Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tuyển chọn các chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Bùi Thị Việt Hà –

Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại

học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong

suốt thời gian học tâp và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa

Sinh học, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã góp ý và

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành Luận văn .

Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn và cá c em Phòng Hóa sinh và Vi sinh môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện

Luận văn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã tạo

mọi điều kiện về vật chất và tinh thần giúp đỡ tôi hoà n thà nh tốt Luận văn nà y.

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thị Quỳnh Trang

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................9 Chƣơng 1: TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU ..........................................................................11

1.1. Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới : ....................................................... ..111

............................................................................ 12

1.3. Những khó khăn thách thứ c nghề

1.4. Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủ y sản :14

1.4.1. Nhiê ̣t đô ̣....................................................................................................................15

1.4.2. Độ pH .......................................................................................................................15

1.4.3. Độ mặn .....................................................................................................................16

1.4.4. Oxy hòa tan (DO) ...................................................................................................16

1.4.5. COD, BOD ..............................................................................................................17

1.4.6. Mâ ̣t đô ̣ vi tảo Vibrio spp. và vi khuẩn tổng số ....................................................17

1.4.7. Nitơ tổng số .............................................................................................................18 3- ) .....................................................................................................20 1.4.8. Photphat (PO4

1.4.9. Sulphuahydro ..........................................................................................................20

1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi trường nướ c nuôi trồng thủ y sản . ................................................................................................. 21

1.5.1. Vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm s ạch nước nuôi tôm, cá ..........21

1.5.2. Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong việc cải tạo nước đầm nuôi trồng thủ y sản .....................................................................24 1.5.3. Ưu điểm và nhươ ̣c điểm củ a biê ̣n phấp sử du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong xử lý nướ c nuôi trồng thủ y sản …………………………………………………….………….. 31

Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 322

2.1. Đối tượng .................................................................................................................... 32

2.1.1 Chủng giống .............................................................................................................32

2.1.2. Hóa chất – thiết bi ̣ ...................................................................................................32

2.1.3. Môi trườ ng ...............................................................................................................32

2.2. Phương pháp nghiên c ứu ......................................................................................... 35

2.2.1. Phương pháp phân l ập vi khuẩn............................................................................35

2

2.2.2. Phương pháp bảo quản giống ................................................................................35

2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn ..................35

2.2.4. Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học ...........................36

2.2.5. Phương pháp định lượng axit lactic......................................................................36

2.2.6. Phương pháp nghiên c ứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế

bào .......................................................................................................................................36

2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh

trưởng của vi sinh vật........................................................................................................38

2.2.8. Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của chủng lựa chọn............39

2.3. Phương pháp ta ̣o chế phẩm ....................................................................................... 43

2.3.1. Nghiên cứ u các điều kiê ̣n thích hơ ̣p cho lên men xốp .......................................43 2.3.2. Trô ̣n hỗn hơ ̣p giống ................................................................................................41

2.3.3. Bảo quản chế phẩm : ...............................................................................................41

...........................41 2.3.4. Thử nghiê ̣m chế phẩm trong xử lý nướ c nuôi trồng thủ y sản

2.4. Phân loại vi sinh vật ................................................................................................... 42 Chương 3: KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬN ......................................................................45

............................................................................ 45

3.1. Tuyển cho ̣n các chủ ng vi sinh vâ ̣t

3.1.1. Bacillus.....................................................................................................................45

3.1.1.1. Phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n .......................................................................................45

3.1.1.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1...................................................................46

3.1.1.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu............................................51

3.1.2. Vi khuẩn Lactic .......................................................................................................53

3.1.2.1. Phân lập và tuyển chọn .......................................................................................53

3.1.2.2. Phân lo ại ...............................................................................................................53

3.1.2.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp

chất kháng khuẩn của L. plantarum L5 ..........................................................................56

3.1.3. Vi khuẩn nitrat hóa ................................................................................................60

3.1.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa .....................................................60

3.1.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn ......62

3

3.2. Tạo chế phẩm ............................................................................................................. 63

........................................63

3.2.1. Thử tính đối kháng lẫn nhau củ a các chủ ng vi khuẩn 3.2.2. Nghiên cứ u các điều kiê ̣n lên men xốp thích hơ ̣p ...............................................64 3.2.2.1. Lựa cho ̣n môi trườ ng lên men xốp thích hơ ̣p ...................................................64 3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên quá trình lên men xốp ..............................66 3.2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men xốp .......................................67

3.2.2.4. Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau ............................................................68

3.2.2.5. Ảnh hưởng của độ ẩm .........................................................................................69

3.2.3. Sản xuất chế phẩm ..................................................................................................70

3.2.4. Đánh giá khả năng làm sa ̣ch nướ c đầm nuôi thủ y sản củ a chế phẩm vừ a ta ̣o đươ ̣c .....................................................................................................................................72

3.2.4.1. Giá trị pH ..............................................................................................................72

3.2.4.2. Nitơ tổng số ..........................................................................................................73

3.2.4.3. Amôni ...................................................................................................................74

3.2.4.4. Nitrit ......................................................................................................................75

3.2.4.5. COD và BOD .......................................................................................................76

KẾT LUẬN ........................................................................................................................79 KIẾ N NGHI ̣ .......................................................................................................................79

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................80

PHỤ LỤC ...........................................................................................................................87

4

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHƢ̃ VIẾ T TẮ T

BOD Biochemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hóa

CMC Cacboxymetyl Cenlluloze Cacboxymetyl xenlulozo

COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hó a hó a ho ̣c

DO Dessolved Oxygen Oxy hòa tan

OD Optical Density Mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c

QCVN Quy chuẩ n Viê ̣t Nam

WHO World Heath Organi zation Tổ chƣ́ c Y tế thế giớ i

5

DANH MỤC CÁ C BẢ NG

Bảng 1.1. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của tôm , cá .........................................15

Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chất lươ ̣ng nướ c nuôi trồng thủ y sản .........................................21

Bảng 3.1: Hoạt tính enzym của 5 chủng lựa chọn.........................................................45

Bảng 3.2: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 4 loại môi trường ..........46

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của

chủng TL1 ..........................................................................................................................47

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp .....48

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 .......................................................................................................49

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng TL1 ...............50

Bảng 3.7: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng nghiên cứu ......................51

Bảng 3.8: Hoạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5 ..........................53

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L5 ...................................53

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng

khuẩn của L. plantarum L5 ..............................................................................................57

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng tổng

hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................58

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất

kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................................59

Bảng 3.13: Đặc điểm hình thái của các chủng oxy hóa amôni phân lập được ..........60

Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái của 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập được ..............61

Bảng 3.15: Hàm lượng nitrit tạo thành và sự sinh trưởng của 13 chủng oxy hóa

amôni phân lập được .........................................................................................................61

Bảng 3.16: Hàm lượng nitrat tạo thành và sự sinh trưởng của 10 chủng oxy hóa

nitrit .....................................................................................................................................62

Bảng 3.17: Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng NA7 và NT2 .................62

Bảng 3.18: Thử tính đối kháng lẫn nhau củ a các chủ ng vi khuẩn ...............................64 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của môi trường lên men xốp lên Bacillus ..............................65

Bảng 3.20 : Ảnh hưởng của môi trường lên me n xốp lên L. plantarum L5: .............65

6

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên Bacillus TL1 .......................................66

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên L. plantarum L5..................................67

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên Bacillus TL1 .........................67

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên L. plantarum L5....................67

Bảng 3.25: Ảnh hưở ng củ a nhiê ̣t đô ̣ lên Bacillus TL1 .................................................68

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên L. plantarum L5............................................69

Bảng 3.27: ảnh hưởng của độ ẩm lên Bacillus TL1 ......................................................69

Bảng 3.28: Ảnh hưởng của độ ẩm lên L. plantarum L5 ...............................................70

Bảng 3.29: Kết quả giá tri ̣ pH sau các ngày thí nghiệm ...............................................72 Bảng 3.30: Kết quả giá tri ̣ Nitơ tổng số sau các ngày thí nghiệm ...............................73

Bảng 3.31: Kết quả giá tri ̣ NH 3 sau các ngày thí nghiệm .............................................74

Bảng 3.32: Kết quả giá tri ̣ nitrit sau các ngày thí nghiệm ............................................75

Bảng 3.33: Kết quả giá tri ̣ COD và BOD sau các ngày thí nghiệm ............................76

Bảng 3.34: Kết quả xử lý nướ c đầm nu ôi thủ y sản củ a chế phẩm ..............................77

7

DANH MỤC CÁ C HÌNH

Hình 3.1: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 5 loại môi trường ...........46

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của

chủng TL1 ..........................................................................................................................48

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp

enzym ngoại bào của chủng TL1 .....................................................................................49

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp

enzym của chủng TL1 .......................................................................................................50

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 .......................................................................................................50

Hình 3.6: Trình tự nucleotit của rARN 16S củ a chủ ng L 5...........................................50

Hình 3.7: Vị trí phân loại của chủng L5 và các loài có quan hệ họ hàng gần…..56

Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp chất

kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................................57

Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và sinh chất kháng

khuẩn của L. plantarum L5 ..............................................................................................58

Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất

kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................................59

Hình 3.11: Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm da ̣ng rắn ..............................................71 Hình 3.12: Giá trị pH sau các ngày thí nghiệm .............................................................73

Hình 3.13: Giá trị nitơ tổng sau các ngày thí nghiệm ...................................................73

Hình 3.14: Giá trị amôni sau các ngày thí nghiệm ........................................................75

Hình 3.15. Giá trị nitrit sau các ngày thí nghiệm ..........................................................76

Hình 3.16. Giá trị COD sau các ngày thí nghiệm..........................................................77

Hình 3.17: Giá trị BOD sau các ngày thí nghiệm..........................................................77

8

MỞ ĐẦ U

, Vớ i đườ ng bờ biển dài tớ i 3260 km cù ng vớ i rất nhiều hòn đảo lớ n nhỏ

290.000 ha

. nhiều đầm phá , eo vi ̣nh , đă ̣c biê ̣t có tớ i 250.000 ha rừ ng ngâ ̣p mă ̣n và bãi triều, Viê ̣t Nam có tiềm năng lớ n về diê ̣n tích nuôi trồng thủ y sản nướ c lơ ̣

Những năm gần đây , cơ cấu chuyển di ̣ch kinh tế cù ng vớ i các chính sách củ a

hủ, phong trào nuôi trồng thủ y sản ven biển ở nướ c ta

khuyến khích củ a chính p ngày càng phát triển mạnh .

Tuy nhiên, trong những năm gần đây ngành nuôi trồng đang phải đối mặt với

, các loại vi khuẩn gây bệnh… làm cho nước trong đầm bị ô

những khó khăn có thể dẫn đến nguy cơ thất bại ở nhiều cơ sở nuôi trồng. Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước đầm nuôi , dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy. Các đầm nuôi trồng thủy sản , đă ̣c biê ̣t là các đầm quảng canh không có hệ thống cấp , thoát nước và xử lí nước thải nên trong quá trình n uôi, phân sinh vâ ̣t , thứ c ăn thừ a , xác động vật thủy sinh , xác rong , tảo, các loại hóa chất sử dụng trong quá trình nuôi nhiễm. Các chất hữu cơ tích tụ lại ở đáy đầm bị phân hủy kị khí sinh ra các sản phẩm như : NH3, H2S, NO3… làm cho tôm cá bi ̣ sốc hoă ̣c gây ha ̣i cho tôm cá và các sinh vâ ̣t khác sống trong đầm . Khi đầm nuôi bị ô nhiễm thì những nhóm vi sinh vật có hại có cơ hội phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi

bị bệnh. Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi

trường ao nuôi và phòng bệnh. Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người. Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh

còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong vật nuôi và vi phạm vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm. Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề

này. Trước thực trạng đó, xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi

trường nước, phòng bệnh cho tôm cá và an toàn với người sử dụng là vấn đề cấp

thiết. Tại một số nước có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển với quy mô công

nghiệp như Mĩ, Nhật, Trung Quốc, Thái Lan,…các biện pháp sinh học được sử

dụng thay thế cho cách dùng hóa chất đã khẳng định được tính an toàn và hiệu quả

trong nuôi trồng.

Các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi trường nước

nuôi trồng thủy sản đã đem lại nhiều lợi ích cho con người và môi trường sống mà các phương pháp khác không có được như: an toàn với người và động vật, đặc hiệu

đối với vật chủ, thích hợp với các phương pháp phòng trừ khác, thời gian bán hủy

9

ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả năng tự nhân

lên và ức chế các vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá.

Vớ i mong muốn

tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng làm sạch môi trường nước nuôi tôm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Tuyển chọn các

chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản”.

Mục đích củ a đề tài : tạo ra được chế phẩm có chứa một số chủng vi sinh vâ ̣t hữu ích nhằm xử lý nướ c nuôi tôm và bướ c đầu đưa ra những kết quả thử nghiê ̣m xử lý nướ c nuôi trồng thủ y sản bi ̣ ô nhiễm ở quy mô phòng thí nghiê ̣m .

10

Chƣơng 1: TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU

1.1. Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Nuôi trồng thủ y sản là mô ̣t ngành sản xuất đô ̣ng thực vâ ̣t thủ y sinh trong

, nuôi , hoă ̣c như ngườ i ta vẫn thườ ng nói

c [8]. điều kiê ̣n kiểm soát hoă ̣c bán kiểm soát trồ ng thủ y sản là sản xuất nông nghiê ̣p trong môi trườ ng nướ

Trong thời gian qua, ngành thuỷ sản ngày càng phát triển và dần trở thành

ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia và là nguồn cung cấp thực phẩm quan

trọng cho cộng đồng các dân cư trên toàn thế giới. Không những phát triển về số

lượng và giá trị, ngành thuỷ sản còn có những bước thay đổi cơ bản về cơ cấu sản xuất. Từ một ngành thuỷ sản công nghiệp với khai thác thuỷ sản đóng vai trò chủ

đạo và những quốc gia có sản lượng lớn nhất là các nước phát triển có những đội

tàu khai thác xa bờ và một nền công nghiệp chế biến hiện đại trong những năm

trước thập kỷ 90, trong giai đoạn từ hơn mười năm trở lại đây, ngành thuỷ sản đã

phát triển theo hướng nông nghiệp, nghĩa là nuôi trồng thuỷ sản (N TTS) đã tăng

nhanh tỷ lệ đóng góp của mình và các nước nông nghiệp chính là những nước có

sản lượng đứng đầu thế giới. Chỉ tính trong giai đoạn 10 năm từ 1993 -2003, trong

khi sản lượng khai thác hầu như đứng yên, chỉ tăng 1,2%, thì sản lượng NTTS tăng

mỗi năm tới 9,4%. Năm 2003, tỷ lệ của NTTS trong tổng sản lượng thuỷ sản thế

giới đã tăng lên 31,7% [8].

Theo thống kê của FAO, năm 2003, tổng sản lượng thủy sản của thế giới đạt gần 132 triệu tấn, lĩnh vực khai thác đạt 90 triệu tấn và nuôi đạt gần 42 triệu t ấn.

Trong đó, lượng thuỷ sản (TS) dùng làm thực phẩm khoảng 101 triệu tấn, chiếm hơn 76,5 % [8].

Nếu phân theo môi trường nuôi, sản lượng các loài thuỷ sản nước ngọt chiếm

tỷ lệ cao hơn (năm 2003, nuôi nước ngọt đạt 25,2 triệu tấn, chiếm 60,14% sản lượng

và 48,7% giá trị). Thuỷ sản nuôi nước mặn chiếm 36,5% sản lượng và 35,7% giá trị.

Mặc dù sản lượng nuôi nước lợ chỉ chiếm 5,8% (năm 2002), nhưng lại chiếm tới

15,9% giá trị vì phần lớn là những sản phẩm giá trị cao.

1.2. Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Vớ i đườ ng bờ biển dài hơn

3200km; Viê ̣t Nam có vù ng đă ̣c quyền kinh tế trên biển rô ̣ng hơn 1 triê ̣u km 2. Viê ̣t Nam cũng có vù ng mă ̣t nướ c nô ̣i đi ̣a lớ n rô ̣ng hơn 1,4 triê ̣u ha nhờ hê ̣ thống sông ngòi , đầm phá dày đă ̣c . Vị trí địa lý và điều kiện

11

esia và Thái Lan . Xuất khẩu thủ y sản trở thành

[6]. tự nhiên thuâ ̣n lơ ̣i giú p Viê ̣t Nam có nhiều thế ma ̣nh nổi trô ̣i để phát triển ngành thủy sản . Từ lâu Viê ̣t Nam đã trở thành quốc gia sản xuất và xuất khẩu thủ y sản hàng đầu khu vực cùng với Indon mô ̣t trong những li ̃nh vực quan tro ̣ng củ a nền kinh tế

Theo số liê ̣u thống kê , 11 tháng đầu năm 2009, kim nga ̣ch xuất khẩu thủ y

sản đạt 3.928 triê ̣u đôla, bằng 93,8% so vớ i cù ng k ỳ năm ngoái ; chiếm 7,6% tổng kim nga ̣ch xuất khẩu cả nướ c [6].

Viê ̣t Nam có hơn 1 triê ̣u km đườ ng bờ biển và 1,4 triê ̣u hecta mă ̣t nướ c nô ̣i . Trữ lươ ̣ng hải sản ở Viê ̣ t 1,73 triê ̣u tấn. Mở

. 2006 - 2008 là khoảng 11%. Đến hết tháng 11

đi ̣a vì vâ ̣y nguồn cung thủ y hải sản rất dồi dào và ổn đi ̣nh Nam ướ c tính có khoảng 4,2 triê ̣u tấn và nguồn tái ta ̣i là khoảng rô ̣ng diê ̣n tích nuôi trồng thủ y sản và cải thiê ̣n khả năng khai thác đánh cá xa bờ đã giúp sản lượng thủy hải sản Việt Nam không ngừng tăng trong những năm qua Mứ c tăng trưở ng trung bình từ năm năm 2009, sản lượng thủy sả n đã đa ̣t hơn 4,4 triê ̣u tấn [6].

, các sản phẩm mặt hàng thủy sản của Việt Nam Trong những năm gần đây

ngày càng được đa dạng hóa . Các sản phẩm như tôm ,cá tra, cá ngừ , hàng khô , mực, . Trong đó ,

bạch tuộc chiếm tỉ trọng lớn nhất trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản tôm đứ ng đầu về kim nga ̣ch xuất khẩu , chiếm 38,4 %.

1.3. Nhƣ̃ng khó khăn thá ch thƣ́ c nghề

Theo đánh giá củ a FAO , thủy sản và các sản phẩm là các sản phẩm được

. Lơ ̣i thế củ a ,

, không bi ̣ phu ̣

. phát triển nhanh nhất trong các mă ̣t hàng thực phẩm hiê ̣n nay nói chung nuôi trồng thủ y sản là có thể thực hiê ̣n đươ ̣c kế hoa ̣ch phát triển sản xuất thủ y sản gia tăng sản lươ ̣ng nhằm đáp ứ ng nhu cầu củ a thi ̣ trườ ng tiêu thu ̣ thuô ̣c vào mù a vu ̣ khai thác như nguồn lơ ̣i tự nhiên

Tuy nhiên , ngoài những thuận lợi đó , nuôi trồng thủ y sản ở Viê ̣t Nam cũng

vớ i nhiều khó khăn như điều kiê ̣n môi trườ ng

Viê ̣t Nam là tính rủ i ro còn cao do những nguyên

(khoảng 17%) lươ ̣ng oài môi đã và đang phải đối mă ̣t , khí hậu , nguồn nướ c , ô nhiễm nướ c thải , nguồn giống , thứ c ăn , dịch bệnh , thờ i tiết… Ha ̣n chế trong nuôi trồng thủ y sản ở nhân chủ quan và khách quan . Về mă ̣t chủ quan , còn có nhiều vấn đề kĩ thuật và phi kĩ thuật mà chúng ta chưa làm chủ được . Trong điều kiê ̣n nuôi trồng thủ y sản hiê ̣n nay, các đầm nuôi thường bị phú dưỡng . Nguyên nhân là do chú ng ta đưa vào đầm nuôi lươ ̣ng thứ c ăn tổng hơ ̣p rất lớ n mà chỉ có phần rất nhỏ thứ c ăn đươ ̣c tôm sử du ̣ng , còn lại là hòa tan trong nước hoặc bài tiết ra ng

12

trườ ng. Lươ ̣ng thứ c ăn thừ a , phế thải hữu cơ và các phế thải khác là những yếu tố làm cho đầm nuôi tôm nhiễm bẩn . Có thể nói các đầm nuôi trồng thủy sản hiện nay

. Do chưa có kinh nghiệm trong phòng

. Bên . Khả năng theo dõi , cảnh báo môi trường đề ên nhân gây tổn thất không nhỏ

bị thất bại là do đầm nuôi bị nhiễm bẩn chống bê ̣nh cho tôm nên sử du ̣ng thuốc chữa bê ̣nh không hơ ̣p lí đã làm tăng khả năng hình thành di ̣ch bê ̣nh vù ng nuôi phòng dịch bệnh còn hạn chế cũng là nguy cạnh đó , sự ô nhiễm còn do tác đô ̣ng qua la ̣i giữa các ngành sản xuất khác nhau , chẳng ha ̣n sự ô nhiễm các vực nướ c tự nhiên từ nguồn phân bón , thuốc trừ sâu , chất thải công nghiệp cũng là m ảnh hưở ng đến cá c vù ng nuôi trồng thủ y sản [12], [18], [21].

