Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích biến đổi di truyền của bệnh nhân mắc tật khuyết mống mắt ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Vũ Đình Chất LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA BỆNH NHÂN MẮC TẬT KHUYẾT MỐNG MẮT Ở VIỆT NAM

Hà Nội – tháng 5 năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Vũ Đình Chất LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA BỆNH NHÂN MẮC TẬT KHUYẾT MỐNG MẮT Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.Nguyễn Hải Hà Hà Nội – tháng 5 năm 2021

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Phân tích biến đổi di truyền

của bệnh nhân mắc tật khuyết mống mắt ở Việt Nam” là công trình nghiên

cứu của cá nhân tôi và các cộng sự tại Viện nghiên cứu Hệ gen thuộc Viện

Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác. Nếu không đúng như

đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.

Hà Nội, tháng 5 năm 2021

Học viên

Vũ Đình Chất

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hải Hà – Phó

Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, người thầy – người chị đã theo sát và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập và làm luận văn.

Thời gian làm tốt nghiệp cũng là lúc tôi gặp nhiều khó khăn và nghĩ tới bỏ

cuộc, tuy vậy, chị Hà đã tận tình giúp tôi để tôi có thể hoàn thành Luận văn này. Những câu chữ ngắn gọn khó có thể giúp tôi diễn tả lòng biết ơn của

mình đối với chị. Khoảng thời gian hơn một năm làm việc với chị giúp tôi học

được nhiều điều và chắc chắn những kiến thức tôi thu lượm được sẽ là hành trang tốt cho tôi trên con đường phía trước. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Nguyễn Đăng Tôn – Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Ths.

Nguyễn Thị Thanh Hoa cùng toàn thể các anh chị em đang làm việc và học

tập tại đây.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Học viện

Khoa học và Công nghệ đã dành tâm huyết xây dựng môi trường nghiên cứu

và học tập sáng tạo cho toàn thể học viên. Bên cạnh đó, để có thể hoàn thành

được khoá học với nhiều thông tin bổ ích không thể không nhắc tới sự tận tuỵ của các thầy cô trong Học viện, đặc biệt thầy cô đang công tác tại Khoa Công

nghệ Sinh học. Đồng thời thôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới toàn thể

anh chị em cán bộ học viện đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian theo học tại đây.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, vợ con, những người thân

trong gia đình và bạn bè, các đồng nghiệp tại Labo IVF Hồng Ngọc đã luôn hỗ trợ, khích lệ và động viên tinh thần từ lúc tôi đăng ký thi và trong suốt quá trình học tập tại Học viện.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

aCGH Lai so sánh hệ gen aCGH

Microarray-based Comparative Genomic Hybridization BAC/YAC Bacterial/Yeast artificial chromosome Nhiễm sắc thể vi khuẩn/ nấm nhân tạo

CTS C-terminal subdomain Tiểu vùng đầu C

CTE Kéo dài đầu C C-terminal exptension

DRR Downstream Regulatory Region Vùng điều hoà xuôi dòng

EE Ectodermal enhancer

ELP4 Elongator complex protein 4

FISH Fluorescence in situ hybridization Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

FOXC1 Forkhead Box C1

HD Homeodomain Vùng HD

ITPR1 Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor Type 1

KMM Khuyết mống mắt

LNK Linker region Vùng liên kết

LOVD Cơ sở dữ liệu đột biến mở Leiden open variation database

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NMD Nonsense-mediated decay Phân huỷ qua trung gian vô nghĩa

NTS N-terminal subdomain Tiểu vùng đầu N

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man Cơ sở dữ liệu trực tuyến bệnh di truyền Menden ở người

PAX6 Paired box 6

PD Vùng PD Pair domain

PITX2 Paired-like homeodomain transcription factor 2

P0/1/ α Promoter 0/1/α

PST Proline-serine-threonine domain Vùng giàu proline, serine, threonine

PTC Mã kết thúc sớm Premature termination codon

TRIM44 Tripartite Motif Containing 44

UTR Untranslated region Vùng không dịch mã

Wilms tumor-aniridia-genital WAGR anomalies-retardation

Giải trình tự toàn bộ hệ gen WES Whole Exom Sequencing biểu hiện

WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen

WT1 Wilms' tumor 1

Danh mục bảng biểu và hình ảnh

HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Bệnh nhân KMM với đột biến PAX6 dị hợp tử biểu hiện kiểu hình mắt rất đa dạng..................................................................................................... 5

Hình 1.2: Lô-cut PAX6 ở người.......................................................................... 10

Hình 1.3: Các mất đoạn ADN trong locus 11p13 chứa vùng điều hoà 3' của PAX6 ................................................................................................................... 16

Hình 1.4: Tần xuất các kiểu đột biến trong cơ sở dữ liệu đột biến PAX6 .......... 17

Hình 1.5: Chiến lược xét nghiệm di truyền đối với những bệnh nhân khuyết

mống mắt ............................................................................................................ 24

Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu.......................................................... 28

Hình 3.1: Điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 0.8% ....................... 38

Hình 3.2: Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM4 ............................... 41

Hình 3.3: Kết quả phân tích MLPA của hai mẫu có đột biến mất đoạn ............ 42

Hình 3.4: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR từ mẫu dị tật mống mắt ..... 44

Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 5 của gen PAX6 trên các

mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 44

Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 7 của gen PAX6 trên các

mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 45

Hình 3.7: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 8 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 46

Hình 3.8: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 9 của gen PAX6 trên các

mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 47

Hình 3.9: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 11 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 48

Hình 3.10: So sánh kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM12 (A) và

người mẹ cũng mắc KMM (B) ............................................................................ 54

Hình 3.11: Sơ đồ phả hệ của bệnh nhân TMM11 .............................................. 55

BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Các thành phần điều hoà bảo thủ và sự điều hoà biểu hiện trong và ngoài mắt của gen PAX6 [26]. ........................................................................... 13

Bảng 2.1: Thông số cài đặt máy điện di mao quản để chạy phân tích MLPA ... 31

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho khuếch đại vùng giáp ranh exon- intron và toàn bộ các exon của gen PAX6.......................................................... 32

Bảng 2.3: Thành phần PCR khuếch đại gen PAX6. ........................................... 34

Bảng 3.1: Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân KMM ......................................... 37

Bảng 3.2: Nồng độ ADN tổng số được xác định bằng ....................................... 39

Bảng 3.3: Bảng mối liên hệ giữa giá trị DQ và số lượng bản sao .................... 40

Bảng 3.4. Các đột biến gen phát hiện trên bệnh nhân KMM ............................. 49

Bảng 3.5: Đột biến và kiểu hình ở mỗi bệnh nhân ............................................. 50

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4

TỔNG QUAN BỆNH KHUYẾT MỐNG.............................................. 4

1.1.1. Đặc điểm lâm sàng .......................................................................... 4

1.1.2. Hội chứng WGAR ........................................................................... 8

1.1.3. Hội chứng Gellespie ........................................................................ 8

CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT

....................................................................................................................... 9

1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen PAX6 ............................................. 9

1.2.2. Sự điều hoà PAX6 .......................................................................... 12

1.2.3. Các đột biến trên PAX6 ................................................................. 16

1.2.3.1. Đột biến mã kết thúc sớm .............................................................. 17

1.2.3.2. Biến dị kéo dài đầu C (CTE) ......................................................... 18

1.2.3.3. Đột biến sai nghĩa ......................................................................... 18

1.2.3.4. Các đột biến trong vùng không mã hoá ........................................ 19

1.2.3.5. Đột biến cấu trúc ........................................................................... 19

1.2.3.6. Đột biến hai alen ........................................................................... 20

1.2.4. Các gen khác ................................................................................. 20

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN ......................................................... 21

1.3.1. Chẩn đoán lâm sàng ...................................................................... 21

1.3.2. Chẩn đoán di truyền ...................................................................... 22

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT ........... 24

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 27

NGUYÊN VẬT LIỆU.......................................................................... 27

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................... 27

2.1.2. Hoá chất và thiết bị ........................................................................ 27

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 28

2.2.1. Thu mẫu ......................................................................................... 29

2.2.2. Tách chiết và đánh giá chất lượng ADN ....................................... 29

2.2.3. Xác định các đột biến cấu trúc bằng MLPA.................................. 29

2.2.4. Giải trình tự gen Sanger ................................................................ 32

2.2.4.1. Thiết kế mồi và PCR ...................................................................... 32

2.2.4.2. Giải trình tự gen ............................................................................ 35

2.2.4.3. Phân tích kết quả tìm đột biến sau giải trình tự ............................ 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 37

KẾT QUẢ ............................................................................................ 37

3.1.1. Kết quả thu thập mẫu nghiên cứu .................................................. 37

3.1.2. Tách chiết ADN tổng số ................................................................ 38

3.1.3. Phân tích đột biến cấu trúc bằng MLPA ....................................... 39

3.1.4. Kết quả PCR khuếch đại gen PAX6 .............................................. 43

3.1.5. Phát hiện đột biến bằng phương pháp giải trình tự ....................... 44

3.1.6. Đánh giá mối liên hệ kiểu gen và kiểu hình cho mỗi bệnh nhân .. 49

THẢO LUẬN....................................................................................... 51

KẾT LUẬN ...................................................................................................... 57

KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 59

MỞ ĐẦU

Dị tật khuyết mống mắt (aniridia/KMM) là rối loạn gây nên hậu quả không có mống mắt thường ở cả 2 mắt của bệnh nhân. Đây là bệnh di truyền

trội với tỉ lệ mắc khoảng 1/40,000 – 100,000 ca sinh, không phân biệt chủng

tộc và giới tính [1]. Dị tật khuyết mống mắt thường được biểu hiện trong 6 tuần đầu sau khi sinh với biểu hiện mống mắt bất thường (mất hoàn toàn hoặc

một phần) hoặc rung giật nhãn cầu. Dị tật này có thể khiến cho bệnh nhân

nhìn không được rõ nét và mắt bị nhạy cảm với ánh sáng. Một số vấn đề với mắt cũng có thể gặp phải ở bệnh nhân như tăng nhãn áp thường xảy ra vào giai đoạn muộn của tuổi niên thiếu hoặc giai đoạn sớm của tuổi dậy thì.

Khoảng 50-80% bệnh nhân mắc KMM sẽ có biểu hiện đục thủy tinh thể và

10% số bệnh nhân bị kém phát triển dây thần kinh thị giác.

Đột biến gây mất chức năng của gen PAX6 là nguyên nhân gây nên

KMM [2]. Vai trò quan trọng của gen PAX6 đối với sự phát triển của mắt lần

đầu tiên được chú ý khi gen này được tìm thấy bị đột biến ở những bệnh nhân

KMM. Gen PAX6 nằm trên nhiễm sắc thể số 11 và mã hóa cho một protein tham gia vào giai đoạn phát triển sớm của mắt, não, cột sống (hệ thống thần

kinh trung ương) và tụy. Với vai trò là 1 yếu tố phiên mã, protein PAX6 bám

vào các trình tự ADN đặc hiệu và qua đó điều hòa hoạt động của các gen khác. Sau khi sinh, protein PAX6 tham gia điều hòa một số gen khác, các gen

này dường như góp phần duy trì các cấu trúc khác nhau của mắt. Đột biến gen

PAX6 tạo nên protein PAX6 không mang chức năng, không có khả năng bám

và hoạt hóa các gen. Từ đó sẽ gây ức chế quá trình hình thành mắt trong giai đoạn phát triển của phôi. Cho tới nay, có khoảng 500 đột biến dị hợp tử trên

gen PAX6 đã được phát hiện là nguyên nhân gây nên KMM và chiếm đến 2/3

số ca bệnh [2]. Trong số đó, 94% đột biến điểm trong gen hình thành tín hiệu kết thúc sớm hoặc làm thay thế axít amin [3]. Nghiên cứu trên chuột trước đó

đã cho thấy đột biến dị hợp tử trên gen PAX6 gây nên tính trạng mắt nhỏ [4].

Các đột biến gây tín hiệu kết thúc sớm ở gen PAX6 sẽ kích hoạt quá trình

phân hủy sản phẩm ARN mang bộ ba mã kết thúc sớm trước khi protein ngắn bất thường được hình thành. Những đột biến sai nghĩa trong gen PAX6 làm

2 thay đổi trình tự axít amin tạo nên sản phẩm protein gấp cuộn sai hoặc có

chức năng bất thường, điều này là nguyên nhân gây nên kiểu hình khiếm

khuyết ở mống mắt hoặc có thể tạo nên dạng nguy hiểm hơn là biến dạng dây thần kinh thị giác hoặc kiểu hình mắt nhỏ [1, 5]. Bên cạnh đột biến điểm, 30%

số ca bệnh KMM có nguyên nhân từ sự tái sắp xếp của nhiễm sắc thể tại vùng

11p13 bao gồm mất toàn bộ gen PAX6 hoặc mất cả vùng gen PAX6 với vùng gen liền kề (đặc biệt là gen WT1-gây nên hội chứng WAGR) [2]. Ngoài ra,

một dạng đột biến trong đó xảy ra tại 2 vị trí của gen PAX6 đều ở dạng dị hợp

tử (compound heterozygous) đã được công bố ở 2 bào thai có bố mẹ đều mắc KMM, các bào thai này có đặc điểm là biến dạng cấu trúc não [6].

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp

một số phương pháp phân tích phân tử như giải trình tự Sanger, lai huỳnh

quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization), MLPA (Multiplex (Microarray-based Ligation-Depent Probe Amplification) và aCGH

Comparative Genomic Hybridization) trong chẩn đoán di truyền cho các bệnh

nhân KMM [7 – 9]. Gần đây vào năm 2017, Blanco-Kelly và cộng sự đã phát

triển phương pháp aCGH trong chẩn đoán phân tử cho những ca bệnh dị tật khuyết mống mắt và hội chứng WAGR [9]. Bên cạnh đó, có một số nghiên

cứu đã kết hợp phương pháp giải trình tự Sanger và MLPA trong sàng lọc các

đột biến trên gen PAX6 ở bệnh nhân KMM [10 – 12]. Việc kết hợp hai kỹ thuật này đã giúp nâng tỷ lệ xác định đột biến từ 49% lên 60%. Như vậy

chứng tỏ việc sử dụng đồng thời cả hai phương pháp giải trình tự Sanger và

MLPA đã tăng độ nhạy cho chẩn đoán [12].

Cho tới nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam công bố về di truyền phân tử của bệnh KMM. Mặc dù có rất nhiều vấn đề với mắt, nhưng

hầu hết những bệnh nhân mắc dị tật khuyết mống mắt đều có thể bảo tồn thị

lực nếu được chăm sóc phù hợp. Trong số bệnh nhân KMM, hơn 2/3 số ca mắc bệnh là do yếu tố di truyền trội từ cha/mẹ, 1/3 số còn lại là đột biến mới

phát sinh [1]. Do đó, chẩn đoán di truyền đóng vai trò quan trọng để xác định

nguyên nhân gây bệnh, tư vấn di truyền cũng như dự đoán nguy cơ hình thành

khối u khác của bệnh nhân (khối u thận). Hơn nữa, kết quả nghiên cứu của đề

3 tài cũng sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu về các đa hình của gen gây KMM ở

Việt Nam.

4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

TỔNG QUAN BỆNH KHUYẾT MỐNG

1.1.1. Đặc điểm lâm sàng

Khuyết mống mắt (KMM) (OMIM 106210) là tình trạng suy sản một

phần hoặc toàn bộ mống mắt đồng thời suy sản hố thị giác, dẫn đến giảm thị

lực và rung giật nhãn cầu [13 – 15]. Bệnh này luôn biểu hiện ở giai đoạn rất

sớm. Những bất thường mắt liên quan như đục thuỷ tinh thể, tăng nhãn áp và bất thường giác mạc nhìn chung sẽ khởi phát muộn dẫn đến mất thị giác tiến

triển. Khoảng 2/3 trường hợp KMM di truyền trội theo dòng họ, phần còn lại là tự phát. Kiểu hình của người mắc KMM có thể khác nhau giữa các gia đình và thậm chí khác nhau trong cùng gia đình. Hơn nữa, người bệnh thường cho

thấy có sự khác biệt nhỏ giữa hai mắt. Hầu hết các trường hợp biểu hiện trong

sáu tuần sau sinh với một bất thường mống mắt hoặc đồng tử rõ ràng hoặc

rung giật nhãn cầu. Mặc dù có nhiều vấn đề về mắt, hầu hết bệnh nhân KMM có thể giữ lại thị lực nếu chăm sóc mắt thích hợp. Bệnh này có thể biểu hiện

như một bất thường tại mắt mà không có liên quan rõ ràng đến các bất thường

có hệ thống khác hoặc là một phần của hội chứng gen tiếp giáp WAGR [16]. Những người mắc hội chứng WAGR có nguy cơ cao sẽ phát triển u nguyên

bào thận (Wilms), đây là dạng ung thư thận ác tính ở thời kỳ niên thiếu. Tỷ lệ

hiện hành của khuyết mống mắt là 1:40,000 tới 1:100,000 không bị ảnh

hưởng bởi nguồn gốc chủng tộc hay giới tính [1, 13].

Mống mắt

Suy sản mô mống mắt là hiện tượng bất thường đặc trưng nhất ở những bệnh nhân KMM. Mức độ bất thường mống mắt có thể biểu hiện rất khác nhau giữa các bệnh nhân (xem hình 1.1). Trong trường hợp nghiêm trọng

nhất, mống mắt bị suy giảm chỉ còn là một điểm nhỏ của phần mô còn sót lại.

Ngược lại, ở những trường hợp nhẹ nhất, mống mắt chỉ có bất thường trên phần truyền sáng hoặc với cấu trúc bề mặt [8, 17]. Những thay đổi khác bao

gồm khiếm khuyết mống mắt một phần, bất thường hoặc lạc vị trí đồng tử và

lộn màng bồ đào.

Hình 1.1 Bệnh nhân KMM với đột biến PAX6 dị hợp tử biểu hiện kiểu hình mắt rất đa dạng. (a) Hoàn toàn không có mô mống mắt với áp-xe phẫu thuật (loại bỏ thuỷ tinh thể) và phần còn lại của bao thuỷ tinh thể mờ đục (đột biến CTE). (b) Mô mống mắt hầu như không có và bị che bởi lớp giác mạc bên ngoài bất thường với tình trạng đục và tạo mạch máu mới. Ngoài ra, một phần bề mặt thuỷ tinh thể đục có sắc tố bất thường (đột biến PCT). (c) Khuyết mống mắt một phần (đột biến sai nghĩa). (d) Bệnh lý giác mạc nghiêm trọng do KMM với tình trạng đục hoàn toàn và hình thành mạch máu (đột biến PCT). (e) Mô mống mắt vẫn còn đầy đủ nhưng có một vùng cấu trúc bất thường (Đột biến sai nghĩa) [3].

Thuỷ tinh thể

Đục thuỷ tinh thể bẩm sinh cũng xuất hiện ở bệnh nhân KMM đặc biệt

phần cực [8, 13, 14, 17]. Đôi khi còn tồn tại tàn dư mạch máu thai nhi của ống trước hoặc màng đồng tử vẫn còn. Đục thuỷ tinh thể hiếm gặp ở trẻ sơ sinh,

nhưng nó phát triển trong khoảng 50-85% bệnh nhân KMM thường ở tuổi

niên thiếu hoặc giai đoạn đầu của thời kỳ trưởng thành. Dịch chuyển thuỷ tinh thể cũng có thể xuất hiện nhưng không thường xuyên.

Áp lực nội nhãn

Hiện tượng áp lực nội nhãn tăng lên mà không thay đổi đĩa thị giác và

thị trường (tăng nhãn áp) và glôcôm (chèn đĩa thị giác và giảm thị trường) xuất hiện khá phổ biến, với tỷ lệ hiện hành cuối cùng là 30-50% [8, 13, 14,

17, 18]. Tăng nhãn áp luôn xuất hiện ở giai đoạn muộn thời niên thiếu hoặc

thời kỳ trưởng thành nhưng có thể có mặt lúc sơ sinh với đường kính giác mạc lớn và kèm với hiện tượng đục giác mạc (chứng mắt trâu).

