Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng nấm fusarium gây hại trên cây cà chua (lycopersicon esculentum mill.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Đặng Đào Ý Đoan

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN

SINH HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM FUSARIUM

GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA

(LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Đặng Đào Ý Đoan

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN

SINH HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM FUSARIUM

GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA

(LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.)

Chuyên ngành

: Vi sinh vật học

Mã số

: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Đặng Đào Ý Đoan

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã trực

tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn

thành luận văn. Cô đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận

văn này.

Xin chân thành cảm ơn Ths. Trần Thị Minh Định cùng toàn thể các thầy cô

khoa Sinh và cán bộ phòng Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Thành

phố Hồ Chí Minh đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè và những người

thân trong gia đình đã luôn bên cạnh và tạo điều thuận lợi để tôi hoàn thành luận

văn này.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. Fusarium gây bệnh trên cây cà chua ................................................................ 3

1.1.1. Nấm Fusarium ............................................................................................ 3

1.1.2. Cây cà chua ................................................................................................ 8

1.2. Xạ khuẩn ......................................................................................................... 13

1.2.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .............................................................. 13

1.2.3. Các đặc điểm phân loại xạ khuẩn ............................................................. 15

1.2.4. Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn .............................................. 16

1.3. Chất kháng sinh .............................................................................................. 18

1.3.1. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh ........................................................ 18

1.3.2. Cơ chế tác động của chất kháng sinh ....................................................... 20

1.3.4. Các chất kháng sinh có khả năng kháng nấm từ xạ khuẩn ...................... 22

1.3.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ

khuẩn trên thế giới và Việt Nam. ............................................................. 24

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 27

2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 27

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................... Error! Bookmark not defined.

2.1.2. Hóa chất ................................................................................................... 27

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 27

2.1.4. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 27

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 28

2.2.1. Phân lập xạ khuẩn ..................................................................................... 28

2.2.3. Quan sát hình thái xạ khuẩn ..................................................................... 30

2.2.4. Xác định khả năng kháng nấm của XK .................................................... 30

2.2.5. Tuyển chọn các chủng XK sinh chất kháng nấm ..................................... 31

2.2.6. Phương pháp định loại xạ khuẩn bằng kĩ thuật di truyền phân tử............ 31

2.2.7. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp ............................. 34

2.2.8. Phương pháp tách chiết chất kháng nấm .................................................. 36

2.2.9. Xác định ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm của hạt

và sự sinh trưởng của cây cà chua ........................................................... 37

2.2.10. Thử nghiệm khả năng kháng Fusarium của dịch lên men XK trên

cây cà chua ............................................................................................ 37

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 40

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng sinh hoạt chất kháng

nấm Fusarium ................................................................................................ 40

3.2. Đặc điểm hình thái của chủng D7................................................................... 42

3.3. Định danh đến loài chủng xạ khuẩn D7 ......................................................... 44

3.4. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng S.

pseudogriseolus sinh hoạt tính kháng Fusarium ............................................ 45

3.4.1. Lựa chọn MT và thời gian lên men thích hợp .......................................... 45

3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .................................................................. 48

3.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng cacbon ........................................................... 49

3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................... 51

3.4.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ ................................................................ 53

3.4.6. Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy ............................................... 54

3.4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ......................................... 55

3.4.8. Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng nấm của

chủng S. pseudogriseolus......................................................................... 57

3.5. Tách chiết chất kháng nấm ............................................................................. 59

3.6. Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm

của hạt và sự phát triển của cây cà chua trong phòng thí nghiệm .................. 62

3.7. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng Fusarium của dich lên men chủng

XK trên cây cà chua trong chậu thí nghiệm ................................................... 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 73

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bào tử BT

Khuẩn lạc KL

Môi trường MT

Nhà xuất bản NXB

Xạ khuẩn XK

Vi khuẩn VK

Vi sinh vật VSV

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................... 32

Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Fusarium ............................. 41

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại MT đến hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus theo thời gian ............................................. 46

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính kháng ............................ 48

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus.............................................................. 50

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt chất kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus .................................................................... 51

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus tại 72 h ................................................ 53

Bảng 3.7. Ảnh hưởng pH ban đầu của MT lên hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus sau 72h ................................................ 54

Bảng 3.8. Ảnh hưởng nhiệt độ của MT lên hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus sau 72 h ...................................................... 56

Bảng 3.9. Động học quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus.............................................................. 57

Bảng 3.10. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus được

chiết bằng các dung môi hữu cơ từ sinh khối ...................................... 60

Bảng 3.11. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus được

chiết bằng các dung môi hữu cơ từ dịch lên men ................................ 61

Bảng 3.12. Tỉ lệ nảy mầm của hạt khi ngâm ở dịch lên men ở các nồng độ

khác nhau ............................................................................................. 63

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của dịch lên men lên khả năng sinh trưởng của cây

cà chua ................................................................................................. 65

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng ức chế Fusarium trên

cây cà chua .......................................................................................... 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Bào tử của Fusarium ................................................................................. 4

Hình 1.2. Penicillium notatum ức chế sự phát triển của Staphylococus

aureus .................................................................................................... 18

Hình 1.3. Vị trí tác động của kháng sinh ................................................................. 20

Hình 1.4. Cấu trúc của kasugamyxin ....................................................................... 22

Hình 1.5. Cấu trúc của polioxin ............................................................................... 23

Hình 1.6. Cấu trúc của blastixidin S ........................................................................ 23

Hình 1.7. Cấu trúc validamyxin A ........................................................................... 24

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc một số chủng xạ khuẩn phân lập được .................... 40

Hình 3.2. Hoạt tính kháng Fusarium của 8 chủng XK tuyển chọn được ................ 42

Hình 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn D7 ........................... 43

Hình 3.4. Hệ sợi chủng D7 ...................................................................................... 43

Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bào tử chủng D7 ................................................... 43

Hình 3.6. Kết quả giải trình tự ARNr 16S của chủng D7 ........................................ 44

Hình 3.7. Biểu đồ ảnh hưởng của thành phần MT đến hoạt tính kháng

Fusarium của chủng S. pseudogriseolus theo thời gian ........................ 47

Hình 3.8. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng D7 trên 4 loại MT sau 72 h

nuôi cấy. ................................................................................................ 48

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus ...................................................................... 49

Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của hàm lượng cacbon đến hoạt tính kháng

Fusarium của chủng S. pseudogriseolus sau 72 h ................................. 51

Hình 3.11. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính kháng

Fusarium của chủng S. pseudogriseolus sau 72h .................................. 52

Hình 3.12. Đồ thị ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus ................................................................ 53

Hình 3.13. Ảnh hưởng pH ban đầu của MT lên hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus ...................................................................... 55

Hình 3.14. Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus ...................................................................... 56

Hình 3.15. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus theo thời gian......................................... 58

Hình 3.16. Biểu đồ hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus

được chiết bằng các dung môi hữu cơ từ sinh khối ............................... 60

Hình 3.17. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus được

chiết bằng các dung môi hữu cơ từ dịch lên men .................................. 61

Hình 3.18. Dịch lên men của chủng S. pseudogriseolus ........................................... 62

Hình 3.19. Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men đến khả năng nảy

mầm của hạt cà chua .............................................................................. 63

Hình 3.20. Tỉ lệ nảy mầm của hạt khi xử lý dịch lên men chủng S.

pseudogriseolus ở các nồng độ khác nhau ............................................ 64

Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men đến khả năng sinh trưởng

của cây cà chua ...................................................................................... 66

Hình 3.22. Ảnh hưởng của dịch lên men đến sự phát triển của rễ cây cà chua ...... 66

Hình 3.23. Cây cà chua sinh trưởng bình thường sau thời gian .............................. 68

Hình 3.24. Cây cà chua bị nhiễm Fusarium sau thời gian ...................................... 68

Hình 3.25. Cây cà chua sau 4 tuần ở lô ĐC 1 ......................................................... 69

Hình 3.26. Cây cà chua sau 4 tuần ở lô ĐC 2 ......................................................... 69

Hình 3.27. Cây cà chua sau 4 tuần ở lô TN1 ........................................................... 69

Hình 3.28. Cây cà chua sau 4 tuần ở lô TN2 ........................................................... 69

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nên

thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại cây trồng, đặc biệt là các loại rau màu.

Đồng thời, điều kiện khí hậu nơi đây cũng rất thuận lợi cho sự phát triển của nhiều

loại vi sinh vật (VSV) trong đó có VSV gây hại cây trồng.

Trong các loại rau màu ở nước ta, cà chua được xếp vào loại rau trồng có giá

trị kinh tế và cho sản lượng khá cao hàng năm. Riêng ở Lâm đồng, theo thống kê

của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh này, năng suất cà chua trung bình

hiện nay là 70 tấn/ha/vụ. Tuy nhiên, các loại bệnh do vi nấm gây ra đã làm giảm

năng suất thu hoạch từ 30-70% trên rau màu. Đặc biệt, Fusarium là tác nhân gây

bệnh trên rất nhiều loại cây trồng, trong đó có cây cà chua. Chúng có thể gây hại

trên mọi giai đoạn sinh trưởng của cây cà chua, làm lá biến vàng héo khô dần, cây

sinh trưởng yếu và cuối cùng toàn cây bị héo chết. Thêm nữa, các bệnh cây do

chúng gây ra có thể lan rộng nhanh chóng thành dịch lớn trên đồng ruộng nhờ gió,

mưa và cả các hoạt động của côn trùng [3,7,11].

Để phòng trừ nấm gây bệnh, người nông dân thường sử dụng nhiều loại thuốc

hóa học. Mỗi năm, Việt Nam sử dụng khoảng 25000 tấn thuốc hóa học diệt sâu

bệnh. Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hóa chất với 1231 tên

thương phẩm hóa học khác nhau [37]. Mặc dù biện pháp này có ưu điểm lớn là diệt

trừ dịch hại nhanh chóng, triệt để, có hiệu quả cao nhưng lại rất tốn kém, gây ô

nhiễm môi trường (MT), làm mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe con

người và vật nuôi.

Vì vậy, để khắc phục những hạn chế này, xu hướng hiện nay là sử dụng các

tác nhân sinh học hay những sản phẩm trao đổi chất của những tác nhân này để

phòng, trừ bệnh hại cây trồng. Trong số đó, xạ khuẩn (XK) là nhóm có nhiều tiềm

năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất

kháng sinh có khả năng chống nấm mạnh.

Từ những lí do trên, với mong muốn tìm hiểu và khai thác nguồn tài nguyên VSV

vô cùng phong phú của Việt Nam, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium gây

hại trên cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.)”.

2. Mục tiêu

Thu nhận và thử nghiệm tác dụng chất kháng Fusarium gây bệnh trên cây cà

chua từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn.

3. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn chủng XK có khả năng sinh hoạt chất kháng nấm

Fusarium cao từ đất trồng cà chua tại Ấp Long Giêng, xã Phước Hậu, huyện Cần

Giuộc, tỉnh Long An.

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài của chủng XK tuyển

chọn.

- Khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho việc sinh chất kháng Fusarium của

chủng XK.

- Thu nhận chất kháng Fusarium từ chủng XK nghiên cứu.

- Bước đầu thử nghiệm ứng dụng dịch lên men chất kháng nấm để phòng trừ

Fusarium gây bệnh trên cây cà chua.

4. Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng XK phân lập từ đất trồng cà chua, tại Ấp Long Giêng, xã Phước

Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An.

- Nấm Fusarium do Trường ĐH Nông Lâm cung cấp.

- Giống cà chua được cung cấp từ Công ty TNHH Nguyên Nông - Gino

(146/ 6A Võ Thị Sáu, quận 3, Tp.HCM).

5. Ý nghĩa của đề tài

Góp phần tìm hiểu về khả năng phòng trừ các bệnh do nấm Fusarium gây ra

trên cây trồng của xạ khuẩn.

6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 12/2013 – 8/2014

Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP.HCM. Tiến hành thực nghiệm tại 96 A, Lý Phục Man, Bình Thuận, quận 7, Tp.HCM.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Fusarium gây bệnh trên cây cà chua

1.1.1. Nấm Fusarium

1.1.1.1. Đặc điểm sinh học

Fusarium là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae. Chúng sống hoại sinh

hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Hệ sợi nấm phân nhánh, có

vách ngăn, sợi nấm thường không màu và chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản

sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào,

phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa, trong tế bào có một

nhân hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan. Trên MT nuôi cấy, tản nấm

có thể tơi xốp như bông, bằng phẳng hoặc lan rộng trên bề mặt môi trường. Mặt

trên của tản nấm có màu trắng, kem, vàng cam, đỏ, tím hồng hoặc tím. Mặt dưới có

thể không màu, hoặc vàng cam, đỏ, tía sẫm hay màu nâu. BT lớn hơi cong hình lưỡi

liềm, có 3 – 5 vách ngăn, kích thước từ 27 - 46 x 3 - 5µm. BT nhỏ hình ovan hoặc

elip, kích thước từ 5 – 12 x 2,2 – 3,5µm, không có vách ngăn, BT được hình thành

trong bọc giả.

Fusarium có 2 hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính.

Thiếu giai đoạn sinh sản hữu tính trong vòng đời nên người ta gọi chung là nấm

không hoàn chỉnh hay nấm bất toàn.

- Sinh sản sinh dưỡng: từ 1 sợi nấm riêng rẽ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ

sinh trưởng và phân nhánh thành hệ sợi nấm. Bào tử hậu (BT màng dày, BT áo) là

những tế bào hơi tròn, có tế bào chất được cô đặc lại, có màng dày bao bọc. Thỉnh

thoảng có bào tử hậu với vách tế bào xù xì hoặc có sắc tố. Ở bào tử này, chất dinh

dưỡng được chuyển từ tế bào kề bên sang tế bào ưu tiên làm tế bào này phồng lên,

chứa nhiều chất dự trữ và có thể chịu đựng những điều kiện bất lợi trong thời gian

dài. Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nảy mầm và phát triển thành sợi nấm mới.

- Sinh sản vô tính bằng bào tử (BT) gồm BT đính lớn, BT đính nhỏ

+ BT đính lớn (bào tử lớn) có kích thước 3 – 8 x 11 - 70µm, trong suốt, dài,

nhiều nhân, hình liềm hoặc cong được sinh ra từ cuống bào tử. Đầu và cuối bào tử

lớn thuôn và nhọn. Một vài BT lớn tách rời và không gắn trên cuống BT. Những tế

bào sinh BT lớn gọi là thể bình [4, 5].

+ BT đính nhỏ (BT nhỏ) kích thước 2 – 4 x 4 – 8 µm, được hình thành từ thể

bình hoặc những cuống BT phân nhánh hoặc không phân nhánh, có thể mọc trực

tiếp từ sợi nấm tạo thành dạng bọc giả trên đầu cành hoặc hình thành dạng chuỗi.

BT có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, hình oval, hình thoi, hình trứng...[

4, 5].

Hình 1.1. Bào tử của Fusarium

a. BT đính lớn b. Bào tử đính nhỏ c. Bào tử hậu (BT vách dày)

1.1.1.2. Tác hại của Fusarium trên rau màu

Fusarium là nấm phân bố rộng ở tất cả các vùng địa lý trên thế giới, có khả

năng gây bệnh với nhiều loại cây trồng. Fusarium đã gây thiệt hại rất lớn đến nền

sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Hằng năm, tại Pakistan

bệnh do Fusarium đã làm năng suất đậu xanh giảm 10 – 50% (Khan et al., 2002)

[23]. Ở Braxin, nấm này cũng làm năng suất cây cà chua giảm từ 45 – 80% hàng

năm [24]. Fusarium gây ra nhiều bệnh khác nhau trên cây trồng như héo do tắc bó

mạch, thối rễ, thân, củ. Một số loài cũng sản sinh độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ

cốc. Ví dụ, sự có mặt của F. oxysporum trên cây gây các bệnh héo do tắc mạch, hay

ký sinh trên hệ rễ gây bệnh thối rễ. Chúng gây thối dưa hấu và củ khoai tây đã bị

sâu hoặc do dụng cụ gặt hái làm tổn thương. Chỉ tính riêng với khoai tây thiệt hại do

Fusarium gây thối củ trên đồng ruộng và trong bảo quản cũng đã chiếm tới 20% sản

lượng thu hoạch được [29, 35, 41]. Thối bắp ngô, chủ yếu do F. graminearum và F.

verticilliodes gây ra, cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại trong hạt. F.

moniliform tiết ra giberelin kích thích sự sinh trưởng gây bệnh lúa von. Chúng còn

tiết ra fumonisin gây bệnh ung thư thực quản ở người (Mazasass, 1972). Một số

dạng F. solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu Hà Lan, đậu cô ve và thối rễ ở các cây

trưởng thành. Các bệnh héo Fusarium thường nghiêm trọng hơn trong điều kiện thời tiết ấm và ẩm ướt, nhiệt độ trung bình 27 – 300C. Nấm gây bệnh có thể lan

truyền qua hạt giống, cây nhiễm bệnh hoặc lan truyền theo nước tưới và nhờ gió

(Haware , 1978) [45].

Con đường xâm nhiễm của Fusarium từ sợi nấm và bào tử nảy mầm trong tàn

dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào rễ con còn non, sau đó lan dần vào các mạch

xylem. Sau khi phát triển trong mạch xylem sẽ lan lên hệ thống mạch dẫn trong

thân, gây tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cho cây bị

héo rồi chết. Quá trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và tạo

ra thể sần có màu nâu (Nene, 1991) [45].

Các triệu chứng bệnh thường thấy do Fusarium gây ra trên cây cà chua con lá

cây không phát triển được và trở nên khô héo. Ở những cây trưởng thành, lá sẽ bị

héo rũ cụp xuống, thường bắt đầu từ các lá chét phía gốc ở một bên cây sau đó lan

ra toàn cây làm cho lá héo rũ, màu vàng. Vết bệnh ở trên thân sát mặt đất hoặc cổ rễ

thường có màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô tóp cả đoạn thân sát mặt đất, bộ rễ

kém phát triển, rễ thối dần và chết đi [3, 7, 9, 18, 20].

1.1.2.3. Các biện pháp phòng trừ nấm Fusarium gây hại trên rau màu

Phòng và trừ bệnh hại là hai mặt không thể tách rời nhau của việc bảo vệ cây

trồng và nông sản nhằm bảo đảm hiệu quả kinh tế cao. Các biện pháp phòng trừ có

thể được chia thành các nhóm sau đây dựa trên nguyên lý tác động và phương pháp

sử dụng các biện pháp đó:

• Biện pháp sử dụng giống chống bệnh và giống sạch bệnh

Tuyển chọn các giống chống một loại bệnh hoặc chống một nhóm bệnh có tác

dụng làm giảm tổn thất và giảm chi phí cho các biện pháp phòng trừ khác là biện

pháp có hiệu quả kinh tế cao. Mặt khác, sử dụng giống không mang bệnh để gieo

trồng có tác dụng phòng trừ bệnh trên đồng ruộng rất lớn. Do đó, đây là biện pháp

đem lại hiệu quả, đảm bảo được chất lượng và năng suất cây trồng cao [5].

• Biện pháp canh tác

Đây là những biện pháp kỹ thuật trồng trọt như làm đất, luân canh cây trồng,

chế độ phân bón, thời vụ gieo trồng, chế độ tưới nước, vệ sinh đồng ruộng có tác

dụng:

- Làm thay đổi điều kiện ngoại cảnh, tạo ra những điều kiện sinh thái trực tiếp,

gián tiếp có lợi nhất cho sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng, tăng khả năng

chống chịu bệnh của cây và khả năng dễ phục hồi sau khi bị bệnh.