, kháng sinh , Trong nuôi trồng thủ y sản thườ ng phải sử du ̣ng các loa ̣i hóa chất

thuốc diê ̣t nấm để tri ̣ bê ̣nh . Tuy nhiên , chúng phải được dùng với liều lượng thích . Nếu không , viê ̣c sử du ̣ng thuốc kháng sinh bừ a bãi sẽ

ng ruô ̣t kháng la ̣i

, đă ̣c

có cả

hợp và theo quy định hợp lí gây hiê ̣n tươ ̣ng kháng thuốc và gây cho ngườ i sử du ̣ng những rủ i ro tiềm ẩn như tăng mẫn cảm vớ i dư lươ ̣ng thuốc hoă ̣c xuất hiê ̣n hê ̣ vi khuẩn đườ các chất kháng khuẩn . Rất nhiều nướ c trên thế giớ i đã có những thay đổi hoă ̣c thắt chă ̣t các quy đi ̣nh củ a quốc gia về viê ̣c sử du ̣ng thuốc tri ̣ bê ̣nh trong nuôi trồng biê ̣t là kháng sinh , đây cũng là yêu cầu nghiêm ngă ̣t củ a nhiều nướ c trong đó các nước nhập khẩu [7], [26].

Mô ̣t khó khăn nữa đối vớ i ngành nuôi trồng thủ y sản đó là di ̣ch bê ̣nh

, đă ̣c y càng phát . Gần 30 bê ̣nh

2 nguyên nhân nhiễm trù ng và không nhiễm

(vi khuẩn , vi rú t , nấm và nguyên sinh đô ̣ng vâ ̣

biê ̣t là đối vớ i tôm . Cùng với việc tăng sản lượng tôm thì bệnh tôm ngà triển nhiều và xuất hiê ̣n nhiều bê ̣nh la ̣ mà chưa có giải pháp điều tri ̣ và hội chứng bệnh của tôm nuôi với trùng đã được một số tài liệu gần đây nhắc đến nhưng sự hiểu biết về chú ng còn rất ít. Mô ̣t số tác nhân gây bê ̣nh quan tro ̣ng nhất cho tôm cá, cũng như các thủy hải sản khác là vi sinh vật t) hay do môi trườ ng, đô ̣c tố [30].

gây bê ̣nh tăng ma ̣nh , tôm sẽ chết

. Những bê ̣nh này chỉ mang tính chất cơ hô ̣i khi nướ c bi ̣ ô

Các vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh gây ra các bê ̣nh nghiêm tro ̣ng cho thủ y hải sản . Ví dụ đối với tôm , chúng gây bệnh đốm trắng , bê ̣nh đầu vàng , bê ̣nh phát sáng… Nếu môi trườ ng tiếp tu ̣c xấu đi hay số lươ ̣ng vi khuẩn nhiều trong mô ̣t thờ i gian ngắn hoă ̣c bê ̣nh sẽ chuyển thành da ̣ng nhiễm khuẩn mãn tính và rất khó chữa nhiễm, đă ̣c biê ̣t là nướ c bi ̣ ô nhiễm hữu cơ hoă ̣c tôm cá chi ̣ u tình tra ̣ng sốc do mô ̣t

13

, pH, mâ ̣t đô ̣ thả quá dày , sự thay

trong các điều kiê ̣n gây ra như sự thay đổi nhiê ̣t đô ̣ đổi về đô ̣ mă ̣n củ a nướ c .

 Vi khuẩn Vibrio gây bê ̣nh cho tôm

Các vi sinh vật gây bệnh luôn tồn tại trong môi trường sinh sống của tôm

(đất, nước, không khí, thức ăn…) và tồn tại ngay trong cơ thể vật chủ. Một trong số

các vi khuẩn gây bệnh nguy hại phổ biến cho tôm là Vibrio spp. Đây là chủng vi

khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có hoạt tính oxidaza, hình que hoặc

hình dấu phẩy, kị khí không bắt buộc, không hình thành bào tử, có thể cư trú trong

nước với các độ mặn khác nhau. Nhóm vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước

nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đầm nuôi nhưng

khi gặp điều kiện bất lợi cho tôm, chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh,

vì vậy chúng được xếp vào loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm) [49]. Vibrio spp. rất phổ biến trong nước mặn, một số loài có khả năng gây bệnh cho tôm (V.

cholera, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. urnissii…). Chúng

thường gây ra các bệnh nghiêm trọng cho tôm như bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng,

bệnh phát sáng…. Khi bị nhiễm vi khuẩn này, lúc đầu, một số nơi trên cơ thể tôm sẽ

bị tiêu hủy như phần đuôi hoặc phần lưng rồi dần dần làm bế tắc hệ thống lưu thông

của máu [38]. Tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn,

đổi màu đỏ hoặc xanh. Nếu môi trường tiếp tục xấu đi hay số lượng vi khuẩn gây

bệnh tăng mạnh, tôm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển

thành dạng nhiễm khuẩn mãn tính. Những bệnh này chỉ mang tính chất cơ hội khi

nước bị ô nhiễm, đặc biệt là nước bị ô nhiễm hữu cơ hoặc tôm cá chịu tình trạng sốc

do một trong các điều kiện gây ra như sự thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày, sự thay đổi về độ mặn của nước.

Vi khuẩn Vibrio spp. trong các đầm nuôi tôm rất phong phú và có xu hướng

tăng dần theo thời gian nuôi, số lượng đạt cực đại vào cuối vụ. Kết quả nghiên cứu

của Nguyễn Trọng Nho và ctv (1996) [21] đầm tôm ở các tỉnh Nam Trung Bộ bị

bệnh có số lượng vi khuẩn Vibrio tổng số từ 110-1500 tế bào/ml. Theo Phan Lương

Tâm và ctv (1998) [29], Nguyễn Việt Thắng (1998) [33] khảo sát các nguyên nhân

gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam cho rằng trong các đầm nuôi tôm bị chết, số

lượng vi khuẩn Vibrio spp. tổng số cũng rất cao. Sự xuất hiện, phân bố của các

chủng Vibrio là theo mùa và phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng của nước. Hiện

tượng bùng nổ Vibrio xảy ra trong các trường hợp nước bị phú dưỡng. Việc định

14

lượng vi khuẩn Vibrio spp. rất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước,

xác định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đ ầm nuôi tôm.

1.4. Ảnh hƣởng của một số điều kiện môi trƣờng lên quá trình nuôi trồng thủy sản

Dạng thức ăn sử dụng nuôi tôm ảnh hưởng rấ t lớ n đến môi trườ ng đầm nuôi .

i trồng thủ y

,

, gây

Trong thờ i gian đầu , đa số các loài nuôi đều cho năng suất cao nhưng chỉ sau mô ̣t thờ i gian sử du ̣ng thứ c ăn , đă ̣c biê ̣t là thứ c ăn tu ơi thì chất lươ ̣ng nướ c suy giảm mô ̣t cách nhanh chóng . Khi hàm lươ ̣ ng các chất hữu cơ và các chất chứ a ni tơ tăng lên thì hàm lượng oxy hòa tan giảm . Sự nh iễm bẩn môi trườ ng nướ c nuô sản được bắt đầu bằng sự tích tụ các sản phẩm thức ăn dư thừa và các chất thải của tôm cá. Khi đó , quá trình sinh trưởng và phát triển của các loài thủy sản bị đình trệ mô ̣t trong số trườ ng hơ ̣p có thể dẫn đến hiê ̣n tươ ̣ng tôm cá bi ̣ chết hàng loa ̣t thiê ̣t ha ̣i lớ n cho sản xuất . 1.4.1. Nhiê ̣t độ

Nhiê ̣t đô ̣ là điều kiê ̣n xác đi ̣nh đă ̣c điểm các quá trình sinh ho ̣c

ược chủ yếu vào mùa có

, lí học , hóa học… diễn ra trong nước . Tôm cá là các đô ̣ng vâ ̣t biến nhiê ̣t . Nhiê ̣t đô ̣ là yếu tố sinh thái quan trọng ảnh hưởng tới nhiều phương diện trong đời sống của tô m cá như : hô hấp, tiêu thu ̣ thứ c ăn , đồng hóa thứ c ăn , tăng cườ ng miễn di ̣ch đối vớ i bê ̣nh tâ ̣t , sự tăng trưở ng… nhiê ̣t đô ̣ thay đổi theo mù a nên ở miền Nam Viê ̣t Nam có thể nuôi tôm cá quanh năm trong khi ở miền Bắc chỉ khai thác đ nhiê ̣t đô ̣ ấm áp . Ở Việt Nam , nhiê ̣t đô ̣ thích hơ ̣p cho tôm cá là 28-36oC [27]. 1.4.2. Độ pH

Độ pH đặc trưng cho hoạt tính phản ứng của môi trường , giá trị pH được tính

bằng : pH = ln [H+].

Độ pH của môi t rường đầm nuôi ảnh hưở ng khá lớ n đến sự sinh trưở ng củ a hần phụ, mang, quá trình lột xác và độ

tôm cá . pH thấp có thể làm tổn thương p cứ ng củ a vỏ tôm. Độ pH thấp làm tăng tính độc của khí H 2S, gây ngô ̣ đô ̣c cho tôm cá, khi pH cao la ̣i làm tăng đô ̣c tính củ a NH 3. Độ pH trong khoảng 7,2 – 8,8 đươ ̣c coi là thích hơ ̣p [37].

Bảng 1.1. Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của tôm , cá

(Lƣơng Đƣ́ c Phẩ m , 2002) [24]

Đặc điểm môi trƣờng pH Giớ i ha ̣n thích nghi củ a tôm, cá

15

4 axit ma ̣nh điểm chết đối vớ i tôm, cá

axit yếu 5-6 tôm cá không sinh sản hoă ̣c khó sinh sản

7-8 trung tính môi trườ ng thích hơ ̣p cho tôm cá

kiềm yếu 9 giớ i ha ̣n cuối cù ng cho tôm cá

kiềm 10 tôm cá không lớ n

> 10 kiềm ma ̣nh điểm chết đối vớ i tôm cá

1.4.3. Độ mặn

Độ mặn được tính dựa trên tổng nồng độ các ion hòa tan trong nước , có quan

. Nhu cầu về đô ̣ mă ̣n thay đổi tù y theo

35‰ [21].

hê ̣ mâ ̣t thiết vớ i đờ i sống củ a thủ y sinh vâ ̣t từ ng loa ̣i tôm cá và thời điểm trong chu trình sống của mỗi loại . Đối với tôm sú , đô ̣ mă ̣n thích hơ ̣p là 15-35‰ NaCl, đô ̣ mă ̣n tối ưu là 29 -30‰ NaCl. Tôm sú sinh trưở ng châ ̣m và năng suất thấp khi nuôi ở đô ̣ mă ̣n cao hơn 1.4.4. Oxy hòa tan (DO)

Oxy hòa tan trong nướ c có ý nghi ̃a rất lớ n t rong viê ̣c đánh giá tra ̣ng thái củ a

,

nướ c và đô ̣ giảm củ a nó cho thấy sự thay đổi ma ̣nh mẽ củ a các quá trình sinh ho ̣c quá trình tự làm sạch , sự nhiễm bẩn củ a nguồn nướ c . Nồng đô ̣ oxy hòa tan phụ thuô ̣c vào mô ̣t loa ̣t các yếu tố tự nhiên như : áp suất , nhiê ̣t đô ̣ nướ c , nồng đô ̣ các muối hòa tan trong nướ c . Khi nuôi tôm , cá, giữa mâ ̣t đô ̣ tôm , cá với hàm lượng oxy hòa tan có mối quan hệ qua lại với nhau. Oxy đươ ̣c tôm, cá sử dụng vào quá trình hô hấp, đồng thờ i oxy đươ ̣c tiêu thu ̣ làm phân hủ y mô ̣t lươ ̣ng chất thải và thứ c ăn dư , hỗ trơ ̣ cho tôm , thừ a củ a tôm , cá. Do đó , oxy là yếu tố quan trọng trong nước nuôi cá phát tri ển. Nướ c nuôi đủ tiêu chuẩn để nuôi tôm cá có nồng đô ̣ oxy hòa tan là : 5- 8mg/l . Trong đầm nuôi , lươ ̣ng oxy hòa tan thấp sẽ làm tôm chậm lớn , có thể chết hàng loạt . Mứ c gây ha ̣i tù y thuô ̣c vào lươ ̣ng oxy hòa tan có trong đầm và giờ i gian tôm, cá phải chịu đựng . Chanratchakool P. (1995) [44] cho rằng hàm lươ ̣ng oxy hòa tan trong nướ c < 4mg/l làm cho tôm , cá sử dụng thức ăn kém , dễ nhiễm bê ̣nh . Chiu Liao P. (1992) [45] nhâ ̣n thấy rằng lươ ̣ng oxy hòa tan nhỏ hơ n 3,5 mg/l sẽ gây chết tôm, cá. Lươ ̣ng oxy hòa tan còn liên quan đến độ mặn và nhiệt độ nước của đầm nuôi. Khi nhiê ̣t đô ̣ oxy trong nướ c giảm , đô ̣ mă ̣n tăng thì khả năng hòa tan

(Gaudiosa, 1975) [50].

16

1.4.5. COD, BOD

COD là nhu cầu oxy hóa học cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ c ác chất hữu cơ trong nướ c thành CO 2 và H 2O. BOD là nhu cầu oxy sinh ho ̣c cần thiết cho vi sinh vâ ̣t tiêu thu ̣ để oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước .

Trong môi trườ ng đầm nuôi

tôm cá, hai chỉ tiêu nghiên cứ u chất lươ ̣ng nướ c , phú dưỡng hóa đồng thời [15]. COD phản ảnh lươ ̣ng

, thườ ng đầu vu ̣ hàm lươ ̣ng COD thấp từ

COD và BOD đươ ̣c dù ng để đánh giá mứ c đô ̣ nhiễm bẩn còn cho biết sự phát triển c ủa sinh vật trong thủy vực tiêu hao oxy do quá trình biến đổi các chất hữu cơ (biến đổi hóa học), do đó giá trị COD phản ánh mứ c đô ̣ gia tăng chất hữu cơ có trong đầm như thứ c ăn thừ a , sản . Sự biến đổi COD trong đầm nuôi tôm phẩm bài tiết củ a tôm và xác sinh vâ ̣t chết tăng dần từ đầu vu ̣ tớ i cuối vu ̣ 0,5 – 1,2mg/l, cuối vu ̣ nuôi có thể lên tớ i 10 - 12 mg/l [23]. Trong đầm nuôi , COD thườ ng biến đổi từ 1,9 - 6,5 mg/l tuy giá tri ̣ ở mứ c trung bình cao nhưng phù hơ ̣p cho tôm cá phát triển [23]. BOD phản ánh lươ ̣ng các chất hữu cơ dễ bi ̣ phân hủ y sinh ho ̣c có trong nướ c . Giá trị BOD càng lớn nghĩa là mức độ ô nhiễm hữu cơ càng cao . Tiêu chuẩn nướ c thủ y sản củ a FAO quy đi ̣nh giá tỉnh BOD < 10 mg/l, giớ i ha ̣n thích hơ ̣p của BOD từ 4 -8 mg/l [23].

Trong đầm nuôi trồng thủ y sản , các thông số BOD , COD càng giảm càng tốt vì điều đó chứng tỏ rằng trong đầm không phải tiêu thụ một lượng lớn oxy hòa tan (DO) trong nước để oxy hóa các chất cặn bã ở đáy đầm . Khi COD , BOD giảm thì DO trong nướ c tăng lên , làm cho nước đầm nuôi trồng thủy sản trong lành và sạch sẽ hơn. Cả hai thông số BOD và COD đều xác định lượng chất hữu cơ có khả năng

. BOD chỉ để thể hiê ̣n oxy hóa nhờ

bị oxy hóa có trong nước nhưng chúng khác nhau về ý nghĩa lươ ̣ng chất hữu cơ dễ bi ̣ phân hủ y sinh ho ̣c nghi ̃a là các chất hữu cơ bi ̣ vi sinh vâ ̣t . COD thể hiê ̣n toàn bô ̣ các chất hữu co có thể bị oxy hóa bằng các tác nhân hóa ho ̣c . Do vâ ̣y , tỉ số BOD / COD luôn nhỏ hơn 1, chỉ số này cao chứng tỏ môi trườ ng đầm nuôi bi ̣ ô nhiễm bở i các chất hữu cơ sinh ho ̣c dễ tan , dễ phân hủ y (thứ c ăn thừ a , chất thải củ a tôm , cá, xác thủ y sinh vâ ̣t ch ết) [37]. 1.4.6. Mâ ̣t độ vi tả o, Vibrio spp. và vi khuẩn tổng số

Vi khuẩn lam và các loài vi tảo là nhóm sinh vâ ̣t đơn giản nhất có khả năng

dụng các

quang hơ ̣p . Chúng sử dụng cacbonic hoặc cacbonat là nguồn cabon và sử muối photpho và nitơ vô cơ để phát triển theo sơ đồ [37]:

Năng lượng ánh sáng

CO2 + PO4 +nNH3 phát triển tế bào m ới +n O2

17

Các kết quả phân tích các mẫu thực vật nổi vùng nước cửa sông ven biển đã

xác định được 72 loài thuộc các ngành Tảo silic , vi khuẩn lam , tảo lục và tảo mắt .

(86,1% tổng số loài ). Hầu hết các loài trong ngành tảo silic là

, thích nghi với độ muối rộng . Ở

cao, tảo silic chiếm ưu thế gần như tuyệt đối . Tảo silic

(zooplankton) và tôm . Ở vùng nước nằm

. Tuy nhiên , đầm nuôi có mâ ̣t đô ̣ tả

[37], [38]. Mâ ̣t đô ̣ tảo cũng là chỉ thị ô

Số lươ ̣ng các loài kể trên còn thấp hơn nhiều so với số thực có trong mặt nước tự nhiên. Trong số thành phần loài đã xác đi ̣nh đươ ̣c , tảo silic có 62 loài, chiếm ưu thế về số lươ ̣ng loài những loài nhiê ̣t đớ i trong nhóm sinh thái xa bờ những thủ y vực có đô ̣ muối là thức ăn quan trọng cho động vật phù du ngành tảo lam chiếm ưu thế sâu trong sông có đô ̣ mă ̣n thấp hoă ̣c ngo ̣t hoàn toàn thì [11]. Mâ ̣t đô ̣ tảo là cơ sở cho chuỗi thứ c ăn ở nướ c . Giữa năng suất tôm và mâ ̣t đô ̣ tạo có sự liên hệ vô cùng quan trọng . Mă ̣t nướ c có mâ ̣t đô ̣ tảo thấp là mă ̣t nướ c chết về phương diê ̣n sản xuất o quá lớ n cũng gây nhiều bất lươ ̣ng cho năng suất và môi trườ ng nhiễm nướ c do phú dưỡng hóa trong đầm nuôi thủ y sản .

Vi khuẩn Vibrio spp. trong các đầm nuôi rất phong phú

, có xu hướng t ăng dần theo thờ i gian nuôi , đa ̣t giá tri ̣ cực đa ̣i vào cuối mù a vu ̣ . Kết quả nghiên cứ u củ a Nguyễn Tro ̣ng Nho và ctv (1996) [23] ở các tỉnh Nam Trung Bộ , đầm nuôi bi ̣ bê ̣nh có số lươ ̣ng vi khuẩn Vibrio spp. tổng số từ 110 – 1500 tế bào/ml. Viê ̣c đi ̣nh lươ ̣ng vi khuẩn Vibrio sp. rất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước cũng như

xác định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đầm nuôi tôm .

Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số là chỉ tiêu xác đi ̣nh điều kiê ̣n v

tổng số có chiều hướ ng tăng dần theo thờ i , nguồn nướ c bi ̣ ô nhiễm từ các

ệ sinh cũng như mức đô ̣ nhiễm bẩn do các hơ ̣p chất hữu cơ , chất thải củ a tôm cá, thứ c ăn thừ a , xác thủy sinh vâ ̣t chết đồng thờ i dự báo tình hình di ̣ch bê ̣nh trong đầm nuôi và nguồn nướ c cung cấp cho đầm nuôi . Lươ ̣ng vi khuẩn gian nuôi , đă ̣c biê ̣t vào thờ i gian có lươ ̣ng mưa lớ n con sông đổ ra . Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số ở nguồn nướ c cung cấp cho đầm nuôi tôm cao hơn nhiều so vớ i tr ong đầm nuôi . Môi trườ ng nướ c có mâ ̣t đô ̣ vi khuẩn cao hơn 107 tế bào/ ml có dấu hiê ̣u bi ̣ ô nhiễm nhe ̣ , dịch bệnh có thể phát sinh [2]. 1.4.7. Nitơ tổng số

Trong nướ c , ammon thườ ng tồn ta ̣i ở da ̣ng NH 3 và NH 4

+. Ammon là sản phẩm k hoáng hóa đầu tiên của các chất hữu cơ , có thể được thực vật phù du hấp thụ trong quá trình quang hơ ̣p hoă ̣c bi ̣ dụng của vi sinh vật

oxy hóa tạo thành muối nitrit và nitrat dưới tác

, quá trình này được gọi là quá trình n itrat hóa . Amôni ở dạng

18

+ không gây đô ̣c cho các loài thủ y sinh vâ ̣t trừ khi hàm lươ ̣ng quá cao

. NH3 là , tuy nhiên NH3 chịu ảnh hưởng của pH ,

Nitrit (NO2 NO2

. Ngoài ra , NO2

NH4 chất gây đô ̣c cho các l oài thủy sinh vật nhiê ̣t đô ̣ và đô ̣ mă ̣n . Khả năng gây độc của N H3 đối vớ i tôm sú cũng có sự khác . Trong đầm nuôi tôm sú , nếu ở nhiê ̣t đô ̣ nhau theo nhiê ̣t đô ̣ và đô ̣ mă ̣n củ a đầm nuôi 3 kém hơn và ngược thấp và đô ̣ mă ̣n cao thì khả năng chi ̣u đựng củ a tôm sú vớ i NH lại, khi ở nhiê ̣t đô ̣ cao v à độ mặn thấp thì khả năng chịu đựng đối với NH 3 tốt hơn. - thườ ng - ) rất cần thiết cho hoa ̣t đô ̣ng củ a thực vâ ̣t phù du - còn là [1].