Bất thường giác mạc

Bất thường giác mạc xuất hiện tương đối muộn chủ yếu do thiếu chức

năng tế bào gốc vùng rìa. Có thể có nhiều bất thường trên giác mạc khác nhau từ tạo mạch ngoại vi nhẹ tới tạo mạch toàn giác mạc, đục và sừng hoá (hình

1.1) [8, 13, 14, 17]. Can thiệp phẫu thuật để giải quyết đục thuỷ tinh thể hoặc

tăng nhãn áp có thể kích hoạt tình trạng suy giác mạc. Ngoài ra hiện tượng tạo nước mắt không thích hợp sẽ làm trầm trọng thêm vấn đề bề mặt của mắt.

Phần trung tâm của giác mạc thường dày lên khiến cho áp kế mắt đo sai áp lực nội nhãn dẫn đến không chẩn đoán được tăng nhãn áp.

Hố thị giác

Suy sản hố thị giác luôn xuất hiện ở bệnh nhân KMM. Biểu hiện của

tình trạng này là phản xạ hố thị giác giảm, giảm sắc tố điểm vàng và các mạch

máu võng mạc đi xuyên qua vùng vô mạch của hố thị giác [8, 14].

Thần kinh thị giác

Suy thần kinh thị giác (thần kinh thị giác nhỏ, dị dạng) xuất hiện lên tới

10% trường hợp bệnh nhân KMM. Ngoài ra tật khuyết dây thần kinh thị giác đôi khi cũng được quan sát thấy ở những bệnh nhân này [8].

Tật khúc xạ, lác và sụp mí

Cận thị, viễn thị, loạn thị, cũng như lác mắt thường thấy ở người

KMM. Ngoài ra, có tới 10% bệnh nhân bị sụp mí.

Hội chứng xơ khuyết mống mắt

Một số phẫu thuật nội nhãn đôi khi kích hoạt sự phát triển của một

màng xơ từ phần còn lại của mô mống mắt mà nằm bên dưới thuỷ tinh thể và giác mạc. Hiện tượng này có thể gây ra dịch chuyển hoặc vướng vào thuỷ tinh

thể và đục giác mạc.

Các đặc điểm hệ thống

Đã có nhiều báo cáo cho rằng bệnh nhân KMM có thể có thiếu hụt cảm

giác và thần kinh mà không liên quan tới mắt. Bởi vậy, người ta ngày càng có

niềm tin rằng KMM đơn có thể có những đặc đểm hệ thống đặc trưng.

Hệ thần kinh trung ương

Ở bệnh nhân KMM đơn, khứu giác giảm dường như là khiếm khuyết

chức năng phổ biến nhất. Các nghiên cứu MRI đã chứng minh các bất thường

của mép trước não, vùng vòng cung vỏ não trước, tiểu não, thuỳ thái dương và chẩm, thể chai, tuyến tùng và khứu giác [19]. Tuy nhiên, dường như không

phát hiện ra bất kỳ dấu hiệu bất thường nào của chức năng thận [15]. Rất hiếm bệnh nhân có biểu hiện khó khăn về hành vi và chậm phát triển [20].

Thính giác

Người khuyết mống mắt có thể có khiếm khuyết xử lý thính giác trung

tâm do chuyển giao bất thường giữa bán cầu, có thể gây khó nghe. Để chẩn

đoán cần đánh giá thính giác chi tiết, nhưng quan trọng ở bệnh nhân, đặc biệt là trẻ em, người mà đã có một sự suy giảm thị lực [19].

8 1.1.2. Hội chứng WGAR

Đối với trường hợp KMM bột phát người ta thường xét nghiệm để sàng lọc nguyên nhân do mất đoạn nhiễm sắc thể. WT1 một gen hàng xóm của

PAX6 và cùng nằm trên vùng 11p13, đây là gen có khuynh hướng sinh ra khối

u Wilms. Do đó, những bệnh nhân bị mất đoạn nhiễm sắc thể bao gồm hai gen này có nguy cơ cao (lên tới 50%) với phát sinh khối u nguyên bào thận

(Wilms – OMIM 195070) ở giai đoạn thơ ấu. Hội chứng WAGR cổ điển

(OMIM 194072) bao gồm khối u Wilms với khuyết mống mắt, bất thường sinh dục và chậm phát triển trí tuệ, nhưng kiểu hình có thể khác nhau nhiều [1, 7, 16]. Khuyết mống mắt là triệu chứng phù hợp nhất [16]. Thuật ngữ hội

chứng WAGR được sử dụng chung thậm chí nếu bệnh nhân không biểu hiện

tất cả bốn đặc điểm cổ điển. Tương tự, mất đoạn WAGR mô tả một mất đoạn bao gồm PAX6 và WT1 nếu không có u Wilms. Khối u Wilms ở bệnh nhân

WAGR thường có cả hai bên và xuất hiện sớm hơn các loại u Wilms khác

[16]. Các bất thường thận phát triển, và xuất hiện phổ biến hơn là tình trạng

viêm cầu thận phân đoạn khu trú giống như bệnh thận giai đoạn cuối [21]. Các bất thường sinh dục bao gồm tinh hoàn lạc chỗ (trong 60% trường hợp

nam giới), lỗ đái lệch thấp và cơ quan sinh dục mơ hồ, bất thường niệu, buồng

trứng, bất thường tử cung và u tuyến sinh dục [16]. Chậm phát triển trí tuệ (IQ<74) đã được chứng minh trong 70% trường hợp bệnh nhân WAGR và có

xu hướng liên quan tới các mất đoạn lớn [1, 16]. Một loạt các đặc điểm dị

hình và các bất thường về hành vi, thần kinh và chuyển hoá, bao gồm cả béo

phì, cũng có thể xuất hiện.

1.1.3. Hội chứng Gellespie

Bệnh nhân mắc hội chứng Gellespie (GS – OMIM 206700) khuyết mống mắt một phần rõ ràng, biểu hiện như giãn đồng tử bẩm sinh và bao gồm

các đặc điểm liên quan tới suy sản tiểu não tiến triển, mất kiểm soát vận động,

chậm phát triển trí tuệ và giảm trương lực bẩm sinh. Đối với hội chứng GS

với hình thái KMM hai mắt và có dạng vỏ sò riêng biệt do sự bất sản của mô trung tâm tới ống nối. Hiện tượng này dường như là hậu quả của sự phát triển

bất thường cơ vòng có nguồn gốc ngoại bì và mô đệm có nguồn gốc trung bì

9 xung quanh đầu xa của mống mắt thai nhi. Trái ngược với bệnh KMM do

PAX6, bất thường trong GS thường giới hạn ở mống mắt và sự thay đổi của

các sợi thấu kính. Suy sản hố thị giác hiếm khi được quan sát [22].

Vào năm 2016, hai dự án độc lập sử dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen

biểu hiện đã xác định được đột biến trên gen ITPR1 là nguyên nhân gây ra hội

chứng Gellespie [22, 23]. Tất cả những trường hợp được báo cáo đều có đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử trên ITPR1 do đó, hội chứng GS hiện nay

được coi như bệnh do rối loạn di truyền đơn gen gây nên. Đáng chú ý là có 17

trong số 22 trường hợp được báo cáo là nữ dù cho những báo cáo ban đầu về hội chứng này khi mà chưa có xét nghiệm di truyền không cho thấy xu hướng lệch giới tính như vậy.

CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT

1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen PAX6

Đột biến gen PAX6 được coi là nguyên nhân chính gây nên KMM [1].

Lô-cut PAX6 (OMIM 607108) đã được lập bản đồ gen cùng với vùng 11p13.

Gen PAX6 có chiều dài là 22 Kb, tuy nhiên vùng điều hoà của nó kéo dài tới xấp xỉ 450 Kb trong hệ gen [24, 25]. PAX6 bao gồm 14 exon, trong đó có ba

vùng không mã hoá.

Hình 1.2: Lô-cut PAX6 ở người. (A) Cấu trúc gen PAX6 trong vùng 11p13, với 14 exon (các hộp màu sắc thể hiện các vùng protein tương ứng),

promoter P0, P1 và Pα (các hộp với đường mũi tên) và các thành phần điều

hoà (hình ovan với đường kẻ ngang) bao gồm vùng tăng cường ở biên (EE),

nằm ngược dòng với PAX6, và vùng điều hoà xuôi dòng (DRR) và SIMO nằm trong các intron của gen hàng xóm ELP4 (kéo dài bốn exon thể hiện bởi các

hộp màu cam). EE: vùng tăng cường bên ngoài; DRR: vùng điều hoà xuôi

dòng. (B) Hai đồng phân chính của PAX6: PAX6 chính tắc, PAX6(5a) và cấu trúc tương ứng của chúng với các domain chức năng. PD: paired domain;

NTS: N-terminal subdomain; CTS: C-terminal subdomain; LNK: Liker

region; HD: Homeodomain; PST: proline-serine-threonine domain; aa:

amino acid [26].

Phân tử protein chính được mã hoá bởi gen PAX6 chứa 422 axít amin và trọng lượng phân tử xấp xỉ 46 KDa. Protein PAX6 có hai vùng gắn ADN

là paired domain (PD) và homeodomain (HD), giữa HD và PD có một đoạn gọi là vùng nối (LNK) (hình 1.2B). Ở đầu C, tiếp giáp với HD là một vùng

chuyển hoạt hoá giàu proline-serine-threonine (PSTD). Vùng PSTD này cần

thiết cho hoạt động khởi đầu phiên mã và nó điều hành việc gắn ADN bởi HD

[27]. Ngược lại, PD bao gồm một tiểu vùng đầu N (NTS hoặc PAI) và một tiểu vùng đầu C (CTS hoặc RED) (hình 1.1B) [28]. Cả hai tiểu vùng gắn các

11 trình tự ADN liên kết tương ứng với hai đồng phân: PAX6 chính tắc và

PAX6(5a) để điều hành hoạt động của chúng [29]. Phiên bản phụ PAX6(5a)

được hình thành nhờ sự cắt ghép thay đổi của exon 5a nằm giữa exon 5 và 6, dẫn tới một đồng phân lớn hơn với 436 amino axít (48 KDa) (hình 1.1B).

Mười bốn amino axít mã hoá bởi exon 5a được chèn trong tiểu vùng NTS của

PD, khoá hoạt động gắn ADN của nó, và để lộ hoạt động gắn ADN của CTS [29].

Một đồng phân thứ ba đã được báo cáo ở chuột và chim cút là

Pax6∆PD. Đồng phân này thiếu hoàn toàn vùng PD và nó được dự đoán dẫn đến một protein bị cắt ngắn [30]. Tuy nhiên, Kim và Lauderdale chỉ ra rằng Pax6∆PD có một chức năng giới hạn trong sự phát triển mắt của động vật có

vú so với PAX6 và PAX6(5a), vì sự biểu hiện quá mức của Pax6∆PD, trong

khi sử dụng hệ thống chuyển gen BAC và YAC, dẫn đến tình trạng mắt nhỏ nghiêm trọng ở cả kiểu dại và chuột thiếu Pax6 [31]. Các hệ thống báo cáo

kép trong sự phát triển phôi chuột cho thấy rằng đồng phân Pax6∆PD, mặc dù

ở mức độ thấp hơn các đồng phân chứa PD, hầu như được xác định trong

ngoại vi võng mạc thần kinh và phát triển thể mi, nhưng nó vắng mặt trong thuỷ tinh thể và giác mạc đang phát triển [32].

Sự điều hoà và các gen đích của mỗi đồng phân trong mắt vẫn chưa

được hiểu biết rõ ràng. Người ta giả thiết rằng PAX6 chính tắc là phổ biến hơn trong sự phát triển các mô mắt giai đoạn phôi thai và liên quan tới sự biệt

hoá và xác định số phận tế bào, trong khi PAX6(5a) có vẻ liên quan đến sự

phát triển hoặc sau sinh và tăng sinh tế bào [33]. Theo đó, các nghiên cứu

biểu hiện ở thuỷ tinh thể mắt chuột chỉ ra rằng, trong quá trình phát triển phôi, sự biểu hiện Pax6 chính tắc là cao hơn (8:1) khi được so với Pax6(5a). Tuy

nhiên, ở các mô mắt trưởng thành (thuỷ tinh thể, giác mạc và võng mạc), tỷ lệ

thay đổi thành 1:1 [34]. Cùng xu hướng được quan sát trong võng mạc của phôi gà, ở đó Pax6 chính tắc được biểu hiện cao trong giai đoạn sớm ở mầm

mắt và tấm thấu kính, trong khi đó sự biểu hiện Pax6(5a) thực sự vượt sự biểu

hiện Pax6 chính tắc trong tiền võng mạc của gà, vì các loài chim sở hữu mật

độ thụ thể ánh sáng cao hơn so với các loài linh trưởng [33]. Những nghiên

12 cứu biểu hiện này dường như chứng minh cho kiểu hình ở người, vì các đột

biến ảnh hưởng tiểu vùng CTS, phần gắn ADN của đồng phần PAX6(5a), liên

quan tới suy sản hố thị giác [29]. Trong giác mạc, PAX6 và PAX6(5a) đều được biểu hiện trong lớp biểu mô, đồng thời mức độ biểu hiện của keratin đặc

hiệu biểu mô có mối tương quan với các đồng phân PAX6. Các nghiên cứu

dựa trên sự tăng cường biểu hiện cho thấy dường như PAX6 chính tắc kích thích KRT3, trong khi PAX6(5a) kích thích sự biểu hiện KRT12 thông qua

mỗi tiểu vùng tương ứng của chúng [35].

Mặc dù các đồng phân PAX6 có thể có các vai trò độc lập và các đích tác động khác nhau trong sự phát triển mắt, sự tồn tại của một hệ thống phản hồi dương giữa Pax6 và Pax6(5a) ở chuột đã được báo cáo [36]. Hơn nữa, tỷ

lệ biểu hiện giữa hai đồng phân có vẻ cần thiết cho sự phát triển bình thường

của mắt, và tỷ lệ thay đổi liên quan tới bất thường mắt và não [37].

1.2.2. Sự điều hoà PAX6

Do sự tương đồng cao giữa Pax6 ở chuột, ruồi giấm, hoặc chim cút với

PAX6 ở người, những sinh vật này được sử dụng rộng rãi như các hệ thống mô hình để nghiên cứu và tìm hiểu chức năng cũng như mạng lưới điều hoà

phức tạp của gen này. Hai promoter chính tham gia vận hành phiên mã PAX6

là P0 và P1. Promoter Pα nằm trong gen tham gia với mức độ thấp hơn và tạo ra nhiều bản phiên mã mà mã hoá cho các đồng phân khác nhau (hình 1.2)

[38, 39]. Các thí nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ trong mắt chuột đang phát

triển cho thấy promoter P0 khởi đầu sự biểu hiện gen ở biểu mô giác mạc và

biểu mô kết mạc, tấm thuỷ tinh thể, và võng mạc, trong khi promoter P1 chủ yếu khởi động phiên mã trong tấm thuỷ tinh thể, túi thị giác, và hệ thần kinh trung ương, nhưng chỉ yếu ở giác mạc và kết mạc. Pα trực tiếp biểu hiện trong

các tế bào amacrine của võng mạc, thể mi, và mô mống mắt [39].

Tuy nhiên, sự điều hoà biểu hiện PAX6 theo kiểu đặc hiệu mô hoặc thời

gian vẫn còn nhiều vấn đề chưa được giải đáp rõ ràng. Hơn nữa, không có

mối liên hệ trực tiếp giữa promoter và sự biểu hiện của các bản phiên mã đặc

biệt. Ở chuột, P0 và P1 cùng khởi đầu sự biểu hiện của các bản phiên mã Pax6 và Pax6(5a), trong khi các bản phiên mã được tạo ra bởi Pα dường như

13 liên quan trực tiếp tới đồng phân Pax6∆PD [38]. Những kết quả này chỉ ra

rằng có thành phần điều hoà bổ sung mà hoạt động cùng với các promoter

trong kiểu điều hoà và biểu hiện phức tạp của PAX6. Vùng điều hoà bảo thủ cis đã được xác định nằm cả hai chiều xuôi và ngược với gen PAX6 như được

tổng hợp trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Các thành phần điều hoà bảo thủ và sự điều hoà biểu

hiện trong và ngoài mắt của gen PAX6 [26].

Vị trí

Sự biểu hiện mắt

Sự biểu hiện ngoài mắt

Thành phần điều hoà

Khoảng cách tới PAX6 (Kb)

Tha m khả o

-215

IT ELP4

[31]

-176

IT ELP4 RGC và thần kinh thị giác

[48]

E180B

-177

IT ELP4

Não trung gian, đại não, tuyến tùng Hạch bán nguyệt, thần kinh rễ sau tuỷ sống

[24]

HS8B

-176

IT ELP4

[24]

HS8A

-172

IT ELP4

võng mạc thần kinh

Các cấu trúc thần kinh

[41]

HS6

-168

IT ELP4 Đài thị giác và võng mạc thần kinh Não trung gian

[41]

HS5

-162

IT ELP4 Võng mạc thần kinh

[24]

HS3

-161

IT ELP4 Võng mạc thần kinh

[24]

HS2

-153

IT ELP4

[24]

SIMO

-126

IT ELP4

Thuỷ tinh thể và võng mạc thần kinh

[48]

E120

-104

IT ELP4 Võng mạc thần kinh

[42]

E100

Não trung gian, não sau, ống thần kinh Khứu giác, não Não trung gian, vùng khứu giác

-54

IT ELP4 Đài thị giác và võng mạc thần kinh Cấu trúc thần kinh

[41]

E60A

-18

IT PAX6

[78]

7CE1

-13

IT PAX6

[38]

NRE

Sự phát triển mắt giai đoạn muộn Võng mạc thần kinh, thể mi, mống mắt

-1

[25]

0CE1

Tuyến tuỵ

5’UTR PAX6

[48]

agCNE14 (P2)

[38]

Giác mạc, thuỷ tinh thể, kết mạc và tuyến lệ

Đảo tuỵ

[78]

agCNE12 (P)

Tuyến tùng

[48]

Không có kiểu đặc hiệu

[48]

Tuyến tùng

[48]

[79]

agCNE11 agCNE10 (Up- 9) agCNE9 (Up- 10) Mouse-like Paupar

[80]

PE3 (E-52)

Tuyến tuỵ và não đang phát triển Không có kiểu đặc trưng

[48]

E-55/C

Không có kiểu đặc trưng

[48]

E-55B

Não sau

[48]

E-55/A

E-72

[48]

PE4 (E120)

110

[80]

Không có kiểu đặc trưng Tuyến tuỵ đang phát triển, đường khứu giác, tiểu não, não sau

178

Não trước

[48]

agCNE5 (Id855) agCNE4

186

Não sau

[48]

agCNE3

214

Khứu giác

[48]

E200

214

[80]

agCNE1

224

[48]

E250

247

Khứu giác, tiểu não Hạch bán nguyệt, rễ thần kinh tuỷ sống Không có kiểu đặc trưng

[48]

Chú thích: IT – Intron; RGC – Tế bào hạch võng mạc

Vùng điều hoà tăng cường (EE) nằm bên ngoài, ngược với gen và cách

promoter P0 khoảng 3.5 Kb. EE tham gia vào điều khiển sự biểu hiện PAX6 trong quá trình phát triển của bề mặt các mô có nguồn gốc ngoại bì (thuỷ tinh

thể, giác mạc, kết mạc) [36, 38]. Ở chuột, người ta thấy rằng Pax6 tương tác

trực tiếp với EE đối với cơ chế tự điều hoà, nhưng nó cũng có thể tương tác

với Sox2 và Sox3, đây là các nhân tố phiên mã có mặt trong quá trình phát triển thuỷ tinh thể và mắt giai đoạn sớm [36]. Phức hệ Pax6-Sox2 có thể cũng

hoạt động trên vùng tăng cường của Sox2 là N-3, cho thấy một cơ chế tương

hỗ giữa hai nhân tố phiên mã trong điều hoà sự biểu hiện gen crystallin [40].

