm sợi

Cơ chất phân Số lượng chủng Tỷ lệ %

lập nấm sợi

Đầt: 114 36,5%

- Đất mặt 93 29,8%

- Đất sâu 5-10 21 6,7%

cm

Lá: 96 30,8%

- Lá vàng 34 10,9%

- Lá mục 62 19,9%

Thân: 102 32,7%

- Thân khô 39 12,5%

- Thân mục 63 20,2%

(Ghi chú: Kết quả bảng 3.1 được tổng hợp từ phụ lục 13)

Từ kết quả ở bảng 3.1 cho thấy ở RNM Cần Giờ hệ nấm sợi vô cùng

phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên lá, thân,

cành cây, trên mặt đất và cả trong đất sâu 5-10cm. Trong đó, các chủng nấm

sợi có trong MT đất là nhiều nhất (114/312 chủng) chiếm 36,5% tổng số nấm

sợi phân lập được. Số chủng nấm sợi sống trên lớp đất mặt nhiều hơn lớp đất

sâu. Điều này có thể giải thích do nấm sợi là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt

là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác lá, thân, cành, động vật, vỏ xác

tôm cua, giáp xác…đang bị phân hủy. Đồng thời, với điều kiện thủy triều lên

xuống hàng ngày nên lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các

chủng nấm sợi sinh trưởng phát triển.

Số chủng nấm sợi trên cơ chất lá (30,8%), trên thân cành (32,7%) ít hơn

trong đất. Do RNM Cần Giờ là nơi có thảm thực vật rất dày đặc, thức ăn chủ

yếu là hợp chất hữu cơ giàu cellulose, không đủ các nguồn dinh dưỡng như

trong đất. Đồng thời, nước mưa sẽ làm rửa trôi lượng lớn bào tử nấm sợi. Đặc

biệt, trên cơ chất lá mục và thân cành mục số lượng nấm sợi nhiều hơn. Vì

đây là những nguồn hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành

glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ nhất [29].

Như vậy, MT sống ở RNM Cần Giờ mặc dù rất khắc nghiệt nhưng có đầy

đủ các yếu tố cần thiết cho nấm sợi sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng

các chất hữu cơ sẳn có để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy các chất thải,

giúp giảm bớt ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ.

Từ các chủng thuần khiết phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành

tuyển chọn các chủng nấm dựa trên khả năng sinh enzym cellulase của chúng.

3.1.2. Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh

enzym cellulase

 Tuyển chọn lần 1

Kiểm tra khả năng sinh enzym cellulase của 312 chủng nấm sợi theo

phương pháp 2.2.3.2. Kết quả trình bày ở bảng 3.2.

Phân tích số liệu từ bảng 3.2 cho thấy:

- Tổng số chủng có enzym : 183/312 chủng chiếm 58,65%

10/183 chủng chiếm 5,5% + Chủng sinh enzym mạnh :

+ Chủng sinh enzym khá mạnh : 6/183 chủng chiếm 3,3%

+ Chủng sinh enzym trung bình: 20/183 chủng chiếm 11%.

+ Chủng sinh enzym yếu : 147/183 chủng chiếm 80,2%.

Trong đó:

- Số chủng trên lá là 69/183 chiếm 37%.

- Số chủng trên thân là 50/183 chiếm 27%.

- Số chủng trên đất là 63/183 chiếm 34%.

Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym celllase của 312 chủng nấm sợi phân lập

STT Kí hiệu chủng Đ1 Đ2 Đ3 Đ4 Đ20a Đ8 Đk Đ11 Đ12 Đ14 Đ15 Đ18 Đ19 Đ20 Đ21 Đ23 Đ25 Đ27 Đ28 Đ29 Đ30 ĐB1 Đ’ 0 ĐB2 ĐB3 ĐB4 ĐB5

D-d (mm) 2,0 4,5 15,5 6,5 23,5 5,5 25,5 5,5 8 6,5 5 3 5 4,5 2,5 4 8 4 5 14 7,5 12,5 29 6 2,5 2,5 6,5

STT Kí hiệu chủng Đ’3 Đ24 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L18 L19 L20 L21 L22 L23 L24 L25 L26 L27 L28

D-d (mm) 27,5 24,5 10,5 4,5 3,5 7,5 5 4,5 7,5 24,5 5 6,5 15 10 1,5 8,5 2,5 12,5 8 12,5 6 1,5 2 16 13 7,5 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149

STT Kí hiệu chủng L13.2 L1.5 L14.5 L21.1 L33a L36a L5.3 L41.8 L41.1 L28.1 T4 T3 T2 T1.4 C1.3 C6 C3.3 C3.4 C1.2 C4.1 C2 (T) T4.5 T4.4 C5 C8 C8a

D-d (mm) 18,0 12,0 14,5 3,5 4,5 6,0 16 13 21 17 9 1 4 26,5 3,5 4,5 9,5 10,5 5,5 3 12 24,5 10,5 24,5 4,5 8 25,5

D-d (mm) 8,5 16,5 18,5 5 13 2 10 6 4 6,5 4,5 4 3 5,5 1,5 5,5 3 17 8,5 4 6 5 6 2 19 3

D-d (mm) 5,5 8 10 14,5 1,5 13 24,5 2 12,5 13 5 14,5 17 14,5 12 5 17 14 3 14,5 12 3 15 4 9 8,5 10 12,5 9 6 10,5 11 6,5 7

STT Kí hiệu chủng ĐB6 28 ĐB7 29 Đ’1 30 Đ’2 31 32 Đ’2.1 Đ’9 33 34 Đ’9.1 35 Đ’9.2 Đcc 36 37 Đ’1.1 38 Đ’1.2 39 ĐTH ĐB 40 Đ34 41 42 Đ34.1 43 Đ30.1 44 Đ33a 45 ĐTH0 46 Đ’10 Đ31 47 48 Đ’5.1 49 Đ’9.1 Đ’9a 50 51 Đ’9b 52 Đ’9.2c 53 Đ30.2 54 Đ’24 55 Đ2b 56 Đ’2.2 Đ’0a 57 58 Đ’9.2a Đ2a 59 60 Đ2.3 61 Đ’14.1

STT Kí hiệu chủng C6 150 C3.4 151 CT 152 T11.6 153 154 C16.2 155 C15.1 156 C16.1 C18 157 C34 158 159 C11.3 C17 160 161 C18.3 T5a 162 163 C13.1 163 C16.2 C12 165 T1.3 166 C7 167 C2.2 168 T’1.4 169 C4.1 170 C3b 171 C2a 172 C3.3 173 T11.7 174 175 CT10.1 T7.1 176 T11.6 177 T1.2 178 T4.6 179 180 C11.4 C16 181 C15b 182 183 C18.3

D-d STT Kí hiệu (mm) chủng 10,5 L29 89 7 L30 90 5,5 L31 91 13 L32 92 8 L33 93 12 L34 94 21 95 L1.3 6,5 L38 96 4,5 L39 97 7 L42 98 11 99 L22.1 19 L15.1 100 8,5 L5.1 101 6,5 L1.4 102 4 L4.1 103 2,5 L1.2 104 17,5 L3.5 105 L’12 13,5 106 4,5 L22.2 107 L6.4 18,5 108 5,5 L34.1 109 6 L33.1 110 15 L37.1 111 8,5 L30.1 112 7,5 L33a 113 6 L32.2 114 10 L36a 12,5 115 15,5 L16a 116 27 14,5 L6.3 10 117 8,5 L3.2b 7 118 17,5 L12.1 9 119 16 L13.2 2,5 120 4 L15.1 8 121 17,5 L14.2 13 122 (Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Qua phân tích có thể kết luận các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ có

khả năng sinh enzym cellulase khá cao (183/312 chủng) chiếm 58,65% số

chủng nấm phân lập được.