1 kg nướ c biển sau khi

. Chlorinity đươ ̣c xác đi ̣nh bằng phương

tồn ta ̣i ở da ̣ng trung gian và hàm lươ ̣ng trong nướ c rất thấp chỉ t iêu vê ̣ si nh, yếu tố chỉ thi ̣ củ a quá trình tự làm sa ̣ch nướ c trong tự nhiên Dạng nitrit thường vô hại nhưng trong môi trường nước mà hàm lượng chlorinity (chlorinity là khối lươ ̣ng củ a clo tính bằng gram chứ a trong bromua và iod đươ ̣c thay thế bằng cloride pháp chuẩn độ , đây là mô ̣t trong những phương pháp xác đi ̣nh nồng đô ̣ muối củ a nướ c biển ) thấp thì nitrit sẽ gây đô ̣c cho tôm cá . Nitrit gây đô ̣c cho tôm , cá là vì oxy tớ i tế bào . chúng tạo thành chất methemoglobin làm giảm quá trình vận chuyển Nitrit cũng có thể kết hơ ̣p vớ i hơ ̣p chất mang gốc CN - và giải phóng gốc này ra khỏi phứ c chất xianua gây đô ̣c ma ̣nh ch o đầm nuôi .

- ) là sản phẩm của sự khoáng hóa các chất hữu cơ chứ a nitơ, cần thiết cho sự p hát triển của thực vật phù du. Tuy nhiên , nếu hàm lươ ̣ng nitrat trong đầm tôm cá vươ ̣t quá 7 mg/l thì môi trườ ng bi ̣ phú dưỡ ng và bi ̣ nhiễm bẩn [2].

-, có tính

+, NH3, NO2

-, NO3

Nitrat (NO3

Trong môi trườ ng nướ c , mối quan hê ̣ giữa NH 4

liên tu ̣c và liên quan chă ̣t chẽ vớ i nhau .

Nitrosomonas bacteria

- + H2O + H+

NH3 + 1,5 O2 NO2

Nitrobacter bacteria

- -, NO3

NO2 + 0,5 O2 NO3

-, mứ c đô ̣ tiêu tốn lươ ̣ng - cần đến 3,43

Trong quá trình oxy hóa ammon thành NO 2

oxy trong nướ c khá lớ n , để oxy hóa 1 mg amôni ở giai đoạn tạo NO 2 - là 4,5 mg O2. Quá trình nitrat hóa quan trọng trong mg O2, còn ở giai đoạn tạo NO 3 nông nghiê ̣p vì nó chuyển hóa muối amô ni thành nitrat là nguồn thứ c ăn tốt cho cây trồng. Trong nuôi trồng thủ y sản , amôni, nitrit, nitrat đều là chất đô ̣c . Do đó , quá trình nitrat hó a giải đô ̣c cho môi trườ ng nuôi trồng thủ y sản .

19

3- )

1.4.8. Photphat (PO4

2-) và orthophotphat dihydro (H2PO4 3- [14]. Hàm lượng PO4

Photphat là chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển củ a rong

PO4

, tảo, trong 3-), orthophotphat monohydro 3-). Trong phân tích mẫu nướ c thườ ng chỉ 3- thườ ng thấp , ít khi vượt quá 1 mg/l, đa phần 3- đươ ̣c bù n đáy hấp thu và trở lại môi trường . Trong cá c đầm nuôi 3- bị kết tủa nhiều . Vì vậy , 3- thích

nướ c, photphat tồn ta ̣i ở 3 dạng là : orthophotphat (PO4 (HPO4 xác định PO 4 hàm lượng PO4 có chất đáy phèn chua nhiều ion nhỏ và sắt thì lượng các đầm nuôi có đáy chua phèn cần được bón nhiều phân lân. Hàm lượng PO4 hơ ̣p cho đầm nuôi là 0,5 mg/l [38].

Trong nướ c , tảo sử dụng CO 2, nitơ vô cơ , orthophotphat và các chất dinh

dưỡng khác để phát tri ển. Tuy nhiên , khi nồng đô ̣ amônia và photphat cao , rong tảo phát triển mạnh tạo sinh khối tới mức động vật phù du và tôm cá trong đầm không thể tiêu thu ̣ hết sẽ dẫn đến tình tra ̣ng bù ng nổ các loa ̣i rong , tảo. Tình trạng này kéo dài sẽ làm cho đầm , hồ bi ̣ phú dưỡng hóa , nướ c đu ̣c và có că ̣n lắng , có mùi khó chịu do tảo bi ̣ phân hủ y , gây giảm oxy trong nướ c . Trong điều kiê ̣n đó thì tôm, cá sẽ sinh trưở ng châ ̣m và dễ mắc bê ̣nh [37]. 1.4.9. Sulphuahydro

Sulphuahydro trong thủ y vực đươ ̣c hình thành do hoa ̣t đô ̣ng phân hủ y chất

ử sulphat

[31]. Trong môi trườ ng nướ c các đầm nuôi trồng

. pH và nhiê ̣t đô ̣ thấp

2- + 8H+  S2- + 4 H2O

hữu cơ củ a vi khuẩn trong điều kiê ̣n yếm khí và vi khuẩn lưu huỳnh kh trong nướ c nơi có nhiều sulphat thủy sản , sulphuahydro thườ ng tồn ta ̣i ở mô ̣t số da ̣ng như : H2S, HS-, S2-. Tuy nhiên , trong các da ̣ng trên chỉ có da ̣ng H 2S là gây đô ̣c cho các thủ y sinh vâ ̣t , mứ c đô ̣ gây (nhiê ̣t đô ̣ đô ̣c có liên quan đến nhiê ̣t đô ̣ và pH củ a đầm nuôi 200C và pH = 5) tồn ta ̣i tớ i 99% là H 2S gây đô ̣c [48]. Các giai đoạn biến đổi tạo ra H2S như sau:

2- + 2(CH2O) + 2 H+  H2S + 2 CO2 + 2 H2O

:

SO4 S2- + H+  HS- HS- + H+  H2S Phương trình tổng quá củ a quá trình khử sunphat SO4 Vì vậy , môi trườ ng axit cung cấp nhiều ion H + phản ứng phân hủy chất hữu

. Theo cơ trong nướ c luôn t ạo ra H 2S gây đô ̣c cho tôm cá và các thủ y sinh vâ ̣t khác

20

, hàm lượng H 2S không (1994) [21], trong đầm nuôi tôm cá

Nguyễn Tro ̣ng Nho đươ ̣c quá 0,1 mg/l.

Bảng 1.2. Tiêu chuẩ n chấ t lƣợng nƣớ c nuôi trồng thủ y sả n

(Khoa thủ y sản , trường đa ̣i ho ̣c Cần Thơ , 2000) [16]

chỉ tiêu giớ i ha ̣n

23-30 nhiê ̣t đô ̣ nướ c (0C)

màu nước xanh nõn chuối

6,5 – 8,5 đô ̣ pH

5-8 O2 (mg/l)

CO2 3-10

NH4+ 1,0

0,5 PO4 3-

Fe tổng số <0,3

10 – 20 COD (mg O2/ l)

0,0 H2S

18 - 30 Độ mặn (%0)

1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi trƣờ ng nƣớ c nuôi trồng thủ y sả n . 1.5.1. Vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước nuôi tôm, cá

Đầm nuôi tôm, cá là những hệ sinh thái nước không đặc trưng do chịu nhiều

tác động của con người. Tuy vậy, cũng giống như khu hệ sinh thái nước tự nhiên

khác, hệ sinh thái đầm nuôi tôm, cá được cấu thành bởi nước, khoáng chất, các hợp

chất hữu cơ hòa tan và hệ thủy sinh vật. Vi sinh vật là một thành phần quan trọng

của hệ thủy vi sinh vật ở đây bởi chúng không những đóng vai trò chủ đạo trong các

chu trình chuyển hóa các nguyên tố cơ bản cấu tạo nên hợp chất hữu cơ mà tác

động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản của người nuôi trồng [13], [35].

Vi sinh vật hữu ích trong nước nuôi tôm bao gồm các nhóm có khả năng phân giải

21

và tái vô cơ hóa các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các hợp chất vô cơ, đồng thời bản

thân chúng cũng không gây hại với tôm (không sinh ra s ản phẩm độc hại, không

gây bệnh). Hoạt động sống của chúng sẽ giúp ích cho việc cải thiện chất lượng môi

trường nước, ổn định pH, tạo điều kiện môi trường không thuận lợi đối với các vi

sinh vật gây hại, cạnh tranh và ức chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh ở

tôm cá, qua đó giúp tôm, cá tăng trưởng nhanh, khỏe mạnh và môi trường sinh thái

trong đầm được cân bằng [28].

Trong môi trường nước nuôi tôm, cá luôn tồn tại các hợp chất hữu cơ từ

nhiều nguồn khác nhau như: lượng thức ăn dư thừa, phân tôm cá, chất tiết ra từ mọi quá trình trao đổi chất của thủy sinh vật, xác động vật, thực vật phù du…[4]. Do đó,

nếu nồng độ của chúng trong nước quá cao sẽ gây ô nhiễm nguồn nước và dẫn tới

các hội chứng sốc ở tôm, cá. Hoạt động tích cực của các vi sinh vật phân giải các

hợp chất hữu cơ sẽ giúp giải phóng những tồn tại hữu cơ gây ô nhiễm nguồn nước,

đồng thời bổ sung trực tiếp hoặc gián tiếp vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho động

vật nuôi trồng [43]. Cơ chế các hoạt động phân giải chất hữu cơ ở vi sinh vật hữu

ích chính là cơ chế của các quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng trong cơ

thể chúng. Nấm, động vật nguyên sinh và đa số vi khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng nên

chúng cần chất hữu cơ từ bên ngoài môi trường để làm thức ăn. Chúng sử dụng

những chất này để thu nhận các tiền chất cho việc xây dựng nên tế bào của mình và

thu nhận năng lượng cho các quá trình sống. Khi đó vật chất hữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và cuối cùng trong những điều kiện

phù hợp thì chuyển hóa ngược lại thành những chất vô cơ ban đ ầu. Trong môi

trường nước nuôi tôm, cá các loại chất hữu cơ thường chiếm tỷ lệ lớn là: protein,

cacbonhidrat, kitin,… Sự phân hủy protein trước hết là nhờ nhiều loại vi khuẩn như

Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và họ vi khuẩn Enterobacteriaceae [34]. Đại

diện cho nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các hợp chất cacbonhidrat bao gồm

các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter … Các

nghiên cứu cụ thể hơn còn cho thấy bên cạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nhóm

vi khuẩn này còn có khả năng cạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển của các vi

khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas [35], [39], [61].

Môi trường nước nuôi tôm, cá vốn là một môi trường giàu dinh dưỡng, thức

ăn giàu đạm luôn được con người cung cấp dư thừa, ngoài ra còn từ phân tôm, cá và xác động vật thủy sinh. Mặt khác, một số hợp chất nitơ vô cơ như NH3 là một khí

22

- là tác nhân gây ung thư đối với nhiều động vật. Do đó, vai trò độc với tôm và NO3 phân giải hợp chất nitơ hữu cơ của nhóm vi khuẩn amôn hóa, nhóm vi khuẩn nitrat

hóa và nhóm vi khuẩn phản nitrat hóa đặc biệt được quan tâm. Tuy nhiên, chỉ một

số ít vi sinh vật (vi khuẩn sống tự do trong đất và nước, vi khuẩn sống cộng sinh với

thực vật, vi khuẩn quang hợp,…) có khả năng cố định nitơ phân tử thành dạng nitơ hợp chất mà các vi sinh vật khác có thể sử dụng được. Dạng amôniac (NH3) và -) được tảo và nhiều vi sinh vật hấp thụ tạo nên nguồn nitơ hữu cơ, sau nitrat (NO3 đó có thể chúng lại trở thành nguồn thức ăn cho động vật thủy sinh.

- Nhóm vi khuẩn amôn hóa: Nhóm này phân giải protein và các hợp chất

hữu cơ chứa nitơ tạo thành amôniac, hoạt động của nhóm vi khuẩn amôn hóa giúp

loại bỏ các hợp chất hữu cơ gây ô nhiếm nguồn nước nuôi tôm, cá góp phần tạo nên

một môi trường trong sạch cho tôm cá phát triển.

- Nhóm vi khuẩn nitrat hóa: vi khuẩn amôn hóa là vi khuẩn hữu ích, song + quá cao vượt sản phẩm mà chúng sinh ra là NH3, nếu trong nước nồng độ NH4 mức cho phép sẽ gây hại cho động vật nuôi trồng [1]. Nhóm vi khuẩn nitrat hóa đó

là các chi Nitrosomonas, Nitrococus, Nitrobacter, Nitrospira,… được xếp vào

nhóm vi khuẩn hữu ích trong môi trường nước nuôi tôm cá vì chúng có khả năng - (dạng không độc với môi trường và các sinh vật khác + thành NO3 chuyển hóa NH4 - do hoạt động của chúng sinh ra lại có thể được đồng trong đầm). Mặt khác, NO3 hóa trong tổng hợp protein của nhiều sinh vật và tảo. Như vậy, nhóm vi khuẩn nitrat hóa không chỉ làm giảm độ độc của nước mà còn góp phần làm mới nguồn nước,

- Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus… là các vi khuẩn có khả năng khử NO3 khí quyển, giúp khép kín vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực, đồng thời thành N2 hạn chế một tác nhân gây hại cho động vật nuôi trồng. Trong nước nuôi tôm cá

mang lại các chất dễ hấp thụ cho động vật thủy sinh [51], [55].

cũng như tại các nhà máy xử lý nước thải, số lượng và hoạt động sinh lý của nhóm

vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn phản nitrat hóa được xem như các thông số giới hạn

tốc độ quá trình chuyển hóa sinh học của nitơ trong nước [26].

Vi sinh vật dị dưỡng sinh trưởng và thu nhận năng lượng bằng nhiều phản

ứng xúc tác enzym. Các enzym có tính đặc hiệu cơ chất cũng như có hiệu quả xúc

tác chuyển hóa cao. Một số enzym cũng tham gia vào chuỗi các phản ứng sinh hóa

để hiệp đồng chuyển hóa một số cơ chất khó phân hủy. Có 2 loại enzym là enzym nội bào vào enzym ngoại bào. Enzym ngoại bào phân hủy các cơ chất cao phân tử

23

thành các phân tử nhỏ hơn để có thể di chuyển vào tế bào qua màng sinh chất.

Enzym nội bào xúc tác các phản ứng oxy hóa cơ chất thu năng lượng và sinh tổng

hợp trong tế bào. Trong quá trình phân hủy cơ chất hữu cơ, vai trò hàng đầu thuộc

về các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp các enzym thủy phân ngoại bào.

1.5.2. Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong việc cải tạo nước đầm nuôi t rồng thủ y sả n

 Định nghĩa về Probiotic

Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế giới WHO, probiotic là “những vi sinh

. Thuâ ̣t ngữ probiotic đươ ̣c dù ng để

[54]. Gần đây , đi ̣nh

vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của cơ thể” [48]. Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy La ̣p , ghép từ chữ pro l à vì và biotic là sự sống, nên tiếng Viê ̣t thườ ng go ̣i là trơ ̣ sinh mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vâ ̣t có tác du ̣ng tăng trưở ng vi sinh vâ ̣t hoă ̣c sinh vâ ̣t khác . Năm 1959, Rl Fuller đi ̣nh nghi ̃ a rõ hơn . Probiotics hay vi sinh vâ ̣t probiotic là những vi sinh vâ ̣t sống , bổ sung vào thứ c ăn có tác du ̣ng cân bằng hê ̣ vi khuẩn đườ ng ruô ̣t và có tác du ̣ng hữu ích cho đô ̣ng vâ ̣t chủ nghĩa này được mở rộng hơ n. Probiotic là chế phẩm bao gồm vi sinh vâ ̣t sống có tác . Tác dụng hữu ích bao gồm tác dụng dụng hữu ích cho động vật và người sử dụng

làm cân bằng hệ vi sinh đường ruột hay sinh chất đối kháng làm giảm số lượng cá thể hay tăng lươ ̣ng kháng thể kích thích hê ̣ thống miễn di ̣ch hoă ̣c là cung cấp enzym trong quá trình trao đổi chất củ a vi khuẩn . Probiotic là giảm các vi sinh vâ ̣t có ha ̣i (các vi sinh vật cạnh tranh th ức ăn và tiết các chất đô ̣c ản h hưở ng xấu tớ i hoa ̣t đô ̣ng sống củ a vâ ̣t chủ ), làm tăng các vi sinh v ật có lợi (đó là các sinh vâ ̣t ca ̣nh tranh th ức , chún g tiết ra các chất diê ̣t khuẩn ăn và vi ̣ trí bám vào các mô vớ i vi sinh vâ ̣t có ha ̣i và vitamin K cho cơ thể ).

Ngày nay, khái niệm probiotic còn được mở rộng sang lĩnh vực môi trường.

Đưa probiotic vào môi trường nước để tạo sự cân bằng giữa các vi sinh vật trong môi trường. Ở nước ta, việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủ y sản và sản xuất giống chỉ mới ứng dụng nhiều từ năm 2000 trở lại đây, qua thực tế

sử dụng đã cho thấy kết quả tốt. Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở nuôi tôm

cá đều sử dụng chế phẩm vi sinh vật probiotic. Với mục tiêu tăng nhanh sản lượng,

người ta thả tôm, cá với mật độ quá dày trong khi không có biện pháp xử lý môi

+, NO2

-, NO3

trường thích hợp, dẫn đến hiện tượng thối đầm, làm giảm oxy hòa tan khiến tôm, cá -, H2S… tăng cao sẽ khiến tôm cá ngạt thở. Hàm lượng các NH3, NH4

24

giảm sự chống đỡ với môi trường bất lợi và tác nhân gây bệnh, nếu vượt quá

ngưỡng sẽ chết.

 Probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản

Probiotic là chế phẩm củ a công nghê ̣ sinh ho ̣c ứ ng du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong

các vấn đề thực tiễn . Trong nuôi trồng thủ y sản , probiotic hiê ̣n đang đươ ̣c coi là mô ̣t liê ̣u pháp an toàn và hiê ̣u quả nhằm thay thế cho các loa ̣i thuốc kháng sinh và hóa chất đã đươ ̣c sử du ̣ng trướ c đây [26].

Probiotic có thành phần là mô ̣t chủ ng đơn hoă ̣c mô ̣t h ỗn hơ ̣p các chủ ng vi

, chúng có khả năng cạnh tranh ức chế

sinh vâ ̣t hữu ích . Nhóm vi sinh vật hữu ích ấy tham gia tích cực vào các quá trình phân hủ y sinh ho ̣c bù n và chất thải hữu cơ các vi sinh vật gây bệnh cho động vật hủy sinh

, chúng rất an toàn với môi trườ ng và . Đối với các hình thức nuôi trồng

đô ̣c tố trong đầm , chủ yếu là NH 3

cũng không gây độc hại đối với người và vật nuôi khác nhau , viê ̣c sử du ̣ng chế phẩm sinh ho ̣c đươ ̣c nhìn nhâ ̣n như biê ̣n phấp tích cực nhất bở i vì chế phẩm sinh ho ̣c có tác du ̣ng giảm và H 2S, giảm mùi hôi , cải thiện màu nước , ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong đầm. Chế phẩm sinh ho ̣c cũng có tác du ̣ng phòng bê ̣nh , giảm thiểu hiện tượng gây bê ̣nh cho tôm . Ngoài ra , việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy

, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn ,

20 – 30% [60]. Bên ca ̣nh đó , viê ̣c sử du ̣ng chế phẩm

. Thực tế thủy sản khá

sản còn giúp đối tượng nuôi hấp thụ thức ăn dễ hơn tăng năng suất thu hoa ̣ch từ sinh ho ̣c tron g nuôi trồng thủ y sản sẽ ha ̣n chế viê ̣c sử du ̣ng hóa chất và chất kháng sinh, yếu tốt gây ra hâ ̣u quả củ a viê ̣c nuôi trồng thủ y sản kém bền vững cho thấy , những cơ sở sử du ̣ng chế phẩm sinh ho ̣c đã đa ̣t năng suất cao, giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh .

Sử du ̣ng chế phẩm probiotic cho kết quả ưu viê ̣t hơn hẳn sử du ̣ng hóa chất

cũng như thuốc kháng sinh vì hóa chất chỉ làm sạch nước tạm thời và chúng giết chết hàng loa ̣t tảo tro ng đầm . Hơn nữa , thay vì cần phải làm sa ̣ch chất hữu cơ và , lắng că ̣n bù n thì hóa chất la ̣i góp phần hình thành nên lớ p bù n dày hơn ở đáy đầm . Bên ca ̣nh đó , nhiều loài tôm, cá tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển và động vật thủy sinh khác cũng có thể bị giết chết bởi hóa chất . Hâ ̣u quả củ a viê ̣c dùng thuốc kháng sinh cũng không kém phần nghiêm trọng . Chất kháng sinh cũng giết chết nhiều loa ̣i vi khuẩn , kể cả vi khuẩn gây ha ̣ i lẫn vi khuẩn có ích , do đó làm giảm tốc độ các quá trình các quá trình chuyển hóa sinh học trong nước , đồng thờ i , giảm khả năng tạo miễn dịch tự nhiên của chúng . Hơn nữa , sử du ̣ng thuốc kháng

25

. Hiê ̣n chuỗi thứ c ăn khi con . Vì thế , hiê ̣n nay các loa ̣i thuốc . Mă ̣t khác , tôm cá là , dễ bi ̣ tổn thương và bi ̣ tấn công bở i nhiều

sinh lâu dài sẽ dẫn đến xuất hiê ̣n các chủ ng vi khuẩn gây bê ̣nh kháng thuốc tươ ̣ng kháng thuốc cũng có thể xuất hiê ̣n ở ngườ i thông qua ngườ i sử du ̣ng các sản phẩm thủ y sản nuôi trồng kháng sinh đều bi ̣ cấm sử du ̣ng trong nuôi trồng thủ y sản những sinh vâ ̣t rất nha ̣y cảm vớ i bê ̣nh tâ ̣t tác động, đôi khi viê ̣c sử du ̣ng chất kháng sinh liên tu ̣c đã là m mất đi sản lươ ̣ng tôm cá khổng lồ , ví dụ vở nhiều nơi trên thế giới đã từng bị mất đến 80% sản lượng thủy

,

sản. Như vâ ̣y , rõ ràng cần phải có một sự kiểm soát khác thay thế thuốc kháng sinh hóa chất và probiotic đã t hể hiê ̣n đươ ̣c vai trò ấy .