Ngoài EE, PAX6 còn có một vùng điều hoà xuôi dòng quan trọng khác

là DRR, nằm trong vùng intron 7 tới 9 của gen ELP4 bên cạnh cách PAX6 tới

150 Kb. DRR chứa một vài thành phần bảo thủ mà nếu vắng mặt sẽ ảnh

hưởng sự biểu hiện PAX6 và sự phát triển bình thường của mắt [24, 31, 41, 42]. Mặc dù vai trò của tất cả các thành phần này vẫn chưa được khám phá,

nhưng DRR được cho là có vai trò tăng cường biểu hiện trong võng mạc và mống mắt, vì mất đoạn vùng DRR ở chuột thủ tiêu hoàn toàn sự biểu hiện của PAX6 trong cả hai mô, cũng như trong thể mi [31]. Mất đoạn DRR không thay đổi nhiều sự biểu hiện PAX6 tại thuỷ tinh thể; hiện tượng này cũng được

quan sát khi mất vùng EE, nó chỉ khiến sự biểu hiện PAX6 trong thuỷ tinh thể

giảm chứ không bị triệt tiêu [43]. Kết quả từ những nghiên cứu này chỉ ra rằng các vùng tăng cường tham gia điều hành phiên mã đặc hiệu mô [31].

Trong vùng DRR, có một thành phần tăng cường đặc hiệu dài 800 bp được đặt tên là SIMO. SIMO có một đoạn trình tự có thể gắn kết với tiểu

15 phần PD của PAX6, hướng sự biểu hiện của gen này trong các giai đoạn sớm

và muộn của sự hình thành mắt, ví dụ bề mặt ngoại bì sớm, thuỷ tinh thể, và

sự biệt hoá võng mạc thần kinh, cũng như ở cơ thể trưởng thành, trong biểu mô thuỷ tinh thể, võng mạc, và mô mống mắt [25]. Vai trò của SIMO trong

sự biểu hiện Pax6 ở động vật cũng đã được chỉ ra trong một số nghiên cứu,

chỉ riêng yếu tố này bị phá vỡ là đủ triệu tiêu sự biểu hiện của Pax6 trong thuỷ tinh thể đang phát triển ở chuột chuyển gen và cá ngựa vằn [25]. Hơn

nữa, đột biến mất nucleotide hoặc đột biến điểm trong SIMO được mô tả gây

ra kiểu hình KMM ở người [25]. Tuy nhiên, sai hỏng biểu hiện của PAX6 trong thuỷ tinh thể khi SIMO bị đột biến có thể do cơ chế tự điều hoà của chính PAX6. Trường hợp này tương tự với cơ chế điều hoà của EE, nghĩa là

SIMO sẽ gắn với PAX6 thông qua tiểu phần PD và điều hoà sự biểu hiện của

chính nó trong một vòng phản hồi dương [25]. Trong thuỷ tinh thể của chuột, hai yếu tố phiên mã họ homeoprotein TALE, Meis1 và Meis2, đã được xác

định như nhân tố điều hoà ngược dòng của Pax6 bằng cách can thiệp vào hoạt

động của cả hai vùng tăng cường EE và SIMO [44]. Tuy nhiên, vai trò chính

xác và các cơ chế điều hòa của những vùng này lên sự biểu hiện của PAX6 trong các mô mắt khác hầu như chưa được biết.

Ngoài ra khi sử dụng công nghệ lai so sánh hệ gen CGH đối với những

bệnh nhân KMM không có đột biến trong trình tự mã hoá PAX6, người ta thấy xuất hiện các mất đoạn trong vùng điều hoà 3’ của PAX6 (hình 1.3),

chứng tỏ có một số thành phần điều hoà bổ sung nằm trong vùng không mã

hoá này [9, 45 – 47]. Do đó, Ansari và cộng sự đề xuất một vùng điều khiển

quan trọng đối với hoạt động phiên mã của PAX6 kéo dài xấp xỉ 254 Kb và bao gồm một số bên cạnh là DNALC24, IMMP1L, và ELP4 [45]. Gần đây,

Plaisancie và cộng sự đã xác định lại vùng này khoảng 18 Kb trong ELP4 mà

không bao gồm SIMO, tuy nhiên, nó chứa thêm một vùng tăng cường bảo thủ cao khác trong DRR, là E180 (hình 1.3) [48]. Những kết quả này nhấn mạnh

vai trò của E180B trong bệnh khuyết mống mắt [47].

Hình 1.3: Các mất đoạn ADN trong locus 11p13 chứa vùng điều hoà

3' của PAX6. Các gen được thể hiện bởi các hộp màu xám và mũi tên chỉ

hướng phiên mã. PAX6 được nhấn mạnh bằng hộp màu đen. Hình ô van thể hiện vùng tăng cường đã biết của PAX6, đặc biệt có hai vùng quan trọng

SIMO và E108B. Các thanh màu thể hiện những mất đoạn được xác định

trong nhóm bệnh nhân KMM không có đột biến trên PAX6 [45, 47]. Các đường dọc nét đứt chỉ ra một vùng ADN bị mất phổ biến trong tất cả các bệnh

nhân KMM được đề cập, vùng điều khiển đầu tiên dài 245 Kb xác định bởi

Ansari và cộng sự (đường màu xanh) và sau đó giảm xuống 18 Kb bởi

Plaisancie và cộng sự (đường màu đỏ) [47]. Toạ độ gen dựa trên bộ gen tham chiếu phiên bản hg19.

1.2.3. Các đột biến trên PAX6

Dữ liệu đột biến PAX6 trên thư viện LOVD

(http://lsdb.hgu.mrc.ac.uk/home.php?select_db=PAX6) cập nhật đến năm

2018 cho thấy có gần 500 đột biến khác nhau được báo cáo. Trong số đó, 4%

là đột biến mất toàn bộ gen hoặc nằm tại các vùng không mã hoá 5’ hoặc 3’, còn lại 96% là đột biến trong gen. Đối với các đột biến trong gen, khoảng

80% nằm trên các exon, nhưng phần lớn tập trung tại vùng mã hoá PD (exon

5, 6) và HD (exon 9) của protein PAX6. Tỷ lệ các loại đột biến bao gồm: vô

17 nghĩa (39%), dịch khung (27%), sai nghĩa (12%), thay đổi điểm cắt nối

(15%), đột biến chèn hoặc mất đoạn nhỏ (2%), và kéo dài đầu C (2%) (hình

1.4 ) [49, 50].

Hình 1.4: Tần xuất các kiểu đột biến trong cơ sở dữ liệu đột biến

PAX6. (A) Tất cả đột biến được báo cáo trong cơ sở dữ liệu. (B) Tần số đột

biến liên quan tới KMM. (C) Sự phân bố của đột biến PAX6 trong kiểu hình không phải KMM. PCT (mã kết thúc sớm) bao gồm tất cả đột biến được dự

đoán gây ra một mã kết thúc sớm và bao gồm vô nghĩa, dịch khung và điểm

cắt. CTE là các biến dị mà gây ra kéo dài đầu C của PAX6 [26].

1.2.3.1. Đột biến mã kết thúc sớm

Những thay đổi nucleotide tạo ra một mã kết thúc sớm (PTC) là các đột

biến phổ biến nhất được thấy trong PAX6. Đột biến vô nghĩa, dịch khung, và phá vỡ điểm cắt nối dẫn đến chèn một mã kết thúc sớm chiếm 65-70% tổng số

đột biến gen PAX6 (hình 1.4A). Bệnh nhân với đột biến PTC có xu hướng

biểu hiện kiểu hình khuyết mống mắt cổ điển [49].

Đầu tiên người ta nghĩ rằng các đột biến với mã kết thúc sớm sẽ tạo ra các protein bị cắt ngắn và tạo ra một ảnh hưởng âm tính trội. Tuy nhiên, hiện nay người ta chấp nhận rằng các bản phiên mã mRNA chứa mã kết thúc sớm

nằm trước mối nối exon cuối cùng 50 bp có thể bị phân huỷ theo cơ chế Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) [51]. Vì vậy, đối với trường hợp

đột biến PTC dị hợp tử sẽ dẫn đến phân huỷ các bản phiên mã bị đột biến và

mức độ protein giảm 50% [49]. Có 4 đột biến PTC đặc biệt chiếm tới 20% tất

cả các loại trong cơ sở dữ liệu bao gồm: c.607C>T, p.Arg203* (exon 8);

18 c.718C>T, p.Arg240* (exon 9); c.781C>T, p.Arg261* (exon 10), và,

c.949C>T, p.Arg317* (exon 11) [49]. Những đột biến này nằm trong các đảo

CpG được methyl hoá thuộc exon 8-13, và tạo thành điểm nóng đột biến với bệnh khuyết mống mắt.

Vẫn chưa có bằng chứng về cơ chế NMD hoạt động trên các bản phiên

mã của PAX6 chứa đột biến PTC mà nằm cuối đầu 3’ của gen [50]. Một số tác giả cho rằng PTC trong vùng này sẽ thoát khỏi cơ chế NMD và chúng tạo ra

một sản phẩm protein cắt ngắn gây ra ảnh hưởng âm tính trội và kiểu hình

nghiêm trọng hơn [52]. Tuy nhiên, đột biến tạo mã kết thúc sớm trong vùng này rất hiếm khi xảy ra. Thật vậy, không có đột biến vô nghĩa nào trong 50 nucleotide cuối của exon 12 và exon 13 được báo cáo ngoại trừ c.1183G>T

(p.Gly395*). Điểm đột biến này nằm tại vị trí nucleotide cuối cùng của exon

12. Tuy nhiên, người ta cho rằng đột biến gây sai lệch trong cắt nối ARN [53], và tất cả các sản phẩm đều dẫn tới kéo dài dịch mã tới đầu C [50].

1.2.3.2. Biến dị kéo dài đầu C (CTE)

Các đột biến dịch khung hoặc đột biến điểm trong PAX6 dẫn đến thay đổi vị trí mã kết thúc và dịch mã tiếp tục ở vùng 3’UTR chỉ chiếm 2% trên

tổng số các loại đột biến được báo cáo trong cơ sở dữ liệu [26]. Một số nghiên

cứu chỉ ra rằng đột biến CTE có ảnh hưởng nghiêm trọng tương tự như đột biến tạo mã kết thúc sớm [2, 8, 54]. Kết quả từ những nghiên cứu này gợi ý

rằng đột biến CTE cũng tạo ra thiếu hụt sản phẩm gen do đơn bội của PAX6.

Tuy nhiên, NMD không phân huỷ các bản phiên mã này, vì chúng không có

PTC, nghĩa là những thay đổi này nên tạo một protein dài và tương đối bền nhưng sự hoạt hoá vùng PST bị ảnh hưởng. Cơ chế chính xác mà đột biến CTE gây ra thiếu hụt đơn bội vẫn chưa được giải thích.

1.2.3.3. Đột biến sai nghĩa

Đột biến sai nghĩa khiến cho một axít amin bị thay thế bởi một cái khác

trong quá trình dịch mã. Tỷ lệ dạng đột biến này được báo cáo lên tới 12%

trong cơ sở dữ liệu PAX6. Những đột biến sai nghĩa tập trung chủ yếu trong vùng PD. Một số nghiên cứu chức năng đã dự đoán đột biến dạng này gây ra

nhiều bất thường trong quá trình gắn ADN và hoạt động hoạt hoá gen của

19 PAX6 [5]. Đột biến sai nghĩa luôn liên quan đến kiểu hình nhẹ hơn nhưng

không điển hình, trong một số trường hợp không thấy biểu hiện của khiếm

khuyết mống mắt [8]. Thực vậy, Tzoulaki và cộng sự báo cáo rằng các đột biến sai nghĩa trong PAX6 chịu trách nhiệm cho 70% rối loạn di truyền không

bao gồm khuyết mống mắt mà được đăng ký trong cơ sở dữ liệu (hình 1.4C)

[50], như mắt nhỏ, bất thường thần kinh thị giác, coloboma, suy sản hố thị giác, và loạn sản đoạn trước [5, 55 – 57].

1.2.3.4. Các đột biến trong vùng không mã hoá

Ngày càng có nhiều báo cáo đề cập đến các đột biến trong vùng không mã hoá ở bệnh nhân có bất thường mắt và rối loạn phát triển thần kinh [58,

59]. Trong cơ sở dữ liệu đột biến PAX6, xấp xỉ 15% tất cả đột biến nằm trong

vùng không mã hoá và nhìn chung chúng liên quan tới kiểu hình KMM cổ điển. Mặc dù phần lớn nằm tại vị trí cho (donor) và nhận (acceptor) ở ranh

giới intron-exon, các đột biến sâu trong intron gần đây đã được ghi nhận ở

một số nghiên cứu trên số lượng lớn bệnh nhân KMM [47, 53]. Đột biến mất

đoạn hoặc đột biến điểm trong vùng không dịch mã 5’ và 3’UTR của PAX6 cũng đã được báo cáo [17, 47]. Phân tích minigen hoặc phân tích in silico cho

thấy rằng hầu hết các biến dị này có thể ảnh hưởng kiểu cắt bình thường, do

đó dẫn đến hình thành PTC và gây ra sự thiếu hụt PAX6 do đơn bội [60].

Những thay đổi trong vùng điều hoà 3’ của PAX6 cũng được xác định

ở bệnh nhân biểu hiện KMM cổ điển. Bhatia và cộng sự đã chỉ ra đột biến

một nucleotide duy nhất (chr11: 31,685,945G>T) nằm trong vùng tăng cường

SIMO gây ra KMM. Vị trí đột biến này nằm xuôi so với PAX6 và cách nó xấp xỉ 150Kb. Tác giả cho rằng đột biến này làm ảnh hưởng tới vị trí nhận biết PAX6 tạo vùng này, do đó phá vỡ vòng tự điều hoà, và dẫn đến giảm

biểu hiện protein gây ra thiếu hụt do đơn bội [25]. Một vài mất đoạn mà bao gồm vùng điều hoà 3’ khác cũng đã được báo cáo gây ra khuyết mống mắt

(hình 1.3) [9, 45 – 47].

1.2.3.5. Đột biến cấu trúc

Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể (mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn,

hoặc đảo đoạn) bao gồm một phần hoặc toàn bộ gen PAX6 hoặc các thành

20 phần điều hoà chiếm tới 10% tất cả các trường hợp KMM. Một số nghiên cứu

thấy rằng dạng đột biến này phổ biến hơn ở các trường hợp KMM bột phát so

với dạng di truyền theo gia đình, tuy nhiên một số nghiên cứu khác lại không thấy sự khác biệt nào đáng kể [2, 7, 61, 62]. Mất đoạn lớn ở vùng chứa gen

PAX6 và các gen liền kề, như WT1, dẫn đến bệnh hệ thống, như WGAR, đặc

trưng bởi sự có mặt của khối u Wilms, KMM, bất thường sinh dục, chậm phát triển trí tuệ.

1.2.3.6. Đột biến hai alen

Những đột biến mà ảnh hưởng cả hai alen PAX6 hiếm khi được mô tả và gây ra những bất thường mắt và phát triển thần kinh nghiêm trọng, trong

hầu hết các trường hợp dẫn tới chết phôi [6, 63]. Một bệnh nhân với tổ hợp

hai đột biến dị hợp tử khác nhau (compound heterozygous mutations) trên PAX6 đã được mô tả với biểu hiện mắt nhỏ, tiểu đường sơ sinh, suy tuyến

yên, đầu nhỏ, tương tự như thể ba nhiễm 21. Bệnh nhân được di truyền một

đột biến sai nghĩa ảnh hưởng vùng PD từ cha (c.112C>T, p.Arg38Trp), và

một đột biến vô nghĩa trong vùng HD từ mẹ (c.718>T, p.Arg240*). Người cha có giác mạc nhỏ và đục thuỷ tinh thể nghiêm trọng, trong khi đó người

mẹ biểu hiện với KMM cổ điển theo gia đình [64]. Có thể thấy rằng dù bị ảnh

hưởng nhưng sản phẩm protein của biến dị sai nghĩa vẫn giữ một số chức năng PAX6, vì đây là gen rất nhạy với liều lượng. Một bệnh nhân khác với tổ

hợp hai đột biến dị hợp tử (c.607C>T, p.Arg203* và c.1058C>G, p.Ser353*),

có biểu hiện với không có mắt, khiếm khuyết hệ thần kinh trung ương nghiêm

trọng, bao gồm não nhỏ và hoàn toàn không có thể chai và khứu giác, đáng buồn là em bé mất vài ngày sau khi sinh [63].

1.2.4. Các gen khác

Khuyết mống mắt cổ điển hầu như vẫn được coi là một rối loạn di

truyền đơn gen. Hiếm khi nào kiểu hình giống KMM là do các đột biến trong

hai gen gây bệnh rối loạn bán phần trước của mắt. Đã có công bố hai trường

hợp KMM, một với đột biến nội gen PITX2 [65] và một với đột biến trong vùng điều hoà của PITX2 nằm ở đầu mút nhiễm sắc thể [45]. Hơn nữa, có bảy

trường hợp với đột biến gen FOXC1 trong đó ba trường hợp là đột biến sai

21 nghĩa [45] và bốn trường hợp là mất toàn bộ gen [45, 66]. Trong chín trường

hợp KMM này có bảy bệnh nhân với tăng nhãn áp bẩm sinh (một trường hợp

không có thông tin), nhiều bệnh nhân khi sơ sinh biểu hiện với chứng mắt trâu. Điều này cho thấy rằng hiện tượng này phổ biến ở người KMM do

FOXC1 hơn là ở người với đột biến PAX6.

Zhang và cộng sự năm 2015 đã mô tả một đột biến sai nghĩa tách biệt trên gen TRIM44 ở một gia đình có bệnh KMM di truyền [67]. Gen này cũng

nằm trên vùng 11p13 và cách PAX6 4 Mb. Tuy nhiên, một số tác giả cho rằng

nên thận trọng khi mô tả khả năng gây bệnh vì đây là phả hệ duy nhất được hỗ trợ bởi dữ liệu nghiên cứu chức năng in vitro [45].

Vẫn còn một tỷ lệ đáng kể bệnh nhân KMM không chẩn đoán di truyền

được [45]. Năm 2016, Ansari và cộng sự phân tích 42 trường hợp khuyết

mống mắt nhưng âm tính với PAX6 bằng aCGH và chỉ xác định được 15 trường hợp. Do đó, còn 27 trường hợp không tìm được nguyên nhân. Sau đó,

một số tác giả tiếp tục nghiên cứu trên số bệnh nhân này và xác định được các

đột biến trong ITPR1 nên quy về hội chứng Gillespie [22, 23]. Vì vậy, một số

tác giả ước tính rằng sẽ có khoảng 5% bệnh nhân với KMM cổ điển sẽ không tìm được nguyên nhân [68].

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

1.3.1. Chẩn đoán lâm sàng

Thông thường bệnh nhân được chẩn đoán với KMM bởi bác sĩ nhi

khoa khi được cha mẹ cho đi khám vì nghi ngờ có vấn đề về thị lực. Tuy nhiên, chẩn đoán KMM cần được khẳng định lại bởi một bác sĩ chuyên về nhãn khoa. Một số xét nghiệm di truyền phân tử có thể được chỉ định để trợ

giúp bác sĩ nhãn khoa đưa ra chẩn đoán cuối cùng.

Phương pháp đánh giá lâm sàng quan trọng nhất là sử dụng đèn Slit-

lamp để xác định bất thường mống mắt và đồng tử. Những hiện tượng như

đục giác mạc, giãn mạch và đục thuỷ tinh thể hoặc tăng nhãn áp cũng có thể

xuất hiện. Đối với trẻ sơ sinh thì đèn Slit-lamp dạng cầm tay là thích hợp nhất. Sử dụng kỹ thuật soi đáy mắt có thể chứng minh suy sản hố thị giác và bất cứ bất thường thần kinh thị giác nào, nhưng đối với trẻ sơ sinh cần sử

22 dụng máy soi đáy gián tiếp. Trẻ em nhỏ có thể cần được kiểm tra dưới gây

mê. Sử dụng kỹ thuật chụp cắt lớp võng mạc có thể chứng minh tình trạng suy

hố thị giác [69], tuy nhiên việc này khó thực hiện ở những em nhỏ với rung giật nhãn cầu. Đối với trẻ sơ sinh có đục giác mạc hoặc phù giác mạc nghiêm

trọng do tăng nhãn áp bẩm sinh, sử dụng siêu âm tần số cao với phần trước

trước có thể chứng minh suy sản hoặc bất sản mống mắt.