Số chủng nấm sợi sinh enzym cellulase sống trên lá là 37% cao hơn so

với các chủng nấm sống trên thân cành và đất. Do nguồn thức ăn chủ yếu của

nấm sợi sống trong RNM Cần Giờ là lá cây, nên chúng phải có khả năng tổng

hợp enzym cellulase để phân giải các hợp chất cellulose khó phân hủy.

Số chủng nấm sợi sống trên thân, cành sinh enzym cellulase thấp hơn ở

lá (27%). Do trong vỏ thân, cành của thực vật ở RNM, thành phần lignin khá

cao (trên 20% khối lượng gỗ khô) [49]. Lignin kết hợp với cellulose và

hemicellulose tạo nên thành tế bào gỗ có độ bền cơ cao, rất khó phân hủy

[52]. Enzym phân giải lignin được tổng hợp sẽ làm ức chế một phần sự tổng

hợp cellulase [53].

Trong lớp đất mặt, số chủng nấm sợi sinh enzym cellulase chiếm 34%

cao hơn ở thân nhưng thấp hơn ở lá. Ta thấy trên đất ngoài thức ăn là lá, thân

cành rụng, còn có nhiều thành phần khó phân giải như rác rưởi, vỏ tôm cua,

xác động vật….Nấm sợi phải cùng lúc tổng hợp nhiều loại enzym khác như

protease, amylase, kitinase để phân hủy các thành phần này. Do đó, hiệu suất

sinh enzym cellulase thấp hơn ở trên lá cây.

Tuy nhiên, số chủng có hoạt tính enzym cellulase yếu khá lớn, chiếm

80,2%, trong khi số chủng có hoạt tính mạnh chỉ chiếm 5,5%. Thực tế, quá

trình phân giải các hợp chất chứa cellulose trong tự nhiên diễn ra rất chậm,

không chỉ dựa vào hệ nấm sợi mà phải có sự tham gia của các VSV khác như

vi khuẩn, xạ khuẩn…để có kết quả cao hơn [30].

Trong 183/312 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase, chúng

tôi bước đầu chọn 10 chủng có hiệu số D-d (mm) cao nhất để tiếp tục nghiên

cứu (xem bảng 3.3).

Bảng 3.3. 10 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao

D-d (mm)

STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập Đất mặt Đất mặt Đất mặt Đất mặt Đất mặt Đất mặt Thân mục Thân khô Thân mục Lá khô 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23,5 29,0 25,5 27,0 24,5 27,5 24,5 26,5 25,5 24,5

Đ20a Đ’ 0 Đk Đ2b Đ24 Đ’3 (T) T1.4 C8a L1.3 (Số liệu rút ra từ bảng 3.2 và phụ lục 13)

 Tuyển chọn lần 2

Để đánh giá chính xác khả năng sinh enzym cellulase của 10 chủng làm

cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ

CMCase của chúng theo phương pháp trong phần 2.2.3.1. Kết quả ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Hoạt độ CMCase của 10 chủng nấm sợi ( đơn vị IU/g)

STT D-d (mm)

Kí hiệu chủng Đ20a Hoạt độ CMCase (IU/g) 13,48 1 23,5

2 29,0 Đ’ 55,70

0

3 25,5 28,17 Đk

4 27,0 53,10 Đ2b

5 Đ24 24,5 14,14

6 27,5 55,01 Đ’3

7 (T) 24,5 14,11

8 T1.4 26,5 37,84

9 L1.3 25,5 28,42

10 C8a 24,5 16,80

Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.4 cho thấy kết quả định tính và định

lượng enzym này của 10 chủng là thống nhất nhau. Trong đó ba chủng có

hoạt độ CMCase cao nhất là chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g),

chủng Đ2b (53,10 IU/g). Chúng đều có nguồn gốc từ lớp đất mặt, nơi có

nguồn thức ăn rất phong phú và nhiều cơ chất cảm ứng khả năng sinh enzym

cellulase. Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.1.

)

60

35

m m

30

50

( d - D

25

40

) g / U I ( e s a C M C

20

30

15

20

10

10

5

0

0

3

4

.

.

k Đ

) T (

0 ’ Đ

3 ’ Đ

a 8 C

4 2 Đ

b 2 Đ

1 L

1 T

a 0 2 Đ

1

2

CMCase (IU/g) 4

5

3

6

7

D-d (mm) 8 10 9

Đồ thị 3.1. Hoạt độ CMCase của 10 chủng nấm sợi

Từ đó, chúng tôi quyết định chọn 3 chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3

(55,01 IU/g) và chủng Đ2b (53,10 IU/g) để nghiên cứu tiếp tục.

3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại ba chủng nấm sợi

Tiến hành cấy ba chủng nấm trên các MT khác nhau theo phương pháp

ở phần 2.2.2.3, phần 2.2.2.4.

- Chủng Đ’0 cấy trên MT PGA.

- Chủng Đ’3 và Đ2b cấy trên MT1.

Khuẩn lạc được ghi nhận mô tả. Cấu trúc vi thể của nấm sợi được quan

sát dưới KHV, chụp hình bào tử, sợi nấm… Chúng tôi sử dụng các khóa phân

loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái của Saccardo (1897), Bùi Xuân

Đồng (1986), Micheli ex Fries (1832) để phân loại ba chủng nấm sợi đến chi.

Kết quả trình bày ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái và phân loại đến chi của ba chủng nấm

Ký hiệu

Đặc điểm hình thái của ba

Đặc điểm định loại đến

Xếp loại

chủng

chủng nấm

chi

thuộc chi

- Khuẩn

lạc: Tròn, mặt

- Khuẩn lạc: màu xanh

nhung mịn, có

rãnh

đến xanh xám, xám

phóng xạ. Màu xanh

đen. Kích thước nhỏ.

xám, mép vàng cam, khi

Có hoặc không có rãnh

già có màu xám đen.

phóng xạ. Không hoặc

Không tiết sắc tố. (Hình

có tiết sắc tố.

3.1)

Chủng

Ascotricha

- Hình thái vi thể: Sợi nấm

(Theo

- Sợi nấm không ngăn

Đ’0

vách. Bộ máy mang

không ngăn vách. Cuống

Saccardo,

bào tử gồm cuống sinh

sinh bào tử phân nhánh,

1897.)

bào tử, bào tử trần

gẫy khúc. Có bào tử túi

hình cầu, gần cầu, quả

hình cầu, bào tử trần

lê, vách dày. Có bào tử

hình quả lê, thể quả hình

túi và thể quả .

quả lê màu đen. (Hình

3.2)

- Khuẩn lạc: Tròn, nhung

- Khuẩn lạc màu lục,

mịn, bột rời. Màu xanh

vàng lục, xanh lục, lục

đậm, mép viền trắng, mặt

xám, xám. Có hoặc

trái có màu hơi nâu.

không có vết khía

Penicillium

Không tiết sắc tố.(Hình

(Theo Bùi

xuyên tâm hay đồng

Chủng

3.3)

Xuân Đồng,

tâm.

Đ’3

- Hình thái vi trể: Sợi nấm

1986.)