Hiện nay các loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang

dưỡng, hóa dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh học.

Những nghiên cứu cho thấy rằng các loài vi khuẩn này đều không độc hại, dễ nuôi

cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước và đất nghèo dinh dưỡng. Chúng có khả năng

phân huỷ thức ăn thừa, chất thải hữu cơ và làm sạch môi trường nhờ enzym do

chúng tổng hợp được. Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh các chất kháng khuẩn

như bacteriocin, một chất có hoạt tính kháng sinh được dùng nhiều trong chăn nuôi,

bảo quản thực phẩm để nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn

của vật nuôi, làm giảm sự phát triển của những vi sinh vật có hại. Chính nhờ những

đặc điểm này mà chúng được dùng để sản xuất các chế phẩm nhằm cải thiện môi

trường nước, nâng cao hiệu suất kinh tế, hạn chế dịch bệnh cho tôm cá.

 Mục đích của việc sử dụng chế phẩm probiotic

Trong nuôi trồng thủy sản sử dụng chế phẩm probiotic nhằm các mục đích:

- Giảm độc tố trong ao ở mức thấp nhất, giảm mùi hôi thối của nước.

- Cải thiện màu nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong ao.

- Phân hủy các chất hữu cơ, phòng tảo nở hoa, hấp thu nguồn tảo chết trong

ao, giảm độ nhớt của nước.

- Cạnh tranh thức ăn làm giảm lượng vi khuẩn có hại, phòng bệnh.

- Tăng sự hòa tan oxy.

- Kích thích hệ miễn dịch trong tôm để kháng bệnh, giảm sốc khi môi trường

thay đổi đột ngột.

- Giúp tôm cá hấp thu thức ăn tốt, giảm hệ số tiêu tốn thức ăn.

- Hạn chế được sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất.

26

- Giảm số lần thay nước trong quá trình nuôi.

 Một số nhóm vi khuẩn thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất

probiotic cho tôm cá

 Nhóm Bacillus

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, trong rất nhiều

môi trường (đất, nước, không khí, thực phẩm…) và gồm nhiều nhóm sinh lí sinh

thái khác nhau (ưa ấm, ưa nhiệt, ưa lạnh…), với gần khoảng gần 500 loài và dưới

loài. Do sự đa dạng sinh thái và đa dạng loài như vậy các hoạt chất sinh học của

chúng cũng vô cùng phong phú: các enzym ngoại bào, các chất kháng khuẩn và kháng nấm, các chất kích thích sinh trưởng thực vật, các chất hoạt động bề

mặt…[32]

Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, hình que, có bào tử, sinh trưởng

trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, thuộc nhóm vi khuẩn dị dưỡng

hoại sinh. Về dinh dưỡng và sinh trưởng nhìn chung Bacillus là những vi khuẩn hóa

tự dưỡng hữu cơ tùy tiện có khả năng sử dụng nhiều các hợp chất hữu cơ đơn giản

như là các đường, axit amin, các axit hữu cơ. Trong một số trường hợp chúng lên

men cacbonhydrat thông qua chuỗi các phản ứng phức tạp tạo ra glycerol và

butanediol. Một số ít loài như Bacillus megaterium lại không cần đến các yếu tố

sinh trưởng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại cần có vitamin B ho ặc các axit

amin. Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30 - 45oC một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65oC. Một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 0oC. pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 -11. Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 như Bacillus

alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius [32].

Trừ Bacillus anthracis gây bệnh than cho người, tất cả các Bacillus khác

được coi là không độc hại cho người. Bacillus làm sạch môi trường nước nhờ khả

năng sinh enzym phân hủy chất hữu cơ nguồn gốc từ thức ăn thừa, chất thải từ tôm

cá: proteaza phân hủy protein, amylaza phân hủy tinh bột, xenlulaza phân hủy

xenlulozơ, kitinaza phân giải kitin. Ngoài chức năng phân giải các hợp chất hữu cơ

làm sạch môi trường thì chúng còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển quá mức vi

sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn

ở trạng thái cân bằng sinh học. Đặc điểm quan trọng nhất của chi Bacillus là có khả năng tạo nội bào tử, nhất là trong những điều kiện bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh

27

dưỡng hay điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ hóa chất… Bào tử Bacillus

có thể tồn tại rất lâu thậm chí trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có thể

nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng. Trong quá trình hình thành bào tử,

Bacillus thường sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực. Một trong những đặc tính đó là sinh enzym phân hủy hữu cơ như

proteaza, amylaza, xenlulaza. Proteaza là enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit

(CO-NH) trong phân tử protein và các chất tương tự. Sản phẩm thủy phân là các

axit amin, sản phẩm trung gian là các peptit có mạch dài ngắn khác nhau. Enzym

amylaza có tác dụng thủy phân tinh bột. Quá trình trải qua giai đoạn dextrin hóa, khi đó chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng

dextrin và giai đoạn đường hóa. Trong giai đoạn này các dextrin vừa được tạo thành

bị phân hủy tiếp thành các phân tử thấp hơn như maltozơ, isomaltozơ, glucozơ.

Enzym xenlulaza xúc tác sự thủy phân xenlulozơ thành s ản phẩm trung gian

xenlubiozơ và sản phẩm cuối cùng là glucozơ. Các sản phẩm cuối cùng của sự phân

hủy chất hữu cơ nhờ hệ enzym proteaza, amylaza, xenlulaza là các axit amin và

glucozơ. Đó là nguồn dinh dưỡng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng

phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước [32].

 Nhóm vi khuẩn lactic

Một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm

nuôi tôm cá là nhóm vi khuẩn lactic. Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau có

hình dạng và kích thước khác nhau. Nhưng nhìn chung chúng được chia thành hai

loại hình cầu và hình que. Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic

còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào.

Streptococcus có tế bào hình cầu hoặc hình ovan, đường kính khoảng

0,5 -1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài. Tuy nhiên, một số

chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài

lớn hơn chiều rộng, chẳng hạn như Streptococus lactic [9].

Leuconostoc có hình dạng hơi dài ho ặc hình ovan, đường kính từ 0,5 - 0,8µm

và chiều dài khoảng 1,6µm. Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng

1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám [9 ].

Lactobacillus có hình que. Đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất. Hình dạng của chúng thay đổi từ hình cầu cho đến hình que dài. Chẳng hạn L. plantatum có

28

dạng hình que kích thước từ 0,7-1,1µm đến 3-8µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng

riêng lẻ, trong khi L. casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình

que mảnh, đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay chuỗi [9].

Về hình thái, vi khuẩn lactic có hình dạnh không đồng nhất. Nhưng về mặt

sinh lý chúng lại có những điểm tương đối đồng nhất. Chúng đều là những vi khuẩn

Gram (+), không có khả năng tạo bào tử, không di động, sinh axit lactic trong quá

trình phát triển, catalase, oxydase và khử nitrat âm tính, không chứa các xitocrom,

hô hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí [10].

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng cũng khác nhau. Chúng không những cần cung cấp đủ các chất dinh dưỡng: cacbon, nitơ, muối

khoáng… mà còn cần các chất kích thích sinh trưởng.

Nhóm vi khuẩn lactic có khả năng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi

trường nhờ sinh chất đối kháng như axit lactic, bacteriocin. Ngoài vai trò kiểm soát

vi sinh vật gây bệnh trong môi trường thì chúng cũng có tác dụng làm giảm mùi hôi

của đầm nuôi. Quan trọng hơn cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này còn có tác dụng hạn

chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩm

thủy sản. Khi sử dụng nhóm vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoài

mục đích làm cân bằng khu hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi

sinh vật có hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng còn có

tác dụng tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [5].

 Nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dƣỡng

Trước đây, theo phân loại truyền thống đã xếp các chủng vi khuẩn nitrat hóa

chung vào cùng một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae sau đó, dựa vào khả năng

oxy hóa các cơ chất vô cơ của vi khuẩn nitrat hóa mà người ta đã chia chúng thành

2 nhóm, đó là nhóm vi khuẩn oxy hóa amôni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit [53].

 Vi khuẩn oxy hóa amôni hay còn gọi là vi khuẩn nitroso là nhóm vi

khuẩn Gram âm, hóa tự dưỡng và hiếu khí bắt buộc. Vi khuẩn này lấy năng

lượng từ quá trình oxy hóa amôni thành nitrit. Quá trình oxy hóa amôni xảy

ra theo phương trình sau:

29

Vi khuẩn oxy hóa amôni tự dưỡng lấy năng lượng và lực khử từ quá trình

oxy hóa amôni để sinh trưởng. Nguồn cacbon chính mà các tế bào vi khuẩn sử dụng là CO2 trong khí quyển thông qua chu trình Calvin-Benson. Các tế bào vi khuẩn sinh trưởng rất chậm, thời gian nhân đôi tế bào của vi khuẩn ít nhất là 7 - 8 giờ,

thậm chí cũng có thể kéo dài thêm vài ngày [42].

Trong hệ thống phân loại hiện nay, người ta chia nhóm vi khuẩn amôni hóa

thành 3 chi, dựa vào sự khác biệt về hình dạng tế bào, kiểu hình và tổ chức nội bào.

Đó là các chi Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira. Tế bào vi khuẩn thuộc

chi Nitrosomonas có hình que thẳng, chi này là phổ biến nhất trong nhóm vi khuẩn amôni hóa, có vùng phân bố rộng, chúng sống trong đất, nước ngọt, bùn, nước lợ,

biển. Chi Nitrosococcus tế bào có hình cầu đặc trưng, tế bào có roi nên có khả năng

di chuyển. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosospira có hình xoắn ốc[62].

 Nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit tự dưỡng được biết đến như là vi khuẩn tự

dưỡng hóa năng (chemoautotroph), Gram âm và hiếu khí. Giống như vi khuẩn oxy hóa amôni, vi khuẩn oxy hóa nitrit sử dụng nguồn cacbon là CO2 thông qua chu trình Calvin-Benson [41]. Quá trình oxy hóa nitrit xảy ra như

sau:

Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn oxy hóa nitrit phụ thuộc vào nồng độ cơ

chất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan. Các chủng vi khuẩn nitrit hóa

tự dưỡng sinh trưởng tốt ở nồng độ nitrit từ 2 - 30 mM, nồng độ nitrit quá cao có thể gây ức chế sinh trưởng của tế bào. Vi khuẩn oxy hóa nitrit có thể sinh trưởng

bình thường trong môi trường tự nhiên ở dải pH = 6 - 8. Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng là pH = 7 - 8. Nhiệt độ lý tưởng cho sinh trưởng của chúng là 25 - 30oC trong môi trường không khí [62].

Tốc độ của giai đoạn (1) xảy ra nhanh gấp 3 lần so với giai đoạn (2). Bằng

thực nghiệm người ta đã chứng minh rằng lượng oxy tiêu hao để oxy hóa 1mg nitơ của muối amôni ở giai đoạn tạo nitrit là 343 mg O2, còn ở giai đoạn tạo nitrat là 4,5 mg O2. Sự có mặt của nitrat trong nước thải phản ánh mức độ khoáng hóa hoàn thành các chất bẩn hữu cơ. Năng lượng sinh ra từ phản ứng nitrat hóa được vi khuẩn

sử dụng trong quá trình tổng hợp tế bào [5].

30

Ngày nay, vi khuẩn oxy hóa nitrit được phân loại thành 4 chi: Nitrobacter,

Nitrococcus, Nitrospina và Nitrospira. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter có

hình que ngắn, màng trong tế bào chứa mũ phân cực. Tế bào vi khuẩn thuộc chi

Nitrococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ống. Tế bào vi khuẩn thuộc chi

Nitrospina có hình que, màng trong tế bào dạng túi. Tế bào vi khuẩn thuộc chi

Nitrospira có hình xoắn và không xuất hiện màng trong tế bào [62].

Các vi khuẩn oxy hóa nitrit có khả năng thích nghi cao với các điều kiện môi

trường khác nhau và chúng thường tồn tại cùng với vi khuẩn oxy hóa amôni do các

vi khuẩn này đã cung cấp nitrit cho chúng trong môi trường hiếu khí [41].

Trong các chế phẩm dùng cho ao, đầm nuôi tôm cá hiện nay người ta thường

bổ sung nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dưỡng cụ thể là chi Nitrosomonas và chi

Nitrobacter. Vi khuẩn thuộc hai chi này đóng vai trò quan trọng trong việc giảm các

độc tố trong môi trường nước, chuyển hóa các chất độc như amôni và hợp chất nitơ,

do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá nuôi phát triển tốt [7] .

1.5.3. Ƣu điểm và nhƣợc điểm củ a biê ̣n phấ p sƣ̉ du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong xƣ̉ lý nƣớ c nuôi trồng thủ y sả n

- Ưu điểm: các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi

và đem lại nhiều lợi ích cho con người và môi

: an toàn đối vớ i ngườ i

trườ ng nướ c nuôi trồng thủ y sản trườ ng sống mà các phương pháp khác không có đươ ̣c như và động vật , đă ̣c hiê ̣u đối vớ i vâ ̣t chủ , thích hợp với các phương pháp phòng trừ khác, thờ i gian bán hủy ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả năng tự nhân lên (tự sinh sản ), có khả năng ức chế các vi sinh vật đã

kháng thuốc hóa học .

- Nhươ ̣c điểm: thờ i gian phát huy tác du ̣ng châ ̣m , tác động không triê ̣t để , , kết quả thu

hiê ̣u quả phương pháp chi ̣u ảnh hưở ng lớ n vào điều kiê ̣n ngoa ̣i cảnh đươ ̣c thườ ng không ổn đi ̣nh .

Để ha ̣n chế các nhươ ̣c điểm này , chúng ta cần phải tuyển chọn các chủng vi

sinh vâ ̣t có tính đối kh áng tốt nhất , nghiên cứ u sử du ̣ng kết hơ ̣p nhiều chủ ng .

31

Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng

2.1.1. Chủng giống

- Các chủng VSV dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ các chủng vi

khuẩn phân lập từ các mẫu đất, nước tại địa bàn Hà Nội.

- Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ bảo tàng giống chuẩn VSV, Viện

VSV và Công Nghệ Sinh học- ĐH Quốc gia Hà Nội, bao gồm các chủng E. coli ATCC 25922; Salmonella typhi ATCC 14028; Proteus mirabilis; Staphylococcus aureus ATCC 25923; Vibrio parahaemolyticus; Shigella flexneri ATCC 29903D; Fusarium oxysporum.

2.1.2. Hóa chất – thiết bi ̣

Hóa chất:

Các hóa chất làm môi trường: peptone, nước nắm, cao nấm men, cao thịt,

CMC, tinh bột tan, kitin, cazein, glucoza,… và nhiều hóa chất thông thường khác.

Dụng cụ:

- Buồng cấy vô trù ng (Pháp)

- Máy lắc Inforsagch – 4103 (Pháp).

- Tủ sấy , tủ ấm (Trung Quốc )

- Cân phân tích (Nhâ ̣t ) - Nồi khử trù ng Tomy SS 325 (Nhâ ̣t ) - Máy đo DO meter Hanna HI 8043 (Hàn Quốc ).

- Máy đo pH Hanna 8733 (Hàn Quốc ).

- Tủ cấy (Trung Quốc )

- Tủ ổn nhiệt (Nhâ ̣t )

- Tủ lạnh (Nhâ ̣t )

- Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)

- Máy li tâm

2.1.3. Môi trườ ng

2.1.3.1. Môi trườ ng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trườ ng tha ̣ch thườ ng cải t iến (g/l):

32

Peptone: 10g Thạch : 14 -15 g

Nướ c mắm : 10ml Nướ c cất: 1 lít

- Môi trườ ng MRS (g/l)

Glucose 20g 2g K2HPO4

Peptone 10g 5g CH3COONa.2H2O

5g 0,58g Cao thi ̣t MgSO4

Cao nấm men 5g 0,28g MnSO4.4H2O

Aminoxitrat 2g 5g CaCO3

Tween 80 1ml Thạch 14-15g

1 lít Nướ c cất

- Môi trườ ng ISP 4 (g/l) pH = 7

1g 2g MgSO4.7H2O CaCO3

NaCl 1g 2g (NH4)SO4

1g 10g Tinh bô ̣t tan KH2PO4

Dịch vi lượng Thạch 14 - 15 g

(g/ml) 1ml

Nướ c 1 lít

Dịch vi lượng : 0,1g FeSO4.7H2O + 0,1g MnCl + 0,1g ZnSO4

Môi trườ ng giữ giống thêm 5g peptone.

- Môi trườ ng NA (g/l): pH = 6,8-7,0

Cao thi ̣t 3g (thay bằng 20ml nướ c mắm )

Peptone 5g

NaCl 50g

Thạch 14-15g

1 lít Nướ c cất

Đun sôi môi trườ ng sau đó đổ vào bình tam giác và ống nghiê ̣m đã khử trùng. Khử trù ng môi trườ ng ở 1210C/ 30 phút , làm nghiêng mặt thạch . Để 370C trong 48h trướ c khi du ̣ng hoă ̣c giữ ở 40C. - Môi trườ ng nuôi Nitrosomonas:

33

1g K2HPO4

0,2g MgSO4

20mg CaCl2.2H2O

50mg FeSO4.7H2O

2,0mg MnCl2.4H2O

1mg Na2MoO4.2H2O

Nước cất 1 lít

pH 8,5

1g - Môi trườ ng nuôi Nitrobacter: K2HPO4

0,2g MgSO4

20mg CaCl2. 2H2O

50mg FeSO4.7H2O

2,0 mg MnCl2.4H2O

1mg Na2MoO4.2H2O

1 lít Nướ c cất

2.1.3.2. Môi trườ ng lên men di ̣ch thể (g/l):

- Môi trườ ng 1: - Môi trườ ng 2:

300g Cà chua 300g Bắp cải

Nước mắm 15ml Nướ c mắm 15ml

1 lít 1 lít Nướ c cất Nướ c cất

- Môi trườ ng 3: - Môi trườ ng 4:

Giá đỗ 300g Khoai tây 300g

Nướ c mắm 15ml Nướ c mắm 15ml

1 lít 1 lít Nướ c cất Nướ c cất

Đun sôi môi trườ ng sau đó đổ 40ml vào bình tam giác 100ml đã đươ ̣c khử trùng, đem khử trù ng ở 121oC trong 30 phút , để nguội môi trường trong 24h giữ ở 4oC.

34

2.2. Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u 2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩ n

- Lấy 1ml mẫu đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã được khử trùng để được độ pha loãng 10-1. Vontex đều sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-6.

- Lấy 50µl dung dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp trải đều lên đĩa

peptri chứa môi trường nuôi cấy.

- Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đó

giữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng.

2.2.2. Phân loại vi sinh vật

Phân loại theo phương pháp truyền thống

Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn dựa vào các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa. Dựa vào đó, người ta

phân loại chúng vào các chi.

Phân lọai theo phương pháp sinh học phân tử

 Phương pháp tách ADN vi khuẩn

- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 l TE trong ống Eppendoff. - Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37oC trong 30 phút.

- Thêm 100 l SDS 10%, ủ ở 37oC trong 30 phút.

- Thêm 300 l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều

trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, l ấy dịch trên.

- (Bước này được lặp lại 2 lần)

- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN.

- Rửa tủa bằng etanol 70%.

- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không.

- Thêm 30-50 l nước, bảo quản để dùng dần.

 Điện di trên gel agaroza

35

- Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit

nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là

ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung

photphodieste của các sợi axit nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về

cực dương khi đặt trong điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel

có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước.

- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào

khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung

dịch 1X TAE. Trộn đều 2l dung dịch loading buffer 6x với 5l mẫu, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng

điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20

phút vớt ra. Quan sát vạch ADN trên máy soi gel.

Thành phần Thể tích (%)

10 X buffer 10

dNTP 1,25 mM 16

Mồi xuôi 1 (10 pmol/l)

Mồi ngược 1 (10 pmol/l)

Taq polymeraza 1,2

Mẫu 2

Nước đủ 100

Mồi cho phản ứng PCR

Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí

nucleotit 27 đến 47

Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí

nucleotit 1525 đến 1507

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bƣớc tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 phút 1 94

36

lặp lại 30 lần chu kỳ sau 2

94 30 giây

55 45 giây

72 2 phút 30 giây

3 72 7 phút

4 4 -

Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như đối

với điện di genome.

 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự

Terminator Ready Reaction Mix Mồi 1 l 8 l

Mẫu Nước cất đủ đến 20l 1l

Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau :

- Chu trình nhiệt

Bước tiến hành Nhiệt độ (oC) Thời gian

1 96 1 phút

2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau

96 10 giây

50 5 giây

60 4 phút

3 4 -

 Xác định hàm lượng axit nucleic

Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường

là micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng. Không thể xác

định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ kế. Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50g/ml

của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40g/ml của ADN hoặc ARN mạch

37

đơn. Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein. Tỷ số A260/A280 là 1,8 đối với mẫu ADN sạch.

 Đọc trình tự ADN

Trình tự của rADN 16S của các chủng vi khuẩn được đọc trực tiếp trên

máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với

các trật tự của các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài.

2.2.3. Phương pháp bảo quản giống

Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch thường, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau khoảng 10 - 14 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-6oC. Sau 1 - 2 tháng cấy truyền lại một lần.

Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong ống cát, trong paraffin

lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin ho ặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng

đến 2 năm.

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn

Xác định hoạt tính enzym

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza,

amylaza) trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch chứa 1% cơ

chất tương ứng (cazein, kitin, CMC, tinh bột tan).

Môi trường gồm cơ chất và thạch được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, sau đó được đổ vào các đĩa peptri đã được vô trùng, với độ dày thạch khoảng 3mm, đợi

nguội, dùng khoan nút chai để đục các lỗ thạch trên môi trường. Nhỏ 200µl dịch nuôi cấy vi sinh vật vào các lỗ thạch, rồi để vào tủ lạnh 4 - 5 giờ cho enzym khuyếch tán vào thạch, sau đó chuyển vào tủ ấm 30 - 32oC. Sau 24 giờ đem ra hiện vòng phân giải bằng cách nhuộm màu các đĩa bằng dung dịch Lugol (với cơ chất là

CMC, kitin, tinh bột) và bằng axit triclo axetic với cơ chất là cazein.

Hoạt tính enzym được xác định qua kích thước vòng phân giải theo công

thức: Hoạt tính enzym = D - d (mm).

Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ khoan

Xác định hoạt tính kháng khuẩn

* Phương pháp đục lỗ thạch

38

Dùng khoan nút chai đ ục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định

trong đĩa peptri. Dịch nuôi vi khuẩn 2 ngày ở nhiệt độ thích hợp được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 15 phút sau đó được nhỏ với lượng 0,1 ml vào mỗi lỗ thạch. Đọc kết quả sau 3 ngày ho ạt tính kháng sinh xác định dựa vào kích thước

vòng vô khuẩn (D - d, mm). Trong đó, D là kích thước vòng vô khuẩn, d là kích

thước thỏi thạch.

* Phương pháp đặt thỏi thạch

Vi sinh vật được nuôi trong môi trường ở nhiệt độ thích hợp trong các đĩa

petri. Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSV kiểm định. Để trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường, rồi đặt vào tủ ấm (30 oC). Đọc kết quả sau một ngày đối với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn.

Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức:

HTE/HTKS = D – d (mm).

D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính thỏi thạch.

2.2.5. Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học

Số lượng tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo

mật độ quang học OD. Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng 660nm.

2.2.6. Phương pháp định lượng axit lactic

Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng. Lấy 10ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 20ml nước cất, thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein 1%. Chuẩn độ bằng dung

dịch NaOH 0,1% cho đến khi xuất hiện màu hồng không đổi trong 1 phút.

Lấy số ml NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ nhân với 10 ta được số độ Therner

(oT). 10o tương đương với 9mg axit lactic.

2.2.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ

- theo phương pháp Griss [49]

của tế bào

-

Định lượng NO2

- được xác định dựa trên phản ứng tạo màu hồng của NO2

Hàm lượng NO2

với thuốc thử Griss.

Thuốc thử:

+ Griss 1: Hòa tan 0,5g axit sunfaninic vào 150ml axit acetic 5N.

39

+ Griss 2: Hòa tan 0,5g α- Naphtylamin vào 50ml nước cất, bổ xung 150 axit

- 5mg/l.

acetic 5N. Bảo quản trong tủ lạnh.

Tiến hành: Thêm 0,05ml Griss 1 và 0,05ml Griss 2 vào 5ml dung dịch mẫu nghiên cứu, sau 10 phút phản ứng kết thúc đo độ hấp thụ ở bước sóng A520 mm. Cường độ mầu tỷ lệ thuận với nồng độ nitrit. Lượng nitrit có trong mẫu nghiên cứu được dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng dung dịch N-NO2

Lập đường chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm cho lần lượt dung dịch nitrit chuẩn

nồng độ từ 0,1 đến 5 mg/l và một mẫu trắng. Làm tuần tự các thao tác đã trình bày ở

trên. Sau đó mang đi đo mật độ quang học, vẽ đường chuẩn và xác định phương trình hồi quy của đường chuẩn trên. Kết quả thu được trình bày ở bảng và biểu diễn

trên đồ thị.

- (mg/l)

0,1 0,5 1 2 3 5 0 Nồng độ NO2

- theo phương pháp Brucine [49]

Độ hấp thụ màu 0,0058 0,346 0,395 0,098 0,171 0,247 0

Định lượng NO3

Phương pháp dựa trên nguyên tắc giữa phản ứng của nitrat và hợp chất

brucine tạo thành phức hợp màu nâu vàng có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước

sóng 410 mm.

Hóa chất: Dung dịch nitrat chứa 100mg N/l; Natri asenit: Hòa tan 0,5g NaAsO2 trong 100 ml nước cất; thuốc thử brucine: hòa tan 1g brucine-sulfate và 0,1g axit sulfanilic trong 70ml nước cất nóng, thêm 3ml axit HCl , làm l ạnh và bổ

sung nước cất đến thể tích cuối cùng là 100ml; dung dịch axit sunfuric: bổ sung cẩn

40

thận 500ml axit H2SO4 trong 125ml nước cất, làm lạnh ở nhiệt độ phòng; dung dịch NaCl: hòa tan 300g NaCl trong 1000ml nước cất

- 1 mg/l.

Tiến hành: Thêm lần lượt 2ml dung dịch NaCl, 10ml dung dịch H2SO4 vào cốc chịu nhiệt chứa 10 ml mẫu nghiên cứu, cốc được đặt trong giá ngâm trong bể

- cũng tương tự như

nước lạnh, bổ sung 0,5 ml thuốc thử brucine, chuyển giá đựng cốc thí nghiệm lên bể nước nóng ở 95oC trong 20 phút, để nguội và đo độ hấp thụ màu ở A410. Lượng nitrat trong mẫu nghiên cứu tính được khi đối chiếu với đồ thị chuẩn sử dụng dung dịch N-NO3

-

Lập đường chuẩn: Cách lập đường chuẩn dung dịch NO3

phương pháp định lượng NO2

- (mg/l)

0.1 0.5 1 2 3 5 0 Nồng độ NO3

Độ hấp thụ màu 0.054 0.262 0.316 0.786 0.91 1.648 0

2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh

trưởng của vi sinh vật.

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Chủng nghiên được nuôi cấy lắc 220 vòng / phút trên các môi trường khác

nhau ở nhiệt độ và pH thích hợp. Sau 2 ngày xác định pH sau nuôi cấy, mật độ tế

bào và hoạt tính enzym.

Ảnh hưởng của pH

Nuôi lắc vi khuẩn 220 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp sau khi đã điều chỉnh

pH ban đầu của môi trường ở các giá trị pH khác nhau với bước nhảy bằng 1. Xác

định OD, pH và hoạt tính enzym, hoạt tính kháng khuẩn sau nuôi cấy.

41

Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Bổ sung vào môi trường nuôi cấy thích hợp 1% các nguồn cacbon khác nhau

là: kitin, tinh bột tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, bột ngô. Tiến hành nuôi cấy

lắc vi khuẩn với vận tốc 220 vòng/phút. Sau 24 giờ xác định OD, pH sau khi nuôi

cấy, hoạt tính enzym

Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Bổ sung nguồn nitơ khác nhau vào môi trường thích hợp với các hàm lượng 1%: NaNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, bột đậu tương, cao nấm men, peptone. Các bước tiếp theo tiến hành tương tự như trên.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường với nguồn cacbon, nitơ, pH

thích hợp, cứ sau 24h lại lấy mẫu để xác định OD, pH, hoạt tính enzym, hoạt tính

kháng khuẩn.

2.2.9. Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của chủng lựa chọn

 Xác định khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn

Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy vào các ống nghiệm. Đem các ống này đun cách thủy ở 80oC trong 10 phút. Sau đó, dùng Pipetman hút 50µl dịch cấy trải trên môi trường thạch thường, đặt vào tủ ấm 30oC. Sau một thời gian, nếu trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc thì chủng vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử và

ngược lại.

 Xác định khả năng hóa lỏng gelatin

Cấy vi khuẩn theo phương pháp thẳng đứng, sâu vào ống nghiệm gelatin đứng. Sau một ngày đặt ở 30oC, lấy ống nghiệm ra giữ ở 4oC trong 1 giờ. Kiểm tra kết quả nếu thấy môi trường hóa lỏng thì kết luận chủng vi khuẩn có khả năng hóa

lỏng gelatin và ngược lại.

 Xác định khả năng chịu muối

Cấy vi khuẩn lên đĩa peptri chứa môi trường thạch thường với các nồng độ

muối khác nhau từ 1-13% giữ trong tủ ấm. Vi khuẩn mọc được ở nồng độ muối nào

thì ta kết luận chúng có khả năng chịu muối ở nồng độ đó.

 Xác định hoạt tính catalaza

42

Nuôi vi khuẩn trên hộp petri, khi chúng tạo thành các khuẩn lạc ta nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên khuẩn lạc. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalaza.

 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon: vi khuẩn được nuôi cấy trên môi

trường thạch thường có bổ sung 1% các nguồn đường: Glucozơ, Dextrin, lactozơ,

sacarozơ, tinh bột… Sau 2 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng. Đối chứng dương là

môi trường có glucoza, đối chứng âm là môi trường không có đường.

+ Nếu vi khuẩn sinh trưởng mạnh hoặc kém hơn đối chứng dương một ít

nghĩa là có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu là (+).

+ Nếu vi khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++).

+ Nếu vi khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hay không mọc nghĩa là

không có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu là (-).

+ Nếu vi khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm nhưng kém hơn đối chứng

dương nhiều, ký hiệu là (±).

2.3. Phƣơng phá p ta ̣o chế phẩ m 2.3.1. Nghiên cứ u cá c điều kiê ̣n thích hợp cho lên men xố p

Cấy giống cấp hai vào các môi trường có chứa các loại chất mang khác nhau như: cám gạo, bột đậu tương , cám ngô , cám gạo , mùn cưa và hỗn hợp của hai hoặc vài chất trên theo các tỉ lệ khác nhau. Bổ sung nước đến độ ẩm 50%. Ủ trong 4-5 ngày ở 30oC, sau đó xác định số lượng tế bào của từng loại vi sinh vật.

Ảnh hưởng của tỷ lệ cám: trấu:

: trấu

Tiến hành lên men xốp các vi sinh vâ ̣t trên các môi trườ ng có tỉ lê ̣ cám khác nhau (trong đó tỷ lê ̣ cám + trấu/ nướ c = 1/1). Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp nhỏ di ̣ch , xác định hoạt tính k háng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

Ảnh hưởng của thời gian lên men

Chất mang sau khi bổ sung giống và làm ẩm được nuôi ở nhiệt độ 30 oC. Sau

các khoảng thời gian 1, 2, 4, 5, 7, 9 ngày tiến hành lấy mẫu xác định hoạt

g pháp nhỏ di ̣ch , xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng

tính enzyme bằng phươn phương pháp đu ̣c lỗ tha ̣ch

Ảnh hưởng của độ ẩm

43

, xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng

Các chủng được lên men riêng rẽ trên các môi trường xốp thích hợp có độ ẩm ban đầu khác nhau nuôi ở điều kiện 300C – 340C trong 4-5 ngày. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp nhỏ dịch phương pháp đu ̣c lỗ tha ̣ch

Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ

Cấy các chủ ng vào môi trư ờng xốp thích hợp, theo dõi trong 4, 5 ngày ở các

nhiệt độ 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 (oC). Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp nhỏ dịch , xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

2.3.2. Trộn hỗn hợp giố ng

: vi khuẩn Bacillu s : vi khuẩn Hỗn hơ ̣p giống đươ ̣c trô ̣n theo tỉ lê ̣ phối trô ̣n

, tùy

lactic: vi khuẩn nitrat = 1: 1: 1. Sau đố đếm số lươ ̣ng khuẩn la ̣c trên đi ̃a tha ̣ch từ ng loa ̣i mà phân lâ ̣p trên môi trườ ng khác nhau để kiểm tra số lươ ̣ng bào tử có trong chế phẩm hỗn hơ ̣p .

Số lươ ̣ng bào tử vi sinh vâ ̣t có trong 1 g chế phẩm đươ ̣c xác đi ̣nh bằng công

thứ c:

X = a. b. 10n

A: số khuẩn la ̣c trng bình trong các đi ̃a tha ̣ch . B: số gio ̣t trong 1 ml

10n: đô ̣ pha loãng mẫu

X: số lươ ̣ng vi sinh vâ ̣t trong 1 g chế phẩm .

2.3.3. Bảo quản chế p hẩm:

Chế phẩm đựng trong tú i nilon kín , đươ ̣c bảo quản ở nhiê ̣t đô ̣ phòng . Sau 3

. tuần kiểm tra số lươ ̣ng vi sinh vâ ̣t

2.3.4. Thử nghiê ̣m chế phẩm trong xử lý nướ c nuôi trồng thủ y sả n

Thí nghiệm sử dụng chế phẩm để làm sạch n ước nuôi trồng thủy sản bị ô

4 bình dung tích 1000ml. Cho vào mỗi bình 500ml

nhiễm đươ ̣c tiến hành trong nướ c lấy từ đầm nuôi tháng thứ 3.

Bình 1 – đối chứ ng; bình 2, 3, 4 – mỗi bình bổ sung 0,5 g chế phẩm/ lít (0,5 ‰) Bình đố i chứ ng không có chế phẩm . Tiến hành thí nghiê ̣m trong 10 ngày .

1 ngày, sau 3 ngày, sau 7 ngày và sau 10

Lấy mẫu nướ c ở các khoảng thờ i gian ngày để phân tích các chỉ tiêu thủy lí , thủy hóa .

44

Chƣơng 3: KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬN

3.1. Tuyển cho ̣n cá c chủ ng vi sinh vâ ̣t 3.1.1. Bacillus

3.1.1.1. Phân lập và tuyển chọn

Một trong những nguyên nhân chính làm ô nhiễm môi trường đầm nuôi đó

chính là thành phần các chất hữu cơ dư thừa trong đầm. Thành phần các chất hữu cơ

này rất đa dạng chứa hàm lượng protein, tinh bột, kitin, xenlulozơ khá cao. Ngoài

ra, trong đầm nuôi cũng tồn tại nhiều loài VSV gây bệnh cho tôm cá. Cho nên, bước

đầu chúng tôi tuyển chọn vi khuẩn dựa trên 2 tiêu chí là chọn ra chủng có hoạt tính enzym phân giải cơ chất cao và kháng được với nhiều vi sinh vật kiểm định.

Từ các mẫu đất và nước thu thập tại địa bàn Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành

phân lập được 31 chủng vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch thường theo

phương pháp 2.2.1. Qua sơ tuyển bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch

chúng tôi đã chọn ra được 5 chủng có khả năng sinh enzym ngoại bào cao phân giải

được cả 4 loại cơ chất là kitin, cazein, CMC, tinh bột. Kết quả được trình bày ở

bảng 3.1.

Bảng 3.1: Hoạt tính enzym của 5 chủng lựa chọn

Hoạt tính enzym (D-d,mm) Kí hiệu chủng Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

TL1 35 32 30 26

BD2 23 23 21 19

A4 25 22 24 20

D3 20 21 20 22

A2 26 23 23 20

Từ kết quả bảng 3.1 ta thấy chủng TL1 có khả năng sinh enzym phân giải

. Kitinaza phân hủ y vỏ

các cơ chất mạnh nhất trong các chủng phân lập được, đặc biệt là có hoạt tính kitinaza rất mạnh (35 mm). Điều này rất cần thiết cho viê ̣c phân giải các chất hữu cơ không mong muốn trong môi trườ ng nuôi trồng thủ y sản tôm lô ̣t xác , proteaza phân hủ y thứ c ăn thừ a và xác đô ̣ng vâ ̣t thủ y sinh , xenlulaza phân hủ y xác tảo . Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng vi khuẩn TL1 cho các nghiên cứu tiếp theo.

45

3.1.1.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng và

hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1

 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Trong quá trình lên men khi tìm được chủng có hoạt tính cao, cần thiết phải

lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất để phát huy năng suất tổng hợp các sản

phẩm mong muốn. Môi trường được coi là thích hợp là môi trường vừa đảm bảo

chủng sản xuất có khả năng sinh trưởng tốt, vừa sản xuất sản phẩm mong muốn với

hiệu quả cao nhất.

Tiến hành nuôi cấy lắc chủng TL1 trên 5 loại môi trường khác nhau: LB, ISP-4, NA, Gause I, Gause II ở 28-30oC, pH trung tính. Ho ạt tính enzym, pH sau nuôi cấy và khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định sau 48h.

Bảng 3.2: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 5 loại môi trƣờng

Hoạt tính enzym (D-d,mm) Môi pH sau OD trƣờng Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

NA 7,2 0,881 26 23 25 19

LB 8,5 1,667 37 24 33 30

ISP4 7,7 0,671 20 16 21 28

Gause I 7,5 0,276 15 13 18 22

Gause II 8,0 1,202 28 25 30 18

Hình 3.1: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 5 loại môi trƣờng

46

Các kết quả cho thấy chủng TL1 có khả năng sinh trưởng trên các môi

trường khác nhau, trong đó tốc độ sinh trưởng và khả năng tổng hợp enzym của

chủng nghiên cứu đều thể hiện mạnh nhất trên môi trường LB. Có thể NaCl trong

môi trường đã tạo ra nồng độ muối phù hợp cho sinh trưởng của các chủng này. Vì

vậy, chúng tôi chọn môi trường LB là môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng

TL1 trong các thí nghiệm tiếp theo.

 Ảnh hưởng của pH ban đầu Chủng TL 1 được nuôi lắc 220 vòng/phút trên môi trường LB ở 28-30oC, pH ban đầu được chỉnh ở các giá trị từ 5 đến 9. Sau 2 ngày, xác định hoạt tính enzym, pH sau nuôi cấy và khả năng sinh trường của vi khuẩn. Kết quả được trình bày

trong bảng 3.3 và bảng 3.4.

Qua bảng và biểu đồ ta thấy , pH ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng cũng như hoạt tính enzym chủng nghiên cứu. Nhìn chung, chủng TL1 thể hiện hoạt tính

enzym cao ở pH trung tính ho ặc kiềm yếu, còn ở pH thấp hoặc kiềm cao thì hoạt

tính enzym giảm. Chủng TL1 ở pH=7 hoạt tính enzym thể hiện mạnh nhất.

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp

enzym của chủng TL1

Hoạt tính enzym (D-d,mm)

pH đầu pH sau OD Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

6,5 0,823 19 16 15 13 5

7,3 1,029 26 20 30 26 6

8,5 1,431 36 23 31 29 7

8,2 1,233 33 24 27 20 8

8,5 0,994 17 12 17 15 9

47

Hình 3.2: Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp

enzym của chủng TL 1

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn TL1 trong di ̣ch LB ở pH =7. Dịch được lắc vớ i vâ ̣n tốc 220 vòng/ phút trong nhiệt đô ̣ 30oC. Cứ sau 24 giờ lại lấy mẫu ra kiểm tra các thông số: pH, giá trị đo OD, hoạt tính enzym.

Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp

enzym ngoại bào của chủng TL1

Hoạt tính enzym (D-d,mm) Thời gian pH sau OD (giờ) Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

7,0 0,704 19 15 21 17 24

8,1 1,484 32 26 32 35 48

8,4 1,253 25 23 28 26 72

7,8 1,048 20 18 22 21 96

48

Hình 3.3: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp

enzym ngoại bào của chủng TL1

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng TL1 sinh trưởng và sinh enzym ngoại

bào mạnh nhất sau 48 giờ nuôi.

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường LB với các nguồn cacbon

khác nhau là: kitin, tinh bột tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, bột ngô.

Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng

hợp enzym của chủng TL1

Hoạt tính enzym (D-d,mm) Nguồn C pH OD (1%) sau Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

Kitin 8,0 1,246 24 29 20 21

Tinh bột 6,7 0,746 22 24 17 25

CMC 8,2 0,83 25 30 20 21

Glucoza 7,8 1,009 23 22 15 18

Lactoza 7,0 0,519 18 12 14 15

Bột ngô 8,5 1,561 26 34 25 24

49

Hình 3.4: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng

hợp enzym của chủng TL1

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng TL1 có khả năng sinh trưởng và sinh

enzym ngoại bào trên 6 nguồn cacbon khác nhau. Chủng TL1 sinh trưởng và sinh

enzym mạnh nhất ở môi trường có nguồn cacbon là bột ngô và yếu nhất với nguồn

cacbon là lactoza. Kết quả cũng cho thấy rằng nguồn cacbon vừa là nguồn dinh

dưỡng vừa là chất cảm ứng sinh tổng hợp enzym. Với nguồn cacbon là kitin thì khả

năng sinh enzym kitinaza cao, cũng tương tự như vậy, enzym amylaza sinh ra nhiều

nhất với nguồn cacbon là tinh bột, proteaza là bột ngô, xenlulaza là CMC.

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Tiếp tục tiến hành khảo sát sự sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng

TL1 trên 6 nguồn nitơ khác nhau. Kết quả như sau :

Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng và hoạt tính enzym của chủng TL1

Hoạt tính enzym (D-d,mm) pH Nguồn N (1%) OD sau Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

7,2 0,359 19 15 20 16 NaNO2

7,3 0,763 21 18 24 20 NaNO3

7,0 0,557 24 21 20 23 (NH4)2SO4

50

Bột đậu tƣơng 7,5 1,870 27 30 28 34

Cao nấm men 8,4 1,534 24 32 27 30

Hình 3.5: Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng và hoạt tính enzym của

chủng TL1

Kết quả cho thấy, chủng TL1 sử dụng được cả nguồn nitơ vô cơ cũng như

nitơ hữu cơ, và sinh trưởng tốt hơn với nguồn nitơ hữu cơ. Đáng chú ý là với nguồn

nitơ bột đậu tương chủng TL1 có khả năng sinh trưởng và sinh enzym mạnh nhất.

