Nấm đảm sinh tổng hợp laccase có khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng để nhuộm vải may quân trang

Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> NẤM ĐẢM SINH TỔNG HỢP LACCASE CÓ KHẢ NĂNG<br /> LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG<br /> ĐỂ NHUỘM VẢI MAY QUÂN TRANG<br /> Phùng Khắc Huy Chú1,3*, Đào Thị Ngọc Ánh2, Đặng Thị Cẩm Hà2<br /> <br /> Tóm tắt: Từ 6 trong số 45 mẫu nấm đảm được thu thập, phân lập từ rừng Quốc<br /> gia Ba Vì, Hà Nội, đã lựa chọn được chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp<br /> laccase thô cao nhất. Dựa theo các đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS1-5,8S-<br /> ITS2 chủng FBV40 được xác định thuộc chi Rigidoporus và được đặt tên là<br /> Rigidoporus sp. FBV40. Hoạt tính laccase thô cao nhất của chủng này đạt 107.708<br /> U/l trên môi trường TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy và có khả năng loại 8 màu thuốc<br /> nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng để nhuộm vải may quân trang ở mức độ khác<br /> nhau, hiệu suất loại màu MN.FBN với nồng độ 100 mg/L đạt cao nhất 88,11% khi<br /> có mặt 200 µM ViO sau 24 h. Ở nồng độ màu MN.FBN là 10 mg/L thì hiệu suất loại<br /> màu đạt 92,72%. Từ các minh chứng thu được cho thấy laccase sinh tổng hợp bởi<br /> chủng nấm đảm FVB40 có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy dệt<br /> nhuộm vải may quân trang cho quân đội.<br /> Từ khóa: Laccase, Rigidoporus, Loại màu, Thuốc nhuộm hoạt tính, Vải quân trang.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Laccase là enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase là một trong số ít các enzyme<br /> đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19. Sự quan tâm đối với các loại laccase đã được gia tăng<br /> trong những năm gần đây do tiềm năng ứng dụng chúng trong việc khử độc các chất ô nhiễm<br /> và trong xử lý sinh học các hợp chất phenol [7, 4]. Chúng chỉ cần oxy nguyên tử trong phản<br /> ứng xúc tác, vì vậy chúng phù hợp đối với các ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý hỗn<br /> hợp các chất ô nhiễm khi được cố định trên các chất mang phù hợp [13]. Vai trò của laccase<br /> đã được xác định khi ứng dụng trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy sinh học các hóa chất<br /> thải có độc tính như các hợp chất hữu cơ clo, các hydrocarbon thơm mạch vòng, các chất<br /> vòng thơm có nitro và thuốc chất trừ sâu và chế tạo sensor sinh học [11, 6].<br /> Hiện nay, công nghiệp dệt nhuộm sử dụng khoảng 2/3 tổng lượng thuốc nhuộm và tiêu<br /> thụ một lượng lớn nước và hoá chất [5]. Các hoá chất được sử dụng đa dạng về thành phần<br /> hoá học, chủng loại từ các hợp chất vô cơ để tổng hợp đến các sản phẩm hữu cơ. Có<br /> khoảng 100.000 loại thuốc nhuộm thương mại với trên 7.105 tấn thuốc nhuộm được sản<br /> xuất hàng năm. Các vấn đề nảy sinh đối với ô nhiễm bởi thuốc nhuộm là khả năng sinh ra<br /> các chất gây ung thư như benzidine và các hợp chất vòng thơm khác [4]. Hầu hết các<br /> phương pháp hiện tại để xử lý nước thải dệt nhuộm không đạt hiệu quả và không kinh tế<br /> như mong muốn. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển phương pháp mới dựa trên laccase<br /> chuyên hoạt động như là chất xúc tác là giải pháp có tiềm năng cao trong loại màu thuốc<br /> nhuộm có các cấu trúc hoá học đa dạng như vậy [15]. Hiện tại, chưa có công bố nào về<br /> việc nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm trong công nghiệp quốc phòng khi sử dụng laccase<br /> hay hỗn hợp của nhiều laccase để xử lý loại hình ô nhiễm này.