- Sợi nấm ngăn vách.

ngăn vách. Chổi hình trụ

Bộ máy mang bào tử

trần dạng chổi gồm 1

dài, thể bình dạng chai,

vòng hoặc 2 vòng thể

bào tử trần hình cầu, elíp,

bình mang bào tử trần .

có gai thưa. (Hình 3.4)

Kí hiệu

Đặc điểm hình thái của ba

Đặc điểm định loại đến

Xếp loại

chủng

chủng nấm

chi

thuộc chi

- Khuẩn lạc: Tròn, mặt trơn,

- Khuẩn lạc: màu xanh

nhung mịn. Mặt phải màu

lục đến xanh xám, nâu,

xanh ngọc bích sau chuyển

đen. Có hoặc không tiết

sang xanh xám, có rãnh

sắc tố.

nhăn nhúm, mặt trái màu

nâu vàng sau chuyển sang

nâu đen. Không tiết sắc tố.

Chủng

(Hình 3.5)

Aspergillus

Đ2b

- Hình thái vi thể: Sợi nấm

(Theo

- Sợi nấm ngăn vách. Bộ

máy mang bào tử trần

ngăn vách, phân nhánh,

Micheli ex

hình hoa cúc gồm giá bào

xanh xám. Cuống sinh bào

Fries, 1832)

tử trần, bọng đỉnh giá, thể

tử không phân nhánh, đầu

bình. Bào tử trần tụ họp

phình to thành bọng hình

thành hình cột , hình cầu,

chùy ngắn, mang thể bình

hình tia tỏa tròn.

hình chai, một tầng. Bào tử

trần hình cầu, vách dày có

gai. (Hình 3.6)

0

Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.1. Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ’

3

Hình 3.2. Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng Đ’0 (x40)

3 (x40)

Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.3. Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ’ Hình 3.4. Hình dạng hệ sợi nấm và chổi của chủng Đ’

Hình 3.5 Hình 3.6

Hình 3.5. Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ2b

Hình 3.6. Hình dạng sợi nấm và đầu bông cúc chủng Đ2b (x40)

Sau đó, chúng tôi tiến hành định danh đến loài ba chủng nấm trên tại

công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC, 45 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1,

Tp. Hồ Chí Minh.

Kết quả ở bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả định danh đến loài của ba chủng nấm sợi

Kí hiệu chủng Tên loài Khóa phân loại

Ames, 1986 Ascotricha guamensis Chủng Đ’0

Penicillium oxalicum Thom and Currie, 1905 Chủng Đ’3

Aspergillus fumigatus Kenneth B- Raper and Chủng Đ2b

Fennell, 1965

(Ghi chú: Kết quả ở bảng 3.6 dựa theo phụ lục kết quả định danh của

công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC)

3.3. Khảo sát một số yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển

và hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

3.3.1. Các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của

nấm sợi

 Ảnh hưởng nguồn cacbon

Chúng tôi cấy các chủng nấm sợi trên MT1, thay glucose bằng các

nguồn cacbon khác nhau CMC, lactose, sucrose, galactose, tinh bột. Sau đó ủ

ba ngày ở nhiệt độ phòng. Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm bằng cách

đo đường kính khuẩn lạc d (mm) theo phương pháp ờ phần 2.2.3.5. Mẫu đối

chứng cấy trên MT1. Kết quả trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của ba chủng nấm sợi

Mức độ phát triển (mm)

Nguồn cacbon A. guamensis P. oxalicum

12,5 A. fumigatus 15 Đối chứng 10

Lactose 6,5 10 20

Sucrose 7,5 11 19

Galactose 5,5 10 17

Tinh bột 6,5 10 11

CMC 9,0 11,5 13,0

(Ghi chú: Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy cả ba chủng nấm sợi đều sinh trưởng phát

triển khá tốt trên MT có các nguồn cacbon khác nhau. Tuy nhiên, chúng

không sinh trưởng mạnh bằng mẫu đối chứng.

Cả ba chủng sinh trưởng phát triển khá tốt trên MT có chứa CMC

(9,0mm, 11,5mm, 13mm). Đây là hợp chất giàu cellulose rất khó phân hủy,

chỉ có những chủng nấm sợi nào có khả năng sinh enzym cellulase mới sử

dụng được nguồn cacbon này để chuyển hóa thành glucose để hấp thụ. So với

nuôi trên MT đối chứng có chứa nguồn cacbon là glucose ta thấy chúng sinh

trưởng mạnh tương đương (10mm, 12,5mm, 15mm). Điều này chứng tỏ CMC

là nguồn cacbon thích hợp cho ba chủng này.

Riêng chủng A. fumigatus sinh trưởng mạnh nhất trên MT chứa nguồn

cacbon từ đường như lactose (20mm). Sinh trưởng yếu trên MT chứa tinh bột

(11mm). Sở dĩ có sự khác nhau này là do giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp

thụ của nấm sợi phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần hóa học của nguồn

cacbon và tùy vào từng chủng nấm sợi [29].

16

14

Kết quả được minh họa lại bằng biểu đồ 3.1

m m

12

10

8

6

4

2

( n ể i r t t á h p ộ đ c ứ M

0

CMC

Lactose

Sucrose Galactose Tinh bột

A. guamensis

P. oxalicum A. fumigatus

Nguồn cacbon

Biểu đồ 3.1. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của ba chủng nấm sợi

Như vậy, cả ba chủng này đều rất thích hợp sống trong MT RNM Cần

Giờ, nơi mà nguồn thức ăn chủ yếu là những hợp chất giàu cellulose.

 Ảnh hưởng nguồn nitơ

Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5.

Mẫu đối chứng nuôi trên MT 1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ của ba chủng nấm sợi

Nguồn nitơ

Mức độ phát triển (mm)

A. guamensis 10

P. oxalicum 12,5

A. fumigatus 15

Đối chứng

Cao thịt

5,5

3

23

Cao nấm men

5

7

23

7

11

26

NH4NO3

Urea

1

8

11,5

4,5

7,5

22,5

(NH4)2SO4.

Bột đậu

6,0

9,0

21,0

(Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Kết quả bảng 3.8 cho thấy cả ba chủng đều có khả năng đồng hóa các

nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau. Trong đó NH4NO3 là nguồn nitơ vô cơ

thích hợp nhất cho cả ba chủng.

So với mẫu đối chứng (15mm), chủng A. fumigatus (26mm) thích hợp

với nguồn nitơ NH4NO3 hơn. Chủng A. guamensis (7,0mm), chủng P.

oxalicum (11,0 mm) thích hợp với nguồn NaNO3 hơn.

Nấm sợi đồng hóa nguồn nitơ hữu cơ thấp hơn nitơ vô cơ. Do nguồn

nitơ hữu cơ muốn sử dụng phải được phân giải thành các axit amin và chuyển

hóa thành NH3 nhờ enzym dezaminase. Do đó nấm sợi muốn sử dụng nguồn

nitơ hữu cơ từ axit amin thì phải có khả năng sinh tổng hợp enzym này [53].

Kết quả được minh họa lần nữa bằng biểu đồ 3.2.

)

30

m m

25

20

( n ể i r t t á h p ộ đ c ứ m

15

10

5

0

Bột đậu

Cao thịt

Cao nấm men

NH4NO3

Ur ea

(NH4)2SO4.

nguồn nitơ

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Biểu đồ 3.2. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của ba chủng nấm sợi

 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi

Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5.

Sau khi ủ nấm sợi 3 ngày trên các MT có pH khác nhau và mẫu đối chứng là

MT1 pH 6,5. Kết quả xem ở bảng 3.9, đồ thị 3.2.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng, phát triển của ba chủng

nấm sợi

Độ pH

Mức độ phát triển (mm) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus 12,5 15 10

0 1 1,5 6 8,5 3 0 5,5 7 8 11 5 4 11 15 22 18 13 Đối chứng 3 4 5 6 7 8

(Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Kết quả cho thấy ba chủng nấm sợi có thể hoạt động ở khoảng pH rất

rộng từ 4-8. pH thích hợp nhất cho cả ba chủng là 6-7.

