Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Vai trò của Auxin trong sự phát sinh hình thái rễ bất định In Vitro từ khúc cắt thân cây đậu Vigna Angularis (Willd.) Ohwi Et Ohashi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Hồ Dịu Thắm

VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH

HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC

CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS

( WILLD.) OHWI ET OHASHI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC

CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS

( WILLD.) OHWI ET OHASHI

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm : 60 42 30 Mã số

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. BÙI TRANG VIỆT TS. LÊ THỊ TRUNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

LỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn sinh lí thực vật của trường Đại học Khoa học Tự

nhiên và Đại học Sư phạm- Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn và giúp đỡ của Quý Thầy Cô. Để

hoàn thành luận văn này, em chân thành gởi lời cảm ơn đến:

Thầy hướng dẫn PGS. TS. Bùi Trang Việt đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều

kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian làm luận văn.

Cô hướng dẫn TS. Lê Thị Trung đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cũng

như tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện các thí nghiệm cho luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn cô TS. Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS. Trần Thị Thanh Thủy, cô TS. Trần

Thị Cúc, cô TS. Nguyễn Thị Mong, thầy TS. Phạm Văn Ngọt, thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ đã giảng

dạy trong suốt thời gian em học tập tại trường.

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô ở Bộ môn sinh lí thực vật trường ĐHKHTN: cô TS. Trần Thanh

Hương, Thầy ThS. Phan Ngô Hoang, cô ThS. Trịnh Thị Cẩm Tú, cô ThS. Trần Thanh Hiền và em

Hồ Thị Mỹ Linh quản lí phòng thí nghiệm trường ĐHSP đã cho em mượn dụng cụ và hóa chất để

thực hiện thí nghiệm.

Cảm ơn BGH trường THPT Nguyễn Văn Linh dã giúp đỡ để tôi có thời gian hoàn thành chương

trình học.

Xin gởi lời cảm ơn đến các bạn lớp sinh học thực nghiệm khóa 19, khóa 20, các bạn bè đồng nghiệp

và các em sinh viên ở phòng bộ môn sinh lí thực vật.

Cuối cùng, con xin nói lời cảm ơn vô hạn với bố mẹ, người đã cố gắng nuôi dưỡng và dạy dỗ để con

có thể được học tập và trưởng thành. Chị và Nhiên ơi cho em bày tỏ lòng biết ơn tới hai người nhé,

đã có những hi sinh nhất định để em có thể thực hiện ước mơ làm cô giáo. Cảm ơn bé Trinh đã nấu

cơm cho chị trong suốt năm qua. Cảm ơn anh luôn ở bên em, yêu thương và chia sẽ với em trong

cuộc sống.

Tp. HCM, tháng 8 năm 2011

Nguyễn Hồ Dịu Thắm

MỤC LỤC

4TLỜI CẢM ƠN4T ...................................................................................................................... 3

4TMỤC LỤC4T ............................................................................................................................ 4

4TDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT4T .................................................................................. 7

4TLỜI MỞ ĐẦU4T ...................................................................................................................... 1

4TCHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU4T ............................................................................. 2

4T1. 1. Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4T .............................................................. 2

4T1. 1.1. Phân loại4T ................................................................................................................................... 2

4T1. 1. 2. Đặc điểm sinh học4T .................................................................................................................... 2

4T1. 1. 3. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới4T............................................................. 4

4T1. 1. 4. Thành phần hóa học4T ................................................................................................................. 4

4T1. 1. 5. Giá trị thực phẩm và giá trị dược liệu4T ....................................................................................... 4

4T1. 1. 6. Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4T ................................................... 5

4T1.2. Sự phát sinh hình thái4T ........................................................................................................................ 6

4T1. 2. 1. Định nghĩa 4T ............................................................................................................................... 6

4T1. 2. 2. Phương pháp nghiên cứu4T .......................................................................................................... 6

4T1. 2. 3. Sự phát sinh rễ4T ......................................................................................................................... 7

4T1. 3. Vai trò các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái4T ....................................... 9

4T1. 3. 1. Vai trò của auxin trong sự tăng trưởng thực vật 4T ....................................................................... 9

4T1. 3. 1. 1. Sinh tổng hợp và vận chuyển auxin4T .................................................................................. 9

4T1. 3. 1. 2. Auxin trong sự phát triển rễ4T .......................................................................................... 10

4T1. 3. 1. 3. Auxin trong sự sinh trưởng, phân chia và phân hóa tế bào 4T.............................................. 11

4T1. 3. 2. Vai trò của giberelin trong sự tăng trưởng thực vật 4T ................................................................ 11

4T1. 3. 2. 1. Sự phát hiện4T ................................................................................................................... 11

4T1. 3. 2. 2. Nơi tổng hợp và di chuyển4T ............................................................................................. 12

4T1. 3. 2. 3. Tác dụng sinh lí4T ............................................................................................................. 12

4T1. 3. 3. Vai trò của Citokinin trong sự tăng trưởng thực vật 4T .............................................................. 13

4T1. 3. 3. 1. Sự phát hiện4T ................................................................................................................... 13

4T1. 3. 3. 2. Nơi tổng hợp4T ................................................................................................................. 13

4T1. 3. 3. 3. Tác dụng sinh lí4T ............................................................................................................. 13

4T1. 3. 4. Vai trò của axit abcisic (AAB)4T ............................................................................................... 14

4T1. 3. 5. Vai trò của Etilen4T ................................................................................................................... 15

4TCHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP 4T .................................................................... 16

4T2.1. Vật liệu4T ........................................................................................................................................... 16

4T2. 2. Phương pháp4T .................................................................................................................................. 16

4T2. 2. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 16

4T2. 2. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro 4T .............................................................................................. 17

4T2. 2. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro4T ......................... 17

4T2. 2. 4. Khảo sát ảnh hưởng của auxin trong sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis4T........................................................................................................................... 17

4T2. 2. 5. Ảnh hưởng của auxin lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis4T ................................................................................................................................. 18

4T2. 2. 6. Ảnh hưởng của auxin ở các nồng độ cao lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis4T ...................................................................................................... 18

4T2. 2. 7. Khảo sát sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin4T ........................................................................................................................................... 19

4T2. 2. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4T .................................... 19

4T2. 2. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây Vigna angularis 7 ngày tuổi4T .......................................................................................................................................................... 19

4T2. 2. 10. Đo cường độ hô hấp4T ............................................................................................................. 19

4T2. 2. 11. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 4T ............................................................. 19

4T2. 2. 12. Xử lý thống kết quả thu được4T ............................................................................................... 20

4TCHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN4T ......................................................................... 21

4T3.1. Kết quả4T ............................................................................................................................................ 21

4T3. 1. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 21

4T3. 1. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro 4T .............................................................................................. 21

4T3. 1. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên chiều cao và khả năng tạo rễ của cây con in vitro 4T ..... 23

4T3. 1. 4. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis4T........................................................................................................................... 25

4T3. 1. 5. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi. 4T .............................................................................................................. 30

4T3. 1. 6. Ảnh hưởng của auxin ở nồng độ cao lên sự phát sinh rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi. 4T .............................................................................................................. 35

4T3. 1. 7. Khảo sát sự hình thành rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi theo thời gian dưới ảnh hưởng của cùng nồng độ auxin. 4T ..................................................................... 37

4T3. 1. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4T .................................... 38

4T3. 1. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây đậu Vigna angularis 4T .......... 39

4T3. 1. 10. Sự thay đổi cường độ hô hấp và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở cây Vigna angularis4T ............................................................ 40

4T3. 2. Thảo luận4T ....................................................................................................................................... 41

4T3. 2. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 41

4T3. 2. 2. Ảnh hưởng của AIA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro 4T ...................................... 41

4T3. 2. 3. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn hình thành và phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp4T ....................................................................................................................................... 42

4T3. 2. 4. Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin 5mg/l4T ................................................................................................................................................. 44

4T3. 2. 5. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin4T ............................................................................... 44

4T3. 2. 6. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao cây và diện tích lá4T ............................................. 44

4T3. 2. 7. Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển rễ bất định4T ......................................................................................................................................... 45

4TCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4T ......................................................................... 46

4T4.1. Kết luận4T ........................................................................................................................................... 46

4T4. 2. Đề nghị4T .......................................................................................................................................... 46

4TTÀI LIỆU THAM KHẢO4T ................................................................................................. 47

4TPHỤ LỤC4T ............................................................................................................................. 1

4TPHỤ LỤC 14T .......................................................................................................................... 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA : Abscisic acid.

BA : Benzyl adenin.

R: Gibberellin.

CĐHTTTV : chất điều hòa tăng trưởng thực vật.

GAR3

IAA : Indole-3-acetic acid.

MS : Murashige và Skoog.

TLT : trọng lượng tươi.

LỜI MỞ ĐẦU

Ngay từ giai đoạn đầu khi con người biết trồng trọt, họ đã có ý thức chọn lọc các cây trồng

mang những đặc tính có lợi cho con người. Quá trình chọn lọc như thế phải mất nhiều thời gian,

hàng chục hoặc hàng trăm năm nhưng không mang lại hiệu quả cao. Đến đầu thế kỉ XX, sinh học

đạt được nhiều thành tựu lớn như khám phá ra định luật di truyền Mendel, hiện tượng di truyền liên

kết của Morgan và những nghiên cứu khác nữa, nhờ đó tạo ra cây trồng mang biến dị tổ hợp của

nhiều gen có lợi. Và rồi kĩ thuật gây đột biến ra đời đã góp phần tạo ra nhiều giống mới có các đặc

tính quý.

Ngày nay chất lượng cuộc sống gia tăng, thị hiếu con người phong phú, nhu cầu về lương

thực, thực phẩm lớn. Làm sao nhân nhanh nhiều giống hay tạo ra nhiều giống mới nhằm đáp ứng thị

hiếu và nhu cầu con người là vấn đề lớn đặt ra cho các nhà chọn lọc và tạo giống vật nuôi và cây

trồng.

Phát sinh hình thái là cơ sở cho vi nhân giống thực vật nên rất được thế giới và nước ta quan

tâm. Việc phát hiện auxin là chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã mở ra cho những nghiên cứu

trồng trọt đầy hấp dẫn. Auxin kích thích khúc cắt hình thành rễ bất định là bước đột phá lớn cho

nhân giống thực vật ( Environ, 2007 ).

Đề tài “Vai trò của auxin trong sự phát sự phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt

thân cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi” được thực hiện nhằm tìm hiểu về các giai

đoạn phát triển rễ bất định in vitro ở cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi dưới ảnh

hưởng của auxin để bổ sung kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu và giảng dạy.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. 1. Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi

1. 1.1. Phân loại

Giới : Plantae

Ngành : Angiospermae

Lớp : Dicotiledoneae

Bộ : Fabales

Họ : Fabaceae

Chi : Vigna

Loài : Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi

(Phạm Hoàng Hộ, 1999).

1. 1. 2. Đặc điểm sinh học

Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi là cỏ nhất niên, thân đứng hay leo, cao 50 đến 80

cm, nhánh có cạnh, có lông dài. Bộ nhiễm sắc thể 2n = 22. Cuống 10 đến 12 cm, có lông, lá phụ

xoan, đầu tròn, có thùy, dài 6 đến 8 cm, gân phụ 4 đến 5 cặp, lá bẹ thon, hình lọng, cao 8 mm.

Chùm ở nách lá, dài 3 đến 10 cm, đài 5 răng ngắn; vành vàng, cao 15 mm, lườn xoắn 360 ( Phạm

Hoàng Hộ, 1999 ). Hoa có màu vàng nhạt với những cánh hoa màu vàng chanh xếp thành từng cặp.

Quả hình trụ, dài 5 đến 8cm, rộng 8 đến 10mm, không có lông, chứa 6 đến 10 hạt. Hạt có hình

thuôn, hai đầu vuông, không có lông, dài 4 đến 7mm , đường kính 5mm, màu nâu sẫm ( Hu, 2005 )

PC nhưng tốt nhất là 30 đến

0 và độ ẩm không khí 15%. Hạt nẩy mầm trên đất ở nhiệt độ 6 đến 10 P

0 34 P

PC. Sau khi trỉa 7 đến 20 ngày cây mầm mới nhô lên khỏi mặt đất. So với các đậu khác, Vigna

Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi có thể được giữ ít nhất 5 năm nếu độ ẩm hạt là 13%

angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi phát triển rất chậm nên cần làm sạch cỏ giữa giai đoạn nảy mầm

và ra hoa (Brink và Belay, 2006).

Hình 1.1. Một số bộ phận chính của cây : a. nhánh; b. hoa;

c.đài; d. nhụy; e. nhị; f.quả; g. hạt (Nguồn: Hu, 2005).

