Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng tích lũy solsodine ở tế bào in vitro của cây cà gai leo (solanum hainanense hance)

Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 -

50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền, làm nguyên

liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong đó, trên 2/3 khối lượng này được

khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Khối lượng

dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa

vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu

khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con

số thống kê cụ thể [10].

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) còn gọi là cà quạnh, cà gai dây,

cà quýnh, cà vạnh, chẻ nan (Tày), b’rongoon (Ba Na), có tên khoa học khác là

Solanum procumben Lour., thuộc họ Cà (Solanaceae) [18]. Trong thành phần hóa

học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, đ y là một steroid alkaloid được

t m thấy ở khoảng 250 loài c y khác nhau thuộc họ Cà, đ c biệt là chi Solanum,

ch ng thư ng tồn tại ở dạng glycoside. Các nghiên c u trước đ y cho thấy

solasodine có hoạt t nh kháng viêm và bảo vệ gan, chống lại tế bào ung thư (đ c

biệt là ngăn ngừa ung thư da). Solasodine còn là tiền chất để sản xuất các loại

corticosteroid, testosteroid và thuốc tránh thai. Ngoài ra, ch ng còn có tác dụng

chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan [14]. Gần đ y, nghiên c u cho thấy solasodine

còn có tác dụng bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở ngư i như Herpes simplex,

H. zoster và H. genitalis (Chating và cs), bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của

vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol trong máu… [64].

Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai leo được khai thác chủ yếu từ nguồn

hoang dại, ch ng thư ng phân tán manh múm và chất lượng không đồng đều, trữ

lượng có giới hạn và hiện đang cạn kiệt do bị thu hái bừa bãi. Vì thế, nguồn nguyên

liệu này không đủ để đáp ng cho việc nghiên c u và điều trị.

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những lĩnh vực ng dụng đạt

nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Phương pháp này với

những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong th i

1

gian ngắn, hàm lượng hợp chất th cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy

trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học

trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên [63].

Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ

vào hệ thống tế bào sống thì khởi động ho c cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC

trong tế bào đó [65]. Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung

elicitor vào môi trư ng nuôi cấy là phương th c để thu được các sản phẩm HCTC

có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi

sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong nuôi cấy tế bào vừa có thể rút

ngắn th i gian lại đạt năng suất cao [42]. Nghiên c u nuôi cấy tế bào huyền phù có

bổ sung elicitor đã được thực hiện thành công ở một số đối tượng như c y nh n s m

(Panax ginseng) [60], [99], rau má (Centella asiatica) [57], giây dác (Cayratia

trifolia) [87], sen tuyết (Saussurea medusa) [106], [112], Pueraria tuberosa [80].…

Các elicitor thư ng được sử dụng trong các nghiên c u là methyl jasmonate

(MeJA), salicylic acid (SA), dịch chiết nấm men (YE), jasmonic acid (JA), ethrel,

chitosan... [57], [62], [65].

Hiện nay đã có một số nghiên c u sản xuất glycoalkaloid toàn phần nói

chung và solasodine nói riêng từ cây cà gai leo, tuy nhiên hiệu suất chưa cao.

Nghiên c u khả năng t ch lũy glycoalkaloid toàn phần trong callus cà gai leo cho

thấy hàm lượng đạt cao nhất 128,17 mg/g khối lượng khô sau 7 tuần nuôi cấy [56].

Các tác giả cũng đã khảo sát khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo và

kết quả cho thấy hàm lượng cao nhất thu được là 121,01 mg/g khối lượng khô sau 4

tuần nuôi cấy [59]. Những nghiên c u này đều thu được kết quả là hàm lượng

glycoalkaloid toàn phần hay solasodine trong callus và tế bào đều cao hơn so với

cây tự nhiên, tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao. Sử dụng các elicitor thực vật có thể

cải thiện được vấn đề này.

Xuất phát từ đó, ch ng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ả ưởng c a một

số elicitor lên khả ă g lũy sol sod e ở t bào in vitro c a cây cà gai leo

(Solanum hainanense Hance). p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù

tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự

2

nhiên cho các nghiên c u trong lĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở

cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế bào để ng dụng

trong lĩnh vực dược phẩm sau này.

Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế

bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).

g o

Kết quả nghiên c u của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá

trị về khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung

các elicitor. Đồng th i luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên c u và

giảng dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đư ng nuôi cấy tế

bào thực vật.

Đề tài là hướng nghiên c u có tiềm năng ng dụng trong lĩnh vực sản xuất

hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào

việc bảo vệ và chăm sóc s c khỏe cộng đồng.

g g g l

Đ y là một trong những công tr nh đầu tiên tại Việt Nam nghiên c u ảnh

hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế

bào cà gai leo. Kết quả của luận án là đáng tin cậy và có thể sử dụng để tiếp tục

nghiên c u phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn.

g ứ

Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro tại Phòng thí

nghiệm Hợp chất th cấp, Viện Tài nguyên, Môi trư ng và Công nghệ sinh học,

Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng 11 năm 2014.

3

C ươ g 1.

1.1. C C C C Ừ C

C

Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là quá tr nh điều khiển sự phát sinh

hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy tách r i trong điều kiện in vitro có định

hướng thành những cấu trúc biệt hóa hay chưa biệt hóa của tế bào trên cơ sở tính

toàn năng của tế bào thực vật [42].

Nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng lớn trong việc cải thiện khả năng tổng

hợp các HCTC có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không

thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật ho c tổng hợp bằng phương pháp hóa

học. Sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được

mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên c u này. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào

thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn

lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].

Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các HCTC

từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều HCTC được sản xuất trong suốt

quá trình phân hóa tế bào, vì thế ch ng được tìm thấy trong các mô có khả năng

ph n hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không

xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất th cấp có khuynh hướng ngưng tạo

thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi

cấy huyền phù thư ng tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có

sự tiếp xúc với môi trư ng khác các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện

ở một m c độ nào đó trong khối để tạo thành các HCTC [7].

Nuôi cấy tế bào thực vật sinh trưởng chậm hơn so với vi khuẩn, th i gian

nh n đôi trong khoảng 24-72 gi . Sự khác nhau này dẫn đến việc phải sử dụng các

điều kiện vô trùng tuyệt đối cho nuôi cấy tế bào thực vật. Thông thư ng, tế bào nuôi

cấy không quang hợp, vì vậy phải bổ sung đư ng làm nguồn carbon. Đ y là nguồn

năng lượng hiệu quả nhất để sản xuất HCTC. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào nhanh

4

hơn so với nuôi cấy callus hay mô, cơ quan; thao tác dễ dàng và có khả năng tương

thích với các thiết bị nuôi cấy tế bào sử dụng cho vi sinh vật [79].

1.1.1. C ươ g y o c v t

1.1.1.1. Nuôi cấy mẻ

Nuôi cấy mẻ là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt th i gian nuôi cấy

không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sinh khối hay sản phẩm

cuối cùng của quá tr nh trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trư ng thay đổi

theo th i gian, mật độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy

mẻ được xem là một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo

một số pha nhất định với những điều kiện đ c trưng [8].

Trước khi nuôi cấy mẻ, cần thiết phải tiến hành cấy chuyển. Quá trình nuôi

cấy đầu tiên trong b nh tam giác, sau đó tế bào nuôi cấy được đưa vào hệ lên men

nhỏ, rồi cấy chuyển vào hệ lên men lớn hơn. C tiếp tục như vậy cho đến khi đạt

được thể tích thích hợp. Điều kiện bên trong hệ lên men sẽ thay đổi trong một chu

kỳ nuôi cấy mẻ, với sản phẩm và nồng độ tế bào tăng trong khi chất dinh dưỡng cạn

kiệt dần. Nhưng không có thành phần nào được bổ sung vào trong chu kỳ nuôi cấy.

Tất cả mẻ nuôi cấy sẽ được thu hồi khi sản phẩm th cấp đạt giá trị cực đại [8].

Các bình ch a mẫu được đ t trên máy lắc với tốc độ 50-200 vòng/phút ho c

có thể nuôi cấy trong hệ lên men có cánh khuấy và sục khí tạo thuận lợi cho sự trao

đổi khí, sự lưu thông của môi trư ng dinh dưỡng trong b nh nuôi cũng như gia tăng

sự tiếp xúc giữa tế bào nuôi cấy với môi trư ng. Trong đó, nuôi cấy dịch huyền phù

ch a các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng ph n tán trong môi trư ng lỏng.

Thư ng khởi đầu bằng cách đ t các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trư ng lỏng

chuyển động (lắc ho c khuấy) [8].

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những

chuyển động xoáy của môi trư ng. Sau một th i gian ngắn nuôi cấy, trong dịch

huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào với k ch thước khác nhau, các

mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền

phù hoàn hảo, ch a tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. M c độ

5

tách r i của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đ c tính của các khối tế bào xốp và

có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trư ng [63].

1.1.1.2. Nuôi cấy mẻ đ ạn

Phương pháp nuôi cấy mẻ hai giai đoạn được áp dụng đối với nhiều loại tế

bào thực vật, và thành công đầu tiên là sản xuất hợp chất shikonin. Trong phương

pháp này, hai môi trư ng được sử dụng. Trong hệ lên men đầu tiên, điều kiện nuôi

cấy được tối ưu hóa cho sản xuất sinh khối tế bào. Sau đó, các tế bào được tập trung

và đưa vào hệ lên men th hai ch a môi trư ng kích thích sự tổng hợp các sản

phẩm th cấp [8].

1.1.1.3. Nuôi cấy mẻ có cung cấp d dưỡng

Đ y là một hình th c khác của hệ thống nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào nuôi cấy

sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này các chất dinh

dưỡng mới sẽ được cung cấp thêm vào hệ lên men mà không loại bỏ dịch nuôi cũ.

Trong hệ lên men này, có hệ thống điều khiển hàm lượng các chất dinh dưỡng được

thêm vào giúp hạn chế hay tăng cư ng tốc độ sinh trưởng ho c sự t ch lũy HCTC.

Tuy nhiên, trong trư ng hợp này thể tích dịch nuôi sẽ tăng lên, môi trư ng dinh

dưỡng dưới dạng đậm đ c sẽ được sử dụng để hạn chế vấn đề này. Đ y vẫn được

gọi là nuôi cấy mẻ vì toàn bộ thể tích của hệ lên men cuối cùng vẫn được thu hồi

theo từng mẻ [8].

1.1.1.4. Nuôi cấy liên tục

Nhược điểm của nuôi cấy mẻ là tốn th i gian khử trùng và cấy chuyển. Nuôi

cấy liên tục là phương pháp kinh tế hơn vì giúp kéo dài th i gian nuôi cấy hay kéo

dài pha log ít nhất vài tháng. Ở hệ thống này, dòng đi vào (môi trư ng mới) bằng

với dòng đi ra (môi trư ng + tế bào và hợp chất trao đổi) để giữ thể tích luôn không

đổi, và điều kiện của hệ thống luôn duy trì ổn định [79].

Do vậy, trong phương pháp nuôi cấy liên tục không những k ch thước trung

bình, trạng thái sinh lý của tế bào mà cả môi trư ng nuôi cấy đều không đổi và

không phụ thuộc vào th i gian, điều này một m t tạo điều kiện nghiên c u sinh

trưởng và sinh lý của tế bào, m t khác cải thiện quá trình sản xuất tế bào ở qui mô

công nghiệp [8].

6

Bản chất của quá trình nuôi cấy liên tục ở trạng thái ổn định cũng có thuận

lợi do dễ dàng điều chỉnh hơn hệ lên men mẻ. Trong suốt th i gian nuôi cấy mẻ,

nhiệt lượng, sự sản xuất kiềm ho c acid, và sự tiêu hao oxygen sẽ biến thiên từ các

tốc độ rất thấp ở lúc bắt đầu tới tốc độ rất cao trong suốt pha log muộn. Vì vậy, điều

chỉnh môi trư ng của một hệ thống như thế khó hơn nhiều so với quá trình liên tục

ở trạng thái ổn định các tốc độ sản xuất và tiêu thụ là hằng số [79].

Về lý thuyết, nuôi cấy liên tục là phương pháp nuôi cấy đầy triển vọng để thu

được các sản phẩm với nồng độ cao; Seki và cs (1997), Phisalaphong và Linden

(1999) đã nghiên c u tăng hiệu suất paclitaxel bằng nuôi cấy liên tục tế bào Taxus

cuspidata và sử dụng nuôi cấy bán liên tục tế bào T. canadensis [94].

Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hạn chế trong nuôi cấy liên tục. Các tế bào luôn ở

trạng thái sinh lý không đổi, nhưng sự t ch lũy các HCTC thư ng diễn ra trong các

tế bào có tốc độ sinh trưởng thấp. Vì vậy, kỹ thuật này chỉ nên áp dụng cho những

sản phẩm trao đổi nào được sản xuất trong quá tr nh sinh trưởng. Nhược điểm th

hai của nuôi cấy liên tục là th i gian nuôi cấy dài làm tăng khả năng dễ bị nhiễm bởi

vi sinh vật (Ramawat và Merillon, 2004).

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện và sản xuất

các hoạt chất sinh học có giá trị. Khả năng ng dụng của phương pháp này thể hiện

qua việc có rất nhiều công trình nghiên c u mới được công bố. Những năm gần đ y,

sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi

nhất trong lĩnh vực nghiên c u này, đ c biệt là khả năng có thể thay đổi nguồn lợi

các hoạt chất sinh học từ thực vật bằng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào. Ưu thế về

m t nguyên lý của công nghệ này là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để

tách chiết một tỷ lệ lớn lượng dược chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].

1.1. . ả ứ

1. p ấ ấp

Hiện tượng trao đổi chất th cấp đã được công nhận từ giai đoạn sớm của thí

nghiệm thực vật hiện đại. Trong công trình xuất bản năm 1873, Julius Sachs, một

ngư i tiên phong trong sinh lý thực vật, đã mô tả như sau: "Ch ng ta có thể chỉ rõ

7

các sản phẩm phụ của quá tr nh trao đổi chất như là các hợp chất được tạo ra bởi

trao đổi chất, nhưng ch ng không chỉ được sử dụng cho việc hình thành các tế bào

mới. Vai trò quan trọng khác của những hợp chất này đối với việc kiểm soát bên

trong thực vật vẫn chưa được biết đến". Sachs không đề cập đến những ch c năng

của các sản phẩm phụ mà ngày nay được biết đến là các HCTC (dẫn theo

Neumannn, 2009) [66].

Các sản phẩm trao đổi th cấp thư ng chiếm một lượng nhỏ (nhỏ hơn 1%

trọng lượng khô) và độc lập cao trong th i kỳ sinh lý và phát triển của thực vật.

M c dù vai trò của HCTC dư ng như không được thừa nhận trong việc duy trì quá

trình sống cơ bản của thực vật - nơi mà ch ng được tổng hợp, chúng lại có vai trò

quan trọng trong sự tương tác giữa thực vật với môi trư ng. Nghiên c u chất trao

đổi th cấp thực chất là lĩnh vực hấp dẫn của sinh lý học thực vật nói riêng hay thực

vật học nói chung [66].

Các HCTC có tác dụng dược lý ho c độc t nh đến con ngư i và động vật

được gọi là các hoạt chất sinh học ở thực vật. Hoạt chất sinh học điển hình ở thực

vật cũng được h nh thành như các HCTC [27].

1.1.2.2. Vai trò củ p ấ ấp

HCTC được sản xuất trong cơ thể thực vật bên cạnh con đư ng sinh tổng

hợp và chuyển hóa sơ cấp của các hợp chất đ ch trong quá tr nh sinh trưởng và phát

triển (như carbohydrate, amino acid, protein và lipid). Ch ng có thể được xem như

là những sản phẩm hóa sinh "dự trữ" trong tế bào thực vật và không cần thiết cho

các ch c năng hàng ngày của cây. Trong hệ thống phát sinh loài, hoạt chất sinh học

th cấp ở thực vật được tổng hợp một cách ngẫu nhiên nhưng ch ng có những vai

trò nhất định. Một số trong chúng có khả năng nắm giữ các vai trò quan trọng trong

đ i sống thực vật. Ví dụ, flavonoid có thể bảo vệ chống lại các gốc tự do được sinh

ra trong quá trình quang hợp; terpenoid có thể thu hút côn trùng thụ phấn, phát tán

hạt, ho c c chế cạnh tranh giữa các loài thực vật; alkaloid giúp tránh sự tấn công

của động vật ăn cỏ ho c các loại côn trùng (phytoalexin). HCTC còn có tác dụng

phát tín hiệu phân tử tế bào ho c mang những ch c năng khác trong cơ thể thực vật.

Việc sản xuất các HCTC ở thực vật thư ng tuân theo quy luật. Do đó, hầu hết các

8

loài thực vật, ngay cả những loài c y lương thực phổ biến cũng có khả năng sản

xuất những loại hợp chất này. Tuy nhiên, các loài thực vật có độc tính ho c dược

t nh điển hình ch a những hoạt chất sinh học mạnh với nồng độ cao hơn so với các

loại c y lương thực [27].