- Tiêu diệt hoặc làm hạn chế VSV gây bệnh, cản trở sự lây lan và tồn tại của

sinh vật gây bệnh, là giải pháp có tác dụng phòng bệnh rất cao.

- Biện pháp canh tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ dàng kết hợp với các biện

pháp khác, không gây hại đến MT [3, 7, 11].

• Biện pháp cơ, lý học

- Chọn lọc hạt giống đảm bảo độ thuần và chất lượng tốt. Xử lý hạt trước khi

gieo trồng.

- Nhổ bỏ, cắt tỉa những cành, cây bệnh. Phương pháp này cần thực hiện sớm

khi bệnh mới xuất hiện trên đồng ruộng.

- Khử trùng đất bằng hơi nóng, nước nóng, có thể đốt rơm rạ trên mặt đất giúp

tiêu hủy nguồn bệnh trong đất.

- Có thể sử dụng ánh nắng, tia tử ngoại, tia vật lý khác để khử trùng hạt giống,

đất [3, 7, 11].

• Biện pháp hóa học

Biện pháp hóa học phòng trừ bệnh cây là việc dùng các thuốc hóa học (gồm

các chất vô cơ, hữu cơ…) có tác dụng trực tiếp tiêu diệt hoặc ức chế VSV gây bệnh

cây, chống lại sự phá hại của bệnh, bảo vệ cây trồng. Biện pháp này có tác dụng

ngăn chặn dập tắt dịch bệnh nhanh, hiệu quả rõ rệt nên được người nông dân sử

dụng phổ biến trong thực tế. Tuy nhiên, biện pháp hóa học có một số nhược điểm

lớn như sau:

- Nếu sử dụng không hợp lý, không đúng liều lượng sẽ cho hiệu quả thấp, gây

độc cho người và gia súc cũng như ô nhiễm MT.

- Phần lớn thuốc hóa học có khả năng tiêu diệt nấm bệnh nhưng đồng thời

cũng tiêu diệt các sinh vật có ích, làm phá vỡ cân bằng sinh học, gây khó khăn cho

việc áp dụng biện pháp sinh học. Mặt khác, chúng có thể để lại dư lượng trên nông

sản quá mức cho phép.

- Nếu sử dụng liên tục một loại thuốc trừ bệnh ở một vùng dẫn đến có thể làm

cho vi sinh vật gây bệnh thích nghi với thuốc và nhờn thuốc [3, 7, 11].

• Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học trong phòng trừ dịch hại rất đa dạng dựa trên nguyên tắc

chung là sử dụng sinh vật có ích để hạn chế sinh vật có hại [5]. Trong phạm vi đề tài

này chúng tôi chỉ giới thiệu biện pháp sinh học bằng việc sử dụng các chế phẩm

sinh học có nguồn gốc từ các VSV.

Chế phẩm sinh học có ưu điểm không độc cho cây, người và gia súc, không

gây ô nhiễm MT. Chúng có tác dụng duy trì sự cân bằng hệ sinh thái trong MT.

không làm thay đổi kết cấu của đất, còn góp phần tăng độ phì nhiêu cho đất [3, 7,

11, 18]. Chế phẩm sinh học làm tăng khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu

cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải công nghiệp, nông nghiệp góp phần

làm sạch MT. Các chế phẩm sinh học là những sản phẩm dạng bột, viên, lỏng…có

nguồn gốc trực tiếp từ sinh khối VSV hoặc từ các sản phẩm trao đổi chất của VSV.

Các chế phẩm sinh học rất đa dạng nhưng dựa vào mục đích có thể chia thành 3

nhóm: nhóm dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất

kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng; nhóm dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải

nông nghiệp và nhóm dùng để phòng trừ sâu bệnh hại. Đây là nhóm được sử dụng

khá rộng rãi và được ứng dụng sớm nhất trong lĩnh vực cây trồng. Hiện nay, trên thị

trường Việt Nam có một số chế phẩm sinh học đang được sử dụng phổ biến như:

chế phẩm score 250EC (difenoconazole) trừ bệnh đốm đen, phấn trắng, thán thư, gỉ

sắt, giác ban trên rau, đốm vòng cà chua và hành. Bayleton 250EC (triadimefon) trừ

phấn trắng trên rau họ thập tự hay bavistin 50FL (SC), carben 50 SC, zoom 50SC

(carbendazim) phòng trừ bệnh đốm lá trên dưa chuột, mốc xám trên cà chua, bệnh

phấn trắng trên bầu bí…

Tóm lại, để hướng đến một nền nồng nghiệp sạch bền vững thì các nước trên

thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng cần tăng cường sử dụng các chế phẩm

sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng thay dần cho việc sử dụng hóa

chất bảo vệ thực vật. Đặc biệt đáng chú ý là những chế phẩm có nguồn gốc từ XK

đã đóng góp vai trò rất lớn trong phòng trừ bệnh hại cây trồng trong nông nghiệp

hiện nay.

Trong các loại rau màu thì cà chua là loại cây chủ mang những đặc điểm rất

thích hợp cho sự gây bệnh của Fusarium.

1.1.2. Cây cà chua (Lycopersicon esculentum (L). Mill.)

1.1.2.1. Đặc điểm sinh học

Cây cà chua có tên khoa học là Lycopersicon esculentum (L). Mill., thuộc họ

Cà (Solanaceae), là loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ.

Cây cà chua là cây dài ngày, có rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả

năng phát triển rễ phụ rất lớn. Thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông,

khi cây lớn gốc thân dần dần hóa gỗ. Thân mang lá và phát hoa. Lá thuộc lá kép

lông chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đôi lá chét, ngọn lá có 1 lá riêng gọi là lá đỉnh. Rìa lá

chét đều có răng cưa nông hay sau tùy giống. Phiến lá thường phủ lông tơ. Hoa mọc

thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính. Trái thuộc loại mọng nước, có hình

dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài. Vỏ trái có thể nhẵn hay có khía. Màu sắc của

trái thay đổi tùy giống và điều kiện thời tiết. Hạt cà nhỏ, dẹp, nhiều lông, màu vàng

sáng hoặc hơi tối. Hạt nằm trong buồng chứa nhiều dịch bào kìm hãm sự nảy mầm

của hạt. Vòng đời của cây cà chua từ lúc để hạt làm giống là 65 – 80 ngày, được

chia làm các giai đoạn sau:

- Cây giống: lá mầm xuất hiện đầu tiên sau 6 – 10 ngày, sau đó các lá các lá

chét bắt đầu mọc. trong đoạn này thân chưa phân nhánh nhưng hệ rễ phát triển

mạnh mẽ khoảng 30 cm trong 2 tuần.

- Giai đoạn tăng trưởng của cây cà chua: kéo dài trong 4 tuần, giai đoạn này

cây tăng vọt về chiều cao, có thể xuất hiện 4- 5 cành trên thân. Số lượng lá cây phát

triển nhiều, tán lá rộng. Giai đoạn này bắt đầu tích lũy chất dinh dưỡng để chuẩn bị

ra hoa.

- Giai đoạn ra hoa và tạo quả: hoa được thụ phấn quả sẽ trưởng thành sau 50 –

55 ngày sau thụ tinh. Quả chín và có thu hoạch sau đó 2 tuần.

Trong vòng đời phát triển của cây cà chua thì giai đoạn cây giống và giai đoạn

ra hoa tạo quả là cây dễ bị nhiễm bệnh.

Cây cà chua có thể sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau như đất sét, đất

cát, đất pha cát, có độ pH = 6 – 6.5. Đất có độ ẩm cao và ngập nước kéo dài sẽ làm

giảm khả năng sinh trưởng của cây. Độ ẩm đất thích hợp cho cà chua là 60 – 70%

(Barehyi, 1971), độ ẩm không khí là 78 – 81%. Tuy nhiên, khi độ ẩm không khí quá

cao (> 90%) dễ làm hạt phấn bị trương nứt, hoa bị rụng (Tạ Thu Cúc, 1983). Nhiệt độ thích hợp cho cà chua để đạt năng suất cao, chất lượng tốt là khoảng 21 – 240C và thời tiết khô. Nhiệt độ dưới 120C kéo dài sẽ gây thiệt hại nghiêm trọng, nhiệt độ trên 270C kéo dài sẽ hạn chế ra hoa, đậu quả. Các tế bào phôi và hạt sẽ bị hủy hoại khi nhiệt độ trên 380C. Trước và sau thụ phấn nếu nhiệt độ ban đêm quá 210C thì

khả năng đậu quả kém.

1.1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây cà chua

Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cà chua có thể chia làm 2

nhóm chính: nhóm nguyên nhân phi sinh vật và nhóm nguyên nhân sinh vật.

 Nguyên nhân phi sinh vật là những yếu tố tự nhiên, điều kiện ngoại cảnh

không phù hợp.

- Đất trồng là nguồn cung cấp chủ yếu các chất dinh dưỡng và nước cho cây

trồng. Cũng như các cây trồng khác, cà chua cần ít nhất 20 nguyên tố dinh dưỡng

cho quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của nó. Trong các nguyên tố đa

lượng thì cà chua cần nhiều kali hơn cả, sau đó đến đạm và lân. Nếu đất thiếu đạm

cà chua sẽ bị bệnh, bị biến đổi màu sắc lá, héo úa, cây cằn cỗi. Trường hợp đất thiếu

lân làm chậm sự phát triển của cây, đặc biệt là trong quá trình hình thành các cơ

quan. Cây có thể bị chết nếu đất thiếu kali do các mô của cây bị chết dần. Nhưng

ngược lại, nếu thừa kali thì sẽ làm cho sự hình và chín của quả sớm hơn nhưng quả

nhỏ, cây sinh trưởng kém. Mặt khác, nếu thiếu các nguyên tố vi lượng cũng gây ra

các triệu chứng bệnh cây. Thiếu bo các điểm sinh trưởng của cây sẽ bị chết.

+ Nước: đất trồng thiếu nước thì cây bị khô héo, dễ gây ra hiện tượng rụng

hoa, quả nhất là trong trường hợp thiếu nước đột ngột. Ngược lại khi đất thừa nước,

nạn ngập úng ảnh hưởng nghiêm trọng đến tình trạng thiếu dưỡng khí trong đất, gây

cản trở cho sự hoạt động của bộ rễ. Thừa nước còn ảnh hưởng đến sự hoạt động của

tập đoàn vi sinh vật đất, đẩy mạnh hoạt động của vi sinh vật yếm khí, tích lũy các

khí độc, nhất là H2S gây độc rễ cây, làm rễ mất khả năng hút nước và chất dinh

dưỡng. Cây dần dần bị cằn cọc, khô vàng, héo lụi và chết. Độ ẩm thay đổi một cách

đột ngột, từ khô hạn chuyển sang mưa ẩm, độ ẩm đất tăng lên quá cao cũng dẫn đến

tình trạng làm nứt rạn quả. Ngoài ra, còn có những trường hợp do cấu tượng của đất

có cấu trúc quá chặt, làm đất dối, đất dễ đóng váng đều ảnh hưởng không tốt đến sự

sinh trưởng của cây, đặc biệt là sự phát triển của bộ rễ [3,7, 11].

- Nhiệt độ: cây muốn sinh trưởng và phát triển tốt đòi hỏi phải có nhiệt độ

thích hợp. Nói chung, cây ở giai đoạn còn non đang sinh trưởng mạnh, chống chịu

nhiệt độ kém hơn ở giai đoạn già và giai đoạn tĩnh. Mô tế bào chứa nhiều nước

chống chịu nhiệt độ kém hơn mô chứa ít nước. Nhiệt độ MT quá cao kéo dài có thể

làm cho chậm lớn, quả chín không đồng đều, chín ép quá sớm. Trong vụ xuân hè, cà

chua trồng muộn gặp tiết trời khô hạn và nóng dễ bị hiện tượng cuốn lá hàng loạt, lá

thô dày, quả non bị quắt. Cà chua có nhiệt độ tối ưu để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển tốt nhất là 21 -240C, nếu nhiệt độ ban đên thấp hơn ngày 4 – 50C thì cây

cho nhiều hoa. Nếu nhiệt độ MT quá thấp có thể làm cho lá cây bị rụng, thụ phấn

kém, phấn hoa chết. Mặt khác, nhiệt độ quá thấp làm thay đổi áp lực thẩm thấu của

tế bào, một số lượng nước trong tế bào thoát ra ngoài mang theo một số chất hòa

tan. Sau đó, gây đóng băng ở trong các gian bào làm cho cây có hiện tượng bị héo

và tế bào bị hóa nâu, thân, cành có thể bị nứt hoặc sưng u [5].

- Ánh sáng và tia phóng xạ:

+ Ánh sáng: trong điều kiện thiếu ánh sáng sự sinh trưởng của cây bị cản trở.

Hoạt động quang hợp của lá bị giảm sút, lá cây có màu xanh nhợt nhạt, uốn cong,

vươn quá dài, mềm yếu. Ngoài ra, cấu tạo bên trong của lá bị biến đổi: vách tế bào

mỏng, chống chịu kém, thân yếu. Cường độ chiếu sáng tối thiểu để cây tăng trưởng

là 2.000 – 3.000 lux.

+ Tia phóng xạ: tác động của tia phóng xạ cũng có thể gây ra những trạng thái

bệnh lý của cây làm kìm hãm sinh trưởng, thậm chí tác động với liều lượng cao tia

rơnghen, tia α, β… cây có thể bị chết rụi, hoặc nhẹ hơn cây có thể bị rụng lá, hay lá

non không mọc ra được.

- Các khí độc trong không gian và chất độc hóa học

Trong không khí nhất là các vùng công nghiệp tập trung thường có nhiều khí

độc, khói bụi được gió đưa đi xa bao trùm lên cây cối gây ra những tác hại nhất

định. Bụi khói nhà máy có thể gây tình trạng làm tắc lỗ khí khổng ở lá dẫn tới sự

phá hủy chế độ trao đổi khí, lá khô chết và rụng, hoa thụ phấn kém. Trong khói

nóng thường có các khí độc SO2, H2S, CO2 gây độc làm táp lá khô úa. Hay sử dụng

thuốc trừ cỏ không đúng kỹ thuật, xử lý đất không đảm bảo đều có thể gây ra các

hiện tượng kìm hãm sự sinh trưởng, dị hình các cơ quan rễ, thân lá.

 Nguyên nhân sinh vật:

Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn,

thối cổ rễ, mốc sương… đã gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm 83%

trong số các bệnh ở cây trồng [29]. Cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở

nước ta dễ mắc nhiều bệnh gây hại đáng kể như héo tươi, virus,... khó phòng trị.

Đặc biệt, ở giai đoạn cây non, cà chua dễ bị các loài vi nấm trong đất (như

Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia…) tấn công gây bệnh.

Nấm Rhizoctonia có thể tồn tại trong đất hoặc xác cây trồng trong nhiều năm

dưới dạng hạch nấm. Chúng có sợi màu vàng, sau chuyển thành vàng nâu. Hạch

nấm thường tồn tại trên vết bệnh, bau đầu có màu trắng sau chuyển thành màu nâu .

Nấm này có thể gây hại trên nhiều loại cây trồng ở các mùa vụ khác nhau.

Nấm Sclerotium sống trong đất, sợi nấm màu trắng đâm tia, các sợi nấm màu

trắng đâm tia, các sợi nấm này nảy sinh sản nhiều hạch nhỏ. Hạch nấm tồn tại trong

đất và có thể xâm nhập trực tiếp với mô cây và gây bệnh cho cây. Nấm này gây

bệnh trên nhiều loại cây trồng. Đặc biệt, chúng gây hại trên cây cà chua và cây lạc ở

miền Bắc Việt Nam vào thời điểm trước khi thu hoạch, lúc đó đất trồng quá ẩm ướt.

Fusarium là một trong những vi nấm gây thiệt hại đến năng suất và chất lượng

cây cà chua. Cây bị nhiễm bệnh, lá héo rũ cụp xuống, rễ kém phát triển và bị thối

dần tới cây héo vàng xẹp xuống rồi chết. Bệnh do Fusarium có thể lan rộng trên

đồng ruộng.

1.1.1.3. Vai trò của cây cà chua

Đầu thế kỷ XVIII, cà chua trở nên phong phú và đa dạng tại các nước Châu

Mỹ và Châu Âu nhưng cuối thế kỉ XVIII, cà chua mới được dùng làm thực phẩm ở

Nga và Italia. Cho đến cuối thế kỉ XIX, cà chua mới thực sự trở thành loại thực

phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày. Ngày nay, cà chua trở thành một

trong những loại rau quả được trồng rộng rãi trên toàn thế giới nhờ có giá trị dinh

dưỡng cao.

Trong thành phần dinh dưỡng của cà chua có chứa nhiều gluxit, nhiều axit hữu

cơ và nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể con người. Cà chua cung cấp năng

lượng và khoáng chất, làm tăng sức sống, giúp cân bằng tế bào, khai vị, giải nhiệt,

chống hoại huyết, chống nhiễm khuẩn, chống nhiễm độc, lợi tiểu, dễ tiêu hóa. Vỏ

quả cà chua chứa nhiều chất chống oxy hóa (các hợp chất phenolique, vitamin C và

lycopene). Dịch quả cà chua dùng để uống chống suy nhược, ăn không ngon miệng,

giảm hàm lượng cholesteron chống xơ cứng động mạch, thống phong, thấp khớp,

thừa urê trong máu, sỏi niệu đạo và mật, táo bón, viêm ruột. Đặc biệt, sử dụng cà

chua hay những sản phẩm từ cà chua có thể chống ung thư tuyến tiền liệt, ung thư

vú. Ngoài ra, cà chua còn dùng làm mỹ phẩm, chữa trứng cá. Lá cà chua còn được

dùng để xua đuổi muỗi và ong bò vẽ.

Tuy nhiên, cà chua xanh có thể tiết ra trong tế bào những hợp chất alcaloides

tập hợp lại gọi chung là “Solanine”. Đây là một chất độc hại nguy hiểm cho cơ thể,

giảm khả năng hấp thụ canxi của xương. Nhưng hàm lượng solanine sẽ giảm dần

khi trái chín. Đồng thời, chất solanine sẽ bị phân hủy bởi nhiệt độ khi chế biến.

Ở nước ta, việc phát triển trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân

canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích nên là loại rau được khuyến

khích phát triển. Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa được phát triển mạnh như

mong muốn do có nhiều tác nhân gây bệnh .Trong đó, Fusarium là đối tượng gây

hại phổ biến nhất, làm giảm khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng.

Theo nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học thì một trong những tác nhân có khả

năng phòng trừ Fusarium có hiệu quả đó chính là xạ khuẩn.

1.2. Xạ khuẩn

Xạ khuẩn có vị trí hệ thống học như sau:

Giới Bacteria

Ngành Actinobacteria

Lớp Actinobacteria

Bộ Actinomycetales

Họ Actinomycetaceae

Xạ khuẩn (Actinomycetes, tiếng Hi Lạp: Aktis, aktinos là “tia”, mykes là

“nấm”). XK là những vi khuẩn hình tia, có khuẩn ty phân nhánh, không vách ngăn,

thuộc loại Gram (+), sống hiếu khí, hoại sinh và thường gặp ở trong đất và nước

[28, 42,43]. Chúng mang đặc điểm giống vi khuẩn nhưng cũng rất gần gũi với nấm

(Das et al., 2008).