<br /> Nhiều loài nấm đảm đã được phân lập từ đất, lá chè mục, lá keo mục và đặc biệt là gốc<br /> các loại cây mục thuộc địa bàn rừng Quốc gia Ba Vì, khi xác định sơ bộ hoạt tính các<br /> enzyme ngoại bào thuộc họ oxidoreductase, peroxidase mà đại diện là laccase, mangan<br /> peroxidase (MnP) và lignin peroxidase (LiP) đã cho ta thấy có đến 50% tổng số mẫu nấm<br /> thu được có khả năng sinh tổng hợp 1 trong 3 loại enzyme ngoại bào trên, trong đó, rất ít<br /> nấm có hoạt tính MnP và LiP. Việc phát hiện, sàng lọc các laccase mới có hoạt tính cao<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 169<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> với các phổ cơ chất đặc biệt và nghiên cứu nâng cao tính ổn định là rất quan trọng để triển<br /> khai ứng dụng ở quy mô công nghiệp.<br /> Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thông báo kết quả nghiên cứu phân lập, phân<br /> loại chủng nấm đảm có khả năng sinh tổng hợp laccase, lựa chọn môi trường nuôi cấy để<br /> sinh tổng hợp laccase cao và so sánh khả năng loại một số màu thuốc nhuộm hoạt tính<br /> thương mại được sử dụng trong công đoạn nhuộm vải may quân trang của nhà máy<br /> X20/Bộ Quốc phòng.<br /> 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Các chủng nấm đảm được thu thập từ đất và gỗ mục ở độ cao trên 600m rừng Quốc gia<br /> Ba vì, thành phố Hà Nội.<br /> 2.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy<br /> Tám loại màu tổng hợp hoạt tính được cung cấp bởi nhà máy X20, Tổng Cục công<br /> nghiệp Quốc phòng, Bộ Quốc phòng. Sử dụng các môi trường nuôi cấy TSH1 (100 ml<br /> dịch chiết khoai tây, 10 g/L glucose, 1 g/L cám gạo, 5 g/L bột đậu tương, 100 µM Cu2+);<br /> PDB (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose); PDB + 1%BDT (Dịch chiết khoai tây<br /> 200g/l, 10g/l glucose, 10g/l bột đậu tương); Czapeck (Saccharose 30 g/l, MgSO4 0,5 g/l,<br /> KH2PO4 1 g/l, NaCl 1 g/l, NaNO3 2 g/l, KCl 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, pH 7); Dịch chiết<br /> khoai tây (Khoai tây 200g/l, pH 7); MEG (KH2PO4 1 g/l, Na2HPO4 4 g/l, NaCl 0,2 g/l,<br /> MgSO4 0,2 g/l, CaCO3 0,5 g/l, cao men 4 g/l, cao malt 2 g/l, glucose 4 g/l, pH 6,5) và Vis<br /> (pepton 3 g/l, glucose 10 g/l, KH2PO4 0,6 g/l, ZnSO4 0,001 g/l, K2HPO4 0,4 g/l, FeSO4<br /> 0,0005 g/l, MnSO4 0,05 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6).<br /> 2.3. Phân lập chủng nấm<br /> Các mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tươi từ rừng Quốc gia Ba Vì, mang về<br /> phòng thí nghiệm chụp ảnh. Sau đó, tiến hành đo hoạt tính laccase của các mẫu tươi (gọi là<br /> hoạt tính in-situ). Tiến hành phân lập, làm sạch trên môi trường thạch chứa dịch chiết<br /> khoai tây, agar 18g/l và bổ sung guaniacol 1 % để song song nhận biết khả năng sinh tổng<br /> hợp oxydoreductase (laccase, LiP và MnP) thông qua vòng màu nâu đỏ là sản phẩm oxy<br /> hóa guaniacol.<br /> 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase<br /> Để phân biệt chính xác laccase, LiP hay MnP được sinh tổng hợp bởi chủng nấm<br /> nghiên cứu, hoạt tính laccase đã được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS (2,2'-azino-<br /> bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) của laccase theo phương pháp của Eggert [1].<br /> 2.5. Phân loại chủng nấm<br /> DNA tổng số của nấm được tách chiết theo mô tả của Eric và Boehm. Sản phẩm PCR<br /> được nhân lên từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’<br /> và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) [18]. Trình tự các đoạn gene được xử lý<br /> bằng phần mềm FinchTV và so sánh với các chủng được công bố trên GenBank (NCBI<br /> database). Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.06.<br /> 2.6. Sàng lọc khả năng loại các màu hoạt tính bằng laccase thô<br /> Dịch enzyme thô có nồng độ cuối 1.000 U/l được sử dụng để đánh giá khả năng loại<br /> màu với sự tham gia của chất gắn kết (CGK) Violuric acid (ViO). Các thuốc nhuộm hoạt<br /> tính thương mại của Nhà máy X20 được sử dụng để đánh giá hiệu quả loại màu bằng<br /> laccase thô. Tổng thể tích phản ứng loại màu là 5 ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4,<br /> màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) và CGK<br /> (nồng độ cuối 200 µM). Mẫu đối chứng có chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC<br /> <br /> <br /> 170 P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp… vải may quân trang.