Hoa kéo dài 30 đến 40 ngày. Cây tự thụ phấn nhưng vẫn có thể xảy ra thụ phấn chéo. Thời

gian sinh trưởng khoảng 60, 80, 90 hoặc120 ngày. Rễ cây cộng sinh với vi khuẩn Bradyrhizobium

nên có khả năng cố định N hơn 100kg N/ ha, con số này còn phụ thuộc vào độ ẩm và pH của đất

(Brink và Belay, 2006).

0 bình hằng năm 500 đến 1750 mm, và nhiệt độ từ 15 đến 30P

PC. Cây có thể chịu được nhiệt độ cao

Vigna angularis sống tốt nhất ở vùng có khí hậu ấm áp và cận nhiệt đới với lượng mưa trung

nhưng rất nhạy cảm với sương mù. Ở nhiệt đới, Vigna angularis thích hợp ở vùng cao và độ pH của

đất từ 5 đến 7,5 (Brink và Belay, 2006).

Ở Trung Quốc, Vigna angularis thường được trồng xen với ngô hoặc kê, còn ở Nhật thì luân

canh xen vụ với khoai tây, củ từ hay lúa mì. Vigna angularis thường bị nhiễm bệnh do nấm, vi

khuẩn hay do côn trùng tấn công như Erysiphe polygoni, Xanthomonas campestris, Matsumuraeses

phaseoli …

Quả đậu không dễ vỡ nên người ta có thể thu hoạch bằng máy gặt. Thông thường, người ta

cắt bằng tay sau đó phơi nhiều ngày trước khi xếp thành đống khô. Khi độ ẩm hạt còn 16% thì tiến

hành đập. Nhiều trái đậu có vỏ mỏng, hạt lại ẩm ướt nên đã nảy mầm bên trong vỏ quả. Sản lượng

hạt thu hoạch trên một ha có thể đạt đến 3500kg. Ở Kenya, người ta trồng thí nghiệm và đã thu

được khoảng 500 đến 600 kg trên ha (Brink và Belay, 2006).

1. 1. 3. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới

Vigna angularis được trồng ở vùng châu Á nhưng nguồn gốc của nó thì chưa được biết

2TViệc thuần hóa 2TVigna angularis 2Tđược biết tới từ thời xa xưa ở Hàn Quốc2T, Trung Quốc và

(Ohashi và Tahashahi, 1981).

Nhật, sau đó 2Tcây trồng này 2Tđược giới thiệu tới nhiều quốc gia khác trên thế giới. Tại Châu phi,

Vigna angularis được trồng thí nghiệm ở Congo, Kenya và Angola. Khó có thể ghi lại số liệu sản

lượng đậu Vigna angularis trên toàn thế giới vì nó được thống kê cùng với các loại đậu khác: Trung

Quốc (470,000 ha), Nhật (60,000 ha), Hàn Quốc (25,000 ha) và Đài Loan (15,000 ha). Từ 1996 đến

2000, Nhật sản xuất hằng năm từ 70000 đến 90000 tấn, trong đó khoảng 80 đến 85% sản lượng này

được thu hoạch từ phía bắc quần đảo Hokkaido5T. 5T Tuy nhiên, mỗi năm Nhật Bản tiêu thụ 140.000 tấn

nên phải nhập khẩu đậu từ các quốc gia như Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan và Canada. Vào những năm

của thập niên 90, Trung Quốc hằng năm xuất khẩu trung bình 20.000 đến 40.000 tấn. Gần đây,

Trung Quốc và Úc đã hợp tác nghiên cứu về việc sản xuất Vigna angularis. Hạt và bột làm từ hạt là

hai thứ hàng hóa quan trọng trong các chợ phương đông (5TSingh và Jauhar, 2005;5T Brink và Belay,

2006). Ở nước ta, trồng lấy hột ở Nha Trang, Sài Gòn (Phạm Hoàng Hộ, 1999).

1. 1. 4. Thành phần hóa học

Hạt đậu Vigna angularis có vị ngọt. 100 g hạt đậu chứa: nước 13,4 g; năng lượng 1377 kJ;

protein 19,9 g; chất béo 0,5 g; carbohydrat 62,9 g; chất xơ 12,7 g; Ca 66 mg; Mg 127 mg; P 381 mg;

Fe 5,0 mg; Zn 5,0 mg; vitamin A 17 IU; thiamin 0,46 mg; riboflavin 0,22 mg; niacin 2,6 mg,

vitamin B R6 R 0,35 mg; folat 622 μg. Ngoài ra, hạt đậu này còn có các axit amin không thay thế:

tryptophan 191 mg; lysin 1497 mg; methionin 210 mg; phenylalanin 1052 mg; threonin 674 mg;

valin 1023 mg; leucin 1668 mg và isoleucin 791 mg; và hứa các axit béo như axit linoleic 113 mg

và axit oleic 50 mg (Brink và Belay, 2006).

1. 1. 5. Giá trị thực phẩm và giá trị dược liệu

Hạt đậu khô có thể nấu chín để ăn hay làm thành bột dùng cho các món súp, các loại bánh và

kem. Việc sử dụng đậu Vigna angularis gắn liền với nền văn hóa của quốc gia. Người Nhật có quan

niệm Vigna angularis biểu hiện của sự thành công và may mắn. Vì thế, Ở Trung Quốc, Đài Loan,

Hàn Quốc và Nhật, vào những dịp chúc mừng hạnh phúc như sinh nhật, đám cưới, kì thi… Vigna

angularis được nấu chung với nếp để ăn. Người Nhật còn xem Vigna angularis là thành phần quan

trọng trong những món ăn truyền thống như bánh bao, bột đậu trộn với agar để làm món tráng

miệng. Ở Trung Quốc, bột đậu trộn với bột mì để làm sợi mì. Ở Nepal, người ta còn lấy những trái

còn non và cây mầm giá để làm rau cải (Singh and Jauhar 5T, 2005)5T.

Ngoài ra, hạt Vigna angularis rang lên có thể được dùng để thay thế cho cà phê hay tẩm

đường để ăn. Thân cây có thể dùng làm thức ăn cho gia súc hay làm phân bón cho đất. Đặc biệt, bột

đậu còn thể dùng để sản xuất dầu gội, kem dưỡng da mặt hay là thành phần trong môi trường nuôi

cấy. Người Trung Quốc còn biết sử dụng hạt đậu Vigna angularis để chữa các bệnh về thận, chứng

táo bón, khối u, xảy thai, không tiết sữa, sự lưu thông máu, lợi tiểu... Lá đậu có tác dụng hạ sốt, còn

cây mầm ngăn chặn sự xảy thai do bị thương ( Brink và Belay, 2006).

Ở Việt Nam, tuy không được dùng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, Vigna angularis được

các thầy thuốc Đông y coi là một vị thuốc dễ sử dụng và an toàn. Vigna angularis có tính mát, giúp

giải nhiệt, chữa chứng suy nhược cơ thể. Rễ đắp trị sưng; hột lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ,

1999).

1. 1. 6. Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi

Vigna angularis là một loại đậu phổ biến nhất ở Nhật, được nghiên cứu về mặt nông học

cũng như thực vật học. Một số tác giả cho rằng phát sinh hình thái phấn hoa là một trong những

điểm phân biệt đáng chú ý giữa chi Phaseolus và chi Vigna ((Ohashi và Tahashahi, 1981; Merechal

et al., 1978).

Để tăng khả năng kháng thuốc diệt cỏ, các gen hpt, gfp và phosphinothricin bar được chuyển

vào Vigna angularis nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Mutasim et al., 2004).

Một nhóm nhà khoa học phát hiện dịch chiết từ vỏ hạt Vigna angularis có chứa các

proanthocyanidin và chất xơ nên có thể chống oxi hóa, chống chứng tăng huyết áp và chữa trị thận

hư (Sato et al., 2009).

Nhóm nhà khoa học người Úc đã nghiên cứu hiệu quả thời gian và các điều kiện cất giữ tác

0 nên bảo quản ở 10 P

PC, độ ẩm 65% (Yousif et al., 2002).

động đến tinh bột, protein, độ cứng và chất lượng hạt khi nấu. Để giữ được chất lượng đậu, tốt nhất

1.2. Sự phát sinh hình thái

1. 2. 1. Định nghĩa

Phát sinh hình thái là thuật ngữ được dùng để chỉ những thay đổi của cơ thể thực vật theo

thời gian để hoàn thành chu trình phát triển ( Bùi Trang Việt, 2003 ).

Phát sinh hình thái ở thực vật bao gồm các quá trình:

- Phát sinh mô ( Histogenesis )

- Phát sinh cơ quan (Organogenesis)

- Phát sinh phôi ( Embryogenesis )

Phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình cơ bản: sự điều hòa hướng kéo dài tế bào

và sự kiểm soát vị trí và hướng mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế

bào riêng rẽ quyết đinh hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật ( Bùi Trang Việt, 2003 ).

1. 2. 2. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sự phát sinh hình thái in vitro dẫn tới nhiều ứng dụng của sinh học thực vật cho

các nghiên cứu về thực vật học, sinh hóa học, vi nhân giống và phát triển cây trồng chuyển gen (

transgenic crops ) ( Lund et al., 2008; Mironova et al., 2010; Phillips, 2008 ).

Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của sinh học. Nhiều

nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc thực vật mà cần phải tìm

hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trong các biến đổi hình thái và cấu trúc. Do đó,

không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh

của nó. Những kĩ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào

học và di truyền học đều có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái ( Bùi Trang Việt,

2000 ).

Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng nhất là:

- Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó.

- Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể

thực vật.

Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành do kích thước

quá bé nhỏ của các loại mô cấy, nên sự áp dụng các hormon thực vật ngoại sinh là cách hữu hiệu về

sự phát sinh hình thái ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

1. 2. 3. Sự phát sinh rễ

Rễ mầm được phát triển từ sinh mô chóp (tiền sinh mô). Sinh mô này có một hoạt tính đặc

biệt có thể riêng cho từng loài thực vật. Về nguồn gốc của rễ có thể có hai cách giải thích:

- Do ba tế bào nguyên thủy tạo ra: một sẽ tạo ra vùng trục trung tâm, một sẽ tạo ra vùng vỏ,

một sẽ tạo ra vùng chóp. Có thể mỗi vùng có tế bào nguyên thủy riêng.

- Chóp rễ và vỏ tạo thành một nhóm không phân biệt có thể vì tế bào nguyên thủy chung cho

cả ba vùng.

Vì rễ thường khởi đầu từ trong trụ nên rễ thường được cho là có nguồn gốc nội sinh. Tuy

nhiên, ở Cardamine pratensis, các thay đổi xảy ra ở vùng tế bào nằm phía ngoài vùng trụ. Đây là

trường hợp rễ có nguồn gốc ngoại sinh.

Sau khi thoát ra khỏi vỏ hạt và tăng trưởng, rễ sẽ phát triển và tạo rễ nhánh và rễ phụ. Sự

phát triển đó gồm một loại phản ứng phân hóa. Rễ nhánh xuất hiện trên rễ chính, cơ chế giống rễ bất

định. Sự tạo rễ bất định là một bước ngoặc quan trọng sự nhân giống vô tính những cây gỗ quý,

những cây lương thực, thực phẩm.

Rễ bất định là những rễ thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều vùng trên cơ

thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá, thực vật cấp thấp nhưng có mạch; đơn tử diệp hay song tử diệp

nhân giống bằng giò, dây leo hay thủy thực vật hoặc những thực vật sống bám vào cây chủ. Hiện

tượng hình thái giải phẫu thực vật có thể chung cho hai cơ quan rễ nhánh hoặc rễ bất định ( Mai

Trần Ngọc Tiếng, 2001).

Rễ bất định có thể mọc ra từ mô của thân trong điều kiên môi trường stress hay bị vết thương

cơ học hoặc trong môi trường tái sinh chồi. Có ít nhất hai con đường hình thành rễ bất định: từ

những tế bào có khả năng tạo cơ quan như tế bào tượng tầng hay từ mô sẹo ( Pop et al., 2011 ).

Sự hình thành rễ bất định được điều hòa bởi nhiều nhân tố môi trường và các yếu tố nội sinh

( Sorin et al., 2005 ). Các tác giả cho rằng sự cân bằng chất hoạt hóa và chất ức chế phiên mã Auxin

Response Factor ( ARF ) điều khiển sự tượng rễ bất định (Gutierrez et al., 2009 ). Auxin và etilen

được xem là hormon kích thích sự hình thành rễ bất định trong khi cytokinin và gibberelin thì ngược

lại (Pop et al., 2011).

Sự hình thành rễ bất định của cành chiết, cành giâm chia làm ba giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu là sự tái phân chia của mô phân sinh bên (tầng phát sinh) tức là một số tế

bào xảy ra sự phản phân hóa mạnh ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm

mống của rễ ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ).