Tế bào thực vật đã được sử dụng thành công như là một nhà máy sản xuất

lượng lớn HCTC dưới các điều kiện cụ thể [66]. Sản xuất HCTC bằng nuôi cấy tế

bào thực vật giúp khắc phục những khó khăn của phương pháp truyền thống như r t

ngắn th i gian, giảm chi phí nhân công, vấn đề m t bằng và nhất là có thể thu được

một lượng lớn sản phẩm như mong muốn. Ngày nay, phương pháp này đã được ng

dụng rộng rãi trên quy mô lớn và ngày càng có nhiều nghiên c u chuyên sâu nhằm

điều khiển để tăng hàm lượng các HCTC t ch lũy trong tế bào thực vật được nuôi

cấy.

Các nghiên c u cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất

các sản phẩm th cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó được chiết từ cây

ngoài tự nhiên (Bảng 1.1) [63].

Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng

tin cậy dựa trên cơ sở:

- Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển các yếu

tố môi trư ng nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng.

- Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên.

- Chọn giống cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn.

- Với việc tự động hóa, điều khiển sinh trưởng và điều hòa quá trình chuyển

hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên.

- Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm.

- Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất lượng

cao hơn c y hoàn chỉnh [64].

9

Bảng 1.1. Sản phẩm thứ c p từ nuôi c y t bào th c v t so sánh v i cây t nhiên [63]

Hiệu su t (% dw)

HCTC

Loài th c v t

Nuôi c y

Cây t nhiên

t bào

Shikonin

Lithospermum erythrorhizon

20,00 (s)

1,50

Ginsenoside

Panax ginseng

27,00 (c)

4,50

Anthraquinones

Morinda citrifolia

18,00 (s)

2,20

Ajmalicine

Catharanthus roseus

1,00 (s)

0,30

Rosmarinic acid

Coleus blumeii

15,00 (s)

3,00

Ubiquinone-10

Nicotiana tabacum

0,036 (s)

0,0003

Diosgenin

Dioscorea deltoides

2,00 (s)

2,00

Berberine

Thalictrurn minor

10,00 (s)

0,01

Berberine

Coptis japonica

10,00 (s)

2,00-4,00

Anthraquinone

Galium verum

5,40 (s)

1,20

Anthraquinone

G. aparbze

3,80 (s)

0,20

Nicotine

N. tabacum

3,40 (c)

2,00

Bisoclaurine

Stephania cepharantha

2,30 (s)

0,80

Tripdiolide

Tripterygium wilfordii

0,05 (s)

0,001

* Chú thích: (c): nuôi cấy callus; (s): nuôi cấy huyền phù.

1.1. . C g ứ sả ứ g y o

1. ư

Để sản xuất các sản phẩm th cấp từ thực vật, mô thực vật ngoại sinh từ cây

hoàn chỉnh được nuôi cấy huyền phù trong điều kiện vô trùng. Nhiều sản phẩm trao

đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn

trong cây hoàn chỉnh [42]. Các HCTC không chỉ là gia vị, chất tạo màu, tạo mùi mà

hầu hết là dược liệu.

Ở nước ta, một số dược liệu cũng được nghiên c u tách chiết từ tế bào thực

vật. Chẳng hạn, vincristin, vinblastin từ tế bào dừa cạn, solasodine từ tế bào cà gai

leo, curcumin từ tế bào nghệ đen, asiaticoside từ tế bào rau má …

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) là một trong những loài c y dược liệu

10

ch a nhiều alkaloid. Từ dừa cạn ngư i ta chiết được các chất chữa ung thư như

vinblastin, vincristin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin. Tuy nhiên, hàm

lượng của những chất này trong cây tự nhiên rất thấp. Bùi Văn Lệ và Nguyễn Ngọc

Hồng (2006) đã nghiên c u khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của một số chất kích thích

sinh trưởng lên quá trình tạo sinh khối tế bào và t ch lũy alkaloid toàn phần có trong

dịch nuôi cấy [5].

Solasodine là một hợp chất chính trong cây cà gai leo (S. hainanense) có

nhiều tác dụng dược lý đã được nghiên c u và công bố. Solasodine được tách chiết

từ cây tự nhiên nhưng hàm lượng chưa cao và nguồn nguyên liệu ngày càng khan

hiếm. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2010) đã nghiên c u sản xuất solasodine từ callus

cây cà gai leo in vitro và thu được kết quả cho thấy, hàm lượng solasodine t ch lũy

trong callus cao hơn khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi

[56]. Nhóm tác giả này (2011) cũng tiếp tục nghiên c u nuôi cấy tế bào cà gai leo

trong chai tam giác để thu solasodine và nhận thấy, solasodine t ch lũy trong tế bào

cao hơn trong callus [59].

Asiaticoside là hoạt chất chính của rau má (Centella asiatica), có hoạt tính

chống oxy hóa, chữa lành vết bỏng, bảo vệ tế bào thần kinh và sinh tổng hợp

collagen [7]. M c dù có nhiều hoạt tính quan trọng nhưng hàm lượng asiaticoside

trong c y rau má không đáng kể. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên c u

tạo callus và khảo sát khả năng t ch lũy asiaticoside trong callus c y rau má [6].

Thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù cây rau má và khảo sát sự t ch lũy asiaticoside

trong tế bào nuôi cấy cũng đã được Loc và An (2010) nghiên c u [55].

Quinone là một nhóm ch c nổi bật với tác dụng kháng lao, chống ung thư,

chữa phong, chống hen suyễn... được xác nhận có trong thành phần của Drosera

burmanni, là một loài thực vật bắt mồi nhỏ, thân thảo, mang nhiều giá trị ng dụng.

Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền

phù tế bào cây D. burmanni cho mục tiêu thu nhận quinone. Kết quả ghi nhận hàm

lượng Plumbagin (một trong nhóm những hợp chất naphthoquinone) trong sinh khối

tế bào là 0,02% [11].

Dịch chiết các loài Drosera đã từng được ch ng minh về khả năng kháng

11

oxy hóa từ rất nhiều nghiên c u trên thế giới cũng như từ khả năng trị liệu trong

những bài thuốc dân gian. Quách Ngô Diễm Phương và cs (2011) đã sàng lọc và ly

trích thành công một hợp chất flavonoid từ ph n đoạn cao chiết có hoạt tính kháng

oxy hóa từ sinh khối cây D. indica nuôi cấy in vitro. Hợp chất được tinh sạch và xác

định cấu trúc là quercetin [13].

1. ư c

Một số dược chất có nguồn gốc thực vật như mao địa hoàng từ Digitalis

purpurea chữa trị rối loạn tim mạch, codeine từ cây anh túc (Papaver somniferum)

làm thuốc giảm đau, an thần, vinblastine và vincristine từ cây dừa cạn (C. roseus)

điều trị bệnh bạch cầu và quinine từ cây C. officinalis bệnh sốt rét. Routian và

Nickell nhận được bằng sáng chế đầu tiên về sản xuất một số hợp chất bằng nuôi

cấy tế bào thực vật vào năm 1956. Nhiều nhà nghiên c u đã sản xuất các hợp chất

có ích bằng nuôi cấy rễ tơ, callus và tế bào huyền phù. Sự đa dạng của các nguyên

liệu thực vật có thể thích ng với nuôi cấy rễ tơ và callus. Nuôi cấy tế bào huyền

phù Thalictrum minus sản xuất stomachic và berberine. Nuôi cấy callus Stizolobium

hassjo sản xuất thuốc chữa parkinson L-dopa. Nuôi cấy huyền phù Hyoscyamus

niger sản xuất một dẫn xuất của hyoscyamine chống tác động kiểu cholin [94].

Ngư i ta cũng đã thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây cà phê

(Coffea arabica), betalain trong callus củ cải đư ng, berberin từ tế bào cây Coptis

japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể

berberin trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương

pháp nuôi cấy tế bào). Những chất này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

hương liệu và trong y học [92].

Rễ của cây nhân sâm (P. ginseng) là một loại dược phẩm quý giá, có tác

dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đư ng, suy nhược cơ thể... Trong rễ của

nó ch a nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có

hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Furuya và cs (Đại học Kitasato,

Nhật) đã nghiên c u nuôi cấy mô callus P. ginseng từ những năm 1970. Kaisha

(1990) đã nghiên c u quy trình sản xuất trên quy mô lớn, sử dụng nhiều kiểu hệ lên

men khác nhau. Năm 1990, Staba (Đại học Minnesota, Mỹ) cũng đã thu được các tế

12

bào nuôi cấy P. ginseng ch a ginsenoside. Choi (1993) đã nghiên c u nuôi cấy P.

ginseng trên quy mô công nghiệp, tác giả nhận thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng tới

hàm lượng saponin trong callus và các tế bào nuôi cấy huyền phù; 3,62% saponin

tổng số được tìm thấy trong callus nuôi cấy trên môi trư ng cơ bản MS bổ sung

5,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN, nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên

môi trư ng có 10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (dẫn theo Misawa, 1994) [63].

Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và th n trên môi trư ng B5 bổ

sung 2 mg/L 2,4-D ho c NAA. Dòng tế bào được tạo ra từ callus có nguồn gốc từ

th n và lá. Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ sung các tiền chất và nuôi

trong 6 tuần th c một l t dịch huyền phù tế bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg taxol

[64].

Chất tanshinone I và cryptotanshinone của c y Salvia miltiorrhiza có tác dụng

ngăn ngừa biến ch ng thiếu máu cục bộ ở cơ tim; tanshinone II A đã thử nghiệm thành

công trong điều trị l m sàng ch ng đau thắt ngực ở Trung Quốc. Vincristine và

vinblastine được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào ở c y dừa cạn (Catharanthus roseus)

là các indole alkaloid đã trở thành thuốc có giá trị trong hóa trị liệu ung thư (theo

Vijaya, 2010) [103].

1. . ELICITOR C C

C C C C

1.2.1. Elicitor

1.2.1.1.

Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ

vào hệ thống tế bào sống thì khởi động ho c cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC

trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ng ho c tăng cư ng sinh

tổng hợp các chất chuyển hóa th cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor

[65].

Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra

từ thực vật bằng phản ng của mầm bệnh (elicitor nội sinh). Trên cơ sở bản chất tự

nhiên, elicitor có thể được ph n thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor

13

sinh học.

- Elicitor p s là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học,

gồm các muối vô cơ, các kim loại n ng và các tác nh n vật lý như sóng siêu m, áp

suất, nhiệt độ, và pH.

- El s là các chất có nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các

polysacharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin ho c cellulose), các vi

sinh vật (chitin ho c glucan) và các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào

có ch c năng là gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa ho c bất hoạt

một số enzyme ho c các kênh ion.

Bảng 1.2. Phân lo i elicitor trong sản xu t các h p ch t thứ c p [65]

A. Theo bản ch t elicitor

Các elicitor sinh h c

Các elicitor phi sinh h c

- Được giải phóng trực tiếp từ vi sinh vật và

- Tác dụng tự nhiên của các tác nhân vật lý ho c

được chấp nhận bởi tế bào thực vật (các

hóa học theo đư ng nội sinh tạo thành các

enzyme, các mảnh thành tế bào)

elicitor sinh học

- Được tạo thành bởi hoạt động của vi sinh

- Tia UV, Windfall

vật trên tế bào thực vật (các đoạn pectin) ...

- Các protein biến tính (Rnase)

- Được tạo thành bởi hoạt động của enzyme

- Đông và rã đông

thực vật trên các thành tế bào vi khuẩn

- Các thành phần không thiết yếu của môi trư ng

(chitosan, glucan)

(agarose, thiếc ...)

- Các hợp chất: nội sinh và tạo thành trong tự

- Các kim loại n ng

nhiên; được hình thành ho c tiết ra bởi tế bào

- Dùng các hóa chất:

thực vật khi đáp ng kích thích khác nhau.

+ Có ái lực cao với DNA

+ Có hoạt tính phá vỡ màng tế bào như thuốc

tẩy: các xenobiochemical;

+ Thuốc diệt nấm (maneb, butylamin, benomyl);

thuốc diệt cỏ (acifluorofen)

B. Theo nguồn gốc c a elicitor

Các elicitor ngo i sinh

Các elicitor nội sinh

- Hình thành từ bên ngoài tế bào, bao gồm

- Được tạo thành qua các phản ng th cấp, cảm

phản ng trực tiếp ho c qua các chất nội sinh

ng bằng một tín hiệu sinh học ho c phi sinh học

trung gian

trong tế bào

- Polysaccharide: glucomanose, glucan,

- Dodeca-β-1,4-D-galacturonide

14

chitosan

- Hepta-β-glucoside

- Peptide và chuỗi các

ion dương:

- Alginate oligomer

monilicolin,

poly-L-lysine,

polyamine,

glycoprotein

-

Enzyme:

polygalacturonase,

endo-

polygalacturonase acid lyase, cellulase

- Acid béo:

acid

arachidonic,

acid

eicosapentanoic

Ngoài ra, có thể ph n loại elicitor dựa trên nguồn gốc của ch ng. Có 2 loại

elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh

- Elicitor ạ s là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các

polysaccharide, polyamine và các acid béo.

- Elicitor ội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được h nh thành

thông qua các phản ng th cấp, được cảm ng bằng t n hiệu sinh học hay phi sinh

học, chẳng hạn như galacturonide ho c hepta-β-glucoside v.v...[65].

1. dụ

Elicitor thực vật là các hóa chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng g y nên

các đáp ng về m t h nh thái, sinh lý và t ch lũy phytoalexin (chất được sinh ra ở

thực vật khi chịu tác động của các tác nh n g y bệnh). Ch ng có thể là các elicitor

phi sinh học như các ion kim loại, hợp chất vô cơ ho c elicitor sinh học có nguồn

gốc từ nấm, vi khuẩn ho c động vật ăn cỏ, mảnh vỡ thành tế bào thực vật cũng như

các hợp chất được giải phóng ra tại vị tr tổn thương của thực vật do mầm bệnh

ho c động vật tấn công. Việc thực vật bị xử lý bằng chất k ch kháng ho c bị tấn

công bằng mầm bệnh g y ra một loạt các phản ng phòng vệ, bao gồm sự t ch lũy

các HCTC bảo vệ ở cả trong c y tự nhiên cũng như trong nuôi cấy. M c dù đã có

những nghiên c u s u về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất HCTC trong

các thực vật, tuy nhiên cơ chế của sự elicitor vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có nhiều giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+, các yếu tố ảnh hưởng đến

sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đư ng c chế hay hoạt hóa nội bào ho c sự

thay đổi áp suất thẩm thấu [65].

15

Elicitor không chỉ cảm ng sự hình thành phytoalexin de novo mà còn hoạt

hóa sự sinh tổng hợp nhiều hợp chất chủ yếu trong tế bào nuôi cấy. Sự tổng hợp

sesquiterpene gossypol ở Gossypium arboretum tăng lên hơn 100 lần khi dùng

elicitor có nguồn gốc từ Verticillum dablia, hay sự tăng sinh tổng hợp của

benzopheanthridine alkaloid sanguinarine lên 26 lần khi sử dụng elicitor trong nuôi

cấy huyền phù tế bào Papaver somniferum. Sự cảm ng sinh tổng hợp isoflavonoid

ở huyền phù tế bào Pueraria lobata bằng elicitor sinh học (dịch chiết nấm men) hay

elicitor phi sinh học (CuCl2) đã được nghiên c u, đ c biệt ở m c độ phân tử.

Elicitor tạo điều kiện để nghiên c u ở m c phân tử của con đư ng truyền tín hiệu

thông qua những tín hiệu ngoại bào dẫn đến sự sinh tổng hợp HCTC, liên quan tới chất truyền tín hiệu th hai như nhóm oxygen hoạt hóa, Ca2+ và phosphoinositide

[65].

Những nghiên c u chuyên s u đã góp phần h nh thành cơ chế cho quá trình

cảm ng bằng elicitor ở thực vật. Các nghiên c u chủ yếu tập trung về các elicitor

sinh học và carbohydrate thông thư ng, còn sự hiểu biết về tác động của các elicitor

phi sinh học trong việc gia tăng vượt m c các HCTC ở thực vật vẫn còn rất sơ sài, quá trình cảm ng bằng elicitor được giả thuyết là bao gồm tín hiệu Ca2+, các nhân

tố đảm bảo tính nguyên vẹn của tế bào, sự ngăn cản hay hoạt hóa các con đư ng nội

bào và thay đổi áp suất thẩm thấu hoạt động như một tác nhân gây stress.

Những nghiên c u bước đầu về sự tác động của các elicitor sinh học ở hệ

thống thực vật được nghiên c u dựa vào cơ chế cảm ng trên tế bào động vật. Ở tế

bào động vật, các thụ quan (receptor) định vị ở màng tế bào sẽ hoạt hóa kênh ion và

protein kinase. Tương tự như thế, các bằng ch ng ch ng minh sự hiện diện của các

thụ quan ở màng tế bào thực vật đã được ghi nhận. Cơ chế cảm ng này dựa trên sự

tương tác giữa elicitor-thụ quan. Khi tế bào thực vật được xử lý với elicitor thì một

loạt các phản ng sinh hóa xảy ra, bao gồm:

- Elicitor gắn vào thụ quan ở màng tế bào. - Thay đổi dòng ion vào thông qua màng tế bào thực vật như kênh Cl-, K+, …, ở thực vật, Ca2+ hoạt động như chất truyền tin th hai với các đáp ng khác

nhau từ tín hiệu của môi trư ng kể cả mầm bệnh. Ví dụ, ở tế bào c y ngò t y, ngư i

16

ta từng phát hiện ra kênh calci đáp ng cảm ng và một kênh vận chuyển vào của

calci được tìm thấy trong vòng vài phút sau khi thêm vào elicitor từ nấm.