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4. Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được<br /> đánh giá trong vòng 24 giờ và được tính bằng công thức:<br /> D = 100*(Ai - At)/Ai<br /> Trong đó: D: Phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%);<br /> Ai: Độ hấp thụ ban đầu;<br /> At: Độ hấp thụ tại thời gian t.<br /> 2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CGK ViO lên khả năng loại màu thuốc<br /> nhuộm MN.FBN<br /> Tổng thể tích phản ứng loại màu MN.FBN là 5 ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4,<br /> màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) và nồng<br /> độ CGK ViO với các nồng độ 0; 100; 200; 400; 600; 800 và 1000 µM. Mẫu đối chứng có<br /> chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM<br /> pH4. Hiệu suất loại màu được tính toán ở các khoảng thời gian khác nhau trong vòng 24<br /> giờ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.<br /> 2.8. Nghiên cứu khả năng loại màu ở các nồng độ khác nhau bởi laccase thô chủng<br /> FBV 40<br /> Tổng thể tích loại màu MN.FBN là 5ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc<br /> nhuộm ở các nồng độ màu 5; 10; 15; 20; 30; 40 và 50 mg/L, dịch laccase thô nồng độ cuối<br /> 1000 U/L và nồng độ CGK là 600 µM. Mẫu đối chứng có chứa màu ở các nồng độ khác<br /> nhau, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4.<br /> Hiệu suất loại màu được tính toán ở các khoảng thời gian khác nhau trong vòng 24 giờ.<br /> Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Các chủng nấm đã được phân lập<br /> Từ 45 mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tại khu vực lấy mẫu, sau khi xử lý bề<br /> mặt được lắc và gạt trên môi trường PDA bổ sung chất chỉ thị guaiacol 0,01%. Sau 4 ngày<br /> nuôi cấy, 6 chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt môi trường, hệ sợi nấm<br /> bông xốp có màu trắng, không mịn và tạo vòng nâu đỏ trên môi trường có chứa chất chỉ thị<br /> guaiacol. Hoạt tính laccase insitu hiện trường cũng đã được tiến hành. Kết quả thu được<br /> chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào thuộc nhóm<br /> peroxidase (MnP, LiP) hoặc oxidoreductase (laccase). Các kết quả được thể hiện ở bảng 1.<br /> Bảng 1. Các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase.<br /> Hoạt tính in situ<br /> Tên mẫu Mặt trước (B) Mặt sau (C)<br /> (U/L)<br /> <br /> <br /> <br /> A46 35<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> BT4 25<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 171<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> BT5 50<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> BT8 23<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> BT9 25<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> FBV40 150<br /> <br /> <br /> <br /> Chú thích: Hình thái khuẩn lạc (mặt trước - B và mặt sau - C) và hoạt tính laccase in<br /> situ (là hoạt tính của mẫu ngay trước khi phân lập) của các chủng nấm được nuôi cấy trên<br /> môi trường PDA bổ sung 0,01% guaiacol làm chất chỉ thị.<br /> Dựa vào kết quả đo hoạt tính enzyme laccase tại bảng 1, cho thấy chủng FBV40 có<br /> hoạt tính cao nhất, khả năng phát triển nhanh nên được lựa chọn để nghiên cứu phân loại,<br /> khả năng sinh tổng hợp laccase và khả năng loại màu thuốc nhuộm. Chủng nấm được phân<br /> loại bằng sự kết hợp cả hai phương pháp truyền thống và so sánh độ tương đồng giữa trình<br /> tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng với các chủng đại diện trên GenBank.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Hình thái sợi và bào tử của chủng FBV40 dưới kính hiển vị điện tử quét<br /> JOLE với độ phân giải x 1.500.