1.3.2. Chẩn đoán di truyền

Việc xem xét tiền sử gia đình ở bệnh nhân nhi đã được chẩn đoán lâm

sàng với KMM là cần thiết. Đối với các bất thường do đột biến PAX6 ở trẻ thì cha/mẹ nên được khám mắt ngay nếu cha/mẹ đã có tiền sử rõ ràng. Nếu bệnh

nhân có cha/mẹ mắc bệnh tương tự khả năng có đột biến mất gen WT1 là

thấp, tuy vậy đã có một số trường hợp hiếm được báo cáo [2, 70].

Đánh giá trạng thái phân tử PAX6

Mặc dù đột biến trong gen gặp phổ biến hơn ở bệnh nhân KMM so với

đột biến mất đoạn, việc phân tích mất đoạn được khuyến cáo đầu tiên bởi vì

tầm quan trọng của việc xác định mất đoạn WAGR trong lâm sàng. Phương pháp aCGH độ phân giải cao dùng cho kiểm tra vi mất đoạn chỉ yêu cầu một

lượng nhỏ mẫu ADN giúp làm tăng hiệu quả và giảm chi phí của xét nghiệm.

Những bệnh nhân không tìm ra được vi mất đoạn bằng các kỹ thuật như aCGH sẽ được kiểm tra các đột biến trong gen nhờ kỹ thuật giải trình tự (bao

gồm cả công nghệ giải trình tự Sanger hoặc thế hệ mới) (hình 1.5). Tuy nhiên,

phương pháp aCGH không phát hiện được những bất thường cấu trúc nhiễm

sắc thể mà không dẫn tới thay đổi số lượng bản sao. Một số phòng thí nghiệm vẫn dùng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) để xác định đột biến cấu trúc NST mà phá vỡ chức năng PAX6 (không thay đổi bản sao) [2, 7].

Tuy nhiên, hiện nay công nghệ giải trình tự toàn bộ hệ gen có thể thay thế FISH cho xác định bất thường cấu trúc dạng cân bằng [71]. Bên cạnh đó sử

dụng phương pháp MLPA có thể xác định mất đoạn tại các vùng đích [12].

Người ta cũng đã phát hiện ra mất đoạn hoặc lặp đoạn trên vùng 11p13 ở một

gia đình mà có cha mẹ chuyển đoạn cân bằng [72].

Những trường hợp không có đột biến mất đoạn gen được phát hiện, nên

thực hiện phân tích đột biến trong gen PAX6. Việc này có thể được yêu cầu

bởi cha mẹ hoặc chính bệnh nhân sau khi đã được bác sĩ tư vấn về ý nghĩa của xét nghiệm di truyền. Các đột biến điểm trong gen được xác định bởi giải

trình tự trực tiếp exon và các vùng nối exon-intron. Một số mất đoạn nhỏ

trong gen cũng có thể xác định được bởi aCGH hoặc MLPA [12].

Chiến lược xét nghiệm di truyền được các chuyên gia đề xuất như sau

(Hình 1.5):

• Sử dụng aCGH độ phân giải cao để kiểm tra vi mất đoạn đối với các

trường hợp KMM được chẩn đoán mới.

• Nếu phát hiện đột biến mất đoạn, xác định mức độ chính xác.

• Kiểm tra mất đoạn của PAX6 và WT1 để xác nhận chẩn đoán hội

chứng WAGR.

• Nếu không phát hiện mất đoạn, sử dụng kỹ thuật giải trình tự để sàng

lọc đột biến trong vùng mã hoá PAX6.

• Nếu có họ hàng bị bệnh, kiểm tra xác định xem họ có mang cùng đột

biến với bệnh nhân

• Nếu gia đình không có tiền sử, kiểm tra ADN cha mẹ để xác định liệu có phải đây là đột biến phát sinh mới hay không. Kiểm tra tình trạng

khảm ở cha mẹ để dự đoán khả năng tái xuất hiện trong những đứa trẻ

tiếp theo của họ.

Khi xác định được đột biến trên PAX6 gây bệnh sẽ giúp xác nhận chẩn

đoán KMM đơn. Những cá thể mà âm tính trong những xét nghiệm này có thể có đột biến sâu trong vùng intron hoặc các thành phần vùng điều hoà. Ngoài ra, bệnh nhân có thể có các đột biến trong FOXC1, PITX2 hoặc PITX3 (hoặc

các gen tiềm năng khác, vẫn chưa được xác định), gây ra kiểu hình tương

đồng với KMM (Hình 1.5) [65, 73, 74].

Hình 1.5: Chiến lược xét nghiệm di truyền đối với những bệnh nhân

khuyết mống mắt. Phân tích đột biến cấu trúc bằng công nghệ aCGH với độ

phân giải cao sẽ được sử dụng đầu tiên cho tất cả các bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng với KMM. Sau đó tuỳ thuộc vào kết quả của xét nghiệm này

mà cần sử dụng thêm các xét nghiệm bổ trợ khác nhằm chẩn đoán chính xác

nguyên nhân gây bệnh [3].

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT

Có khá nhiều nghiên cứu về KMM bẩm sinh trên thế giới được công bố trong những năm gần đây. Bốn hướng tiếp cận chính của các nghiên cứu KMM bao gồm: 1) xác định đột biến di truyền gây bệnh và bổ sung vào cơ sở dữ liệu; 2) tìm hiểu cơ chế gây bệnh của các dạng đột biến; 3) tìm hiểu về mối

tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình ở người mắc bệnh; và 4) nghiên cứu về liệu pháp điều trị đối với những bệnh nhân mắc KMM bẩm sinh.

Phần lớn các nghiên cứu xác định đột biến di truyền gây bệnh KMM sử

dụng hai phương pháp chính là giải trình tự Sanger và MLPA. Sự kết hợp của hai kỹ thuật này nhằm tìm kiếm đột biến trong gen PAX6 và mất đoạn vùng

25 11p13 để sàng lọc hội chứng WAGR [11]. Ngoài ra, một số nghiên cứu sử

dụng kỹ thuật aCGH với độ phân giải cao và thiết kế riêng để sàng lọc locus

11p13 nhằm nâng cao hiệu quả tìm kiếm đột biến [9]. Hơn nữa, sử dụng droplet PCR các nhà khoa học còn phát hiện được tình trạng khảm đột biến

PAX6 (đột biến phát sinh sau giai đoạn hợp tử) [75]. Sử dụng real time PCR

nhiều tác giả đã chỉ ra nồng độ mRNA ở những bệnh nhân chứa đột biến mã kết thúc sớm có nồng độ bằng một nửa so với mẫu đối chứng. Từ kết quả này

các tác giả cho rằng nguyên nhân gây bệnh đối với trường hợp đột biến tạo

PCT là do mRNA bị phân huỷ theo cơ chế NMD [76]. Một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra cơ chế tương tự gây ra sự thiếu hụt protein PAX6 ở những bệnh nhân có đột biến điểm cắt. Điều này nghĩa là một số đột biến điểm cắt

sau đó tạo ra mã kết thúc sớm và do đó mARN bị phân huỷ khiến lượng

protein được sản xuất không đủ [60]. Ngoài ra, một số công cụ tin sinh học cũng được sử dụng trong nghiên cứu để dự đoán chức năng protein được sinh

ra từ các gen lỗi nhằm tìm kiếm cơ chế gây bệnh KMM [77].

Hướng nghiên cứu đánh giá mối tương quan kiểu đột biến và sự biểu

hiện bệnh cũng được một số tác giả trên thế giới quan tâm. Pedersen và cộng sự năm 2020 đã báo cáo nếu bệnh nhân có đột biến trong vùng mã hoá của

gen PAX6 sẽ gây ra lớp bên ngoài võng mạc mỏng hơn so với đột biến vùng

không mã hoá [78]. Ngược lại, cũng có nghiên cứu chưa phát hiện được bất cứ mối tương quan giữa kiểu đột biến và kiểu hình ở bệnh nhân mắt tật

khuyết mống mắt [61].

Điều trị và chăm sóc đối với những bệnh nhân mắc chứng bệnh di

truyền nói chung và tật khuyết mống mắt nói riêng được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Đã có nghiên cứu nhằm tìm ra hướng điều trị cho bệnh nhân

KMM mang đột biến vô nghĩa trên PAX6. Trong một thử nghiệm in vitro Liu

và cộng sự có thể tăng việc sản xuất protein ở dòng tế bào bạch cầu từ người bệnh có đột biến PCT trên PAX6 lên tới 30-40% [79]. Hơn nữa, mô hình tế

bào giác mạc mắc bệnh do khuyết mống mắt cũng đã được tạo ra bởi công

nghệ CRISPR/Cas 9, đồng thời tác giả đã sử dụng protein PAX6 tái tổ hợp để

chữa trị và kết quả thể hiện khá khả quan [80]. Tuy nhiên, vẫn cần nhiều

26 nghiên cứu cận lâm sàng và lâm sàng để có đủ bằng chứng cho việc ứng dụng

những phương pháp điều trị này đối với bệnh nhân KMM.

Cho đến nay, ở Việt Nam có ba báo cáo nghiên cứu đề cập tới các trường hợp dị tật KMM. Trong đó, tác giả Phạm Thị Chi Lan là người đầu

tiên báo cáo về 30 trường hợp bệnh nhân KMM tại Hội nghị nhã khoa toàn

quốc năm 2008. Tuy nhiên, đây chỉ là một báo cáo nhận xét về bệnh này theo hồ sơ bệnh án của bệnh nhân tại Bệnh viện Mắt TP. Hồ Chí Minh từ năm

2000 tới 2007 [81]. TS. Lê Đỗ Thuỳ Lan tại Đại học Y khoa Phạm Ngọc

Thạch là tác giả thứ hai có đề cập tới dị tật KMM trong nghiên cứu của cô năm 2010. Trong nghiên cứu này bác sĩ Lan tính toán tỷ lệ của những kiểu dị tật mắt bẩm sinh chứ không thực hiện phân tích di truyền phân tử của bệnh

[82]. Báo cáo thứ ba về KMM do TS. Vũ Thị Bích Thuỷ và cộng sự tại Bệnh

viện Mắt trung ương đăng trên tạp chí Nhãn khoa Việt Nam năm 2010. Bệnh nhân nhập viện do tình trạng tăng nhãn áp nặng (Glôcôm), sau đó được chẩn

đoán KMM bẩm sinh [83]. Tuy nhiên, giống như hai công trình ở trên nghiên

cứu này cũng không thực hiện chẩn đoán phân tử để tìm đột biến gây ra tình

trạng KMM ở bệnh nhân.

27 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu là mười bốn bệnh nhân đã được chẩn đoán KMM trên lâm sàng từ năm 2019 – 2020 tại các bệnh viện chuyên khoa trên

địa bàn thành phố Hà Nội. Chẩn đoán KMM được thực hiện bởi bác sĩ chuyên

nhãn khoa dựa trên thăm khám lâm sàng. Độ tuổi chẩn đoán từ 1 tới 27 tuổi.

Đối với các bệnh nhi việc tham gia nghiên cứu được sự đồng ý của cha mẹ. Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và những người thân trong gia đình được

thu và bảo - 20°C cho đến khi tách chiết ADN. Nghiên cứu này được chấp

thuận bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y Sinh học (Institutional Review Board-IRB) của Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu phù hợp với các quy định của

tuyên bố Helsinki và Hiệp hội nghiên cứu về thị lực và nhãn khoa (Research

in Vision and Ophthalmology ARVO) trên đối tượng con người.

2.1.2. Hoá chất và thiết bị

Máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này thuộc Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Một số thiết bị

được sử dụng chính yếu trong nghiên cứu bao gồm: Máy ly tâm Eppendorf

(Đức) và máy ly tâm lạnh đa năng 5810R* (Đức); Máy PCR Mastercycler pro

S (Đức); Máy soi gel và chụp ảnh tự động DigiDoc-It® Imaging System của (UV- Vis Ultra-violet production (Mỹ); Máy đo 24 quang phổ

BioSpectrometer Basic, Đức); Máy giải trình tự gen ABI 3500 Genetic Analyzer của hãng Applied Biosciences (Mỹ).

• Tách chiết ADN: Sử dụng bộ kít tách chiết ADN từ máu ngoại vi E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit của hãng OMEGA Bio-tek,

Mỹ.

• Điện di: Gel agarose của Affymetrix, Cleveland, Mỹ; Dung dịch

TAE 1X; Loading Buffer 6X; Ethidium bromide.

• Hoá chất PCR: Taq 2X Master Mix của New England Biolab, Mỹ; dNTPs, nước 3D (deionized double distilled (3D) water) và

DMSO từ hãng bioWORLD, Mỹ; Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này được tổng hợp và cung cấp bởi công ty Sinh hoá

Phù Sa, Cần Thơ, Việt Nam.

• Hoá chất tinh sạch sản phẩm sau PCR: Sử dụng kit Gen JETTM

PCR purification của Thermo Scientific, Mỹ.

• Hoá chất giải trình tự: Ethanol của Merk, Mỹ; Kit giải trình tự

Big Dye Terminator v3.1 của Applied Biosciences.

• Hoá chất phản ứng MLPA: Bộ kit SALSA MLPA Probemix

P219 PAX6 (MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan).

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:

• Thu 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân vào ống chống đông chứa

EDTA (K2-K3)

Bước 1

• Tách chiết ADN tổng số bằng kít E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit • Xác định nồng độ ADN sau tách chiết bằng máy Qubit Fluorometer

Bước 2

• Thực hiện phân tích mất đoạn theo phương pháp MLPA sử dụng kít

SALSA MLPA Probemix P219 PAX6

Bước 3

• PCR các vùng exon, vùng nối intron exon, và vùng promoter • Giải trình tự gen

Bước 4

• Phân tích kết quả

Bước 5

Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu.

2.2.1. Thu mẫu

Thu 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân vào ống chứa chất chống đông EDTA với hàm lượng 1,5 mg/mL. Việc lấy máu cần đảm bảo vô trùng và bảo

quản ở -20°C cho đến khi tách chiết ADN.

2.2.2. Tách chiết và đánh giá chất lượng ADN

Sử dụng bộ kít E.Z.N.A Blood DNA mini (Omega) để tách chiết ADN

tổng số từ mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân. Tiến hành đo nồng độ của sản

phẩm ADN sau khi tách chiết bằng máy Qubit Flourometer sử dụng bộ kít và hướng dẫn sử dụng của hãng. Trong phương pháp này, hỗn hợp hoá chất

Qubit dye được trộn đều với dung dịch ADN tổng số và sau đó đo tín hiệu

huỳnh quang mẫu sau pha trộn. Cường độ tín hiệu huỳnh quang nhận được sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ ADN gắn với Qubit dye. Từ đó, máy sẽ tính ra nồng

độ ADN trong mẫu sau tách chiết dựa vào so sánh với đường chuẩn được

thiết lập dựa trên hai mẫu ADN có nồng độ chuẩn được cung cấp cùng với bộ

kít.

Ngoài ra, chất lượng ADN sau tách chiết còn được kiểm tra bằng

phương pháp điện di trên gel agarose 0.8%. Bản gel sau điện di được nhuộm

với dung dịch ethidium bromide và kết quả được đánh giá dưới đèn UV.

2.2.3. Xác định các đột biến cấu trúc bằng MLPA

Bộ kít SALSA MLPA Probemix P219-B4 PAX6 bao gồm 44 đầu dò

MLPA và khuếch đại các sản phẩm có kích thước từ 130 tới 463 nucleotide. Trong đó có 32 đầu dò cho vùng 11p13-14 bao gồm: 7 đầu dò xuôi dòng gen

PAX6, 13 đầu dò trên PAX6 (ít nhất mỗi đầu dò cho một exon trừ exon 11), 6 đầu dò nằm giữa gen PAX6 và WT1, 3 đầu dò nằm trên WT1, 3 đầu dò ngược dòng WT1. Ngoài ra, trong bộ kít còn có thêm 3 đầu dò nhắm đến vùng exon 1 của gen SOX2 và 9 đầu dò tham khảo nằm trên nhiễm sắc thể thường.

* Thực hiện phản ứng MLPA

Mẫu ADN được yêu cầu cho phản ứng MLPA là 5μl với nồng độ

10ng/μl trong đệm TE. Các bước tiến hành thí nghiệm như sau:

• Bước 1: Biến tính ADN

Lấy 5μl ADN tổng số (50ng) cho vào ống PCR 0.2ml. Biến tính ADN sử dụng máy gia nhiệt PCR trong 5 phút ở 98oC, sau đó làm lạnh mẫu xuống 25oC và lấy mẫu ra khỏi máy.

• Bước 2: Phản ứng lai - Trộn đều dung dịch đệm MLPA buffer và MLPA probemic trước khi sử

dụng bằng máy vortex sau đó quay ly tâm nhẹ các ống mẫu.

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng lai (hybridization mastermix): Hỗn hợp phản ứng lai bao gồm MLPA buffer và MLPA probemic pha theo tỷ lệ

1:1 ([1.5 μl MLPA buffer + 1.5 μl probemix]/trên 1 phản ứng). Trộn đều hỗn hợp bằng pipetting hoặc vortex.

- Bổ sung 3 μl hỗn hợp phản ứng lai vào mỗi mẫu ADN đã được biến tính

trước đó, trộn đều pipetting.

- Tiến hành lai: ủ hỗn hợp phản ứng 95oC trong 1 phút, sau đó giữ mẫu ở

60oC trong 16-20 giờ.

• Bước 3: Phản ứng gắn kết - Vortex đều 2 lọ dung dịch ligase buffer - Chuẩn bị hỗn hợp Ligase 65: Công thức: [25 μl DDW + 3 μl Ligase Buffer A + 3 μl Ligase Buffer B]/1 phản ứng. Sau đó thêm 1 μl enzyme

Ligase 65 và trộn đều hỗn hợp bằng pipetting (không vortex).

- Tiến hành hạ nhiệt độ ủ mẫu từ 60oC xuống 54oC và duy trì ở nhiệt độ

này.

- Khi mẫu đang ở 54oC trong máy PCR, thêm 32 μl hỗn hợp ligase 65 vào

mỗi ống mẫu, trộn đều bằng pipetting.

- Thực hiện gắn kết: Tiếp tục ủ mẫu 15 phút ở 54oC (gắn kết hai phần của đầu dò), sau đó nâng lên 98oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme ligase 65. Hạ nhiệt độ xuống 20oC và có thể lấy mẫu ra khỏi máy PCR.

• Bước 4: Phản ứng PCR

- Trộn đều lọ Salsa PCR primer mix bằng vortex. Làm ấm Polymerase trong tay 10 giây để giảm độ nhớt.

- Chuẩn bị hỗn hợp enzyme polymerase:

31 - Công thức: [7.5 μl DDW + 2 μl Salsa PCR primer + 0.5 μl Salsa polymerase]/ 1 phản ứng. Trộn đều hỗn hợp này bằng pipetting và giữ

trên khay đá lạnh.

- Khi các ống mẫu ở nhiệt độ phòng, thêm 10 μl hỗn hợp chứa

polymerase vào mỗi ống mẫu. Trộn đều bằng pipetting.

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: Tiến hành 35 chu kỳ khuếch đại (95oC: 30 giây, 60oC: 30 giây, 72oC: 60 giây); 72oC: 10 phút; 15oC: dừng. Sản phẩm PCR có thể được lưu trữ ở 4oC trong vòng 1 tuần, hoặc lưu trữ lâu dài ở - 25oC với điều kiện tránh ánh sáng.

• Bước 5: Phân tích đoạn bằng điện di mao - Sử dụng 0.7 μl sản phẩm PCR cho điện di mao quản nhằm phân tích các

đoạn ADN đã được khuếch đại sau phản ứng.

- Chuẩn bị hỗn hợp: - Công thức: [0.7 μl sản phẩm PCR + 0.2 μl sản phẩm PCR LIZ (GS500) + 9 μl HiDi formamide]. Đĩa chứa hỗn hợp sau pha trộn được làm ấm lên tới 86oC và duy trì trong 3 phút, sau đó làm lạnh xuống 40oC trong 2 phút. Lúc này, hỗn hợp đã sẵn sàng cho điện di mao quản.