Như vậy, ba chủng nấm này sinh trưởng phát triển mạnh ở pH 6-7, rất

thích hợp với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ.

)

25

m m

(

20

n ể

15

10

5

i r t t á h p ộ đ c ứ m

0

pH 3

pH 4

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8 độ pH

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm

 Ảnh hưởng độ mặn đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm

Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5.

Sau khi ủ nấm sợi 3 ngày trên các MT có độ mặn khác nhau và mẫu đối

chứng là MT 1 không có muối pH 6,5.

Kết quả trình bày ở bảng 3.10, đồ thị 3.3.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng độ mặn đến sinh trưởng phát triển của ba chủng

nấm sợi

Độ mặn Mức độ phát triển (mm)

(%) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus

Đối chứng 7 10 25

3 7 11 27

5 3 6 18

10 2 5,5 6

20 1 2 2

(Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy cả ba chủng nấm sợi đều sinh trưởng phát

triển trên MT nước ngọt lẫn nước mặn. Điều này chứng tỏ chúng có nguồn

gốc từ đất liền du nhập vào RNM Cần Giờ và thích nghi điều kiện sống ở đó.

Ta thấy cả ba chủng đều sinh trưởng mạnh nhất ở MT có nồng độ muối

3%, mạnh hơn so với MT không có muối, và giảm dần đến 20%. Mặc dù là

nấm du nhập từ đất liền nhưng chúng thích hợp với điều kiện nước lợ hơn.

)

30

m m

(

25

n ể i r

t

20

t

á

h

p

15

ộ

đ

10

c ứ m

5

0

3%

5%

10%

20%

Đối chứng độ mặn

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Kết quả được minh họa một lần nữa qua đồ thị 3.3.

Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng độ mặn đến sinh trưởng phát triển của ba chủng

nấm sợi

Vậy, độ mặn thích hợp nhất cho ba chủng nấm sợi sinh trưởng là 3%,

phù hợp với điều kiện nước lợ ở RNM Cần Giờ.

 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm

Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5.

Sau khi ủ chúng 3 ngày ở các nhiệt độ khác nhau, kết quả ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của ba chủng

nấm sợi

Mức độ phát triển (mm)

Nhiệt độ (0C)

A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus 3,0 1,0 7,0 25

4,5 11 15 30

3 4 12,5 40

0 0 1 60

(Ghi chú: Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Kết quả cho thấy ở nhiệt độ cao quá 600C nấm không sống được, chỉ có chủng A. fumigatus là loài ưa nhiệt mới sống được ở nhiệt độ này. Còn ở 250C nấm phát triển rất yếu. Trong khoảng 300C-400C nấm sinh trưởng mạnh, nhất là ở 300C vì đây là nhiệt độ tốt nhất cho sợi nấm nảy mầm và tạo bào tử. Kết

)

16

m m

(

14

12

n ể i r t t á h p

10

ộ đ

8

c ứ m

6

4

2

0

25

30

quả được minh họa ở đồ thị 3.4.

60 nhiệt độ

A. guamensis

P. oxalicum

40 A. fumigatus

Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của ba chủng

nấm sợi Vậy, nhiệt độ thích hợp nhất cho cả ba chủng sinh trưởng phát triển là 300C.

 Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng phát triển của ba chủng

nấm sợi

Cấy các chủng nấm sợi vào MT1, mỗi ngày đo đường kính khuẩn lạc từ

ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Kết quả ở bảng 3.12 đồ thị 3.5.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của ba chủng nấm sợi

Mức độ phát triển (mm)

P. oxalicum A. fumigatus

Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 7 A. guamensis 0,5 2 6 8 11 13 18 3 6 10 14 19 24,5 25 3 10 22 25 34 35 35,5

(Ghi chú: Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy ba chủng đều sinh trưởng chậm, khuẩn

lạc lớn dần theo thời gian nhưng vẫn bé hơn các chủng nấm sợi ở đất liền.

Đến ngày thứ 7 thì sinh trưởng chậm lại. Đây là điểm đặc trưng của nấm sợi ở

RNM. Riêng chủng A. fumigatus sinh trưởng mạnh và nhanh hơn hai chủng

)

40

m m

(

n ể

35

30

i r t t á h p

25

ộ đ

20

c ứ m

15

10

5

0

2

3

6

7

ngày

1 A. guamensis

4 P. oxalicum

5 A. fumigatus

còn lại.

Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng phát triển của ba chủng

nấm sợi

Tóm lại, sau khi khảo sát các điều kiện MT ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển của ba chủng nấm sợi, ta có thể rút ra đặc điểm đặc trưng

của ba chủng nấm sống ở RNM Cần Giờ :

- Ba chủng đều sinh trưởng chậm, khuẩn lạc nhỏ hơn các chủng nấm

sống ở đất liền.

- Có khả năng đồng hóa nguồn cacbon CMC tốt nhất.

- Sử dụng nguồn nitơ vô cơ NH4NO3 tốt nhất.

- Độ mặn thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển là 3%.

- pH thích hợp nhất từ 6-7. - Nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng phát triển là 300C.

3.3.2. Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến hoạt độ enzym

CMCase của ba chủng nấm sợi

 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm

Thí nghiệm này nhằm mục đích xác định thời gian tối ưu để thu nhận

enzym cellulase có hoạt lực cao nhất.

Tiến hành nuôi nấm sợi trên MT11 ở các thời gian khác nhau 24 giờ,

36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ. Sau khi nuôi cấy, ly trích enzym và xác định

hoạt độ CMCase theo phương pháp 2.2.3.1

Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.13, đồ thị 3.6.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ enzym CMCase

Hoạt độ CMCase (IU/g)

Tên chủng

24 giờ 55,68 36 giờ 56,55 48 giờ 56,58 60 giờ 37,92 72 giờ 23,71 A. guamensis

56,49 56,87 53,95 37,72 21,71 P. oxalicum

37,76 56,49 55,98 28,43 28,22 A. fumigatus

(Kết quả được tính từ phụ lục 10 theo công thức ở phần 2.2.3.1)

Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.13 cho thấy ba chủng có hoạt độ

CMCase cao ở khoảng 24- 48 giờ.

- Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy

(56,58 IU/g), vì chủng này sinh trưởng chậm hơn hai chủng còn lại nên thời

gian tổng hợp enzym cao nhất chậm hơn.

- Chủng P. oxalicum có hoạt độ CMCase cao nhất 56,87 IU/g và A.

fumigatus có hoạt độ enzym CMCase cao nhất 56,49 IU/g sau 36 giờ nuôi cấy

Thời gian này nấm sợi bắt đầu tạo bào tử nên enzym cellulase được

tổng hợp mạnh nhất [30]. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của

Trần Thạnh Phong (2004).

Ta thấy thời gian sinh trưởng của các chủng nấm sợi chậm kéo theo

thời gian sinh enzym cellulase cũng chậm hơn so với nấm sợi sống ở đất liền.

Đây là điểm đặc trưng của nấm sợi sống ở RNM Cần Giờ, thời gian

sinh trưởng rất chậm và khả năng sinh enzym cellulase cũng tỉ lệ thuận với

60

50

tốc độ sinh trưởng của nấm sợi.

) g / U I ( e s a C M C

40

30

20

10

0

24 giờ

36 giờ

48 giờ

60 giờ

72 giờ thời gian

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ CMCase của ba chủng

nấm sợi

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase của ba

chủng nấm sợi

Thí nhiệm này nhằm mục đích xác định nguồn cơ chất cảm ứng khả

năng sinh enzym cellulase tốt nhất cho ba chủng nấm sợi.