<br /> Quan sát các đặc điểm hình thái, khuẩn lạc trên đĩa thạch và hệ sợi nấm dưới kính hiển<br /> vi điện tử, dựa vào khóa phân loại Robert A. Samson chủng FBV40 thuộc nấm đảm. Tuy<br /> nhiên để làm rõ các kết quả phân loại truyền thống, việc xác định và so sánh so sánh độ<br /> tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng này đại diện trên với các đại<br /> diện trên GenBank đã được tiến hành. Trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 được khuếch đại bởi<br /> <br /> <br /> 172 P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp… vải may quân trang.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> cặp mồi ITS1-ITS4 của chủng nấm FBV40. Sử dụng các phần mềm đã được mô tả ở phần<br /> phương pháp, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng ở hình 2. Từ cây phát sinh chủng<br /> loài cho thấy chủng FBV40 gần gũi nhất với các đại diện thuộc chi Basidiomycetes với<br /> mức độ tương đồng 96 đến 99% tương ứng với các chủng là B. sp. HKC4 được thu thập từ<br /> vùng biển Hawai (Mỹ) [10] và chủng B. sp. C2-14 được thu thập từ rặng san hồ ở Phúc<br /> Kiến (Trung Quốc) và 93 đến 99% với chi đại diện của Rigidoporus lần lượt là R. Vinctus<br /> C1-9 được phân lập từ vùng biển san hô của vùng biển Phúc Kiến và R. Vinctus FRIM 142<br /> được phân lập từ rừng nhiệt đới ở Malaysia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Hiện chưa có<br /> nhiều nghiên cứu về đặc điểm hình thái cũng như khả năng sinh tổng hợp laccase của các<br /> chủng nấm trên. Từ cây phát sinh chủng loại, đặc điểm hình thái, chủng nấm FBV40 thuộc<br /> chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp. FBV40.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Cây phát sinh chủng loại chủng FBV40.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Sinh tổng hợp laccase thô chủng FBV 40 trên các môi trường.<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 173<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Môi trường phù hợp để sinh tổng hợp laccase<br /> Bảy môi trường nuôi cấy đã được lựa chọn để khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase<br /> thô của chủng FBV40, kết quả được mô tả ở hình 3.<br /> Từ kết quả ở hình 3, trên môi trường TSH1 chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp<br /> laccase thô cao nhất lên tới 107.708 U/L sau 8 ngày nuôi cấy. Tiếp đến là ở môi trường PDB<br /> có bổ sung 1% bột đậu tương đạt 41.343 U/L sau 6 ngày nuôi cấy và ở các môi trường<br /> Czapeck, Vis và MEG với hoạt tính lần lượt thu được là 5; 13; 12 và 68,7 U/L mặc dù đây<br /> đều là các môi trường cơ bản để nuôi cấy nấm nhưng hoạt tính laccase thô thu được lại rất<br /> thấp. Theo nghiên cứu của Cambria và cs về chủng nấm R. lignosus có hoạt tính lần lượt là<br /> 120.000 U/L và 75.000 U/L khi bổ sung chất cảm ứng là phenylhydrazine,<br /> guaniancol trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 25mM Nito và 500 µg/L<br /> CuSO 4 trong môi trường sau 21-24 ngày nuôi cấy [8]. Ở Việt Nam, khi nghiên<br /> cứu khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng nấm Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ gỗ<br /> mục ở rừng Quốc gia Cúc Phương hoạt tính đạt cao nhất khi bổ sung NaNO3 và KNO3 (tỷ lệ<br /> 3:7) với nồng độ 3 g/l vào môi trường và có hoạt tính là 132 U/l. Như vậy, có thể thấy rằng<br /> thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp laccase<br /> của chủng FBV40. Môi trường TSH1 là môi trường phù hợp nhất trong số các môi trường<br /> khảo sát để FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase có hoạt tính cao nhất.<br /> Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thô<br /> Với mục đích sử dụng enzyme thô để phục vụ khảo sát khả năng loại màu thuốc nhuộm<br /> hoạt tính để nhuộm vài may quân trang, chủng nấm FBV40 được nuôi lắc trên môi trường<br /> TSH1 và hoạt tính laccase cao nhất thu được sau 8 ngày nuôi cấy là 107.708U/L. Kết quả<br /> chứng minh rằng laccase thô từ chủng FBV40 trên có khả năng loại được các màu hoạt<br /> tính ở mức độ khác nhau, khi sử dụng phương pháp đánh giá khả năng loại màu trên thiết<br /> bị UV-VIS. Kết quả loại màu được trình bày ở bảng 2.