Giai đoạn khử phân hóa tế bào xảy ra như sau: lúc ban đầu không bào còn to, lạp thể và ti thể

phân cắt mạnh, càng lúc càng nhỏ, tế bào trở nên giống như tế bào mô phân sinh cấp hai; sau đó tế

bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân và hạch nhân to ra. Sau giai đoạn hoạt hóa này, tế

bào có đặc tính của tế bào vùng mô phân sinh cấp một có khả năng sinh cơ quan. Tiếp theo, các tế

bào có sự phát triển mạnh hoạt tính phân chia tế bào để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ. Sự phân

chia tăng lên tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa các tế bào mô phân sinh cấp một (

Bùi Trang Việt, 2003 ).

+ Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn xuất hiện mầm rễ.

+ Giai đoạn cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ thoát khỏi vỏ ra ngoài tạo nên rễ

bất định ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ).

A

B

Hình 1.2. Sự hình thành và phát triển rễ. A: Sự hình thành sơ khởi rễ; B: Sơ khởi rễ và rễ kéo dài (

Nguồn: Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001 ).

1. 3. Vai trò các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái

Mở đầu thực sự cho các nghiên cứu về hormon tăng thực vật được đánh dấu bởi các thí

nghiệm của Darwin ( 1880 ) về hiệu ứng của ánh sáng trên sự cong của diệp tiêu Avena và sự phát

hiện của Went (1928 ) về vai trò kích thích sự kéo dài tế bào của auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

Hormon là thuật ngữ do các nhà sinh lí học động vật Bayliss và Starling gọi vào năm 1904.

Dựa vào định nghĩa hormon động vật, ta có định nghĩa: “hormon thực vật là một chất hữu cơ do tế

bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển tới một nơi khác, ở đó, với nồng

độ thấp, chất ấy gây ra một phản ứng sinh lý”.

Song song với các hormon được tổng hợp trong cơ thể thực vật, ngày nay bằng con đường

hóa học con người đã tổng hợp nên hàng loạt các chất khác nhau có hoạt tính sinh lí tương tự và đã

có những ứng dụng rất rộng rãi trong nông nghiệp (Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ).

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật không phải là các chất dinh dưỡng, các vitamin hay

những nguyên tố khoáng thiết yếu cho thực vật (Bùi Trang Việt, 2000 ) nhưng nó là thành phần

quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này, các nhà nghiên cứu có thể chủ

động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực vật in vitro (Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ).

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo mối quan hệ

hài hòa giữa các cơ quan, bộ phận trong cơ thể điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và

các hoạt động sinh lí của thực vật ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có

thể tác động đến thực vật một cách trực tiếp ( sự phân chia tế bào, sự tăng trưởng tế bào) hay gián

tiếp ( tương tác với các hormon hoặc các phân tử khác ) (Pop et al., 2011). Hai nhóm chất được sử

dụng rộng rãi là auxin và citokinin (Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ).

1. 3. 1. Vai trò của auxin trong sự tăng trưởng thực vật

Auxin là một hợp chất tương đối đơn giản: acid indol-3-acetic ( IAA). Các chất có cấu trúc

gần giống IAA là dẫn xuất hay tiền chất của IAA, và có cùng vai trò với IAA trong vài cơ quan đều

được gọi là auxin theo nghĩa rộng.

1. 3. 1. 1. Sinh tổng hợp và vận chuyển auxin

Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non, từ

tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng. Sau đó auxin di chuyển xuống rễ và

tích tụ trong rễ. Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của auxin có vai trò trong việc

thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan (

Bùi Trang Việt, 1998; Berleth và cs, 2001).

Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được

nhìn rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển vận này, chúng bị thoái

hóa bởi auxin – oxydase, điều này cho thấy các nồng độ auxin luôn cao hơn gần với những nơi tổng

hợp ra chúng. Như vậy auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở

phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào ( Dương Công Kiên, 2002 ).

Auxin được tổng hợp thường không ở dạng tự do mà ở dạng liên kết với một acid amin hay

glucid. Các dạng liên kết này không có hoạt tính auxin mà ở dạng dự trữ và vận chuyển của auxin (

Bùi Trang Việt, 2000 ).

Sự di chuyển hữu cực từ ngọn tới gốc cần năng lượng, tùy thuộc vào sự định hướng của mô,

ít chịu ảnh hưởng của trọng lực, rất chậm, thường xảy ra trong các tế bào nhu mô bao quanh bó

mạch của thân và trong mọi tế bào diệp tiêu ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

1. 3. 1. 2. Auxin trong sự phát triển rễ

Auxin đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái. Đặc tính di chuyển và hiệu

ứng theo nồng độ của auxin quyết định chiều hướng và tính hữu cực trong sự phát sinh cơ quan

(Sachs, 1993). Từ khi auxin lần đầu được mô tả, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy sự liên hệ chặt chẽ

giữa auxin với sự phát triển rễ (Overvoorde et al., 2010). Auxin giúp sự kéo dài tế bào, sự phân

chia, sự phát triển và duy trì mô phân sinh ngọn rễ (Mironova et al., 2010).

Một trong những hiệu ứng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào đã được chứng

thực từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann) là khả năng phát sinh rễ. Hiệu ứng đó tạo nên một trong

các ứng dụng quan trọng của auxin hoặc các chất gần giống auxin, là cơ sở của tất cả các sản phẩm

thương mại (bột nhão hay dung dịch ) nhằm xúc tiến sự giâm cành (Nguyễn Như Khanh, 2007).

Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ ( phát thể non của rễ ), nhưng ngăn cản sự

tăng trưởng của các sơ khởi này. Đặc tính này được ứng dụng phổ biến trong giâm cành, hiện tượng

được chứng minh bao gồm ít ra là hai giai đoạn: tạo sơ khởi và kéo dài sơ khởi này (Mai Trần Ngọc

Tiếng và các cs, 1980). Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin ( như thiamin mà rễ

không tổng hợp được), axit amin (như arginin) và nhất là các hợp chất ortho- diphenolic ( như axit

cafeic, axit chlorogenic) (Bùi Trang Việt, 2000).

Vai trò của auxin cho sự phân hóa rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô. Trong môi trường chỉ

có auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất hiện rễ mà thôi. Vì vậy trong kĩ thuật nhân giống vô tính thì việc

sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kì quan trọng và bắt buộc ( Vũ Văn Vụ, 1999).

Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng auxin cảm ứng sự tượng rễ bất định (adventitious root

initiation) ở các khúc thân in vitro với các nồng độ auxin khác nhau ( Lund et al., 2008; Mironova

et al., 2010; Sorin et al., 2005). Cùng với bản chất, nồng độ và khuynh độ của auxin (auxin

gradients) giải thích được phần nào về sự tạo rễ bất định ở mức phân tử (Gutierrez et al. 2009).

Những thay đổi nồng độ auxin nội sinh liên quan với những giai đoạn sinh lí của rễ, nồng độ

auxin nội sinh cao thường ứng với giai đoạn hình thành sơ khởi rễ (Caboni et al., 1997). Khi xử lí

auxin ngoại sinh trên khúc cắt, nồng độ auxin nội sinh đạt tới đỉnh cao trùng với thời điểm tạo sơ

khởi rễ (Pop et al., 2011).

-10

Điều đáng lưu ý là việc sử dụng auxin có hiệu quả ức chế ngay ở nồng độ thấp đối với hệ rễ.

P –

-12

Đối với rễ, auxin có tác dụng kích thích ở nồng độ thấp khoảng 10 P

-6 P M; ở thân nồng độ cao hơn 10P

-7 P – 10P

P M. Trong các auxin thì NAA và IBA là hai loại được sử

10P

dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy mô. IAA ít được dùng hơn vì ít bền trong khi hấp khử trùng

môi trường (Võ Thị Bạch Mai, 2004 ).

1. 3. 1. 3. Auxin trong sự sinh trưởng, phân chia và phân hóa tế bào

Auxin có ảnh hưởng quan trọng trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái thực vật. Auxin

cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào thực vật ( Bùi Trang Việt, 2000).

Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình

ra ( Vũ Văn Vụ, 2008 ). Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài

dưới ngọn của thân. Sự kéo dài tế bào rễ cần nồng độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân. Ở nồng độ

cao, auxin kích thích sự tạo mô sẹo từ các tế bào sống. Đặc tính này được áp dụng trong nuôi cấy tế

bào ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng ( tầng phát sinh libe- mộc ) đồng

thời giúp sự phân hóa của mô dẫn (libe- mạch mộc), nhưng hầu như không tác động trên mô phân

sinh sơ cấp. Như vậy auxin tác động trên sự tăng trưởng theo đường kính ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

1. 3. 2. Vai trò của giberelin trong sự tăng trưởng thực vật

1. 3. 2. 1. Sự phát hiện

Năm 1926 Kurosawa (Nhật) phát hiện chất trích nấm Gibbrella fujikuroi gây bệnh lúa von.

Năm 1938 Yabuta và Sumili cô lập từ Gibbrella một hỗn hợp mà họ gọi là giberelin nhưng chưa rõ

bản chất (Bùi Trang Việt, 2000). Năm 2003, 126 loại GA khác nhau với vòng gibban cơ bản được

tìm thấy ở thực vật và nấm. Giberelin là một nhóm lớn, đó là các giberelin ARx R hay GRxR theo thứ tự

khám phá (Võ Thị Bạch Mai, 2004).

1. 3. 2. 2. Nơi tổng hợp và di chuyển

Axit mevalonic là chất khởi đầu tổng hợp giberelin. Trong cây, giberelin ở dạng tự do hoặc

dạng liên kết với các chất khác (glucose, protein…). Giberelin được tổng hợp trong lá non, phôi, rễ

non, quả non và được tổng hợp mạnh trong lục lạp.

Giberelin được chuyển từ mạch mộc qua libe nhờ liên hệ giữa hai hệ thống. Giberelin đi qua

các mạch nhờ những tế bào tia lõi. Giberelin di chuyển nhờ sự thoát hơi nước. Trong cây bị cắt đứt

ngọn, giberelin sẽ được đẩy theo ảnh hưởng sức đẩy của rễ ( Mai Trần Ngọc Tiếng , 2001 ).

1. 3. 2. 3. Tác dụng sinh lí

Giberelin kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia nhân tế bào thân.

Giberelin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì. Giberelin liều cao kích thích

mạnh sự tăng trưởng lá. Trên lá yến mạch hay diệp tiêu lúa, giberelin chỉ có vai trò làm tăng hiệu

ứng auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

Giberelin ảnh hưởng rất rõ rệt lên sự sinh trưởng của các dạng đột biến lùn. Ảnh hưởng đặc

trưng của giberelin lên sự ra hoa là kích thích sự sinh trưởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa.

Trong sự biểu hiện phái tính của hoa, giberelin ức chế phát triển hoa cái (Vũ Văn Vụ và cs, 2008),

kích thích sự tạo hoa đực ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật, giberelin làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự

tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi xoma. Ở mô sẹo thuốc lá, GAR3 R đặc biệt có tác dụng cản sự

tạo chồi khi nó có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng và cản mạnh hơn khi mẫu cấy

được nuôi trong tối. Thông thường GAR3 R có tác dụng cản sự ra rễ và khi xử lí cành giâm với GAR3 R ở

nồng độ cao (1-10mg/l) ở ngay vị trí đáy cành giâm thì cành này sẽ không tạo được rễ (Nguyễn

Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

Ở một số loài thực vật, xử lí GAR3 R trước khi chuyển cành giâm vào môi trường ra rễ sẽ làm

tăng sự tạo rễ. Tác dụng làm tăng sự ra rễ xảy ra một cách mạnh mẽ khi xử lí acid giberelic ngay khi

sự xuất hiện rễ bắt đầu, nhưng chỉ sau một thời gian ngắn sau đó thì acid giberelic lại có tác dụng

cản (Nguyễn Đức Lượng- Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

Trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và tạo lại các dòng cây sạch bệnh, ích lợi của việc thêm kích

thích tố giberelin vào môi trường nuôi cấy đã được kiểm tra bởi Pennazio và Redolfi (1974), hai tác

giả này đã quan sát thấy việc gia tăng sự hồi phục của cây nuôi cấy lên đến 49% so với các cây đối

chứng trong môi trường lỏng (Dương Công Kiên, 2002 ).

Nồng độ giberelin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy khoảng từ 0,1 đến 10 ppm,

thường dùng dưới dạng acid giberelic (GAR3 R) (Võ Thị Bạch Mai, 2004).

1. 3. 3. Vai trò của Citokinin trong sự tăng trưởng thực vật

1. 3. 3. 1. Sự phát hiện

Năm 1938 Bonner trích từ trái đậu một chất làm tăng trưởng tế bào của trái này và được gọi

là citokinin. Năm 1955 Miller và Skoog chiết xuất từ tinh dịch cá thu chất có khả năng kích thích sự

phân chia tế bào rất mạnh gọi là kinetin. Năm 1963 Letham và Miller chứng minh chất trích từ phôi

nhũ bắp non có cùng hiệu ứng với kinetin, gọi là zeatin. Sau zeatin, hơn 30 citokinin khác nhau

được cô lập. Ngày nay, citokinin chỉ một nhóm chất thiên nhiên hay nhân tạo có đặc tính sinh lý

giống nước dừa hay kinetin (Bùi Trang Việt, 2000).