- Gia tăng hoạt tính của phospholipase thực vật được tìm thấy ở một vài mô

thực vật và nuôi cấy tế bào thực vật sau khi xử lý với elicitor, tổng hợp các tín hiệu

th cấp như InsP3 và deacylglycerol (DAG), giải phóng tín hiệu nội bào trung gian Ca2+, nitric oxyde và con đư ng tín hiệu octadecanoid.

- Sự thay đổi nhanh trong việc phosphoryl hóa protein được quan sát dựa

trên việc bổ sung elicitor của các nuôi cấy tế bào khác nhau. Những nghiên c u gần

đ y ch ng minh rằng sự phosphoryl hóa đóng một vai trò quan trọng trong sự

chuyển tín hiệu thực vật chống lại mầm bệnh và stress, hoạt hóa protein kinase.

- Hoạt hóa protein G (là một phần trong việc đáp ng tín hiệu với elicitor).

- Hoạt hóa NADPH oxydase đáp ng AOS (active oxide specie), acid hóa

cytosol.

- Tái sắp xếp lại bộ xương tế bào.

- Tạo các oxy hoạt động.

- T ch lũy các protein có liên quan đến mầm bệnh như chitinase và

glucanase, endopolygalacturonase… các nh n tố ngăn cản protease.

- Sự chết tế bào ở vị trí bị xâm nhiễm.

- Sự thay đổi cấu trúc ở màng tế bào (lignin hóa màng tế bào, tích tụ mô sẹo).

- Hoạt hóa phiên mã các gen đáp ng kháng.

- Các phân tử đề kháng của thực vật như tanin, phytoalexin được phát hiện 2-

4 gi sau khi xử lý với elicitor.

- Tổng hợp jasmonic và acid salicylic như một thông tin th cấp.

- Đáp ng tập nhiễm SAR (systemic acquired resistance).

Không phải tất cả các elicitor đều diễn ra theo chuỗi sự kiện phía trên, những

nghiên c u về trật tự th i gian của những sự kiện này và sự kết nối bên trong giữa

chúng còn nhiều ph c tạp và vẫn đang được nghiên c u [25].

1.2.1.3. Các y u tố ả ưở đ n quá trình cảm ng

Tăng cư ng sản xuất HCTC từ nuôi cấy tế bào thực vật thông qua sự cảm

ng đã mở ra một hướng nghiên c u mới trong công nghiệp dược phẩm. Các thông

17

số như thành phần và nồng độ elicitor, th i gian cảm ng, tuổi nuôi cấy, dòng tế

bào, chất điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng và đ c điểm thành tế bào

phù hợp có thể tăng khả năng t ch lũy các sản phẩm th cấp [65].

Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình

cảm ng. Prakash và cs (2008) nhận thấy khi bổ sung các elicitor jasmonic acid, YE

và chitosan ở các nồng độ khác nhau đều tác động đến sự t ch lũy azadirachtin trong

tế bào Azadirachtin indica. Bổ sung jasmonic acid và YE ở nồng độ cao (100 mg/L)

cho hiệu quả t ch lũy azadirachtin tốt hơn ở nồng độ thấp (10-50 mg/L). Trong khi

đó, nồng độ chitosan thấp (50 mg/L) k ch th ch azadirachtin t ch lũy cao hơn và

giảm dần khi tăng lượng chitosan (100-500 mg/L) [77].

Thời gian tiếp xúc với elicitor: Nghiên c u của Namdeo và cs (2007) cho

thấy sản xuất ajmalicine tăng khoảng 3 lần bởi ở tế bào C. roseus được cảm ng với

dịch chiết của T. viride trong 48 gi , trong khi đó tăng 2 lần ở tế bào được cảm ng

bởi dịch chiết của A. niger và F. moniliforme. Tuy nhiên, th i gian tiếp x c cao hơn

96 gi làm giảm ajmalicine t ch lũy. Kết quả tương tự cũng được công bố bởi

Rijhwani và Shanks (1998), Moreno và cs (1993), Negeral và Javelle (1995) [65].

Thời kỳ nuôi cấy: Th i điểm cấy chuyển là một yếu tố quan trọng trong sản

xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học nh sự cảm ng. Kết quả sản xuất

ajmalicine từ tế bào C. roseus của Namdeo và cs (2007) cho thấy ajmalicine cao

nhất (166 µ/g, dw) được t ch lũy trong tế bào 20 ngày tuổi được xử lý với dịch chiết

của T. viride [65].

Thành phần dinh dưỡng: Thành phần môi trư ng cũng đóng một vai trò quan

trọng cho quá trình cảm ng. Theo Namdeo và cs (2007), sự t ch lũy ajmalicine

trong môi trư ng Zenk nhiều hơn so với môi trư ng MS [65].

Ngoài ra, ảnh hưởng của sự cảm ng cũng còn phụ thuộc vào đ c tính của

elicitor, dòng tế bào ho c các dòng vi sinh vật sử dụng elicitor, sự có m t của các

chất điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng của môi trư ng và các điều kiện

nuôi cấy [65].

1.2.2. Nghiên cứu ứ g d g elicitor o g y o

1.2.2.1. Nghiên c u ở ư

18

Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor trong các nghiên c u cải thiện khả năng

t ch lũy các HCTC khi nuôi cấy tế bào mới được quan tâm trong th i gian gần đ y.

Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã thử nghiệm tăng sinh hàm lượng

quinone trong cây D. burmanni in vitro bằng phương pháp sử dụng elicitor. Kết quả

cho thấy khả năng làm thay đổi hàm lượng hoạt chất trong cây in vitro của các tác

nhân cảm ng bao gồm: chất dẫn truyền tín hiệu (SA), tác nhân cảm ng cây phản

ng phòng vệ (vi khuẩn và nấm men) hay kỹ thuật g y stress điều kiện nuôi cấy

(stress dinh dưỡng). Trong đó, khi bổ sung dịch chiết nấm men, hàm lượng quinone

tăng từ 1,12-2,66 lần so với đối ch ng, salicylic acid làm tăng 1,2-2,0 lần, sinh khối

vi khuẩn làm tăng 1,22-2,46 lần và g y stress dinh dưỡng làm tăng 1,15-1,5 lần hàm

lượng quinone trong cây so với đối ch ng [12].

Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2012) nghiên c u ảnh hưởng của 2-hydroxy-

benzoic acid và dịch chiết nấm men đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp

asiaticoside trong nuôi cấy tế bào cây rau má (Centella asiatica). Kết quả nhận thấy

khi bổ sung ở ngày th 10 của nuôi cấy lần lượt 100 µM 2-hydroxybenzoic acid và

4 g/L dịch chiết nấm men, hàm lượng asiaticoside t ch lũy trong tế bào rau má tăng

gấp 5 và 3,5 lần so với đối ch ng không cảm ng [57].

1.2.2.2. Nghiên c u ở trên th gi i

Trên thế giới cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên c u về ảnh

hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng và khả năng t ch lũy HCTC từ nuôi cấy tế bào

thực vật. Hầu hết các nghiên c u cho thấy hàm lượng HCTC tăng lên khi bổ sung

elicitor. Cụ thể:

Pereira và cs (2007) sử dụng các elicitor sinh học (Candida albicans,

Fusarium oxyporum, Penicillium avelanium và Saccharomyces cerevisiae) để

nghiên c u tăng khả năng t ch lũy triterpene (oleanolic acid và ursolic acid) trong

nuôi cấy tế bào Tebernaemontana catharinensis. Kết quả cho thấy, S. cerevisiae có

khả năng làm tăng t ch lũy triterpene tốt nhất, đạt 5 và 7 mg/g khối lượng khô lần

lượt cho ursolic và oleanolic acid. Trong khi đó các elicitor còn lại ảnh hưởng kém

hơn đến khả năng t ch lũy triterpene trong nuôi cấy tế bào T. catharinensis [73].

19

Ramawat và cs (2008) đã nghiên c u cải thiện khả năng t ch lũy

isofllavonoid trong tế bào loài Pueraria tuberosa bằng MeJA, SA và YE. Kết quả

cho thấy isoflavonoid đạt được cao nhất khi bổ sung 150 mg/L YE [80].

Keng và cs (2010) sử dụng 4 loại elicitor: chitosan, NaH2PO4, Na2CO3 và

polyvinylpyrrolidone (PVP) để khảo sát ảnh hưởng của ch ng đến khả năng t ch lũy

alkaloid trong tế bào Eurycoma longifolia nuôi cấy huyền phù. Hai alkaloid trong

nghiên c u này là 9-hydroxycanthin-6-one và 9-methoxycanthin-6-one. Kết quả sau 13

ngày nuôi cấy có xử lý elicitor cho thấy, bổ sung NaH2PO4 tăng khả năng t ch lũy 2

loại alkaloid cao hơn các loại elicitor còn lại. Cụ thể ở nồng độ 2 mg/L và 20 mg/L

NaH2PO4 lần lượt đạt được 0,94% 9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-

one là 0,75% so với đối ch ng 0,08% [50].

Rhee và cs (2010) nghiên c u tăng cư ng khả năng t ch lũy decursin và

decursinol trong nuôi cấy rễ và rễ tự nhiên của cây Angelica gigas Nakai bằng elicitor. Các loại elicitor được sử dụng gồm YE, chitin, MeJA, SA và Cu2+. Nuôi cấy rễ A. gigas với sự bổ sung kết hợp 2 g/L YE và 0,5 mM Cu2+ tại pha cuối của

đư ng cong sinh trưởng đã tăng sự t ch lũy decursin và decursinol lên 6,86 mg/l,

cao gấp 3,22 lần so với đối ch ng [86].

Cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) được nuôi cấy in vitro trong hệ lên men

2,5 L sau 17 đến 22 tuần. Cousins và cs (2010) đã sử dụng nhiều elicitor khác nhau

để tăng khả năng tổng hợp các HCTC ở cây này. Ở thí nghiệm th nhất,

phenylalanine ho c MeJA được bổ sung vào môi trư ng nuôi cấy từ tuần th 12 đến

17. Thí nghiệm th 2, c y con được bổ sung các chất như proline, dịch chiết cá giàu

proline, MeJA ho c chitosan vào tuần th 20 (th i gian kéo dài 1,5 tuần). Sau 5

tuần xử lý ở thí nghiệm th nhất, sinh khối của cây giảm và sự t ch lũy các hợp chất

chống oxy hóa cũng giảm, sự suy giảm khả năng chống oxy hóa tương tự nhau khi

xử lý riêng lẽ phenylalanine, MeJA ho c xử lý kết hợp. Ở thí nghiệm th 2, khi xử

lý stress nitrogen ở nồng độ thấp, hàm lượng các hợp chất phenol tăng lên, chiếm

4,7% khối lượng khô, cao hơn đối ch ng chiếm 4,1% khối lượng khô [40].

Hiệu quả của các oligosaccharide (DP4, DP7 và DP10) tách chiết từ Fusarium

oxysporum Dzf17 lên khả năng sản xuất diosgenin ở c y Dioscorea zingiberensis đã

20

được Li và cs (2011) nghiên c u. Tế bào huyền phù được xử lý elicitor sau 26 ngày

nuôi (hỗn hợp oligosaccharide ở nồng độ 20 mg/L) và thu vào ngày th 32. Hàm

lượng diosgenin thu được cao nhất là (2,187 mg/L), gấp 5,65 lần so với đối ch ng

(0,387 mg/L). Xử lý elicitor riêng lẻ ở các nồng độ 2-10 mg/L, công th c xử lý DP7

6 mg/L cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng diosgenin đạt 3,202 mg/L, gấp 8,27 lần

đối ch ng. Khi xử lý DP7 hai lần vào ngày 24 và 26 và thu vào ngày 30, hàm lượng

diosgenin tăng lên đáng kể (4,843 mg/L, gấp 12,38 lần so với đối ch ng) [53].

Veerashree và cs (2012) đã nghiên c u ảnh hưởng của elicitor lên sự tạo thành

gymnemic acid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Gymnema sylvestre. Nuôi cấy dịch

huyền phù tế bào G. sylvestre được xử lý với 4 elicitor khác nhau: MeJA, YE,

chitin, và pectin. Kết quả cho thấy cả 4 loại elicitor được thử nghiệm đều cảm ng

sự tạo thành gymnenic acid trong nuôi cấy huyền phù. Hàm lượng gymnemic acid

đạt được cao nhất sau khi xử lý với YE (100,47 mg/L), tiếp đó MeJA (70,43 mg/L),

pectin (64,19 mg/L) và chitin (62,72 mg/L). Việc bổ sung elicitor đã có những tác

động quan trọng đến sự sinh trưởng tế bào so với mẫu đối ch ng tương ng. Hàm

lượng gymnemic acid đạt cao nhất sau khi xử lý với 0,5 g/L dịch YE trong 20 ngày

nuôi cấy, cao gấp 5,25 lần so với mẫu đối ch ng [102].

Bota và cs (2012) đã sử dụng 2 chủng Botrytis và Sclerotinia là tác nhân cảm

ng để sản xuất flavonoid ở c y Digitalis lanata. Các tác giả đã sử dụng 1-2 mL

dịch nấm/100 mL dịch huyền phù để cảm ng dòng tế bào số 11 và 13. Kết quả cho

thấy ở cả 2 dòng tế bào và 2 elicitor, sự t ch lũy flavonoid đều tăng theo th i gian và

nồng độ xử lý. Hàm lượng flavonoid thu được sau 96 gi cảm ng, tế bào dòng 11

đạt 1000 mg% với Botrytis và 999,81 mg% với Sclerotinia, dòng tế bào 13 đạt

1051,65 mg% với Botrytis và 1025,43 mg% với Sclerotinia [32].

Admeh và cs (2014) đã sử dụng dịch chiết A. niger, Penicillium notatum,

YE, và chitosan để cảm ng sản xuất psoralen trong quá tr nh nuôi cấy tế bào c y

Psoralea corylifolia. Xử lý elicitor bằng A. niger làm tăng quá tr nh sản xuất

psoralen lên 9 lần so với đối ch ng. Xử lý bằng Penicillium notatum, YE, và

chitosan làm tăng t ch lũy psoralen lên 4-7 lần. Công th c xử lý A. niger ở nồng độ

1% cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng psoralen đạt 9,850 μg/g sinh khối khô [21].

21

Nghiên c u ảnh hưởng của MeJA đến khả năng t ch lũy astragaloside ở rễ tơ

cây Astragalus membranaceus 34 ngày tuổi, Jiao và cs (2014) nhận thấy hàm lượng

đạt cao nhất khi xử lý 157,4 µM MJ trong 18,4 gi . Astragaloside đạt 5,5 ± 0,13

mg/g khối lượng khô, cao hơn 2,1 lần so với mẫu đối ch ng (2,7 ± 0,05 mg/g khối

lượng khô) [49].

Các elicitor sinh học (dịch chiết Rhizopus oligosporus và A. niger) và phi

sinh học (MeJA và SA) đã được Vaddadi và cs (2015) sử dụng để tăng cư ng khả

năng tổng hợp các hoạt chất sinh học ở cây cà phê vối (Coffea canephora). Kết quả

nghiên c u cho thấy các elicitor đã làm tăng đáng kể các HCTC được tổng hợp,

caffeine tăng 42%, theobromine tăng 39%, trigonelline tăng 46%, cafestol và

kahweol tăng 32% [100].

1.3. CÂY C

1. .1. s

1. ố p ố

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn

có tên khoa học khác là Solanum procumbens. Ngoài ra, cà gai leo còn có nhiều tên

gọi địa phương khác như: cà quánh, cà quạnh, cà quýnh, cà bò, cà cạnh, cà hải nam,

cà gai dây [2].

Cà gai leo mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đư ng, ở độ cao

dưới 300 m. Phân bố ở Bắc Giang (Yên Thế), Phú Thọ (Việt Trì), Hà Nội (Bưởi),

Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Khánh

Hoà, Gia Lai (An Khê, Kon Hà Nừng). Ngoài ra, còn có ở Trung Quốc (Hải Nam,

Quảng Đông, Quảng Tây) [9].

1. đ dư l ủ l

1.3.1.2.1. Đặc điểm hình thái và thành phần hóa học

Cà gai leo thuộc loại cây leo, thân dài 0,6-1,0 m hay dài hơn, rất nhiều gai dẹp,

cành xoè rộng, trên phủ lông hình sao. Lá hình tr ng hay thuôn, phần gốc lá hình

r u hay hơi tròn, mép nguyên hay lượn và khía thùy, hai m t nhất là m t dưới phủ

lông trắng nhạt, phiến dài 3-4 cm, rộng 12-20 mm, có gai, cuống dài 4-5 mm. Hoa

22

tím nhạt, nhị vàng họp thành xim gồm 2-4 hoa. Quả hình cầu, khi chín có màu vàng

bóng, nhẵn, đư ng kính 5-7 mm. Hạt màu vàng, hình thận, có mang dài 4 mm, rộng

2 mm [19].