<br /> Bảng 2. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng<br /> trong quân đội bằng laccase thô chủng FBV40.<br /> <br /> MT BES NY S3R<br /> <br /> C T C<br /> T<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> MY BES MY EG<br /> T<br /> <br /> T C C<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 174 P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp… vải may quân trang.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> <br /> <br /> MR EBR<br /> C NY FN2R<br /> T C<br /> T<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> C MN FBN NN SG C<br /> <br /> T T<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chú thích: C- Đường biểu diễn màu đối chứng; T- Đường biểu diễn màu thí nghiệm.<br /> Đối với các màu thuốc nhuộm hoạt tính khi không sử dụng CGK, laccase của chủng<br /> nấm FBV40 có ít khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng trong nghiên<br /> cứu này. Hiệu suất loại các màu này bởi laccase thô chủng FBV40 khi không có CGK dao<br /> động trong khoảng từ 1 đến 5,56% sau 24 giờ thí nghiệm, cao nhất chỉ đạt 5,56% đối với<br /> màu MR.EBR.<br /> Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thô khi sử dụng CGK là ViO sau<br /> 24 giờ khá cao. Với hiệu suất loại màu hoạt tính thương mại nằm trong khoảng rất rộng từ<br /> 4,22% đến 88,11%, trong đó, hiệu suất loại màu thấp nhất là màu MY-BES chỉ đạt 4,22%<br /> và cao nhất đối với màu MN. FBN lên tới 88,11% sau 24h phản ứng. Kết quả thu được<br /> cho thấy vai trò của CGK trong phản ứng loại màu của laccase bởi chủng FBV40 đối với<br /> các màu thuốc nhuộm hoạt tính từ nhà máy X20, trong đó, đặc biệt là khả năng loại màu<br /> MN.FBN với hiệu suất tăng từ 0,22% đến 88,11% và màu NN.SG từ 0,11% đến 77,05%.<br /> Đặc biệt, hiệu suất loại màu không có sự biến động lớn sau 24 giờ khi có mặt của CGK.<br /> Từ kết quả này cho thấy vai trò của CGK rất quan trọng trong việc loại màu thuốc nhuộm<br /> bởi laccase thô chủng FBV40. Số liệu thực nghiệm cho thấy, enzyme thô chủng FBV40 có<br /> hiệu quả cao trong việc loại các màu thuốc nhuộm thuộc nhóm màu có 2 gốc azo và có<br /> màu xanh lá cây hoặc xanh đen (đây là những màu được sử dụng chính để nhuộm vải may<br /> quân trang cho quân đội hiện nay), còn những màu mang nhóm màu có gốc azo đơn và có<br /> màu vàng, đỏ hoặc xanh da trời, laccase thô từ chủng FBV40 loại màu kém hơn rất nhiều.<br /> Theo nghiên cứu khi sử dụng 09 chủng trong tập đoàn HN1 đã loại màu được 83,89% đối<br /> với màu 100 mg/L Reactive Blue 222 (MN.FBN) sau 15 h nuôi lắc [2]. Khi loại màu RB<br /> 222 bằng phản ứng phenton thì loại màu được gần 90% và tăng lên đạt 96,88% và đạt<br /> 95,23% sau khi xử lý hiếu khí bằng 2 chủng nấm đảm trắng P.ostreatus IBL-02 và P.<br /> chrysosporium IBL-03 [14]. Chủng Pseudomonas sp. D4 được phân lập từ nước thải nhà<br /> máy nhuộm có khả năng loại màu cao nhất đối với màu 100 mg/l RB 222 sau 24 h đạt 70%<br /> ở pH 7 và nhiệt độ nuôi cấy 350C [18]. Hiện chưa có nhiều công trình nghiên cứu trong nước<br /> và quốc tế về sử dụng laccase thô để loại màu RB 222. Khi nghiên cứu khả năng loại màu<br /> của laccase tinh sạch với hoạt tính 20 U/L rLac15 thu từ chủng vi khuẩn nước biển khi có<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 175<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> mặt methylsyringate làm CGK, phản ứng ở nhiệt độ 450C, pH 8,5 trong 1 h thì 93% màu RB<br /> 194 (NN.SG) bị loại [17].