- Cài đặt các thông số cho điện di mao quản như sau:

Bảng 2.1: Thông số cài đặt máy điện di mao quản để chạy phân tích MLPA

Thiết bị Mao quản Thông số chạy điện di

ABI-3500 Tám mao quản 50 Chương trình chạy: Phân tích đoạn

cm Hiệu điện thế tra mẫu: 1.6kV

Thời gian tra mẫu: 15 giây

Hiệu điện thế chạy: 15kV

Thời gian chạy: 1800 giây

Nhiệt độ chạy: 60oC

Hoá chất: POP 7

Sử dụng phần mềm Coffalyzer để phân tích kết quả sau khi chạy điện

di trên máy ABI 3500. Tín hiệu huỳnh quang được xác định bởi máy điện di

mao quản không được sử dụng trực tiếp để tính toán số lượng bản sao, do tín hiệu này còn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau. Đầu tiên, cường

độ tín hiệu huỳnh quang của mỗi đầu dò sẽ được chuẩn hoá trong mỗi mẫu.

Sau đó, so sánh tín hiệu từ các mẫu khác nhau nhằm xác định mẫu nào có bản sao thay đổi bất thường. Những mẫu không có sự thay đổi nào về số lượng

bản sao PAX6 sẽ cho hình ảnh đỉnh các tín hiệu của đầu dò giống với hình ảnh

kết quả của mẫu đối chứng khoẻ mạnh. Tỉ lệ của tín hiệu các đầu dò sau bước chuẩn hóa thứ 2 sẽ là ~ 1. Đối với trường hợp mất đoạn dị hợp tử, tỉ lệ này ~ 0.5. Tỷ lệ cuối cùng được gọi là Dosage Quotient (DQ). Phần mềm

Coffalyzer.net sẽ tính toán DQ cho từng đầu dò và đưa ra kết quả cuối cùng.

2.2.4. Giải trình tự gen Sanger

2.2.4.1. Thiết kế mồi và PCR

Các cặp mồi nhân gen được thiết kế dựa trên trình tự nhân chuẩn của PAX6 mang mã số truy cập (accession number) NG_008679.1 trong ngân

hàng GenBank. Các cặp mồi này cho phép khuếch đại được toàn bộ 13 exon

và 50-100bp thuộc hai intron liền kề.

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho khuếch đại vùng giáp ranh exon-intron và toàn bộ các exon của gen PAX6

Locus

Tên mồi

Trình tự (5’

3’)

Kích thước

PAX6_ex1F GGAGAGGGAGCATCCAATC

E1 – E2

651 PAX6_ex2R AGGGGGAGACCTGTCTGAAT

PAX6_ex3F CCTGAGAGTGAGGCTCAGAGA

E3

293 PAX6_ex3R AGTAGAAGCGATGCCCCAAT

PAX6_ex4F CAAGCCCCAAAGGGTAGATT

E4

451 PAX6_ex4R ATCGAGAAGAGCCAAGCAAA

E5

PAX6_ex5F

TGAGGATGCATTGTGGTTGT

484 PAX6_ex5R AAGGATGGTGGAAGGAGAGG

PAX6_ex6F

TGCAGATGCAAAAGTCCAAG

E6

486 PAX6_ex6R CCCCAGGTACAAAGGAGACA

PAX6_ex7F ACCAAGCAATGGTGAAGGAC

E7

492 PAX6_ex7R AGCCCTGAGAGGAAATGGTT

PAX6_ex8F ACCTTGGGAATGTTTTGGTG

E8

437 PAX6_ex8R CTGAAAAGATGCCCAGAGAAA

PAX6_ex9F AGGTGGGAACCAGTTTGATG

E9 – E11

862 AX6_ex11R TCTCAAGGGTGCAGACACAG

AX6_ex12F

TAGCTCGAGGCCCAATCTTA

E12 – E13

1302

PAX6_ex13R GTTAAACACGCCCTCCCATA

Phản ứng PCR được thực hiện trong một hỗn hợp có thể tích 25 µl bao

gồm 20 ng ADN hệ gen, 10 pmol mồi mỗi loại, và 12.5 µl Taq 2X Master

Mix (New England Biolab, Ipswich, MA).

Quá trình khuếch đại các đoạn trình tự đích được thực hiện theo các

điều kiện sau đây: đầu tiên mẫu được biến tính ở 95°C trong 2 phút, tiếp theo

là 35 chu kỳ khuếch đại sản phẩm bao gồm: biến tính ở 95°C trong 30 giây; bước gắn mồi trong 30 giây (nhiệt độ được cài đặt thích hợp cho từng cặp mồi

cụ thể); Kéo dài chuỗi ở 68°C trong 30 giây đến 1 phút và bước cuối cùng ở

68°C trong 5 phút.

34 Bảng 2.3: Thành phần PCR khuếch đại gen PAX6.

Thành phần Thể tích (μL)

Taq 2X Master Mix 12.5

Mồi xuôi (10pmol/µl) 1

Mồi ngược (10pmol/µl) 1

ADN (20 ng/µl) 1

Nước cất 9.5

Tổng 25

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1.2

% sau đó nhuộm với ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng UV.

Tinh sạch sản phẩm PCR

• Sử dụng bộ kít Gen JETTM PCR purification của hãng Thermo

Scientific để tinh sạch sản phẩm PCR.

• Bổ sung Binding Buffer vào các ống eppendorf có chứa mẫu với tỷ lệ thể tích là 1:1. Chú ý: Kiểm tra màu sắc của dung dịch. Màu vàng là chỉ

thị cho pH tối ưu cho gắn kết ADN. Nếu dung dịch có màu da cam hoặc tím thì bổ sung 10μL sodium acetate 3M, pH 5.2 và trộn đều.

• Chuyển hỗn hợp sang cột tinh sạch. Ly tâm 14000 vòng trên phút trong

1 phút ở 25°C. Sau đó loại bỏ dịch.

• Bổ sung 700μL Wash Buffer vào cột tinh sạch. Ly tâm 14000 vòng trên

phút trong 1 phút ở 25°C. Sau đó loại bỏ dịch.

• Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1.5mL.

• Bổ sung 35μL Elution Buffer vào ch nh giữa cột tinh sạch. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 14000 vòng trên phút trong 1 phút ở 25°C.

• Loại bỏ cột tinh sạch. Thu sản phẩm

• Bảo quản ở -20°C.

• Sản phẩm sau tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di

truyền agarose.

2.2.4.2. Giải trình tự gen

• PCR cho giải trình tự

Sản phẩm ADN sau tinh sạch sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khi giải trình tự sử dụng bộ kít BigDye Terminator V3.1. Mỗi phản ứng

PCR này bao gồm: 1 µl BigDye sequencing Buffer 5X, 1 µl mồi xuôi hoặc

mồi ngược 1.6 pmol/µl, 1 µl Big Dye, 2 µl ADN đã được tinh sạch, 5.5 µl

nước khử ion vô trùng. PCR cho giải trình tự gen được tiến hành trên máy luân nhiệt (MJ Research) với chu trình như sau: biến tính ban đầu ở 96°C

trong vòng 1 phút, tiếp theo là 25 chu kỳ của sự biến tính ở 96°C trong 10

giây; 50°C trong 5 giây; 60°C trong 4 phút. Giảm nhiệt nhanh đến 4°C và giữ cho đến khi sử dụng.

• Tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự

Bổ sung 3µl EDTA và 60µl cồn tuyệt đối vào sản phẩm PCR, tiếp theo

tiến hành ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút ở 4ºC và sau đó ADN kết tủa được làm khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.

• Biến tính mẫu

Bổ sung 10 μL Hi-Di vào trong mẫu và trộn đều. Tiếp theo mẫu được

biến tính bằng máy PCR ở 95°C trong 2 phút trước khi làm lạnh nhanh bằng đá.

• Mẫu đã sẵn sàng cho giải trình tự

Chạy điện di mao quản trên máy giải trình tự gen ABI 3500 Gentic Analyzer. Các nucleotid trên đoạn gen sẽ được biểu hiện bằng các đỉnh (peak)

với 4 màu tương đương với 4 loại nucleotid A, T, G, C.

2.2.4.3. Phân tích kết quả tìm đột biến sau giải trình tự

So sánh trình tự gen của bệnh nhân với trình tự tham khảo của gen

PAX6 trên thư viện GenBank bằng phần mềm BioEdit nhằm xác định các đột biến. Kết hợp với thông tin những đột biến PAX6 đã được đăng ký trên cơ sở

36 dữ liệu LOVD (http://lsdb.hgu.mrc.ac.uk/home.php?select_db=PAX6) để xác

định vai trò của các đột biến với quá trình hình thành và phát triển của

bệnh. Phân tích kết quả tìm đột biến sau giải trình tự.

37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT QUẢ

3.1.1. Kết quả thu thập mẫu nghiên cứu

Tổng số có 14 bệnh nhân mắc KMM đã được chẩn đoán trên lâm sàng

bởi bác sĩ chuyên ngành nhãn khoa tham gia vào nghiên cứu này. Số lượng

bệnh nhân nam và nữ là không khác biệt trong nghiên cứu này (7/7). Thông

tin về các đặc điểm lâm sàng và nhân chủng học của các bệnh nhân trong nghiên cứu này được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3.1: Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân KMM

Mã bệnh nhân

Năm sinh

Giới tính

Tăng nhãn áp

Tổn thương giác mạc

Thị lực (RE & LE)

Rung giật nhãn cầu

Thiểu sản hoàng điểm

Đục thủy tinh thể

Tiền sử gia đình

TMM1

2015

Nam

Không Không Không

Có

RE: có LE: Rõ

TMM2

2016

Nữ

Không Không Không Không

Không

TMM3

2015

Nữ

Có

Không Không

Không

TMM4

2018

Nam

Không Không Không Không

Không

TMM5

2019

Nữ

Có

Không Không

Không

TMM7*

2012

Nam

Không Không Không Không

Không

TMM8*

2012

Nam

Không Không Không Không

Không

Anh em sinh đôi

TMM9

2016

Nam

Không Không Không

Không

Có

TMM10

2016

Nữ

Có

Không

Có

Không

Có

RE: PL (-) LE: 20/100 NO CO.OP RE: 20/100 LE:20/100 NO CO.OP NO CO.OP RE: 20/200 LE:20/30 RE: 20/30 LE:20/200 NO CO.OP NO CO.OP

TMM11

1993

Nữ

Có

Không Không Không

Không

RE: 20/200 LE: 20/400

Đại gia đình

TMM12

2020

Nam

Không

Có

Đục GM Mẹ

Có

Không Không

Không

TMM13

2019

Nữ

Có

Không Không

Không

Bố

TMM15

2016

Nữ

Có

NO CO.OP NO CO.OP NO CO.OP

1991

Nam

Có

Không Không

Không

Có

NO CO.OP

TMM14 (Bố của TMM15)

GM: Giác mạc; RE: Mắt phải; LE: Mắt trái; NO CO.OP: Không hợp tác để đo thị lực; *: Anh em ruột.

3.1.2. Tách chiết ADN tổng số

Tất cả các mẫu ADN tổng số sau khi tách chiết sẽ được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose với nồng độ 0.8%. Phân tử

ADN sau tách chiết thường có kích thước và trọng lượng lớn nên sẽ di chuyển

chậm khi tiến hành điện di. Do đó, sau điện di các phân tử ADN trong mẫu sẽ chiếm vị trí cao trên bản gel. Băng ADN sẽ được hiển thị bằng phương pháp

nhuộm EtBr. Phân tử EtBr sẽ bám vào khe giữa mạch đôi ADN trong quá

trình nhuộm. Hơn nữa, phân tử này có khả năng phát sáng dưới tia tử ngoại, do đó ta có thể phát hiện được các băng ADN khi để bản gel dưới đèn UV.

Hình 3.1: Điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 0.8%.

Kết quả điện di được thể hiện ở ảnh bên trên cho thấy hầu hết các dải băng đều sắc nét và vùng sáng tập trung chủ yếu ở vùng 20 kb. Điều này có

nghĩa rằng sản phẩm ADN tổng số sau tách chiết không bị đứt gãy nhiều, có

độ tinh khiết cao nhằm đảm bảo cho các bước thí nghiệm tiếp theo.

Ngoài kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di, chúng tôi còn thực hiện đo nồng độ ADN tổng số sau tách chiết. Sử dụng máy Qubit

Fluorometer và bộ kít theo hướng dẫn sử dụng của hãng nồng độ ADN trong

các mẫu được xác định nằm trong khoảng 20.8 – 63.7 ng/ml. Các thông số đo chi tiết cho mỗi mẫu được thể hiện trong bảng sau.

39 Bảng 3.2: Nồng độ ADN tổng số được xác định bằng kit Qubit® dsDNA BR

STT Mã Mẫu

Nồng độ ADN (ng/µl) 63.7 1 TMM.001

2 TMM.002 32.1

3 TMM.003 33.6

4 TMM.004 32.5

5 TMM.005 20.8

6 TMM.007 38.8

7 TMM.008 35.9

8 TMM.009 34.3

9 TMM.010 35.7

10 TMM.011 28.2

11 TMM.012 55.9

12 TMM.013 35.1

13 TMM.014 44.3

14 TMM.015 33.9

3.1.3. Phân tích đột biến cấu trúc bằng MLPA

Kỹ thuật MLPA được áp dụng cho toàn bộ 14 mẫu bệnh nhân tham gia

vào nghiên cứu nhằm phát hiện đột biến cấu trúc của vùng 11p13-14. Sử dụng kỹ thuật điện di mao quản để phân tích sản phẩm sau phản ứng MLPA. Do đó, kết quả phân tích được thể hiện dưới dạng bảng số liệu và điện di đồ

(electropherogram). Mỗi sản phẩm khuếch đại của một đầu dò được thể hiện

bằng một đỉnh tín hiệu (peak). Phần mềm trên máy phân tích sẽ tính ra kích thước của các băng được khuếch đại bằng cách so sánh các đỉnh tín hiệu trong

mẫu bệnh phẩm và và tín hiệu khi chạy thang kích thước chuẩn (LIZ-GS

500). Hơn nữa, kết quả chạy mẫu bệnh phẩm cũng được so sánh với mẫu đối

chứng người khoẻ mạnh, từ đó tính ra tỷ lệ DQ (Dosage quotients). Chiều cao mỗi băng tín hiệu thay đổi cho thấy sự thay đổi bản sao ADN có trình tự bổ

40 sung với đầu dò tương ứng. Bảng 3.3 trình bày các thông số về mối tương

quan giữa số bản sao ADN và sự phân bố của giá trị DQ do nhà sản xuất đưa

ra (số bản sao là 2 được coi là bình thường). Ngoài ra, kết quả của phân tích được coi là đáng tin cậy khi độ lệch chuẩn (standard deviation) của mỗi đầu

dò trong mẫu đối chứng nhỏ hơn 10%. Nếu tín hiệu từ các đầu dò trong các

exon liền kề cùng tăng hoặc cùng giảm là thể hiện mất/hoặc lặp nhiều đoạn exon liền kề nhau. Ngược lại, kết quả được cho là không đáng tin cậy khi các

đầu dò bổ sung với exon không liền kề cho tín hiệu cùng tăng hoặc giảm.

Hoặc các đầu dò chuẩn (reference probes) trong cùng một mẫu cho ra số lượng bản sao bất thường.

Bảng 3.3: Bảng mối liên hệ giữa giá trị DQ và số lượng bản sao

Phân bố giá trị DQ Số bản sao

DQ = 0 0 bản sao (mất đoạn đồng hợp tử)

0.4 < DQ < 0.65 2 => 1 bản sao (mất đoạn dị hợp tử)

0.8 < DQ < 1.2 2 bản sao – Bình thường

1.3 < DQ < 1.65 2 => 3 bản sao (lặp đoạn dị hợp tử

1.75 < DQ < 2.15 2 => 4 bản sao

Phân tích MLPA đối với mẫu của 14 bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu đều cho kết quả rõ ràng. Có 12 trên 14 bệnh nhân âm tính với xét nghiệm

MLPA. Điều này có nghĩa rằng không có bất cứ mất đoạn nào trên vùng gen

được sàng lọc (vùng 11p13 bao gồm: PAX6, WT1, ELP4…). Kết quả MLPA điển hình của mẫu âm tính được trình bày trong hình 3.2 bên dưới.

(A) (B)

Hình 3.2: Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM4. Đây là kết

quả một mẫu điển hình âm tính với MLPA. A) Hình ảnh kết quả phân tích

đoạn trên máy điện di mao quản. Tất cả các các lô-cút được thiết kế đều được khuếch đại thành công và cho tín hiệu rõ ràng trên biểu đồ. Hình A phía dưới

là biểu đồ trực quan thể hiện số lượng bản sao của mỗi lô-cút. Tất cả các vùng gen được phân tích đều có đầy đủ hai bản sao, không có mất đoạn và lặp đoạn xảy ra. B) Bảng kết quả thông số chi tiết quá trình phân tích mẫu.

Trị số DQ được phần mềm COFFALYSER tính toán dựa trên sự so sánh tỷ lệ

tín hiệu với mẫu tham khảo. Giá trị DQ nằm hoàn toàn trong khoảng 0.8 tới

1.2 (khung màu đỏ). Điều này có nghĩa rằng không có hiện tượng thay đổi số lượng bản sao vùng ADN được kiểm tra.

Kết quả phân tích MLPA cho thấy mẫu TMM2 bị mất ba locus nằm

trên hai gen DCDC1 và ELP4 và mẫu TMM12 bị mất toàn bộ gen PAX6, tất

cả đều mất ở dạng dị hợp tử (mất 1 allele). Bảng số liệu tỉ lệ DQ cho thấy các giá trị DQ nằm từ 0.56-0.68. Kết quả biểu đồ sóng cũng cho thấy các đỉnh tín

hiệu của các hai gen này đều thấp hơn một nửa so với mẫu đối chứng (Hình

3.3 A,B).

(A)

(B)

Hình 3.3: Kết quả phân tích MLPA của hai mẫu có đột biến mất

đoạn. A) Biểu đồ điện di và hình ảnh thể hiện số lượng bản sao mỗi lô-cút của mẫu TMM12. Tất cả các lô-cút đều được khuếch đại thành công và cho tín hiệu rõ ràng. Hình ảnh cho thấy mẫu TMM2 có 3 lô-cút chỉ có một bản

sao (ba điểm trong khung màu đỏ ở phía dưới). Ba lô-cút bị mất bao gồm hai

vị trí trên gen DCDC1 và một trên ELP4. B) Biểu đồ điện di và hình ảnh thể hiện số lượng bản sao của mỗi lô-cút được kiểm tra trong mẫu TMM12. Tất

cả các băng điện di tương ứng với từng lô-cút được thiết kế cho tín hiệu rõ

ràng. Hình ảnh thể hiện toàn bộ các lô-cút tương ứng với phần exon của

43 PAX6 và một số vùng ngược dòng với gen có một bản sao duy nhất (các điểm

trong khung màu đỏ bên dưới hình B).

Kết quả phân tích MLPA cho thấy có 2 trong 14 (14.28%) bệnh nhân có đột biến mất đoạn gen đều ở trạng thái dị hợp tử. Trong đó, mẫu TMM2 bị

mất đoạn trong vùng không dịch mã 3’ UTR của gen PAX6 (Hình 3.3A). Đột

biến này không phát hiện được ở mẫu bố mẹ của bệnh nhân. Ngược lại, mẫu TMM12 bị mất toàn bộ gen PAX6 (Hình 3.3B). Kiểm tra mẫu bố mẹ của bệnh

nhân đã xác định đột biến mất đoạn này được truyền từ người mẹ cũng bị

KMM.

3.1.4. Kết quả PCR khuếch đại gen PAX6

Sau khi kiểm tra MLPA, 12 mẫu không phát hiện được bất thường cấu

trúc gen tiếp tục được sàng lọc đột biến bằng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp. ADN tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch

đại các vùng trình tự mã hoá và vùng biên intron - exon (50-100 bp). Đối với

PCR, mồi là các yếu tố quan trọng để giúp khuếch đại đặc hiệu các đoạn

ADN quan tâm. Cặp mồi nhân vùng điều hoà và vùng mã hoá của gen được thiết kế dựa trên trình tự tham khảo của PAX6 mang mã số truy cập

NG_008679.1 trên ngân hàng Genbank.