1. 3. 3. 2. Nơi tổng hợp

Citokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng tương tự như các phytohormon

khác ( Vũ Văn Vụ và cs 2008 ). Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các citokinin tự do

cho cả cơ thể thực vật. Từ rễ, citokinin di chuyển trong mạch mộc để tới chồi ( Bùi Trang Việt,

2000; Kieber, 2002 ), khi rễ bị thương thì có một sự phát triển yếu của nụ vì không tạo đủ citokinin

( Mai Trần Ngọc Tiếng , 2001 ). Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có

khả năng tổng hợp citokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ).

1. 3. 3. 3. Tác dụng sinh lí

Kích thích phân chia tế bào

Citokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Citokinin tác động trên cả hai

bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Có được hiệu quả

này là do citokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp axit nucleic và protein ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008

). Khi nuôi cấy mô nghèo citokinin ( mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu ), auxin kích thích sự nhân đôi

nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

Kích thích tạo cơ quan

Citokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự

phân hóa chồi ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). Citokinin kích thích sự tăng trưởng lá, sự phân hóa mầm.

Citokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm và làm tăng sự nở hoa, tăng sự

tượng hoa ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 )

Citokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều. Chính vì vậy mà từ rễ lên

chồi ngọn thì hiện tượng ưu thế ngọn càng tăng dần tương ứng với sự tăng hàm lượng auxin và giảm

hàm lượng citokinin ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008). Skoog và Miller ( 1965 ) chứng minh khúc cắt lõi

hay mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay chồi tùy theo tỉ lệ auxin/ citokinin ( A/C) trong môi trường nuôi cấy:

A/C cao giúp sự tạo rễ ( thí dụ 2/0,2); A/C thấp giúp tạo chồi (thí dụ 2/0,5) ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

Một tỉ lệ cân bằng giữa hai chất điều hòa trên chỉ tạo khối mô sẹo không phân hóa (Mok và cs,

1994). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ citokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai

đoạn tạo chồi in vitro ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ).

Đôi khi người ta cũng nhận thấy rằng citokinin cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tạo

thành rễ bất định khi không có hiện diện của auxin. Ví dụ, chồi củ cải đường ra rễ trong môi trường

MS có bổ sung kinetin và không có auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

Làm chậm lão hóa

Citokinin làm chậm sự lão hóa ở chỗ là làm tăng sự kích thích hoạt động tổng hợp của protein

và làm chậm sự thoái biến citokinin ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). Dầu không cản hoàn toàn nhưng

citokinin làm chậm rõ rệt sự lão suy lá; lá còn giữ màu lục khi được phun trên cây hay xử lí trực tiếp

trên lá tách rời ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Hiệu quả kìm hãm sự hóa già, kéo dài tuổi thọ của cơ quan

có thể chứng minh là cành giâm ra rễ thì rễ tổng hợp cytokinin nội sinh và kéo dài thời gian sống

của lá lâu hơn. Trên cây nguyên vẹn thì khi hệ thống rễ phát triển mạnh sẽ là lúc cây trẻ và sinh

trưởng mạnh. Nếu hệ thống rễ bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già (Vũ Văn Vụ và cs,

2008). Trong nuôi cấy, nồng độ citokinin được sử dụng khoảng từ 0,1 đến 10 ppm, thường dùng

nhất là 1 đến 2 ppm. Thường dùng phối hợp với auxin, khi dùng ở nồng độ cao thì mẫu cấy có thể

cho ra nhiều chồi con nhưng sự tăng trưởng của từng chồi sẽ bị hạn chế (Võ Thị Bạch Mai, 2004).

Citokinin cảm ứng sự biểu hiện các gen điều hòa bởi ánh sáng (Chen và cs, 1993; Crowell và

cs, 1994) và cây các cây mầm bị hoàng hóa nếu được tăng trưởng trong điều kiện có mặt citokinin

sẽ có kiểu hình như cây mầm tăng trưởng dưới ánh sáng (Chory và cs,1994)

1. 3. 4. Vai trò của axit abcisic (AAB)

Axit abcisic được tổng hợp ở hầu hết các bộ phận của cây như rễ, lá, hoa, quả, hạt, củ và tích

lũy nhiều ở các cơ quan già, các cơ quan đang ngủ nghỉ, cơ quan sắp rụng. Nó được vận chuyển

trong cây không phân cực theo phloem hoặc xilem. Axit abcisic là một chất ức chế sự sinh trưởng

rất mạnh nhưng nó không gây hiệu quả độc khi ở nồng độ cao ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ).

Là chất đối kháng với giberelin, axit abcisic cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của hạt và làm

chậm sự kéo dài lóng (Bùi Trang Việt, 2000). Trong cơ quan đang ngủ nghỉ hàm lượng axit abcisic

tăng gấp 10 lần thời kì dinh dưỡng. Sự ngủ nghỉ kéo dài cho đến khi nào hàm lượng axit abcisic

trong chúng giảm đến mức tối thiểu. Axit abcisic kích thích sự rụng nhưng không phải là chất chủ

yếu (so với etilen và auxin). Axit abcisic đã kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thành tầng

rời ở cuống (Vũ Văn Vụ và cs, 2008).

Axit abcisic được xem như là một hormon của “stress” vì nó được hình thành mạnh để phản

ứng với các “stress” hoặc điều kiện bất thuận của môi trường. Ví dụ: khi cây bị thiếu nước thì hàm

lượng axit abcisic tăng nhanh trong lá, làm khí khổng nhanh chóng đóng lại và giảm ngay sự thoát

hơi nước. Axit abcisic được xem là một hormon của sự hóa già. Mức độ hóa già của cơ quan và của

cây gắn liền với sự tăng hàm lượng axit abcisic trong chúng (Vũ Văn Vụ và cs, 2008).

1. 3. 5. Vai trò của Etilen

Nhiều nghiên cứu xác minh etilen gây nên hai hiệu quả sinh hóa trong quá trình chín của quả:

biến đổi tính thấm của màng dẫn đến sự giải phóng các enzym liên quan đến quá trình chín và kích

thích sự tổng hợp các enzym gây nên các biến đổi sinh hóa trong quá trình chín. Etilen hoạt hóa sự

hình thành tầng rời ở cuống, lá, hoa, quả qua việc kích thích sự tổng hợp các enzym phân hủy thành

tế bào (Vũ Văn Vụ và cs, 2008).

Etilen kích thích sự ra hoa của một số thực vật, chẳng hạn xử lí etilen hoặc các chất có bản

chất tương tự như etilen đã kích thích dứa, xoài ra hoa trái vụ (Vũ Văn Vụ và cs, 2008). Etilen kích

thích sự kéo dài thân cây mầm và sự tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000).

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

- Hạt Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi từ cơ sở sản xuất Xuân Hồng.

- Cây con Vigna angularis in vitro 7 ngày sau sự nảy mầm trên môi trường MS.

0, 6 cm

- Khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp (để nghiên cứu quá trình phát triễn rễ) (ảnh 2.1).

B

0, 6 cm

C

1,3 cm

A

Ảnh 2.1. Vật liệu trong nuôi cấy tạo rễ bất định. A: Cây con in vitro 7 ngày tuổi; B: Các khúc cắt

trụ thượng diệp ở vị trí 1, 2, 3. C: Các khúc cắt trụ hạ diệp ở vị trí 1, 2, 3.

2. 2. Phương pháp

2. 2. 1. Khử trùng mẫu

Hạt được rửa dưới vòi nước chảy và lắc trong calcium hypochlorite 10% và thủy ngân 0 clorua 0,1% (Hình 2.1), sau đó được nuôi cấy trên môi trường MS, ở nhiệt độ 27 ± 2 P PC, chiếu sáng 2000 ± 200 lux (12 giờ mỗi ngày). Sau 7 ngày nuôi cấy, ghi nhận tỉ lệ mẫu không nảy mầm và tỉ lệ

mẫu sống và không nhiễm.

2. 2. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro

0 agar 6 g/l (pH 5,7) được hấp khử trùng (121 P

PC trong 15 phút). Hạt Vigna angularis sau sự khử

Sử dụng môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung vitamin, sucrose 30 g/l,

PC, ánh sáng 2000 ± 200 lux (12 giờ mỗi ngày).

0 Sự nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 27 ± 2 P

trùng được gieo vào mỗi ống nghiệm có chiều dài 20 cm và đường kính 2 cm để tạo cây in vitro.

Các điều kiện này được áp dụng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.

2. 2. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro

Hạt Vigna angularis được đặt vào từng ống nghiệm như trong sự nuôi cấy hạt và tạo cây in

vitro (phương pháp 2.2.2). Môi trường MS được bổ sung BA 1 mg/l và IAA ở các nồng độ 0,1; 1;

và 5 mg/l. Qua 7 ngày nuôi cấy, các kết quả về chiều cao thân, chiều dài rễ và số lượng rễ con được

ghi nhận.

2. 2. 4. Khảo sát ảnh hưởng của auxin trong sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis

Trụ hạ diệp của cây con in vitro 7 ngày tuổi được sử dụng trong thí nghiệm này. Từ vị trí cổ

rễ của cây con cắt bỏ một đoạn dài 5 mm, tiếp tục cắt trụ hạ diệp thành 3 đoạn ( tương ứng với các

vị trí 1, 2, 3 được minh họa trong ảnh 2.1 ), mỗi đoạn dài 5 mm. Các đoạn (khúc cắt) này được nuôi

cấy trong bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung IAA ở các nồng độ 0,1; 1; và 5 mg/l theo

Mẫu (Hạt)

Rửa mẫu dưới vòi nước chảy trong 30 phút

Ngâm và lắc nhẹ bằng xà phòng 5% trong 3 phút

Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng

Đưa hạt vào tủ cấy vô trùng

Ngâm và lắc mẫu bằng cồn 700 trong 20 giây

đúng vị trí (chiều ngọn-gốc) của các khúc cắt.

Rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng

Ngâm và lắc mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút

Ngâm và lắc mẫu bằng calcium hypochlorite 10% trong 4 phút Rửa sạch mẫu nhiều lần bằng nước cất vô trùng

Cấy mỗi hạt vào mỗi ống nghiệm chứa môi trường MS Quan sát và ghi nhận kết quả

Hình 2.1. Sơ đồ qui trình khử trùng hạt đậu Vigna angularis

Sau 24 và 48 giờ nuôi cấy, lần lượt cắt phần đoạn trụ hạ diệp ngập trong môi trường nuôi cấy

( khoảng 2,5 mm ) thành 10 lát mỏng. Dưới kính hiển vi, quan sát số sơ khởi rễ và rễ kéo dài của

mỗi lát cắt. Kết quả là giá trị bình quân của 6 khúc cắt. Chỉ tiêu số lượng và chiều dài rễ được đánh

giá vào ngày thứ 7 sau khi cấy.

2. 2. 5. Ảnh hưởng của auxin lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis

Các khúc cắt trụ thượng diệp in vitro có nguồn gốc từ cây con in vitro 7 ngày tuổi là vật liệu

nuôi cấy. Từ đỉnh cây cắt bỏ một đoạn dài 5mm, tiếp đó cắt liên tiếp 3 đoạn trụ thượng diệp ( tương

ứng với ba vị trí 1, 2, 3 được minh họa trong ảnh 2.1 ), mỗi đoạn dài 5 mm. Mẫu thí nghiệm được

cấy theo vị trí 1, 2, 3 trong các bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung IAA 0,1; 1; và 5 mg/l

theo đúng vị trí (chiều ngọn-gốc) của các khúc cắt.

Sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy, phần gốc của mỗi đoạn trụ thượng diệp chìm trong môi trường

( khoảng 2,5 mm ) được cắt thành 10 lát mỏng. Quan sát dưới kính hiển vi để đếm số sơ khởi rễ và

rễ kéo dài của từng lát cắt. Kết quả thống kê là giá trị trung bình của 6 khúc cắt. Chỉ tiêu số lượng

và chiều dài rễ được xác định vào ngày thứ 7 sau khi cấy.

2. 2. 6. Ảnh hưởng của auxin ở các nồng độ cao lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis

Từ kết quả khúc cắt trụ thượng diệp của cây con 7 ngày tuổi ở vị trí thứ nhất tạo rễ mạnh

trong môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l (so với các vị trí khác), các khúc cắt ở vị trí thứ nhất

này được đặt trong các bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung IAA với các nồng độ 5; 7,5;

và 10 mg/l. Sau một tuần, ghi lại chiều dài và số lượng rễ trên từng mẫu thí nghiệm.