<br /> Bên cạnh việc nghiên cứu khả năng loại màu, hoạt tính laccase cũng được đánh giá<br /> trong quá trình loại màu. Kết quả, sau 24 giờ, hoạt tính laccase thô còn lại không có sự<br /> khác nhau giữa các công thức thí nghiệm và giữa các màu, hoạt tính còn từ 2,5% đến<br /> 13,9,5%. Đặc biệt, khả năng loại các màu MY-BES, MT-BES, MY-EG, NY-FN2R, NY-<br /> S3R và MR-EBR của laccase bởi chủng nghiên cứu không lớn dao động không lớn nằm<br /> trong khoảng 2,56% (MY-BES) đến 55,76% (MR.EBR) sau 24 h thí nghiệm. Như vậy, có<br /> thể laccase từ chủng FBV40 đã tham gia vào quá trình phân hủy một trong số các tác nhân<br /> khác trong cấu trúc phân tử của các màu này và không có khả năng loại được gốc mang<br /> màu. Một nghiên cứu chỉ ra rằng 65% hoạt tính laccase vẫn còn trong quá trình loại màu<br /> RBBR và Indigo carmine sau 12 h thí nghiệm, trong khi đó, hoạt tính laccase vẫn còn 35%<br /> khi loại màu Azure A và Acid red. Khi có mặt CGK thymol và ViO thì hoạt tính laccase<br /> mất hoạt tính ít hơn [9]. Từ những kết quả trên thấy rằng với các loại thuốc nhuộm, CGK<br /> và chủng vi sinh vật sinh tổng hợp khác nhau thì có những ảnh hưởng khác nhau lên hoạt<br /> tính laccas trong quá trình loại màu.<br /> Tuy nhiên, để làm sáng tỏ khả năng loại màu với từng loai thuốc nhuộm hoạt tính được<br /> sử dụng nhuộm vải quân trang thì cần có phải có thêm nhiều nghiên cứu hơn nữa, có thể<br /> phải sử dụng tổ hợp của laccase được cố định lên chất mang phù hợp. Kết quả Bảng 4 trên<br /> cho thấy, laccase thô chủng FBV40 được phân lập từ Ba Vì có khả năng loại màu cao nhất<br /> đối với màu MN.FBN khi có mặt CGK ViO. Để đánh giá chi tiết hơn về khả năng của<br /> laccase thô cũng như ảnh hưởng của nồng độ ViO và nồng độ màu thuốc nhuộm đối với<br /> chủng này, màu MN.FBN và CGK ViO được lựa chọn để nghiên cứu các thí nghiệm tiếp<br /> theo. Ảnh hưởng của nồng độ CGK lên khả năng loại màu của laccase chủng FBV40 đối<br /> với màu MN. FBN được thể hiện ở hình 4.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Khả năng loại màu MN.FBN ở các nồng độ CGK Vio khác nhau.<br /> Tử kết quả trên thấy rằng, khả năng loại màu MN. FBN tỷ lệ với nồng độ CGK ViO,<br /> tuy nhiên ở các nồng độ ViO 600, 800 và 1000µM sau thời gian phản ứng 3,5h thì phần<br /> trăm loại màu tăng lên không đáng kể tương ứng lần lượt là 90,58%, 91,52% và 92,17%.<br /> Như vậy, chọn nồng độ 600µM ViO để tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khả năng loại<br /> màu ở các nồng độ màu thuốc nhuộm khác nhau. Theo một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi<br /> có mặt ViO với nồng độ 200µM thì làm tăng 70% khả năng loại màu Indigo carmine bởi<br /> <br /> <br /> 176 P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp… vải may quân trang.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> laccase chủng Pichia pastoris GS115. Kết quả ViO là CGK hiệu quả nhất trong loại các<br /> màu RBBR, acid red và CBB. Loại màu thuốc nhuộm trong hệ laccases-CGK có liên quan<br /> đến loại CGK và cấu trúc phân tử của thuốc nhuộm [9]. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của các<br /> CGK lên khả năng khả năng loại màu thuốc nhuộm của laccase loài P.cinnabarinus, khi<br /> có mặt acetosyringone và syringaldehyde thì hiệu suất loại màu đạt trên 80%, tuy nhiên,<br /> nếu sử dụng CGK là HBT và nồng độ ViO cao đến 250 μM để đạt được hiệu suất tương tự<br /> [12]. Khi có mặt ViO, 4 màu thuốc nhuộm RBBR, anthraquinoid, Coomassie brilliant blue<br /> G-250, triphenylmethane đã bị loại tới 70% bởi laccase [9]. Từ những dữ liệu trình bày<br /> trên cho thấy khả năng loại màu của nhiều loại laccase liên quan đến loại CGK, cấu trúc<br /> phân tử của thuốc nhuộm và điều kiện cho phản ứng loại màu. Hiệu suất loại màu của<br /> laccase thô đối với màu MN.FBN ở các nồng độ khác nhau được trình bày ở hình 5.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Loại màu MN.FBN bởi laccase thô chủng FBV40 ở các nồng độ màu khác nhau.<br /> Số liệu thu được ở hình 5 cho thấy đã không có sự khác biệt lớn ở hiệu suất loại màu ở các<br /> nồng độ thuốc nhuộm từ 10 đến 50mg/L. Khả năng loại màu cao nhất đạt 92,72% ở nồng độ<br /> thuốc nhuộm là 10mg/L sau 1h phản ứng. Như vậy, laccase thô từ chủng FBV40 có khả năng<br /> loại màu tốt nhất ở nồng độ màu là 10mg/L.