1.2.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

 Về hình thái

Khác với các VSV khác, khuẩn lạc XK thường ở dạng thô ráp, chắc, xù xì,

dạng phấn, không trong suốt, có nếp tỏa ra theo hình tia phóng xạ. Kích thước KL

thay đổi tùy loài xạ khuẩn và điều kiện nuôi cấy. Đường kính của mỗi khuẩn lạc XK

chỉ chừng 0,5 – 2 mm nhưng cũng có những KL đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn. Khuẩn

lạc XK có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…[5,

9,10,14, 17, 28]. Khuẩn lạc có cấu trúc 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp

trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

Hệ sợi của XK chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Đường

kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 – 1,0 µm đến 2 - 3µm. Đa số xạ

khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Khuẩn ty có màu sắc

phong phú màu trắng, vàng, da cam, lam, tím…[38]. Khuẩn ty cơ chất phát triển

một thời gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh. Sau một

thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các cuống BT và

chuỗi BT. Cuống BT có thể có nhiều hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn

sóng, xoắn, móc, vòng…

 Về cấu trúc Thành tế bào XK gồm 3 lớp: lớp màng ngoài dày khoảng 60 – 120 AO, khi già có thể là 150 AO, lớp giữa rắn và chắc hơn, dày khoảng 50AO, lớp trong dày 50 AO

được cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptit gồm các gốc N–axetylglucozamin

(NAG) liên kết với các axit N–axetylmuramic (NAM) bởi các liên kết β 1, 4 –

glycozit. Thành tế bào có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào.

Màng tế bào XK dày khoảng 7,5 – 10 nm, chứa nhiều enzim tham gia quá

trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển các chất qua màng. Màng tế bào được

cấu tạo chủ yếu bởi hai thành phần photpholipit và protein [4,5, 43, 50, 51].

Nhân chưa phân hóa hình thái, chúng thuộc loại tế bào tiền nhân. Một trong

những đặc điểm đáng lưu ý của XK là chúng không bền vững về mặt di truyền và

thường xảy ra sự tái sắp xếp lại các phần tử ADN. Điều này gây ra một số hiện

tượng lạ như: tạo ra tính đa hình thái, tính kháng thuốc.

Ngoài ra, trong tế bào chất của XK còn có hạt mezoxom và các hạt

poliphotphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Suodan III), các hạt polisaccarit

(bắt màu với dung dịch Lugol). Chúng có vai trò làm tăng diện tích tiếp xúc của

màng sinh chất do đó làm tăng cường hoạt tính enzym, tăng chuyển điện tử…[4].

 Về sinh sản

XK sinh sản vô tính bằng bào tử. BT được hình thành trên các nhánh phân hóa

của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh BT. Sự hình thành BT của XK theo 2

phương thức: kết đoạn và cắt khúc.

- Kết đoạn: Hạt cromatin trong cuống sinh BT được phân chia thành nhiều hạt

phân bố đồng đều dọc theo sợi cuống sinh BT. Sau đó tế bào chất tập trung bao bọc

quang mỗi hạt cromatin gọi là tiền BT. Tiền BT hình thành màng tạo thành BT nằm

trong cuống sinh BT. Bào tử thường có hình cầu hoặc ôvan và được giải phóng khi

màng cuống sinh BT bị phân giải hoặc bị tách ra [51].

- Cắt khúc: Hạt cromatin phân chia phân bố đồng đều dọc theo cuống sinh BT

Sau đó, giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần đều có tế bào chất. BT

hình thành theo kiểu này thường có hình viên trụ hoặc hình que [38].

Ngoài hình thức sinh sản bằng BT, xạ khuẩn còn có hình thức sinh sản sinh

dưỡng. Các đoạn khuẩn ty gãy ra MT phát triển thành hệ khuẩn ty.

Như vậy, có thể nói những đặc điểm sinh học của XK là cơ sở rất quan trọng

để tiến hành định danh XK.

1.2.3. Các đặc điểm phân loại xạ khuẩn

XK là nhóm VSV gây nhiều khó khăn trong phân loại. Tuy nhiên hiện nay,

tùy theo phương pháp phân loại XK người ta dựa vào những tiêu chuẩn sau:

 Theo phương pháp truyền thống: dựa vào các đặc điểm hình thái, tính

chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý – sinh hóa, miễn dịch học. Trong các đặc điểm hóa

phân loại thì dựa vào thành phần hóa học của thành tế bào là đặc điểm quan trọng

nhất để phân loại XK.

Thành tế bào: XK có một thành tế bào riêng biệt, những biến đổi trên thành

tế bào của XK là điều thuận lợi cho các tiêu chuẩn phân loại. Thành tế bào XK được

cấu tạo từ peptidoglycan. Trong khi, vi khuẩn Gram (–) có lớp peptidoglycan mỏng

(5 – 20% khối lượng khô của thành tế bào VK) với cấu trúc thông thường thì XK

lớp peptidoglycan dày (30 – 95% khối lượng khô của thành tế bào XK) với cấu trúc

biến đổi mang tính phân loại [2]. Thành tế bào XK có chứa một số loại đường

ngoài các glucosamine và axit muramic peptidoglycan. Thành phần đường này sẽ

cung cấp thông tin để phân loại XK (Lechevalier et al., 1970) [28, 32].

Ngoài ra chúng còn có các đặc điểm khác như thành phần đường,

menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ G+X trong ADN cũng mang

tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân loại XK.

 Phương pháp hiện đại: tất cả các loài VSV đều có cùng một cách tổng hợp

protein nhờ các riboxom. ARNr thành phần cơ bản có trong mọi tế bào VSV. Vai

trò và chức năng của chúng là giống nhau ở tất cả các riboxom. Cấu trúc không gian

của phân tử ARNr rất giống nhau giữa các loài VSV khác nhau.

Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S là

lớn hơn so với phân tử ARNr 16S. Tuy nhiên, trình tự đã được xác định hoàn chỉnh

của gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phong

phú và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế.

Chính vì vậy, việc dựa vào trình tự gen mã hóa ARNr 16S để làm sáng tỏ mối

quan hệ phát sinh chủng loại của VSV được xem là phương pháp lý tưởng nhất, phổ

biến nhất được dùng để định loại XK. Hiện nay, người ta đã phân loại được không

dưới 10 bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Trong đó có khoảng 478 loài đã được công

bố thuộc chi Streptomyces hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào

nhóm xạ khuẩn hiếm [4].

1.2.4. Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn

XK có khả năng sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như chất

kháng sinh, vitamin nhóm B, các loại enzym và một số axit hữu cơ.

 Các enzym

Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận được các loại enzym như sau:

- Enzym amylaza: thu nhận từ các loài S. aureofaciens, S. diastochromogens,

…Là enzym thủy phân tinh bột thành đường. Vì tinh bột cũng là một trong những

sản phẩm chủ yếu của thực vật nên amylaza giữ một vị trí quan trọng trong việc

phân giải các sản phẩm với thành phần chủ yếu là tinh bột. Chúng có vai trò trong

việc làm sạch MT và được ứng dụng nhiều trong công nghệ sản xuất rượu, bia, bánh

mì…

- Enzym xenlulaza: thu nhận từ các loài S. antibioticus, Streptomyces sp. 0143,

…Đây là enzym xúc tác phản ứng phân giải lignoxenlulozơ thành glucozơ.

Lignoxenlulozơ là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm xenlulozơ (30

– 40%), hemixenlulozơ và lignin (15 – 30%). Enzym này được ứng dụng rộng rãi

xử lý phế phải MT, phân giải các phế liệu rẻ tiền từ rơm rạ, mạt cưa, đay gai để tạo

ra các sản phẩm có giá trị.

- Enzym proteaza: được dùng nhiều trong công nghiệp chất tẩy rửa, sữa, bia và

các lĩnh vực công nghiệp khác như công nghiệp dược, thuộc da, xử lý chất thải,

công nghiệp thực phẩm, có tác dụng làm mềm thịt… Các chế phẩm được bán trên

thị trường như: chế phẩm Pronaza của Nhật (thu nhận từ S. griseus), chế phẩm có

tên M – zim của Mỹ (thu nhận từ S. fradiae). Enzym proteaza được thu nhận từ S.

rimosus, S. kinoluteus, S. verticillatus var. zynogenes, S. fradiae,…

- Enzym kitinaza: thu nhận từ S. griseus,… Là enzym phân giải kitin trong vỏ

côn trùng, nấm, vỏ tôm cua. Chúng có vai trò quan trọng trong việc sản xuất thuốc

diệt trừ nấm bệnh hại cây trồng, kể cả những côn trùng gây hại trong nông, lâm, ngư

nghiệp [2, 15].

 Các chất kích thích sinh trưởng

Chất kích thích sinh trưởng là những chất ở nồng độ sinh lý có khả năng kích

thích sự sinh trưởng của cây trồng

Có rất nhiều XK trong đất cũng có khả năng sinh tổng hợp auxin – một dạng

phytohoocmon rất có ý nghĩa đối với cây trồng. Auxin có vai trò quan trọng trong

sự kiểm soát sự tăng dài của tế bào. Vì tế bào thực vật có vách bao bọc, nên tế bào

chỉ có thể tăng trưởng được khi vách tế bào được kéo dài ra. Vách được cấu tạo bởi

phần lớn là đường đa mà thành phần chính là xenlulôzơ. Ở vách sơ cấp, xenlulôzơ

hiện diện dưới dạng những sợi dài liên kết với các đường đa khác để tạo ra một

mạng lưới. Khi tăng trưởng các liên kết có thể bị đứt gãy tạm thời, do đó vách tế

bào trở nên đàn hồi hơn và những những vật liệu mới được chen vào. Auxin có vai

trò chính trong cả hai quá trình trên. Trong các auxin, β – indole acetic axit (IAA) là

một kích thích tố sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều. Đã có nhiều

công trình nghiên cứu về khả năng sinh IAA của XK. Các XK có khả năng sinh

IAA bao gồm S. olivochromoferus 1/247 có khả năng tạo thành 33 µg IAA/ml canh

trường, S. olivochromoferus 1/294 có khả năng tạo thành 9µg IAA/ml canh

trường,… [12, 13].

 Các chất kháng sinh

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành

kháng sinh. Trong số 8000 kháng sinh hiện nay thì trên thế giới có trên 80% là có

nguồn gốc từ XK.

Theo định nghĩa của viện sĩ Outchinnikov (1987), chất kháng sinh là những

chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con

đường hóa học có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt VSV khác một cách ngay ở nồng độ thấp (10-3 – 10-2 microgam/ml).

Các nhóm kháng sinh thường gặp của xạ khuẩn là:

- Nhóm β-lactam

- Nhóm aminoglycosid

- Nhóm macrolide

- Chloramphenicol

- Tetracycline

1.3. Chất kháng sinh

1.3.1. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh

Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử

dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus

anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại VK

hiếu khí lành tính khác. Tuy nhiên, những phát hiện này không có ý nghĩa thực tiễn

vì các nhà khoa học chưa có trong tay những thứ thuốc công hiệu.

Liên tiếp sau đó, Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của

một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các

chủng đối kháng. Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng

khuẩn của Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loại

trực khuẩn này. Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách được từ nấm mốc một chế

phẩm có thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu

khuẩn.

Đến tháng 10 năm 1928, tại viện St.

Mary, London, Alexander Fleming – nhà sinh

vật học người Anh đã phát hiện ra penixillin.

Trong khi tiến hành thí nghiệm, ông đã quan

sát thấy những KL nấm mốc Penicillium

notatum ức chế mạnh, thậm chí làm tan cả

khuẩn lạc của tụ cầu khuẩn Staphylococus

Hình 1.2: Penicillium notatum ức chế

aureus. Ông đã cấy nấm này vào MT dịch thể

sự phát triển của Staphylococus aureus

và phát hiện thấy dịch nuôi cấy có khả năng

ức chế hoặc tiêu diệt VK gây bệnh. Fleming đã đặt tên cho chất kháng khuẩn này là

penixillin. Một thập kỷ sau, penixillin đã được nghiên cứu và sản xuất với số lượng

lớn và trở thành một “loại thuốc thần kì”. Năm 1945 A.Fleming, E. Chain và H. W.

Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của

16].

penixillin mở ra kỉ nguyên mới trong y học – kỉ nguyên kháng sinh [1, 6, 9, 10,15,

Năm 1939, Rene’ Jules Dubos đã phát hiện ra gramixydin và tiroxydin từ quá

trình nuôi cấy Bacillus brevis. Trong những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ

hoàng kim của việc nghiên cứu chất kháng sinh. Hàng loạt chất kháng sinh đã được

phát hiện ra và có ứng dụng trong y học. Vào năm 1944, Waksman phát hiện ra

streptomycin. Năm 1947, Ehrlich phát hiện ra chloramphenicol. Năm 1948, Duggar

phát hiện ra clotetraxyclin. Năm 1952, Gurre phát hiện ra erythromycin. Trong giai

đoạn từ năm 1960 – 1970 là bước ngoặc đánh dấu sự bùng nổ của ngành công

nghiệp về kháng sinh. Trong những năm 1993 – 2002, số lượng các tác nhân kháng

khuẩn đã tăng lên từ 90 – 120. Trong khoảng thời gian đó, năm 1999, kháng sinh

lospomal HA – 92 ra đời, được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL – 312.

Nó có tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của

chuột, có hoạt tính mạnh chống các nấm gây bệnh.

Tại Nhật Bản (năm 2003), kháng sinh yatakemycin đã được tách chiết từ xạ

khuẩn Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. Kháng sinh này

có khả năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans, có

khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml [1,16,39 ].

Tại Hàn Quốc (năm 2007) phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp. C684

sinh kháng sinh laidlomycin có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và

các cầu khuẩn kháng vancomycin [1, 16, 39].

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại với sự hỗ trợ

của nhiều ngành khoa học khác đã làm cho tốc độ tìm kiếm các chất kháng sinh

diễn ra nhanh chóng và đạt được nhiều thành tựu rực rỡ. Nhiều trung tâm nghiên

cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn

liên tục phát hiện được hàng loạt chất kháng sinh có giá trị ứng dụng trong thực

tiễn. Để sản xuất chất kháng sinh con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV

sinh chất kháng sinh trong tự nhiên mà còn sử dụng nhiều phương pháp như dùng

kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh

tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để cải biến chúng, tạo ra những chủng mới có

hoạt tính kháng sinh cao. Đồng thời, tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong

thời gian ngắn nhất. Đặc biệt, trong gian đoạn hiện nay với sự xuất hiện ngày càng

nhiều của những VK đa kháng thuốc và sự thiếu hụt của các nhóm kháng sinh mới

đòi hỏi các ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh phải cải biến những chất kháng

sinh cũ và thúc đẩy công tác nghiên cứu để tìm ra những chất kháng sinh mới phù

hợp.

1.3.2. Cơ chế tác động của chất kháng sinh

Cơ chế tác động của chất kháng sinh là những cách thức mà chất kháng

sinh tác động lên các vị trí đích khác nhau trong tế bào qua đó ảnh hưởng đến sự

sinh trưởng của VSV. Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản

chất hóa học và nồng độ của chất kháng sinh. Nhìn chung cơ chế tác động của

chất kháng sinh được biểu hiện theo các hướng cơ bản sau: [1,12]

Hình 1.3. Vị trí tác động của kháng sinh

 Ức chế sự tổng hợp thành tế bào

Thành tế bào của VSV có chức năng duy trì hình dạng đặc trưng cho tế bào

và để chịu áp suất thẩm thấu cao ở bên trong nên đây là thành phần cần thiết cho

sự tồn tại của VSV. Cơ chế tác động của kháng sinh lên thành tế bào VSV do can

thiệp vào sự hình thành peptidoglycan qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: tổng hợp uridindiphosphat (UDP) axetyl muramyl pentapepid.

Phản ứng cuối của giai đoạn này thành lập dipeptid D-alanin. Cycloserin ức chế giai

đoạn này do cấu trúc tương tự nên cạnh ranh với D-alanin để gắn vào enzym.

Giai đoạn 2: phản ứng kết hợp UDP – axetyl muramyl pentapeptid và UDP –

axetyl glucosamin thành một chuỗi nhờ transglucosidase. Các kháng sinh

vancomycin, bacitracine ức chế transglucosidase, ức chế sự tổng hợp tiền chất của

peptidoglycan.

Giai đoạn 3: hoàn tất đường nối ngang của hai peptidoglycan kế cận. Phản

ứng cần sự có mặt của enzym transpeptodase, penicillin ức chế enzym này.

 Ức chế sự tổng hợp protein

Kháng sinh thuộc nhóm này gồm có chloramphenicol, erythromycins,

lincomycins, tetracyclines, và các aminoglycozit.

Nhóm aminoglycozit ức chế tổng hợp protein theo 2 cách:

+ Ức chế tác động của hỗn hợp khởi đầu RNAm-f-meth-RNAt, gắn với

receptor chuyên biệt trên ribosom 30S gây biến dạng ribosom dẫn đến đọc sai mã ở

tiểu đơn vị 30S nên mang vào những acid amin không đúng làm protein mất hoạt

tính.

+ Chloramphenicol gắn với receptor trên tiểu phần 50S của ribosom ức chế

enzim peptidyltransferase, ngăn cản việc gắn kết các axit amin mới vào chuỗi peptit

mới.

Các kháng sinh nhóm macrolide và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của

ribosom, ngăn cản sự dịch chuyển của ribosom từ codon này tới codon kế tiếp, kết

quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợp protein bị dừng lại.

 Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic

Axit nucleic (ADN, ARN) là những đại phân tử sinh học không thể thiếu đối

với sự sống của tế bào. Sự có mặt của một số chất kháng sinh đã cản trở quá trình

tổng hợp axit nucleic bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotit, ức chế quá trình

sao chép hoặc dùng quá trình phiên mã.

Nhóm các các quinolon và fluoroquinolon ức chế mạnh sự tổng hợp ADN do

ức chế ADN – gyraza nên không thể mở vòng ADN để sao chép.

tạo thành mARN (ARN thông tin).

Nhóm rifampin gắn với enzym ARN polymeraza ngăn cản quá trình sao mã

Nhóm các trimethoprinm tác động vào enzyme xúc tác quá trình tạo nhân

purin làm ức chế quá trình tạo axit nucleic [1, 16,12].

 Phá hủy màng tế bào

Màng sinh chất là nơi trao đổi các chất giữa tế bào VK với MT bên ngoài.

Màng sinh chất có tính chọn lọc để kiểm soát các thành phần bên trong tế bào.

Các kháng sinh colistin, polymyxin, amphotericin có khả năng phá hủy màng

sinh chất bằng cách gắn với ergosterol hay cholesterol là thành phần của màng sinh

chất. Chúng gây tổn thương màng, tạo nên các lỗ trên màng, khi đó các phân tử lớn

và các ion sẽ thoát ra ngoài dẫn tới gây chết tế bào. Màng sinh chất của hầu hết vi

khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng đề kháng với amphoterixin B. Tuy

nhiên, chúng có thể bị phá hủy bởi polymixin và các kháng sinh loại polyen. Kháng

sinh này có tác dụng như những chất tẩy loại cation làm xáo trộn tính thẩm thấu của màng sinh chất khiến các ion như Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra khỏi tế bào.

Tóm lại các chất kháng sinh từ XK có đặc điểm chung là có tác dụng ngay cả

ở nồng độ rất thấp với hoạt tính mạnh và phổ kháng khuẩn khá rộng. Đặc điểm nổi

bật của kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn là khả năng bền với nhiệt và tác dụng

lên vi sinh vật mang tính chọn lọc.

1.3.4. Các chất kháng sinh có khả năng kháng nấm từ xạ khuẩn

 Một số một số nhóm kháng sinh có khả năng kháng nấm từ XK

 Kasugamyxin

Kasugamyxin là chất kháng sinh

có nguồn gốc từ XK Streptomyces

kasugaensis sinh ra (Umezawa và cs,

1965), nhuộc nhóm aminoglycozit.

