Nghiên cứu tách chiết và thủy phân collagen từ da cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Collagen được chiết từ da cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) đã xử lý loại tạp sau đó được thủy phân bằng enzyme để thu nhận collagen thủy phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy collagen được chiết bốn lần bằng nước nóng ở các nhiệt độ khác nhau từ 60 - 100o C đạt hiệu suất trên 82%. Điều kiện thủy phân được tối ưu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tách chiết và thủy phân collagen từ da cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ THỦY PHÂN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyễn Thị Hương Thảo1, Đinh Thị Mến1, Nguyễn Thị Mỹ Thuận1 TÓM TẮT Collagen được chiết từ da cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) đã xử lý loại tạp sau đó được thủy phân bằng enzyme để thu nhận collagen thủy phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy collagen được chiết bốn lần bằng nước nóng ở các nhiệt độ khác nhau từ 60 - 100oC đạt hiệu suất trên 82%. Điều kiện thủy phân được tối ưu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM). Nhiệt độ 55,5oC, pH 8 thủy phân dịch chiết collagen trong 260 phút sử dụng enzyme Corolase 7089 với tỷ lệ enzyme 9U/g cơ chất là điều kiện tối ưu để đạt mức độ thủy phân trên 34%. Sản phẩm sau khi thủy phân gồm 87% là collagen có kích thước
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Protease phẩm thuỷ phân, dịch sau khi thuỷ phân được Corolase 7089 (AB enzymes) là lọc một khối lượng xác định qua bộ lọc màng endopeptidase kiềm sản xuất từ vi khuẩn Bacillus cut-off Amicon (Milipore-Ireland) ở các kích subtilis, họat tính tối thiểu là 840 UHb/g. thước phân tử 30kDa, 10kDa và 3kDa, xác định protein trong từng phân đoạn bằng phương pháp Tách chiết collagen Lowry. Tỷ lệ phân đoạn được tính bằng tỷ lệ Collagen được trích ly trong nước nóng phần trăm lượng protein thu được ở từng phân trong 4 lần ở các nhiệt độ 60, 75, 90 và lần cuối đoạn so với lượng protein trong dịch thuỷ phân ở 100oC nhằm tận thu lượng collagen còn sót lại ban đầu đem lọc. trong da cá. Tỷ lệ da cá: nước trong hai lần chiết Các phương pháp phân tích đầu tiên là 1: 2 và 1:1 cho hai lần chiết sau cùng. Hàm lượng hydroxyproline, collagen: Để xác định thời gian thích hợp cho mỗi lần được xác định bằng phương pháp so màu với chiết, dịch chiết được lấy mẫu rồi đem lọc trước thuốc thử Ehrlich theo phương pháp AOAC khi đo OD ở 280nm theo thời gian. Sau mỗi lần 990.26. Collagen trong mẫu được tính tương chiết hỗn hợp được lọc qua vải để thu dịch chiết đương bằng lượng hydroxyproline x 7,7 và dịch chiết sau các lần chiết được gộp chung (Nalilanon et al., 2007). để tính hiệu suất. Hiệu suất tách chiết được tính bằng tỷ lệ phần trăm lượng collagen thu được Mức độ thủy phân DH% (Hoyle và Mer- trong dịch chiết so với lượng collagen trong da ritt, 1994): mức độ thủy phân được xác định cá ban đầu. thông qua chỉ số N hòa tan trong TCA bằng cách bổ sung lượng thể tích tương đương TCA Quá trình thủy phân dịch chiết tạo 20% nhằm kết tủa protein còn lại trong dung collagen thủy phân dịch sau khi thủy phân, sau đó ly tâm ở 7500v/ Điều kiện pH thích hợp cho quá trình thủy phút trong 15 phút rồi lọc loại bỏ kết tủa. Xác phân được khảo sát căn cứ vào điều kiện pH đối với định hàm lượng N trong dịch thủy phân ban đầu enzyme do hãng AB Enzymes cung cấp. Ghi nhận và trong dịch nổi sau li tâm bằng phương pháp mức độ thủy phân theo pH để xác định khoảng pH Kjeldahl. Mức độ thủy phân DH(%) là tỷ lệ giữa phù hợp cho phản ứng thủy phân collagen. hàm lượng N tan trong TCA 10% sau thủy phân Để tối ưu hóa phản ứng