<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Từ 45 chủng nấm đảm được thu thập, phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì, Hà Nội, đã lựa<br /> chọn đượng chủng FBV40, dựa theo các đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS1-5,8S-<br /> ITS2, chủng FBV40 thuộc nấm đảm thuộc chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus<br /> sp. FBV40. Hoạt tính laccase thô cao nhất của chủng này là 107.708U/l trên môi trường<br /> TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy. Trong số 8 màu hoạt tính của nhà máy X20/Bộ Quốc phòng thì<br /> hiệu suất loại màu bởi laccase thô dao động trong khoảng từ 4,22% đến 92,17% (khi loại<br /> màu thuốc nhuộm MN.FBN có mặt CGK ViO sau 24h thí nghiệm). Ở nồng độ 600µM<br /> ViO, laccase thô chủng FBV40 có khả năng loại màu cao nhất đối với thuốc nhuộm<br /> MN.FBN. Thời gian loại màu diễn ra nhanh, mạnh trong khoảng thời gian từ 1 đến 3,5h.<br /> Laccase thô chủng FBV40 có khả năng cao trong loại các màu thuốc nhuộm có 2 gốc azo<br /> và có phần từ mang màu xanh lá cây hoặc xanh đen (đây là những màu được sử dụng<br /> chính để nhuộm màu quần áo cho bộ đội hiện nay). Ngược lại, nhóm màu có gốc azo đơn<br /> và mang màu vàng, đỏ hoặc xanh da trời thì bị loại màu kém hơn. Từ các minh chứng thu<br /> được cho thấy laccase sinh tổng hợp bởi chủng nấm đảm FVB40 có khả năng là ứng cử<br /> viên đầy tiềm năng để phát triển công nghệ nhằm xử lý nước thải nhà máy nhuộm X20/Bộ<br /> Quốc phòng.<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 177<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Lời cảm ơn: Bài báo được thực hiện với sự tài trọ về kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước<br /> "Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các<br /> gene, các enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin", Mã số DTDLCN. 13/14.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. C.Eggert, U.Temp and K.E.Eriksson, "The ligninolytic system of the white rot<br /> fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the<br /> laccase", Appl Environ Microbiol 62(4) (1996), 1151-1158.<br /> [2]. D.M.Srinivas, S.Rakesh and B.Nikhil, "Biodegradation study on Reactive Blue<br /> 222 by Bacterial Consortium", Chem Environl 2(4)(2012), 69-79.<br /> [3]. G.Singh, P.Kaur, N.Capalash and P.Sharma, "Laccase from prokaryotes: a<br /> newsource for an old enzyme", Reviews in Environmental Science and<br /> Biotechnology 10(4) (2011), 309-326.<br /> [4]. H.Hou, J.Wang, C.Du, and B.Yan "Enhancement of laccase production by<br /> Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye",<br /> Process Biochemistry 39(11) (2004), 1415-1419.<br /> [5]. I.M.Banat, D.Singh, and R.Marchant, "Microbial decolorization of textile-dye-<br /> containing effluents: a review", Bioresource Technology 58(1996), 217-227.<br /> [6]. J.C.Gonzalez, A.Rodriguez, J.F.Osma and C.J.Almeciga-Diaz, "Production of<br /> Trametes pubescens laccase under submerged and semi-Solid culture conditions<br /> on agro-Industrial wastes", PLoS ONE 8(9) (2013).<br /> [7]. J.M.Bollag, K.L.S and D.H.Anderson, "Laccase mediated detoxification of<br /> phenolic compounds", Applied and Environmental Microbiology 54(12) (1988),<br /> 3086 - 3091.<br /> [8]. M.T.Cambria, V.Calabrese, A.Cambria, "Enhanced Laccase Production in White-<br /> Rot Fungus Rigidoporus lignosus by the Addition of Selected Phenolic and<br /> Aromatic Compounds", Appl Biochem Biotechnol 163 (2011), 415 - 422.<br /> [9]. M.R.Hu, G.Q.Zhang, Z.Q.Xue, S.Qian, "Laccase-mediator system in the<br /> decolorization of different types of recalcitrant dyes", Journal of Industrial<br /> Microbiology & Biotechnology 36(1)(2009), 45-51.<br /> [10]. Q.Li, "Diversity of fungal isolates from three Hawaiian marine sponges"<br /> Microbiological Research 164(2009), 233-241.