Ngoài yếu tố mồi kể trên, chu trình nhiệt phù hợp sẽ quyết định hiệu quả của phản ứng. Nhiệt độ sẽ đảm bào việc giãn xoắn và phân tách sợi ADN

hoàn toàn, đồng thời cũng giúp tối ưu việc gắn và kéo dài chuỗi trong phản

ứng trùng hợp chuỗi. Chúng tôi tiến hành khuếch đại vùng điều hoà và toàn

bộ 13 exon của gen PAX6 bằng 9 phản ứng với các cặp mồi đặc hiệu trong đó exon 1 và 2; exon 9, 10 và 11; exon 12 và 13 được khuếch đại chung. Sản phẩm sau khi khuếch đại bởi phản ứng PCR được kiểm tra bằng cách điện di

trên gel agarose 0.8% và kết quả được trình bày trên hình 3.4. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm của các phản ứng PCR là một băng duy nhất sáng rõ,

nghĩa bộ mồi khuếch đại thành công và đặc hiệu. Đoạn ADN được nhân lên

từ phản ứng bằng cặp mồi tương thích có kích thước từ 300 bp tới 900 bp.

Các sản phẩm này được tinh sạch và sử dụng cho phản ứng giải trình tự gen trực tiếp.

Hình 3.4: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR từ mẫu dị tật mống mắt. M: thang ADN chuẩn (marker 1kb plus), 1-13: sản phẩm PCR của các exon 1 đến 13.

3.1.5. Phát hiện đột biến bằng phương pháp giải trình tự

Trình tự gen thu được của mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự cDNA chuẩn (mã số NM_001258464.1, Genbank) của PAX6 và trình tự gen

của mỗi đoạn PCR theo thiết kế (Hình 3.5 – 3.9).

430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_NM_001258464.1 CGAGCCCCGTGGAATCCCGCGGCCCCCAGCCAGAGCCAGCATGCAGAACAGTCACAGCGGAGTGAATCAGCTCGGTGGTGTCTTTGTCAACGGGCGGCCACTGCC PAX6_E5: .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM2_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM3_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM4_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM5_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM6_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM7_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM8_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM9_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM10_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11Me_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11OFF1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11S1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11S1-OFF1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM13_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM14_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM15_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_NM_001258464.1 GGACTCCACCCGGCAGAAGATTGTAGAGCTAGCTCACAGCGGGGCCCGGCCGTGCGACATTTCCCGAATTCTGCAGGTGTCCAACGGATGTGTGAGTAAAATTCT PAX6_E5: ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM1_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM2_PAX6_E5 .............................................................-.................AT.CT..CGCCGCC.CCCC.CTCG.C TMM3_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM4_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM5_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM6_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM7_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM8_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM9_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM10_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM11_PAX6_E5 ..............................................S.S.S.KSSA.MW.....SA.....G.MR..GAAT.CT.CCGGSGCC.CCC..TTCS.G TMM11Me_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM11OFF1_PAX6_E5 ..............................................S.S.G.GSSA.MT........T.CT..MR..GAA..CT.C.GGSSCCSCCCCCTTCS.C TMM11S1_PAX6_E5 ..............................................S.S.G.GSSAMMT.....SA...CTG.MR.KGAA..TT.C.GS.GCGSCCC.MTTSS.G TMM11S1-OFF1_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM13_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM14_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM15_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C

Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 5 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6_cDNA_NM_001258464.1

45 trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. PAX6_E5 trình tự vùng biên và exon 5

theo lý thuyết được khuếch đại bởi cặp mồi E5F và E5R trong nghiên cứu.

TMM_PAX6_E5 trình tự vùng biên intron và exon E5 của bệnh nhân và người thân tham gia trong nghiên cứu. Tất cả các mẫu nghiên cứu được

khuếch đại và giải trình tự thể hiện chính xác vùng exon E5 và vùng biên

intron theo thiết kế. Vùng exon tương đồng với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. Vùng biên intron không tương đồng do cDNA không chứa trình tự intron.

Kết quả đọc trình tự cho thấy nucleotide 572 trên trình tự của bệnh nhân

TMM11 là S (C và G) so với trình tự chuẩn là C, đồng thời các vị trí sau đó hầu hết đều ở trạng thái 2 nucleotide (Vùng hình chữ nhật được khoanh trên hình). Điều này chỉ ra rằng mẫu TMM11 có đột biết mất một nucleotide C ở

trạng thái dị hợp tử. Kiểm tra những người trong đại gia đình bệnh nhân

TMM11 phát hiện đột biến tương tự ở những người mắc KMM (con gái bệnh nhân mã TMM11OFF1_PAX6_E5, chị gái TMM11S1_PAX6_E5). Trong khi

đó những người không mang tật KMM có trình tự bìn thường và hoàn toàn

giống với các mẫu khác và trình tự chuẩn (mẹ đẻ bệnh nhân mã

TMM11Me_PAX6_E5, cháu gái mã TMM11S1-OFF_PAX6_E5).

780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_NM_001258464.1 AGATTACTGTCCGAGGGGGTCTGTACCAACGATAACATACCAAGCGTGTCATCAATAAACAGAGTTCTTCGCAACCTGGCTAGCGAAAAGCAACAGATGGGCGCAGACGGCATGT TMM1_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM2_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM3_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---..................KY.YY..RMMCTG..TA...AA....RA....TG.....R..C.S..TG... TMM3Bo_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTT-.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM3Me_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM4_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM5_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM6_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM7_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM8_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM9_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM10_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM11_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGKTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM13_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM14_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... TMM15_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT-----.G.TT.G.AG---...................................................................... 890 900 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_NM_001258464.1 ATGATAAACTAAGGATGTTGAACGGGCAGACCGGAAGCTGGGGCACCCGCCCTGGTTGGTATCCGGGGACTTCGGTGCCAGGGCAACCTACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGA TMM1_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM2_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM3_PAX6_E7 G......TA..GA.G..GA......RS.C....A..TG...SA.C...C.TG..TG..A.......ACTT...K.C...G..AACCT....RAGG.GAAAACC..RMAC..MTCT TMM3Bo_PAX6_E7 ................................................................................................G-AAAAC...AGC.GCCAT TMM3Me_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM4_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM5_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM6_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM7_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM8_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM9_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM10_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM11_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM13_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM14_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM15_PAX6_E7 ................................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT

Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 7 của gen PAX6

trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6_cDNA_NM_001258464.1

trình tự chuẩn trên ngân hàng gen với mã truy cập 001258464.1. TMM-

46 _PAX6_E7 trình tự vùng biên intron và exon E7 của bệnh nhân và người thân

tham gia trong nghiên cứu. Vùng exon tương đồng với trình tự chuẩn trên

ngân hàng gen. Vùng biên intron không tương đồng do cDNA không chứa trình tự intron. Kết quả phân tích cho thấy nucleotide 834 trên trình tự của

bệnh nhân TMM3 là K (G và T), trong khi đó điểm này trên trình tự chuẩn là

G. Đồng thời hầu hết các tín hiệu giải trình tự sau vị trí này đều chồng lấn lên nhau và thể tín hiệu của hai nucleotide cùng vị trí. Tiến hành phân tích sâu

hơn cho thấy mẫu TMM3 mang đột biến dịch khung do mất 2 nucleotide G và

T tại vị trí c.375-376. Trên hình cũng thể hiện kết quả giải trình tự mẫu cha mẹ của bệnh nhân TMM13 (TMM13Me_PAX6_E7 và TMM13Bo_PAX6_E7). Mẫu bố mẹ bệnh nhân mang trình tự bình thường do vậy đột biến này mới

920 930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040. 1050

phát sinh ở đời con.

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_001258464.1 G-GCAGACC--GGAAGCTGGGGCACCCGCCCTGGTTGGTATCCGGGGACTTCGGTGCCAGGGCAACCTACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGAAGGAGGGGGAGAGAATACCAACTCCATCAGTTCCAACGGAGAAGAT PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM1_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM2_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM3_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM4_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM5_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................Y.................................................. TMM5Bo_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM5Me_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM6_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM7_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM8_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM9_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM10_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM11_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM13_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................... TMM14_PAX6_E8 CCM.C.GG.--CCTTTTK....STT.AAAGT.AT.CCAA..TTTT---Y.WMCC.T.TTTTTTTTTTKGTT.CGA.K.SYKS.ARSM.MMR.R.R.RR.......................................... TMM15_PAX6_E8 CCC.CAGS.--CCYTTTG.RR.SYT..AAGT.AW.CCAAW.TTTT---Y..MCC.Y.TTTTTTTTTT.TTY.CGA.K.SYKS...S..C.R.R.R.RR.......................................... 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_001258464.1 TCAGATGAGGCTCAAATGCGACTTCAGCTGAAGCGGAAGCTGCAAAGAAATAGAACATCCTTTACCCAAGAGCAAATTGAGGCCCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGAACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAGAAAGACT PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM1_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM2_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM3_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM4_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM5_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM5Bo_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM5Me_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM6_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM7_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM8_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM9_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM10_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM11_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM13_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM14_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G. TMM15_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---------.....GC.G.

Hình 3.7: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 8 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6_cDNA_001258464.1 trình tự

chuẩn trên ngân hàng gen với mã truy cập 001258464.1. PAX6_E8 trình tự vùng biên và exon 8 theo lý thuyết được khuếch đại bởi cặp mồi E8F và E8R

trong nghiên cứu. TMM-_PAX6_E8 trình tự vùng biên intron và exon E8 của

bệnh nhân và người thân tham gia trong nghiên cứu. Vùng exon tương đồng

với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. Vùng biên intron không tương đồng do cDNA không chứa trình tự intron. Kết quả so sánh trình tự cho thấy mẫu

47 ADN của bệnh nhân TMM5 xuất hiện đột biến điểm tại vị trí 1000 so với trình

tự chuẩn. Đây là dạng đột biến thay thế nucleotide dị hợp tử (C T). Đột

biến này tạo ra mã kết thúc sớm. Kiểm tra và phân tích ADN của bố và mẹ bệnh nhân cho thấy trình tự ADN bình thường giống như trình tự tham khảo.

Tương tự, kết quả phân tích trình tự exon 8 đã giúp phát hiện đột biến ADN

trong mẫu của bệnh nhân TMM14 và TMM15. Đây là đột biến them nucleotide dẫn đến làm dịch chuyển khung đọc mở. Cụ thể, từ nucleotide 987

theo trình tự tham khảo có xuất hiện biến đổi. Mỗi vị trí thường có tín hiệu

của hai nucleotide, đây là dấu hiệu của đột biến làm dịch khung đọc mở ở dạng dị hợp tử. Phân tích kết quả phát hiện ra đột biến thêm một nucleotide G vào vị trí 987 (c.551insG). Hai mẫu TMM14 và TMM15 có đột biết giống hệt

nhau. Xem trong khung hình ovan.

1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_NM_001258464.1 CCCAAGAGCAAATTGAGGCCCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGAACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAGAAAGACTAGCAGCCAAAATAGATCTACCTGAAGCAA PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM1_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM2_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM3_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM4_PAX6_E9 TGG..A-T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM5_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM6_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM7_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM8_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM9_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM9Me_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM10_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM11_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM13_PAX6_E9 TGG..A-T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM14_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. TMM15_PAX6_E9 TGG..A-T...C..-.---.TC--TTTC............................................................................. 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_NM_001258464.1 GAATACAGGTATGGTTTTCTAATCGAAGGGCCAAATGGAGAAGAGAAGAAAAACTGAGGAATCAGAGAAGACAGGCCAGCAACACACCTAGTCATATTCCTATCA PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T----------- TMM1_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM2_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM3_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM4_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM5_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM6_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM7_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM8_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM9_PAX6_E9 ........--R.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM9Me_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM10_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM11_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM13_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM14_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG TMM15_PAX6_E9 ........--G.---------.C...GA.A--CTG..C..TTTC-----.C.CT.TGT..T..----------------AT..CA--T.T...T.--.....GAG

Hình 3.8: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 9 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6 cDNA NM 001258464.1 trình

tự chuẩn trên ngân hàng gen với mã truy cập 001258464.1. PAX6_E9 trình tự

vùng biên và exon98 theo lý thuyết được khuếch đại bởi cặp mồi E9F và E9R

trong nghiên cứu. TMM- PAX6 E9 trình tự vùng biên intron và exon E9 của bệnh nhân và người thân tham gia trong nghiên cứu. Vùng exon tương đồng

với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. Vùng biên intron không tương đồng do cDNA không chứa trình tự intron. Kết quả phân tích phát hiện đột biến điểm

48 thay thế nucleotide tại vị trí tiếp giáp giữa exon và intron (Điểm đột biến ký

hiệu R trong đường tròn). Đây là đột biến dị hợp tử thay thế nucleotide G

A. Vì là đột biến điểm nên các nucleotide sau đó không sai khác và tương đồng với vùng biên intron đã thiết kế. Bên cạnh đó, mẫu ADN của mẹ bệnh

nhân (TMM9Me PAX6 E9) cũng được thu thập và kết quả phân tích không

phát hiện đột biến vùng nội gen PAX6.

2460 2470 2480 2490 2500 2510 2520 2530 2540 2550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| cDNA_PAX6: CAACCAATTCCACAACCCACCACACCGGTTTCCTCCTTCACATCTGGCTCCATGTTGGGCCGAACAGACACAGCCCTCACAAACACCTACAGCGCTCTGCCGCCT PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM1_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM2_PAX6 E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM3_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM4_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM5_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM6_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM7_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM8_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM9_PAX6_ E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM10_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM11_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM13_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.................................Y............................................ TMM14_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A.............................................................................. TMM15_PAX6_E11 --..T.C.GT..TTT.T.TTGC.CT.A..............................................................................

2560 2570 2580 2590 2600 2610 2620 2630 2640 2650 2660

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| cDNA_PAX6: ATGCCCAGCTTCACCATGGCAAATAACCTGCCTATGCAACCCCCAGTCCCCAGCCAGACCTCCTCATACTCCTGCATGCTGCCCACCAGCCCTTCGGTGAATGGG PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM1_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM10_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM16_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM4_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM5_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM6_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM7_E9-11_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM8_E9-11_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM9_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM10_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM11_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM13_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM14_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A TMM15_PAX6_E11 .......................................GTA--...G.--G..TG.------.GG.GG-.......A----A.-....G..CCA.A-...GT.A

Hình 3.9: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 11 của gen PAX6

trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6 cDNA NM 001258464.1 trình tự chuẩn trên ngân hàng gen với mã truy cập 001258464.1. PAX6 E11 trình

tự vùng biên và exon11 theo lý thuyết được khuếch đại bởi cặp mồi E11F và

E11R trong nghiên cứu. TMM- PAX6 E11 trình tự vùng biên intron và exon E9 của bệnh nhân và người thân tham gia trong nghiên cứu. Vùng exon tương đồng với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. Kết quả phân tích cho thấy mẫu

ADN TMM13 mang đột biết điểm thay thế nucleotide C T. Bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử nên điểm này xuất hiện tín hiệu của hai nucleotide T và C

(Y). Trình tự vùng exon và giáp ranh intron 11 của những bệnh nhân khác

không có bất thường.

Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ đột biến dị hợp tử là 50% (7/14). Có 2 đột biến vô nghĩa được xác định trong tổng số 7 mẫu được phát hiện bởi giải trình tự gen (28.57%). Đột biến dạng dịch khung được phát hiện ở 4 mẫu sau

49 giải trình tự PAX6. Hậu quả của những đột biến dịch khung này đều dẫn đến

kết thúc dịch mã sớm. Ngoài ra, đột biến cuối cùng được phát hiện trong

nhóm mẫu được giải trình tự gen là dạng đột biến điểm cắt ghép trong vùng không mã hoá intron. Trong số các đột biến được phát hiện có 3 đột biến nằm

trên exon 8, đây là trình tự mã hoá cho vùng HD có chức năng gắn ADN của

PAX6. Ngoài ra, 1 đột biến nằm trên exon 7 và 1 đột biến nằm trên exon 6, đây là đoạn trình tự mã hoá cho phần PD trên phân tử protein PAX6. Thông

tin chi tiết về các loại đột biến được trình bày trong bảng 3.4.

Ảnh hưởng

Mã BN

Gen

Exon/intron Vị trí đột biến

Loại đột biến

Protein/ARN

TMM2

PAX6

3’UTR

Vùng điều hoà

TMM3

PAX6

Exon 7

p.R125Sfs*6

PCT (131)

c.375- 376delAG

TMM5

PAX6

Exon 8

c.538C>T;

p.Q180X

PCT, LOVD

TMM9

PAX6

Intron 9

c.765+1G>A

Điểm cắt

TMM11

PAX6

Exon 6

c.112delC

p.R38Gfs*16

PCT (54)

TMM12

PAX6

Mất đoạn

Không protein

Toàn bộ gen

TMM13

PAX6

Exon 11

c.C949T

p.R317X

PCT

TMM14

PAX6

Exon 8

c.551insG

p.E183Sfs*15

PCT (198)

TMM15

PAX6

Exon 8

c.551insG

p.E183Sfs*15

PCT (198)

Chú thích: BN – Bệnh nhân; PCT – Xuất hiện mã kết thúc sớm; LOVD – Cơ sở dữ liệu đột biến LOVD PAX6.

Bảng 3.4. Các đột biến gen phát hiện trên bệnh nhân KMM

3.1.6. Đánh giá mối liên hệ kiểu gen và kiểu hình cho mỗi

bệnh nhân

Có 77,78% bệnh nhân đã xác định được đột biến di truyền liên quan đến gen PAX6 bao gồm cả mất đoạn vùng điều hoà 3’UTR biểu hiện rung giật nhãn

cầu. Bên cạnh đó, 66,67% bệnh nhân biểu hiện với tình trạng thiểu sản hoàng

50 điểm. Ngược lại, hầu hết các bệnh nhân không gặp phải tình trạng đục thuỷ

tinh thể, tăng nhãn áp và tổn thương giác mạc. Chỉ duy nhất một bệnh nhân

với đột biến mất toàn bộ gen có biểu hiện tăng nhãn áp và đục giác mạc (Bảng 3.5). Có thể do mất toàn bộ gen mà việc sản xuất protein PAX6 chỉ diễn ra

trên alen còn lại nên bệnh nhân này có biểu hiện nặng hơn bao gồm cả đục

giác mạc, suy hố thị giác và rụng giật nhãn cầu. Mặc dù chúng tôi chưa phát hiện ra sự khác biệt giữa các bệnh nhân trong mối tương quan giữa kiểu đột

biến gen và kiểu hình tương ứng. Tuy nhiên, chúng tôi xác nhận rằng tình

trạng KMM do đột biến PAX6 thường đi kèm các biểu hiện khác liên quan như rung giật nhãn cầu và thiểu sản hoàng điểm.