2. 2. 7. Khảo sát sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin

Tiếp tục sử dụng môi trường MS có bổ sung IAA 5mg/l để nuôi cấy khúc cắt trụ thượng diệp

ở vị trí thứ nhất. Chiều dài và số lượng rễ trung bình của mẫu cấy được xác định theo từng khoảng

thời gian ở các ngày 5, 7, và 14 sau khi bắt đầu nuôi cấy.

2. 2. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp

Những đoạn trụ thượng diệp in vitro (dài 5 mm) ở các vị trí 1, 2 và 3 từ cây in vitro 7 ngày

tuổi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l. Các khúc cắt được cắm vào môi

trường theo chiều ngược, nghĩa là cực ngọn (dài 2,5 mm) sẽ được cắm vào môi trường và cực gốc

quay lên trên. Sau 60 giờ, đoạn trụ thượng diệp (dài 2,5mm) nằm phía trên môi trường được cắt

thành 10 lát mỏng. Quan sát dưới kính hiển vi để đếm số sơ khởi rễ và rễ kéo dài. Kết quả là giá trị

trung bình của 6 lát cắt. Sau 7 ngày, chiều dài trung bình rễ và số rễ hình thành là những chỉ tiêu

theo dõi.

2. 2. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây Vigna angularis 7 ngày tuổi

Sau khử trùng, hạt đậu Vigna angularis được ngâm 24 giờ trong bình tam giác 100 ml chứa

môi trường MS có bổ sung IAA (0,01; 0,1; 1; và 5 mg/l ), và sau đó được cấy trong các ống nghiệm

chứa môi trường MS. Vào ngày thứ 8 và 12, tất cả lá in vitro của từng cây được chụp ảnh, và diện

tích lá được tính nhờ phần mềm LIA 32. Cùng với diện tích lá, chiều cao thân cũng được xác định.

2. 2. 10. Đo cường độ hô hấp

Qua các thí nghiệm, khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí thứ nhất có khả năng ra rễ mạnh trên

môi trường MS bổ sung IAA 5mg/l nên được dùng làm vật liệu để đo cường độ hô hấp sau 0, 48, và

5 ngày nuôi cấy bằng cách dùng máy Warburg. Máy này gồm một bồn chứa nước có bộ phận điều

nhiệt và khuấy. Các áp kế Warburg gắn vào thành bồn. Cử động lắc của giá áp kế sẽ giúp sự

khuyếch tán khí giữa mẫu vật, dung dịch ngâm mẫu vật và pha khí trong bình. Cường độ hô hấp của

mô được xác định qua lượng OR2 R hấp thu (μl) trên trọng lượng tươi trên giờ.

2. 2. 11. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được định lượng bằng phương pháp hóa học sắc kí

lỏng cao năng (HPLC). HPLC là sắc ký cột (column chromatograph ) đi kèm với detector nhạy có

thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký với tốc độ nhanh và hiệu suất cao.

Hoạt động của HPLC cần có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng

30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài mililit/phút. Trong phương pháp này, mẫu

chỉ cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà

không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ trong quá trình phân tích.

2. 2. 12. Xử lý thống kết quả thu được

Các số liệu được sử lí thống kê bằng chương trình SPSS, phiên bản 11.5 dùng cho Windows.

Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất p=0,05 của giá trị được biển hiện bằng các mẫu tự khác

nhau.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1. Kết quả

3. 1. 1. Khử trùng mẫu

Hạt được khử trùng với calcium hypochlorite 10% và thủy ngân clorua 0,1% trong 4 phút.

Sau 1 tuần nuôi cấy, với cùng một khoảng thời gian xử lý, tỉ lệ hạt không nảy mầm như nhau (3%),

nhưng tỉ lệ mẫu sống thì không tương đương. Nếu xử lý bằng thủy ngân clorua 0,1%, 93% mẫu nảy

mầm không bị nhiễm. Như vậy, thủy ngân clorua với nồng độ 0,1% rất thích hợp cho việc khử trùng

mẫu ( bảng 3.1).

Bảng 3.1. Kết quả khử trùng với calcium hypochlorite 10% và thủy ngân clorua 0,1%

trong 4 phút.

Chỉ tiêu theo dõi Calcium hypochlorite 10% Thủy ngân clorua 0,1%

( Ca(OCl) R2 R. 4HR2 RO) (HgCl R2 R)

Tỉ lệ mẫu không nảy mầm 3% 3%

Tỉ lệ mẫu sống và không 26% 93%

nhiễm

3. 1. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro

Nhìn chung, những cây in vitro 7 ngày tuổi được tạo ra từ sự nuôi cấy hạt trên môi trường

MS có chiều cao tương đối đồng đều. Lúc này, cây cao khoảng 12 đến 13 cm, vẫn còn mang hai lá

mầm và hai tử diệp (ảnh 3.1).

0,6cm

Ảnh 3.1. Cây con 7 ngày tuổi trên môi trường MS được dùng để làm vật liệu ở các thí nghiệm tiếp

theo.

3. 1. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên chiều cao và khả năng tạo rễ của cây con in vitro

Trong các nghiệm thức thí nghiệm, cây con sau 7 ngày nuôi cấy từ hạt trên môi trường MS

có sự sinh trưởng tốt nhất ( bảng 3.2 , ảnh 3.2 - 3.9).

Bảng 3. 2. Chiều cao thân, chiều dài và số lượng rễ ở cây Vigna angularis sau sự nảy mầm 7

ngày trong môi trường MS có bổ sung AIA 0,1; 1; và 5 mg/l kết hợp với BA 1mg/l hay không.

Nồng độ BA Nồng độ IAA Chiều cao thân Chiều dài rễ Số rễ / cây

( mg/l ) ( mg/l ) ( cm ) ( cm )

Đối chứng ( MS ) 2,27 ± 0,13P

1 5,60 ± 0,13P 1,33 ± 0,14P 1,83 ± 0,29P 0

1 6,40 ± 0,18P 0,60 ± 0,04P 5,25 ± 0,25P 0,1

1 5,00 ± 0,17P 6,90 ± 0,38P 1

1 0,27 ±0,02P 7,60 ± 0,31P 5

0 9,50 ± 0,30P 0,58 ± 0,19P 0,1

0 14,7 ± 0,80P 1

g 12,30 ± 0,47P b b a,b a 4,60 ± 0,25P e d 8,80 ± 0,32P c

d c b a 0,32 ± 0,02P a b a 0,34 ± 0,08P a

g 22,70 ± 1,42P a b b,c c d 13,50 ± 1,07P d e

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05

0 7,50±0,34P 0,23 ±0,01P 17,90 ± 0,43P 5

P),

rõ rệt lên hình thái của cây con in vitro. Với BA 1mg/l, số rễ hình thành thấp nhất ( 1,83 ± 0,29P

nhưng rễ dài hơn ( 1,33 ± 0,14P

Pcm) so với các môi trường có áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có hiệu ứng

vật. Khi phối hợp IAA với BA, các chỉ tiêu theo dõi tùy vào tỉ lệ IAA / BA. Tỉ lệ này cao thì chiều

cao cây và chiều dài rễ thấp, nhưng số rễ tạo ra nhiều nhất. Ví dụ, trên môi trường với IAA 5mg/l và

BA 1mg/l, chiều cao cây là 4,60 ± 0,25 cm, chiều dài rễ là 0,27 ± 0,02 cm, và số rễ là 7,60 ± 0,31.

Trong khi đó, trên môi trường với IAA 0,1mg/l và BA 1mg/l , chiều cao cây là 6,40 ± 0,18 cm,

chiều dài rễ là 0,60 ± 0,04 cm, và số rễ là 5,25 ± 0,25.

Khi xử lý riêng rẽ, IAA ở nồng độ cao cho nhiều rễ nhưng ức chế sự kéo dài thân và rễ. Ví

dụ, với IAA 5mg/l, chiều cao cây là 7,50 ± 0,34 cm, chiều dài rễ là 0,23 ± 0,01 cm và số rễ là17,90

± 0,43. Ngược lại, với IAA 0,1 mg/l, chiều cao cây là 9,50 ± 0,30 cm, chiều dài rễ là 0,58 ± 0,19 cm

và số rễ là 13,50 ± 1,07.

1, 4 cm

1, 5 cm

1,5 cm

1,5 cm

Ảnh 3. 4. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1 mg/l và IAA 0,1 mg/l Ảnh 3. 5. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1 mg/l và IAA 1 mg/l.

Ảnh 3. 2. Cây Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS.

Ảnh 3. 3. Cây Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1 mg/l.

1 cm

1,2 cm

1 cm

1,2 cm

Ảnh 3. 6. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1mg/l và IAA 5 mg/l Ảnh 3. 7. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với IAA 0,1 mg/l

Ảnh 3. 9. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với IAA 5 mg/l

Ảnh 3. 8. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với IAA 1 mg/l.

3. 1. 4. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis

Quan sát dưới kính hiển vi toàn bộ các mẫu cấy thí nghiệm, ở tất cả các nghiệm thức, sơ khởi

rễ chưa hình thành sau một ngày nuôi cấy, và chỉ xuất hiện khi đã nuôi cấy 48 giờ ( bảng 3. 3 ).

Bảng 3. 3. Số sơ khởi rễ từ các khúc cắt trụ hạ diệp cây đậu Vigna angularis ở ba vị trí khác

nhau và được nuôi cấy trong các môi trường MS có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau.

Thời gian Nồng độ IAA Số sơ khởi rễ

(giờ) ( mg/l ) Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3

Đối chứng ( MS )

0,1

24 1

5

a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a3

a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a2

a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a 0,00 ± 0,00P a1

Đối chứng ( MS 2,50 ± 0,42P 1,33 ± 0,28P 0,00 ± 0,00P

)

48 0,1 2,83 ± 0,30P 2,16 ± 0,30P 0,00 ± 0,00P

a2 b2 b1

a2 b2 b1

3,83 ± 0,11P 3,58 ± 0,15P 1,08 ± 0,00P 1

a1 b1 c1

Các số trung bình trong cột với các mẫu kí tự khác nhau và các số trung bình trong hàng với các số thứ tự

khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05.

4,00 ± 0,00P 4,00 ± 0,00P 4,00 ± 0,00P 5

Khả năng tạo sơ khởi rễ giữa các vị trí khúc cắt ở môi trường nuôi cấy MS có bổ sung IAA

5mg/l tương đương nhau. Tuy nhiên, với IAA 0,1mg/l, so với các khúc cắt ở các vị trí 1 và 2, thì các

khúc cắt ở vị trí 3 chưa cho sơ khởi rễ trong khoảng thời gian 48 giờ khảo sát giống như đối chứng.

Sau 7 ngày nuôi cấy, phần đoạn thân của các khúc cắt trụ hạ diệp nằm chìm trong thạch đều

hình thành rễ (ảnh 3.14 - 3.17). Đối với cả ba vị trí của khúc cắt, khả năng tạo rễ cao nhất khi sử

dụng IAA 5mg/l ( bảng 3.4).

Bảng 3. 4. Chiều dài rễ và số rễ tạo ra từ khúc cắt trụ hạ diệp cây đậu Vigna angularis ở ba vị

trí khác nhau sau 7 ngày được nuôi cấy trong các môi trường MS có bổ sung IAA ở các nồng độ

khác nhau.

0 0,1 1 5 Nồng độ IAA ( mg/l )

Chiều dài rễ (cm

c2 c2 b 1 a2

)

Số rễ trung bình

c2 c2 c1 a 1 a 1 b 1

a1 b 1 0,52 ± 0,09P a1 b 1 0,57 ± 0,06P a1 b 1 0,59 ± 0,04P c1 b2 11,40 ± 0,90P c1 b 1 9,75 ± 0,84P c1 b 1 P± 0,78P 9,08P

Các số trung bình trong hàng với các mẫu kí tự khác nhau và các số trung bình trong cột với các số

thứ tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05.

Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3 Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3 2,34 ± 0,18P 2,21 ± 0,18P 1,32± 0,31P 3,10 ± 0,32P 2,75 ± 0,37P 1,83± 0,46P 2,51 ± 0,90P 2,55 ± 0,11P 2,20 ± 0,11P 3,91 ± 0,83P a 1,2 3,73 ± 0,11P a 1 3,5 ± 0,19P 1,2 ± 0,12P 1,35 ± 0,13P 1,44 ± 0,11P 7,70 ± 0,94P 5,42 ± 0,42P 4,1 ± 0,24P

Trên môi trường không hay có xử lý IAA, số rễ hình thành có sự khác biệt tùy vào vị trí khúc

cắt. Ví dụ, trên môi trường MS, số rễ là 3,10 ± 0,32 ở vị trí 1 nhưng là 1,83± 0,46 ở vị trí 3. Trên

môi trường MS với IAA 1 mg/l, số rễ là 7,70 ± 0,94 ở vị trí 1 nhưng là 4,1 ± 0,24 ở vị trí 3. Trên

môi trường đối chứng, rễ bất định vẫn được hình thành do auxin nội sinh đã di chuyển xuống trong

thân và kích thích tạo rễ.