thủy phân, bố trí so với hàm lượng N ban đầu trong mẫu. thí nghiệm tại pH xác định từ thí nghiệm trên, Định lượng protein tan bằng phương khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân và tỷ pháp Lowry: dựa vào phản ứng màu của Pro- lệ E/S và thời gian thủy phân đến mức độ thủy tein và thuốc thử Folin để tạo phức màu xanh phân DH. đặc trưng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng Thí nghiệm tối ưu hóa được bố trí theo kế 750nm và dựa vào đường chuẩn Protein để từ họach hỗn hợp bậc hai xoay tâm k=3, cánh tay đó định lượng hàm lượng Protein. đòn α = 2k/4 = 23/4. Để xác định kết quả tối ưu Phương pháp xử lí số liệu hóa của các thí nghiệm ảnh hưởng tương tác của Phân tích phương sai ANOVA để xác định các yếu tố lên hàm mục tiêu sử dụng phương sự khác biệt của các số liệu và sai số chuẩn bằng pháp bề mặt đáp ứng RSM (Response surface phần mềm Statgraphics nhằm kiểm định độ tin method) sử dụng phần mềm Modde 5.0 để xử cậy của kết quả thu được từ các thí nghiệm. lý kết quả. KẾT QUẢ Đánh giá kích thước phân tử của sản phẩm thuỷ phân 3.1. Chiết collagen trực tiếp bằng nước Để đánh giá kích thước phân tử của sản Da cá được chiết 4 lần tại các nhiệt độ 60oC, TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 125
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 75oC, 90oC và 100oC, theo thời gian lấy mẫu biểu diễn độ hấp thu theo thời gian chiết được dịch chiết đem đo độ hấp thu ở 280nm. Đồ thị trình bày trong hình 1. Hình 1. Biến đổi độ hấp thu của dịch chiết theo thời gian ở 60oC, 750C, 90oC và 100oC (từ trên xuống, trái sang phải). Kết quả đo OD ở 280nm phản ánh hàm lượng chiết lên đến 90oC sau 120 phút khả năng chiết đạt protein tan trong dung dịch. Ở lần chiết đầu tiên tối đa do đó OD không thay đổi sau thời gian này. sau khoảng thời gian chiết 120 phút độ hấp thu Sau 3 lần chiết ở các nhiệt độ khác nhau, miếng da hầu như không thay đổi chứng tỏ ở 60oC khả năng cá còn lại là một phần da mềm trong, nhằm tận thu chiết collagen từ da cá đạt cực đại sau 120 phút lượng collagen còn sót lại trong da, nhiệt độ chiết gia nhiệt. Nhằm tăng khả năng chiết phần da cá được tăng tới nhiệt độ sôi. Ở nhiệt độ sôi sau 45 sau khi chiết lần 1 được tiếp tục chiết ở nhiệt độ phút khả năng chiết collagen đạt tối đa. cao hơn. Ở lần chiết thứ hai khả năng chiết đạt cao Nhằm đánh giá hiệu suất của từng lần chiết, nhất sau 90 phút, sau thời gian này hầu như không dịch chiết sau mỗi lần chiết được gộp chung lại chiết được thêm collagen vào dung dịch. đem xác định hàm lượng collagen. Kết quả hiệu Kết quả khảo sát cho thấy khi gia nhiệt dịch suất chiết được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Hiệu suất chiết sau từng giai đoạn Lần chiết Hiệu suất chiết collagen (%) Lần 1: 60oC trong 120 phút 32,46 ± 2,75 Lần 2: 75 C trong 90 phút o 77,73 ± 3,36 Lần 3: 90oC trong 120 phút 83,85 ± 2,52 Lần 4: 100 C trong 45 phút o 86,84 ± 4,47 Như vậy collagen được chiết hiệu quả từ da cá bằng nước nóng trong 4 lần với hiệu suất chiết đạt trên 82%. 126 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 3.2. Tối ưu hóa quy trình thủy phân bằng Kết quả cho thấy đối với dung dịch collagen Corolase thì Corolase hoạt động hiệu quả hơn trong Khảo sát pH thích hợp cho phản ứng khoảng pH ≤8,0. Sự khác biệt về mức độ thủy thủy phân phân tại pH 7,5 và 8,0 không có ý nghĩa thống kê nên để giảm việc phải điều chỉnh pH của dịch Dịch chiết collagen đem đi thủy phân có pH chiết quá nhiều, đề tài quyết định chọn pH của khoảng 8,8 – 9,0 được điều chỉnh tới các giá trị dịch thủy phân bằng 8,0 để thực hiện phản ứng pH khác nhau bằng dung dịch NaOH và HCl. thủy phân. Enzyme Corolase được