Kháng sinh này dùng để chống bệnh

đạo ôn, trên cây lúa và các cây họ Hình 1.4: Cấu trúc của kasugamyxin

đậu. Kasugamyxin chỉ có tác dụng mạnh đối với P. oryzae khi dùng trong môi

trường axit. Còn đối với VK kể cả Pseudomonas thì tác dụng ở pH trung tính. Đây

là đặc điểm cần lưu ý để pha chế khi sử dụng cho từng đối tượng [21].

 Polioxin

Polioxin là nhóm kháng sinh thuộc họ nucleotit peptidylpyrimidin, có nguồn

gốc từ xạ khuẩn Streptomyces cacaoi var. asoensis sinh ra (Isono và cs, 1965).

Chúng có đặc tính là không độc với vật nuôi và cây trồng, không tác dụng với VK

và nấm men nhưng có tác dụng kháng nấm mạnh. Chúng có khả năng ức chế sự

tổng hợp kitin thành tế bào của nấm gây hại trên các loại cây trồng như cải, cà chua,

lúa…( Hori và cs, 1974). Polioxin gây phồng lên một cách bất thường ở đầu ống

mầm BT và đầu hệ sợi của nấm (Eguchi và cs, 1968).

R = CH2OH polioxin B

R = COOH polioxin D

Hình 1.5: Cấu trúc của polioxin

 Blastixidin S

Blastixidin S là kháng sinh được tinh chế từ dịch nuôi cấy xạ khuẩn S.

griseochromogenes [169]. Blastixidin S có phổ tác dụng rộng, không những ức chế

sự sinh trưởng của P. oryzae mà chúng còn có khả năng ức chế VK, nấm, thậm chí

có thể chống u, chống virut (Tanaka và cs 1961, Hairai, Shimomura, 1965). Đối với

bệnh đạo ôn trên cây khoai tây, Blastixidin S ức chế mạnh mẽ sự phát triển của hệ

sợi P. oryzae.

Hình 1.6: Cấu trúc của blastixidin S

 Validamyxin

Validamyxin là chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn Streptomyces

hygroscopicus var limoneus sinh ra. Chủng này có thể sinh ra 5 thành phần có cấu

trúc tương tự nhau và được định tên từ Validamyxin là B – F, cùng với

validoxylamine A (Iwasa và cs, 1971). Chúng có tác dụng tiêu diệt nấm gây bệnh

khô vằn ở lúa do Rhizoctonia spp gây ra.

Đặc biệt, validamyxin A có thể đặc trị đối với bệnh thối thân, thối rễ, đốm đen

trên nhiều loại hạt (Wakae, Matssura, 1975).

Hình 1.7: Cấu trúc validamyxin A

1.3.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ

khuẩn trên thế giới và Việt Nam.

 Trên thế giới

Hiện tượng cây trồng bị nhiễm nấm đã trở nên phổ biến và tăng lên đáng kể

trong nhiều thập kỉ qua. Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã bỏ ra nhiều

năm để điều tra tình hình sử dụng chất kháng sinh từ XK trong việc ngăn chặn các

bệnh ở thực vật.

Bộ Nông nghiệp, Hải sản và thực phẩm Anh (MAFF) đã đưa ra chỉ định tất

cả các chất kháng sinh dùng trong y học không được phép sử dụng trong nông

nghiệp [9, 44].

Ở Hà Lan, 2 chất kháng sinh được phép sử dụng là streptomycin và

validamyxin.

Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập được Streptomyces.sp 5406 có khả năng

sinh chất kháng sinh phòng chống bệnh thối rễ và đã áp dụng trên 6 triệu ha trồng

bông và đã thu được kết quả khả quan [29].

Năm 2002, Ấn Độ đã phân lập chủng Streptomyces sp.201 có khả năng sinh

kháng sinh mới là z – methylheptyl iso – nicotinate. Chất kháng sinh này có khả

năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F. solani gây

hại trên rau màu.

Tại Nhật Bản năm 2003, kháng sinh yatakemycin đã được tách chiết từ xạ

khuẩn Streptomyces sp. TP – A0356. Hơn nữa, Nhật Bản cũng đã có những chế

phẩm chống các bệnh đạo ôn, khô vằn rất có hiệu quả như blastidin S,

kasugamyxin, validamyxin [39]. Năm 2011, tác giả Bảo – Xin Zhang và công sự đã

tìm ra chất kháng mới milbemycins từ chủng XK đột biến S. bingchenggensis X-4

có khả năng phòng trừ sâu bọ [29]. Nhiều nước khác như Hàn Quốc, Thái Lan, Mỹ

cũng đã rất thành công trong việc nghiên cứu và sử dụng chất kháng sinh từ XK để

phòng và trị nấm gây bệnh cây trồng.

Không những trong lĩnh vực nông nghiệp mà trên lĩnh vực y học và nhiều lĩnh

vực khác, kháng sinh từ XK có vai trò hết sức quan trọng. Từ 1940 – 1958,

Waksman đã phát hiện ra 22 hợp chất kháng sinh khác nhau từ XK, trong đó 3 loại:

actinomycin, neomycin và streptomycin đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị một

số bệnh ở người. Năm 1952, ông đã tìm ra được kháng sinh vacomycin từ XK từ đất

tại Ấn Độ và Indonesia. Kháng sinh này có tác dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng

do VK [51]. Trong những năm gần đây, năm 2010, Alexander DC và cộng sự đã

tìm ra được A54145 thuộc nhóm kháng sinh lipopeptit sản xuất bởi S. fradiae ức

chế sự hoạt động của một số VK gây hại trên da động vật và con người [32].

 Trong nước

Nhìn chung, những nghiên cứu chất kháng sinh từ XK đã bắt đầu được quan

tâm bởi các nhà khoa hoc.

Năm 1994, tác giả Lê Gia Hy đã có công trình nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân

lập ở Việt Nam [15].

Năm 1995, tác giả Lê Thanh Bình đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ chế kháng

kháng sinh của một số chủng XK (Streptomyces) với kháng sinh do chúng tổng hợp

ra và ứng dụng trong việc phân lập, tạo giống VSV.

Năm 2000, tác giả Biền Văn Minh đã nghiên cứu khả năng sinh chất kháng

sinh của một số chủng XK phân lập từ đất Bình – Trị - Thiên.

Năm 2004, tác giả Đỗ Thu Hà đã nghiên cứu XK sinh chất kháng sinh chống

nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng.

Năm 2006, tác giả Bùi Thị Việt Hà đã thực hiện đề tài nghiên cứu XK sinh

chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam. Tác giả Nguyễn Hoàng

Minh Huy cũng đã tiến hành khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn S.

dicklowii [9, 12].

Năm 2008, tác giả Bùi Thị Hà đã tiến hành nghiên cứu XK thuộc chi

Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên

[10].

Năm 2011, tác giả Nguyễn Huỳnh Minh Quyên tiến hành điều tra, nghiên cứu

một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ XK

[19].

Hiện nay, ở nước ta cũng sử dụng nhiều loại chất kháng sinh từ XK như:

validamyxin chống bệnh khô vằn, polioxin chống bệnh đen lá, streptomyxin chống

bệnh bạc lá hại lúa…Mặc dù đã thu được những hiệu quả nhất định song việc sử

dụng chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật ở nước ta còn hạn chế do người nông

dân đã quen với việc sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật. Bên cạnh đó giá thành

của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất của người nông

dân. Vì vậy, cần phối hợp thống nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm

sinh học với việc tuyên truyền kiến thức cho người nông dân. Cần xây dựng phương

pháp canh tác mới nhằm đem lại hiệu quả cao trong phòng chống dịch bệnh, nâng

cao năng suất cây trồng, đồng thời bảo vệ MT và sức khỏe con người.

Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Hóa chất

- Các loại đường chuẩn: glucozơ, saccarozơ, lactozơ, maltozơ, inositol,

dextrin, metanol, butanol…do hãng Merck (Đức) sản xuất.

- Các loại dung môi: n-butanol, etanol, etyl-acetat, iso-propanol, metanol,

benzen… do Nga và Trung Quốc sản xuất.

- Các hóa chất khác: cao thịt, cao nấm men, pepton do hãng Merck sản xuất.

KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, FeSO4.7H2O, tinh bột tan,

gelatin, CMC, xenlulozơ do Trung Quốc sản xuất.

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu đề tài gồm: nồi hấp cao áp ALP

(Nhật Bản), tủ sấy Memmert (Đức), kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỹ thuật

số Olympus 5.1 (Nhật Bản), máy đo pH Pometer KL-009(II) (Trung Quốc), máy li

tâm Rotina (Đức), kính lúp soi nổi Olympus (Nhật Bản), tủ cấy vô trùng Box

laminer (Việt Nam), tủ lạnh National (Nhật Bản), tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật Bản),

máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức).

2.1.3. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

+ Môi trường Gauze-1 (g/l): phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn

Tinh bột tan : 20 g

: 0,5 g : 0,01 g K2HPO4 FeSO4

: 0,5 g : 0,5 g MgSO4.7H2O KNO3

NaCl : 0,5 g Agar : 18 g

Nước cất : đủ 1000 ml pH : 7 – 7,4

(Môi trường giữ giống có thêm: pepton 5 g; cao nấm men 10 g).

+ Môi trường Gauze-2 (g/l): nghiên cứu XK

Nước chiết thịt : 30 ml Pepton : 5 g

NaCl : 5 g Glucozơ : 10 g

Agar : 18 g Nước cất : đủ 1000 ml

pH : 7 – 7,4

 Cách tạo nước chiết thịt:

- Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ bạc nhạc đem xay hoặc thái nhỏ. Cứ 500 g

thịt thêm 1000 ml nước cất.

- Đun nóng từ từ, giữ ở 500C trong 1giờ. Sau đó đun sôi 30 phút.

- Để nguội và lắng trong dung dịch vừa đun.

- Lọc bằng vải hoặc giấy lọc.

+ Môi trường ISP – 4 (g/l): nghiên cứu XK

Tinh bột tan : 10 g : 1 g K2HPO4

: 1 g NaCl : 1 g MgSO4.7H2O

: 2 g : 2 g (NH4)2SO4 CaCO3

Nước cất : đủ 1000 ml Dung dịch khoáng : 1ml

pH : 7 – 7,4

+ Môi trường ISP – 1 (g/l): nghiên cứu XK

Tryton : 5 g Cao nấm men : 3 g

Agar : 18 g

pH Nước cất : đủ 1000 ml : 7 – 7,4

+ Môi trường Potato Glucose Agar (PDA) (g/l): nuôi cấy , giữ giống nấm

Fusarium.

Khoai tây : 300g Glucozơ : 50 g

Agar : 20g (nếu làm môi trường đặc)

Nước cất : đủ 1000 ml

 Cách chế dịch khoai tây:

- Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch.

- Cân 300g, thái nhỏ, thêm 1000ml nước.

- Đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập xạ khuẩn

 Lấy mẫu

Sử dụng dụng cụ vô trùng gạt bỏ 5 cm lớp đất mặt và tiến hành lấy đất sâu

5cm. Đựng mẫu trong túi nilon, buộc kín miệng, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, thời

gian lấy mẫu. Bảo quản mẫu trong thùng xốp chứa nước đá được vận chuyển về

phòng thí nghiệm và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C.

 Phân lập XK bằng phương pháp sấy khô (Nonomura et al, 1969)

 Nguyên tắc

- Tách rời các tế bào XK.

- Nuôi cấy các tế bào trên môi trường đặc trưng để tạo ra KL riêng rẽ, cách

biệt nhau.

 Cách tiến hành

- Các mẫu đất được làm khô ở nhiệt độ phòng trong 5 – 7 ngày, rồi xử lý ở nhiệt độ 90 – 1100C trong 10 – 30 phút để loại bỏ các VK không sinh BT (hầu hết

các bào tử XK không chết ở điều kiện này).

- Cân 1g đất cho vào bình tam giác 250 ml chứa 99 ml nước cất vô trùng, lắc

trên máy lắc 30 phút sẽ được độ pha loãng là 1/100. Để có độ pha loãng là 1/1000

lấy 1 ml của dung dịch có độ pha loãng là 1/100 cho vào ống nghiệm có 9 ml nước

cất vô trùng. Tiếp tục tiến hành pha loãng đến nồng độ mong muốn.

- Từ dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-4 nhỏ 0,1 ml lên bề mặt môi trường

Gauze – 1 đã chuẩn bị sẵn trong các hộp Petri. Dùng que gạt vô trùng trang đều dịch

huyền phù trên mặt môi trường cho 3 hộp, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 7 - 14 ngày

mang các hộp Petri ra quan sát.

- Các KL với hình thái khác nhau được chọn và cấy truyền sang MT Gauze -

1 mới để thuần khiết lần thứ hai.

2.2.2. Bảo quản giống bằng dầu khoáng

 Nguyên tắc:

- Đảm bảo tốt các điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm thay đổi

bản chất ban đầu của giống.

- Làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV đồng thời ngăn cản sự

sinh sản của chúng.

 Cách tiến hành: - Khử trùng dầu khoáng 20% bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 2 giờ. Sau

đó, sấy khô ở 1700C trong 1 – 2 giờ, rồi để nguội.

- Cấy XK lên môi trường Guaze – 1 sau 14 ngày. Đổ lên bề mặt môi trường có

XK phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm.

- Trét parafin đặc lên miệng ống nghiệm và giữ ở điều kiện lạnh (-200C).

2.2.3. Quan sát hình thái xạ khuẩn

 Quan sát đại thể

Sử dụng que cấy đầu vuông vô trùng lấy một ít BT từ ống giống XK cho vào

ống nghiệm chứa 5 ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù.

Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi cấy chấm điểm vào giữa đĩa

Petri.

Ủ đĩa Petri trong tủ ấm 7 – 14 ngày, sau đó lấy ra quan sát đặc điểm KL (kích

thước, màu sắc, hình dạng tính chất khuẩn lạc XK, màu sắc môi trường,...).

 Quan sát vi thể (phương pháp xẻ rãnh thạch của Okamia Suzuki, 1968)

Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp Petri, cấy dịch BT xạ khuẩn

xung quanh mép rãnh.

Đặt 1 hoặc 2 lamelle vô trùng nghiêng 45° lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy

nắp đĩa Petri để vào tủ ấm 28 – 30°C.

Sau 7-14 ngày lấy lamelle ra khỏi đĩa Petri tiến hành nhuộm màu và quan sát

hệ sợi, cuống sinh BT,... dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100.

2.2.4. Xác định khả năng kháng nấm của XK

 Phương pháp khoan lỗ thạch

 Nguyên tắc:

Nuôi cấy VSV đối kháng trên cùng một MT thạch, kiểm tra vòng kháng nấm,

để xác định chủng XK sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium.

 Cách tiến hành: Bổ sung 2% (v/V) giống XK với mật độ 108 BT/ml vào bình tam giác 250 ml

chứa 50 ml môi trường dịch thể, lắc 220 vòng/ phút trong 3-5 ngày. Sử dụng khoan

nút chai vô trùng (d = 9mm) khoan lỗ trên đĩa môi trường PDA. Dùng que cấy vô

trùng, cấy chấm điểm Fusarium (nuôi 3 ngày trên môi trường PDA) vào 2 phía đối

diện của lỗ thạch. Sau đó, dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch nuôi cấy XK nhỏ vào

lỗ thạch mới khoan. Đậy nắp hộp Petri để ở nhiệt độ phòng, sau 3-5 ngày tiến hành

kiểm tra kết quả. Nếu XK có khả năng sinh hoạt chất kháng Fusarium thì dịch

kháng nấm khuếch tán xung quanh lỗ thạch tạo nên vòng kháng nấm, làm cho nấm

không phát triển xung quanh lỗ thạch.

 Đánh giá kết quả:

Đánh giá khả năng kháng nấm dựa vào khoảng cách vô khuẩn D - d (mm).

D - d ≥ 25 mm: Hoạt tính kháng nấm rất mạnh.

D - d ≥ 20 mm: Hoạt tính kháng nấm mạnh.

D - d ≥ 15 mm: Hoạt tính kháng nấm trung bình.

D - d <10 mm: Hoạt tính kháng nấm yếu.

Trong đó: D là đường kính vô khuẩn, d đường kính lỗ thạch.

2.2.5. Tuyển chọn các chủng XK sinh chất kháng nấm

- Nhân giống: giống gốc từ MT bảo quản được hoạt hóa trên môi trường thạch

nghiêng sau 7 ngày, thu huyền phù BT chuyển sang các bình tam giác dung tích

250ml chứa 50 ml môi trường Gauze - 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong

48 giờ ở nhiệt độ phòng.

- Lên men: chuẩn bị bình tam giác dung tích 250 ml chứa 50 ml môi trường Guaze – 1 dịch thể. Tiến hành bổ sung 2% MT nhân giống (v/V) (mật độ 108

BT/ml) vào bình môi trường đã chuẩn bị. Quá trình lên men kéo dài 72 giờ ở nhiệt

độ phòng, trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau đó thử hoạt tính kháng nấm trong dịch

lọc, bằng phương pháp khoan lỗ thạch.

Dựa vào kết quả D – d để chọn chủng XK sinh chất kháng nấm mạnh nhất.

2.2.6. Phương pháp định loại xạ khuẩn bằng kĩ thuật di truyền phân tử

(Steyn, A.J.C. and Pretorius, 1992)

 Tách chiết bộ gen xạ khuẩn theo quy trình của Qiagen

 Nguyên tắc

Thành tế bào của XK được phá vỡ giúp ADN được giải phóng ra. Protein và

ARN được tách ra khỏi ADN nhờ các loại ARN-aza,, proteaza và các loại dung môi

thích hợp.

Cách tiến hành

Nuôi cấy chủng XK đã tuyển chọn trong môi trường Gauze-1, trên máy lắc với

vận tốc 220 vòng/phút. Sau 72 giờ, lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf.

Li tâm 8000 vòng/phút, trong 5 phút thu sinh khối xạ khuẩn. Huyền phù sinh khối với 54% TE và 25 µl lysozyme nồng độ 5 mg/ml được ủ ở 370C, trong 30 phút. Cho 30 μl SDS 10% và 3 μl protein K 20 mg/ml, đảo đều. Ủ ở 370C, trong 1 h

Tiếp tục cho 800 μl chloroform vào hỗn hợp trên, lắc mạnh. Sau đó, tiến hành

ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút để thu dịch nổi.

Cho phenol (bằng thể tích dịch nổi thu được), vortex, ly tâm, thu dịch nổi

Cho phenol : chloroform (bằng thể tích dịch thu được), vortex, ly tâm, thu dịch

nổi (thực hiện 2 lần)

Cho chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, vortex, ly tâm thu dịch trong

(thực hiện 2 lần)

Cho 10 μl RNase (20 μg/ul), ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng

Cho 0,7 lần thể tích Isopropanol

Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa Rửa tủa bằng 500 μl ethanol 70%. Bảo quản -20 oC.

 Khuếch đại trình tự ARNr 16S

Sử dụng cặp mồi có trình tự như sau để khuếch đại vùng ARNr 16S của xạ

khuẩn:

Mồi xuôi: 27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’

Mồi ngược: 1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT’-3’

Thành phần của phản ứng PCR thu gen được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR

Nước dNTP Buffer 27F (100 pmol) 1492R (100 pmol) Template (500 ng/µl) Enzyme (10U/µl) Tổng thể tích 77,5 µl 10 µl 10 µl 0,25 µl 0,25 µl 1 ul 1 µl 100 µl

95°C

72°C

5 phút

30 giây

A phút

5 phút

55°C

4°C

30 giây

2 x 30 chu kỳ

∞

Chu trình nhiệt

Tinh chế sản phẩm PCR

Sản phẩm khuếch đại được tinh chế bằng bộ kít QIAquick PCR Purification

 Quy trình thực hiện:

Hỗn hợp sản phẩm được cho vào một eppendorf 1,5 ml

Bổ sung buffer PB với tỉ lệ 5:1 (v/v) so với thể tích sản phẩm PCR, trộn đều

Chuyển dung dịch vào cột tinh chế. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 – 60

giây, đổ bỏ dịch sau khi qua cột

Bổ sung 750 µl buffer PE vào cột để rửa. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 –

60 giây, đổ bỏ phần dịch sau khi qua cột

Ly tâm lại 9000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn buffer PE

Chuyển cột sang một eppendorf 1,5 ml mới

Bổ sung 30 – 50 µl Buffer EB (10mM Tris-HCl, pH 8,5) hay Mili Q vào chính

giữa cột, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút, thu phần dịch chứa gen và ở nhiệt độ -

20oC.