Bảng 3.5: Đột biến và kiểu hình ở mỗi bệnh nhân

Mã BN

Vị trí đột biến

Thị lực

Exon/ intron

Loại đột biến

Tăng nhãn áp

Rung giật nhãn cầu

Thiểu sản hoàng điểm

Đục Thuỷ tinh thể

Tổn thương giác mạc

TMM2

3’UTR

Không Không Không Không Không

Mất đoạn

RE: PL (-) LE: 20/100

TMM3

Exon 7

c.375-376delAG

Có

Không Không Không

Dịch khung

RE: 20/100 LE: 20/100

TMM5

Exon 8

c.538C>T;

NO CO.OP

Có

Không Không Không

Vô nghĩa

TMM9

Intron 9

c.765+1G>A

NO CO.OP

Có

Không

Điểm cắt

Không

TMM11

Exon 6

c.112delC

Có

Không Không Không Không

Dịch khung

RE: 20/200 LE: 20/400

TMM12

NO CO.OP Không

Có

Không

Có

Toàn bộ gen

Đục GM

Mất đoạn

TMM13 Exon 11

c.C949T

NO CO.OP

Có

Không Không Không

Vô nghĩa

TMM14

Exon 8

c.547insG

NO CO.OP

Có

Không Không Không

Dịch khung

TMM15

Exon 8

c.547insG

NO CO.OP

Có

Không Không Không

Dịch khung

Chú thích: NO CO.OP – Không hợp tác để đo; BN – Bệnh nhân; GM – Giác mạc

THẢO LUẬN

Khuyết mống mắt là dị tật bẩm sinh mà biểu hiện bởi khuyết một phần hoặc toàn bộ mô mống mắt, đồng thời có suy hố thị giác dẫn đến giảm thị lực

ở bệnh nhân. Khuyết mống mắt có thể là bệnh độc lập hoặc biểu hiện cùng

với các bất thường hệ thống khác như trong trường hợp hội chứng WAGR. Đối với bệnh nhân mắc hội chứng WAGR nguy cơ xuất hiện khối u Wilms ở

thận rất cao. Việc kiểm tra và tầm soát thường xuyên sự phát sinh khối u

Wilms ở thận của bệnh nhân nhi cho tới khi bệnh nhân lên 8 tuổi là rất quan trọng. Hội chứng này gây bởi mất đoạn các gen giáp bao gồm PAX6 và WT1 nằm trên vùng 11p13-14. Do đó, chiến lược tiếp cận khi chẩn đoán di truyền

đối với những bệnh nhân có biểu hiện KMM là ưu tiên sàng lọc mất đoạn gen

vùng 13 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 11. Vì thế, chúng tôi lựa chọn MLPA là xét nghiệm đầu tiên sử dụng cho tất cả bệnh nhân khuyết mống mắt tham

gia vào trong nghiên cứu này. Bộ kít SALSA MLPA Probemix P219 PAX6

chúng tôi sử dụng bao gồm 44 đầu dò bao phủ toàn bộ gen PAX6 và cả gen

WT1. Kết quả phân tích có thể phân định được vùng mất đoạn có hay không có bao gồm WT1, điều này quan trọng cho việc quản lý bệnh nhân sau xét

nghiệm. Trong nghiên cứu này, phân tích MLPA cho thấy toàn bộ 14 bệnh

nhân của chúng tôi đều không có mất đoạn gen WT1. Kết quả này khẳng định tất cả bệnh nhân KMM trong nghiên cứu không mắc hội chứng WGRA. Điều

này cũng có nghĩa nguy cơ về phát sinh khối u Wilms ở thận là thấp và tần số

xuất hiện tương tự như trong quần thể chung. Kết quả này có ý nghĩa quan

trọng cho việc theo dõi sức khoẻ và thăm khám của bệnh nhân.

Nghiên cứu này xác định được 2 bệnh nhân có mất đoạn gây ảnh hưởng

PAX6 và dẫn đến biểu hiện bệnh KMM. Trong đó, bệnh nhân đầu tiên có mất đoạn vùng điều hoà và không dịch mã 3’ UTR của gen PAX6. Bệnh nhân chỉ có biểu hiện KMM và không kèm theo các biểu hiện liên quan như rung giật

nhãn cầu, đục giác mạc và thiểu sản hoàng điểm… Việc phát hiện đột biến

mất đoạn ADN không nằm trong vùng mã hóa gen PAX6 là nguyên nhân gây

nên dị tật KMM ở bệnh nhân TMM2 có thể hợp lý. Tình trạng mất đoạn không liên quan đến gen PAX6 ở những bệnh nhân mắc bệnh KMM đã được

52 mô tả trước đây bởi một số tác giả [75 – 77]. Khi mất đoạn không bao gồm

trình tự mã hóa PAX6, thì được gọi là “hiệu ứng vị trí”, một cơ chế gây bệnh

tiềm ẩn của dị tật mống mắt. Phân tích MLPA cho thấy ở những bệnh nhân này có hiện tượng mất đoạn dị hợp tử ở một số gen, bao gồm cả gen ELP4.

Kleinjan và cộng sự đã xác nhận rằng các yếu tố điều hòa cis nằm trong các

intron của gen ELP4 là các yếu tố kiểm soát tầm xa đặc hiệu PAX6 (specific long-range control elements), rất cần thiết cho sự biểu hiện bình thường của

gen. Ngoài ra, một số nghiên cứu chức năng trên tế bào người và mô hình

động vật cũng chỉ ra sự hiện diện của 3 yếu tố điều hòa ở vùng downstream PAX6, cần thiết cho sự biểu hiện bình thường của gen [31]. Phát hiện phân tử của chúng tôi cung cấp thêm bằng chứng về vai trò của các yếu tố điều hoà

bên ngoài vùng mã hoá của gen PAX6, như đã được các nghiên cứu khác báo

cáo là ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện protein. Trường hợp còn lại mắc bệnh do mất toàn bộ gen PAX6, đây là một bệnh nhân nhi sinh năm 2020. Do mất

toàn bộ một alen nên việc sản xuất protein chỉ diễn ra trên alen còn lại, đây có

thể là nguyên nhân khiến cho bệnh nhân này biểu hiện nặng hơn bao gồm đục

giác mạc, thiểu sản hoàng điểm và rung giật nhãn cầu. Tuy vậy, có một điều may mắn là cả hai bệnh nhân có phát hiện mất đoạn gen chỉ liên quan đến

PAX6 và không mất đoạn với WT1, nguy cơ mắc khối u Wilms tương tự như

với quần thể chung.

Bên cạnh mất đoạn vùng 11p13, đột biến PAX6 vẫn được cho là

nguyên nhân chính gây ra bệnh khuyết mống mắt. Đã có một cơ sở dữ liệu về

các đột biến trên PAX6 liên quan tới bệnh KMM được thành lập với gần 500

biến dị. Có tới 96% đột biến nằm trong gen PAX6, 4% còn lại thuộc các vùng không mã hoá bao gồm vùng điều hoà 3’ UTR và 5’ UTR. Trong nghiên cứu

này nhờ giải trình tự chúng tôi xác định được 7 trên 12 mẫu có đột biến nội

gen PAX6 sau khi âm tính với kết quả MLPA. Trong số đột biến được xác định phần lớn là dạng dịch khung do mất hoặc chèn nucleotide vào khung đọc

mở của PAX6 (4/7). Tất cả các đột biến dịch khung này đều tạo ra mã kết

thúc sớm (PCT) ngay sau điểm đột biến khoảng vài chục nucleotide. Như vậy

6/7 (85.71%) trường hợp đột biến nội gen tạo ra mã kết thúc sớm và gây ra kiểu hình khuyết mống mắt. Tỷ lệ này cũng khá tương đồng với những gì

53 được báo cáo trên cơ sở dữ liệu LOVD về đột biến PAX6 (70%). Người ta đã

chứng minh rằng những đột biến tạo ra mã kết thúc sớm sẽ không tạo ra

những protein bị cắt ngắn mà sẽ không tạo ra sản phẩm protein do sự phân huỷ ARN qua trung gian vô nghĩa. Cũng có thể vì lý do này mà kiểu hình của

các đột biến dịch khung, vô nghĩa hoặc mất toàn bộ gen khá tương đồng. Hầu

hết các bệnh nhân đều có hiện tượng rung giật nhãn cầu và thiểu sản hoàng điểm bên cạnh bất thường mống mắt.

Nghiên cứu này đã thực hiện khai thác tiền sử bệnh trong gia đình kết

hợp với kiểm tra sự hiện diện của đột biến gen phát hiện được trên bệnh nhân đối với các thành viên gia đình trong trường hợp họ đồng ý tham gia nghiên cứu. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra đột biến gen của bố mẹ các bệnh nhân

dương tính với đột biến gen gây bệnh. Kết quả là 6/9 cặp bố mẹ được kiểm tra

không mang đột biến gen, điều này phù hợp với kết quả khai thác tiền sử bệnh trong gia đình của tất cả 6 bệnh nhân này đều không có người bị bệnh. Ba

trong số chín trường hợp còn lại (33%) báo cáo tiền sử gia đình đã có người

mắc bệnh tương tự. Kết quả xét nghiệm di truyền đối với mẫu cha mẹ và

người thân của ba bệnh nhân tái khẳng định sự di truyền của đột biến trong những trường hợp này. Đối với hai trường hợp TMM12 và TMM14, những

đột biến này mới xuất hiện trong hai thế hệ gần đây. Bệnh nhân TMM12

mang đột biến mất toàn bộ gen PAX6 là do được di truyền từ người mẹ đã xuất hiện đột biến tương tự. Bệnh nhân TMM12 tuy mới 1 tuổi nhưng bệnh

biểu hiện khá nặng bao gồm thiểu sản hoàng điểm, đục giác mạc và tăng nhãn

áp. Điều này có thể do sự ảnh hưởng của đột biến mất toàn bộ gen. Ngược lại,

bệnh nhân TMM14 mang một đột biến dịch khung do được di truyền từ người cha. Hai cha con đều có biểu hiện rung giật nhãn cầu và thiểu sản hoàng điểm,

các triệu trứng còn lại chưa thấy xuất hiện. Tất cả những người thân khác

cùng thế hệ hoặc ở đời trên với cha mẹ hai bệnh nhân này đều được báo cáo không xuất hiện bệnh tương tự.

(A)

(B)

Hình 3.10: So sánh kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM12

(A) và người mẹ cũng mắc KMM (B). Biểu đồ phân tích đoạn của cả hai

mẫu cho thấy tất cả các đầu dò đã gắn trúng đích và khuếch đại sản phẩm có

kích thước đúng như thiết kế của bộ kít. Cường độ tín hiệu của mỗi băng được so sánh với mẫu chuẩn của người khoẻ mạnh từ đó tính ra tỷ lệ DQ. Dựa vào

chỉ số này phần mềm sẽ chỉ ra lô-cút nào mất hoặc lặp trên nhiễm sắc thể.

Hai biểu đồ bên dưới thể hiện trực quan tỷ lệ DQ tính toán được với mỗi lô- cút được khuếch đại bởi đầu dò tương ứng. Như vậy, có thể thấy toàn bộ 17 vị

trí bao phủ trên gen PAX6 có tỷ lệ DQ<0.65 đối với mẫu bệnh nhân TMM12.

Điều này chỉ ra rằng bệnh nhân có mất đoạn toàn bộ gen PAX6 ở trạng thái dị hợp tử. Hơn nữa, biểu đồ bên dưới hình B cũng cho thấy kết quả tương tự với mẫu của người mẹ (TMM12Me).

Trường hợp khuyết mống mắt do di truyền cuối cùng thuộc gia đình

bệnh nhân TMM11. Kết quả giải trình tự cho thấy mẫu TMM11 mang đột biến c.112delC làm dịch khung đọc mở và tạo mã kết thúc sớm. Bệnh nhân

báo cáo bệnh xuất hiện từ đời ông nội và được truyền cho nhiều người trong

55 gia đình bao gồm bố đẻ của bệnh nhân (Hình 3.11). Ngoài ra, chị gái ruột, hai

bác gái và con gái bệnh nhân TMM11 cũng mắc tật khuyết mống mắt tương

tự. Bệnh biểu hiện trong đại gia đình bao gồm thị lực kém và rung giật nhãn cầu, những triệu chứng khác chưa thấy xuất hiện. Kết quả phân tích di truyền

đối với mẫu của con gái (mắc bệnh), chị gái (mắc bệnh), mẹ đẻ (không mắc

bệnh) và con gái của chị gái (không mắc bệnh) cho thấy kết quả đột biến c.112delC xuất hiện dạng dị hợp tử ở những người mắc bệnh. Bệnh nhân báo

cáo người cha có mắc KMM bẩm sinh tuy nhiên, ông đã mất nên không thể

thực hiện phân tích di truyền trong nghiên cứu. Kết quả này một lần nữa khẳng định tình trạng dị tật mống mắt bẩm sinh trong gia đình TMM11 là do di truyền phát sinh từ đời trước.

Hình 3.11: Sơ đồ phả hệ của bệnh nhân TMM11. Bệnh nhân TMM11 tham gia vào trong nghiên cứu và được xác định mang đột biến c.112delC trên gen PAX6. Đột biến này làm lệch khung đọc mở và tạo mã kết thúc sớm. Phả hệ trên đây được xây dựng từ việc khai thác tiền sử gia đình bệnh nhân. Theo đó, dị tật KMM đã xuất hiện trong tổng thể 4 đời trong phả hệ. Một số người thân của bệnh nhân như mẹ đẻ, con gái, chị gái, và cháu gái cũng được lấy mẫu máu để xét nghiệm cho gen PAX6. Kết quả trên những người thân mắc bệnh (chị gái và con gái) cũng xác nhận mang đột biến tương tự với bệnh nhân. Ngược lại, mẹ đẻ và cháu gái khoẻ mạnh không mang đột biến này.

Có 5 trong số 14 bệnh nhân (35%) tham gia vào trong nghiên cứu

không được xác định có bất cứ bất thường nào khi sử dụng hai phương pháp

xét nghiệm là MLPA và giải trình tự gen. Phương pháp MLPA và giải trình tự được sử dụng trong nghiên cứu này không thể phát hiện được những biến đổi

nhỏ trong vùng điều hoà mà nằm cách xa gen PAX6 như SIMO hoặc EE. Hơn

nữa, một số bất thường di truyền trên các gen khác như TRIM44, FOXC1, PITX2 cũng đã được chứng minh gây ra bệnh khuyết mống mắt [45, 66, 67].

Do đó, chúng tôi sẽ tiến hành các nghiên cứu sâu hơn trên nhóm mẫu chưa

phát hiện đột biến gây bệnh trong nghiên cứu này bằng các công nghệ cho phép phát hiện đột biến gen có quy mô lớn hơn như giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) hoặc aCGH. Hiện nay WES được sử dụng khá phổ biến trong xét

nghiệm di truyền các bệnh hiếm gặp hoặc khi nhà nghiên cứu chưa định hình

được rõ nhóm bệnh mà bệnh nhân đang gặp phải. Bằng cách sử dụng WES đã có nhiều đột biến trên vùng biểu hiện của các gen khác nhau đã được xác định

trên các bệnh nhân mắc dị tật bẩm sinh. Bên cạnh đó, aCGH là phương pháp

hữu hiệu cho xác định các vi mất đoạn trên toàn bộ hệ gen. Nhiều đột biến vi

mất đoạn không thể xác định bởi nhiễm sắc thể đồ, MLPA đã được phát hiện nhờ kỹ thuật aCGH.

Lợi ích của aCGH trong nghiên cứu về tật khuyết mống mắt đã được

chỉ ra trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Thực vậy, năm 2016 Ansari và cộng sự đã sử dụng aCGH có độ phân giải cao để tìm đột biến di truyền trên 42

trường hợp bệnh nhân âm tính với giải trình tự nội gen PAX6. Kết quả tác giả

đã tìm được 15 trên 42 trường hợp có các biến đổi cấu trúc nhỏ trong vùng

11p13 [45]. Một số bệnh nhân trong 27 trường hợp còn lại đã được chỉ ra mức hội chứng Gillespie do có đột biến trên gen ITPR1. Do đó, một số tác giả ước

tính có khoảng 5% số trường hợp khuyết mống mắt sẽ không phát hiện được

nguyên nhân [68]. Do vậy, để xác định được nguyên nhân di truyền của những bệnh nhân còn lại, aCGH với độ phân giải cao hoặc tập trung vào đột

biến các gen khác sẽ là lựa chọn ưu tiên.

57 KẾT LUẬN

Từ những kết quả đạt được trong nghiên cứu này tôi xin đưa ra một số

kết luận như sau:

- Đã ứng dụng thành công kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen để phát hiện đột biến di truyền gây tật khuyết mống mắt trên người Việt Nam.

- Đã xác định được đột biến gây bệnh ở 9/14 bệnh nhân khuyết mống mắt. Trong đó, hai đột biến mất đoạn gen lớn và đột biến điểm trong gen PAX6.

- Kết quả của nghiên cứu bổ xung thông tin vào cơ sở dữ liệu đột biến

gen gây bệnh mắt trong cộng đồng người Việt Nam.

KIẾN NGHỊ

Từ kết quả đáng khích lệ thu được bởi nghiên cứu này tôi mạnh dạn

đưa ra những kiến nghị sau:

- Áp dụng phương pháp MLPA và giải trình tự Sanger để sàng lọc đột

biến gen PAX6 cho bệnh nhân khuyết mống mắt.

- Đối với bệnh nhân không có đột biến gen PAX6, tiếp tục sàng lọc mở rộng bằng các phương pháp khác như phân tích aCGH, giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa (WES) hoặc giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS).

59 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Grønskov K, Olsen JH, Sand A, Pedersen W, Carlsen N, Bak Jylling AM, Lyngbye T, Brøndum-Nielsen K, Rosenberg T, 2001, Population-based risk

estimates of Wilms tumor in sporadic aniridia. A comprehensive mutation

screening procedure of PAX6 identifies 80% of mutations in aniridia, Hum Genet, 109(1), pp. 11-8.

2. Robinson DO, Howarth RJ, Williamson KA, van Heyningen V, Beal SJ, Crolla JA, 2008, Genetic analysis of chromosome 11p13 and the PAX6 gene

in a series of 125 cases referred with aniridia, Am J Med Genet A, 146A(5), pp. 558-69.

3. Hingorani M, Hanson I, van Heyningen V, 2012, Aniridia, Eur J Hum

Genet, 20(10), pp. 1011-7.

4. Hill RE, Favor J, Hogan BL, Ton CC, Saunders GF, Hanson IM, Prosser J,

Jordan T, Hastie ND, van Heyningen V, 1991, Mouse small eye results from

mutations in a paired-like homeobox-containing gen, Nature, 354(6354), pp.

522-5.

5. Azuma N, Yamaguchi Y, Handa H, Tadokoro K, Asaka A, Kawase E,

Yamada M, 2003, Mutations of the PAX6 gene detected in patients with a

variety of optic-nerve malformations, Am J Hum Genet, 72(6), pp. 1565-70.

6. Schmidt-Sidor B, Szymańska K, Williamson K, van Heyningen V,

Roszkowski T, Wierzba-Bobrowicz T, Zaremba J, 2009, Malformations of

the brain in two fetuses with a compound heterozygosity for two PAX6

mutation, Folia Neuropathologica, 47(4), pp. 371-82.

7. Crolla JA, van Heyningen V, 2002, Frequent chromosome aberrations

revealed by molecular cytogenetic studies in patients with aniridia, Am J Hum

Genet, 71(5), pp. 1138-49.

8. Hingorani M, Williamson KA, Moore AT, van Heyningen V, 2009,

Detailed ophthalmologic evaluation of 43 individuals with PAX6 mutations,

Invest Ophthalmol Vis Sci, 50(6), pp. 2581-90.

60 9. Blanco-Kelly F, Palomares M, Vallespín E, Villaverde C, Martín-Arenas R,

Vélez-Monsalve C, Lorda-Sánchez I, Nevado J, Trujillo-Tiebas MJ,

Lapunzina P, Ayuso C, Corton M, 2007, Improving molecular diagnosis of aniridia and WAGR syndrome using customized targeted array-based CGH,

PLOS ONE, 12(2), pp. e0172363.

10. Zhang X, Wang P, Li S, Xiao X, Guo X, Zhang Q, 2011, Mutation spectrum of PAX6 in Chinese patients with aniridia, Mol Vis, 17, pp. 2139-

47.

11. Primignani P, Allegrini D, Manfredini E, Romitti L, Mauri L, Patrosso

MC, Veniani E, Franzoni A, Del Longo A, Gesu GP, Piozzi E, Damante G, Penco S, 2016, Screening of PAX6 gene in Italian congenital aniridia patients

revealed four novel mutation, Ophthalmic Genet, 37(3), pp. 307-13.

12. Redeker EJ, de Visser AS, Bergen AA, Mannens MM, 2008, Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) enhances the molecular

diagnosis of aniridia and related disorders, Mol Vis, 14, pp. 836-40.

13. Nelson LB, Spaeth GL, Nowinski TS, Margo CE, Jackson L, 1984,

Aniridia. A review, Surv Ophthalmol, 28, pp. 621-642. 621-642.

14. Lee H, Khan R, O'Keefe M, 2008, Aniridia: current pathology and

management, Acta Ophthalmol, 86, pp. 708-715.