bổ sung vào dung dịch với tỷ lệ 1% cơ chất nhằm khảo sát khả năng Chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương thủy phân của Corolase. Kết quả xác định mức pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao ba yếu tố độ thủy phân DH% ở nhiệt độ 55oC trong thời nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ enzyme/cơ chất, cấu gian 240 phút được trình bày trong bảng 2. trúc có tâm với hàm mục tiêu là mức độ thủy phân.Số thí nghiệm tối ưu là N =18 thí nghiệm, Bảng 2. Kết quả thủy phân dịch chiết collagen trong đó có 4 thí nghiệm ở tâm phương án. Các tại các pH khác nhau thông số của thí nghiệm như trong bảng 3. pH Mức độ thủy phân DH% Bảng 3. Các thông số của thí nghiêm tối ưu hóa 7,50 33,63 ± 0,30a -α -1 0 1 α 8,00 34,05 ± 0,73a 8,50 32,45 ± 0,47b X1(0C) 46,59 50 55 60 63,41 9,00 31,86 ± 0,38b X2(‫ح‬,phút) 139,08 180 240 300 340,92 Chú thích: các giá trị có cùng kí tự mũ thì sự khác X3[E/S] (%) 0,159 0,5 1 1,5 1,841 nhau giữa chúng là không có nghĩa (α = 5%). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 4. Bảng 4. Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm cấp hai, ba yếu tố X1 X2 X3 0 C ‫ح‬ [E/S] Y -1 -1 -1 50 180 0,5 21,995 1 -1 -1 60 180 0,5 24,576 -1 1 -1 50 300 0,5 27,933 1 1 -1 60 300 0,5 28,081 -1 -1 1 50 180 1,5 28,972 1 -1 1 60 180 1,5 30,593 -1 1 1 50 300 1,5 30,002 1 1 1 60 300 1,5 30,475 -1,682 0 0 46,59 240 1 27,169 1,682 0 0 63,41 240 1 29,704 0 -1,682 0 55 139,08 1 30,743 0 1,682 0 55 340,92 1 33,192 0 0 -1,682 55 240 0,159 19,090 0 0 1,682 55 240 1,841 32,981 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 127
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 0 0 0 55 240 1 32,562 0 0 0 55 240 1 34,507 0 0 0 55 240 1 33,555 0 0 0 55 240 1 34,192 Theo phương pháp trực giao ba yếu tố, x1*x2 -0,44765 0,52494 0,418587 phương trình hồi quy được biểu diễn theo x1*x3 -0,0796 0,52494 0,883228 dạng sau: x2*x3 -1,06623 0,52494 0,076721 Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b11x12 + b22x22 + b33x33 Qua bảng trên, ta thấy các biến độc lập đều có ảnh hưởng đến mức độ thủy phân (Y), do giá Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm cho trị P < 0,05; ngoại trừ x1 do có P > 0,05. Trong hàm mục tiêu bằng phần mềm Modde 5.0, ta đó, thời gian thủy phân (x2) và tỷ lệ enzyme (x3) nhận được các kết quả như trong bảng 5. có tác động tích cực và ảnh hưởng dương đến Bảng 5. Ảnh hưởng của các biến độc lập mức độ thủy phân, còn x12, x32 có ảnh hưởng đến mức độ thủy phân âm đến mức độ thủy phân.Tác động kép của các Yếu tố Hệ số Std. Err. P yếu tố đều không rõ rệt vì p >0,05. Constant 33,7374 0,741296 6,00E-11 Từ bảng số liệu trên, thu được phương trình x1 0,665248 0,401751 0,136341 hồi quy của mức độ thủy phân như sau: x2 1,0597 0,401751 2,98E-02 Y = 33,73 + 1,06x2 + 2,99x3 – 2,01x12 – 2,86x32 x3 2,98873 0,401751 7,34E-05 x1*x1 -2,01121 0,417397 0,001324 Chuyển sang biến số thực thu được phương trình hồi quy theo biến số thực: x2*x2 -0,76301 0,417397 0,104954 Y= -220,844 + 8,844 Z1 + 0,0176Z2 + x3*x3 -2,85976 0,417397 0,000131 5,98Z3 - 0,0804Z12 - 1,144Z32 Bảng 6. Kết quả phân tích phương sai Anova của thí nghiệm tối ưu hóa y DF SS MS F (variance) Total 18 15926,3 884,795 Constant 1 15624,6 15624,6 Total Corrected 17 301,724 17,7484 Regression 9 284,088 31,5653 14,3186 Residual 8 17,6359 2,20449 N = 18 Q2 = 0,598 Cond. no. = 4,3489 DF = 8 R2 = 0,942 Y-miss = 0 Trong đó R2: hệ số xác định; SS: tổng bình phương (sum of squares); DF: bậc tự do (degrees of freedom); MS: trung bình bình phương (mean square); F: F-value. Giá trị F có độ tin cậy ở 95%. 