 Giải trình tự ARNr 16S

Sản phẩm khuếch đại sau khi tinh chế được giải trình tự tại công ty Macrogen

(Hàn Quốc).

 Định danh chủng xạ khuẩn dựa vào trình tự ARNr 16S

Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit. Các trình tự

nucleotide hoàn chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách

sử dụng công cụ BLAST. Từ đó xác định tên loài của chủng nghiên cứu.

2.2.7. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp

2.2.7.1. Lựa chọn MT lên men thích hợp

- Nhân giống: giống gốc từ MT bảo quản được hoạt hóa trên MT thạch

nghiêng sau 7 ngày, thu huyền phù BT chuyển sang các bình tam giác dung tích

250ml chứa 50 ml môi trường Gauze - 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong

48 h ở nhiệt độ phòng.

- Lên men: chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml lần lượt 4 môi trường

dịch thể ISP-1, ISP-4 và Gauze -1, Gauze -2. Bổ sung 2% thể tích MT nhân giống (v/V) vào các bình tam giác đã chuẩn bị với tỉ lệ 2% thể tích với (mật độ 108

BT/ml). Tiến hành nuôi lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định hoạt tính

kháng nấm của XK trong dịch lên men ở thời gian 24, 48, 72, 96, 120, 144 h bằng

phương pháp khoan lỗ thạch. Lựa chọn MT và thời gian nuôi cấy cho hoạt tính

kháng nấm của XK đạt mức cao nhất.

2.2.7.2. Khảo sát nguồn cacbon thích hợp

Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT đã chọn. Bổ sung thay thế

nguồn cacbon bằng tinh bột tan, glucozơ, lactozơ, saccarozơ vào MT nuôi cấy với

một lượng tương đương.

Giống sau khi được hoạt hóa và nhân giống, tiến hành bổ sung một lượng MT nhân giống 2% (v/V) (108 BT/ml) và tiến hành lên men trên máy lắc, với tốc độ 220

vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định ở trên), tiến hành thử hoạt

tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn

nguồn cacbon thích hợp nhất.

2.2.7.3. Khảo sát hàm lượng cacbon thích hợp

Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường đã chọn. Bổ sung thay

thế các hàm lượng khác nhau của nguồn cacbon đã xác định ở trên ở các mức: 16,

18, 20, 22, 24g.

Giống sau khi được nhân lên, tiến hành bổ sung một lượng MT nhân giống 2% (v/V) (108 BT/ml) và tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút

ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm

trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nồng độ cacbon thích

hợp nhất.

2.2.7.4. Khảo sát nguồn nitơ thích hợp

Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường đã chọn (có bổ sung

nguồn cacbon với nồng độ thích hợp đã chọn). Bổ sung thay thế lần lượt nguồn

nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 và KNO3 vào 50 ml dung dịch môi trường

nuôi cấy.

Sau đó, cấy vào MT lên men 1 lượng 2% (v/V) giống đã được nhân giống.

Tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau

thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng

phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nguồn nitơ thích hợp nhất.

2.2.7.5. Khảo sát hàm lượng nitơ thích hợp

Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml dung dịch môi trường (dịch thể) đã

chọn, có bổ sung nguồn cacbon với nồng độ thích hợp.

Bổ sung thay thế các hàm lượng khác nhau 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07g của

nguồn nitơ đã xác định ở trên.

Sau đó, cấy 2% (v/V) giống đã được nhân lên và tiến hành lên men trên máy

lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến

hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch

để chọn nồng độ nitơ thích hợp nhất.

2.2.7.6. Khảo sát pH thích hợp cho xạ khuẩn sinh hoạt tính kháng nấm

Cấy 2% (v/V) dịch nhân giống XK vào bình tam giác 250ml chứa 50 ml MT

lên men, chỉnh pH ban đầu theo các mức khác nhau 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Sau đó tiến

hành lên men trong điều kiện lắc (220 vòng/ phút), ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian

(đã xác định) thử hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khoan lỗ thạch.

Lựa chọn pH ban đầu thích hợp để XK sinh hoạt tính kháng nấm cao nhất.

2.2.7.7. Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho xạ khuẩn sinh chất kháng nấm

Cấy 2% (v/V) XK đã được nhân giống vào 50 ml dung dịch MT (dịch thể) đã

chọn trong bình tam giác 250ml, tiến hành nuôi lắc (220 vòng/ phút) ở các nhiệt độ

25, 28, 30, 35, 370C. Tiến hành lên men sau thời gian (đã khảo sát được) và thử

hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Lựa chọn nhiệt độ thích

hợp để XK sinh hoạt tính kháng nấm cao nhất.

2.2.7.8. Động học quá trình lên men tổng hợp chất kháng Fusarium từ XK

Mục đích của việc nghiên cứu động học lên men là để xác định thời gian và

điều kiện tối ưu cho việc hình thành chất kháng nấm của chủng XK nghiên cứu.

Tiến hành lên men chủng đã được tuyển chọn cùng các đều kiện nhiệt độ, pH,

nguồn cacbon, nguồn nitơ với hàm lượng đã xác định và thời gian thích hợp. Tiến

hành xác định sinh khối, hoạt tính kháng nấm và pH tại các thời điểm 12, 24, 36,

48, 60, 72, 84, 96, 108, 132, 144 h. Vẽ đồ thị động học của quá trình sinh tổng hợp

chất kháng Fusarium của chủng XK nghiên cứu. Xác định thời điểm tốt cho hoạt

tính kháng nấm và thu sinh khối của chủng XK.

2.2.8. Phương pháp tách chiết chất kháng nấm

 Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong các dung môi hữu cơ của chất

kháng nấm, tiến hành li tâm không những loại bỏ được sinh khối mà còn loại bỏ

được các chất độc hại ra khỏi dịch nuôi cấy.

 Cách tiến hành:

Sau khi nuôi cấy XK trong các điều kiện MT cụ thể đã xác định, trên máy lắc

220 vòng/phút. Sau đó, tiến hành li tâm 5000 vòng/ phút để tách riêng dịch nuôi cấy

và sinh khối.

 Phần sinh khối:

Phần sinh khối được chiết bằng các loại dung môi khác nhau ( etanol, axeton,

etyl axetat, metanol), với tỉ lệ là 1: 1. Hỗn hợp dung môi sinh khối này được lắc 220

vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó li tâm 5000 vòng/ phút để loại

sinh khối. Cuối cùng dùng dung môi chiết được thử hoạt tính kháng nấm Fusarium

bằng phương pháp khoan lỗ thạch.

So sánh kết quả đo vòng kháng khuẩn để lựa chọn dung môi thích hợp để tách

chất kháng nấm từ sinh khối XK.

 Dịch nuôi cấy

Dịch nuôi cấy sau khi loại sinh khối có thể được tách chiết bằng các loại dung

môi hữu cơ khác nhau như: n – butanol, etyl axetat, n – propanol và iso – butanol tỷ

lệ giữa dịch chiết và dung môi là 1 : 1. Hỗn hợp dịch nuôi cấy và dung môi được lắc

220 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thử hoạt tính kháng nấm

Fusarium trong dung môi và trong dịch chiết bằng phương pháp khoan lỗ thạch.

So sánh kết quả đo vòng kháng khuẩn để lựa chọn dung môi thích hợp để tách

chất kháng nấm từ dịch nuôi cấy XK.

2.2.9. Xác định ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm của

hạt và sự sinh trưởng của cây cà chua

Dịch lên men XK đã kiểm tra hoạt tính kháng nấm được pha loãng đến các

nồng độ: 1, 10, 20, 50 và 100%. Ngâm hạt cà chua vào dịch pha loãng ở các tỉ lệ

trên, sau 24 h vớt ra, đặt vào hộp Petri có lót bông thấm nước. Mỗi hộp đặt 150 hạt.

Để hộp này ở nhiệt độ phòng, theo dõi khả năng nảy mầm của hạt sau 4 ngày. Đối

chứng ngâm hạt trong nước cất. Tính tỉ lệ nảy mầm và theo dõi sự sinh trưởng của

cây ở lô đối chứng và các lô thí nghiệm.

2.2.10. Thử nghiệm khả năng kháng Fusarium của dịch lên men XK trên

cây cà chua

- Nguyên tắc: Tính số lượng cây bị nhiễm bệnh dựa trên các dấu hiện ban đầu

của thân, lá của cây cà chua sau khi xử lý dịch lên men chủng XK nghiên cứu.

- Phương pháp gây nhiễm:

+ Chuẩn bị dịch Fusarium:

Nấm Fusarium được nuôi cấy trên môi trường PDA, để ở nhiệt độ phòng

trong 3 – 5 ngày. Dùng que cấy lấy các bản thạch mỏng có tơ nấm và hạch nấm cho

vào bình tam giác có sẵn 20 ml nước cất vô trùng. Lắc dung dịch trên máy lắc 1000

vòng/phút trong 15 phút.

+ Cách tiến hành:

Tưới, phun trực tiếp dịch nấm Fusarium, dịch kháng nấm không pha loãng

của XK vào đất hoặc cây trồng.

- Bố trí thí nghiệm như sau:

+ Cơ chất gieo trồng và chế độ chăm sóc của 4 lô thí nghiệm trên đều như

nhau:

• Đất trồng: đất sạch Gino được cung cấp bởi Công ty TNHH Nguyên Nông -

Gino (146/ 6A Võ Thị Sáu, quận 3, Tp.HCM).

• Chậu cây: có kích thước 36 x 42 cm.

• Số lượng cây: 10 cây/chậu. Mỗi lô thí nghiệm 50 cây.

• Tưới cây 2 lần/ ngày đảm bảo đủ ẩm vào buổi sáng và chiều mát.

• Sau khoảng 20 ngày cần bổ sung phân đạm (5g/20 lít nước/ 200 cây) để đảm

bảo cung cấp chất dinh dưỡng đầy đủ cho cây trồng phát triển.

+ Đảm bảo đồng nhất các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, nước và

phân bón) ở các lô thí nghiệm.

- Các lô thí nghiệm được bố trí như bảng sau:

Công Kí hiệu Tiến hành Mục đích thức

Theo dõi sự sinh

trưởng, phát triển bình Không gây nhiễm (A), không sử CT 1 ĐC 1 thường của cây khi dụng (B) vào đất, hạt giống.

không có xử lí.

Sau khi gieo hạt 5 ngày tiến Theo dõi sự tấn công

CT 2 ĐC 2 hành gây nhiễm (A) vào đất và của nấm Fusarium trên

không xử lí thêm (B). cây cà chua.

- Hạt không được ngâm trong

Xác định khả năng dịch (B).

phòng nấm Fusarium - Phun (B) vào đất trước khi CT 3 TN 1 nhờ chất kháng nấm trồng cây con.

của xạ khuẩn - Phun (A) vào đất sau khi trồng

cây con 5 ngày.

Công Kí hiệu Tiến hành Mục đích thức

- Hạt không được ngâm trong

Xác định khả năng trị dịch (B)

nấm Fusarium nhờ - Phun (A) vào đất trồng. CT 4 TN 2 chất kháng nấm của xạ - Sau khi thấy xuất hiện dấu hiệu

khuẩn. bệnh đầu tiên mới bắt đầu phun

(B) vào đất.

Ghi chú: (A): dịch nấm Fusarium

(B): dịch lên men từ XK

+ Cứ sau 4 ngày, tiến hành phun (A) và (B) theo cách tiến hành thí nghiệm, lặp

lại đến lần thứ 3.

+ Yêu cầu:

o Quan sát biểu hiện bệnh của cây trên thân và lá sau mỗi tuần (tuần 1 – 4). o Tính số lượng cây bị nhiễm bệnh sau 4 tuần. - Phương pháp xử lí số liệu

Các thí nghiệm trong luận văn được lặp lại 3 lần. Kết quả trình bày trong luận

văn là số liệu trung bình ± độ lệch chuẩn, được tính bằng phần mềm Microsoft

Excel 2007.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng sinh hoạt chất kháng

nấm Fusarium

Từ các mẫu đất thu nhận được, chúng tôi đã phân lập được 32 dạng khuẩn lạc

XK khác nhau (tạm gọi là chủng) và được kí hiệu từ D1 đến D32. Các chủng này

KL có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, xám, đen, đỏ, hồng, vàng, nâu…

D1 D4 D7 D8

D10 D11 D12 D14

D15 D16 D18 D19

D20 D25 D27 D30

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc một số chủng xạ khuẩn phân lập được

Sau đó, chúng tôi tiến hành tuyển chọn sơ bộ các chủng XK có khả năng sinh

hoạt chất kháng nấm Fusarium bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Ở bước này,

chủng XK được lên men trong bình tam giác 250 ml có chứa 50 ml MT Guaze – 1, đã bổ sung 2% (v/V) dịch nhân giống (mật độ 108 BT/ml), nuôi trên máy lắc với tốc

độ 220 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày, lọc lấy dịch lên men để thử khả

năng kháng nấm Fusarium bằng cách đo đường kính vòng kháng nấm. Kết quả

được trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Fusarium

Kí hiệu Hoạt tính kháng TT chủng Fusarium (D – d, mm)

1 D1 6

2 D4 8

3 D7 22

4 D19 5

5 D20 16

6 D25 8

7 D27 18

8 D30 9

Kết quả cho thấy, trong tổng số 32 chủng XK phân lập được có 8 chủng có

khả năng sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium. Trong đó có 5 chủng có khả năng

sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium yếu, 2 chủng kháng nấm trung bình và 1 chủng

D7 kháng nấm mạnh.

Từ kết quả trên, chúng tôi chọn được chủng D7 để sử dụng cho những nghiên

cứu tiếp theo.

D1 D4 D7 D19

D20 D25 D27 D30

Hình 3.2. Hoạt tính kháng Fusarium của 8 chủng XK tuyển chọn được

3.2. Đặc điểm hình thái của chủng D7

 Hình thái đại thể

Tiến hành cấy xạ XK trên môi trường Guaze- 1 và quan sát KL sau 7 ngày

nuôi cấy cho thấy:

Về kích thước, KL có đường kính 6mm. Bề mặt KL có dạng thô ráp, xù xì,

không trong suốt, mép KL trơn.

Mặt phải KL vùng trung tâm có màu trắng, xung quanh có màu xám đen và

viền mép có màu trắng.

Mặt trái KL vùng trung tâm có màu xám, viền mép có màu trắng. Không có

sắc tố tiết ra trên MT Guaze -1.

(a)

(b)

Hình 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn D7

a: mặt phải b: mặt trái

 Hình thái vi thể Sau 7 ngày nuôi cấy XK trong đĩa Petri bằng phương pháp xẻ rãnh thạch

(Okamia Suzuki, 1968), quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100, nhận thấy

hệ sợi chủng D7 phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, không có vách ngăn.

Cuống BT dạng thẳng, số lượng BT trên một chuỗi là ba đến nhiều BT. Bào tử

có dạng hình bầu dục và không có khả năng di động.

Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và Hình 3. 4. Hệ sợi chủng D7

bào tử chủng D7

Để có cơ sở cho những nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo chúng tôi tiến hành

định danh chủng D7 bằng kỹ thuật di truyền phân tử.

3.3. Định danh đến loài chủng xạ khuẩn D7

 Kết quả thu nhận trình tự ARNr 16S Bộ gen của chủng XK D7 được tách chiết. Trình tự ARNr 16S trên bộ gen

được nhân bản bằng phương pháp PCR và chạy điện di trên gel agarose 1% để kiểm

tra kết quả. Trên Hình 3.6 cho thấy đã thu nhận được trình tự ADN có kích thước

khoảng 1500 bp, thang GeneRuler™ ADN Ladder 2

Hình 3.6. Kết quả giải trình tự ARNr 16S của chủng D7

TGCAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTG

GGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGA

TCATCTTGGGCATCCTTGGTGATCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTA

TCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGG

CGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA

ATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCG

GGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGC

CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTA

TTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAAC

CCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGG

TGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGG

 Kết quả giải trình tự

CCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG

TCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAG

CTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATT

GACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCT

TACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGT

ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC

GAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAG

ACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGT

CTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAG

CGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTC

GGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC

ACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCG

Vùng trình tự ARN 16S sau khi khuếch đại được gửi giải trình tự tại công ty

Macrogen và so sánh độ tương đồng di truyền với các loài trên ngân hàng gen

NCBI bằng công cụ BLAST theo phụ lục 1.

Kết quả xác định được chủng XK kí hiệu D7 và chủng Streptomyces

pseudogriseolus có sự tương đồng 100% về trình tự của vùng ARNr 16S.

Dựa trên kết quả phân tích được, chúng tôi đã xác định được chủng D7 là

Streptomyces pseudogriseolus và gọi là S. pseudogriseolus D7.

3.4. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng S.

pseudogriseolus sinh hoạt tính kháng Fusarium

3.4.1. Lựa chọn MT và thời gian lên men thích hợp

Môi trường đóng vai trò hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát

triển của VSV. Một MT lên men tốt là MT vừa thuận lợi cho sự sinh trưởng vừa cho

hiệu suất kháng sinh cao. Vì vậy, để chọn MT lên men thích hợp nhất cho chủng

nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nuôi chủng S. pseudogriseolus trên 4 loại MT khác

nhau: Guaze – 1, Guaze – 2, ISP – 1 và ISP – 4. Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144 h lên

men, tiến hành khảo sát khả năng kháng Fusarium của chủng XK bằng phương

pháp khoan lỗ thạch. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và minh họa trong hình

3.7; 3.8.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại MT đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng

S. pseudogriseolus theo thời gian

Hoạt tính kháng nấm Fusarium của chủng S. pseudogriseolus Thời gian ( D – d, mm) trên các MT khác nhau (h) Guaze – 1 Guaze – 2 ISP – 1 ISP – 4

24 2,230 ± 0,14 1,28 ± 0,46 0,860 ± 0,19 3,37 ± 0,47

48 13,17 ± 0,31 9,28 ± 0,24 4,430 ± 0,61 6,17 ± 0,21

72 22,02 ± 0,82 20,0 ± 0,73 20,10 ± 1,12 20,0 ± 0,65

96 20,00 ± 0,82 16,4 ± 0,36 11,83 ± 0,82 15,5 ± 0,59

120 8,250 ± 0,74 12,5 ± 0,14 6,370 ± 0,50 8,07 ± 0,74

144 6,140 ± 0,04 4,36 ± 0,26 2,600 ± 0,51 5,83 ± 0,93

Kết quả cho thấy, ở cả 4 môi trường chủng XK đều có hoạt tính kháng

Fusarium. Điều này chứng tỏ chủng XK này có thể sinh trưởng và sinh hoạt tính

kháng Fusarium trên nhiều loại môi trường khác nhau.