15. Thompson PJ, Mitchell TN, Free SL, Williamson KA, Hanson IM, van Heyningen V, Moore AT, Sisodiya SM, 2004, Cognitive functioning in

humans with mutations of the PAX6 gene, Neurology, 62, pp. 1216–1218.

16. Fischbach BV, Trout KL, Lewis J, Luis CA, Sika M, 2005, WAGR syndrome: a clinical review of 54 cases, Pediatrics, 116, pp. 984–988.

17. Gronskov K, Rosenberg T, Sand A, Brondum-Nielsen K, 1999,

Mutational analysis of PAX6: 16 novel mutations including 5 missense

mutations with a mild aniridia phenotype, Eur J Hum Genet, 7, pp. 274–286.

18. Valenzuela A, Cline RA, 2004, Ocular and nonocular findings in patients

with aniridia, Can J Ophthalmol, 39, pp. 632–638.

61 19. Bamiou DE, Free SL, Sisodiya SM, Chong WK, Musiek F, Williamson

KA, van Heyningen V, Moore AT, Gadian D, Luxon LM, 2007, Auditory

interhemispheric transfer deficits, hearing difficulties, and brain magnetic resonance imaging abnormalities in children with congenital aniridia due to

PAX6 mutations, Arch Pediatr Adolesc Med, 161, pp. 463–469.

20. Heyman I, Frampton I, van Heyningen V, Hanson I, Teague P, Taylor A, Simonoff E, 1999, Psychiatric disorder and cognitive function in a family

with an inherited novel mutation of the developmental control gene PAX6,

Psychiatr Genet, 9, pp. 85–90.

21. Breslow NE, Collins AJ, Ritchey ML, Grigoriev YA, Peterson SM, Green DM, 2005, End stage renal disease in patients with Wilms tumor: results from

the National Wilms Tumor Study Group and the United States Renal Data

System, J Urol , 174, pp. 1972–1975.

22. McEntagart M, Williamson KA, Rainger JK, Wheeler A, Seawright A, De

Baere E, Verdin H, Bergendahl LT, Quigley A, Rainger J, Dixit A, Sarkar A,

López Laso E, Sanchez-Carpintero R, Barrio J, Bitoun P, Prescott T, Riise R,

McKee S, Cook J, McKie L, Ceulemans B, Meire F, Temple IK, Prieur F, Williams J, Clouston P, Németh AH, Banka S, Bengani H, Handley M, Freyer

E, Ross A; DDD Study, van Heyningen V, Marsh JA, Elmslie F, FitzPatrick

DR, 2016, A Restricted repertoire of de novo mutations in ITPR1 cause gillespie syndrome with evidence for dominant-negative effect, Am J Hum

Genet, 98, pp. 981-992.

23. Gerber S, Alzayady KJ, Burglen L, Brémond-Gignac D, Marchesin V, Roche O, Rio M, Funalot B, Calmon R, Durr A, Gil-da-Silva-Lopes VL, Ribeiro Bittar MF, Orssaud C, Héron B, Ayoub E, Berquin P, Bahi-Buisson

N, Bole C, Masson C, Munnich A, Simons M, Delous M, Dollfus H,

Boddaert N, Lyonnet S, Kaplan J, Calvas P, Yule DI, Rozet JM, Fares Taie L, 2016, Recessive and Dominant De Novo ITPR1 Mutations Cause Gillespie

Syndrome, Am J Hum Genet, 98, pp. 971-980.

62 24. Kleinjan DA, Seawright A, Schedl A, Quinlan RA, Danes S, van

Heyningen V, 2001, Aniridia-associated translocations, DNase

hypersensitivity, sequence comparison and transgenic analysis redefine the functional domain of PAX6, Hum. Mol. Genet, 10, pp. 2049–2059.

25. Bhatia S, Bengani H, Fish M, Brown A, Divizia MT, de Marco R,

Damante G, Grainger R, van Heyningen V, Kleinjan DA, 2013, Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6

enhancer causes aniridia, Am J Hum Genet, 93, pp. 1126-1134.

26. Lima Cunha D, Arno G, Corton M, Moosajee M, 2019, The Spectrum of

PAX6 Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in the Eye, Genes (Basel), 10, pp. 1050.

27. Singh S, Chao LY, Mishra R, Davies J, Saunders GF, 2001, Missense

mutation at the C-terminus of PAX6 negatively modulates homeodomain function, Hum Mol Genet, 10, pp. 911-918.

28. Tang HK, Singh S, Saunders GF, 1998 , Dissection of the transactivation

function of the transcription factor encoded by the eye developmental gene

PAX6, J Biol Chem, 273, pp. 7210-7221.

29. Azuma N, Yamaguchi Y, Handa H, Hayakawa M, Kanai A, Yamada M,

1999, Missense mutation in the alternative splice region of the PAX6 gene in

eye anomalies, Am J Hum Genet, 65, pp. 656-663.

30. Carriere C, Plaza S, Martin P, Quatannens B, Bailly M, Stehelin D, Saule

S, 1993, Characterization of quail Pax-6 (Pax-QNR) proteins expressed in the neuroretina, Mol Cell Biol, 13, pp. 7257-7266.

31. Kleinjan DA, Seawright A, Mella S, Carr CB, Tyas DA, Simpson TI, Mason JO, Price DJ, van Heyningen V, 2006, Long-range downstream

enhancers are essential for Pax6 expression, Dev Biol, 299, pp. 563-581.

32. Lakowski J, Majumder A, Lauderdale JD, 2007, Mechanisms controlling Pax6 isoform expression in the retina have been conserved between teleosts

and mammals, Dev Biol, 307, pp. 498-520.

63 33. Azuma N, Tadokoro K, Asaka A, Yamada M, Yamaguchi Y, Handa H,

Matsushima S, Watanabe T, Kohsaka S, Kida Y, Shiraishi T, Ogura T,

Shimamura K, Nakafuku M, 2005, The Pax6 isoform bearing an alternative spliced exon promotes the development of the neural retinal structure, Hum

Mol Genet, 14, pp. 735-745.

34. Zhang W, Cveklova K, Oppermann B, Kantorow M, Cvekl A, 2001, Quantitation of PAX6 and PAX6 (5a) transcript levels in adult human lens,

cornea, and monkey retina, Mol Vis, 7, pp. 1-5.

35. Sasamoto Y, Hayashi R, Park SJ, Saito-Adachi M, Suzuki Y, Kawasaki S,

Quantock AJ, Nakai K, Tsujikawa M, Nishida K, 2016, PAX6 Isoforms, along with Reprogramming Factors, Differentially Regulate the Induction of

Cornea-specific Genes, Sci Rep , 6, p. 20807.

36. Aota S, Nakajima N, Sakamoto R, Watanabe S, Ibaraki N, Okazaki K, 2003, Pax6 autoregulation mediated by direct interaction of Pax6 protein with

the head surface ectoderm-specific enhancer of the mouse Pax6 gene, Dev

Biol , 257, pp. 1-13.

37. Pinson J, Mason JO, Simpson TI, Price DJ, 2005, Regulation of the Pax6: Pax6 (5a) mRNA ratio in the developing mammalian brain, BMC Dev Biol ,

5, p. 13.

38. Kammandel B, Chowdhury K, Stoykova A, Aparicio S, Brenner S, Gruss P, 1999, Distinct cis-essential modules direct the time-space pattern of the

Pax6 gene activity, Dev Biol , 205, pp. 79-97.

39. Xu ZP, Saunders GF, 1997, Transcriptional regulation of the human PAX6 gene promoter, J Biol Chem , 272, pp. 3430-3436.

40. Inoue M, Kamachi Y, Matsunami H, Imada K, Uchikawa M, Kondoh H,

2007, PAX6 and SOX2-dependent regulation of the Sox2 enhancer N-3

involved in embryonic visual system development, Genes Cells, 12, pp. 1049- 1061.

41. McBride DJ, Buckle A, van Heyningen V, Kleinjan DA, 2011, DNaseI

hypersensitivity and ultraconservation reveal novel, interdependent long-

64 range enhancers at the complex Pax6 cis-regulatory region, PLoS One, 6, p.

e28616.

42. Griffin C, Kleinjan DA, Doe B, van Heyningen V, 2002, New 30 elements control Pax6 expression in the developing pretectum, neural retina

and olfactory region, Mech Dev, 112, pp. 89-100.

43. Patricia V. Dimanlig, Sonya C. Faber, Woytek Auerbach, Helen P. Makarenkova, Richard A. Lang, 2001, The upstream ectoderm enhancer in

Pax6 has an important role in lens induction, Development, 128, pp. 4415– 4424.

44. Zhang X, Friedman A, Heaney S, Purcell P, Maas RL, 2002, Meis homeoproteins directly regulate Pax6 during vertebrate lens morphogenesis,

Genes Dev, 2002, 16, pp. 2097-107.

45. Ansari M, Rainger J, Hanson IM, Williamson KA, Sharkey F, Harewood L, Sandilands A, Clayton-Smith J, Dollfus H, Bitoun P, Meire F, Fantes J,

Franco B, Lorenz B, Taylor DS, Stewart F, Willoughby CE, McEntagart M,

Khaw PT, Clericuzio C, Van Maldergem L, Williams D, Newbury-Ecob R,

Traboulsi EI, Silva ED, Madlom MM, Goudie DR, Fleck BW, Wieczorek D, Kohlhase J, McTrusty AD, Gardiner C, Yale C, Moore AT, Russell-Eggitt I,

Islam L, Lees M, Beales PL, Tuft SJ, Solano JB, Splitt M, Hertz JM, Prescott

TE, Shears DJ, Nischal KK, Doco-Fenzy M, Prieur F, Temple IK, Lachlan KL, Damante G, Morrison DA, van Heyningen V, FitzPatrick DR, 2016,

Genetic Analysis of ‘PAX6-Negative’ Individuals with Aniridia or Gillespie

Syndrome, PLoS One, 11, p. e0153757.

46. Macdonald GC, Hesselson SE, Chan JY, Jenkins AB, Laybutt DR, Hesselson D, Campbell LV, 2019, Deletion distal to the PAX6 coding region

reveals a novel basis for familial cosegregation of aniridia and diabetes

mellitus, Diabetes Res Clin Pract, 48, pp. 64-71.

47. Plaisancié J, Tarilonte M, Ramos P, Jeanton-Scaramouche C, Gaston V,

Dollfus H, Aguilera D, Kaplan J, Fares-Taie L, Blanco-Kelly F, Villaverde C, Francannet C, Goldenberg A, Arroyo I, Rozet JM, Ayuso C, Chassaing N,

65 Calvas P, Corton M, 2018, Implication of non-coding PAX6 mutations in

aniridia, Hum Genet, 137, pp. 831-846.

48. Bhatia S, Monahan J, Ravi V, Gautier P, Murdoch E, Brenner S, van Heyningen V, Venkatesh B, Kleinjan DA, 2014, A survey of ancient

conserved non-coding elements in the PAX6 locus reveals a landscape of

interdigitated cis-regulatory archipelagos, Dev Biol, 387, pp. 214-228.

49. Moosajee M, Hingorani M, Moore AT, 2003, PAX6-Related Aniridia, In

GeneReviews.

50. Tzoulaki I, White IM, Hanson IM, 2005, PAX6 mutations: Genotype-

phenotype correlations, BMC Genet, 6, p. 27.

51. Celik A, Kervestin S, Jacobson A, 2015, At the crossroads between

translation termination and ribosome recycling, Biochimie, 114, pp. 2-9.

52. Inoue K, Khajavi M, Ohyama T, Hirabayashi S, Wilson J, Reggin JD, Mancias P, Butler IJ, Wilkinson MF, Wegner M, Lupski JR, 2004, Molecular

mechanism for distinct neurological phenotypes conveyed by allelic

truncating mutations, Nat Genet, 36, pp. 361-369.

53. Vasilyeva TA, Voskresenskaya AA, Käsmann-Kellner B, Khlebnikova OV, Pozdeyeva NA, Bayazutdinova GM, Kutsev SI, Ginter EK, Semina EV,

Marakhonov AV, Zinchenko RA, 2017, Molecular analysis of patients with

aniridia in Russian Federation broadens the spectrum of PAX6 mutations, Clin Genet, 92, pp. 639-644.

54. Bobilev AM, McDougal ME, Taylor WL, Geisert EE, Netland PA,

Lauderdale JD, 2016, Assessment of PAX6 alleles in 66 families with aniridia, Clin Genet, 89, pp. 669-677.

55. Williamson KA, FitzPatrick DR, 2014, The genetic architecture of

microphthalmia, anophthalmia and coloboma, Eur J Med Genet, 57, pp. 369-

380.

56. Harding P, Moosajee M, 2019, The Molecular Basis of Human

Anophthalmia and Microphthalmia, J Dev Biol, 7, p. 16.

66 57. eml B, Reis LM, Lemyre E, Clark RD, Kariminejad A, Semina EV, 2016,

Novel mutations in PAX6, OTX2 and NDP in anophthalmia, microphthalmia

and coloboma, Eur J Hum Genet, 24, pp. 535-541.

58. Perenthaler E, Yousefi S, Niggl E, Barakat TS, 2019, Beyond the Exome:

The Non-coding Genome and Enhancers in Neurodevelopmental Disorders

and Malformations of Cortical Development, Front Cell Neurosci, 13, p. 352.

59. Protas ME, Weh E, Footz T, Kasberger J, Baraban SC, Levin AV, Katz

LJ, Ritch R, Walter MA, Semina EV, Gould DB, 2017, Mutations of conserved non-coding elements of PITX2 in patients with ocular dysgenesis

and developmental glaucoma, Hum Mol Genet, 26, pp. 3630-3638.

60. Filatova AY, Vasilyeva TA, Marakhonov AV, Voskresenskaya AA,

Zinchenko RA, Skoblov MY, 2019, Functional reassessment of PAX6 single

nucleotide variants by in vitro splicing assay, Eur J Hum Genet, 27, pp. 488- 493.

61. Yokoi T, Nishina S, Fukami M, Ogata T, Hosono K, Hotta Y, Azuma N,

2016, Genotype-phenotype correlation of PAX6 gene mutations in aniridia,

Hum Genome Var, 3, p. 15052.

62. Hall HN, Williamson KA, FitzPatrick DR, 2019, The genetic architecture

of aniridia and Gillespie syndrome, Hum Genet, 138, pp. 881-898.

63. Glaser T, Jepeal L, Edwards JG, Young SR, Favor J, Maas RL, 1994, PAX6 gene dosage effect in a family with congenital cataracts, aniridia,

anophthalmia and central nervous system defects, Nat Genet, 7, pp. 463-471.

64. olomon BD, Pineda-Alvarez DE, Balog JZ, Hadley D, Gropman AL, Nandagopal R, Han JC, Hahn JS, Blain D, Brooks B, Muenke M, 2009, Compound heterozygosity for mutations in PAX6 in a patient with complex

brain anomaly, neonatal diabetes mellitus, and microophthalmia, Am J Med

Genet A, 149A, pp. 2543-2546.

65. Perveen R, Lloyd IC, Clayton-Smith J, Churchill A, van Heyningen V,

Hanson I, Taylor D, McKeown C, Super M, Kerr B, Winter R, Black GC,

67 2000, Phenotypic variability and asymmetry of Rieger syndrome associated

with PITX2 mutations, Invest Ophthalmol Vis Sci, 41, pp. 2456-2460.

66. Sadagopan KA, Liu GT, Capasso JE, Wuthisiri W, Keep RB, Levin AV, 2015, Anirdia-like phenotype caused by 6p25 dosage aberrations, Am J Med

Genet A, 167A, pp. 524-528.

67. Zhang X, Qin G, Chen G, Li T, Gao L, Huang L, Zhang Y, Ouyang K, Wang Y, Pang Y, Zeng B, Yu L, 2015, Variants in TRIM44 cause aniridia by

impairing PAX6 expression, Hum Mutat, 36, pp. 1164-1167.

68. Hall HN, Williamson KA, FitzPatrick DR, 2019, The genetic architecture

of aniridia and Gillespie syndrome, Hum Genet, 138, pp. 881-898.

69. Thomas MG, Kumar A, Mohammad S, Proudlock FA, Engle EC,

Andrews C, Chan WM, Thomas S, Gottlob I, 2011, Structural grading of

foveal hypoplasia using spectral-domain optical coherence tomography a predictor of visual acuity, Ophthalmology, 118, pp. 1653-1660.

70. Fantes JA, Bickmore WA, Fletcher JM, Ballesta F, Hanson IM, van

Heyningen V, 1992, Submicroscopic deletions at the WAGR locus, revealed

by nonradioactive in situ hybridization, Am J Hum Genet, 51, pp. 1286–1294.

71. Hu L, Liang F, Cheng D, Zhang Z, Yu G, Zha J, Wang Y, Xia Q, Yuan D,

Tan Y, Wang D, Liang Y, Lin G, 2020, Location of Balanced Chromosome-

the Oxford

Translocation Breakpoints by Long-Read Sequencing on Nanopore Platform, Front Genet, 10, p. 1313.

72. Dolan M, Berry SA, Rubin KR, Hirsch B, 2011, Deletion and duplication

of 11p13-11p14: reciprocal aberrations derived from a paternal insertion, Am J Med Genet A, 155A, pp. 2775–2783.

73. Ito YA, Footz TK, Berry FB, Mirzayans F, Yu M, Khan AO, Walter MA,

2009, Severe molecular defects of a novel FOXC1 W152G mutation result in

aniridia, Invest Ophthalmol Vis Sci, 50, pp. 3573-3579.

74. Semina EV, Ferrell RE, Mintz-Hittner HA, Bitoun P, Alward WL, Reiter

RS, Funkhauser C, Daack-Hirsch S, Murray JC, 1998, A novel homeobox

68 gene PITX3 is mutated in families with autosomal-dominant cataracts and

ASMD, Nat Genet, 19, pp. 167-170.

75. D'Elia AV, Pellizzari L, Fabbro D, Pianta A, Divizia MT, Rinaldi R, Grammatico B, Grammatico P, Arduino C, Damante G, 2007, A deletion 3' to

the PAX6 gene in familial aniridia cases, Mol Vis, 13, pp. 1245-1250.

76. Wawrocka A, Budny B, Debicki S, Jamsheer A, Sowinska A, Krawczynski MR, 2012, PAX6 3' deletion in a family with aniridia,

Ophthalmic Genet, 33, pp. 44-48.

77. Davis LK, Meyer KJ, Rudd DS, Librant AL, Epping EA, Sheffield VC,

Wassink TH, 2008, Pax6 3' deletion results in aniridia, autism and mental retardation, Hum Genet, 123, pp. 371-378.

78. Kleinjan DA, Seawright A, Childs AJ, van Heyningen V, 2004,

Conserved elements in Pax6 intron 7 involved in (auto)regulation and alternative transcription, Dev Biol, 265, pp. 462-477.

79. Vance KW, Sansom SN, Lee S, Chalei V, Kong L, Cooper SE, Oliver PL,

Ponting CP, 2014, The long non-coding RNA Paupar regulates the expression

of both local and distal genes, EMBO J, 33, pp. 296-311.

80. Roux LN, Petit I, Domart R, Concordet JP, Qu J, Zhou H, Joliot A,

Ferrigno O, Aberdam D, 2018, Modeling of Aniridia-Related Keratopathy by

CRISPR/Cas9 Genome Editing of Human Limbal Epithelial Cells and Rescue by Recombinant PAX6 Protein, Stem Cells, 36(9), pp.1421-1429.

81. Phạm Thị Chi Lan (2008), “Nhận xét 30 trường hợp tật không mống mắt

từ 2000 - 2007 tại BV. Mắt TP.HCM”, Hội nghị Nhãn khoa toàn quốc Việt nam tại TP.HCM 11-13/9/2008

82. Lê Đỗ Thuỳ Lan và cộng sự, 2010, “Khảo sát tỷ lệ dị tật bẩm sinh mắt tại

Bệnh viện mắt thành phố Hồ Chí Minh và tuyến cơ sở”, Y học thực hành, 11,

pp 45-51.

83. Vũ Thị Bích Thuỷ, Trần Thu Hà, 2010, Nhân một trường hợp glôcôm

bẩm sinh không có mống mắt, Tạp chí nhãn khoa Việt Nam, 19, pp 49-51.