<br /> [11]. R.S´anchez, L.Serrano, A.Toledano, J.Labidi and A.Rodr´ıguez, "Hesperaloe<br /> funifera as a raw material for integral utilization of its components",<br /> BioResources 6(1)(2011), 3-21.<br /> [12]. S.Camarero, M.J.Martínez, Á.T.Martínez, "Lignin-Derived Compounds as<br /> Efficient Laccase Mediators for Decolorization of Different Types of Recalcitrant<br /> Dyes", Appl. Environ. Microbiol 71(4)(2005), 1775-1784.<br /> [13]. S.Herrera, "Industrial and biotechnological applications of laccases:a review"<br /> Biotechnology Advances 24(5) (2006), 500 - 513.<br /> [14]. S.Kiran, M.Asgher, "Degradation and Mineralization of Azo Dye Reactive Blue<br /> 222 by Sequential Photo-Fenton’s Oxidation Followed by Aerobic Biological<br /> Treatment Using White Rot Fungi", Bulletin of Environmental Contamination and<br /> Toxicology 90(2)(2013), 208-215.<br /> [15]. S.Rodriıguez Couto and G.M.G´ubitz, "Influence of redox mediators and metal<br /> ions on synthetic acid dye decolourization by crude laccase from Trametes<br /> hirsuta" Chemosphere 58(4)(2005), 417-422.<br /> [16]. T.White, T.Bruns, S.Lee and J.Taylor, "Amplification and direct sequencing of<br /> fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to<br /> methods and applications. (Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds)",<br /> <br /> <br /> 178 P.K.H. Chú, Đ.T.N. Ánh, Đ.T.C. Hà, “Nấm đảm sinh tổng hợp… vải may quân trang.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Academic Press, New York, USA (1990), 315-322.<br /> [17]. W.Fang, F.Chang, H.Peng, X.Zhang, Y.Xiao, "Dye decolorization by bacterial laccase<br /> Lac15", Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 28(8) (2012), 973-980.<br /> [18]. W.Mohamed, "Isolation and Screening of Reactive Dye Decolorizing Bacterial<br /> Isolates from Textile Industry Effluent" International Journal of Microbiological<br /> Research 7(1)(2016), 1-8.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> BASIDIOMYCETES FUNGUS SYNTHESIS LACCASE THAT HAS<br /> DECOLOURATION ABITILY OF ACTIVE DYES USED TO DYE FABRIC SEWING<br /> AMMUNITION UNIFORM<br /> <br /> From strains of fungus to be isolated for screening enzyme laccase from Ba Vi<br /> National Park, FBV40 strain was chosen, being capable of biosynthesis with the<br /> highest crude laccase. The strains FBV40 were identified to belong to the genus<br /> Rigidoporus and named Rigidoporus sp. FBV40. The highest crude laccase activity<br /> of this strain reached 107,708 U/L when being cutivated in TSH1 medium after 8<br /> days. Crude laccase of FBV40 is capable of decolouration of 8-commercial reactive<br /> dyes used to dye the military uniform sewing fabric in varying degrees. The<br /> decolouration efficiency of MN.FBN at 100 mg /L concentrations was the highest at<br /> 88.11% in the presence of mediator 200 µM ViO after 24 h experiment. Especially,<br /> crude laccase decolouration of FBV40 strain was of the higher capability in<br /> decolouring with blue dyes than red and yellow ones. Time for decolouration of<br /> FBV40 strain take place at high speed within a period from 1 to 3.5 hours. Through<br /> obtained evidences, laccase synthesized by Rigidoporus sp. FBV40 is of high<br /> potential for application in wastewater treatment of textile plants in particular as<br /> well dye plant used to ammunition military in general.<br /> Keywords: Laccase, Rigidoporus, Decolouration, Active dyes, Ammunition.<br /> <br /> Nhận bài ngày 17 tháng 10 năm 2017<br /> Hoàn thiện ngày 13 tháng 11 năm 2017<br /> Chấp nhận đăng ngày 20 tháng 12 năm 2017<br /> <br /> Địa chỉ: 1 Bộ Tư lệnh Hóa học/Bộ Quốc phòng;<br /> 2<br /> Viện Công nghệ Sinh học/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;<br /> 3<br /> Học viện Khoa học và Công nghệ/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.<br /> *<br /> E-mail: Phunghuychu@gmail.com.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 52, 12 - 2017 179<br />