)

m m

,

d -

D

(

m ấ n g n á h k t n

Hình 3.7: Biểu đồ ảnh hưởng của thành phần MT đến hoạt tính kháng

Fusarium của chủng S. pseudogriseolus theo thời gian

Mặt khác, trên cả 4 MT, hoạt tính kháng Fusarium trong giai đoạn đầu (24 h)

rất thấp, không đáng kể. Sau đó, hoạt tính tăng dần lên nhưng tốc độ tăng tương đối

chậm (48 h) và đạt cao nhất ở 72 h trên cả 4 loại MT. Hoạt tính kháng nấm bắt đầu

giảm dần đến 144 h. Trong 4 loại MT khảo sát thì MT Guaze – 1 cho hoạt tính

kháng nấm cao nhất ở các thời điểm 48, 72, 96 và 144 h so với các MT còn lại ở

cùng thời điểm. Đặc biệt, ở 72 h trên MT Guaze – 1 hoạt tính kháng nấm đạt giá trị

cao nhất 22,02 mm. Điều này hoàn toàn phù hợp vì khi nuôi cấy XK từ 72 – 96 h là

thời gian thích hợp nhất để thu nhận các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 như chất

kháng sinh, enzym. Trong khi đó, thời gian trước 72 h là thời XK sinh trưởng phát

triển hệ sợi tạo sinh khối. Sau 120 h trở đi thì sinh khối và khả năng tạo chất kháng

nấm của XK giảm [1,2]. Hơn nữa, do thành phần cơ bản của 4 loại MT này có tỉ lệ

tương đương nhau nên hoạt tính kháng nấm của chủng nghiên cứu không khác nhau

nhiều.Kết quả này hoàn toàn phù hợp các tác giả Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006)

[10], khi kết luận trên MT Guaze – 1, XK có thể tạo sinh khối thấp nhưng cho hoạt

chất kháng sinh cao. Tác giả Bùi Thị Việt Hà (2006) khi chọn MT giàu nguồn

cacbon là tinh bột để nuôi cấy và lên men. Theo tác giả H Nishimura và H Otsuka

(1969) đã kết luận chủng S. pseudogriseolus sống được trên nhiều MT sống khác

nhau có thể sinh kháng sinh tsushimycin [36].

So sánh hiệu quả tổng hợp hoạt tính kháng Fusarium của chủng S.

pseudogriseolus trên cả 4 loại MT, chúng tôi nhận thấy thành phần MT và thời gian

nuôi cấy đã ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh hoạt tính kháng nấm của XK như

nhiều nghiên cứu trước đã khẳng định [14, 17]. Với mục đích lựa chọn MT lên men

thích hợp, chúng tôi chọn Guaze – 1 và xác định 72 h là thời gian tối ưu cho XK

sinh hoạt chất kháng Fusarium cao nhất để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.

Guaze – 1

Guaze – 2

ISP – 1

ISP – 4

Hình 3.8. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng D7 trên 4 loại MT

sau 72 giờ nuôi cấy.

3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nuôi cấy chủng S. pseudogriseolus trên MT Guaze – 1, trong đó nguồn

cacbon lần lượt được thay đổi là tinh bột tan, glucozơ, lactozơ, saccarozơ với hàm

lượng tương đương là 20 g. Sau 72 h, thu dịch lên men và tiến hành kiểm tra hoạt

tính kháng nấm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và minh họa trong hình 3.9.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus

Nguồn cacbon Hoạt chất kháng nấm (D – d, mm)

Saccarozơ 19,01 ± 0,81

Glucozơ 16,50 ± 1,08

Lactozơ 18,00 ± 0,91

Tinh bột tan 23,00 ± 0,08

)

m m

,

d -

D

(

19,01

16,5

m ấ n g n á h k h n í t t ạ o H

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính kháng

Fusarium của chủng S. pseudogriseolus

Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy chủng S. pseudogriseolus có khả năng sử

dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau để sinh tổng hợp hoạt chất kháng Fusarium.

Điều này đã chứng tỏ XK có thể tồn tại được ở nhiều MT khác nhau.Trong số

những nguồn cacbon trên chủng S. pseudogriseolus có thể sử dụng thì tinh bột tan là

loại thích hợp hơn cả. Theo chúng tôi, khi nuôi chủng S. pseudogriseolus trong MT

Guaze – 1 với nguồn cơ chất là tinh bột thì sẽ sản sinh ra enzym amylaza để phân

giải tinh bột. α, β – amylaza sẽ phân giải tinh bột thành mantozơ và dextrin.

Glucoamylaza tác động và phân giải chúng thành đường glucozơ. Có lẽ chủng này

đã sử dụng đồng thời các sản phẩm của quá trình phân giải tinh bột để sinh trưởng

và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong đó có chất kháng Fusarium. Trong khi

đó, 3 MT còn lại chỉ có duy nhất một trong những nguồn cacbon như saccarozơ,

lactozơ và glucozơ nên chủng này cũng có khả năng sinh hoạt chất kháng nấm

nhưng không cao. Kết quả này phù hợp Umezawa (1965) khi nghiên cứu sự sinh

tổng hợp kháng sinh chống nấm từ XK [34]. Từ đó, chúng tôi chọn tinh bột tan làm

nguồn cacbon khi tiến hành nuôi cấy chủng S. pseudogriseolus.

3.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột tan

Hàm lượng cacbon trong MT lên men cũng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng

nấm của chủng XK. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng cacbon trong MT

bằng cách bổ sung 2% (v/V) dịch nhân giống chủng S. pseudogriseolus vào bình

tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường Guaze – 1, thay đổi khối lượng tinh bột tan

theo thứ tự từ 16, 18, 20, 22, 24 g. Sau 72 h lên men, tiến hành xác định hoạt tính

kháng nấm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và hình minh họa 3.10.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột tan đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus

Hàm lượng tinh Hoạt tính kháng Fusarium

bột tan (g) (D – d, mm)

16 9,57 ± 0,31

18 16,9 ± 1,42

20 23,0 ± 0,08

22 20,0 ± 0,71

24 18,24 ± 0,88

Kết quả cho thấy, ở các mức hàm lượng cacbon thay đổi từ 16 – 24 g chủng

XK đều có khả năng sinh hoạt tính kháng Fusarium ở mức độ khác nhau. Hoạt tính

kháng nấm tăng dần khi hàm lượng tinh bột tăng dần từ 16 g đến 20 g và đạt giá trị

cao nhất khi hàm lượng tinh bột trong MT lên men là 20 g. Tuy nhiên, khi tiếp tục

nâng hàm lượng tinh bột lên trên 20 g thì hoạt tính kháng nấm giảm dần và giảm

mạnh ở 24 g Theo chúng tôi, điều này có thể do: khi bổ sung 16 g tinh bột vào MT

thì hoạt chất kháng nấm yếu. Chúng tỏ, với hàm lượng cacbon thấp thì lượng tinh

bột này không đủ để chủng S. pseudogriseolus vừa tăng sinh khối vừa sinh hoạt chất

kháng nấm. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi không tương đồng với nghiên cứu

của một số tác giả khác. Điều này chứng tỏ, XK có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon

khác nhau. Đối với chủng S. pseudogriseolus, để hoạt tính kháng nấm đạt giá trị cao

nhất, MT cần bổ sung 20 g tinh bột là phù hợp.

m u

)

18,24

i r a s u F

16,9

m m

,

9,57

d -

D

(

g n á h k h n

í t t ạ o H

20 Hàm lượng tinh bột tan (g)

Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của hàm lượng cacbon đến hoạt tính kháng

Fusarium của chủng S. pseudogriseolus sau 72 h

3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Để lựa chọn nguồn nitơ thích hợp nhất cho chủng này, tiến hành bổ sung 2%

(v/V) dịch nhân giống chủng S. pseudogriseolus vào bình tam giác 250 ml chứa 50

ml môi trường Guase – 1 với nguồn cacbon là 20 g tinh bột tan. Tiến hành thay thế

nguồn nitơ với hàm lượng tương đương lần lượt là cao nấm men, pepton, KNO3,

(NH4)2SO4 và NH4Cl. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5 và minh họa trong hình

3.11.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt chất kháng Fusarium của chủng

S. pseudogriseolus

Nguồn nitơ

Cao nấm men Hoạt tính kháng Fusarium (D –d, mm) 8,900 ± 0,79

Pepton 13,60 ± 0,71

KNO3

23,10 ± 0,21 18,90 ± 0,73 (NH4)2SO4

16,63 ± 1,29 NH4Cl

)

m m

,

23,1

d -

D

(

m u i r a s u F g n á h k h n í

13,6

Hình 3.11. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus sau 72h

Kết quả trên cho thấy: chủng S. pseudogriseolus đều có thể sinh trưởng và

sinh tổng hợp chất kháng nấm ở mức độ khác nhau trên các MT có các nguồn nitơ

khác nhau. Tuy nhiên, đối với những nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men và

pepton thì hoạt chất kháng nấm không cao bằng những nguồn nitơ vô cơ. MT được

bổ sung lần lượt những hợp chất KNO3, (NH4)NO3 và NH4Cl thì chủng XK này lại

có khả năng sinh chất kháng nấm cao hơn. Đặc biệt với nguồn nitơ là KNO3 cho

hoạt tính kháng Fusarium đạt giá trị cao nhất (23,1mm). Chúng tôi cho rằng có lẽ

- và NH4

với nguồn nitơ hữu cơ, XK không thể hấp thụ trực tiếp được phải qua quá trình + thì XK mới sử dụng được [1]. Trong MT lên chuyển hóa về dạng NO3

men, nguồn nitơ này đóng vai trò là thành phần nguyên liệu cho sự tổng hợp các sản

phẩm của tế bào, giúp tế bào thực hiện quá trình trao đổi chất và điều hòa quá trình

chuyển hóa các sản phẩm trao đổi chất bậc 2.

Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi không phù hợp với một số tác giả trước

đây. Chứng tỏ các chủng XK có thể có nhu cầu khác nhau về nguồn nitơ. Trong thí

nghiệm này, chủng S. pseudogriseolus sử dụng KNO3 để sinh tổng hợp hoạt tính

kháng Fusarium cao nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn KNO3 làm nguồn nitơ cho những

nghiên cứu tiếp theo.

3.4.5. Ảnh hưởng của hàm lượng KNO3

Cũng tương tư như hàm lượng cacbon, hàm lượng nitơ cho vào MT nuôi cấy

cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng XK. Chúng

tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitơ trong MT bằng cách bổ sung

2% (v/V) chủng S. pseudogriseolus đã được nhân giống vào bình tam giác 250 ml

chứa 50 ml MT Guase – 1 với 20 g tinh bột tan và bổ sung thay thế theo thứ tự

nguồn nitơ tương ứng là 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07g KNO3. Kết quả được thể hiện

ở bảng 3.6 và minh họa trên hình 3.12.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng KNO3 đến hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus tại 72 h

Hoạt tính kháng Fusarium (D – d, mm)

Hàm lượng KNO3 (g) 0,03 8,530 ± 0,29

17,33 ± 0,81 0,04

23,10 ± 0,21 0,05

23,50 ± 0,43 0,06

25,00 ± 0,08 0,07

m u

)

m m

,

d -

D

(

i r a s u F g n á h k h n í t t

Hình 3.12. Đồ thị ảnh hưởng hàm lượng KNO3 đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus

Kết quả thu được cho thấy, chủng S. pseudogriseolus có khả năng sinh tổng

hợp chất kháng nấm ở các hàm lượng khác nhau của nguồn nitơ. Hoạt tính kháng

nấm của chủng nghiên cứu tỉ lệ thuận với hàm lượng KNO3 bổ sung vào MT lên

men. Trong đó, với 0,03 g KNO3 trong MT lên men thì hoạt kháng nấm của chủng

S. pseudogriseolus không cao. Chứng tỏ với hàm lượng nitơ quá ít không đủ cho

nhu cầu sinh trưởng và tạo các sản phẩm trao đổi bậc 2, trong có chất kháng

Fusarium. Hoạt tính kháng nấm của chủng XK rất mạnh (25 mm) khi nguồn ntiơ bổ

sung vào là 0,07 g. Theo chúng tôi, nếu bổ sung vào MT lên men nguồn nitơ thích

hợp với hàm lượng vừa đủ thì có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và tạo ra chất

kháng Fusarium cho chủng XK nghiên cứu.

Như vậy, bổ sung 0,07 g KNO3 sẽ cho hoạt tính kháng nấm cao nhất so với

các mức thí nghiệm chúng tôi khảo sát.

3.4.6. Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy

pH ban đầu của MT có vai trò trọng trong quá trình sinh tổng hợp chất kháng

sinh của VSV. Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu bằng lên

men chủng XK trên MT Guaze – 1 (với 20 g tinh bột tan, 0,07 g KNO3) đã được

điều chỉnh pH ở các mức 6; 6,5; 7; 7,5 và 8 bằng NaOH 1N và HCl 1N. Sau 72 h,

tiến hành xác định hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Kết quả

được trình bày trong bảng 3.7 và minh họa hình 3.13.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng pH ban đầu của MT lên hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus sau 72h

pH ban đầu

Hoạt tính kháng Fusarium (D – d, mm) 16,0 ± 0,62

6,0

6,5 18,1 ± 0,37

25,1 ± 0,28 7,0

7,5 8,0 20,2 ± 1,43 9,03 ± 1,40

)

m m

,

d -

7,5

6,5

D

(

m u i r a s u F g n á h k h n í t

Hình 3.13: Ảnh hưởng pH ban đầu của MT lên hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus

Qua khảo sát, chúng tôi nhận thấy chủng S. pseudogriseolus có khả năng sinh

hoạt chất kháng nấm ở hầu hết các điều kiện pH khảo sát. Đặc biệt hoạt tính cao

nhất ở pH 7 và giảm dần ở pH 7,5 và 8. Có thể pH 7 đã có ảnh hưởng quan trọng

đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng XK này. Đặc biệt, còn ảnh hưởng đến sự

tạo thành các sản phẩm trung gian, sự phân li, sự hòa tan các chất trong môi trường

từ đó ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm và hoạt tính của chất

này. Nhiều công trình nghiên cứu cho biết pH thích hợp cho XK sinh hoạt tính

kháng nấm thường là pH trung tính, còn pH axit hay kiềm đều làm ức chế quá trình

tổng hợp hoạt chất này [1].

Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của các tác giả Bùi Thị Việt Hà

(2006), Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006), Bùi Thị Hà (2008) khi xác định pH ban

đầu của môi trường nuôi cấy thích hợp cho XK sinh hoạt chất kháng nấm trong

khoảng pH từ 6,5 – 7,5.

3.4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp các chất

có hoạt tính sinh học, trong đó có kháng sinh. Vì vậy, chúng tôi tiến hành lên men

chủng S. pseudogriseolus MT Guaze – 1 (20 g tinh bột tan, 0,07 g KNO3) với pH 7, trên máy lắc ở các mức nhiệt độ khác nhau 25, 28, 30, 35, 370C. Sau 72 h, chúng tôi

tiến hành xác định hoạt tính kháng nấm của chủng này bằng phương pháp khoan lỗ

thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8 và minh họa hình 3.14.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng nhiệt độ của MT lên hoạt tính kháng Fusarium của chủng

S. pseudogriseolus sau 72 h

Hoạt chất kháng Fusarium

Nhiệt độ (oC) (D –d, mm)

18,0 ± 0,37 25

19,1 ± 1,51 28

21,0 ± 0,96 30

25,3 ± 0,29 35

19,1

18,5 ± 1,08 37

)

m m

,

d -

D

(

m u i r a s u F g n á h k h n í

Hình 3.14. Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng Fusarium của chủng

S. pseudogriseolus

Ở các mức nhiệt khảo sát, chúng tôi nhận thấy hoạt tính kháng nấm của chủng XK đạt mức khá cao, dao động từ 18 – 25, 3 mm và cao nhất ở mức 350C ( 25,3 mm). Kết quả này phù hợp với hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng 350C là

nhiệt độ thích hợp cho XK sinh chất kháng sinh. Đặc biệt là nghiên cứu của tác giả

H Nishimura và H Otsuka (1969) đã kết luận chủng S. pseudogriseolus có thể sinh kháng sinh tsushimycin cao khi nuôi cấy ở nhiệt độ từ 30 – 350C.

3.4.8. Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng nấm của

chủng S. pseudogriseolus

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành lên men chủng S.

pseudogriseolus với các điều kiện thích hợp ở trên là: môi trường Guaze – 1, tinh bột tan 20 g, KNO3 0,07 g, ở nhiệt độ lên men 350C, pH 7, thời gian từ 12 - 144 h. Cứ sau 12 h tiến hành xác định sinh khối, độ pH dịch lên men và hoạt tính kháng

nấm của chủng XK nghiên cứu. Vẽ đồ thị động học của quá trình lên men tổng hợp

chất kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus trong thời gian là 12 đến 144 h.

Kết quả trình bày ở bảng 3.9 và minh họa hình 3.15.

Bảng 3.9. Động học quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng nấm Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus

Thời gian (h) 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 7,02 7,04 7,09 7,13 7,15 7,20 7,38 7,50 7,00 6,51 6,00 5.80 Sinh khối XK (g/l) 0,200 ± 0,01 4,310 ± 0,11 5,720 ± 0,02 8,600 ± 0,20 11,50 ± 0,10 13,78 ± 0,08 13,10 ± 0,40 12,53 ± 0,17 11,20 ± 0,20 10,40 ± 0,60 8,630 ± 0,63 7,600 ± 0,30 Hoạt tính kháng Fusarium (D –d, mm) 2,330 ± 0,62 4,720 ± 0,15 9,900 ± 0,7 17,00 ± 0,41 18,00 ± 0,71 25,20 ± 0,71 24,27 ± 0,90 23,50 ± 0,41 12,20 ± 0,78 7,530 ± 0,61 6,900 ± 0,08 3,670 ± 1,25

Sinh khối (g/l)

Hoạt chất kháng Fusarium (D-d, mm)

15,0

12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0

108

120

132

144

Hình 3.15: Động học quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus theo thời gian

Kết quả trên đồ thị cho thấy, trong thời gian từ 12 – 24 h lượng sinh khối của

chủng nghiên cứu tăng chậm. Đây là pha mở đầu trong chu kì sinh trưởng của

chủng XK. Trong pha này, chủng S. pseudogriseolus bắt đầu thích nghi với MT và

bắt đầu hình thành nên hệ enzym cảm ứng để phân giải tinh bột tạo ra các sản phẩm

trung gian cung cấp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng. Từ 24 – 72 h,

có thể xem đây là pha logarit. Lúc này, chủng XK đã thích nghi với MT sống và sử

dụng cơ chất để sinh trưởng với tốc độ nhanh. Hệ sợi của XK phát triển to, chắc, có

nhiều bào tử đảm và lượng ARN cao [1]. Thời gian từ 72 – 96 h được xem là pha

cân bằng vì sinh khối của chủng nghiên cứu không tăng nữa. Sau đó, sinh khối của

chủng giảm mạnh từ sau 96 – 144 h và được xác định là pha suy vong. Hệ sợi của

XK trở nên mảnh hơn và hàm lượng ARN trong sợi thấp hơn do nguồn dinh dưỡng

bị cạn kiệt đồng thời các sản phẩm trao đổi chất, các chất độc hại được tạo ra nhiều

hơn [1].

Cũng từ kết quả đồ thị cho thấy: ở pha mở đầu, hoạt tính kháng nấm của

chủng XK yếu, bắt đầu tăng dần ở pha logarit và đạt giá trị cao trong pha cân bằng

(72 – 96 h). Đặc biệt, cao nhất ở 72 h (25,2 mm). Điều này hợp lý vì khả năng sinh

các sản phẩm trao đổi chất bậc trong đó có chất kháng sinh của VSV thường là cuối

pha logarit, đầu pha cân bằng [1]. Sau đó, hoạt tính kháng nấm giảm dần ở pha suy

vong (96 – 144 h). Cùng với sự biến đổi của hoạt tính kháng nấm thì pH cũng thay

đổi. Tuy nhiên, pH trong giai đoạn từ 12 – 72 h không thay đổi nhiều. Ở 72 h, pH

của MT lên men đạt giá trị (pH 7,2) là mức pH ở đó sinh khối và hoạt tính kháng

Fusarium của chủng cao nhất. Từ 96 – 144 h, pH giảm mạnh vì đây là pha suy

vong.