Đây là nguồn nitơ dễ kiếm và rẻ tiền, rất phù hợp để sử dụng với mục đích sản xuất

3.1.1.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu

Chủng nghiên cứu được tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh học để bước

đầu phân loại theo phương pháp vi sinh thông thường. Kết quả được trình bày ở

bảng 3.7.

Bảng 3.7: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng nghiên cứu

Kết quả Đặc điểm Chủng TL1

Trắng, khô, bề mặt nhăn Hình dạng khuẩn lạc nheo

Giống non hình que +

51

Kích thước tế bào 0,5 x 2,5 µm

Thuộc Gram (+) +

Khả năng di động +

Hiếu khí bắt buộc +

Khả năng chịu muối 10%

Khả năng sinh axit từ - glucoza

Nội bào tử +

Hóa lỏng gelatin +

Catalaza +

Kitinaza 35

Amylaza 30

Proteaza 26

Xenlulaza 32

Kết quả ghi ở b ảng 3.7 ta thấy chủ ng TL 1 có dạng hình que , kích thước tế

. bào 0,5 x 2,5 µm, bắt màu Gram +, sinh nô ̣i bào tử , di đô ̣ng đươ ̣c và có khả năng sinh trưở ng đươ ̣c trong môi trườ ng chứ a 2 -10% NaCl. Chủng TL 1 không có khả năng khử sunfat và nitrat , không có khả năng sinh axit từ glucoza . Đặc biệt là chủng TL1 có khả năng sinh nhiều enzym với hoạt tính rất mạnh và rất cần thiết co việc phân giải các chất hữu cơ không mong muốn trong môi trườ ng nuôi tôm cá

Đối chiếu những đặc điểm của chủng TL1 trình bày ở bảng 3.7 với khóa

phân loại Bergey chúng tôi khẳng định rằng chủng này thuộc chi Bacillus.

Chủng Bacillus TL1 phân lâ ̣p đươ ̣c là chủ ng có khả năng sinh trưở ng tốt trên

có khả năng sinh hàng loạt enzym ngoại bào như

các nguồn cơ chất đơn giản và proteaza, xenlulaza, kitinaza và amylaza . Vì những ưu điểm trên , chủng Bacillus TL1 rất đáng đươ ̣c xem xét để đưa vào sản xuất chế phẩm probiotic dù ng trong xử lý ô nhiễm nước đầm nuô i trồng thủ y sản .

52

3.1.2. Vi khuẩn Lactic

3.1.2.1. Phân lập và tuyển chọn

, trong đó có vi khuẩn Vibrio. Các chất kháng , không , không dù ng trong y tế

, dễ phân giải sau mô ̣t thờ i gian sử du ̣ng

Như đã đề cập ở phần 1.5.1, nhóm vi khuẩn lactic là một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm nuôi trồng thủ y sản . Nhiều loa ̣i vi khuẩn lactic c ó khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sinh trưở ng củ a các vi khuẩn gây bê ̣nh khuẩn đươ ̣c xem như là các chất kháng sinh tự nhiên gây đô ̣c ha ̣i cho con ngườ i và môi trườ ng nên không để la ̣i dư lươ ̣ng trong sản phẩm . Vì vậy chúng tôi đã tiếp tục thực hiện đề tài với đối tượng là vi khuẩn lactic.

Từ tập hợp các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu lên men chua

trên môi trường MRS, chúng tôi đã tuyển chọn được chủng L5 có khả năng sinh

bacteriocin kháng mạnh với Vibrio parahaemolyticus (25mm).

Bảng 3.8: Hoạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5

Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm) Chủng V. parahaemolyticus E. coli Salmonella typhi

L5 25 20 9

3.1.2.2. Phân loại

Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống

Các đặc điểm sinh học của chủng L5 được trình bày trong bảng 15.

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L5

Đặc điểm Kết quả

Hình dạng khuẩn lạc Tròn, trắng đục

Hình dạng tế bào Que ngắn, xếp đơn lẻ hoặc tạo chuỗi ngắn

Kích thước tế bào 0,5 - 1,5 µm

Khả năng hình thành bào tử -

Hiếu khí tùy tiện +

Nhuộm Gram +

53

Catalaza -

Khả năng di động -

Khả năng sinh axit 24,5 mg/l

Hoạt tính enzym ngoại bào (D-d,mm)

Proteaza 18

Xenlulaza 9

Amylaza 12

Khả năng đồng hóa đƣờng

Glucozơ +

Tinh bột ±

Dextrin +

Lactozơ ±

Sorbitol -

Maltozơ +

Các kết quả ghi ở bảng 3.10 cho thấy, chủng vi khuẩn L 5 có dạng que ngắn ,

. Chủng

kích thước 0,5 – 1 µm, nhuộm Gram +, không có khả năng di đô ̣ng và không hình thành bào tử . Đây là vi khuẩn hiếu khí tù y tiê ̣n không có phản ứ ng catalase L5 có khả năng đồng hóa nhiều loại đường . Khi so sánh các đặc điểm trên với khóa

phân loại Bergey cho thấy chủng L5 là vi khuẩn lactic điển hình thuộc chi

Lactobacillus [62].

Phân loại theo phƣơng pháp sinh học phân tử

Trình tự rARN 16S của chủng L5

TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGCCTAAAGAATCTAATACGACTGTTGAAA TTTC

AGCACCCGCACTTTAGCAGCAATTGAACGGGCATCCCTGTTATCCCACGAAAGTCGCAAT

AATGTGGTTCGCTTCTCCGTTAACCAACGGACAAAACGATTACGATACATTTATCAAACGC

TACAGGCCTTATATCAGCAACAACAAGAACGCTTTCGGTAACTCACCAGATGTCGGGGAA

GTAACGGAACAACTACAGCCCACTGATTTGTCAGGTGACGAACTTGAAATTTCATTTAACC

CAGACTACATGAAAGAAGCGTTACGTTCGTTTGGGCAAGCTATGATCAAAATCTCATTCAC

GATGGCATTGCGCCCATTCACTTTAGTGCCAACTGAAGAAGGCGAAAACTTTATTCAGTTG

ATTACACCAGTTCGAACGTTTTAATTAGCTGAATAAATATACAATTCTAAATAAAAGGCCC

54

GCATTTCACCGTGAAATGCGGGCCTTTTATGACGGCTAAAACTAGCTAAAGATGGGGCAA

TGAATAGGCAATAGCGATGATGTAACTTTTGAAGTTTTAACTTATGCATATTATATTAGCT

GCTGGTGAATTGTCACGCTAACTATCGATGTTGCCCTACTAAAATCCCACCATCTGATGAA

CCCCAGTCCTTGCACTCGTTCGCTACAAACGCTCGCTTTCAGATAATGAATGCTGGCTTTA

GCCAATTTTTATAGGTAAAAAACAAGATATTTTATTAAAATCCGCAAAATTAGGGAATTTC

AGCAAATTTACCCCTAGGCTAGTATCCCGATATTAAAAAGCCCTAAATCGTCTTAAAATGG

CTCTGAGTGCGGTTATAAATTGAATTTTCATCAAAAAACAAGTATAATATAACCTGTTAGG

AGTGTGTGTAGCACGCCAGACAGTCGTTTAATAGCTTGTAATCAGATAGGCAGGTGACAT

TGTGAAACAGCCAATAGATATTAAAACCCCATATATGACGTTGGGGCAACTCTTAAAAGAA

ACGGCCATCATTGGATCGGGTGGTCAGGCGAAGTGGTTCTTAAAAGAA ACAACCGTGTTA

GTTAATGGTGAACCAGATGATCGGCGGGGTCGGAAACTTTATCCAGGCGATACGATTGAA

GTTGAAGACAACGGGTCATTTTTTATTCGCTCAAATCAAGAAACGACTGATTAGATGTACT TAGAAAACTTAGTCTTGCATGATTTTCGGAACTACGCGGATTTGACCATTAATTTTAGTCA

GGGCGTTAATGTTCTATTAGGTGAAAATGCGCAGGGAAAGACGAACCTGTTGGAAGCCAT

TTATGTGTTGGCGTTAACGCGTAGTCACCGCACCGCTAACGATAAGGAATTAATTCGGTG

GCAAACCACCACGGCAACGTTGCAAGGCCGGTTACATAAAAGTACCGGTGCTGTCCCCTT

GGAACTTGAATTGGGGCGGCGGGGCAAGCGAGCGAAAGTCAATCATCTTGAGCAAGCCA

AATTATCCCAGTACGTCGGAAATTTGAACGTGATCGTGTTTGCACCTGAAGATTTATCCAT

CGTTAAAGGGGCACCCGCGGTTCGCCGTCGGTTTATGGATATGGAATTTGGTCAGATGAG

CCCTAAATACCTCTATAACCTAAGTCAGTATCGCACGATTTTAAAACAACGTAATCAATAC

TTACGGCAATTAAATCGGCAGCAGGCCAAGGATAAGGTTTATTTGGGT GTCTTGTCGGAT

CAATTGGCTGCATTTGGTGCGGAAATCATCCATAAACGACTACAACTGTTGCAGCAACTTG

AGAAATGGGCGCAAGCTGTTCACAGCGAGATTACGCAAGTGGACAGGCTGGATCACCTCC

TTT

Hình 3.6: Trình tự nucleotit của rARN 16S của chủng L5

Xây dựng cây phân loại

So sánh trình tự rARN 16S của chủng L5 bằng phần mềm CLUSTAL và

với các trình tự đã có sẵn thuộc chi Lactobacillus trong ngân hàng gen (Genbank),

chúng tôi đã xây dựng được cây chủng loại phát sinh (hình 3.7).

55

PHYLIP_1

Streptomyces AB217603

1

8

00

0

L5 Lactobacillus plantarum GQ289387

Lactob acillus paracollinoides Lactob acillus lacrimicola

8

Lactob acillus paraplantarum

0

6

Lactob acillus durianis

0

6

8

Lactob acillus sp AF51

8

8

2

0

Lactob acillus suebicus AB2

1

Lactob acillus sp AJ78

00

Lactob acillus uvarum EU3

6

Lactob acillus pentosus AB36

6

8

Lactob acillus vaccinostercus

5

6

2

Lactob acillus collinoides

9

Lactob acillus paralimentarius

2

Hình 3.7: Vị trí phân loại của chủng L5 và các loài có quan hệ họ hàng gần

So sánh với dữ liệu trong ngân hàng gen Quốc tế xác định được trình tự gen

rARN 16S của chủng L5 tương đồng 99,9 % với đoạn rARN 16S của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum.

3.1.2.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp

chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

 Ảnh hưởng của pH ban đầu

L. plantarum L5 được nuôi cấy trên dịch MRS có pH thay đổi từ 4 đến 8, ở

. Đối với các thí nghiệm xác định khả năng đối

(0,1 N) tới pH trung tính để

nhiệt độ 320C  2, trong 48h. Sau đó đem di ̣ch đo pH và phân tích khả năng sinh trưở ng, khả năng kháng khuẩn kháng , dịch nuôi cấy được trung hòa bằng kiềm NaOH chắc chắn rằng vòng vô khuẩn ta ̣o ra không phải do axit mà là bacteriocin do vi khuẩn tiết ra . Kết quả được biểu diễn ở bảng 3.10.

56

Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm)

pH đầu pH sau OD E.coli Vibrio parahaemolyticus Salmonella typhi

3,8 0,468 11 9 2 4

3,6 0,924 21 18 5 5

4,0 1,207 25 20 10 6

4,5 1,354 24 19 9 7

5,2 1,173 18 15 3 8

Qua bảng ta thấy rằng L. plantarum L5 sinh trưởng được trên dải pH rộng, trong đó pH= 6 - 7 là phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn. Ở

pH hơi kiềm thì các chỉ số này có xu hướng giảm, còn ở pH = 4 khả năng sinh

trưởng của L. plantarum L5 kém.

Hình 3.8: Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và khả năng sinh tổng

hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

57

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy chủng L5 trên môi trường dịch MRS, cứ sau 24h xác

định các chỉ số pH, OD và hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả cho thấy thời gian L.

plantarum L5 sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất là sau 48 giờ.

Bảng 3.11: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm) Thời gian OD pH Vibrio Salmonella (giờ) E.coli parahaemolyticus typhi

24 0,804 4,8 15 8 0

48 1,085 4,3 25 19 10

72 0,988 4,5 21 14 5

96 0,721 5,0 18 11 3

Hình 3.9: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và sinh chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

 Ảnh hưởng của nồng độ muối

58

.

Tiến hành nuôi cấy L. plantarum L5 trên môi trường dịch MRS có bổ sung các nồng độ muối từ 2 % - 10% . Sau 48 giờ thu di ̣ch làm các thí nghiê ̣m tiếp theo . Kết quả thu đươ ̣c thể h iê ̣n qua bảng và hình bên dướ i Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trƣởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm) Nồng độ OD pH Vibrio muối (%) E.coli Salmonella typhi parahaemolyticus

2 1,197 4,2 18 8 23

4 0,971 4,5 11 4 16

6 0,562 5,0 4 0 10

8 0,129 6,0 0 0 0

10 0,091 6,3 0 0 0

Hình 3.10: Ảnh hƣởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trƣởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

Kết quả biểu diễn trên đồ thị cho thấy chủng L5 có thể sinh trưởng và tổng

hợp chất kháng khuẩn cao ở nồng độ muối 2 - 4%, đây cũng là nồng độ muối của

các đầm nuôi thủy sản nước lợ và nước biển. Còn từ nồng độ muối 6% trở đi sự

59

sinh trưởng, sinh axit cũng như sinh chất kháng khuẩn của chủng kém đi, và gần

như không còn ở nồng độ muối 10%.

, chịu được môi trường có * Vớ i các đă ̣c điểm là vi khuẩn hiếu khí tù y tiê ̣n

(V.

nồng đô ̣ NaCl cao , có khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh cho tôm cá parahaemolyticus, E.coli và Salmonella typhi ), thuô ̣c nhóm vi khuẩn an toàn (vi khuẩn lactic đươ ̣c FDA xác nhâ ̣n là nhóm vi khuẩn an toàn - GRAS ) như đã xác đi ̣nh đươ ̣c ở trên , chủng Lactobacillus plantarum L5 có thể được dùng để nghiên cứ u ta ̣o chế phẩm xử lý nướ c nuôi trồng thủ y sản . 3.1.3. Vi khuẩn nitrat hóa

Trong nuôi trồng thủ y sản , tiêu chuẩn ngàng (28TCN – 171-2001) đối vớ i -) là <1 mg/l và vớ i nitrit (NO2) lươ ̣ng amôni (NH3-N) là < 0,4 mg/l, vớ i nitrat (NO3 là 0,1 mg/l. Nếu vượt quá ngưỡng này , tôm cá có thể bi ̣ bê ̣nh . Muốn đa ̣t đươ ̣c các chỉ tiêu trên cần phải tiến hành ox y hóa amôni thành nitrit và nitrit thành nitrat nhờ

các vi khuẩn tự dưỡng . Phản ứng đầu nhờ vi khuẩn Nitrosomonas, phản ứ ng sau nhờ vi khuẩn Nitrosobacter. Do đó, nhóm vi khuẩn oxy hóa amôni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit tham gia vào quá trình nitrat thực hiện oxy hóa amôni thành

nitrat đóng vai trò rất quan trọng trong việc làm giảm hợp chất nitơ gây độc cho tôm cá.

3.1.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa

Chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn oxy hóa amôni trên môi trường thạch

Winogradsky I từ một số mẫu nước khác nhau, sau 6 ngày nuôi trong điều kiện hiếu khí ở 28oC đã thu được 13 chủng (bảng 3.13).

Cũng tương tự, vi khuẩn oxy hóa nitrit hóa được phân lập trên môi trường

Winogradsky II, kết quả thu được 10 chủng (bảng 3.14).

Bảng 3.13: Đặc điểm hình thái của các chủng oxy hóa amôni phân lập đƣợc

Ký hiệu Ký hiệu Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc chủng chủng

- bé, đỏ nhạt, lồi, bóng, - vàng đậm, rất bé, nhẵn NA8 NA1 d=0,5-1mm bóng, d < 0,5mm

- vàng nhạt,bóng, - trong, có nhân màu đỏ, NA9 NA2 d=1-1,3mm bóng, d= 0,8-1mm

NA3 - trong, bóng, d=1mm NA10 - màu nâu trong, to, d=1,2-

60

1,5mm

NA4 NA11 - màu cam, lồi, bé, d=0,7mm - vàng chanh, to, dẹt, d=1,5-2mm

- nâu rìa răng cưa, d= 1- NA5 - bé, trắng, lồi, d=0,5mm NA12 1,2mm

- cam nhạt, dẹt, bóng, to, NA6 - trắng đục, dẹt, d=1-1,2mm NA13 d=1,5-1,8mm

NA7 - nâu đỏ, bóng, d=1mm

Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái của 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập đƣợc

Ký hiệu Ký hiệu Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc chủng chủng

NT1 - nâu, bóng, d = 0,5-1mm NT6 - nâu nhạt, dẹt, d= 1,5mm

- vàng chanh, lồi, - trắng đục, bề mặt khô, d NT2 NT7 d = 0,5-0,8mm = 0,3 - 0,5mm

- hồng, nhẵn bóng, d = 0,5 - - trắng đục, dẹt, bóng, d = NT3 NT8 1mm 0.5mm

- màu đỏ, rìa trong, d = NT9 NT4 - trắng trong, bé 1,5-1,7mm

- nâu trong, bé, bóng, NT5 - da cam, lồi, d= 0,8 - 1mm NT10 d=0,3 – 0,5 mm

Để xác định khả năng chuyển hóa của các vi khuẩn nitrat hóa phân lập được,

chúng tôi tiến hành định lượng nitrit tạo thành dựa trên phương pháp Griss trên môi

trường Winogradsky I và hàm lượng nitrat tạo thành theo phương pháp Brucine trên

môi trường Winogradsky II sau 7 ngày nuôi lắc. Sinh trưởng của vi khuẩn được

xác định thông qua đo mật độ quang học OD. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15 và

3.16.

Bảng 3.15: Hàm lƣợng nitrit tạo thành và sự sinh trƣởng của 13 chủng oxy hóa

amôni phân lập đƣợc

Chủng OD Chủng OD

- tạo thành

- tạo thành

NO2 NO2

61

(mg/l) (mg/l)

NA1 0,413 1,71 NA8 0,539 2,88

NA2 0,735 3,26 NA9 0,980 4,21

NA3 1,316 5,23 NA10 1,728 6.86

NA4 0,909 4,13 NA11 0,511 2,56

NA5 0,492 1,55 NA12 1,674 6,12

NA6 0,689 2,14 NA13 0,755 3,70

NA7 1,869 7,06

Bảng 3.16: Hàm lƣợng nitrat tạo thành và sự sinh trƣởng của 10 chủng oxy hóa nitrit

-

-

Chủng OD Chủng OD Hàm lƣợng NO3 (mg/l) Hàm lƣợng NO3 (mg/l)

NT1 1,597 6,05 NT6 1,407 4,16

NT2 1,658 6,88 NT7 1,612 6,57

NT3 0,554 2,97 NT8 1,145 4,07

NT4 1,545 5,12 NT9 0,666 3,56

NT5 1,636 5,75 NT10 0,856 4,32

Trong cùng một điều kiện nuôi cấy như nhau, từ 13 chủng oxy hóa amôni

phân lập được chúng tôi đã chọn được chủng NA7 và từ 10 chủng oxy hóa nitrit

phân lập được đã chọn được chủng NT2 có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa

nitơ cao hơn cũng như sinh trưởng trội hơn các chủng còn lại.

3.1.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn

Bảng 3.17: Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng NA7 và NT2

Đặc điểm Chủng NA7 Chủng NT2

vàng chanh, lồi, Hình dạng khuẩn lạc nâu đỏ, bóng, d=1mm d=0,5-0,8mm

62

Hình dạng tế bào Que ngắn Que thẳng

Kích thước tế bào 1,0 x 1,5 µm 0,7 x 2,0 µm

Nhuộm Gram Gram (-) Gram (-)

Khả năng chuyển hóa nitơ Oxy hóa amôni Oxy hóa nitrit

Khả năng chịu muối 4% 4%

Theo khóa phân loại Bergey, chủng vi khuẩn oxy hóa amôni NA7 có đặc

điểm đặc trưng của vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas. Còn chủng vi khuẩn oxy hóa

nitrit NT2 có đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter.

3.2. Tạo chế phẩm

Sự chuyển hóa vâ ̣ t chất trong tự nhiên là hết sứ c phứ c ta ̣p . Viê ̣c xử lý nướ c

, tạo ra sự chuyển hóa hài hòa trong to àn bộ

thải nuôi trồng thủy sản không phải là sử dụng một loài vi sinh vật thuần khiết nào đó mà là cả mô ̣t hỗn hơ ̣p nhiều loài chuỗi vâ ̣n chuyển . Mỗi loài sinh vâ ̣t sẽ thực hiê ̣n mô ̣t hoă ̣c vài mắc xích trong toàn bô ̣ chuỗi chuyển hóa .

. Các chủng vi sinh vật được lựa chọn nhằm sản xuất chế phẩm phải có hoạt tính sinh học cao : khả năng phân giả i ma ̣nh các cơ chất , thờ i gian mo ̣c nhnah , tích ứng rộng ở cá c pH và nhiê ̣t đô ̣ khác nhau , có khả năng kháng các chủng gây bệnh . Các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao thì khi sử dụng sẽ nhân nhanh sinh khối trong mô ̣t thờ i gian ngắn , tiết ra mô ̣t lươ ̣ng lớ n enzym phân giải

, chúng tôi quyết định sử Sau khi làm các thí nghiê ̣m phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n

dụng 4 chủng vi khuẩn Bacillus TL1, L. plantarum L5, Nitrosomonas sp. NA7 và Nitrobacter sp. NT2 để tạo chế phẩm xử lý nướ c nuôi trồng thủ y sản bi ̣ ô nhiễm . 3.2.1. Thử tính đố i khá ng lẫn nhau củ a cá c chủ ng vi khuẩn

Kiểm tra tính đối kháng giữa các chủ ng vi sinh vâ ̣t đã tuyển cho ̣n để xem

triển chú ng có ứ c chế nhau không là viê ̣c làm rất

trong quá trình sinh trưở ng và phát cần thiết . Bởi vì nếu các chủ ng vi sinh vâ ̣t không ứ c chế nhau thì chú ng ta mớ i có thể phối trô ̣n chú ng vào chung mô ̣t chế phẩm đươ ̣c .