Tiến hành cấy dịch huyền phù bào tử ba chủng nấm trên môi trường

bán rắn với tỉ lệ khác nhau theo phương pháp ở phần 2.2.3.2.

Thời gian nuôi cấy chủng A. guamensis là 48 giờ, hai chủng còn lại là

36 giờ. Ly trích enzym theo phương pháp 2.2.2.6 và xác định hoạt tính

CMCase theo phương pháp 2.2.3.1.

Kết quả trình bày ở bảng 3.14, đồ thị 3.7.

Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.14 cho thấy hoạt độ CMCase của cả ba

chủng đều cao trên các nguồn cacbon khác nhau.

Nguồn cacbon hydrat mà chủng nấm sợi sử dụng được trong quá trình

sinh tổng hợp cellulase là rất phong phú.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase

Tên chủng 6C: 4T 6GL: 4C

53,69 Hoạt độ CMCase (IU/g) 6C: 6C: 4GL 6C: 4MD 4BM 56,59 56,88 56,52 18,25 A. guamensis

56,17 54 55,38 56,56 28,25 P. oxalicum

55,35 50,41 60,8 59,34 27,84 A. fumigatus

(Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 4 theo công thức ở phần 2.2.3.1)

- Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất trên MT 6C: 4BM

(56,88 IU/g), các MT còn lại hoạt lực cũng cao tương đương. Nguyên nhân

do bã mía có khả năng giữ nước tốt, hàm lượng cellulose trong bã mía tương

đối cao nên có thể làm chất cảm ứng cho quá trình sinh enzym cellulase.

Ngoài ra bã mía còn có độ tơi xốp cao, tạo nên độ thoáng khí của MT nuôi

cấy tốt hơn.

- Chủng P. oxalicum có hoạt lực CMCase cao nhất trên MT 6C: 4MD

(56,56IU/g). Chủng A. fumigatus có hoạt lực cao nhất trên MT 6C: 4GL

(60,80 IU/g). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả trong các nghiên cứu của

Loginova, 1976 đối với chủng Trichoderma [53].

So với kết quả nghiên cứu của Trần Thạnh Phong (2004), hoạt độ

CMCase của chủng Trichoderma reesei VTT-D-80133 trên MT 6CM: 4BM

là 98,35 IU/g thì chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase thấp hơn. Có lẽ vì

đây là chủng hoang dại chưa qua cải tạo bằng các phương pháp gây đột biến

để có hoạt lực cao hơn. Tuy nhiên, so với chủng Aspergillus niger K84 trên

MT 6CM: 4BM có hoạt độ CMCase là 10,22 IU/g thì chủng A. guamensis

cao hơn [40].

Trên MT 6GL:4C, cả ba chủng đều có hoạt lực CMCase thấp nhất. Đây

là MT có độ ẩm và hàm lượng cám thấp không đủ thành phần dinh dưỡng nên

chưa thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzym cellulase của nấm sợi. Do

đó, cần tìm MT có hàm lượng cám mì cao, giữ được độ ẩm và hàm lượng

cellulose thích hợp thì các chủng mới sinh enzym cellulase cao.

Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.7.

) g /

70

60

U I ( e s a C M C

50

40

30

20

10

0

6C: 4T

6C: 4GL

6C: 4MD

A. guamensis

6C: 4BM P. oxalicum

A. fumigatus

6GL: 4C Nguồn cacbon

Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase của ba chủng

nấm sợi

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase của ba chủng

nấm sợi

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nuôi ba chủng nấm sợi trên

MT11 có bổ sung thêm 0,5% urê. 0,5% (NH4)2SO4, 0,5% pepton, 0,5% cao

thịt, 0,5% cao nấm men. Nuôi cấy trong 48 giờ đối với chủng A. guamensis,

36 giờ đối với hai chủng còn lại.

Ly trích enzym theo phương pháp 2.2.2.6 và xác định hoạt độ CMCase

theo phương pháp 2.2.3.1

Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.15, đồ thị 3.8.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase

Tên chủng Hoạt độ CMCase (IU/g) Pepton NH4NO3 (NH4)2SO4

Cao thịt

Cao nấm men 27,88 16,64 27,91 28,1 12,07 54,81 12,74 27,34 5,44 55,8 56,56 56,45 7,86 27,2 27,87

A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus (Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 5 theo công thức ở phần 2.2.3.1)

Kết quả cho thấy cả ba chủng đều sinh enzym CMCase mạnh nhất trên

MT chứa nguồn nitơ vô cơ NH4NO3. Ở phần 3.2.1 ta đã kết luận ba chủng

này cũng sinh trưởng phát triển tốt nhất trên MT có nguồn nitơ vô cơ

NH4NO3 (kết quả ở biểu đồ 3.2). Do đó, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh

enzym cellulase tỉ lệ thuận. Đây là đặc điểm rất thuận lợi khi sử dụng các

chủng nấm sợi này để sản xuất enzym cellulase, vừa thu được sinh khối nấm

sợi, vừa thu được lượng cellulase lớn trên cùng một loại MT.

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng

(2004) là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh tổng hợp cellulase là NaNO3 và

60

50

NH4NO3 [30]. Kết quả này được minh họa chính xác hơn ở đồ thị 3.8.

) g / U I ( e s a C M C

40

30

20

10

0

Cao thịt

Cao nấm men

Pepton

NH4NO3

(NH4)2SO4

nguồn nitơ

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm

sợi

 Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Tiến hành nuôi chủng A. guamensis trên MT 6C: 4BM, chủng P.

oxalicum trên MT 6C: 4MD, chủng A. fumigatus trên MT 6C: 4GL. Bổ sung

thêm 0,5% NH4NO3, dùng HCl, NaOH điều chỉnh pH về các độ pH 4, 5, 6, 7,

8. Nuôi ở thời gian 36- 48 giờ. Ly trích enzym và xác định hoạt độ CMCase

theo phương pháp 2.2.3.1.

Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.16, đồ thị 3.9.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ enzym CMCase

Hoạt độ CMCase (IU/g)

Tên chủng

pH4 28,28 pH5 48,85 pH6 56,85 pH7 56,51 pH8 28,26 A. guamensis

28,18 55,99 56,08 56,15 34,89 P. oxalicum

28,38 53,45 54,5 55,89 53,26 A. fumigatus

(Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 6 theo công thức ở phần 2.2.3.1)

- Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất ở pH6 (56,86

IU/g).

- Chủng P. oxalicum có hoạt độ cao nhất 56,15 IU/g và A. fumigatus có

hoạt độ cao nhất 55,89 IU/g ở pH7.

Kết quả thống nhất với nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh (2000) về

khả năng sinh enzym cellulase của A. niger RNNL-363 [24].

Ở pH quá thấp (<5) hay quá cao (>8) hoạt độ CMCase của các chủng

nấm sợi giảm mạnh. Nguyên nhân do pH quá thấp, quá cao sẽ làm bất hoạt

một số enzym cellulase và làm cố định enzym này bên trong khuẩn ty nấm,

enzym không tiết ra ngoài sợi nấm nên hoạt độ giảm [29].

Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.9.

)

25

m m

(

20

15

10

5

n ể i r t t á h p ộ đ c ứ m

0

pH 3

pH 4

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8 độ pH

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Riêng chủng A. fumigatus trên MT pH8 vẫn tổng hợp được enzym

cellulase rất cao, nên rất thích hợp với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ.

 Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Tiến hành nuôi:

- Chủng A. guamensis trên MT 6C: 4BM, ở pH6.

- Chủng P. oxalicum trên MT 6C: 4MD, ở pH7.

- Chủng A. fumigatus trên MT 6C: 4GL, ở pH7.

Bổ sung thêm 0,5% NH4NO3. Điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô

trùng về các độ ẩm 50%, 55%, 60%, 70%, 75%. Sau 36-48 giờ nuôi cấy, ly

trích enzym và xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1. Kết quả

được ghi nhận ở bảng 3.17, đồ thị 3.10.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Hoạt độ CMCase (IU/g)

Tên chủng

50% 38,84 55% 56,28 60% 56,78 70% 55,48 75% 10,35 A. guamensis

55,9 56,6 56,29 56,15 28,11 P. oxalicum

53,69 56,07 56,41 56,52 36,77 A. fumigatus

(Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 8 theo công thức ở phần 2.2.3.1)

- Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất ở độ ẩm 60% (56,78

IU/g). Kết quả này phù hợp với báo cáo của Kim và cs (1985) là tốc độ sinh

trưởng tối ưu của Trichoderma reesei ở độ ẩm 60%, nhưng sinh ra enzym

cellulase tối đa là ở độ ẩm khoảng 50% [53].

- Chủng P. oxalicum có hoạt độ CMCase cao nhất ở độ ẩm 55% (56,6

IU/g).

- Chủng A. fumigatus có hoạt độ CMCase cao nhất ở độ ẩm 70% (56,52

IU/g).

Kết quả được minh họa một lần nữa bằng đồ thị 3.10.

) g /

60

50

U I ( e s a C M C

40

30

20

10

0

50%

55%

60%

70%

75% độ ẩm

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Các tác giả Toyama và Ogawa (1997) cũng nhận xét rằng các chủng

nấm sợi khác nhau cần độ ẩm khác nhau cho quá trình phát triển của chúng.

Khi tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm cơ chất phồng lên, tăng độ xốp tạo

điều kiện cho nấm sợi tiếp xúc với cơ chất dễ dàng hơn. Nếu tăng độ ẩm cao

hơn sẽ làm cơ chất quá ẩm, độ xốp giảm và ngăn sự khuếch tán O2 từ bên

ngoài vào MT, sự sinh trưởng của nấm sẽ chậm và khả năng sinh enzym sẽ

giảm [30].

 Ảnh hưởng độ mặn đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Tiến hành nuôi ba chủng nấm theo các điều kiện giống như ảnh hưởng

độ ẩm. Điều chỉnh độ ẩm bằng nước muối có nồng độ 0%, 3%, 5%, 10%,

20%. Nuôi ở thời gian thích hợp, ly trích enzym theo phương pháp 2.2.2.6 và

xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1. Kết quả ở bảng 3.18.

Bảng 3.18. Ảnh hưởng độ mặn đến sinh tổng hợp enzym cellulase

0% 51,98 Hoạt độ CMCase (IU/g) 10% 5% 3% 28,43 48,17 55,32 20% 22,41 Tên chủng A. guamensis

53,49 55,56 40,3 28,31 26,8 P. oxalicum

53,47 54,60 48,44 14,15 13,96 A. fumigatus

(Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 9 theo công thức ở phần 2.2.3.1 )

Đối với nấm sợi ở RNM thì khả năng chịu mặn là một đặc điểm đặc

trưng của chúng. Qua kết quả ở bảng 3.18 ta thấy cả ba chủng có hoạt độ

CMCase cao ở MT không có muối, nhưng sinh enzym CMCase cao nhất ở

MT có nồng độ muối ở 3%, sau đó giảm dần đến 20%.

Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.11.

) g /

60

50

40

U I ( e s a C M C

30

20

10

0

0%

3%

5%

10%

20%

Độ mặn

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ CMCase của ba chủng

nấm sợi

 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Tiến hành nuôi ba chủng ở MT giống MT xác định ảnh hưởng độ mặn.

Ly trích enzym và xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1.

Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.19, đồ thị 3.12.

Bảng 3.19. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase

Hoạt độ CMCase (IU/g)

250C 26,01 28,24 28,22 300C 56,81 56,88 56,49 400C 52,68 56,58 56,24 500C 36,15 46,07 47,21 Tên chủng A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus

(Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 7 theo công thức ở phần 2.2.3.1)

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym của nấm sợi.

Kết quả cho thấy ba chủng có hoạt lực cao ở 30 - 400C, cao nhất ở 300C.

60

50

Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.12.

) g / U I ( e s a C M C

40

30

20

10

0

25

30

40

50

A. guam ensis

P. oxalicum

A. fum igatus

nhiệt độ

Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase

Nhiệt độ sinh trưởng trùng với nhiệt độ sinh CMCase của ba chủng nấm nghiên cứu (300C), là nhiệt độ phổ biến ở RNM Cần Giờ. Chứng tỏ các

chủng nấm sợi chúng tôi nghiên cứu có khả năng đưa vào sản xuất với điều

kiện nhiệt độ ở đất liền. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Norkrans

(1967) là các chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose cao đều là các loại nấm ưa ấm, phát triển thích hợp nhất ở 25-30oC [53].

Tóm lại, các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp CMCase của

ba chủng nấm sợi nghiên cứu ở bảng 3.20.

Bảng 3.20. Các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp

CMCase của ba chủng nấm sợi

Chủng nấm

A. guamensis

P. oxalicum

A. fumigatus

Điều kiện MT 1. Nguồn cacbon

2. Nguồn nitơ

3. pH

4. Độ ẩm

5. Độ mặn

6. Nhiệt độ

7. Thời gian

6C:4BM (56,88 IU/g) NH4NO3 (55,8 IU/g) pH6 (56,85 IU/g) 60% (56,78 IU/g) 3% (55,32 IU/g) 300C (56,81 IU/g) 48 giờ (56,58 IU/g)

6C:4MD (56,56 IU/g) NH4NO3 (56,56 IU/g) pH7 (56,15 IU/g) 55% (56,6 IU/g) 3% (55,56 IU/g) 300C (56,88 IU/g) 36 giờ (56,87 IU/g)

6C:4GL (60,8 IU/g) NH4NO3 (56,45 IU/g) pH7 (55,89 IU/g) 70% (56,52 IU/g) 3% (54,60%) 300C 56,49 IU/g) 36 giờ (56,49 IU/g)

3.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học khác của ba chủng nấm sợi

 Hoạt tính enzym ngoại bào

Chúng tôi tiến hành nuôi nấm sợi trên MT xốp cơ sở (MT11), chiết

dịch enzym theo phương pháp như mục 2.2.16. Sau đó, kiểm tra khả năng

sinh các loại enzym cellulase, protease, amylase, kitinase theo phương pháp ở

phần 2.2.3.2, kiểm tra khả năng phân giải dầu theo phương pháp 2.2.3.4. Kết

quả ở bảng 3.20, đồ thị 3.13, hình 3.7-3.10

Bảng 3.21. Khả năng tạo enzym ngoại bào của ba chủng nấm sợi

Tên chủng

cellulase (D-d), mm 29 27 27,5

protease (D-d), mm 15,5 15,5 21

amylase (D-d), mm 18 14 21

kitinase (D-d) mm 24 17,5 21

Phân giải dầu 0 0 0

A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus

Kết quả bảng 3.21 cho thấy cả ba chủng đều có hoạt tính enzym thủy

phân ngoại bào mạnh. Ngoài khả năng sinh enzym cellulase cao, ba chủng

nấm còn sinh enzym amylase, protease, kitinase rất cao. Sự kết hợp hoạt động

của các enzym trên giúp phân giải mạnh các biopolymer, nguồn cơ chất phổ

biến trong RNM Cần Giờ.