Qua quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy chủng S. pseudogriseolus có thể

sinh hoạt chất kháng nấm mạnh nhất trong điều kiện pH 7,2; thời gian có thể kéo

dài từ 72 – 96 h và tốt nhất là 72 h. Kết quả này có thay đổi chút ít so với khảo sát

ban đầu là pH 7 và thời gian 72 h. Điều này chứng tỏ các số liệu chúng tôi đã thu

nhận được trên đây là có thể chấp nhận được.

Như vậy, điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm

của chủng S. pseudogriseolus có thể tiến hành lên men:

- Môi trường Guaze – 1, với 20g tinh bột tan, 0,07g KNO3

- pH ban đầu 7,2

- Thời gian lên men từ 72 – 96 h, để thu sinh khối chủng nghiên cứu có thể lên

men trong điều kiện trên và kết thúc sau 72 h.

- Nhiệt độ MT lên men 350C.

3.5. Tách chiết chất kháng nấm

Sau khi lên men S. pseudogriseolus trên môi trường Guaze – 1 với các điều

kiện thích hợp ở trên, sau 72 h, tiến hành ly tâm dịch lên men để tách sinh khối và

dịch lên men nhằm thu chất kháng nấm.

- Khi tách chiết chất kháng nấm từ sinh khối được thực hiện theo phương pháp

ở phần 2.2.8. Dùng dung môi vừa chiết được thử hoạt tính kháng nấm Fusarium

bằng phương pháp khoan lỗ thạch.

- Tách chiết chất kháng nấm từ dịch lên men được thực hiện theo phương pháp

ở phần 2.2.8. Tiến hành thử hoạt tính kháng nấm Fusarium bằng phương pháp

khoan lỗ thạch. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.10, 3.11 và minh họa hình 3.16;

3.17.

Bảng 3.10. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus được chiết

bằng các dung môi hữu cơ từ sinh khối

Nguồn Hoạt tính kháng Dung môi chiết Fusarium (D – d, mm)

Metanol 20,0 ± 1,37

Etyl axetat 18,3 ± 0,62 Sinh khối Axeton 24,0 ± 0,75

Etanol 25,3 ± 0,51

)

m m

,

18,3

d -

D

(

m ấ n g n á h k h n í t t ạ

Hình 3.16. Biểu đồ hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus

được chiết bằng các dung môi hữu cơ từ sinh khối

Kết quả bảng trên cho thấy:

Khi tiến hành tách chiết chất kháng nấm từ sinh khối thì 2 loại dung môi

axeton và etanol đạt hiệu quả cao. Trong đó, etanol cho hiệu quả cao nhất (25,3

mm), hơn nữa dung môi này không độc với người sử dụng và là một sản phẩm dễ

tìm kiếm trên thị trường với giá thành thấp. Vì vậy, chúng tôi chọn etanol làm dung

môi để thu chất kháng nấm từ sinh khối.

Bảng 3.11. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus được chiết

bằng các dung môi hữu cơ từ dịch lên men

Hoạt tính kháng Nguồn chiết Dung môi Fusarium (D – d, mm)

n – butanol 21,47 ± 0,62

Etyl axetat 23,00 ± 0,39 Dịch lên

n – propanol men 19,00 ± 0,45

Iso – butanol 18,30 ± 0,33

)

21,47

m m

,

d -

D

(

m ấ n g n á n h k h n í t t ạ o

Hình 3.17. Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus được chiết

bằng các dung môi hữu cơ từ dịch lên men

Đối với dịch lên men chủng S. pseudogriseolus, dung môi etyl axetat cho hiệu

quả cao nhất (23 mm).

Kết quả này hoàn toàn phù hợp các kết quả nghiên cứu của các tác giả Bùi Thị

Việt Hà (2006) và Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006) về việc lựa chọn etanol để tách

chiết chất kháng Fusarium từ sinh khối và dung môi etyl axetat để tách chất kháng

nấm từ dịch lên men. Như vậy, chất kháng nấm nằm trong cả dịch lên men lẫn sinh

khối. Tuy nhiên trong sinh khối chất kháng nấm nhiều hơn.

Vì vậy, chúng tôi chọn etanol làm dung môi để thu chất kháng nấm từ sinh

khối, dung môi etyl axetat để tách chất kháng nấm từ dịch lên men của chủng này.

Hình 3.18: Dịch lên men của chủng S. pseudogriseolus

3.6. Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm

của hạt và sự phát triển của cây cà chua trong phòng thí nghiệm

 Sự nảy mầm của hạt:

Để xác định được ảnh hưởng nồng độ dịch lên men chủng XK nghiên cứu tới

khả năng nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây chúng tôi bố trí thí nghiệm như

- Chuẩn bị 6 đĩa Petri có lót bông thấm nước

- Pha loãng dịch lên men với nước cất để đạt các nồng độ: 1; 10; 20; 50 và

100%.

- Ngâm hạt cà chua vào dịch lên men pha loãng ở các nồng độ trên, sau 24 h

vớt ra đặt vào các đĩa Petri đã chuẩn bị. Mỗi hộp đặt 150 hạt cà chua và để ở nhiệt

độ phòng. Đối chứng ngâm hạt trong nước cất.

Quan sát sự nảy mầm của hạt sau 4 ngày và sự sinh trưởng của cây sau 7 ngày.

Kết quả được minh họa trong bảng 3.12 và hình 3.19; 3.20.

Bảng 3.12. Tỉ lệ nảy mầm của hạt khi ngâm ở dịch lên men ở các nồng độ khác

nhau

Nồng độ Số hạt nảy Tỉ lệ % hạt nảy

dịch lên men (%) mầm/150 hạt mầm

140 ± 4,08 93,3 Nước cất (ĐC)

130 ± 8,16 86,7 1

51,0 ± 3,74 80,0 10

120 ± 4,08 34,0 20

21,0 ± 2,16 14,0 50

0,00 0,00 100

)

93,3

100

86,7

%

(

m ầ m y ả n t ạ h ệ l

Hình 3.19. Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men đến khả năng nảy

mầm của hạt cà chua

Kết quả thu được cho thấy, xử lý hạt bằng dịch lên men của chủng S.

pseudogriseolus với các nồng độ khác nhau sẽ có ảnh hưởng khác nhau đến tỉ lệ nảy

mầm của hạt. Khi tăng dần nồng độ dịch lên men từ 1 – 100% thì tỉ lệ nảy mầm của

hạt giảm từ 86,7 xuống 0%. Với nồng độ dịch lên men không pha loãng (nồng độ

100%) thì khả năng nảy mầm của hạt cà chua đã bị ức chế hoàn toàn. Ở nồng độ

dịch lên men 1% thì tỉ lệ nảy mầm của hạt tăng (86,7%). Tuy nhiên, tỉ lệ này vẫn

thấp hơn 6,6% so với đối chứng (93,3%). Điều này có thể do chất lượng hạt giống

chưa phải là tốt nhất. Do đó, tỉ lệ nảy mầm của hạt cà chua ở đối chứng không cao.

Hơn nữa, có thể do nồng độ dịch lên men thích hợp cho sự nảy mầm của hạt thấp

hơn 1% mà chúng tôi chưa khảo sát tới.

Nước cất 1% 10%

20% 50% 100%

Hình 3. 20. Tỉ lệ nảy mầm của hạt khi xử lý ở dịch lên men chủng S.

pseudogriseolus ở các nồng độ khác nhau

 Sự phát triển chiều cao và hệ rễ của cây cà chua

Theo dõi sự phát triển của cây cà chua sau khi ngâm hạt ở các nồng độ tương

ứng trên kết quả được ghi nhận ở bảng 3.13 và hình minh họa 3.21; 3.22.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của dịch lên men lên khả năng sinh trưởng của cây cà

chua

Sự phát triển Sự thay đổi Nồng độ

của rễ Sự phát triển chiều cao so dịch lên Chiều cao

của cây con với đối chứng men (%) cây con (cm)

(cm)

Phát triển khá Phát triển mạnh, Nước cất 3,0 – 4,0 đồng đều đồng đều

Bằng nhau Phát triển khá Phát triển khá 1 3,0 – 4,0 đồng đều mạnh

Phát triển Phát triển không

không đồng đồng đều 10 2,5 – 3,0 0,5 – 1,0

đều

Phát triển Phát triển chậm

chậm, không 1,0 – 2,5 1,5 – 2,0 20

đồng đều

0,5 – 1 2,5 – 3,0 Kém phát triển Kém phát triển 50

Hạt không 100 nảy mầm

Kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy khi nồng độ lên men quá cao không

những ức chế sự nảy mầm của hạt mà còn kìm hãm sự phát triển của cây con. Ở

nồng độ 50% chiều cao cây con chỉ đạt từ 0,5 – đến 1 cm, hệ rễ của cây kém phát

triển, cây sinh trưởng rất yếu. Khi nồng độ dịch lên men giảm dần thì khả năng sinh

trưởng của cây cũng tăng lên, hệ rễ phát triển mạnh hơn. Khi nồng độ ở 1% thì sự

phát triển của không chênh lệch nhiều với đối chứng.

Vì vậy, nếu xử lý hạt cà chua bằng dịch lên men ở nồng độ 1%:

+ Khả năng nảy mầm của hạt 86,7% thấp hơn đối chứng 6,6 % (sau 4 ngày).

+ Chiều cao của cây từ 3 – 4 cm, hệ rễ phát triển khá mạnh, đồng đều tương

đương với đối chứng (sau 7 ngày).

Nước cất 1% 10%

20% 100%

50%

Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men đến khả năng sinh trưởng

của cây cà chua

100% 50% 20%

10% Nước cất 1%

Hình 3.22. Ảnh hưởng của dịch lên men đến sự phát triển của rễ cây cà chua

3.7. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng Fusarium của dịch lên men chủng

XK trên cây cà chua trong chậu thí nghiệm

Tiến hành gieo trồng, gây nhiễm nấm bệnh và sử dụng dịch lên men ở nồng

độ 100% của chủng S. pseudogriseolus trên cây cà chua như phần 2.2.10.

- ĐC 1 (đối chứng 1): không gây nhiễm Fusarium, không bổ sung dịch lên của

chủng XK nghiên cứu vào đất trồng và hạt giống.

- ĐC 2 (đối chứng 2): sau khi gieo hạt 5 ngày tiến hành gây nhiễm Fusarium

vào đất và không xử lý dịch lên men của chủng XK.

 Để xác định khả năng phòng Fusarium nhờ chất kháng nấm của XK chúng

tôi tiến hành thí nghiệm 1:

- TN 1 (thí nghiệm 1): không ngâm hạt trong dịch lên men của XK mà bổ

sung trực tiếp vào đất trước khi trồng cây con. Sau 5 ngày trồng cây con, phun dịch

Fusarium lên cây. Cứ cách 4 ngày 1 lần, chúng tôi tiếp tục bổ sung dịch lên men

XK và dịch nấm như đã thực hiện cho đến 28 ngày.

 Để xác định khả năng trừ Fusarium nhờ chất kháng nấm của XK chúng tôi

tiến hành thí nghiệm 2 như sau:

- TN 2 (thí nghiệm 2): không ngâm hạt trong dịch lên men của XK. Tiến hành

gây nhiễm Fusarium vào đất khi trồng cây con. Sau khi thấy xuất hiện dấu hiệu

bệnh đầu tiên, bắt đầu phun dịch lên men của XK. Cách 4 ngày 1 lần tiếp tục bổ

sung dịch nấm và dịch lên men XK cho đến 28 ngày.

Theo dõi các dấu hiện bệnh cây sau mỗi tuần (tuần 1 - 4). Đến cuối tuần thứ 4,

tiến hành thống kê lượng cây bị nhiễm bệnh trên các lô đối chứng và thí nghiệm.

Kết quả như sau:

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng ức chế Fusarium trên cây

cà chua

Tổng số cây Số sây bị bệnh Tỉ lệ (%)

Lô TN ĐC 1 ĐC 2 TN 1 TN 2 50 50 50 50 0 36 ± 7,87 24 ± 3,56 17 ± 0,82 0,0 72,0 48,0 34,0

Hình 3.23. Cây cà chua sinh trưởng bình thường sau thời gian

d. 4 tuần a. 1 tuần b. 2 tuần c. 3 tuần

Hình 3.24. Cây cà chua bị nhiễm Fusarium sau thời gian

a. 1 tuần b. 2 tuần c. 3 tuần d. 4 tuần

Hình 3.25. Cây cà chua sau 4 Hình 3.26. Cây cà chua sau 4 tuần

ở lô ĐC 2 tuần ở lô ĐC 1

Hình 3.28. Cây cà chua sau 4 tuần ở

Hình 3.27. Cây cà chua sau 4 tuần ở lô TN1 lô TN2

Theo dõi biểu hiện bệnh của cây: ở lô ĐC 1 cây sinh trưởng, phát triển bình

thường sau 4 tuần theo dõi. Ở các lô còn lại sau 2 tuần, cây cà chua con bị nhiễm

Fusarium xuất hiện triệu chứng lá cây bắt đầu bị vàng ở phần sát gốc thân, thân cây

chuyển sang màu nâu. Đến tuần 3, dấu hiệu vàng lá bắt đầu lan rộng ra, phần gốc

cây có màu nâu sậm. Tuy nhiên đến tuần thứ 4 cây cũng chỉ có những dấu hiệu như

tuần 3. Khi thống kê số lượng cây bị bệnh dựa trên những dấu hiệu trên cho thấy: ở

lô ĐC 1, chúng tôi tiến hành trồng cà chua mà không gây nhiễm nấm Fusarium,

không bổ sung dịch lên men XK thì cây sinh trưởng và phát triển bình thường. ĐC 2

sau khi gieo hạt 5 ngày tiến hành gây nhiễm nấm Fusarium mà không bổ sung dịch

nuôi cấy XK thì có 32 cây bị bệnh (72%). Đối với lô TN 1 với mục đích kiểm tra

khả năng phòng Fusarium từ dịch lên men XK, chúng tôi đã chủ động bổ sung dịch

này vào đất trước khi trồng cây. Dịch lên men có khả năng kiểm soát và tiêu diệt

các mầm bệnh trong đất, trong đó có Fusarium. Kết quả, số lượng cây bị bệnh 24

(48%) giảm 24% so với đối chứng. Ở lô TN 2 nhằm kiểm tra khả năng trị

Fusarium, chúng tôi đã phun trực tiếp dịch lên men lên cây bị nhiễm Fusarium và

số cây bị nhiễm bệnh là 17 (34%), giảm 38% so với đối chứng. Chứng tỏ dịch lên

men từ XK có khả năng sinh hoạt chất kháng nấm nhưng hiệu lực chưa cao. Nguyên

nhân có thể do hoạt tính kháng nấm bị ảnh hưởng bởi điều kiện ngoại cảnh không

phù. Hơn nữa, trong giai đoạn chúng tôi tiến hành thí nghiệm là thời điểm điều kiện

thời tiết bất lợi, mưa dầm có thể rửa trôi 1 lượng dịch lên men XK. Tuy nhiên, đây

cũng là số liệu tham khảo bước đầu cho thấy chủng S. pseudogriseolus có tác dụng

trong việc phòng trừ Fusarium gây hại trên cây cà chua.

Như vậy từ thử nghiệm này cho thấy, có thể sử dụng dịch kháng nấm của

chủng S. pseudogriseolus trong phòng và trị bệnh do Fusarium trên cây cà chua.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được kết quả sau:

1. Từ các mẫu đất trồng rau tại ấp Long Giêng, xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc,

Long An thu thập được, chúng tôi đã phân lập được 32 chủng xạ khuẩn. Đã tuyển

chọn được 1 chủng XK có hoạt tính kháng Fusarium mạnh nhất trong số 8 chủng có

tính kháng nấm này được kí hiệu là D7.

2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại bằng phương pháp sinh

học phân tử cho biết chủng này có tên khoa học là Streptomyces pseudogriseolus

D7.

3. Đã khảo sát các điều kiện lên men thích hợp cho chủng S. pseudogriseolus

sinh hoạt chất kháng Fusarium: môi trường Guaze – 1, với thành phần 20 g tinh bột, 0,07 g nitơ, pH là 7, nhiệt độ 350C với thời gian lên men là 72 h.

4. Đã xác định được etanol (với tỷ lệ 1:1) là dung môi thích hợp nhất để tách

chiết chất kháng Fusarium từ sinh khối XK và etyl axetat là dung môi để tách chiết

chất kháng nấm từ dịch lên men của chủng S. pseudogriseolus (với tỷ lệ 1:1).

5. Kết quả bước đầu thử nghiệm tác dụng của chủng S. pseudogriseolus trong

phòng trừ Fusarium trên cây cà chua cho thấy:

- Ở quy mô phòng thí nghiệm, tỷ lệ nảy mầm của hạt khi xử lý hạt giống bằng

dịch lên men chủng XK ở nồng độ 1% sẽ cho:

+ Tỉ lệ nảy mầm của hạt đạt 86,7 %, thấp hơn 6,6% so với đối chứng (sau

4 ngày).

+ Chiều cao cây và sự phát triển hệ rễ sau 7 ngày tương đối mạnh, đồng

đều so với đối chứng.

- Ở quy mô chậu thí nghiệm, khi bổ sung dịch lên men XK với nồng độ 100%

vào cây cà chua bị nhiễm nấm sau 4 tuần:

+ Tác dụng phòng nấm và làm giảm số cây bị bệnh so với đối chứng là

24%

+ Tác dụng trị nấm và tổng số cây bị bệnh giảm 38% so với đối chứng.

 Kiến nghị:

- Tiếp tục xử lý hạt giống ở nồng độ thấp hơn 1% dịch lên men với sự nảy

mầm của hạt và sự phát triển của thân và rễ cây cà chua.

- Xác định lượng sinh khối Fusarium cần thiết gây nhiễm hiệu quả trên cây

chua.

- Thử nghiệm quy mô rộng lớn tác dụng phòng trừ Fusarium từ dịch lên men

trên cây cà chua.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Tiếng Việt

1. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa

học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr. 90-91, 102-105, 121-136

2. Nguyễn Trọng Cẩn (1998), Công nghệ enzym, NXB Nông nghiệp, Tp. HCM,

tr. 25-50, 152-163.

3. Đường Hồng Dật (1969), Khoa học bệnh cây, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà

Nội, tr 66-68.

4. Nguyễn Lân Dũng và cs (2012), Vi sinh vật học (tập 1, 2), NXB Khoa và Kỹ

thuật, Hà Nội, tr. 103-112, 123-127.

5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2008), Vi sinh vật học,

NXB Giáo dục, tr 39 – 41, 69 – 71.

6. Lê Xuân Dân (2013), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng tụ cầu vàng

Staphylococcus aureus phân lập từ đất rừng ngập mặn Thái Bình và Nam

Định, Luận văn Thạc sĩ, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

Hà Nội, tr. 10-18.

7. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998), Bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông nghiệp,

Hà Nội, tr. 33-47.

8. Đặng Văn Giáp (2007), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS –

Excel, NXB Giáo dục, tr. 21-29.

9. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm

gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 3-48, 54-64.

10. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất

kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên, Luận văn Thạc

sĩ Sinh học, Trường Đại học Thái Nguyên, tr. 3-8.