Thành phần hoá học: toàn c y và đ c biệt ở rễ có ch a alkaloid, thành phần

chính là solasodine, solasodinine. Ngoài ra, còn ch a tinh bột, saponoside,

flavonoside và diosgenine [2].

1.3.1.2.2. Giá trị dược lý

Cà gai leo là một cây thuốc quý, rễ được dân gian dùng làm thuốc chữa thấp

khớp, ho, dị ng, đau nh c xương, đau răng, trị rắn cắn, đau lưng, cảm cúm…

Thấp khớp là một bệnh khá phổ biến do nhiều tác nhân gây ra. Trong y học

cổ truyền, có nhiều bài thuốc chữa thấp khớp kết hợp nhiều loại dược liệu trong đó

có cà gai leo. Cà gai leo có tác dụng trừ phong thấp, tiêu độc, trừ ho, cầm máu, giảm

đau. Đoàn Thị Nhu và cs (1998) đã ch ng minh cà gai leo có tác dụng chống viêm

cấp trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng cao hư, chống viêm mãn trên mô hình

gây u hạt thực nghiệm bằng amian trên chuột cống trắng, đồng th i gây teo tuyến c

trên chuột cống non. Ngoài ra, còn có những công trình nghiên c u khác ch ng

minh cà gai leo có tác dụng kháng viêm, giảm đau, giảm sự phát triển của quá trình

xơ trong xơ gan thực nghiệm trên chuột [3].

Phạm Kim Mãn và cs (1999) đã nghiên c u tác dụng chống ung thư của cà

gai leo và kết luận rằng, chế phẩm dịch chiết từ cây cà gai leo nồng độ 5 mg/100

mL có tác dụng hủy diệt tế bào ung thư 180 Sarcoma với tỷ lệ tế bào chết là 52,8%

[9].

Việc nghiên c u thăm dò khả năng ngăn ch n tiến triển xơ của cà gai leo trên

mô h nh g y xơ gan thực nghiệm của Maros (1966) cho thấy sau 3 tháng g y xơ gan

trên chuột cống trắng, xơ gan hình thành rõ rệt, thể hiện trên các chỉ tiêu hóa sinh và

tổ ch c học. Ở th i điểm 5 tuần, quá trình bệnh lý mới tiến triển tới giai đoạn thoái

hóa mô gan, chưa có sự gia tăng rõ rệt của collagen. Nhưng khi xơ đã ở giai đoạn

hoàn chỉnh, song song với các biến đổi về tổ ch c học, hàm lượng collagen ở gan

xơ cũng tăng cao gấp 2,5 lần so với b nh thư ng. Dịch chiết cà gai leo với liều cho

uống hàng ngày 6 g/kg thể trọng chuột, tuy không ngăn ch n hoàn toàn được quá

23

tr nh xơ hóa, nhưng có tác dụng làm chậm quá trình tiến triển của xơ. Hàm lượng

collagen trong gan ở lô chuột dùng dịch chiết cà gai leo chỉ bằng 71% so với lô

chuột đối ch ng g y xơ không dùng thuốc. Về m t tổ ch c học, thí nghiệm cho thấy

toàn bộ chuột ở lô đối ch ng g y xơ đều bị xơ n ng ho c vừa, còn ở lô dùng cà gai

leo hầu hết chỉ xơ nhẹ ho c không xơ [18].

Gần đ y, nhiều tác dụng khác của cà gai leo được phát hiện như: kháng

viêm, c chế xơ gan giai đoạn kịch phát, giảm nhẹ khối u. Viện Dược liệu (2001) đã

bào chế thành công thuốc "Haina" từ cà gai leo, đạt tiêu chuẩn cơ sở có hàm lượng

glycoalkaloid toàn phần trong mỗi viên từ 2,125 mg đến 2,875 mg tính theo

solasodine. Sau đó, tiến hành thử tác dụng lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan B mạn

hoạt động. Kết quả cho thấy Haina có tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, c chế xơ

gan, đồng th i có tác dụng tốt trên các chỉ thị virus viêm gan B [3].

Trong những năm gần đ y, vấn đề gốc tự do và các ch ng bệnh gây ra do

quá tr nh peroxide hóa lipid gia tăng như lão hóa, viêm hoại tử tế bào, ung thư...

được các nhà khoa học đ c biệt quan tâm. Nguyễn Thị Bích Thu và cs (2001) đã

khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cà gai leo. Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy

dịch chiết glycoalkaloid toàn phần có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Những kết quả

thu được góp phần giải th ch cơ chế tác dụng kháng viêm, bảo vệ gan của chế phẩm

Haina [14].

Cà gai leo có tác dụng bảo vệ gan chống lại những tổn thương g y ra bởi

Trinitrotoluene (TNT), tác dụng này là do sự tương tác giữa các chất chuyển hóa

của TNT với thành phần của cà gai leo và giữa cà gai leo với tế bào gan. TNT xâm

nhập vào cơ thể sẽ được chuyển hóa trong tế bào gan và làm gia tăng sự hình thành

của superoxide và hydrogen peroxide. Chúng tấn công vào cấu trúc lipoprotein của

màng tế bào gan bằng chuỗi phản ng lipoperoxide gây ra sự phá hủy tế bào gan.

Flavonoid là tác nhân kháng oxy hóa của cà gai leo có thể hạn chế chuỗi phản ng

lipoperoxide gây ra bởi tác nhân oxy hóa. Cà gai leo còn ch a saponin steroid làm

tăng s c chống chịu của màng tế bào gan dưới sự tấn công của TNT và các tác nhân

oxy hóa [98].

24

1. . . C g ứ solasodine

1. s l s d

1.3.2.1.1. ấ o con đường ch ển h

- Công th c tổng quát: C27H43NO2

Hình 1.1. C u trúc hóa h c c a solasodine

- Con đư ng chuyển hóa:

Sinh tổng hợp solasodine nói riêng hay spirosolane alkaloids nói chung có

liên quan mật thiết với sinh tổng hợp spirostane steroids có cùng cấu trúc vòng [61].

Nhóm spirosolane chỉ khác nhóm spirostane ở nguyên tử oxygen của vòng F

được thay bằng -NH. Một điểm cần chú ý là ở đ y có isomer ở C-22 (khác với

nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc S. laciniatum có cấu trúc (25R)

22 còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22.

Việc thêm nitrogen vào alkaloid xảy ra muộn trong con đư ng phát sinh sinh vật.

Điều này phổ biến khi tìm thấy trong cả solasodine và diosgenine hay chlorogenine

cùng nhau trong các loài thực vật. Tỷ lệ giữa diosgenine và solasodine trong lá của

S. laciniatum giới hạn trong khoảng 1:7 và 1:16 [61].

Con đư ng thông thư ng được chấp nhận của sinh tổng hợp steroid trong

thực vật được trình bày trong hình 1.2. Khởi đầu từ acetyl-CoA biến đổi thành

cholesterol thông qua con đư ng mevalonic acid. Những phản ng giả thiết trong

hình 1.6 cho thấy xuyên suốt quá trình nghiên c u những hợp chất này là một chất

trung gian teinemine. Teinemine có thể là một phần trong con đư ng sản xuất hai

stereoisomer là solasodine và tomatidenol, ho c là solanidine [61].

25

Hình 1.2. Co ường khả thi tổng h p steroid trong th c v t

cải ti n từ c a Kaneko và cs (1976) [61]

26

Thí nghiệm ch ng minh cho con đư ng giả thuyết này ở chỗ hầu hết toàn bộ

các tiền chất đã biết trong thí nghiệm này có thể dự đoán được sản phẩm chuyển

hóa cuối cùng. Vòng carbon của cấu trúc steroid solasodine chắc hẳn xuất phát từ

nhóm methyl hay carboxyl carbon của acetic acid. Điều này được lưu ý bởi sự thoái

biến sau khi tiến hành nhiễm xạ acetic acid hay mevalonic acid cây S. laciniatum,

xác nhận được có định vị phóng xạ trong carbon dự đoán của solasodine (dẫn theo

Mann, 1979) [61].

Nhóm spirosolane chỉ khác nhóm spirostane ở nguyên tử oxygen của vòng F

được thay bằng -NH. Một điểm cần chú ý là ở đ y có isomer ở C-22 (khác với

nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc S. laciniatum có cấu trúc (25R)

22 còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22.

Việc thêm nitrogen vào alkaloid xảy ra muộn trong con đư ng phát sinh sinh vật.

Điều này phổ biến khi tìm thấy trong cả solasodine và diosgenine hay chlorogenine

cùng nhau trong các loài thực vật. Tỷ lệ giữa diosgenine và solasodine trong lá của

S. laciniatum giới hạn trong khoảng 1:7 và 1:16 [61].

Con đư ng thông thư ng được chấp nhận của sinh tổng hợp steroid trong

thực vật được trình bày trong hình 2.2. Khởi đầu từ acetyl-CoA biến đổi thành

cholesterol thông qua con đư ng mevalonic acid. Những phản ng giả thiết trong

hình 1.6 cho thấy xuyên suốt quá trình nghiên c u những hợp chất này là một chất

trung gian teinemine. Teinemine có thể là một phần trong con đư ng sản xuất hai

stereoisomer là solasodine và tomatidenol, ho c là solanidine [61].

Thí nghiệm ch ng minh cho con đư ng giả thuyết này ở chỗ hầu hết toàn bộ

các tiền chất đã biết trong thí nghiệm này có thể dự đoán được sản phẩm chuyển

hóa cuối cùng.

Vòng carbon của cấu trúc steroid solasodine chắc hẳn xuất phát từ nhóm

methyl hay carboxyl carbon của acetic acid. Điều này được lưu ý bởi sự thoái biến

sau khi tiến hành nhiễm xạ acetic acid hay mevalonic acid cây S. laciniatum, xác

nhận được có định vị phóng xạ trong carbon dự đoán của solasodine (dẫn theo

Mann, 1979) [61].

27

Nghiên c u nuôi cấy mô cũng cung cấp thêm thông tin minh ch ng. Nuôi

cấy mô cây S. xanthocarpum tổng hợp solasodine khi có 2,4-D hơn là dùng IAA

như một auxin. Khi nuôi cấy dịch huyền phù S. xanthocarpum được bổ sung thêm

cholesterol th solasodine thu được cao gấp 20 lần. Điều này là phù hợp với giả thiết

ở hình 3.2 [61].

1.3.2.1.2. c d ng dược gi ị d ng - Nhiệt độ nóng chảy: 200 – 202oC.

Solasodine là một loại steroid alkaloid có trong các cây họ Cà (Solanaceae).

Nó có thể thay thế cho diosgenin để tổng hợp thương mại các loại hormon steroid

khác nhau. Solasodine đã được báo cáo là có thể chống ung thư [35], c chế độc hại

nhiều loài sinh vật [89]. Solasodine alkaloid c chế acetylcholinsterase - một

enzyme quan trọng trong việc truyền xung động thần kinh [88]. Gần đ y, solasodine

được biết như một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đ c biệt là ung thư

da [36].

1. sả ấ s l s d ấ ở

l

Có khoảng gần 100 loài Solanum khác nhau được công bố có ch a

solasodine ở một hay nhiều bộ phận khác nhau (bảng 1.2). Tuy nhiên, chỉ có một số

t loài được xem là có thể sản xuất solasodine thương mại [61].

Bảng 1.3. Tổng h p một số loài Solanum sinh ra solasodine [61]

lư ng solasodine

Loài

Cơ q sol sod e

(% khố lư ng khô)

Lá

0,01-0,03

S. abutiloides

S. alatum

-

0,30

S. astroites

-

0,30

S. atriplicifolium

-

1,00

S. atropurpureum

-

0,10

S. auriculatum

-

0,50

S. boerhaviaefolium

-

0,20

S. boerhaavii

-

0,06

28

S. cornutum

-

0,60

S. douglasii

-

0,10

S. flavum

-

0,80

S. guineense

-

0,10

S. haematocarpum

-

0,10

S. humile

-

0,70

S. laciniatum

-

1,00-3,80

S. luteum

-

0,50

S. marginatum

-

0,10-0,50

S. melanocerasum

-

0,10

S. memphiticum

-

0,20

S. miniatum

-

1,00

S. nodiflorum

-

0,30

S. ochroleucum

-

0,60

S. paranense

-

0,07

S. pyracanthum

-

0,20

S. sodomaeum

-

1,00

S. tomentosum

-

1,00

S. venosum

-

0,20

S. verbascifolium

-

1,60

S. villosum

-

1,00

S. xanthocarpum

-

0,70

S. aculeatissium

Quả

2,00-3,00

S. americanum

-

0,20

S. astroites

-

0,60

S. atriplicifolium

-

0,50

S. auriculatum

-

1,70

S. boerhaviaefolium

-

0,20

S. boerhaavii

-

0,02

S. capsiciforme

-

0,06

S. ciliatum

-

0,20

S. curtipes

-

0,10

29

S. eleagnifolium

-

2,00-3,00

S. flavum

-

0,90

S. furcatum

-

0,30

S. gracile

-

0,70

S. guineense

-

0,10

S. haematocarpum

-

0,20

S. heterophyllum

-

0,60

S. incanum

-

4,00

S. inopinum

-

1,00

S. intergrifolium

-

0,10

S. interandium

-

0,10

S. jubatum

-

2,20

S. khasianum

-

5,00

S. laciniatum

-

3,60

S. linearifolium

-

0,83

S. luteum

-

0,80

S. macrocarpum

-

0,20

S. mammosum

-

2,00

S. marginatum

-

0,70-2,30

S. melanocerasum

-

0,30

S. memphiticum

-

0,07

S. miniatum

-

0,50

S. nodiflorum

-

0,20

S. ochroleucum

-

0,60

S. platanifolium

-

1,90

S. pyracanthum

-

0,10

S. quinquangulare

-

0,90

S. roxburghii

-

0,40

S. saponaceum

-

0,01-0,09

S. sarachoides

-

0,30

S. simile

-

0,76

S. sodomaeum

-

1,90

30

S. symonii

-

0,18

S. torvum

-

0,10

S. trachycyphyum

-

3,20

S. trilobatum

-

3,50

S. umbellatum

-

1,50

S. venosum

-

0,40

S. vescum

-

0,14

S. villosum

-

1,00

S. xanthocarpum

-

3,00

S. aviculare

Toàn bộ

S. platanifolium

-

S. indicum

Quả và thân/cuống

S. kieseritzkii

Phần khí sinh

S. laciniatum

Thân/cuống

0,10-0,30

S. lorentzii

Đỉnh

S. pyretifolium

-

S. quitoense

-

0,02

S. rostratum

-

0,03

S. saponaceum

-

0,03

S. sodomaeum

Chồi

0,90

Nigra và cs (1987) đã nghiên c u sự t ch lũy solasodine trong callus từ các

bộ phận khác nhau của S. eleagnifolium là trụ dưới lá mầm, lá mầm, rễ, lá và quả.

Kết quả nhận thấy, callus trong môi trư ng MS cải tiến có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D

đều có khả năng t ch lũy solasodine dù nguồn gốc của chúng không giống nhau.

Callus từ lá mầm, trụ dưới lá mầm và lá t ch lũy solasodine cao nhất sau 4 và 5 tuần

nuôi cấy. Solasodine t ch lũy trong callus từ quả đạt cực đại sau 7 tuần và callus từ

rễ là từ 3 tuần nuôi cấy [69].

Tiếp tục nghiên c u ảnh hưởng của auxin, ánh sáng và sự phân hóa tế bào

đến khả năng t ch lũy solasodine trong callus S. eleagnifolium, Nigra và cs (1989)

nhận thấy bổ sung 4,5 µM 2,4-D vào môi trư ng nuôi cấy callus hàm lượng

31

solasodine t ch lũy cao nhất so với bổ sung IAA (5,7 µM), NAA (5,4 µM), IBA (4,9

µM) hay 2,4,5-T (3,9 µM). Trong điều kiện tối, solasodine t ch lũy thấp hơn so với

khi chiếu sáng chu kỳ 16 gi /ngày. Mô phân hóa bởi cân bằng đầy đủ kích thích

sinh trưởng (tỷ lệ 2,5 µM IBA và 8,8 µM BAP) sản xuất solasodine nhiều hơn các

mô không có sự phân hóa này [67].

Nigra và cs (1990) cũng tiến hành nghiên c u ảnh hưởng của nguồn carbon

và nitrogen đến sinh trưởng và t ch lũy solasodine trong nuôi cấy mẻ dịch huyền

phù S. eleagnifolium. Trên môi trư ng MS cải tiến có 4,5 µM 2,4-D với các nguồn

carbon khác nhau: fructose, glucose, maltose và sucrose. Nghiên c u cho thấy ở

cùng nồng độ lần lượt là 90 mM và 180 mM, cả bốn nguồn carbon đều có khả năng

làm tăng lượng solasodine t ch lũy sau 11 ngày nuôi cấy, tuy nhiên 180 mM sucrose

sau 6 ngày nuôi cấy đạt lượng solasodine cao nhất (0,9 mg/g). Đối với nguồn

nitrogen, kết quả cho thấy sử dụng phối hợp NH4NO3 và KNO3 với tỷ lệ 2:1

solasodine t ch lũy cực đại (4,08 mg/g khối lượng khô) [68].