Các chủng được nuôi lắc trên môi trườn g thích hơ ̣p , sau đó thu di ̣ch nuôi có

chứ a kháng sinh . Thử khả năng đối kháng củ a các chủ ng theo phương pháp nhỏ

63

. Đây là cơ sở

dịch. Kết quả đươ ̣c cho thấy các chủ ng này không có đối kháng nhau để có thể đưa các chủng này v ào trong cùng một chế phẩm .

Bảng 3.18: Thƣ̉ tính đố i khá ng lẫn nhau củ a cá c chủ ng vi khuẩ n

Nitrosomonas sp. Nitrobacter sp. Chủng Bacillus TL1 L. plantarum L5 NA7 NT2

Bacillus TL1

L. plantarum L5

Nitrosomonas sp.

NA7

Nitrobacter sp. NT2

3.2.2. Nghiên cứ u cá c điều kiê ̣n lên men xố p thích hợp

Khi đã có 4 chủng vi khuẩn : Bacillus TL1, L. plantarum L5, Nitrosomonas

sp. NA 7 và Nitrobacter sp. NT2 chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm dạng rắn .

3.2.2.1. Lựa chọn môi trườ ng lên men xốp thích hợp

Có thể nói việc lựa chọn môi trường lên men để sản xuất chế phẩm nào đó có

vai trò hết sức quan trọng, bởi lẽ thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men

phải phù hợp với sự sinh trưởng, phát triển của từng chủng vi sinh vật, và tạo điều

kiện kích thích sự hình thành các hoạt tính sinh học của chúng, đồng thời lại phải

đảm bảo yếu tố nguồn nguyên liệu sẵn có, dễ kiếm và rẻ tiền.

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy c hủng vi khuẩn Bacillus TL 1 và T. plantarum L5 trên nguồn cơ chất khác nhau như cám ngô , cám gạo , bô ̣t đâ ̣u tương , trấu vớ i đô ̣ ẩm thích hợp . Sau 4 ngày xác định các hoạt tính enzym bằng phương pháp nhỏ

dịch.

, cám gạo , bô ̣t đâ ̣u tương . trên môi trườ ng cám : trấu

Kết quả đươ ̣c thể hiê ̣n trong bảng 3.19 và bảng 3.20. Cả hai chủng vi khuẩn Bacillus TL1 và L. plantarum L5 đều sinh trưở ng và thể hiê ̣n hoa ̣t tính enzym ma ̣nh khi đươ ̣c lên men xốp trên các môi trườ ng như cám ngô Đặc biệt , vi khuẩn này cho kết quả cao nhất khi lên men (tỷ lệ 1: 1).

64

Bảng 3.19: Ảnh hƣởng của môi trƣờ ng lên men xố p lên Bacillus

Hoạt tính enzym Nguồn cơ chất Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

Cám ngô 24 16 20 21

Cám gạo 26 17 22 20

Cám ngô + bô ̣t 22 15 19 20 đâ ̣u tương

Cám gạo + bô ̣t 20 15 20 22 đâ ̣u tương

Cám ngô + trấu 24 20 24 22

Cám gạo + trấ u 35 30 32 33

Bô ̣t đâ ̣u tương + 25 18 20 19 trấu

Bảng 3.20: Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men xốp lên L. plantarum L5:

Hoạt tính kháng khuẩn

Nguồn cơ chất Vibrio Salmonella E.coli parahaemolyticus typhi

Cám ngô 12 11 6

Cám gạo 14 9 7

13 10 8 Cám ngô + Bô ̣t đâ ̣u tương

Cám gạo + bô ̣t 15 12 7 đâ ̣u tương

Cám ngô + trấu 14 12 8

Cám gạo + trấ u 25 22 12

Bô ̣t đâ ̣u tương + 16 13 9 trấu

65

Qua hai bảng kết quả ta thấy , môi trườ ng thích hơ ̣p cho viê ̣c lên men xốp các

chủng vi sinh vật đó là môi trường cám trấu . Điều này cũng rất phù hơ ̣p cho viê ̣c

sản xuất chế phẩm , vì đây là những nguyên liệu dễ kiế m, rẻ tiền.

3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám: trấu lên quá trình lên men xốp Sau khi đã lựa cho ̣n môi trườ ng lên men xốp thích hơ ̣p cho các chủ ng vi sinh

: trấu tớ i khả

vâ ̣t , chúng tôi tiến hành thí nghiệm xem xét ảnh hưởng của tỉ lệ cám năng sinh trưở ng và tiết enzym củ a các vi khuẩn .

Chúng tôi tiến hành lên men xốp các vi sinh vật trên các môi trường có tỉ lệ cám: trấu khác nhau (trong đó tỷ lê ̣ cám + trấu/ nướ c = 1/1). Sau bốn ngày xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp nhỏ dịch , xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đu ̣c lỗ tha ̣ch . Kết quả đươ ̣c trình bày như hai bảng dướ i đây .

Qua hai bảng kết quả ta thấy

hoạt tính enzym mạnh nhất ở môi trường có tỷ lệ cám , chủng Bacillus TL1 sinh trưở ng và thể hiê ̣n : trấu là 1:1. Tương tự , vi

khuẩn L. plantarum L5 cũng cho kết quả cao nhất khi lên men trên môi trường có cám: trấu là 1:1.

Bảng 3.21: Ảnh hƣởng của tỉ lệ cám : trấ u lên Bacillus TL1

Hoạt tính enzym Tỉ lệ cám:

trấu Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

11 8 2: 8 10 9

12 10 3: 7 11 9

13 11 4: 6 15 12

29 31 5: 5 32 30

17 18 6: 4 19 20

14 13 7: 3 15 12

16 10 8: 2 14 13

66

Bảng 3.22: Ảnh hƣởng của tỉ lệ cám : trấ u lên L. plantarum L5

Hoạt tính kháng khuẩn

Tỉ lệ cám: trấu Vibrio Salmonella E.coli parahaemolyticus typhi

2: 8 - - -

3: 7 9 8 6

4: 6 14 11 8

5: 5 23 21 10

6: 4 14 13 9

7: 3 12 11 7

8: 2 10 10 7

3.2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men xốp

Chúng tôi tiến hành lên men xốp các chủng vi sinh vật trên môi trường cám : trấu tỉ lê ̣ 1: 1. Sau 1, 2, 4, 5, 7, 9 ngày lấy thử hoạt tính enzym , kháng khuẩn . Kết quả như sau :

Bảng 3.23: Ảnh hƣởng của thờ i gian lên men xố p lên Bacillus TL1

Hoạt tính enzym

Thờ i gian (ngày) Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

10 8 1 8 9

11 13 2 12 10

27 32 4 29 32

25 17 5 20 23

17 16 7 19 20

11 12 9 13 12

Bảng 3.24: Ảnh hƣởng của thời gian lên men xốp lên L. plantarum L5

Hoạt tính kháng khuẩn Thờ i gian (ngày )

67

Vibrio Salmonella E.coli parahaemolyticus typhi

- - - 1

- - - 2

13 11 8 4

24 20 11 5

16 14 9 7

13 11 8 9

, chủng Bacillus TL1 sinh enzym ma ̣nh Như vâ ̣y qua hai bảng kết quả ta thấy

nhất sau 4 ngày lên men xốp . Còn chủng L. plantarum L5 thể hiê ̣n hoa ̣t tính kháng khuẩn ma ̣nh nhất sau 5 ngày lên men .

3.2.2.4. Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ là một trong những yếu tố môi trường có ảnh hưởng lớn tới sự

sinh trưởng và phát triển của chủng trong quá trình nuôi c ấy cũng như trong

thực tiễn. Ở điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, mỗi chủng nuôi cấy

thường có một giá trị nhiê ̣t đô ̣ xác định là thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển.

Tiến hành lên men xốp các chủng vi sinh vật trong các điều kiện thích

. Sau 4 ngày (vớ i vi khuẩn Bacillus TL1) và 5

. hơ ̣p ở các nhiê ̣t đô ̣ khác nhau ngày (vớ i vi khuẩn L. plantarum L5) đem thử các chỉ số sinh ho ̣c

Bảng 3.25: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên Bacillus TL1

Hoạt tính enzym

Nhiê ̣t đô ̣ (oC) Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza

9 8 11 9 20

20 19 18 21 25

31 33 30 31 30

20 22 24 18 35

19 20 18 16 40

68

45 15 16 13 14

50 13 12 11 12

Bảng 3.26: Ảnh hƣởng của nhiệt độ l ên L. plantarum L5

Hoạt tính kháng khuẩn

Nhiê ̣t đô ̣ (oC) Vibrio Salmonella E.coli parahaemolyticus typhi

20 10 8 7

25 12 9 10

30 15 13 9

35 25 21 12

40 17 16 9

45 12 10 8

Qua kết quả ở bảng ta thấy chủng vi khuẩn Bacillus TL 1 thích hợ p nhất khi

lên men ở 30oC, còn chủng L. plantarum L5 thích hợp nhất khi lên men ở 35oC. 3.2.2.5. Ảnh hưởng của độ ẩm

Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên cơ chất thích hợp có độ ẩm khác nhau. Nuôi trong tủ ấm 4 ngày ở 300C vớ i Bacillus TL1 và 5 ngày ở 35oC vớ i L. plantarum L5. Sau đó đem xác đi ̣nh các hoa ̣t tính enzym , kháng khuẩn .

Kết quả cho thấy cả hai chủ ng đều sinh trưở ng và sinh enzym tốt nhất khi đô ̣ : cám trấ u bằng 1:1. Khi có quá ít hoă ̣c quá

L. , đă ̣c biê ̣t vớ i chủ ng

.

ẩm môi trường lên men xốp là nước nhiều nướ c đều khiến cho sự sinh trưở ng bi ̣ giảm sú t plantarum L5 khi có quá ít nướ c thì không thể hiê ̣n khả năng kháng khuẩn Kết quả đươ ̣c thể hiê ̣n chi tiết hơn tro ng các bảng dướ i đây .

Bảng 3.27: Ảnh hƣở ng củ a đô ̣ ẩ m lên Bacillus TL1

Hoạt tính enzym

Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza Độ ẩm (tỷ lê ̣ nướ c: cám trấu)

2: 8 10 8 11 10

69

3: 7 19 20 19 21

4: 6 21 22 25 20

5: 5 30 31 33 32

6: 4 19 21 22 17

7: 3 15 17 12 15

8: 2 12 12 11 13

Bảng 3.28: Ảnh hƣởng của độ ẩm lên L. plantarum L5

Hoạt tính kháng khuẩn

Vibrio Salmonella Độ ẩm (tỷ lệ nướ c: cám trấu ) E.coli parahaemolyticus typhi

2: 8 - - -

3: 7 10 - 8

4: 6 12 11 9

5: 5 23 20 11

6: 4 16 17 9

7: 3 12 10 7

8: 2 - 8 -

3.2.3. Sản xuất chế phẩm

Tiến hành nhân giống cấp 1, cấp 2 đối vớ i 4 chủng vi sinh vật đã được tuyển

chọn làm giống sản xuất chế phẩm vi sinh vật như sau :

Vi khuẩn Bacillus: lựa cho ̣n những ống giống thuần nhất rồi nhân sinh khối

180 vòng/ phút

riêng rẽ trong môi trườ ng giá đỗ di ̣ch thể trên máy lắc vớ i tốc đô ̣ trong 24 giờ . Tiếp đến đem giống cấp 1 nhân tiếp trong môi trườ ng giá đỗ di ̣ch thể trên máy lắ c 180 vòng/ phút trong 48 giờ . Sau đó cấy vào môi trườ ng cám trấu ủ ở nhiê ̣t đô ̣ thích hơ ̣p . Sau 4 ngày đem sấy khô ở nhiệt độ 40oC.

70

Vi khuẩn lactic đươ ̣c nuôi cấy trên môi trườ ng MRS da ̣ng di ̣ch trong

2 ngày , sau đó đươ ̣c cấy vào m ôi trườ ng cám trấu ở nhiê ̣t đô ̣ thích hơ ̣p . Sau 5 ngày đem sấy khô ở 40oC.

nogradsky II Hai chủ ng nitra t cũng đươ ̣c nuôi cấy trên Winogradsky I và wi

và cấy vào môi trường cám trấu như trên .

Bốn chủ ng trên dươ ̣c trô ̣n lẫn vớ i nhau the o tỷ lê ̣ 1: 1: 1: 1 tạo thành một chế

phẩm vi sinh vâ ̣t .

Thu hồi sản phẩm sau lên men Sản phẩm sau lên men được đem đi sấy khô ở nhiệt độ 40oC cho đến khi độ

ẩm khô đến 10%. Sau đó được phối trộn theo tỉ lệ: 1:1.

Sản phẩm sau khi được phối trộn sẽ được nghiền dưới dạng bột, sau đó được đóng gói trong túi polyme 2 lớp khối lượng 250g và để ở nhiê ̣t đô ̣ phòng . Cứ sau 1 tháng tiến hành đếm số lượng các loại vi sinh vật trong chế phẩm .

Quy trình sản xuất chế phẩm đươ ̣c thể hiê ̣n t heo sơ đồ:

Ống giống

Nhân giố ng cấ p I (môi trƣờ ng cải tiến dịch, 300C, pH =7, nuôi 1 ngày)

(riêng tƣ̀ ng chủ ng )

Nhân giố ng cấ p II (môi trƣờ ng cải tiến dịch,) 350C, pH =7, nuôi 2 ngày)

(riêng tƣ̀ ng chủ ng )

Lên men xố p

71

(Cám, trấ u, 30-35 0C, đô ̣ ẩ m 50%, 4 – 5 ngày)

sấ y 40 0C, đô ̣ ẩ m 10%

Nghiền, rây

Đó ng tú i bả o quả n

Hình 3.11: Sơ đồ quy tri ̀nh sả n xuấ t chế phẩ m da ̣ng rắ n

chế phẩm vừ a

3.2.4. Đá nh giá khả năng làm sa ̣ch nướ c đầm nuôi thủ y sả n củ a tạo được

, chúng tôi tiến Để thử khả năng làm sa ̣ch nướ c củ a chế phẩm vừ a ta ̣o đươ ̣c

hành thử nghiệm lên đối tượng nghiên cứu là nước đầm nuôi tôm cá bị ô nhiễm.

Tiến hành thí nghiê ̣m vớ i 4 bình dung tích 500ml: mô ̣t bình đối chứ ng không bổ sung chế phẩm , 3 bình thí nghiệm được bổ sung 0,5‰ (0,5 g/l) chế phẩm . Lấy mẫu nướ c vào ngày đầu , sau 3 ngày, 7 ngày và 10 ngày để phân tích các chỉ tiêu thủy lí, thủy hóa . Kết quả đươ ̣c thể hiê ̣n qua từ ng chỉ số môi trườ ng .

3.2.4.1. Giá trị pH

Bảng 3.29: Kết quả giá tri ̣ pH sau các ngày thí nghiệm

Bình thí nghiệm Bình đối chứng

đơn vi ̣ Ngày Sau 3 Sau 7 Sau 10 Ngày Sau 3 Sau 7 Sau 10

đầu ngày ngày ngày đầu ngày ngày ngày

pH đv pH 7,4 7,2 7,1 7,0 7,4 7,4 7,2 7,2

72

Hình 3.12: Giá trị pH sau các ngày thí nghiệm

Giá trị pH ở ở bình thí nghiệm và bình đối chứng đều giảm sau

10 ngày thí nghiê ̣m. Tuy nhiên ở bình thí nghiê ̣m , pH giảm ma ̣nh hơn , từ pH = 7,4 ở ngày đầu 7,0. Còn ở bình đối đã giảm xuống 7,2 sau 3 ngày và sau mười ngày giảm xuống chứ ng pH sau 3 ngày vẫn là 7,4 và đến ngày thứ 10 giảm xuống 7,2.

3.2.4.2. Nitơ tổng số

Bảng 3.30 : Kết quả giá tri ̣ nitơ tổ ng số sau các ngày thí nghiệm

đơn vi ̣ Các thông số Bình đối chứng Sau 7 Sau 3 ngày ngày Sau 10 ngày Ngày đầu

Nitơ tổng số 7,00 7,01 6,98 6,92 mg/l N Ngày đầu 7,00± 0,30 Bình thí nghiệm Sau 7 Sau 3 ngày ngày 5,00± 5,30± 0,15 0,42 Sau 10 ngay 4,36± 0,11

Hình 3.13: Giá trị nitơ tổ ng sau các ngày thí nghi ệm

73

Nitơ tổng số biểu thi ̣ cho nguồn thứ c ăn hữu cơ giàu đa ̣m trong môi trườ ng

nướ c. Chúng quyết định sức sản xuất của thủy sinh vật nói chung và tôm cá nói riêng.

Theo kết quả ở bảng và đồ thi ̣ trên ta thấy

, ở các bình thí nghiệm hàm lượng ni tơ tổng giảm rõ rê ̣t sau 10 ngày nghiên cứu . Trong khi đó ở bình đối chứ ng chỉ số này có giảm nhưng tốc độ giảm chậm và giảm ít . Ở bình thí ngiê ̣m ngày đầu tiên đo đươ ̣c là 7,00 mg/l, sau 3 ngày thí nghiệm giảm xuống 5,3 mg/l, sau 7 ngày giảm còn 5,00 mg/l và sau 10 ngày đã giảm xuống còn 4,36 mg/l. Còn ở bình đối chứng hàm lươ ̣ng nitơ tổng ngày đầu là 7,00 mg/l đến 3 ngày sau vẫn là 7,01 mg/l, sau 7 ngày là 6,98 mg/l và sau 10 ngày là 6,92 mg/l; lươ ̣ng nitơ giảm xuống rất nhỏ , không đáng kể .

3.2.4.3. Amôni

+ không gây đô ̣c cho thủ y sinh vâ ̣t nhưng NH 3 là chất gây độc cho các thủy

Amôni là sản phẩm khoáng đầu tiên của các chất hữu cơ . Amôni ở dạng

NH4 sinh vâ ̣t .

Bảng 3.31: Kết quả giá tri ̣ amôni sau các ngày thí nghiệm

Bình thí nghiệm Bình đối chứng

đơn vị các thông số Ngày đầu Sau 3 ngày Sau 7 ngày Ngày đầu

1,34 Sau Sau Sau 10 7 3 ngày ngày ngày 1,33 1,35 1,32

1,34± 0,21 0,52± 0,023 0,15± 0,032 Sau 10 ngày 0,07± 0,015 amôni mg/l NH3- N

74

Hình 3.14: Giá trị amôni sau các ngày thí nghiệm

Qua kết quả đươ ̣c trình bày ở bảng và đồ thi ̣ ta thấy

. Ở các bình thí nghiệm , sau 10 ngày thí nghiệm hàm lượng NH 3 đã giảm từ 1,34 xuống còn 0,07 mg/l. Còn ở bình đối chứng thì lượng NH 3 hầu như giảm không đáng kể , từ 1,34 mg/l xuống 1,32 mg/l sau 10 ngày thí nghiệm .

3.2.4.4. Nitrit

Bảng 3.32: Kết quả giá tri ̣ nitrit sau các ngày thí nghiệm

-

đơn vi ̣ thông số

mg/l Bình đối chứng Sau 7 Sau 3 ngày ngày 0,17 0,19 Sau 10 ngày 0,18 Ngày đầu 0,23 NO2

Bình thí nghiệm Sau 3 ngày 0,17± 0,01 Sau 7 ngày 0,13± 0,03 Sau 10 ngay 0,12± 0,01 Ngày đầu 0,23± 0,02

Hình 3.15. Giá trị nitrit sau các ngày thí nghiệm

Nitrit là chỉ tiêu vê ̣ sinh , yếu tố chỉ thi ̣ củ a quá trình tự làm sa ̣ch nướ c trong c mà hàm lươ ̣ng

tự nhiên . Dạng nitrit thường vô hại nhưng trong môi trường nướ chlorinity thấp thì nitrit sẽ gây đô ̣c cho tôm cá .

Qua bảng ta thấy , ở bình thí nghiệm hàm lượng nitrit giảm rõ rệt sau 10 ngày thí nghiệm : từ 0,23 mg/l ngày đầu tiên xuốn g còn 0,12 mg/l ngày thứ 10. Trong khi đó ở bình đối chứng , lươ ̣ng nitrit có giảm nhưng giảm ít , ngày đầu là 0,23 mg/l và đến ngày thứ 10 là 0,18 mg/l.

75

3.2.4.5. COD và BOD

COD là nhu cầu ox y hóa học cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ các chất hữu cơ trong nướ c thành CO 2 và H 2O. BOD là nhu cầu oxy sinh ho ̣c cần thiết cho vi sinh vâ ̣t tiêu thu ̣ để oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước .

Trong đầm nuôi trồng thủ y sản , hai chỉ tiêu nghiên cứ u chất lươ ̣ng nướ c

COD và BOD đươ ̣c dù ng để đánh g iá mức độ nhiễm bẩn , phú dưỡng đồng thời còn cho biết sự phát triển củ a sinh vâ ̣t trong thủ y vực .