Đặc biệt, ba chủng nấm này có hoạt tính enzym kitinase khá cao (D-d=

24mm; 17,5mm; 21mm). Nhờ đó chúng sẽ phân hủy xác động vật biển như

các loài giáp xác, vỏ tôm, cua…hạn chế mùi hôi thối làm ô nhiễm MT RNM

Cần Giờ.

Tuy nhiên cả ba chủng đều không có khả năng sinh enzym phân giải

dầu. Vì RNM Cần Giờ nằm sát biển nên thường bị ô nhiễm dầu do các tai nạn

chìm tàu dầu. Nếu các chủng nấm sợi sinh trưởng ở RNM Cần Giờ có khả

năng phân giải dầu sẽ góp phần làm sạch MT. Ba chủng nấm đều không có

đặc tính quý giá này.

Kết quả này được minh họa lại bằng biểu đồ 3.3

m m

30

) d - D

(

25

20

15

10

5

0

cellulase

protease

amylase

Kitinase

Phân giải dầu

A. guamensis

P. oxalicum A. fumigatus

Biểu đồ 3.3. Khả năng tạo enzym, phân giải dầu của ba chủng nấm sợi

(a) (b) (c)

Hình 3.7. Hoạt tính cellulase của ba chủng nấm sợi

(a) (b) (c)

Hình 3.8. Hoạt tính enzym amylase của ba chủng nấm sợi

(a) (b) (c)

Hình 3.9. Hoạt tính enzym protease của ba chủng nấm sợi

(a) (b) (c)

Hình 3.10. Hoạt tính enzym kitinase của ba chủng nấm

(Ghi chú: a. A. guamensis; b. P. oxalicum ; c. A. fumigatus)

 Hoạt tính kháng sinh của ba chủng nấm sợi

Chúng tôi cũng tiến hành nuôi các chủng nấm sợi trên MT xốp cơ sở

(MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp như mục 2.2.2.6. Kiểm tra hoạt

tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.3. Kết quả ở bảng 3.22, hình 3.11-

3.12.

Bảng 3.22. Khả năng sinh kháng sinh của ba chủng nấm sợi

Tên chủng E.coli Bacillus subtillis

(D-d), mm (D-d), mm

5,0 1,0 A. guamensis

4,0 5,0 P. oxalicum

1,0 2,0 A. fumigatus

(Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm)

(a) (b) (c)

Hình 3.11. Hoạt tính kháng E. coli của ba chủng nấm

a. A. guamensis; b. P. oxalicum ; c. A. fumigatus

(a) (b) (c)

Hình 3.12. Hoạt tính kháng B. subtilis của ba chủng nấm sợi

a. A. guamensis; b. P. oxalicum ; c. A. fumigatus

Qua kết quả trên ta thấy ba chủng nấm đều có khả năng sinh kháng sinh

tiêu diệt các VSV gây bệnh, nhưng mức độ đối kháng yếu.

Chủng P. oxalicum có hoạt tính kháng sinh cao hơn hai chủng còn lại,

điều này cũng phù hợp với các công trình nghiên cứu về kháng sinh Penicilin

sinh ra từ nấm Penicillium.

Như vậy, qua kết quả khảo sát ta thấy ba chủng nấm sợi đều có thể

tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzym thủy phân ngoại bào mạnh như cellulase,

protease, amylase, kitinase, các chất kháng sinh chống lại các VSV gây bệnh

như E.coli, B. subtilis.

3.5. Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzym cellulase thô từ ba

chủng nấm sợi

3.5.1. Thử nghiệm khả năng đường hóa giấy in, giấy báo cũ

Để thấy được khả năng ứng dụng của enzym cellulase thu nhận được từ

các chủng nấm sợi phân lập được từ RNM Cần Giờ, chúng tôi tiến hành khảo

sát khả năng đường hóa giấy in, giấy báo cũ. Ba chủng nấm sợi nuôi cấy ở

các điều kiện thích hợp để có hoạt tính CMCase cao nhất như đã nghiên cứu ở

trên. Sau đó ly trích bằng dung dịch đệm Na-acetate 50mM pH5, lọc thu dịch

enzym để đường hóa giấy in, giấy báo cũ theo phương pháp 2.2.4.1. Sau đó

đo hàm lượng đường khử bằng thuốc thử DNS dựa vào đường chuẩn glucose

ở phụ lục 1. Kết quả được trình bày qua bảng 3.23.

Bảng 3.23. Khả năng đường hóa của enzym cellulase từ ba chủng nấm

% đường hóa

11,41 Dịch chiết enzym cellulase từ chủng nấm sợi Ascotricha guamensis

10,12 Penicillium oxalicum

14,62 Aspergillus fumigatus

26,02 Hổn hợp enzym từ 3 chủng

Bảng 3.23 cho thấy, enzym cellulase từ Ascotricha guamensis có khả

năng đường hóa khoảng 11,41%, từ Penicillium oxalicum đường hóa khoảng

10,124%, Aspergillus fumigatus có khả năng đường hóa 14,62%. Kết quả này

thấp hơn so với nghiên cứu của Trần Thạnh Phong (2004) đối với dịch chiết

từ Trichoderma.

Hỗn hợp dịch nuôi cấy của 3 chủng theo tỉ lệ 1:1:1 có khả năng đường

hóa cao hơn các chủng riêng rẽ (26,02%). Do có một số chủng nấm chỉ sinh

một loại enzym cellulase không phân cắt triệt để cellulose. Các chủng nấm

khác nhau sẽ sinh ra các loại enzym endoglucanse hay exoglucase nhiều ít

khác nhau. Các enzym này sẽ phối hợp hoạt động phân cắt cellulose thành

glucose mạnh hơn, triệt để hơn.

Như vậy, trong quá trình sử dụng enzym này cần có sự phối hợp dịch

chiết enzym của ba chủng nấm sợi.

3.5.2. Bước đầu thử nghiệm dịch chiết enzym cellulase thô từ 3

chủng nấm sợi vào việc phân hủy rơm rạ làm phân bón

Sau khi chọn được ba chủng, chúng tôi tiến hành ủ đống rơm rạ bằng

phương pháp ủ quy mô nhỏ theo phương pháp 2.2.4.2.

 Theo dõi sự thay đổi một số chỉ tiêu của đống ủ

Sau 1 tháng, tiến hành theo dõi một số chỉ tiêu và so sánh với ủ trong

hộp xốp có bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi. Kết quả ở bảng 3.24.

Ở lô thí nghiệm nhiệt độ tăng cao hơn đối chứng do tác động của dịch

chiết enzym phân cắt thành phần cellulose của rơm rạ, quá trình trao đổi chất

tăng nhanh nên nhiệt độ cũng tăng cao hơn. Đến tuần cuối cùng, quá trình

phân giải rơm rạ đã hoàn tất, nhiệt độ giảm. Trong khi ở mẫu đối chứng mới

bắt đầu phân cắt sợi rơm nên nhiệt độ vừa tăng cao hơn nhưng thấp hơn so với mẫu thí nghiệm (320C).

Kết quả là ở mẫu thí nghiệm sợi rơm đã bị phân hủy thành mùn nên

màu sẫm lại, nhũn và mềm có thể làm phân bón cho cây trồng. Còn ở mẫu đối

chứng sợi rơm vẫn còn màu nâu nhạt, chưa mềm nhũn.