Quadri và cs (1993) tiến hành nghiên c u ảnh hưởng của elicitor đến việc

t ch lũy solasodine trong tế bào S. eleagnifolium. Chủng nấm thuộc loài Alternaria

sp. phân lập từ các điểm bệnh trên bề m t quả chín của cây S. eleagnifolium hoang

dại được sử dụng như elicitor. Các dòng tế bào 14 ngày tuổi được xử lý elicitor

trong 48-72 gi , kết quả nhận thấy hàm lượng solasodine tăng khoảng 65% trong

nuôi cấy dịch huyền phù [78].

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng như tuổi và kích

cỡ mẫu đưa vào nuôi cấy in vitro đến khả năng sản xuất solasodine trong cây S.

eleagnifolium đã được Alvarez và cs (1993) nghiên c u. Hàm lượng solasodine tăng

cao hơn khi phối hợp NAA (50 µM) và kinetin (0,25 µM) so với sử dụng riêng lẻ,

tăng từ 0,8 mg/L đến 2,54 mg/L. Mẫu 19 ngày tuổi với kích cỡ 5% v/v được lựa

chọn nuôi cấy trong bioreactor để sản xuất solasodine [23]. Năm 1994, nhóm tác giả

tiếp tục nghiên c u sự t ch lũy solasodine trong nuôi cấy các cơ quan biến nạp (rễ

và chồi) của S. eleagnifolium. Trong các dòng biến nạp của tế bào rễ với

Agrobacterium rhizogenes LBA 9402, dòng 5 có hàm lượng solasodine t ch lũy cao

nhất (1,9 mg/L) sau 30 ngày nuôi cấy [24]. Parsons và cs (2001) cũng nghiên c u

32

sản xuất solasodine từ protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy huyền phù tế bào của

cùng một đối tượng S. eleagnifolium Cav. [72].

Weissenberg (2001) đã ph n lập solasodine bằng cách thủy phân trực tiếp

các cây thuộc chi Solanum hay các glycoside của chúng [105].

Bhatnagar và cs (2004) sử dụng phương pháp nuôi cấy mô cây S. laciniatum

để sản xuất solasodine. Solasodine t ch lũy cao nhất trong callus sau 30 ngày nuôi

cấy, và tăng lên 1,2 đến 1,4 lần khi bổ sung thêm L-arginine (50-150 mg/L). Các

chồi tái sinh trên môi trư ng có 4,0 mg/L BA cho hiệu quả t ch lũy solasodine cực

đại, gấp khoảng 10 lần so với callus [30].

Bhat và cs (2008) tiến hành gây stress m n để tăng sự t ch lũy solasodine

trong S. nigrum. Các mô in vitro phát triển khác nhau (callus không tái sinh, callus

tái sinh và chồi tái sinh từ lá) được nuôi cấy trong điều kiện stress m n (0-150 mM

NaCl) để tăng hàm lượng solasodine. Trong môi trư ng có 150 mM NaCl, các

callus tái sinh phát triển và đạt lượng solasodine cao nhất trong các mẫu thí nghiệm

(2,39 mg/g khối lượng khô) sau 12 tuần nuôi cấy [28]. Khảo sát các chồi và lá tái

sinh từ callus cũng nhận thấy solasodine t ch lũy cao hơn so với các chồi ex vitro

(Bhat và cs, 2010) [29]. Sutkovic và cs (2011) cũng nghiên c u đối với callus 15

ngày tuổi của S. nigrum khi xử lý nồng độ NaCl từ 50-200 mM sau 8 tuần nuôi cấy,

ghi nhận kết quả hàm lượng solasodine t ch lũy tăng hơn so với đối ch ng không xử

lý NaCl [96].

Yogananth và cs (2009) tiến hành phân lập so sánh solasodine từ nuôi cấy in

vitro và in vivo của cây S. nigrum nhận thấy, solasodine t ch lũy trong phần lá non

của cây in vivo (0,0798 mg/g) thấp hơn trong callus in vitro. Callus in vitro nuôi

trong môi trư ng bổ sung k ch th ch sinh trưởng khác nhau thì sự t ch lũy

solasodine cũng khác nhau. Solasodine t ch lũy cao nhất trong các thí nghiệm khi

callus nuôi cấy có bổ sung 2,5 mg/L IAA + 0,5 mg/L BAP (0,142 mg/g) và 2,0

mg/L NAA + 0,5 mg/L BAP (0,1162 mg/g) [107].

1. . . C g ứ ố ư g g leo

C y cà gai leo đã được Viện Dược liệu ch ng minh có tác dụng kháng viêm,

33

bảo vệ gan, hạn chế sự tạo thành xơ của các tổ ch c và thuốc “Haina” bào chế từ cà

gai leo đã được thử nghiệm trên lâm sàng (tại Bệnh viện 103) có kết quả tốt đối với

bệnh nhân viêm gan B mạn thể hoạt động [3].

Năm 2000, Nguyễn B ch Thu và cs đã nghiên c u tác dụng của cà gai leo

trên collagenase là một enzyme có tác dụng đ c hiệu trên collagen. Trong các

trư ng hợp bệnh lý như xơ gan, xơ phổi… có sự tăng t ch tụ collagen ở các tổ ch c

này. Quá trình thoái hóa tổ ch c collagen có sự tham gia của collagenase. Bình

thư ng collagenase ở dạng không hoạt động. Khi có các tác nh n tác động như

corticosteroid, bỏng, viêm loét… hoạt động của collagenase mới thể hiện rõ [14].

Nguyễn B ch Thu và cs (2001) đã áp dụng kỹ thuật ELISA để khảo sát mối

tương tác giữa protein sinh ung thư (oncoprotein-E6, E6AP và E7) với sản phẩm

gen c chế ung thư p53 và Rb đã gi p phát hiện dịch chiết từ cà gai leo có tác dụng

chống ung thư do virus như ung thư cổ tử cung, ung thư gan g y bởi các virus HPV,

HBV… [16].

Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2005) đã nghiên c u ảnh hưởng của một số chất

k ch th ch sinh trưởng lên khả năng tái sinh in vitro cây cà gai leo [6].

Nguyễn Hữu Thuần Anh và cs (2008) đã nghiên c u khả năng t ch lũy

glycoalkaloid toàn phần trong callus của cây cà gai leo (Solanum hainanense

Hance). Kết quả cho thấy glycoalkaloid toàn phần tích lũy trong callus của cà gai

leo đạt cực đại sau 10 tuần nuôi cấy (37,73 mg/mL) trên môi trư ng cơ bản MS có

bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BAP [1].

Loc và Thanh (2011) đã nghiên c u khả năng t ch lũy glycoalkaloid toàn

phần trong tế bào cà gai leo trong nuôi cấy tế bào huyền phù. Kết quả cho thấy hàm

lượng glycoalkaloid toàn phần t ch lũy cao nhất trong tế bào sau 4 tuần nuôi cấy

trong môi trư ng và điều kiện tối ưu gấp 5,9 lần so với rễ c y 1 năm tuổi ngoài tự

nhiên [59].

34

C ươ g

C

2.1. C

Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in vitro từ callus

được tạo ra từ cây in vitro.

Hình 2.1. Cây cà gai leo in vitro

2. . C

2.2.1. Xác định khả năng sinh trưởng và t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo.

2.2.2. Nghiên c u ảnh hưởng của elicitor đến khả năng sinh trưởng và t ch lũy

solasodine của tế bào cà gai leo:

- Ảnh hưởng của MeJA: nồng độ: 25-250 µM sau đó chọn nồng độ tốt nhất

tiếp tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.

- Ảnh hưởng của YE: nồng độ : 1-5 g/L, sau đó chọn nồng độ tốt nhất tiếp

tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.

- Ảnh hưởng của SA: nồng độ: 50-250 µM, sau đó chọn nồng độ tốt nhất tiếp

tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.

- Ảnh hưởng kết hợp của các elicitor: kết hợp 2 elicitor, kết hợp 3 elicitor:

chọn nồng độ riêng lẽ tốt nhất phối hợp với các nồng độ nghiên c u của elicitor còn

35

lại. Chọn nồng độ phối hợp tốt nhất tiếp tục nghiên c u th i gian nuôi cấy 7 tuần và

th i điểm cảm ng từ 7-21 ngày.

2.2.3. Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine lên khả năng c

chế collagenase.

2.2.4. Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro của

cây cà gai leo.

2. . C

2. .1. ươ g y o

2.3.1.1. Nuôi cấy cây in vitro

Các đoạn thân có mắt lá của cây cà gai leo ngoài tự nhiên rửa sạch bằng

nước xà phòng loãng dưới dòng nước chảy, khử trùng cồn 70% trong 1 phút, HgCl2

0,1% trong 8 phút, rửa lại bằng nước cất khoảng 5 lần trước khi cấy lên môi trư ng

tạo cây in vitro (S0) [4]. Thành phần môi trư ng S0: môi trư ng MS, sucrose 30g,

agar 0,8g; IBA 0,5 mg/L. Đoạn thân ch a mắt lá (dài khoảng 2,5-3,0 cm) được chọn

từ các cành có độ dài khoảng 30 cm trên c y 1 năm tuổi (lấy 5 mắt lá/cành tính từ

ngọn).

Các đoạn thân có mắt lá của cây in vitro tiếp tục được cấy trên môi trư ng S0

để nhân cây tạo nguyên liệu.

2. ấ ll s

Nuôi cấy callus từ các bộ phận khác nhau (cuống lá, mảnh lá, đoạn thân và

đoạn rễ) của cây cà gai leo in vitro trên môi trư ng cơ bản MS có saccharose 30

g/L, agar 8 g/L, bổ sung NAA 0,1 mg/L và 2,4-D 1,0 mg/L [1]. Kết quả cho thấy

các callus tạo từ cuống lá, đoạn th n và đoạn rễ có màu vàng nhạt, tương đối r i

rạc, thích hợp để làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào.

Callus 3 tuần tuổi được cắt thành những khối nhỏ đư ng kính khoảng 0,5 cm

để nhân sinh khối trên cùng môi trư ng nhưng thay 0,1 mg/L NAA bằng 0,1 mg/L

BAP [59].

36

2. ấ

Chọn các callus có màu vàng nhạt, rắn và r i (chủ yếu callus có nguồn gốc từ

đoạn thân, cuống lá và đoạn rễ) để nuôi cấy tế bào. Nghiền nhỏ (sử dụng đầu que cấy

hay đầu dao cấy để tách các tế bào r i ra, một số ít cụm tế bào tương đối khó phá r i

nên dùng dao cấy để chia nhỏ) 3 g callus trong điều kiện vô trùng để chuyển vào nuôi

ở bình tam giác 250 mL ch a 50 mL môi trư ng nhân sinh khối callus (không bổ

sung agar) ở tốc độ lắc 120 vòng/phút. Sau 4 tuần, tế bào được chuyển sang môi

trư ng mới có thành phần giống môi trư ng ban đầu và nuôi trong cùng điều kiện

cho đến khi thu được dịch tế bào huyền phù đồng nhất.

Tế bào sau 4 tuần nuôi cấy tăng sinh được sử dụng cho các thí nghiệm thăm

dò elicitor, nồng độ và th i điểm bổ sung ch ng vào môi trư ng. Mỗi lần cấy chuyển,

lắc đều bình mẫu để có dịch tế bào đồng nhất, hút 20 mL dịch tế bào (khoảng 1,65 g)

đưa vào b nh ch a môi trư ng MS có 40 g sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D

nuôi ở tốc độ lắc 150 vòng/phút [59].

2.3.1.3. Xử lý cảm ng t bào

Bổ sung methyl jasmonate (25-250 µM), dịch chiết nấm men (1-5 g/L), và

salicylic acid (50-250 µM) ở dạng riêng rẽ ho c phối hợp các nồng độ tối ưu của

ch ng vào môi trư ng nuôi cấy tế bào tại các th i điểm khác nhau: lúc bắt đầu nuôi

cấy (0 ngày), 7, 14 và 21 ngày sau khi nuôi cấy.

Tất cả môi trư ng dinh dưỡng được điều chỉnh đến pH 5,8 trước khi khử trùng

ở 121oC, trong 15 phút. Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được giữ ở nhiệt độ 25  2oC, cư ng độ ánh sáng 2000-3000 lux (đối với callus, tương đương 28-42 µmolphoton/m2/s) và 500 lux (đối với tế bào huyền phù, tương đương 7 µmolphoton/m2/s), th i gian chiếu sáng 10 gi /ngày.

2. 4 X đ nh sinh khối t bào

- Tế bào được lọc qua giấy lọc và rửa sạch môi trư ng bằng nước cất bằng hệ

thống lọc ch n không, c n để xác định khối lượng tươi. Tế bào sau đó được sấy khô ở 50oC trong khoảng 24 gi cho đến khi khối lượng không đổi, c n để xác định khối

37

lượng khô.

- Chỉ số sinh trư ng (GI) được tính theo công th c:

Trong đó: FWi là sinh khối tươi của tế bào lúc bắt đầu nuôi cấy và FWf là

sinh khối tươi của tế bào lúc kết thúc nuôi cấy.

2. . . ươ g s

2.3.2.1. Chi t Soxhlet

Sinh khối khô của tế bào cà gai leo được nghiền thành bột mịn. Cân 1 g mẫu

và chiết cách thủy bằng sinh hàn ngược với 50 mL dung dịch acetic acid 5% trong

methanol trong 3 gi . Lọc và cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không (Heidolph, Germany) ở 50oC. Hòa tan kết tủa bằng methanol và định m c đến 10

mL [15].

2.3.2.2. Sắc ký lỏng hi ă

Dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo được lọc bằng màng Minisart 0,2

µm (Sartorius, Đ c), pha loãng 5 lần trong cùng dung môi và bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Sử dụng cột Hypersil MOS (C8) (5 μm, 4.6×150 mm) của Thermo Scientific,

th i gian chạy cho một mẫu là 5 phút, tốc độ dòng 1 mL/ph t và detector có bước

sóng 254 nm. Pha tĩnh là silica gel (pha ngược) và pha động là methanol 100%.

Ph n t ch HPLC được tiến hành trên hệ thống Shimadzu LC 20A với bơm

LC-20AD, đầu dò SPD-20A, bộ bơm mẫu tự động SIL-20A HT và sử dụng phần

mềm LC Solution (ver. 1.22). Tất cả hóa chất sử dụng trong quá trình phân tích này

đều của hãng Sigma-Aldrich và Merck.

2. ạ c ch collagenase của solasodine

Nguyên tắc của phương pháp này là solasodine sẽ làm giảm hoạt tính

collagenase được biểu thị bằng độ dài (mm) cột collagen gel bị tiêu sau một th i

gian nhất định [14].

38

Chuẩn bị cột gel: Cân 50 mg collagen type I từ g n đuôi chuột (Sigma, Mỹ)

hòa trong 50 mL dung dịch acetic acid 0,05 M, bổ sung NaCl để đạt đến nồng độ

0,04 M, điều chỉnh pH 7,5-8 bằng Tris.HCl 2 M để thu được dung dịch collagen

trong suốt. Dùng các ống mao quản đư ng kính 2 mm, dài 150 mm hút dịch

collagen tới chiều cao 2/3 ống (100 mm). Nút kín một đầu ống bằng paraffin và bịt đầu còn lại bằng giấy paraffin. Đ t các ống này thẳng đ ng trong tủ ấm 37oC để qua

đêm, collagen sẽ đông đ c lại thành gel trong suốt.

Xác định hoạt tính của dịch chiết solasodine: Lấy cột gel ra khỏi tủ ấm và

đánh dấu chiều cao cột gel để xác định điểm mốc của quá trình tiêu gel. Pha dung

dịch collagenase type I (C3867-1VL, Sigma-Aldrich, Mỹ) 0,2 mg/mL bằng đệm

Tris.HCl 0,05 M (pH 7,9). Cho 150 µL hỗn hợp dung dịch collagenase 0,2 mg/mL

và dịch chiết solasodine (tỷ lệ 1:1) vào cột collagen gel. Đối ch ng là dung dịch collagenase 0,1 mg/mL. Để các cột gel vào tủ ấm 37oC trong 24 gi , sau đó lấy các

cột ra đo chiều dài gel bị tiêu (gel hóa lỏng) do tác dụng của collagenase để xác

định hoạt tính của dịch chiết solasodine. Dịch chiết solasodine sử dụng để xác định

hoạt tính là dịch chiết từ tế bào cà gai leo nuôi cấy có xử lý 150 µM SA.

2. . . l số l ệ

Mỗi thí nghiệm được l p lại 3 lần. Các số liệu thực nghiệm được tính trung

bình mẫu và sai số chuẩn bằng Microsoft Excel, phân tích one-way ANOVA

(Duncan’s test, p<0,05) bằng chương tr nh SPSS (ver. 18.1).