128 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Dựa vào kết quả của bảng phân tích (Gabrielsson et al., 2002) và độ sai lệch giữa ANOVA, chúng tôi nhận thấy kết quả có ý nghĩa chúng ∈ [0,2 ; 0,3] (Eriksson et al., 2000) cho thống kê ở mức P 0,8 và Q2 >0,5 diễn dưới dạng không gian ba chiều như sau: Hình 2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố lên mức độ thủy phân trong không gian ba chiều. Kết quả chiếu xuống bề mặt đáp ứng như sau: Hình 3. Đồ thị vòng dự đoán kết quả quy hoạch thực nghiệm Điều kiện tối ưu cho quá trình thu nhận mẫu thí nghiệm lặp lại độc lập dựa trên các giá collagen được xác định bằng phần mềm Modde trị tối ưu như đã nêu ở trên. Mức độ thủy phân 5.0. Tương tác giữa nhiệt độ, thời gian và tỉ lệ DH% thu được là 34,20 ± 0,58 (%). Kết quả E/S là đường cong có cực đại. Cả ba yếu tố này gần với kết quả dự đoán từ phương trình ảnh hưởng trực tiếp lên hiệu suất thủy phân. hồi quy nêu trên. Tại điều kiện tối ưu thời gian thủy phân là 260 Từ các khảo sát trên, chúng tôi có thể chọn (phút) nhiệt độ 55,5oC, tỷ lệ E/S 1,25% mức độ ra thông số công nghệ cho quá trình thủy phân thủy phân đạt cực đại là 34,64 (%). Để kiểm bằng Corolase 7089 như sau: nhiệt độ 55,50C chứng tính chính xác của giá trị nhận được từ pH: 8, thời gian: 260 phút, tỷ lệ E/S: 1,25%. phương trình hồi quy chúng tôi đã tiến hành 3 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 129
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 3.3. Đánh giá kích thước phân tử của sản collagen trong da trở nên lỏng lẻo sau đó dùng phẩm thuỷ phân nước để chiết ở nhiệt độ cao để phá vỡ cấu Để đánh giá hai quá trình thủy phân, dịch trúc triple helix tạo những phân tử gelatin kích sau thuỷ phân của từng giai đoạn được lọc qua thước nhỏ hơn. Tuy nhiên, theo phương pháp màng lọc cut-off 30, 10 và 3kDa (Amicon – này dịch chiết có pH thấp thường 30 5,17 chuỗi xoắn ốc bậc ba bền vững của collagen sẽ bị phá hủy, dẫn đến thay đổi cấu trúc xoắn < 30 94,83 cuộn (helix-to-coil). Điều này giúp collagen dễ dàng thoát ra ngoài dung dịch (Benjakul et al., 10< x< 30 7,62 2007). Thêm vào đó, một số liên kết peptide
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 có gần 90% protein có khối lượng
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 STUDY ON EXTRACTION AND HYDROLYSIS OF COLLAGEN FROM TRA CATFISH SKIN (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyen Thi Huong Thao1, Dinh Thi Men1, Nguyen Thi My Thuan1 ABSTRACT Collagen was extracted from the pretreated Tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus) skin then hydrolyzed by enzyme to isolate collagen hydrolysate. The results showed that collagen was ex- tracted four times in water with the yield of over 85%. Hydrolysis conditions were optimized by using a response surface methodology (RSM). An enzyme to substrate level of 1.25% (v/w), tem- perature of 55.5oC the time of 260 minutes and pH of 8.0 were found to be the optimum conditions to obtain the highest degree of hydrolysis (over 34%) using Corolase 7089. The collagen hydroly- sate produced contained 87% collagen with molecular weight below 10kDa in which the fraction below 3kDa occupied 60%.This process is suitable to produce collagen hydrolysate for cosmetic and food application. Key words: collagen hydrolysate, Corolase, degree of hydrolysis, response surface methodology (RSM), Tra catfish skin. Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Lan Chi Ngày nhận bài: 6/6/2013 Ngày thông qua phản biện: 20/6/2013 Ngày duyệt đăng: 8/7/2013 1 Center for Fisheries Post Harvest Technology, Research Institute for Aquacutute No2 Email: nthuongthao@yahoo.com 132 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013