Hàm lượng auxin ngoại sinh quyết định chiều dài rễ. Thật vậy, ở nồng độ 0,1 mg/l, IAA giúp

chiều dài rễ trung bình của mỗi khúc cắt trụ hạ diệp cao nhất, nhưng ở nồng độ 5 mg/l, IAA lại ức

chế sự kéo dài rễ. Ví dụ, đối với vị trí 1, rễ dài 2,51 ± 0,90 với IAA 0,1 mg/l, nhưng chỉ dài 0,52 ±

20μm

0,09 cm với IAA5 mg/l.

Ảnh 3. 10. Lát cắt ngang trụ hạ diệp sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS

15μm

Ảnh 3. 11. Tế bào vùng phát sinh libe mộc của khúc cắt trụ hạ diệp nuôi cấy sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS

20μm

Ảnh 3. 12. Sơ khởi rễ hình thành từ khúc cắt trụ hạ diệp trên môi trường MS có bổ sung IAA 5mg/l sau 48 giờ nuôi cấy

15μm

Ảnh 3. 13. Rễ kéo dài từ khúc cắt trụ hạ diệp trên môi trường MS có bổ sung IAA 5mg/l sau 72 giờ nuôi cấy

0,8 cm

0,6cm

Ảnh 3. 15. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp theo vị trí 1, 2 và 3 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 0,1mg/l

Ảnh 3. 14. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp theo các vị trí 1, 2 và 3 sau 7ngày nuôi cấy trong môi trường MS

0,6cm

0.8 cm

Ảnh 3. 17. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp theo các vị trí 1, 2 và 3 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 5mg/l

Ảnh 3. 16. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp theo các vị trí 1, 2 và 3 sau 7ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l

3. 1. 5. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi.

Khúc cắt trụ thượng diệp được nuôi cấy trên môi trường MS (đối chứng) và môi trường MS

có bổ sung IAA 0,1; 1 và 5mg/l chưa tạo rễ sau một ngày nuôi cấy ( bảng 3.5 ). Sự hình thành sơ

khởi rễ phụ thuộc vào nồng độ auxin áp dụng. Thật vậy, môi trường với IAA 5mg/l, sơ khởi rễ hình

thành 48 giờ sau khi cấy, nhưng đến ngày thứ 3, các khúc cắt trên môi trường đối chứng MS và có

bổ sung IAA 0,1mg/l vẫn chưa có sự hình thành sơ khởi rễ.

Bảng 3. 5. Số sơ khởi rễ hình thành từ khúc cắt trụ thượng diệp cây đậu Vigna angularis 7

ngày tuổi ở các vị trí khác nhau dưới tác động của IAA ở các nồng độ khác nhau.

Thời gian Nồng độ IAA Số sơ khởi rễ

(giờ) (mg/l) Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3

24 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0

0,1 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P

0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 1

0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 5

48 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0

0,1 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P

0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 1

a1 a1 a1 a1 a1 a1 a1 b1

a1 a1 a1 a1 a1 a1 a1 b1

a1 a1 a1 a1 a1 a1 a1 b1

3,50 ± 0,93P 3,00 ± 0,69P 2,00 ± 0,42P 5

72 giờ 0 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P

0,1 0,00 ± 0,00P 0,00 ± 0,00P

1 3,50 ± 0,65P 2,50 ± 0,29P

a1 a1 b2 c2

a1 a1 a1 a1 0,00 ± 0,00P b1 b1,2 1,5 ± 0,25P b1 b1,2 2,25 ± 0,48P

Các số trung bình trong hàng với các mẫu kí tự khác nhau và các số trung bình trong cột với các số

thứ tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05

5,00 ± 0,41P 3,75 ± 0,85P 5

Sau 7 ngày nuôi cấy, khúc cắt trụ thượng diệp trên môi trường đối chứng không thể cho rễ

con, như đối với tất cả các môi trường có IAA (bảng 3.6). Khi xử lý auxin, nồng độ auxin càng cao

thì số rễ càng tăng. Ví dụ, ở vị trí 1, IAA 5 mg/l cho 7,87± 0,71 rễ, nhưng IAA 1 mg/l chỉ cho 4,59

± 0,48 rễ. Tuy nhiên, nồng độ IAA cao thì chiều dài rễ bị ức chế. Cho nên, khả năng tạo rễ của mẫu

cấy với IAA 0,1 mg/l rất thấp nhưng chiều dài trung bình rễ lại cao nhất. Rễ được tạo ra có kích

thước lớn nằm phía dưới bề mặt môi trường (ảnh 3.24 - 3.27).

Bảng 3. 6. Số rễ và chiều dài rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp cây đậu Vigna angularis 7 ngày

tuổi ở các vị trí khác nhau dưới tác động của IAA ở các nồng độ khác nhau, sau 7 ngày nuôi cấy.

0 1 5

0,00 ± 0,00P 7,87± 0,71P

d2 d1 d1

Nồng độ IAA (mg/l) Vị trí 1 Số rễ trung bình Vị trí 2 0,00 ± 0,00P 5,16± 0,53P

Vị trí 3 0,00 ± 0,00P 3,08± 0,34P 4,72± 0,43P

Vị trí 1 0,00 ± 0,00P 0,93 ± 0,64 P 0,22± 0,01P

a1 a1 a1

Vị trí 2 0,00 ± 0,00P 0,91± 0,13 P 0,30± 0,03P

b2 4,59 ± 0,48P b1,2 3,83± 0,56P b1 c1 c1 b1

c2 c1,2 c1 b1 b1 b1

Các số trung bình trong hàng với các mẫu kí tự khác nhau và các số trung bình trong cột với các số

thứ tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,5

Chiều dài rễ trung bình (cm) Vị trí 3 0,00 ± 0,00P 0,1 a1 2,41± 0,26P a1 1,92 ± 0,41P a1 1,30 ± 0,28P a1 1,49 ± 0,17P a1 1,30 ± 0,20 P a1 0,91 ± 0,23P 0,85± 0,12 P 0,31± 0,05P

20μm

15μm

Ảnh 3. 18. Lát cắt ngang trụ thượng diệp sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS Ảnh 3. 19. Tế bào vùng phát sinh libe mộc của khúc cắt trụ thượng diệp nuôi cấy sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS

20μm

15μm

Ảnh 3. 20. Lát cắt ngang có sơ khởi rễ hình thành từ khúc cắt trụ thượng diệp trên môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l sau 48 giờ Ảnh 3. 21. Một phần lát cắt ngang có sơ khởi rễ hình thành từ nuôi cấy khúc cắt trụ thượng diệp trên môi trường MS có bổ sung IAA 5mg/l sau 48 giờ

20 μm

15 μm

Ảnh 3. 22. Lát cắt ngang có rễ lú ra khỏi vỏ sau 72 giờ nuôi cấy khúc cắt trụ thượng diệp trên môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l Ảnh 3. 23. Một phần lát cắt ngang có rễ lú ra khỏi vỏ sau 72 giờ nuôi cấy khúc cắt trụ thượng diệp trên môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l

0,4cm

0,5cm

Ảnh 3. 24. Khúc cắt trụ thượng diệp ở các vị trí 1, 2 và 3 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS

Ảnh 3. 25. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo các vị trí 1, 2 và 3 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 0,1 mg/l

0,6cm

0,4cm

Ảnh 3. 27. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo các vị trí 1, 2 và 3 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l

Ảnh 3. 26. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo các vị trí 1, 2 và 3 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 1 mg/l

3. 1. 6. Ảnh hưởng của auxin ở nồng độ cao lên sự phát sinh rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi.

Khi áp dụng IAA 5; 7,5 và 10 mg/l lên cùng một loại mô đích là khúc cắt trụ thượng diệp ở

vị trí thứ nhất, số rễ tăng tới mức tối đa sau 7 ngày nuôi cấy nhưng chiều dài rễ giảm mạnh ở các

nồng độ 7,5 và 10 mg/l ( bảng 3.7; ảnh 3.28 và 3.29 ).

Bảng 3.7. Khả năng tạo rễ khúc cắt trụ thượng diệp cây đậu Vigna angularis ở vị trí thứ nhất,

sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 5; 7,5 và 10 mg/l

Nồng độ IAA (mg/l) Số rễ Chiều dài rễ (cm)

5

7,5

a 7,67± 0,83 P a 8,13 ± 0,69 P a 9,25± 0,51P

b 0,29 ± 0,03 P a 0,15 ± 0,03 P a 0,11± 0,02P

Các số trung bình trong hàng với mẫu kí tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05.

0,4 cm

0,4 cm

10

Ảnh 3. 28. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 7,5mg/l Ảnh 3. 29. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IAA 10 mg/l

3. 1. 7. Khảo sát sự hình thành rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi theo thời gian dưới ảnh hưởng của cùng nồng độ auxin.

Trên môi trường MS với IAA 5mg/l, khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 của cây đậu Vigna

angularis 7 ngày tuổi cho số rễ gia tăng theo thời gian cho tới ngày thứ 7, nhưng sau đó, giữa các

ngày 7, 9 và 14 thì sự tăng số lượng rễ không có ý nghĩa về mặt thống kê. Chiều dài rễ hầu như gia

tăng theo thời gian cho tới ngày 14. Sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp trong thí

nghiệm này qua hai bước chính rõ rệt: tạo sơ khởi rễ và kéo dài các sơ khởi này (ảnh 3.30-3.33).

Bảng 3. 8. Khả năng tạo rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 của cây đậu Vigna

angularis theo thời gain nuôi cấy trên môi trường MS với IAA 5mg/l

Thời gian (ngày) Chiều dài rễ ( cm )

5

7

b 8,91 ± 0,73P

a 0,11 ± 0,03 P ab 0,23 ± 0,01 P b 0,34± 0,02P c 1,45 ± 0,06P

Số lượng rễ a 5,33 ± 0,61 P b 7,75 ± 0,81 P b 7,83± 0,88P 9

14

0,5cm

0,5cm

Các số trung bình trong hàng với mẫu kí tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05

Ảnh 3. 30. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 trên môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l sau 5 ngày nuôi cấy

Ảnh 3. 31. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 trên môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l sau 7 ngày nuôi cấy

0,5cm

0,5cm

Ảnh 3. 33. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 trên môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l sau 14 ngày nuôi cấy

Ảnh 3. 32. Sự hình thành rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 trên môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l sau 9 ngày nuôi cấy

3. 1. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp

Khi cấy khúc cắt trụ thượng diệp ngược chiều trên môi trường MS (đối chứng), sơ khởi rễ

chưa xuất hiện ở 60 giờ, và rễ chưa xuất hiện cho tới 7 ngày nuôi cấy ( bảng 3.9 ). Qua 7 ngày nuôi

cấy, các khúc cắt trụ thượng diệp trên môi trường với IAA 1mg/l đều mọc rễ, tuy nhiên rễ không

nằm dưới bề mặt trường (ảnh 3.34 và 3.35).

Bảng 3. 9. Khả năng phát sinh rễ của các khúc cắt trụ thượng diệp cây đậu Vigna angularis

Các số trung

khi cấy ngược chiều trên môi trường MS (đối chứng) và môi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l.

bình

trong

Chỉ tiêu so sánh Thời gian Vị trí khúc cắt Đối chứng (MS)

hàng với các

2,29 ± 0,52P 1 Sơ khởi rễ

mẫu kí

tự

60 giờ 0,00 ± 0,00P 1,86 ± 0,47P 2

khác nhau và

0,00 ± 0,00P 1,29 ± 0,29P 3

các số trung

2,73 ± 0,37P 1 Số lượng rễ

bình

trong

0,00 ± 0,00P 2,53 ± 0,31P 2 trung bình 7 ngày

cột với các

0,00 ± 0,00P 2,00 ± 0,58P 3

số

thứ

tự

0,00 ± 0,00P 2,13 ± 0,17P 1 Chiều dài rễ

khác

nhau

a 0,00 ± 0,00P a a a 0,00 ± 0,00P a a a a a

0,00 ± 0,00P 1,85 ± 0,63P 2 trung bình (cm) 7 ngày

thì khác biệt

có ý nghĩa ở mức p= 0,05.

0,00 ± 0,00P IAA 1 mg/l b1 b1 b1 b1 b1 b1 b1 b1 b1 1,62 ± 0,23P 3

0,5cm

0,5cm

Ảnh 3. 34. Khúc cắt trụ thượng diệp cấy ngược chiều sau 7 ngày trên môi trường MS Ảnh 3. 35. Sự hình thành rễ bất định khi cấy khúc cắt trụ thượng diệp ở các vị trí 1, 2 cà 3 ngược chiều trên môi trường MS và có bổ sung IAA 1mg/l

3. 1. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây đậu Vigna angularis

Vào ngày thứ 8 và thứ 12 của sự nuôi cấy các cây in vitro sau khi ngâm hạt trong môi trường

MS và môi trường MS với IAA 0,01; 0,1; 1 và 5mg/l, sự sinh trưởng của cây con không có sự sai

biệt có ý nghĩa ( bảng 3.10 ).