39

sơ ồ g ệ

Cây cà gai leo in vitro

Nuôi cấy callus

Nhân callus

Nuôi cấy tế bào

Xử lý các elicitor khác nhau

Thăm dò nồng độ elicitor

Thăm dò th i điểm bổ sung elicitor

Thu sinh khối tế bào

Tách chiết solasodine

Định lượng

Thử nghiệm hoạt t nh sinh học

40

C ươ g

K T QU NGHIÊN C U

3.1. C CỦA T BÀO CÀ GAI

LEO

3.1.1. ưởng c a t bào

Tiến hành nuôi cấy tế bào và thu sinh khối sau mỗi tuần, từ tuần th 1 đến

tuần th 7, để khảo sát quá trình sinh trưởng của chúng. Kết quả được trình bày ở

hình 3.1.

Hình 3.1. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo

không xử lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy

Pha lag của tế bào chỉ xuất hiện trong một th i gian ngắn (1-2 ngày đầu),

nhưng do sinh khối tế bào được thu 1 tuần/lần nên khó quan sát giai đoạn này. Cũng

có thể do chúng tôi sử dụng các tế bào đang trong giai đoạn sinh trưởng từ nuôi cấy

dịch huyền phù tế bào. Pha log kéo dài từ pha lag đến hết tuần th 4, trong th i gian

này tế bào sinh trưởng tương đối mạnh, đạt 4,98 g khối lượng tươi (0,45 g khối

41

lượng khô). Dịch tế bào có màu vàng nhạt và tế bào khá đồng nhất. Sau pha log,

sinh trưởng của tế bào bắt đầu giảm và sinh khối chỉ còn 3,35 g tươi (0,24 g khô) ở

tuần th 7, l c này dịch huyền phù tế bào chuyển từ màu vàng nhạt sang nâu và

1 cm

xuất hiện tế bào chết do môi trư ng cạn kiệt dinh dưỡng.

a

b

Hình 3.2. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo

trong môi trư ng không xử lý elicitor sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trư ng

MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D; tốc độ lắc 150 vòng/ph t

3.1. . lũy sol sod e a t bào

Khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo được khảo sát từ 1-7 tuần

nuôi cấy. Kết quả nghiên c u cho thấy lượng solasodine t ch lũy trong tế bào tăng

dần từ tuần th nhất đến tuần th 4 và đạt cực đại là 123,5 mg/g khối lượng khô.

Sau đó, từ tuần th 5-7, hàm lượng solasodine bắt đầu giảm dần chỉ còn 51,5 mg/g

(Hình 3.3).

Thông thư ng, các HCTC t ch lũy nhiều nhất vào cuối pha sinh trưởng. Một

số nghiên c u cho thấy mối tương quan nghịch giữa tốc độ sinh trưởng và khả năng

sản xuất các HCTC. Khi tốc độ sinh trưởng tăng, hoạt động phân chia và sản xuất

sinh khối của tế bào diễn ra mạnh. Nhưng khi chuẩn bị bước vào pha ổn định, sinh

trưởng bắt đầu giảm, lúc này hoạt động sản xuất các HCTC mới tăng lên [83].

Trong nghiên c u của chúng tôi, pha ổn định của tế bào cà gai leo rất ngắn, sau khi

tế bào kết th c sinh trưởng thì sinh khối giảm ngay (bước vào tuần th 5). Vì vậy,

42

lượng solasodine được tổng hợp cao nhất ở cuối giai đoạn sinh trưởng của tế bào

(tuần th 4) là hợp lý.

Hình 3.3. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo

không xử lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy

Kết quả của chúng tôi cho thấy hàm lượng solasodine của tế bào tăng dần

theo th i gian nuôi cấy, đạt cao nhất ở tuần th 4, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng

5,3 lần. Kết quả này phù hợp với các kết quả đã được công bố trước đ y [59].

3.2. NG CỦA ELICITOR C

SOLASODINE CỦA T BÀO CÀ GAI LEO

3.2.1. ưởng c a methyl jasmonate

3.2.1.1. N độ methyl jasmonate

Bổ sung MeJA nồng độ từ 25 µM đến 250 µM vào môi trư ng dinh dưỡng

lúc bắt đầu nuôi cấy, kết quả về khả năng sinh trưởng và t ch lũy solasodine sau 4

tuần được trình bày trong bảng 3.1 và 3.2.

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy tế bào cà gai leo được xử lý MeJA sinh trưởng

chậm hơn đối ch ng. Sinh khối tươi giảm nhiều (3,98-2,29 g, đối ch ng 4,98 g) khi

43

tăng nồng độ MeJA. Tuy nhiên, khối lượng khô thay đổi không đáng kể giữa các

công th c xử lý elicitor (0,34-0,37 g, đối ch ng 0,45 g).

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của MeJA lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo

ố lư g o (g)

GI

ồ g ộ eJ (µM)

25

1,30

50

1,13

100

1,19

150

0,99

200

0,80

250

0,76

ĐC

ươ 3,89b 3,38d 3,57c 2,96e 2,40f 2,29g 4,98a

Khô 0,37b 0,35bc 0,34c 0,36bc 0,34bc 0,35bc 0,45a

1,66

Đ : ế bào không x lý elicitor. Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có

nghĩ hống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05 (Duncan's test). Chú thích này dùng

chung cho tất cả các bảng.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo

ồ g ộ eJ (µ )

25 50 100 150 200 250

ĐC1 ĐC2

Solasodine (mg/g) 127,5c 159,0a 138,0b 98,0e 38,0f 36,5f 123,5d 23,5g

Đ 1: ế bào không x lý elicitor. Đ 2: ễ của cây tự nhiên 1 năm ổi

Dịch chiết tế bào 4 tuần tuổi được ph n t ch HPLC để khảo sát ảnh hưởng

của nồng độ MeJA (25-250 µM) lên t ch lũy solasodine. Phân tích HPLC dịch chiết

của tế bào cà gai leo nuôi trong môi trư ng có bổ sung MeJA ở các nồng độ khác

44

nhau cho thấy các phổ sắc ký đều có kiểu peak giống nhau, trong đó 1 peak có th i

gian lưu khoảng 2,1-2,2 phút, gần trùng với peak của solasodine chuẩn (2,2 phút) và

của dịch chiết rễ cây cà gai leo tự nhiên 1 năm tuổi (2,2 phút) (Phụ lục 1). Kết quả

trình bày ở bảng 3.2 cho thấy ở nồng độ MeJA từ 25-50 µM, solasodine t ch lũy

mạnh trong tế bào và đạt cực đại 159 mg/g, gấp 1,3 lần tế bào đối ch ng không bổ

sung MeJA (123,5 mg/g) và gấp 6,8 lần rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi (23,5 mg/g).

1 cm

Lượng solasodine giảm dần khi tăng MeJA từ 100-250 µM.

a

b

Hình 3.4. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo trong môi

trư ng MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 50 µM MeJA

(lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/ph t sau 4 tuần nuôi cấy

3.2.1.2. Thời gian nuôi cấy

Nồng độ MeJA 50 µM được chọn để khảo sát quá tr nh sinh trưởng và th i

điểm t ch lũy solasodine cao nhất của tế bào cà gai leo trong suốt 7 tuần nuôi cấy.

Kết quả tr nh bày ở hình 3.5 cho thấy sinh khối tươi tăng dần từ tuần th 1 và đạt

cực đại sau 4 tuần nuôi (3,38 g), sinh khối khô đạt cực đại ở tuần th 4 và 5 (0,35 và

0,38 g, sai khác không có ý nghĩa thống kê với p>0,05), thấp hơn đối ch ng tương

ng khoảng 0,7 và 0,8 lần. Sau tuần th 4 ho c 5, sinh khối tươi và khô bắt đầu

giảm và đến tuần th 7 còn lại 3,26 g khối lượng tươi và 0,27 g khối lượng khô.

45

Hình 3.5. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM MeJA

sau 7 tuần nuôi cấy

Hình 3.6. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo

khi bổ sung 50 µM MeJA sau 7 tuần nuôi cấy

46

Hình 3.6 biểu diễn đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo được

xử lý elicitor bởi 50 µM MeJA sau 7 tuần nuôi cấy. Lượng solasodine cũng tăng

dần từ tuần th 1 đến tuần th 4 tương tự sinh khối tế bào. Trong giai đoạn đầu của

sự sinh trưởng (tuần 1-3), solasodine được tổng hợp không nhiều. Tuy nhiên, từ

tuần th 4 hàm lượng solasodine tăng nhanh và đạt cực đại đến 159 mg/g khối

lượng khô, cao hơn trong rễ của c y 1 năm tuổi khoảng 6,8 lần và đối ch ng là tế

bào không xử lý MeJA khoảng 1,3 lần. Từ tuần th 5-7, hàm lượng solasodine giảm

nhiều chỉ còn 69,5 mg/g khối lượng khô.

3.2.1.3. Thờ đ m cảm ng

Dựa vào kết quả nghiên c u ảnh hưởng của nồng độ MeJA lên khả năng t ch

lũy solasodine trong tế bào cà gai leo, nồng độ MeJA 50 µM được chọn để khảo sát

th i điểm cảm ng trong nuôi cấy tế bào. Sinh khối tế bào được thu sau 4 tuần và

kết quả được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của th i điểm xử lý MeJA 50 µM lên sinh trưởng của tế bào cà gai

leo

ố lư g o (g)

Ngày ả ứ g

GI

7

0,88

14

0,84

21

0,99

ươ 3,39b 3,43b 3,71a 3,38b

Khô 0,31b 0,33ab 0,34a 0,35a

1,13

C

Đ : bổ sung MeJA 50 µM o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy.

Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy th i điểm bổ sung MeJA đã ảnh hưởng đến khả

năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo. Tại các th i điểm khảo sát là 7, 14 và 21

ngày, sinh trưởng của tế bào đều giảm so với đối ch ng (th i điểm ban đầu của quá

trình nuôi cấy). Như vậy, tế bào cà gai leo sinh trưởng tốt nhất khi bổ sung 50 µM

MeJA ở th i điểm ban đầu nuôi cấy.

47

Th i điểm xử lý elicitor là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng

t ch lũy các sản phẩm th cấp của tế bào thực vật, ảnh hưởng của xử lý MeJA lên

hàm lượng solasodine sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng t ch lũy

solasodine của tế bào cà gai leo

ờ ( g y)

7 14 21

ĐC

lư g ( g g) 108,5b 79,5c 74,5d 159,0a

Đ : bổ sung MeJA 50 µM o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy.

Các th i điểm bổ sung elicitor từ 7-21 ngày của quá trình nuôi cấy đều cho

thấy hàm lượng solasodine giảm so với đối ch ng bổ sung th i điểm ban đầu. Tế

bào t ch lũy solasodine thấp nhất khi bổ sung MeJA vào ngày nuôi cấy 21 (74,5

mg/g khối lượng khô) và cao nhất vào ngày bắt đầu nuôi cấy (159,0 mg/g khối

lượng khô).

3.2.3. ưởng c a dịch chi t n m men

3.2.3.1. N độ d ch chi t nấm men

Nồng độ YE được sử dụng để bổ sung vào môi trư ng lúc bắt đầu nuôi cấy

là từ 1-5 g/L. Sinh khối tế bào được thu sau 4 tuần để đánh giá ảnh hưởng của YE.

Kết quả trình bày ở bảng 3.5.

Nhìn chung, YE có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng của tế bào cà gai leo

nhưng theo hướng ngược với MeJA. YE có tác dụng k ch th ch sinh trưởng của tế

bào, sinh khối tươi tăng mạnh so với đối ch ng không xử lý elicitor (7,94-9,30 g và

4,98 g), tuy nhiên sinh khối khô chỉ tăng nhẹ (0,41-0,54 g và 0,45 g).

48

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo

ố lư g o (g)

ồ g ộ (g )

GI

1

3,10

2

3,07

3

2,93

4

2,69

5

Khô 0,54a 0,53a 0,48b 0,43c 0,41c

2,65

ĐC

ươ 9,30a 9,20b 8,80c 8,08d 7,94e 4,98f

0,45bc

1,66

Đ : ế bào không x lý elicitor.

Trong các nồng độ được khảo sát, 3 g/L YE có tác dụng kích thích sinh tổng

hợp solasodine mạnh nhất (220,5 mg/g khối lượng khô), gấp khoảng 1,8 lần đối

ch ng không xử lý elicitor và 9,4 lần so với rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi. Các nồng độ

khác như 2 và 4 g/L YE cũng có hiệu quả tương tự như yếu hơn. Riêng nồng độ 5

g/L YE có tác dụng ngược lại, hàm lượng solasodine thu được từ công th c xử lý

này thấp hơn đối ch ng không elicitor (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo

ồ g ộ (g )

1 2 3 4 5

ĐC1 ĐC2

lư g ( g g) 125,5d 165,0c 220,5a 198,0b 112,0e 123,5d 23,5f

Đ 1: ế bào không x lý elicitor. Đ 2: ễ của cây tự nhiên 1 năm ổi

49

1 cm

a

b

Hình 3.7. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo trong

môi trư ng MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 3 g/L YE

(lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy

3.2.3.2. Thời gian nuôi cấy

Từ kết quả thăm dò nồng độ, 3 g/L YE được chọn để bổ sung vào môi trư ng

lúc bắt đầu nuôi cấy và khảo sát th i điểm t ch lũy solasodine cao nhất của tế bào cà

gai leo trong suốt 7 tuần. Kết quả nghiên c u được trình bày ở hình 3.8.

Hình 3.8. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L YE

sau 7 tuần nuôi cấy

50

Sinh khối tế bào tăng dần từ tuần th 1 và lớn nhất vào tuần th 4 (8,8 g khối

lượng tươi, tương ng 0,48 g khối lượng khô), sau đó giảm khá nhanh và thấp nhất

ở tuần th 7 (chỉ còn 5,78 g khối lượng tươi và 0,32 g khối lượng khô).

Hàm lượng solasodine cũng tăng dần từ tuần th 1 đến tuần th 4 và đạt cực

đại là 220,5 mg/g khối lượng khô, gấp khoảng 1,8 lần so với tế bào đối ch ng,

khoảng 9,5 lần so với rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi và khoảng 1,4 lần so với tế bào

được xử lý MeJA 50 µM. Hàm lượng solasodine sau đó giảm dần đến tuần th 7

(còn 51,5 mg/g).

Hình 3.9. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3g/L YE

sau 7 tuần nuôi cấy

3.2.3.3. Thờ đ m cảm ng

Dựa vào kết quả khảo sát nồng độ và đư ng cong t ch lũy solasodine, chúng

tôi chọn nồng độ xử lý 3 g/L YE và thu sinh khối của tế bào 4 tuần tuổi để nghiên

c u ảnh hưởng của th i điểm cảm ng (7-21 ngày sau khi nuôi cấy) lên khả năng

sinh trưởng và t ch lũy solasodine của chúng. Các tế bào được bổ sung YE vào lúc

bắt đầu nuôi cấy được sử dụng để làm đối ch ng.

51

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh trưởng của tế bào

cà gai leo

ố lư g o (g)

ờ ( g y)

GI

7

2,93

14

2,80

21

1,89

ĐC

ươ 8,79a 8,41a 5,66b 8,80a

Khô 0,45a 0,36b 0,35b 0,48a

2,93

Đ : 3 g/L YE được bổ ng o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy

Bảng 3.7 trình bày khả năng sinh trưởng của các tế bào được cảm ng ở các

th i điểm khác nhau. Kết quả cho thấy, khi bổ sung YE vào th i điểm bắt đầu nuôi

cấy cũng như sau 7 ngày tế bào có khả năng sinh trưởng tương đương nhau (GI

khoảng 2,93). Ở th i điểm cảm ng là 14, ngày sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và

mạnh nhất là ở 21 ngày (GI chỉ đạt 1,89).

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng t ch lũy solasodine của

tế bào cà gai leo

ờ ( g y)

7 14 21 ĐC

lư g ( g g) 110,5b 96,0c 92,0d 220,5a

Đ : 3 g/L YE được bổ ng o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy

Phân tích hàm lượng solasodine t ch lũy trong tế bào cho thấy th i điểm cảm

ng tốt nhất vẫn là lúc bắt đầu nuôi cấy (solasodine đạt 220,5 mg/g khối lượng

khô). Ở các th i điểm khác lượng solasodine thu được thấp hơn từ 2-2,3 lần, dao

động trong khoảng 92,0-110,5 mg/g khối lượng khô (Bảng 3.8). Kết quả này cũng

tương tự như kết quả xử lý 50 μM MeJA.

52

3.2.4. ưởng c a salicylic acid

3.2.4.1. N độ salicylic acid

SA ở các nồng độ từ 50-250 µM được bổ sung vào môi trư ng lúc bắt đầu

nuôi cấy để khảo sát khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo sau 4 tuần. Các thí

nghiệm được tiến hành tương tự như các th nghiệm nghiên c u ảnh hưởng cảm ng

của MeJA và YE, kết quả được trình bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của SA lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo

ố lư g o (g)

GI

ồ g ộ (µM)

50

4,01

100

2,68

150

2,54

200

2,00

250

1,74

ĐC

ươ 12,03a 8,05b 7,61bc 5,99bc 5,21c 4,98c

Khô 0,81a 0,68ab 0,64ab 0,53bc 0,51c 0,45c

1,66

Đ : ế bào không x lý elicitor

Nồng độ 50 và 100 µM SA đã có ảnh hưởng kích thích rõ rệt lên sinh khối tế

bào (tương ng là 12,03 g và 8,05 g tươi, 0,81 g và 0,68 g khô với GI từ 2,68-4,01)

so với đối ch ng (4,98 g tươi và 0,45 g khô, GI = 1,66). Sự sinh trưởng của tế bào ở

các nồng độ khác của SA (150-250 µM) không sai khác đáng kể so với đối ch ng

(p>0,05).