Bảng 3.24 . Một số chỉ tiêu theo dõi mẫu ủ

Mẫu ủ

Chỉ tiêu

Đối chứng Thấp hơn (320C) Thí nghiệm Tăng cao hơn (380C) - Nhiệt độ đống ủ

trong tuần đầu.

Cao hơn (350C) Thấp hơn (320C) - Nhiệt độ đống ủ

trong tuần cuối.

12cm 20 cm - Độ giảm chiều cao

của đống ủ.

Nâu nhạt Nâu sẫm - Màu sắc của rơm rạ.

Sợi mềm, không Sợi rơm mềm, nhũn - Độ dai của rơm.

nhũn.

Ghi chú: Đối chứng: không bổ sung dịch nuôi cấy

Thí nghiệm: Có bổ sung dịch nuôi cấy

Từ kết quả ở bảng 3.24 ta thấy rằng việc bổ sung VSV vào đống ủ có

hiệu quả hơn ủ nhờ VSV tự nhiên có trong đống ủ, rút ngắn thời gian ủ, giảm

ô nhiễm MT gây ra do thời gian ủ kéo dài.

Mẫu ủ không có bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi cũng phân hủy nhưng

thời gian chậm hơn, phải kéo dài đến 65 ngày mới đạt được độ phân hủy

giống như mẫu ủ có bổ sung dịch enzym.

 Đánh giá độ chín của mẫu ủ

Tiến hành trồng đậu theo 2 lô thí nghiệm và đối chứng theo phương

pháp 2.2.4.2 (xem kết quả ở bảng 3.25). Kết quả bảng 3.25 cho thấy mẫu bổ

sung dịch chiết enzym từ ba chủng đều cho kết quả cao hơn mẫu đối chứng.

Như vậy phân ủ đã chín và có hiệu quả cao.

Bảng 3.25. Tỷ lệ hạt nảy mầm, trọng lượng tươi của đậu xanh sau 7 ngày

trồng trên phân ủ từ rơm rạ

STT Bổ sung dịch chiết Số hạt nảy Tỷ lệ hạt Trọng

từ các chủng nấm mầm (hạt) nảy mầm lượng tươi

(%) thu được(g)

1 Đối chứng 55 50,8 29/57

2 150 84,2 48/57 A. guamensis

3 120 73,7 42/57 P. oxalicum

4 95 63,2 36/57 A. fumigatus

5 180 87,7 50,57 Nhiễm hỗn hợp

dịch chiết enzym

(Đối chứng: Không bổ sung dịch chiết enzym)

Mẫu nhiễm dịch chiết từ A. guamensis có trọng lượng tươi 150g, tỉ lệ

hạt nảy mầm là 84,2% cao nhất. Do chủng này có hoạt độ CMCase cao nhất

(55,70 IU/g) nên phân hủy rơm rạ thành mùn cao hơn hai chủng còn lại.

Mẫu nhiễm hỗn hợp có trong lượng tươi là 180g, cao hơn mẫu nhiễm

A. guamensis là 30g, cao hơn mẫu nhiễm P. oxalicum là 50g, cao hơn mẫu

nhiễm A. fumigatus là 85g, và đặc biệt cao hơn mẫu không bổ sung dịch nuôi

cấy nấm sợi là 125g. Do hoạt động phối hợp của các enzym từ các chủng

khác nhau sẽ phân cắt sợi rơm rạ thành mùn tốt hơn.

Kết quả này có thể được đánh giá là khá tốt. So với báo cáo của Lê Thị

Thanh Thủy (2001) thì kết quả này thấp hơn, nhưng so với mức chuẩn để

đánh giá độ chín của phân ủ là trọng lượng tươi 160g thì chủng A. guamensis

150g (93,75%), mẫu nhiễm hỗn hợp dịch chiết cao hơn 180g (112,5%).

Như vậy, sử dụng hỗn hợp dịch chiết enzym sẽ cho kết quả cao hơn sử

dụng riêng rẽ dịch chiết từng chủng nấm.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

 Kết luận

Qua các kết quả thí nghiệm, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:

1. Đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau từ RNM Cần Giờ.

Trong đó có 114 chủng phân lập từ đất, 96 chủng phân lập từ lá, 102 chủng

phân lập từ thân, cành.

2. Đã xác định được 183/312 chủng chiếm 58,65%. Trong đó:

+ 10/183 chủng sinh enzym mạnh chiếm 5,5% chủ yếu sống

trong đất.

+ 6 /183 chủng sinh enzym khá mạnh chiếm 3,3%

+ 20/183 chủng sinh enzym trung bình chiếm 11%.

+ 147/183 chủng sinh enzym yếu chiếm 80,2%.

Trên cơ sở đó tuyển chọn ba chủng có hoạt độ cellulase cao nhất là:

chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g) và chủng Đ2b (53,10 IU/g).

3. Ba chủng nấm sợi tuyển chọn có nguồn gốc từ đất mặt ở RNM Cần

Giờ được định danh như sau:

- Chủng Đ’0 : Ascotricha guamensis Ames.

- Chủng Đ’3 : Penicillium oxalicum Currie & Thom.

- Chủng Đ2b : Aspergillus fumigatus Fresenius.

4. Đã xác định được điều kiện MT thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh

tổng hợp cellulase của ba chủng nấm sợi là:

- Nguồn cacbon tốt nhất đối với chủng A. guamensis là 6C:4BM

(56,88 IU/g), chủng P. oxalicum là 6C:4MD (56,56 IU/g), chủng A. fumigatus

là 6C:4GL (60,80 IU/g).

- Nguồn nitơ tốt nhất là NH4NO3.

- Độ pH= 6-7.

- Độ ẩm MT 55-70%

- Độ mặn thích hợp nhất là 3%. - Nhiệt độ thích hợp nhất là 300C.

- Thời gian thu enzym tốt nhất là 36- 48 giờ.

5. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học của ba chủng nấm sợi cho thấy

ngoài enzym cellulase, chúng còn có khả năng sinh cả 3 loại enzym là

protease, amylase, kitinase. Mạnh nhất là kitinase (24mm). Có khả năng đối kháng với 2 loại VSV kiểm định (G+, G-) là E. coli, B. subtilis.

6. Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzym cellulase thô từ ba

chủng nấm sợi vào việc đường hóa giấy in, giấy báo cũ cho thấy sự phối hợp

của ba chủng với tỉ lệ 1:1:1 cho kết quả cao nhất; Đồng thời, chúng còn có

khả năng chuyển hóa nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho cây trồng,

phân ủ được đánh giá đạt hiệu quả cao đối với dịch chiết hỗn hợp (112,5%).

Như vậy, sử dụng phối hợp cả ba chủng nấm sợi sẽ cho hiệu quả cao.

Tuy nhiên, trong ba chủng nấm sợi nghiên cứu ta thấy chủng A. guamensis rất

phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam và có hoạt độ CMCase cao nhất so

với hai chủng còn lại. Trong bước đầu thử nghiệm sử dụng thì chủng này

cũng cho kết quả cao hơn. Do đó, ta có thể chọn chủng A. guamensis nghiên

cứu thêm để có thể ứng dụng vào sản xuất.

 Kiến nghị

Nếu có điều kiện nên nghiên cứu thêm một số vấn đề để hoàn chỉnh đề

tài hơn:

- Tách chiết và tinh sạch enzym cellulase với hàm lượng và hoạt tính

cao từ MT nuôi cấy thích hợp của các chủng.

- Tiếp tục thử nghiệm ứng dụng enzym cellulase của ba chủng trên các

nguồn cơ chất khác nhau để làm tăng hiệu quả ứng dụng của đề tài.