Bảng 3.10. Chiều cao và diện tích lá của cây đậu Vigna angularis sau 8 và 12 ngày nuôi cấy trên môi trường MS với IAA ở các nồng độ khác nhau

8 ngày 12 ngày Nồng độ ( IAA mg/l )

P)

P)

Chiều cao (cm) Diện tích lá 2 (mmP Chiều cao (cm) Diện tích lá 2 (mmP

a a 418,29± 40,43P 14,87± 0,85P a 379,49 ± 47,85P a 15,32 ± 2,02P a a 16,03 ± 0,7P 484,91± 66,08P a a 338,83 ± 35,37P 15,09 ± 2,69P a a 494,39± 52,71P 15,00± 0,62P

a 24,58±1,02P a 25,5 ± 1,5P a 25,27± 1,1P a 24,7 ± 1,16P a 26,4 ± 0,54P

a 65,07 ± 2,81P a 64,64 ± 5,52P a 69,09 ± 5,59P a 60,07 ± 4,74P a 63,3 3 ± 4,35P

Các số trung bình trong hàng với mẫu kí tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05

0 0,01 0,1 1 5

3. 1. 10. Sự thay đổi cường độ hô hấp và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở cây Vigna angularis

 Sự thay đổi cường độ hô hấp

Cường độ hô hấp của vùng tạo rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở cây đậu Vigna

angularis gia tăng theo sự phát triển rễ, tăng vào ngày thứ 2 sau khi đặt mẫu vào môi trường có IAA

5 mg/l, sau đó tăng rất mạnh vào ngày thứ 5 (bảng 3.11).

Bảng 3.11. Sự thay đổi cường độ hô hấp của vùng phát sinh rễ ở khúc cắt trụ thượng diệp ở cây đậu Vigna angularis được xử lí IAA 5 mg/l theo thời gian.

Thời gian (ngày)

Các số trung bình trong hàng với mẫu kí tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05

0 2 5 Cường độ hô hấp (µlOR2 R/g TLT /giờ) a 187,00 ± 26,20P b 231,13 ± 34,36P c 307, 81 ± 43,14P

Hình 3. 1. Sự thay đổi cường độ hô hấp theo thời gian khảo sát

 Sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh

Thời gian Hoạt tính (ng/g)

IAA ABA Zeatin GAR3

0 Không phát hiện 96,7 Không phát hiện Không phát hiện

2 391,3 20,3 Không phát hiện Không phát hiện

Tại vùng phát sinh rễ trong khúc cắt trụ thượng diệp cách vị trí đỉnh ngọn 5 mm của cây đậu

5 416,3 24 Không phát hiện Không phát hiện

Vigna angularis, khi được xử lý với IAA 5mg/l, hoạt tính IAA tăng lên và đạt giá trị 391,3 ng/g vào

ngày thứ 2. Sau đó, tiếp tục tăng vào ngày thứ 5 (từ 391,3 ng/g lên đến 416,3 ng/g). Ngược lại, hoạt

tính ABA giảm theo thời gian. Hoạt tính GAR3 R và zeatin không phát hiện được trong các mẫu ( bảng

3.12 ).

Bảng 3.12. Sự thay đổi hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian ở khúc cắt trụ thượng diệp cây Vigna angularis được xử lí IAA 5mg/l

3. 2. Thảo luận

3. 2. 1. Khử trùng mẫu

Khi đưa mẫu của bất kì cây trồng nào vào nuôi cấy in vitro đều cần phải khử trùng mẫu.

Trong quá trình thu hoạch và cất giữ, hạt rất dễ bị nhiễm nấm và vi khuẩn. Hơn nữa, khi rửa nước

hạt bị trương lên, hóa chất khử trùng thấm vào mẫu gây tổn thương mô sống và gây ảnh hưởng đến

tỉ lệ nảy mầm tạo cây con. Vì thế, việc khử trùng mẫu không dễ dàng. Kết quả khử trùng cho thấy,

thủy ngân clorua ở nồng độ 0,1% rất thích hợp để khử trùng hạt Vigna angularis (Willd.) Ohwi et

Ohashi.

3. 2. 2. Ảnh hưởng của AIA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro

Trên môi trường đối chứng, rễ dài, mảnh và có nhiều rễ nhánh. Nếu bổ sung BA 1mg/l vào

môi trường nuôi cấy, rễ ngắn và mập hơn. Theo Bùi Trang Việt, citokinin giúp gia tăng kích thước

tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, citokinin cản sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng

rộng tế bào. Như vậy, BA 1 mg/l đã ức chế sự tạo rễ của cây con in vitro, làm cho rễ ngắn và to so

với đối chứng.

Nếu cố định nồng độ BA ở 1 mg/l đồng thời gia tăng nồng độ IAA ( 0,1; 1; và 5 mg/l ) thì số

rễ tăng lên so với môi trường BA 1mg/l. Tỷ lệ auxin trên citokinin (A/C) có vai trò quan trọng trong

sự phát triển rễ bất định. Do đó, môi trường với sự bổ sung IAA 5 mg/l và BA 1 mg/l (nghiêng về

tác động của auxin) cho số rễ nhiều hơn hẳn. Nồng độ citokinin cao cản sự tăng trưởng của rễ và

cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin, nên trong nuôi cấy mô, citokinin được coi như chất ức chế

sự hình thành rễ (Humphries, 1960).

Nếu chỉ bổ sung IAA ( 0,1; 1 và 5 mg/l ) vào môi trường nuôi cấy, cây con mang nhiều rễ

hơn so với môi trường có sự kết hợp với BA 1mg/l. Rõ ràng, IAA là chất điều hòa tăng trưởng thực

vật có khả năng kích thích sự tạo rễ. Tuy vậy, môi trường có IAA 1 và 5 mg/l riêng rẽ hay kết hợp với

BA 1mg/l đã ức chế sự kéo dài rễ.

Khi môi trường nuôi cấy có sự kết hợp giữa BA 1 mg/l và IAA ( 0,1; 1 và 5 mg/l ) hoặc chỉ

có IAA ( 1 và 5 mg/l ) thì sự hình thành mô sẹo ở bộ rễ xảy ra. Mô sẹo là một khối tế bào không

phân hóa, phân chia mạnh, thường tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, dưới tác

động của auxin riêng rẽ hay phối hợp với citokinin (Bùi Trang Việt, 2000).

3. 2. 3. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn hình thành và phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp

Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất gồm nhiều cơ quan có chức năng khác

nhau và bắt nguồn từ một tế bào hợp tử ban đầu. Tế bào này phân chia thành khối tế bào chưa

chuyên hóa rồi biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc trưng cho từng mô và cơ quan với chức

năng khác nhau. Đây là hiện tượng phân hóa tế bào. Tuy nhiên, các tế bào chuyên hóa ấy không mất

đi hoàn toàn sự biến đổi của mình. Trong những điều kiện thích hợp, các tế bào chuyên hóa có thể

trở thành các tế bào chưa chuyên hóa. Đây là hiên tượng phản phân hóa tế bào (Trịnh Đình Đạt,

2009).

Để tạo rễ, các khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp cần được đặt vào môi trường có bổ

sung IAA với nồng độ khác nhau. Theo Mai Trần Ngọc Tiếng và cộng sự (1980), sự ra rễ gồm hai

giai đoạn: thành lập sơ khởi rễ và kéo dài. Gần đây hơn, một số tác giả cho rằng sự tạo rễ được khởi

phát bằng sự phân chia của các tế bào nhu mô (Nag và cs, 2001). Ở giai đoạn hoạt hóa mô, các tế

bào sẽ lần lượt trải qua các biến đổi nhằm tái lập lại trạng thái có tính chất giống như tế bào mô

phân sinh cấp một: tế bào chất đậm đặc, nhân và tiểu hạch lớn.

Các khúc cắt trụ hạ diệp trong tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều có sơ khởi rễ xuất hiện

sau 48 giờ nuôi cấy, ngoại trừ khúc cắt ở vị trí thứ 3 trên môi trường MS và MS có bổ sung IAA

0,1mg/l. Có lẽ ở vị trí này xa cỗ rễ hơn, hàm lượng auxin nội sinh ít không đủ ngưỡng kích thích tạo

sơ khởi rễ sớm. Như vậy, khả năng hình thành sơ khởi rễ ở trụ hạ diệp phụ thuộc vào vị trí của khúc

cắt.

Một trong những hiệu ứng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào đã được chứng

thực từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann), đó là khả năng phát sinh rễ (Nguyễn Như Khanh,

2007). Trong sự phát sinh rễ in vitro, auxin được xem là có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ

(Ahloowalia, 1991; Comanin và cộng sự, 1992; Zimmerman, 1993). Trong nuôi cấy, auxin thường

tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào, kích thích sự tạo rễ bất định ( Pierik,

1987).

So với trụ hạ diệp, khúc cắt trụ thượng diệp khó hình thành sơ khởi rễ hơn. Sau 2 ngày, chỉ

các mẫu cấy trong nghiệm thức có bổ sung IAA 5mg/l cho sơ khởi rễ. Đến ngày thứ 3, sơ khởi rễ

được tìm thấy ở những khúc cắt trong môi trường có nồng độ IAA 1mg/l. Kết quả này phù hợp với

lí thuyết, auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ ( phát thể non của rễ ). Vậy IAA là chất

điều hòa tăng trưởng thực vật có khả năng kích thích trụ thượng diệp hình thành rễ, và ở nồng độ

cao 5mg/l, IAA sẽ giúp sự tạo rễ sớm hơn.

Ở cây song tử diệp, auxin gây ra tình trạng rối loạn tổ chức của sinh mô ngọn rễ, kích thích

hoạt động của chu luân và nội bì tạo ra một vùng tế bào phân sinh và xuất hiện nhiều mô phân sinh

rễ (Bùi Trang Việt, 2000). Rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp và thựợng diệp của cây đậu Vigna angularis

phát sinh rễ từ các mô nội sinh.

Sau 7 ngày nuôi cấy, phần khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp nằm dưới mặt thạch đã

xuất hiện nhiều rễ có kích thước lớn. Đối với trụ hạ diệp, rễ được hình thành trên cả môi trường đối

chứng. Điều này được giải thích, auxin tổng hợp trong ngọn thân, lá non sau đó di chuyển tới rễ và

tích tụ trong rễ (Bùi Trang Việt, 2000) để kích thích sự ra rễ. Vì thế, trong số ba vị trí khúc cắt, vị trí

thứ nhất có chiều dài rễ và số rễ cao hơn vị trí thứ 3.

Khúc cắt trụ thượng diệp Vigna angularis không tạo được rễ con trên môi trường đối chứng.

Rễ bất định chỉ hình thành nếu môi trường có bổ sung IAA. IAA trong môi trường nuôi cấy sẽ cảm

+ các bơm proton HP

Ptrên màng nguyên sinh chất hoạt động, acid hóa vách tế bào, làm vách tế bào trở

ứng sản sinh ra IAA nội sinh kích thích sự tạo rễ. Ngoài ra, sự có mặt của IAA ngoại sinh hoạt hóa

nên lỏng lẻo, kích thích quá trình phân chia và hấp thu nước từ môi trường giúp cho sự tăng trưởng

tế bào (Bùi Trang Việt 2000).

Mặc dù số lượng rễ con trung bình tạo ra từ khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp được xử

lý IAA 0,1 mg/l ít so với xử lý IAA 1 và 5 mg/l, nhưng chiều dài rễ trung bình trên mẫu cấy lớn

hơn. Điều đó cho thấy hàm lượng IAA thấp (0,1 mg/l) kích thích sự kéo dài rễ, và hàm lượng IAA

cao (1 và 5 mg/l) ức chế sự kéo dài rễ.

Đối với sự nuôi cấy trụ thượng diệp, IAA 5mg/l làm tăng mạnh số lượng rễ trung bình trên

mẫu cấy ở vị trí 1, vì các khúc cắt này ở gần ngọn nhất nên có hàm lượng auxin lớn hơn hai vị trí

còn lại. Khi di chuyển từ đỉnh xuống các cơ quan, auxin bị phân hủy bởi enzym auxin- oxydase, nên

nồng độ auxin giảm dần ở những nơi xa với nơi tổng hợp ra nó (Dương Công Kiên, 2003).

3. 2. 4. Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin 5mg/l

Số lượng trung bình rễ ở ngày 7, 9 và 14 sau sự cấy không sai khác về mặt thống kê, nhưng

có sự khác biệt với ngày thứ 5. Kết quả này có thể cho phép kết luận, sau khi cấy 5 ngày rễ vẫn tiếp

tục phát sinh cho tới ngày 7. Ngược lại, chiều dài rễ tăng cho tới 2 tuần. Có lẽ hàm lượng auxin

ngoại sinh đã giảm dần theo thời gian khảo sát do nhu cầu phát sinh cơ quan và do đó đã kích thích

rễ kéo dài.