11. Phan Thúy Hiền, Lester W. Burgess, Timothy E. Knight, Len Tesoriero (2009),

Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam, NXB Trung tâm Nghiên cứu

Nông nghiệp quốc tế Australia, tr 88-92, 116-132.

12. Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006), “Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ

khuẩn Streptomyces dicklowii”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học

Sư phạm TP. Hồ Chí Minh, tr. 20-26, 54-58.

13. Lê Thị Hoa (1998), Nghiên cứu khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực

vật (IAA) của xạ khuẩn , luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Hà Nội,

tr. 25-37.

14. Lê Mai Hương, (1993), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập ở

Hà Nội và vùng phụ cận, Luận án Tiến sĩ, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội,

tr. 8-14.

15. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất

kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam,

Luận án Tiến sĩ, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, tr. 12-19.

16. Nguyễn Khang (2005), Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y học, Hà Nội, tr. 25-

35, 138-152.

17. Nguyễn Đức Lượng và cs (2006), Thí nghiệm Công nghệ sinh học (tập 1, 2),

NXB Đại học Quốc gia, Tp.HCM, tr. 30-34, 38-41, 57.

18. Phạm Thị Lịch (2013), Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ

chủng Trichoderma sp. Phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua, Luận văn

Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm TP.HCM, tr. 79-82.

19. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), “Điều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có

khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn”, báo

cáo kết quả thực hiện đề tài KHCN đặc biệt cấp ĐHQG Hà Nội – Viện Vi

sinh vật và Công nghệ sinh học, tr. 16-20.

20. Phạm Thị Thùy (2004), Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, NXB Đại

học Quốc gia Hà Nội.

21. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục,

tr 35 – 47.

22. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), Bảo vệ cây trồng

bằng các chế phẩm từ vi nấm, NXB Nông nghiệp, tr.144-153.

23. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu

thực nghiệm trong nông lâm nghiệp trên máy tính, NXB Nông nghiệp, tr. 37-

24. Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2003), Một số dịch hại chính trên cây

trồng tại TP. Hồ Chí Minh, TP.HCM, tr. 124-136.

25. Viện công nghệ sinh học (2011), Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất

kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis,Tạp chí sinh học

– Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

 Tiếng Anh

26. Abdel-Aziz, Mohamed S., Talkhan, Fatma N., Fadel, Mohamed, AbouZied,

Azza A., Abdel-Razik, Ahmed S. (2005), “Improvement of Xylanase

Production from Streptomyces Pseudogriseolus via UV Mutagenesis”

Australian Journal of Basic & Applied Sciences;2011, Vol. 5 Issue 5, p1045,

pp. 1-4.

27. Annaliesa S. Anderson and Elizabeth M. H. Wellington (2001), “The taxonomy

of Streptomyces and related Genera”, Inter. J. Sys. Evol. Microbiol 51, pp.

797 – 814.

28. Basavaraj K Nanjwade, S Chandrashekhara, Prakash S, Goudanavar, Ali M

Shamarez1 and Fakirappa V Manvi, (2010), “Production of Antibiotics from

Soil-Isolated Actinomycetes and Evaluation of their Antimicrobial

Activities”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, Nigeria, pp. 1-8.

29. Bảo-Xin Zhang , Zhang Hui , Xiang-Jing Wang , Ji-Dong Wang , Chong-Xi

Liu và Wen-Sheng Xiang, (2011), New milbemycins from

mutant Streptomyces bingchenggensis X-4, The Journal of Antibiotics, Japan,

pp. 1-3.

30. Bugress L.W, Liddell C.M, Summerell B.A (1998), “Laboratory manual for Fusarium research”, 2nd Edition, University of Sydney, Australia, pp.156-

160.

31. R.Craveri, LR Hill, P.L. Manachini and L.G. Silvestr, (1965),

“Deoxyribonucleic Acid Base Compositions among Thermophilic

Actinomycete”, Printedin Great Britain, pp. 335-339.

32. Dylan C Alexander, Jessica Rock, Jian-Qiao Gu, Carmela Mascio, Min Chu,

Paul Brian and Richard H Baltz, “Production of novel lipopeptide antibiotics

related to A54145 by Streptomyces fradiaemutants blocked in biosynthesis of

modified amino acids and assignment of lptJ , lptK andlptL gene functions ”,

The Journal of Antibiotics, USA, PP. 1-4.

33. Muhammad Nasir Subhani, Shahbaz Talib Sahi, Liaqat Ali, Safdar Hussain1,

Javaid Iqbal1 and Nisar Hussain, (2003), “Management of Chickpea wilt

caused by Fusarium oxysporium f. sp. miceris through antagonistic

34. Hamada.M., Hasimoto, T., Takahashi, S., Yoneyama, M., Miyake, T., Takeuchi,

microorganisms”, Canadian Journal of Plant Protection. Volume 1, 1, pp.1-6.

Y., Okami, Y, Umezawa, H (1965), “Antimicrobial activity of kasugamycin”,

35. Hélvio Gledson Maciel Ferraz, Renata Sousa Resende, Patrícia Ricardino

J. Antibiot, 18, pp. 104-106.

Silveira, Camila Cristina Lage Andrade, Elisângela Aparecida Milagres, José

Rogério Oliveira, Fabrício de Ávila Rodrigues, (2014), “Rhizobacteria

induces resistance against Fusarium wilt of tomato by increasing the activity

of defense enzymes”, Bragantia vol.73 no.3 Campinas.

36. H Nishimura, H Otsuka (1969), “Antibiotic tsushimycin and production

thereof”, BiBTex, Endnote, USA, US3781420A, pp. 1-5.

37. Hoe Do Van, (2005), “ Renewals of pesticide policies in Vietnam”, In Forum

on China pesticide export development strategy, pp. 35-50.

38. Hotam Singh Chaudhary, Bhavana Soni, Anju Rawat Shrivastava, Saurabh

Shrivastava, (2013), “Diversity and Versatility of Actinomycetes and its Role

in Antibiotic Production”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, India,

vol. 3 pp. 83-94.

39. Igarashi Y, Futamata K, Fujita T, Sekine A, Senda H, Naoki H, Furumai T

(2003), “Yatakemycin, a novel antifungal antibiotic produced by

Streptomyces sp. TP-A0356”, The Journal of Antibiotics, Janpan, pp. 107-

113.

40. Jin Cheol Yoo, Jun Ho Kim, Jung Wan Ha, Nae Soo Park, Jae Kyung Sohng,

(2007), “Production and Biological activity of laidlomycin, anti –

MRSA/VRE antibitotic from Streptomyces sp. CS684”, The Jounrnal of

Microbiology, Korea, pp. 6-10.

41. Joachim Mueller, Roger A. Aeschbacher, Astrid Wingler, Thomas Boller, and

Andres Wiemken (2001), “Trehalose and Trehalase in Arabidopsis”, Plant

physiol, p. 125, pp. 1086-1093.

42. Kampfer, P., Kroppenstedt, RM and Dott, W. (1991), A numerical classification

of the genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized

physiological tests. J. Gen. Microbiol .,p. 137, pp. 1831 – 1891.

43. Komagata, k., and Suzuki K., (1987), “ Lipit and cell wall analysis in bacterial

systematic”, Methods Microbiol, p. 19, pp. 161 – 207.

44. Patricia S. McManus, Virginia O. Stockwell, George W. Sundin, Alan L. Jones

(2002), “Antibiotic use in plant agriculture”, Ann. Rev. Phytopathol, p. 4, pp.

443-465.

45. Puhalla J.E (1985), Classification of strains of Fusarium oxysporum on the

basis of vegetatative compatibility, Australian Centre for International

Agricutural Research (ACIAR), 24, pp. 135-145.

46. Selman Waksman A., Hubert A. Lechevalier, (1962), “Antibiotics of

Actinomycetes”, vol. 3, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, pp. 5-12, 114-

122.

47. Sheo B. Singh, John F. Barrett, (2006), “Emprical antibacterial drug discovery

– Foundation in natural products, Natural Products Chemistry”, Biochemi

pharmacol xxx, pp. 1-10.

48. Tashiro, N., K. Miyashita, and T. Suzui (1990), “Taxonomic studies on the

Streptomyces species isolated as causal organisms of potato scab”, Ann.

Phytopathol. Soc. Jpn, p. 56, pp. 73-82.

49. Thomas. R.M, J.A. Turner, (1998), “ A review of changes in fungicide use on winter wheat” in England & Wales 1970 – 1996, 7th International Congress

Plant Pathol. Edinburgh, pp. 45-50.

50. Tresner. H. D, Buckus. E. J (1963), “System of color wheels for Streptomyces

taxonomy”, Appl. Microbiol, p.11, pp. 335-338.

51. Waksman, S.A. (1961) “The Actinomycetes, Classification, identification and

descriptions of genera and species”, vol 2, The Williams & Wilkins Co.,

Baltimore, USA, pp. 15-59.

 Internet

52. http://www.fairfaxcounty.gov/nvswcd/newsletter/soilmedicine.htm

PHỤ LỤC

Streptomyces pseudogriseolus strain NBRC 12902 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Sequence ID: ref|NR_112329.1|Length: 1477Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 32 to 1391GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alig nment stati sti cs fo r matc h #1

Phụ lục 1: Bảng so sánh trình tự ARN 16S của chủng D7 với ngân hàng gen NCBI

Score

Expect Identities

Gaps

Strand

2512 bits(1360) 0.0

1360/1360(100%) 0/1360(0%) Plus/Plus

Query 4 AGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGC 63

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 32 AGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGC 91

Query 64 AATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCA 123 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 92 AATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCA 151

Query 124 TCTTGGGCATCCTTGGTGATCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCA 183

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 152 TCTTGGGCATCCTTGGTGATCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCA 211

Query 184 GCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGA 243

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 212 GCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGA 271

Query 244 CCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA 303

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 272 CCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA 331

Query 304 TTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGT 363

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 332 TTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGT 391

Query 364 TGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGG 423

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 392 TGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGG 451

Query 424 CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTG 483

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 452 CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTG 511

Query 484 GGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCC 543

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 512 GGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCC 571

Query 544 GGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGT 603

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 572 GGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGT 631

Query 604 AGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCG 663

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 632 AGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCG 691

Query 664 ATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC 723

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 692 ATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC 751

Query 724 ACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTA 783

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 752 ACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTA 811

Query 784 ACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGAC 843

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 812 ACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGAC 871

Query 844 GGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTAC 903

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 872 GGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTAC 931

Query 904 CAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACA 963

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 932 CAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACA 991

Query 964 GGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 1023

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 992 GGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 1051

Query 1024 CGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACC 1083

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1052 CGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACC 1111

Query 1084 GCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTT 1143

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1112 GCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTT 1171

Query 1144 GGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGA 1203

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1172 GGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGA 1231

Query 1204 ATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGA 1263

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1232 ATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGA 1291

Query 1264 GTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA 1323

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1292 GTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA 1351

Query 1324 CCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCG 1363

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1352 CCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCG 1391

Phụ lục 2: Ảnh hưởng của MT Guaze – 1 đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus theo thời gian

Trung Độ lệch Hoạt tính kháng Fusarium

bình chuẩn Chủng S. pseudogriseolus MT Guaze - 1 Lần 1 Lần 2 Lần 3

2,16 2,50 2,04 2,23 0,14 24 h

13,60 12,90 13,01 13,17 0,31 48 h

21,00 22,05 23,00 22,02 0,82 72 h

20,00 19,09 20,90 20,00 0,74 96 h

8,30 8,10 8,35 8,25 0,11 120 h

6,16 6,10 6,15 6,14 0,03 144 h

Phụ lục 3: Ảnh hưởng của MT Guaze – 2 đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus theo thời gian

Chủng S. Hoạt tính kháng Fusarium Trung Độ lệch pseudogriseolus ( D – d, mm) bình chuẩn MT Guaze - 2 Lần 1 Lần 2 Lần 3

0,46 1,02 1,93 0,90 1,28 24 h

0,24 9,60 9,01 9,22 9,28 48 h

0,73 19,30 19,70 21,01 20,00 72 h

0,36 16,60 15,90 16,70 16,40 96 h

0,14 12,70 12,40 12,40 12,50 120 h

0,26 4,48 4,60 4,00 4,36 144 h

Phụ lục 4: Ảnh hưởng của MT ISP – 1 đến hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus theo thời gian

Chủng S. Hoạt tính kháng Fusarium Trung Độ lệch pseudogriseolus (D – d, mm) bình chuẩn MT ISP - 1 Lần 1 Lần 2 Lần 3

0,98 0,59 1,00 0,86 0,19 24 h

5,02 4,69 3,59 4,43 0,61 48 h

21,30 20,40 18,60 20,10 1,12 72 h

11,90 12,80 10,80 11,83 0,82 96 h

5,70 6,90 6,50 6,37 0,50 120 h

2,80 3,10 1,90 2,60 0,51 144 h

Phụ lục 5: Ảnh hưởng của MT ISP – 4 đến hoạt tính kháng nấm Fusarium của chủng S. pseudogriseolus theo thời gian

Chủng Hoạt tính kháng Fusarium Trung Độ lệch S. pseudogriseolus (D – d, mm) bình chuẩn MT ISP - 4 Lần 1 Lần 2 Lần 3

4,01 2,90 3,20 3,37 0,47 24 h

6,40 5,90 6,20 6,17 0,21 48 h

19,20 20,80 20,00 20,00 0,65 72 h

16,10 14,70 15,70 15,50 0,59 96 h

9,00 7,20 8,00 8,07 0,74 120 h

4,90 7,10 5,50 5,83 0,93 144 h

Phụ lục 6: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S. pseudogriseolus

Nguồn Cacbon Trung bình Độ lệch chuẩn

Hoạt tính kháng Fusarium (D – d, mm) Lần 2 20,00 16,01 19,00 22,90 Lần 3 19,02 15,50 18,20 23,09 Lần 1 18,02 18,00 16,80 23,01 19,01 16,50 18,00 23,00 0,81 1,08 0,91 0,08 Saccarozơ Glucozơ Lactozơ Tinh bột tan

Phụ lục 7: Ảnh hưởng của hàm lượng cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S. pseudogriseolus

Hàm lượng cacbon (g) Trung bình Độ lệch chuẩn

Hoạt tính kháng Fusarium (D –d, mm) Lần 2 9,40 15,80 22,90 19,60 19,01 Lần 1 10,01 16,00 23,01 21,00 17,00 Lần 3 9,30 18,90 23,09 19,40 18,70 9,57 16,90 23,00 20,00 18,24 0,31 1,42 0,08 0,71 0,88 16 18 20 22 24

Phụ lục 8: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh hoạt tính

khángFusarium của chủng S. pseudogriseolus

Nguồn Nitơ Trung bình Độ lệch chuẩn

Lần 1 10,01 14,00 23,01 18,00 18,00 Lần 3 8,50 12,60 23,40 18,90 14,90 8,90 13,60 23,10 18,90 16,63 0,79 0,71 0,21 0,73 1,29 Cao nấm men Pepton KNO3 (NH4)2SO4 NH4Cl

Hoạt tính kháng Fusarium (D – d, mm) Lần 2 8,20 14,20 22,90 19,80 17,00

Phụ lục 9: Ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng

S. pseudogriseolus

Hoạt tính kháng Hàm lượng Trung Độ lệch Fusarium (D – d, mm) nitơ (g) bình chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3

8,90 8,20 8,50 8,53 0,29 0,03

17,80 16,20 18,00 17,33 0,81 0,04

23,01 22,90 23,40 23,10 0,21 0,05

23,90 22,90 23,69 23,50 0,43 0,06

25,00 25,10 24,90 25,00 0,08 0,07

Phụ lục 10: Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng S.

pseudogriseolus

Hoạt tính kháng Fusarium Trung Độ lệch (D –d, mm) pH ban đầu bình chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3

16,80 15,90 15,30 6,0 16,00 0,62

18,60 18,00 17,70 6,5 18,10 0,37

24,90 24,90 25,50 7,0 25,10 0,28

18,50 20,10 22,00 7,5 20,20 1,43

7,90 11,00 8,20 8,0 9,03 1,40

Phụ lục 11: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính khángFusarium của chủng S.

pseudogriseolus

Hoạt tính kháng Fusarium Độ Nhiệt Trung (D – d,mm) lệch bình độ chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3

18,50 17,90 17,60 18,00 0,37 25

19,00 21,00 17,30 19,10 1,51 28

19,70 22,00 21,30 21,00 0,96 30

25,60 24,90 25,39 25,30 0,29 35

17,00 19,00 19,50 18,50 1,08 37

Phụ lục 12: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính kháng Fusarium

của chủng XK theo thời gian

Hoạt tính kháng Fusarium, Thời gian Trung Độ lệch (D – d, mm) bình chuẩn (h) Lần 1 Lần 2 Lần 3

3,00 2,50 1,50 2,33 0,62 12

4,50 4,80 4,85 4,72 0,15 24

10,80 9,80 9,10 9,90 0,70 36

17,50 16,50 17,00 17,00 0,41 48

18,4 17,0 18,6 18,00 0,71 60

25,8 24,2 25,6 25,20 0,71 72

23,0 25,0 24,8 24,27 0,90 84

23,0 24,0 23,5 23,50 0,41 96

13,3 11,7 11,6 12,20 0,78 108

7,5 6,8 8,3 7,53 0,61 120

6.8 6,9 7,0 6,90 0,08 132

4,0 5,0 2,0 3,67 1,25 144

Phụ lục 13: Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S. pseudogriseolus được chiết

bằng các dung môi hữu cơ.

Hoạt tính kháng Fusarium, Trung Độ lệch (D –d, mm) Nguồn chiết bình chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3

Metanol 20,60 21,30 18,10 20,00 1,37

Etyl axetat 18,40 19,00 17,50 18,30 0,62

Axeton 24,80 23,00 24,20 24,00 0,75 Sinh khối

Etanol 25,50 24,60 25,80 25,30 0,51

21,47 0,62 n – butanol 21,3 20,8 22,3 Dịch lọc Etyl axetat 23,0 23,2 22,8 23,00 0,39

n – propanol 19,5 18,4 19,1 19,00 0,45

Iso – butanol 18,5 17,8 17,8 18,03 0,33

Phụ lục 14: Tỉ lệ nảy mầm của hạt khi xử lý dịch lên men chủng S.

seudogriseolus ở các nồng độ khác nhau

Số lần kiểm tra Tỉ lệ % Nồng độ Trung Độ lệch hạt nảy % bình chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 mầm

Nước cất 145,00 140,00 135,00 140,00 4,08 93,30

1 140,00 130,00 120,00 130,00 8,16 86,70

10 50,00 56,00 47,00 51,00 3,74 34,00

20 120,00 115,00 125,00 120,00 4,08 80,00

50 20,00 24,00 19,00 21,00 2,16 14,00

100 0,00 0,00 0,00 0,00 4,08 0,00

Phụ lục 15: Thực nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm Fusarium của xạ khuẩn

trên cây cà chua

Hình 15.1: Chuẩn bị bầu đất ươm cây

Hình 15.2: Cây cà chua bắt đầu có 2 lá thật

Hình 15.3: Cây cà chua có 4 lá thật

Hình 15.4: Các lô thí nghiệm

Phụ lục 16: Ảnh hưởng của chất kháng đến khả năng ức chế

Fusarium trên cây cà chua

Số lần lặp lại TN Lô TN Trung bình Độ lệch chuẩn

Lần 1 0,00 25,00 27,00 17,00 Lần 2 0,00 43,00 19,00 16,00 Lần 3 0,00 40,00 26,00 18,00 0,00 36,00 24,00 17,00 0,00 7,87 3,56 0,82 ĐC 1 ĐC 2 TN 1 TN 2