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của SA lên khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo

ồ g ộ (µM/L) 50 100 150 200 250

ĐC1

lư g (mg/g) 133,5d 186,5b 245,0a 162,0c 51,0f 123,5e 23,5g

ĐC2

Đ 1: ế bào không x lý elicitor. Đ 2: ễ của cây tự nhiên 1 năm ổi

53

Kết quả phân tích HPLC cho thấy lượng solasodine tăng dần khi bổ sung SA

từ 50-150 μM, sau đó giảm mạnh ở 200-250 μM SA. Nh n chung, SA đã ảnh hưởng

lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn cả MeJA và

YE. Ở môi trư ng có bổ sung 150 µM SA, lượng solasodine trong tế bào đạt cao

nhất (245 mg/g khối lượng khô), cao hơn khi xử lý 50 μM MeJA khoảng 1,5 lần và

1 cm

3 g/L YE khoảng 1,1 lần.

b

a

Hình 3.10. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo trong

môi trư ng MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 150 µM SA

(lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/ph t sau 4 tuần nuôi cấy

3.2.4.2. Thời gian nuôi cấy

Tương tự như khi nghiên c u 2 elicitor MeJA và YE, ch ng tôi đã sử dụng

nồng độ 150 μM SA để khảo sát quá tr nh sinh trưởng và t ch lũy solasodine của tế

bào trong suốt 7 tuần nuôi cấy. Kết quả thu được cho thấy 2 tuần đầu sinh khối tế

bào tăng mạnh và đạt cực đại ở tuần th 3 (8,36 g tươi và 0,68 g khô), tuần th 4 và

5 giảm nhẹ, tuần th 6 giảm rất mạnh và đến tuần th 7 chỉ còn 4,85 g tươi và 0,34

g khô (Hình 3.11). Kết quả này hơi khác so với đối ch ng không cảm ng ho c

trư ng hợp MeJA và YE, sinh khối cao nhất là ở tuần th 4.

Kết quả nghiên c u quá tr nh t ch lũy solasodine trong tế bào cho thấy hàm

lượng chất này cũng tăng dần từ tuần th 1 đến tuần th 4 và đạt cực đại là 245

mg/g khối lượng khô, cao hơn trong rễ tự nhiên c y 1 năm tuổi khoảng 10,6 lần và

54

đối ch ng không cảm ng khoảng 2 lần. Từ tuần th 5 đến tuần th 7, lượng

solasodine giảm rõ rệt và chỉ còn 111,5 mg/g khối lượng khô. Xu hướng t ch lũy

solasodine trong tế bào ở trư ng hợp này cũng tương tự như khi ch ng chịu tác

động của MeJA và YE nhưng hàm lượng là cao hơn đáng kể (Hình 3.12).

Hình 3.11. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150 µM SA

sau 7 tuần nuôi cấy

Hình 3.12. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150 µM SA

sau 7 tuần nuôi cấy

55

3.2.4.3. Thờ đ m cảm ng

Bảng 3.11 cho thấy th i gian cảm ng ngắn (150 μM SA) t ảnh hưởng đến

sinh trưởng của tế bào. Tế bào đối ch ng có th i gian cảm ng dài nhất, do đó sinh

khối chỉ được 7,61 g tươi và 0,68 g khô. M c dù sinh khối tươi thu được rất cao ở

các th i gian cảm ng khác (7-21 ngày), nhưng lượng chất khô lại không nhiều chỉ

chiếm từ 5-5,7%, thấp hơn 2 trư ng hợp MeJA và YE.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung 150 µM SA lên sinh trưởng của tế bào cà gai

leo

ố lư g o (g)

ờ ( g y)

GI

7

2,71

14

2,97

21

3,04

ĐC

ươ 8,12c 8,90b 9,13a 7,61d

Khô 0,68b 0,69b 0,74a 0,68b

2,54

Đ : SA 150 μM được bổ ng o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy

Kết quả khảo sát cho thấy xử lý 150 μM SA vào th i điểm 7-21 ngày sau khi

nuôi cấy cũng không đủ th i gian cảm ng để tế bào có thể sản xuất một lượng

solasodine cao, tương tự như MeJA và YE, chỉ đạt từ 82,5-117 mg/g khối lượng

khô). Xử lý SA ngay từ lúc bắt đầu nuôi cấy vẫn cho kết quả tốt nhất, 245 mg/g

khối lượng khô, cao hơn các trư ng hợp khác từ 2-3 lần (Bảng 3.12).

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung 150 µM SA lên khả năng t ch lũy solasodine

của tế bào cà gai leo

ờ (ngày)

7

14

21

ĐC

lư g (mg/g) 117,0b 101,5c 82,5d 245,0a

Đ : SA 150 μM được bổ ng o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy

56

3.2.5. ưởng k t h p c a các elicitor

3.2.5.1. N độ các elicitor

3.2.5.1.1. Kết hợp hai elicitor

Từ kết quả nghiên c u xử lý riêng lẻ từng elicitor (MeJA, YE và SA), chúng

tôi chọn nồng độ thích hợp nhất của chất này kết hợp với các nồng độ khác nhau

của chất kia để tìm hiểu ảnh hưởng phối hợp ch ng lên sinh trưởng và t ch lũy

solasodine của tế bào cà gai leo. Cụ thể như sau:

50 µM MeJA kết hợp với YE (1-5 g/L) ho c SA (50-250 µM).

3 g/L YE kết hợp với MeJA (25-250 µM) ho c SA (50-250 µM).

150 µM SA kết hợp với MeJA (25-250 µM) ho c YE (1-5 g/L).

Các elicitor được bổ sung vào môi trư ng vào lúc bắt đầu nuôi cấy.

Các kết quả phối hợp tốt nhất của từng c p elicitor sau 4 tuần nuôi cấy được

trình bày ở bảng 3.13. Nhìn chung, hiệu quả xử lý phối hợp không bằng xử lý riêng

rẽ, sinh khối tế bào và solasodine thu được cao nhất (tương ng 7,74 g tươi và 197,5

mg/g khối lượng khô) ở công th c 150 µM SA và 3 g/L YE, chỉ cao hơn 50 µM

MeJA (3,38 g tươi và 159,0 mg/g khối lượng khô) nhưng thấp hơn so với 3 g/L YE

(8,8 g tươi và 220,5 mg/g khối lượng khô) và 150 μM SA (7,61 g tươi và 245,0

mg/g khối lượng khô).

Bảng 3.13. Ảnh hưởng kết hợp của từng c p elicitor lên sinh trưởng và t ch lũy solasodine

của tế bào cà gai leo

Elicitor

ố lư g o (g)

GI

SA

Solasodine (mg/g)

ươ

Khô

MeJA (µM)

YE (g/L)

(µM)

50

2

-

1,52

50

-

50

1,72

25

-

150

1,79

-

3

150

2,58

25

3

-

1,97

4,56f 5,17d 5,37c 7,74a 5,91b 4,98e

0,43bc 0,42c 0,49b 0,47ab 0,55a 0,45ab

1,66

186,0b 165,5d 173,0c 197,5a 170,5c 123,5e

C -: không có elicitor

57

3.2.5.1.2. Kết hợp ba elicitor

Nồng độ của các elicitor được sử dụng để kết hợp như sau: MeJA (25-250

µM), YE (1-5 g/L) và SA (50-250 µM). Các elicitor cũng được bổ sung vào môi

trư ng l c bắt đầu nuôi cấy.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng kết hợp của 3 elicitor lên sinh trưởng và t ch lũy solasodine của tế

bào cà gai leo

ồ g ộ elicitor

ố lư g o (g)

GI

Solasodine (mg/g)

ươ

Khô

SA (µM)

MeJA (µM)

YE (g/L)

150

5

50

1,61

150

3

150

1,41

100

3

50

1,35

4,82b 4,23c 4,05d 4,98a

0,31c 0,32c 0,39b 0,45a

1,66

153,0c 160,0b 180,5a 123,5d

C

Bảng 3.14 tr nh bày các nồng độ kết hợp cho hàm lượng solasodine cao nhất

của 3 chất nói trên. Nh n chung, solasodine ở trư ng hợp này thấp hơn trư ng hợp

kết hợp 2 elicitor, cao nhất chỉ đạt 180,5 mg/g khối lượng khô và sinh khối tế bào là

1 cm

4,05 g tươi (100 µM SA, 50 µM MeJA và 3 g/L YE).

b

a

Hình 3.13. (a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo trong

môi trư ng MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D bổ sung 150 µM SA

và 3 g/L YE (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy

58

3.2.5.2. Thời gian nuôi cấy

Nồng độ xử lý kết hợp của 2 chất SA 150 µM và YE 3 g/L cho hàm lượng

solasodine cao nhất đã được sử dụng để nghiên c u ảnh hưởng của chúng lên quá

tr nh sinh trưởng và t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo. Kết quả nghiên c u

trong 7 tuần nuôi cấy được trình bày ở hình 3.14 và 3.15.

Hình 3.14. Đư ng cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo

khi bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy

Sinh khối khô đạt cực đại ở tuần th 3 và 4 (0,48 và 0,47 g, sai khác không

có ý nghĩa thống kê, p>0,05), sau đó giảm dần từ tuần th 5 đến tuần th 7. Nhìn

chung, tế bào sinh trưởng tốt, sinh khối tươi cao nhất là 7,74 g (Hình 3.15).

Phân tích HPLC từ dịch chiết tế bào cà gai leo cho thấy solasodine tăng từ

tuần th 2 đến tuần th 4, đạt giá trị cực đại là 197,5 mg/g khối lượng khô. Từ tuần

th 5, lượng solasodine bắt đầu giảm và chỉ còn 98,5 mg/g khối lượng khô ở tuần

th 7 (Hình 3.16).

59

Hình 3.15. Đư ng cong t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo

khi bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy

Nhìn chung, xử lý kết hợp các elicitor ở các nồng độ khác nhau ở nghiên c u

này đều có tác dụng tăng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo so với đối

ch ng. Công th c kết hợp tốt nhất cho lượng solasodine cao hơn khoảng 1,6 lần so

với tế bào không được xử lý và khoảng 8,4 lần so với rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi.

Tuy nhiên, xử lý kết hợp chỉ hiệu quả hơn xử lý riêng rẽ với 50 μM MeJA

(solasodine: 197,5 mg/g so với 159 mg/g khối lượng khô), nhưng không bằng xử lý

riêng rẽ với 3 g/L YE (solasodine: 220,5 mg/g khối lượng khô) và 150 μM SA

(solasodine: 245 mg/g khối lượng khô).

3.2.5.3. Thờ đ m cảm ng

Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE lên sinh trưởng

và t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày ở

bảng 3.15 và 3.16.

Tương tự như xử lý riêng rẽ MeJA, YE và SA, xử lý kết hợp các elicitor

cũng cho thấy th i điểm bổ sung thích hợp nhất là lúc bắt đầu nuôi cấy, hay nói

cách khác th i gian cảm ng dài (4 tuần) có hiệu quả nhất. Sinh trưởng của tế bào

60

và lượng solasodine đều cao hơn so với các th i điểm cảm ng khác (7-21 ngày sau

khi nuôi cấy) tương ng với th i gian cảm ng là 21-7 ngày. So với kết quả nghiên

c u ở tế bào của phần lớn các loài thực vật khác mà chúng tôi sẽ đề cập trong phần

bàn luận, tế bào cà gai leo đòi hỏi th i gian cảm ng dài ngày hơn.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến khả năng sinh

trưởng của tế bào cà gai leo

ố lư g o (g)

ờ

GI

(ngày)

ươ

Khô

7

6,62b

0,45ab

2,21

14

5,35cd

0,39b

1,78

21

5,13d

0,32c

1,71

ĐC

7,74a

0,47a

2,58

Đ : SA 150 μM YE 3 g/L được bổ ng o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của th i điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến khả năng t ch

lũy solasodine của tế bào cà gai leo

ờ ( g y)

Solasodine (mg/g)

7

11,8b

14

51,0c

21

46,0d

ĐC

197,5a

Đ : SA 150 μM YE 3 g/L được bổ ng o môi ường lúc bắ đầu nuôi cấy

3.3. KH HOẠT TÍNH CỦA SOLASODINE TỪ DỊCH CHI T

T BÀO CÀ GAI LEO

Kết quả nghiên c u hoạt tính solasodine của dịch chiết tế bào cà gai leo 4

tuần tuổi được trình bày ở bảng 3.17.

Ở mẫu đối ch ng (dung dịch collagenase 0,1 mg/mL) chiều cao cột collagen gel bị

tiêu là 67,7 mm; trong khi ở mẫu có dịch chiết solasodine, chiều cao cột gel bị tiêu

61

t hơn khoảng 4,5 lần (chỉ 15 mm). Điều này đã ch ng tỏ hiệu quả kháng viêm in

vitro của dịch chiết solasodine từ tế bào cà gai leo trên collagenase tinh khiết, và

cho phép đưa ra nhận định bước đầu về khả năng c chế collagenase của chúng. Kết

quả của chúng tôi phù hợp với kết quả của Nguyễn Bích Thu và cs (2000) [14] về

xác định hoạt tính của dịch chiết glycoalkaloid toàn phần từ rễ cà gai leo (chủ yếu là

solasodine) trên collagenase.

Bảng 3.17. Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên collagenase

Chi u dài cột gel

Chi u dài cột gel

Chi u cao cột gel

Thí nghiệm

ầu (mm)

sau 24 giờ (mm)

bị tiêu (mm)

Dịch chiết solasodine

119,0 ± 2,1

104,0 ± 1,5

15,0 ± 0,6

ĐC

118,0 ± 1,8

50,3 ± 1,2

67,7 ± 1,6

Đ : d ng dịch collagenase 0,1 mg/mL.

3.4. QUY TRÌNH S N XU T SOLASODINE HI U SU T CAO TỪ T BÀO

IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHI M

3.7.1. Nuôi c y t o nguyên liệu

3.7.1.1. Nuôi cấy cây in vitro

- Các đoạn thân có mắt lá (dài khoảng 2 cm) của cây cà gai leo ngoài tự

nhiên rửa sạch bằng nước xà phòng loãng dưới dòng nước chảy, khử trùng cồn 70%

trong 1 phút, HgCl2 0,1% trong 8 phút, rửa lại bằng nước cất khoảng 5 lần trước khi

1 cm

cấy lên môi trư ng tạo cây in vitro S0 [4].

Hình 3.16. Cây cà gai leo in vitro trong môi trư ng S0 sau 4 tuần nuôi cấy

62

Thành phần môi trư ng S0: môi trư ng cơ bản MS (Murashige và Skoog,

1962), sucrose 30 g/L, agar 0,8 g/L; IBA 0,5 mg/L.

- Các đoạn thân có mắt lá của cây in vitro tiếp tục được cấy trên môi trư ng

S0 để nhân cây tạo nguyên liệu.

3.7.1.2. Nuôi cấy tạo callus

- Sử dụng đoạn thân, cuống lá, đoạn rễ và mảnh lá của cây in vitro cấy vào

môi trư ng S1 để tạo callus sơ cấp [1].

Thành phần môi trư ng S1: môi trư ng cơ bản MS, sucrose 30 g/L, agar 0,8

1 cm

g/L; NAA 0,1 mg/L và 2,4-D 1,0 mg/L.

Hình 3.17. Callus cà gai leo in vitro trong môi trư ng S2 sau 4 tuần nuôi cấy

- Chọn các callus sơ cấp màu vàng nhạt, rắn và khô để nhân trong môi

trư ng S2 tạo callus th cấp.

Thành phần môi trư ng S2: môi trư ng cơ bản MS, sucrose 30 g/L, agar 0,8

g/L; BAP 0,1 mg/L và 2,4-D 1,0 mg/L.

3.7.1.3. Nuôi cấy tạo t bào huy n phù

- Nghiền nhỏ 3 g callus trong điều kiện vô trùng để chuyển vào nuôi ở bình

tam giác 250 mL ch a 50 mL môi trư ng S2 không bổ sung agar, nuôi cấy lắc ở tốc

độ 120 vòng/phút [59].

- 20 mL dịch tế bào huyền phù từ callus (khoảng 1,65 g) được chuyển nhân

sinh khối trong bình tam giác 250 mL ch a 50 mL môi trư ng S3, nuôi cấy lắc ở tốc

độ 150 vòng/phút [59].

63

Thành phần môi trư ng S3: môi trư ng cơ bản MS, sucrose 40 g/L; BAP 0,1

mg/L và 2,4-D 1,0 mg/L.

Hình 3.18. Tế bào cà gai leo nuôi cấy trong môi trư ng S3 tốc độ lắc 150 vòng/phút

* Tất cả c c môi ường nuôi cấ được kh trùng trong autoclave ở 121oC trong 15 phút.