3. 2. 5. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin

Sự di chuyển auxin có vai trò đặc biệt trong sự tăng trưởng và phân hóa. Auxin di chuyển

chủ yếu trong libe, theo cách thụ động, không có tính hữu cực. Tuy nhiên, hầu như trong mọi tế bào

sống đều có khả năng vận chuyển auxin, đây là sự di chuyển hữu cực (Bùi Trang Việt, 2000).

Để chứng minh sự di chuyển hữu cực của auxin, khúc cắt trụ thượng diệp được nuôi cấy trên

môi trường MS và MS có bổ sung IAA 1mg/l. Khi đặt cực gốc của mẫu cấy quay lên trên, cực

ngọn cắm vào thạch của môi trường. Sau một tuần, các khúc cắt trụ thượng diệp không mọc rễ trên

môi trường MS, ngược lại, mẫu cấy trên môi trường có bổ sung IAA 1mg/l cho phép sự hình thành

rễ. Rễ bất định không xuất hiện trong môi trường thạch mà mọc ở cực gốc. Kết quả thí nghiệm cho

thấy, auxin ngoại sinh di chuyển hữu cực từ ngọn đến gốc và là tín hiệu hóa học để kích thích mọc

rễ.

Sự di chuyển hữu cực được giải thích theo mô hình hóa thẩm thấu (Goldsmith, 1977 ) như

- lipit vào cytosol. Tại đây, pH= 7, auxin trở thành dạng AIAP P ( thích nước ) và tích tụ trong cytosol.

- P ở mặt gốc nhiều hơn mặt Trong màng nguyên sinh chất của mỗi tế bào, các chất vận chuyển AIAP

- ngọn nên đã đưa AIAP P qua màng vào vách tế bào. Và cứ thế, quá trình lặp lại, từ tế bào này qua tế

sau: Trong môi trường của vách tế bào, pH ≤ 5, auxin ở dạng AIAH ( thích lipit ) xuyên qua lớp kép

bào khác để đưa auxin về gốc ( Bùi Trang Việt, 2000 ).

3. 2. 6. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao cây và diện tích lá

IAA ở các nồng độ 0,1; 1 và 5mg/l tác động rõ rệt lên sự hình thành rễ bất định của khúc cắt

trụ hạ diệp và trụ thượng diệp, nhưng hầu như không có hiệu ứng đối với hạt nên chiều cao và diện

tích lá trong các nghiệm thức không có khác biệt. Như vậy, ở cùng một nồng độ, auxin thể hiện hiệu

ứng khác nhau tùy vào mô đích.

3. 2. 7. Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển rễ bất định

Khúc cắt trụ thượng diệp cây đậu Vigna angularis được nuôi cấy trên môi trường MS với

IAA 5mg/l có cường độ hô hấp gia tăng theo thời gian, vì cần nhiều năng lượng cho các hoạt động

của quá trình tạo rễ bất định. Mẫu cấy có cường độ hô hấp tăng lên vào ngày thứ 2 ứng với giai

đoạn hình thành sơ khởi rễ. Sau đó, tiếp tục tăng cao ở ngày thứ 5 tương ứng với giai đoạn kéo dài

rễ. Như vậy, cường độ hô hấp đạt giá trị cao nhất vào giai đoạn kéo dài rễ, cao hơn giai đoạn tạo sơ

khởi rễ và ngày 0 do cần nhiều năng lượng cho hoạt động kéo dài và tạo mới các rễ con.

Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh biến đổi theo thời gian tương ứng

với các giai đoạn hình thành và phát triển rễ bất định. Hoạt tính IAA tăng lên rõ rệt so với ngày 0,

đúng vào giai đoạn tạo sơ khởi rễ ở ngày thứ 2. Giai đoạn đầu trong sự tạo rễ cần có hàm lượng

auxin cao để khởi xướng sự phân hóa tế bào mạnh mẽ (Võ Thị Bạch Mai 2004). Hoạt tính IAA tiếp

tục tăng ở ngày thứ 5, tương ứng với giai đoạn rễ kéo, từ 391,3 ng/g lên đến 416,3 ng/g. Do IAA ở

nồng độ cao quá đã ức chế sự kéo dài rễ.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

- Rễ bất định từ thân Vigna angularis có nguồn gốc nội sinh, và sự phát triễn rễ gồm ba giai

đoạn: giai đoạn các tế bào vùng nhu mô phân chia mạnh, giai đoạn hình thành sơ khởi rễ, và giai

đoạn sơ khởi rễ kéo dài và lú ra khỏi vỏ.

- Trụ hạ diệp dễ hình thành rễ bất định hơn trụ thượng diệp, và IAA có khả năng kích thích

tạo rễ bất định từ trụ thượng diệp cây đậu Vigna angularis.

- Cường độ hô hấp và hàm lượng IAA nội sinh thay đổi theo các giai đoạn phát triển rễ.

- Đối với trụ thượng diệp, IAA 5 mg/l cần cho sự tạo rễ nhưng ức chế sự kéo dài rễ (tác động

của auxin thay đổi theo các bước phát sinh hình thái).

- Dưới tác dụng của IAA ngoại sinh, vị trí thứ nhất của trụ thượng diệp cho rễ nhiều hơn các

vị trí bên dưới (tác động của auxin thay đổi theo vị trí mô trong thân).

- Auxin di chuyển hữu cực và rễ luôn mọc ở cực gốc của trụ thượng diệp.

4. 2. Đề nghị

Trong tương lai, nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của auxin và các

chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác trong sự phát triển rễ nói riêng và trong sự phát triển nói

chung, bao gồm sự tăng trưởng, ra hoa và đậu trái, ở cây đậu Vigna angularis.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Trịnh Đình Đạt (2009). Công nghệ di truyền. NXB giáo dục.

2. Nguyễn Đình Giậu (2000). Sinh học đại cương. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM.

3. Phạm Hoàng Hộ (1999). Cây cỏ Việt Nam, quyển 1. NXB trẻ.

4. Dương Công Kiên (2002). Nuôi cấy mô thực vật. NXB giáo dục.

5. Nguyễn Như Khanh (2007). Sinh học phát triển thực vật. NXB giáo dục.

6. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002). Công nghệ tế bào. NXB Đại học quốc gia

Tp.HCM.

7. Võ Thị Bạch Mai (2004). Sự phát triển chồi và rễ. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM.

8. Mai Trần Ngọc Tiếng (2001). Thực vật cấp cao. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM.

9. Bùi Trang Việt (1998). Sinh lí thực vật đại cương. Phần III – Phát triển. NXB Đại học Quốc gia

Tp.HCM.

10. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lí thực vật đại cương. Phần II – Phát triển. NXB Đại học Quốc gia

Tp.HCM.

11. Bùi Trang Việt (2003). Sinh phôi thể hệ ở thực vật. Giáo trình cao học sinh lí thực vật.

12. Vũ Văn Vụ (1999). Sinh lí thực vật ứng dụng. NXB giáo dục.

13. Vũ Văn Vụ (chủ biên), Vũ Thành Tâm và Hoàng Minh Tấn (2008). Sinh lí học thực vật.

NXB giáo dục.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

14. Berleth T. and Sachs T., 2001. “Plant morphogenesis: long-distance coordination and local

patterning”, Plant Biology, 57 - 62.

15. Blythe E.K., Sibley J.L., Tilt K.M., and Ruter J.M. (2007). Methods of auxin application in

cutting propagation: A review of 70 years of scientific discovery and commercial practice, 25,

166 – 185.

16. Brink M., Belay G., 2006. Cereals and pulse, Backhuys, p.204-206

17. Chen C.M., Jin G., Anderson B.R., and Etral J., 1993. “ Modulation of plant gene expression

by cytokinin”, Plant physiol., 20, 609 - 619.

18. Crowell D.N. and Amasino R. M., 1994. “ Cytokinin and plant gene regulation”, In: Mok

D.W.S, Mok M.C., ed, Cytokinin: Chemistry, Activity and Function, CRC Press, Boca Raton,

FL, 233 – 242.

19. Gutierrez L., Bussell J.D., Păcurar D.I., Schwambach J., Păcurar M., and Bellini C., 2009.

Phenotypic plasticity. Of adventisous rooting in Arabidopsis controlled by complex regulation

of auxin response factor transcript and micro RNA abundance. The Plant Cell, 21, 3119 –

3132.

20. Humphries E. C., 1960. Inhibition of root development on petioles and hypocotyl of dwarf

bean (phaseolus vulgaris) by citokinin.. Phyciol Plantarum, 13, 659-663.

21. Hu S., 2005. Food plants of China, The Chinese University Press, 344-346

22. Khalafalla M., El-Shemy H., Mizanur R., Teraishi M., Teraishi M., and Ishimoto M., 2004.

Recovery of herbicide-resistant Azuki bean [Vigna angularis (Wild.), Ohwi & Ohashi] plants

via Agrobacterium- mediated transformation, 4 (1), 61-67

23. Lund S.T., Smith A.G., Hackeet W.P., 2008. Cuttings of tobacco mutant, rae, undergo cell but

do not initiate adventitious root in respone exogenous auxin. Physiologia Plantarum, 97, 372 -

380.

24. Mironova V.V. , Omelyanchuk N.A., Yosiphon G., Fedeev S.I., Kolchanov N. A.,

Mjolsness E., and Likhoshvai V.A., 2010. A plausible mechanism for auxinpatterning along

the developing root. BMC Systems Biology, 4, 34-36.

25. Ohashi H. and Tahashahi H., 1981. Pollen Morphology of Vigna angularis, 94, 177 – 184.

26. Overvoorde P., Fukaki H., and Beeckman T., 2010 . Auxin control of root development. Cold

Spring Harbor Laboratory Press, 20, 541-553.

27. Phillips G.C, 2008. In vitro morphogenesis in plant- recent advances. In vitro cellular and

0T28. Pop T.I. 0T1T, 0T1TPameil D., and Bell C., 0T2011. Auxin Control in the Formation of Adventitious Roots, Not

Bot Hor Agrobot Cluj, 39, 307-316

developmental biology – plant, 40, 342-345.

29. Sachs T. 1993. The role of auxin in the polar organization of apical meristems. Aust. J. Plant

Physiol, 20, 541-553.

30. Sato S., Yuuka M., and Yamate J. 2009. Beneficial Effects of Azuki Bean (Vigna angularis) Extract:

Anti-Oxidant, Anti-Hypertension and Treatment for Renal Damage. 5, 217-222

31. Singh R. and Jauhar P. 2005. Genetic Resources, Chromosome Engineering, and Crop

Improvement, Taylor and Francis, 238-241

32. Sorin C., Bussell J.D., Camus I., Liung K., Kowalczyk M., Geiss G., McKhann H., Garcion

C.,Vaucheret H., Sandberg G., and Bellini C., 2005. Auxin and light control of adventitious

rooting in Arabidopsis require argonaute. The Plant Cell, 17, 1343-1359

33. Yousif A., Deeth H., and Caffin N., 2002. Effect of storage time and condition on the hardness

and cooking quality of adzuki (Vigna angularis), LWT- Food Sciene and Technology, 35, 388

– 353.

TÀI LIỆU TRÊN INTERNET

34. 4Thttp://www.ingentaconnect.com/content/ben/cnf/2009/00000005/00000003/art4T

35. 4Thttp://www.mendeley.com/research/structure-of-novel-glyceroglycolipids-in-adzuki-bean-

vigna-angularis-seeds/4T

36. 4Thttp://www.highbeam.com/doc/1G1-194811474.html4T

37. 4Thttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/191578154T

38. 4Thttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2621.2009.02117.x/abstract4T

39. 4Thttp://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=167434154T

40.http://resources.metapress.com/pdfpreview.axd?code=g6uu5u082144wk50&size

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MURASHIGE & SKOOG (1962)

Khoáng đa lượng

Nồng độ (mg/l)

1650

NHR4 RNOR3

1900

KNO R3

440

CaClR2 R.2HR2 RO

370

MgSOR4 R.7HR2 RO

170

KH R2 RPOR4

170

NaHR2 RPOR4

Khoáng vi lượng

Nồng độ (mg/l)

6,2

HR3 RBO R3

22,3

MnSO R4.R2H R2 RO

8,6

ZnSOR4 R.4HR2 RO

KI

0,83

0,25

NaR2 RMoOR4 R.2HR2 RO

0,025

CuSOR4 R.5HR2 RO

0,025

CoClR2 R.6HR2 RO

Dung dịch Fe-EDTA

Nồng độ (mg/l)

27,8

FeSOR4 R.7HR2 RO

37,3

NaR2 REDTA

Vitamin MS

Nồng độ (mg/l)

Glycine

2

Myo-inositol

100

Thiamin

0,1

pH

5,7 ± 0,1