:

Theo kết quả thí nghiê ̣m chú ng tôi có bảng số liê ̣u cù ng vớ i sơ đồ như sau Bảng 3.33: Kết quả giá tri ̣ COD và BOD sau các ngày thí nghiệm

Bình thí nghiệm Bình đối chứng các

thông đơn vi ̣ Ngày Sau 3 Sau 7 Sau 10 Ngày Sau 3 Sau 7 Sau 10

số đầu ngày ngày ngay đầu ngày ngày ngày

15± 11,02± 7,08± 5,10± COD mg/l 15 14,2 13,9 13,5 0,5 0,49 0,20 0,36

8,9± 6,8± 4,7± 3,5± BOD mg/l 8,9 8,2 8,0 7,8 0,17 0,16 0,20 0,10

Hình 3.16. Giá trị COD sau các ngày thí nghi ệm

76

Hình 3.17: Giá trị BOD sau các ngày thí nghiệm

Như vâ ̣y , có thể nhận thấy rằng , sau 10 ngày thí nghiệm thì chỉ số BOD và

COD ở bình t hí nghiệm đã giảm đáng kể . Ở ngày đầu COD là 15 mg/l và BOD là 8,9 mg/l thì đến ngày thứ 10 COD chỉ còn 5,10 mg/l và BOD còn 3,5 mg/

. Còn ở bình đối chứng các chỉ số này tuy có giảm nhưng giảm chậm và ít , ngày đầu COD là 15 mg/l thì đến ngày 10 là 13,5 mg/l còn BOD ngày đầu là 8,9 mg/l đến ngày thứ 10 là 7,8 mg/l.

Đá nh giá chung Bảng 3.34: Kết quả xƣ̉ lý nƣớ c đầm nuôi thủ y sả n củ a chế phẩ m

Bình thí nghiệm Bình đối chứng các đơn vi ̣ thông số Ngày đầu Sau 3 ngày Sau 7 ngày Sau 10 ngay Ngày đầu Sau 3 ngày Sau 7 ngày Sau 10 ngày

pH đv pH 7,4 7,2 7,1 7,0 7,4 7,4 7,2 7,1

Độ muối ‰ 21 19 19 20 21 20 19 20

7,00 7,01 6,98 6,92 Nitơ tổng số mg/l N

-

1,34 1,33 1,35 1,32 N NH3

mg/l 0,23 0,19 0,17 0,18 NO2 7,00± 0,30 1,34± 0,21 0,23± 0,02 5,30± 0,42 0,52± 0,023 0,17± 0,01 5,00± 0,15 0,15± 0,032 0,13± 0,03 4,36± 0,11 0,07± 0,015 0,12± 0,01

COD mg/l 15 14,2 13,9 13,5 15± 0,5 11,02± 0,49 7,08± 0,20 5,10± 0,36

8,9± 6,8± 4,7± 3,5± BOD mg/l 8,9 8,2 8,0 7,8 0,17 0,16 0,20 0,10

77

Như vâ ̣y có thể thấy rằng , khả năng làm sạch nước đầm nuôi tôm cá của chế

ệt. Ở 3 bình thí nghiệm có bổ sung chế

, chất

3 ngày xử lí , các chỉ số môi trường như

. Sau 7 ngày nước đã

. Sau 10 ngày các chỉ số - giảm : nitơ tổng giảm 37,7%, amôni giảm 91,8%, NO2

phẩm vi sinh là rất cao và có hiê ̣u quả rõ r phẩm vi sinh , các chỉ số b ất lợi của môi trường đã giảm dần theo thời gian lươ ̣ng nướ c đươ ̣c cải thiê ̣n đáng kể sau - giảm mạnh nhưng vẫn ở trạng thái ô nhiễm nhẹ NH3, NO2 đươ ̣c làm sa ̣ch và nằm trong giớ i ha ̣n chi ̣u đựng củ a sinh vâ ̣t ở bể thí nghiệm giảm rõ rệt 47,8%, COD giảm 66,0% và BOD giảm 60,6% bể đối chứ ng (không dù ng chế phẩm ) các chỉ số môi trường có giảm nhưng không đáng kể , sau 10 ngày thí nghiê ̣m, nướ c vẫn ở tình tra ̣ng ô nhiễm , quá trình tự làm sạch tự nhiên diễn ra chậm . p, Hàng ngày , trong các đầm nuôi trồng thủ y sản nhất là nuôi công nghiê ̣

, phân sinh vâ ̣t , tảo chết, xác đòi hỏi thờ i gian rất dài , như , ảnh h ưởng đến s ự phát triển của thủy

, các vi sinh vật có ích thúc đẩy

lươ ̣ng chất thải hữu cơ liên tu ̣c gia tăng do thứ c ăn thừ a đô ̣ng vâ ̣t… nếu để quá tình tự làm sa ̣ch tự nhiên thì vâ ̣y thì chất lươ ̣ng nướ c ngày càng suy thoái sản nuôi . Khi bổ sung chế phẩm vi sinh vào nướ c quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ dư thừa , cải thiện chất lượng nước theo hướ ng có lơ ̣i cho tôm phát tr iển. Kết quả thu đươ ̣c cho thấy khi dù ng chế phẩm xử lí nướ c nuôi trồng thủ y sản đã bi ̣ ô nhiễm đều có hiê ̣u quả hơn khi nướ c tự làm sa ̣ch tự nhiên.

78

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận chính sau đây:

1. Đã tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có khả năng làm sạch nước

nuôi trồng thủ y sản đó là các chủng: TL1, L5, NA7, NT2

Chủng TL1 được xác định thuộc chi Bacillus. -

Chủng L5 được xác định thuộc về loài Lactobacillus plantarum có -

khả năng sinh bacteriocin, ức chế mạnh với Vibrio parahaemolyticus.

Chủng NA7 có khả năng chuyển hóa amôni thành nitrit cao. -

Chủng NT2 có khả năng chuyển hóa nitrit thành nitrat cao. -

Đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa c ủa 5 chủng trên 2.

3. Nghiên cứu một số điều kiện lên men xốp thích hơ ̣p cho viê ̣c ta ̣o chế

4 chủng Bacillus TL1, L. plantarum L5,

phẩm vi sinh vâ ̣t củ a hỗn hơ ̣p Nitrosomonas sp. NA7 và Nitrobacter sp. NT2.

4. Tạo chế phẩm probiotic dạng rắn

, đa ̣t các chỉ tiêu : sau 10 ngày nitơ tổng giảm 37,7%, - giảm 47,8%, COD giảm 66,0% và BOD giảm 60,6% bể

, thử nghiê ̣m xử lý nướ c đầm nuôi tôm ở quy mô ph òng thí nghiệm . Chế phẩm đã có tác du ̣ng làm thay đổi đang kể theo chiều hướ ng tích cực các chỉ số trong nướ c ở đầm nuôi tôm cá của tiêu chuẩn ngành nuôi trồng thủy sản amônia giảm 91,8%, NO2 đối chứ ng (không dù ng chế phẩm ) các chỉ số môi trường có giảm nhưng không đáng kể , sau 10 ngày thí nghiệm , nướ c vẫn ở tình tra ̣ng ô nhiễm , quá trình tự là m sạch tự nhiên diễn ra chậm .

KIẾ N NGHI ̣

- Tiếp tu ̣c thử nghiê ̣m tác du ̣ng củ a chế phẩm ta ̣i hiê ̣n trườ ng vớ i các phương thứ c nuôi khác nhau ở quy mô lớ n .

h vâ ̣t để

- Tiếp tu ̣c nghiên cứ u quy trình lên men ta ̣o sinh khối lớ n các chủ ng vi sin phục vụ việc sản xuất chế phẩm ở quy mô lớn .

79

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Viê ̣t:

1. Nguyễn Tác An (1996), Phương phá p quản lý chất lượng nướ c phu ̣c vu ̣ nuôi

trồng thủy hải sản, Giáo trình cao học , Đa ̣i ho ̣c thủ y sản Nha T rang.

(1998), Báo cáo đề tài “Điều tra hiện trạng môi trường ven 2. Nguyễn Tác An

biển thà nh phố Nha Trang và đề xuất cá c giải phá p cải thiê ̣n và phá t triển môi trườ ng”, Nha Trang.

3. Bộ khoa học công nghệ và môi trường (2000), Tiêu chuẩn nước sinh hoạt

TCVN 6772-2000, tiêu chuẩn nước cho bảo vệ đời sống thủy sinh TCVN 6773-2000, Hà Nội.

4. Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước giàu hợp chất nitơ và photpho, Nhà xuất bản

Khoa học tự nhên và Công nghệ, Hà Nội.

5. Lê Văn Cát, Đỗ Thị Hồng Nhung, Ngô Ngọc Cát (2006), Nước nuôi thủy sản:

Chất lượng và biện pháp cải thiện chất lượng, Nhà xuất bản Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội.

– Phòng phân tích (2010), Báo cáo 6. Công ty cổ phần chứ ng khoán An Bình

Ngành Thủy sản Việt Nam.

7. Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản (2000), “Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh,

hóa chất và chế phẩm trong môi trường nuôi tôm”, Trích tham luận tại hội

nghị phát triển nuôi tôm tạo sản phẩm vệ sinh thực phẩm khu vực miền chung và miền nam, Thông tin Khoa học công nghệ, số 9, tr 11-12.

8. Cục Khai thác và Bảo vệ Nguồn lợi thủy sản (2003), Chuyên đề: Tình hình nuôi

trồng thủy sản trên thế giớ i và cá c vấn đề đá ng quan tâm – số 4 / 2003.

9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học,

Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.

10. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản

Giáo dục, Hà Nội.

11. Hồ Thanh Hải (1999), Tiềm năng về điều kiê ̣n tự nhiên và nguồn lợi sinh vật

vùng triều cửa sông ven biển cho phát triển thủy hải sản, Báo cáo hội thảo

80

khoa ho ̣c về quản lý và sử du ̣ng bền vững tài nguyên và môi trườ ng đất ngâ ̣p nướ c cử a sông ven biển , Hà Nội .

12. Nguyễn Văn Hảo (2002), Một số vấn đề về kĩ thuật nuôi tôm sú công nghiệp,

Nhà xuất bản Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh.

13. Lại Thúy Hi ền (1998), “Một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa của một số chủng vi

khuẩn khử sulphat phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, Tạp chí sinh học, 8, tr.

37-38.

– hóa họ c 14. Nguyễn Đứ c Hô ̣i (1996), Phương phá p thu và phân tích mẫu lý

, Viê ̣n nghiên cứ u

nướ c, Trung tâm thông tin KHKT và kinh tế thủ y sản thủy sản 1, Hà Nội .

15. Hoàng Huệ (1996), Xử lý nướ c thải, Nhà xuất bản Xây dựng , Hà Nội .

16. Khoa Thuỷ Sản, trường Đại học Cần Thơ (2000), Cẩm nang kĩ thuật nuôi thủy

sản nước lợ, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

17. Lê Văn Khoa (Chủ biên ) (2003), Chỉ thị sinh học môi trường , Nhà xuất bản

Giáo dục .

18. Trần Tường Lưu (1994), “Đánh giá về một số khía cạnh môi trường liên quan

đến bệnh tôm ở khu vực phía Nam”, Báo cáo kết quả nghiên cứu chương

trình khảo sát nguyên nhân gây chết tôm nuôi tại khu vực phía Nam và

biện pháp phòng trừ để phát triển nghề nuôi tôm, Phần I, Viện nghiên cứu

môi trường thủy sản II, thành phố Hồ Chí Minh.

19. “Một số bệnh tôm nuôi và biện pháp phòng chống”, Thông tin khoa học công

nghệ thủy sản, số 9/2002.

20. Nguyễn Văn Nam, Phạm Văn Ty. “Vai trò của chế phẩm sinh học trong nuôi

trồng thủy sản”, Tạp chí Thông tin Khoa h ọc Công nghệ - Kinh tế thủy

sản, số 3/2007, tr. 27 – 28.

21. Nguyễn Trọng Nho (1994), Tình hình nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam, một

số đặc điểm của tôm sú, Đại học Thủy sản.

(1996), Các chỉ tiêu sinh thái chủ 22. Nguyễn Tro ̣ng Nho – Tạ Khắc Thường và ctv

cao yếu trong cá c ao nuôi tôm ở cá c tỉnh Nam Trung bộ và vấn đề nâng

81

năng suất ở đây, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ , Nha Trang.

23. Nguyễn Tro ̣ng Nho , Tạ Khắc Cường , Lục Minh Diệp , Nguyễn Thi ̣ Xuyến (1997), Nghiên cứ u cải tiến quy trình nuôi tôm sú thi ̣t tại Khá nh Hò a đạt hiê ̣u quả kinh tế cao và năng suất ổn đi ̣nh, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Nha Trang.

24. Lương Đức Phẩm (2000). Vi sinh vật lương thực và thực phẩm, Nhà xuất bản

Giáo dục, Hà Nội.

25. Lương Đức Phẩm (2002), Công nghệ xử lý nước thải bằng các biện pháp sinh

học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.

26. Văn Phú (2003), “Bio – niềm tin trọn ve ̣n của ngườ i nuôi tôm ”, Tạp chí thủy

sản, (12/2002, 1/2003).

27. Lê Thi ̣ Phươ ̣ng (2010), Nghiên cứ u chất lượng nướ c trong cá c đầm nuôi tôm

vùng rừng ngập mặn ven biển huyê ̣n Giao Thủy, tỉnh Nam Định và một số biê ̣n phá p sinh học là m sạch nướ c trong cá c đầm nuôi tôm, Luâ ̣n án tiến si ̃ sinh ho ̣c.

28. Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội.

29. Phan Lương Tâm và ctv (1998), “Kết quả bước đầu đánh giá nguyên nhân gây

chết tôm ở các tỉnh phía Nam”, Tạp chí thủy sản, Hà Nội , tr. 149-162.

30. Bùi Quang Tề (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, Nhà xuất bản

Nông nghiệp, Hà Nội.

31. Đặng Ngọc Thanh (1974), Thủy sản họ c đại cương , Nhà xuất bản đại học và

trung ho ̣c chuyên nghiê ̣p , Hà Nội .

32. PGS. TS Ngô Tự Thành (2001), “ Sự phân bố, sinh trưởng và sinh tổng hợp

protease ngoại bào của Bacillus ở vùng Hà Nội”, Tạp chí sinh học 23, tr.

153-157.

33. Nguyễn Việt Thắng (1998), “Xác định nguyên nhân chính gây bệnh cho tôm ở

Đồng bằng sông Cửu Long và các giải pháp tổng hợp”, Các công trình

nghiên cứu khoa học công nghệ thủy sản 1991-1995, Vụ Khoa học công

nghệ, Hà Nội, tr. 163-173.

82

34. Nguyễn Hữu Thọ (2001), “Biến động của sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD,

chlo hữu cơ trong môi trường nước ảnh hưởng đến khả năng xảy ra bệnh

đốm trắng, bệnh đàu vàng trên tôm nuôi ở Khánh Hòa”, Tạp trí thủy sản,

43, Bộ Thủy sản-Trung tâm nghiên cứu thủy sản III, tr. 5-15.

35. Võ Thị Thứ , La Thi ̣ Nga, Trương Ba Hù ng , Nguyễn Minh Dương , Nguyễn Liêu

Ba (2003), Nghiên cứ u tạo chế phẩm Biochie và đá nh giá tá c du ̣ng của chế phẩm đến môi trườ ng nướ c nuôi tôm cá , Hô ̣i nghi ̣ Công nghê ̣ sinh ho ̣c toàn quốc 12/2003.

36. Phạm Văn Tình (2003), Kĩ thuật nuôi tôm sú thâm canh, Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Hà Nội.

37. Lê Trình (1997), Quan trắ c và kiểm soá t ô nhiễm môi trườ ng nướ c , Nhà xuất

bản Khoa học kỹ thuật .

38. Vũ Thế Trụ (1994), Cải tiến kĩ thuật nuôi tôm tại Việt Nam, Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Hà Nội.

Tiếng Anh

39. Artemia Internation LLC (2002), “Sprirulina superfood for ornamental fish”,

Technical Information Shrimp Larval and Enrichment Feed s, Dec 3.

40. Block E., Koops H.P., Ahlers B. (1991), The biochemistry of nitriflying

organisms, In Variations in Autotrophic Life, Academic Press Limited,

San Diego, pp. 171-177.

41. Block E., Sundermeyer-Klinger, Stackebraandt E. (1993), New facultative

lithoautotrophic nitrite- oxidizing bacteria, Arcg. Microbiol, 136, pp.281-

284

42. Bothe, Jost, Schloter. M., Ward B. and Witzel (2000), Molecular analysis of

ammonia oxidation and denitrification in the natural environments, FEMS

Microbiol. Rev.,24, pp. 673-682.

43. Boyd C. E. and Tucker C. S. (1998), Pond aquaculture water quality

Management, Kluwer Academic Publishers, London, pp. 5.

83

44. Chanratchakool P., Turnbull J. F. and liusuwan C. (1995), Health management

in shrimp pond, Aquatic animal health research institute kasetsart

university campus, Jatujak, Bangkok 10900 Thailand.

45. Chiu Liao P. (1992), Marine prawn culture industry of Taiwan, In marine

shrimp culture principle and practies. Elsevier – Amsterdam – London –

Newyork – Tokyo, pp. 653-674.

46. Diana J.S., Lin C.K., Schneeberger P.J. (1991), “Relationships amônig nutrient

inputs, water nutrient concentration, primary production, and yield of

Oroechromis niloticus in pond”, Aquaculture, pp. 323-341.

47. Emanuel V., Adrian V., Ovidiu P., Gheorghe C. (2005), “Isolation of a

Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the

preservation of fodders”, African Journal of Biotechnology, 50(3), pp.

403-404.

48. FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food

including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint

FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional.

49. Franson (1995), Standard methods for the Examinaition of Water and

Wastewater, Publication Office American Public Health Association- Washington, DC 2005, 19th Edition, pp. 225-227; 240-243.

50. Gaudiosa Almazan-Gonzales (1995), Pond limnology and water quality parameters, Aquaculture derpartment southeast fisheries development

center training and information division techno-transfer section tigbanan.

Hoilo city, Philippines.

51. Hebe M. Dionisi, Alice C. Layton, Gerda Harms, Igrid R. Gregory, Kevin G.

Robinson and Gray S. Sayler (2002), “Quantification of Nitrosomonas

oligotropha - like Ammonia Oxidizing Bacteria & Nitrospira spp. from

Full-Scale Wastewater Treatment Plants by Competitive PRC”,

Application and Evironmental Microbiology, pp. 245-253.

52. Hung-Hung Sung, Shi-Fang Hsu, Chih-Kun Chemical, Yun-Yuan Tinh, Wei-

Liang Chao. “Relationship between desease outbreak in cultured tiger

84

shrimp (Penaeus monodon) and the composition of Vibrio communites in

pond water and shrimp hetopancreas during cultivation”, Inc, Jan 9.

53. Hung-Soo, Mitsuyo, H. and Makoto (2005), Characteritics of ammonium

removal by heterotrophic nitrification - Aerobic denitrification by

Alcalgenes faecali, 100(2), pp. 184-191.

54. Ian L. Brown, Kenneth J. Mc Naught, Robert N. Ganly, Patric Lynne Conway,

Anthony John Evans, David Lioyd, Topping, XinWang (2000),Probiotic

compositions, US patent No: 6, 060, 050.

55. Kakani (2003), “Probiotics: their role in aquaculture, Energee - American

Standard Products”, Inc, Jan 10.

56. Keeton Jimmie A, William Diane P (2000) “Probiotic formulation and method

for reduction of pathogenic bacteria” US patent No: US

200331049091Nichols, Andrew W. (2007). "Probiotics and athletic

performance: A systematic review", Current Sports Medicine Reports

(Current Medicine Group LLC), pp. 269–273.

57. Paez-osuna F. (2001), “The environmental inpact of Shrimp aquaculture: cause,

effects, and mitigating alternatives”, Environ Manage, 46, pp. 65-69.

58. Sambasivam S., Chandrran R. & Ajmal Khan S. (2003), “Role of probiotics on

the environment of shrimp pond”, Environ Bio, 34, pp. 13-17.

59. Shan H., Obbanrd J. P. (2001), “Ammonia removal from prawn aquaculture water using immobilized nitrifying bacteria”, Appl Microbiol Biotechnol,

71, pp 24-30.

60. Sirirat Dengripat et all (1998), Effects of probiotic bacterium on black tiger

shrimp Penaeus monodon survival and growth, In Aquaculture 167.

61. Wang-Xiang-Hong, LiJun, JiWei-Shang, Xu-Huai-Shu (2002),

Application of Probiotics in Aquaculture, Ocean University of Chindo,

China, May 20, pp. 145-147.

62. William et all (1994), Bergey’s Manual of detereminative Bacteriology, 9th,

edition, pp. 559-560

Website:

85

63. http://www.atcvietnam.com.vn

64. http://opac.lrc.ctu.edu.vn

65. http://vi.wikipedia.org/wiki

86

PHỤ LỤC

Mô ̣t số hi ̀nh ả nh liên quan đến luâ ̣n văn :

Hình 2: Hoạt tính kitinaza của Hình 1: Hình dạng khuẩn lạc chủng TL1 chủng TL1 (D-d=35mm)

Hình 3: Ho ạt tính xenlulaza của chủng TL1 (D-d=32mm) Hình 4: Hoạt tính amylaza của chủng TL1 (D-d=30mm)

Hình 5: Hình dạng tế bào chủng TL1

87

Hình 6: Hoạt tính kháng Vibrio của chủng L5 Hình 7: Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của chủng L5

Hình 8: Nhuộm Gram chủng L5 Hình 9: Hình dạng khuẩn lạc chủng L5

Màu xanh: tế bào L5 Màu đỏ: tế bào E.coli

Hình 10: Chuẩn độ axit lactic theo phƣơng pháp Therner

88

Hình 11: Hình dạng tế bào chủng NA7 Hình 12: Hình dạng tế bào chủng

NT2

Hình 13: Định lƣợng nitrit bằng Hình 14: Định lƣợng nitrat bằng

phƣơng pháp Griss phƣơng pháp Brucine

Hình 16: Thí nghiệm xử lý nƣớc TTTS bị ô nhiễm bằng chế phẩ m Hình 15: Thí nghiệm xác định tỷ lệ cám: trấ u thích hợp cho lên men xố p

89