* Điều kiện nuôi cấ c c môi ường có bổ sung agar: nhiệ độ nuôi 25 ± 2 o , cường độ

chiếu sáng 2000-3000 lux. * Điều kiện nuôi cấ c c môi ường không bổ sung agar: nhiệ độ nuôi 25 ± 2 o , cường

độ chiếu sáng 500 lux.

* Tất cả các thí nghiệm đề được tiến h nh ong điều kiện chiếu sáng 10 giờ/ngày với

thời gian nuôi cấy 4 tuần.

3.7.2. Nuôi c y sản xu t solasodine

- 20 mL dịch tế bào huyền phù chuyển vào môi trư ng S3 có xử lý 150 µM

salicylic acid từ lúc bắt đầu nuôi cấy để sản xuất solasodine.

Nuôi cấy lắc ở tốc độ 150 vòng/phút. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ nuôi 25 ± 2 oC, cư ng độ chiếu sáng 500 lux,

th i gian chiếu sáng 10 gi /ngày.

Th i gian nuôi cấy: 4 tuần.

3.7.3. Thu sinh khối t bào và tách chi t solasodine

- Tế bào cà gai leo sau 4 tuần có xử lý 150 µM salicylic acid lúc bắt đầu nuôi cấy được lọc và rửa sạch môi trư ng bằng nước cất, sau đó được sấy khô ở 50oC

trong khoảng 24 gi cho đến khi khối lượng không đổi thu được sinh khối khô.

64

- Thu dịch chiết solasodine: sinh khối khô của tế bào cà gai leo được nghiền

thành bột mịn, cân 1 g và chiết cách thủy bằng sinh hàn ngược với 50 mL dung dịch

acetic acid 5% trong methanol trong 3 gi , lọc và cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không ở 50oC, hòa tan kết tủa bằng methanol và định m c đến 10 mL [15].

Hình 3.19. Dịch chiết solasodine

- Định lượng solasodine: dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo được lọc

bằng màng Minisart 0,2 µm (Sartorius, Đ c), pha loãng 5 lần trong cùng dung môi (methanol) và bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Sử dụng cột Hypersil MOS (C8) (5 μm,

4.6×150 mm) của Thermo Scientific, th i gian chạy cho một mẫu là 5 phút, tốc độ

dòng 1 mL/ph t và detector có bước sóng 254 nm. Pha tĩnh là silica gel (pha ngược)

và pha động là methanol 100%.

- Xác định hoạt tính của dịch chiết solasodine:

Chuẩn bị cột gel: Cân 50 mg collagen type I từ g n đuôi chuột (Sigma, Mỹ)

hòa trong 50 mL dung dịch acetic acid 0,05 M, bổ sung NaCl để đạt đến nồng độ

0,04 M, điều chỉnh pH 7,5-8 bằng Tris.HCl 2 M để thu được dung dịch collagen

trong suốt. Dùng các ống mao quản đư ng kính 2 mm, dài 150 mm hút dịch

collagen tới chiều cao 2/3 ống (100 mm). Nút kín một đầu ống bằng paraffin và bịt đầu còn lại bằng giấy paraffin. Đ t các ống này thẳng đ ng trong tủ ấm 37oC để qua

đêm, collagen sẽ đông đ c lại thành gel trong suốt. Lấy cột gel ra khỏi tủ ấm và

đánh dấu chiều cao cột gel để xác định điểm mốc của quá trình tiêu gel. Pha dung

dịch collagenase type I 0,2 mg/mL bằng đệm Tris.HCl 0,05 M (pH 7,9). Cho 150

µL hỗn hợp dung dịch collagenase 0,2 mg/mL và dịch chiết solasodine (tỷ lệ 1:1)

vào cột collagen gel. Đối ch ng là dung dịch collagenase 0,1 mg/mL. Để các cột gel

65

vào tủ ấm 37oC trong 24 gi , sau đó lấy các cột ra đo chiều dài gel bị tiêu (gel hóa

lỏng) do tác dụng của collagenase để xác định hoạt tính của dịch chiết solasodine.

ơ ồ tóm t t quy trình

Cây cà gai leo tự nhiên

1. Kh trùng: - Ethanol 70% trong 1 phút - HgCl2 0,1% trong 8 phút - Rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng

4 tuần

2. T o cây in vitro từ đoạn thân có mắt lá trong môi trư ng S0

Cây cà gai leo in vitro

4 tuần

3. T o callus từ đoạn th n, đoạn rễ, cuống lá và mảnh lá của cây in vitro trong môi trư ng S1

Tạo callus

3 tuần

4. Nhân callus trong môi trư ng S2

Nhân callus

4 tuần

5. Nuôi 3 g callus trong 50 mL môi trư ng S2 (không agar) tốc độ lắc 120 vòng/phút

4 tuần

6. Nuôi 20 mL dịch tế bào trong 50 mL môi trư ng S3 tốc độ lắc 150 vòng/phút

Nuôi tế bào huyền phù

7. Bổ sung 150 µM salicylic acid vào môi trư ng S3 lúc bắt đầu nuôi cấy tế bào, tốc độ lắc 150 vòng/phút, 4 tuần.

Tăng sinh solasodine

8. Tách chi t solasodine từ t bào theo ươ g Soxhlet.

9. ị lư ng dịch chiết solasodine bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

10. ịnh ho t tính trên cột collagen gel.

Dịch chiết solasodine

Hình 3.20. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm

66

C ươ g 4

BÀN LU N

4.1. C

Trong nghiên c u này, pha lag của tế bào chỉ xuất hiện trong một th i gian

ngắn, pha log kéo dài đến hết tuần th 4. Sau pha log, sinh trưởng của tế bào bắt

đầu giảm và ở tuần th 7 xuất hiện tế bào chết. So với các kết quả nghiên c u khác,

tế bào huyền phù của cà gai leo sinh trưởng khá tốt và có th i gian nuôi cấy tương

đương với tế bào của một số loài trong chi Solanum như S. eleagnifolium 26 ngày

[67], S. aviculare 28 ngày [52], và S. chrysotrichum 22 ngày (nuôi cấy lắc trong

bình tam giác) ho c 16 ngày (nuôi cấy trong hệ lên men) [90]. Tốc độ sinh trưởng

của tế bào huyền phù cà gai leo nhanh hơn nhiều so với callus của ch ng (10 tuần)

[56].

Khả năng t ch lũy solasodine của tế bào cà gai leo tăng dần từ tuần th nhất

đến tuần th 4 và đạt cực đại là 123,5 mg/g khối lượng khô, cao hơn trong rễ tự

nhiên khoảng 5,3 lần. Sau đó, từ tuần th 5-7, hàm lượng solasodine bắt đầu giảm

dần. Kết quả này phù hợp với các kết quả đã được công bố trước đ y [59]. Kết quả

nghiên c u của ch ng tôi cũng tương tự kết quả nghiên c u khả năng sản xuất

jaceosidin của tế bào S. medusa, hàm lượng jaceosidin và sinh khối tế bào đều đạt

cực đại vào ngày th 14 [112]. Thực ra, quá tr nh t ch lũy các HCTC giữa các loài

cũng không hoàn toàn giống nhau, không phải loài nào cũng tăng t ch lũy khi sinh

trưởng của tế bào đi vào pha ổn định. Chẳng hạn, Rao và cs (2008) khi nuôi cấy tế

bào Tinospora cordifolia đã nhận thấy khối lượng khô tế bào đạt cực đại sau 36

ngày nuôi, nhưng lượng berberine trong tế bào lại thu được cao nhất vào ngày th

24 trong pha sinh trưởng của chúng [82].

4.2. NG CỦA METHYL JASMONATE

MeJA là một hợp chất tạo hương dễ bay hơi lần đầu tiên được tìm thấy trong

hoa của cây Jasminum grandiflorum, sau đó được ch ng minh là phân bố rộng rãi

trong giới thực vật. MeJA được ghi nhận như một chất điều hòa cần thiết cho sự

67

sống tế bào, có vai trò trung gian trong quá trình phát triển khác nhau (nảy mầm, tạo

rễ, sinh sản, chín quả, già yếu) và các phản ng bảo vệ tế bào chống lại các stress

sinh học và phi sinh học (tổn thương do côn trùng g y ra, điều kiện bất lợi của môi

trư ng như hạn hán, nhiệt độ thấp, độ m n) [37].

MeJA và jasmonic acid là những hợp chất điều hoà sinh trưởng thực vật có vai

trò trong sự lão suy của thực vật, tham gia vào con đư ng truyền tín hiệu ngoại sinh

(stress, vết thương, sinh vật gây bệnh) và cảm ng hoạt động của hệ thống bảo vệ ở

thực vật. MeJA khởi động sự phiên mã mRNA de novo của các gen PAL dẫn tới sự

tạo phenylalanine ammonia-lyase, enzyme đầu tiên của con đư ng phenylpropanoid

liên quan ch t chẽ đến sự sản xuất các HCTC ở thực vật (Brincat và cs, 2002) (dẫn

theo Lê Thị Thủy Tiên và cs, 2010) [17]. MeJA đã được nghiên c u và sử dụng

rộng rãi làm elicitor trong sản xuất các HCTC từ nuôi cấy tế bào thực vật [99].

Bonfill và cs (2010) đã nghiên c u sử dụng MeJA để tăng khả năng t ch lũy

centelloside và phytosterol trong nuôi cấy tế bào rau má. Khi bổ sung 100 µM

MeJA vào môi trư ng nuôi cấy, các tác giả thu được hàm lượng centelloside cao

gấp 6,9 lần so với mẫu không được bổ sung MeJA [31].

4.2.1. ưởng c a nồ g ộ methyl jasmonate

Thông thư ng, bổ sung các elicitor vào môi trư ng nuôi cấy đều c chế khả

năng sinh trưởng của tế bào, kết quả này được công bố trên nhiều công trình nghiên c u trước đ y. Chẳng hạn, các elicitor như MeJA, Ag+, chitosan và dịch chiết từ

nấm (polysaccharide) ở các nồng độ khác nhau đều c chế sinh trưởng của tế bào

Taxus chinensis [111]. Kết quả nghiên c u của Frankfater và cs (2009) về ảnh

hưởng của MeJA và SA lên sự tạo thành gossypol, 6-methoxygossypol và 6,6’-

dimethoxygossypol trong nuôi cấy rễ tơ c y G. barbadense cũng cho thấy MeJA có

tác dụng c chế quá tr nh sinh trưởng của tế bào [44].

Trong nghiên c u của chúng tôi, trong môi trư ng có MeJA sinh trưởng của tế

bào cà gai leo kém hơn so với đối ch ng không bổ sung elicitor, nồng độ elicitor

càng cao thì sự sinh trưởng của tế bào càng giảm. Kết quả này phù hợp với các

nghiên c u trước đ y về sự c chế của elicitor lên sinh trưởng của tế bào thực vật.

68

Thanh và cs (2005) đã sử dụng MeJA để tổng hợp ginsenoside trong nuôi cấy huyền

phù tế bào của nhân sâm trong biorector 5 L. Nhóm tác giả tiến hành thăm dò bổ

sung vào môi trư ng nuôi cấy MeJA các nồng độ từ 50-400 µM, sau 25 ngày nuôi

cấy thu được hàm lượng ginsenoside cao nhất ở nồng độ 200 µM, cao gấp 2,2 lần so

với tế bào nuôi cấy không bổ sung MeJA. Trong khi đó, sinh khối tươi và sinh khối

khô của tế bào giảm 1,06 và 1,10 lần so với tế bào nuôi cấy không bổ sung MeJA

[99].

Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình cảm ng, sự tích

lũy các HCTC sẽ đạt cao nhất ở nồng độ elicitor thích hợp. Namdeo và cs (2002)

nhận thấy sự t ch lũy ajmalicine trong nuôi cấy cây dừa cạn (C. roseus) được xử lý

nồng độ chất kh ch kháng cao (5%) là cao hơn so với xử lý ở nồng độ thấp (0,5%).

Tuy nhiên, nồng độ chất k ch kháng cao hơn 10% ảnh hưởng bất lợi lên sự t ch lũy

ajmalicine. Nồng độ chất k ch kháng cao g y ra hiện tượng đáp ng quá ngưỡng,

dẫn đến chết tế bào [65]. Trong nghiên c u của chúng tôi, sự t ch lũy solasodine đạt

cao nhất khi được xử lý MeJA ở nồng độ 50 µM (159 mg/g, gấp 1,3 lần tế bào đối

ch ng không bổ sung MeJA). Sự t ch lũy solasodine mạnh khi được xử lý elicitor ở

nồng độ thấp (25-50 µM) và giảm dần khi xử lý MeJA ở nồng độ trên 100 µM.

Nhiều nghiên c u đã công bố cho thấy nồng độ MeJA thích hợp để tổng hợp

các HCTC thư ng cao hơn nghiên c u của chúng tôi, thư ng từ 100 µM trở lên.

Chẳng hạn, MeJA ở nồng độ 100 µM tăng khả năng t ch lũy taxol trong tế bào

huyền phù Taxus chinensis var mairei lên cực đại (0,143 µM) [104]. Roat và cs

(2009) đã nghiên c u ảnh hưởng của các elicitor trong sinh tổng hợp stilbenes của

tế bào cây giây giác. Khi xử lý 250 µM MeJA ở ngày nuôi cấy th 7 đã thu được

hàm lượng resveratrol cao nhất sau 15 ngày nuôi với 186 µg/g (cao hơn xử lý SA và

erther) [87]. Nopo-olazabal và cs (2014) nghiên c u sản xuất stilbenoid ở rễ cây

Vitis rotundifolia khi xử lý 100 µM MeJA ho c 10 mM H2O2 trong 96 gi . Kết quả

cho thấy hàm lượng stilbenoids đạt cao nhất khi xử lý MeJA sau 12 gi nuôi cấy

[70].

4.2.2. ưởng c a thời gian x lý methyl jasmonate

69

Trong nuôi cấy tế bào thực vật, các HCTC t ch lũy nhiều nhất vào cuối giai

đoạn sinh trưởng cực đại. Đã có những bằng ch ng rõ ràng cho thấy có mối quan hệ

ngược giữa tốc độ sinh trưởng và khả năng sản xuất các chất th cấp. Khi tốc độ

sinh trưởng cao, các quá tr nh sơ cấp của tế bào là phân chia tế bào và sản xuất sinh

khối tế bào đã diễn ra mạnh mẽ. Ngược lại, trong pha tĩnh khi sự sinh trưởng giảm,

lúc này hoạt động sản xuất và t ch lũy các chất th cấp mới tăng lên [102].

Đối với cây cà gai leo, pha ổn định của tế bào rất ngắn, sau khi tế bào sinh

trưởng cực đại thì sinh khối giảm ngay (từ tuần th 5). Vì vậy, hàm lượng

solasodine được tổng hợp cao nhất vào cuối giai đoạn tế bào sinh trưởng cực đại (4

tuần) là hợp lý. Kết quả này của ch ng tôi cũng tương tự kết quả nghiên c u khả

năng sản xuất jaceosidin của tế bào S. medusa. Hàm lượng jaceosidin và sinh khối

tế bào đều đạt cực đại vào ngày th 14 của quá trình nuôi cấy [112]. Ngoài ra, quá

tr nh t ch lũy các HCTC không giống nhau giữa các loài khác nhau, không phải loài

thực vật nào cũng tăng cư ng t ch lũy các HCTC khi sinh trưởng của tế bào đi vào

pha ổn định. Khi nuôi cấy tế bào T. cordifolia, Rao và cs (2008) nhận thấy rằng

trong khi khối lượng khô tế bào đạt cực đại (9,9 g/L) sau 36 ngày nuôi cấy, thì hàm

lượng berberine trong tế bào lại thu được cao nhất vào ngày 24 trong pha log của tế

bào (3,8 mg/g khối lượng khô) [82].

Th i điểm xử lý elicitor cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả

năng sinh trưởng và t ch lũy các sản phẩm th cấp của tế bào thực vật. Kết quả

nghiên c u của chúng tôi cho thấy th i điểm bổ sung MeJA đã ảnh hưởng đến khả

năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo. Sinh trưởng của tế bào ở các th i gian xử lý

elicitor khác nhau (7, 14 và 21 ngày) đều giảm so với xử lý ở th i điểm ban đầu của

quá trình nuôi cấy. Như vậy, tế bào cà gai leo sinh trưởng tốt nhất khi xử lý 50 µM

MeJA ở th i điểm ban đầu nuôi cấy.

Tương tự như đối với sinh khối tế bào, các th i điểm bổ sung elicitor từ 7-21

ngày của quá trình nuôi cấy tế bào cà gai leo đều cho thấy hàm lượng solasodine

giảm so với đối ch ng bổ sung th i điểm ban đầu. Tế bào t ch lũy solasodine thấp

nhất khi bổ sung MeJA vào ngày nuôi cấy 21 (74,5 mg/g khối lượng khô) và cao

nhất vào ngày bắt đầu nuôi cấy (159,0 mg/g khối lượng khô). Như vậy, th i gian

70

cảm ng càng dài sự t ch lũy solasodine càng lớn. Kết quả nghiên c u của chúng tôi

tương tự như kết quả nghiên c u của Chong và cs (2005) về ảnh hưởng của các

elicitor khác nhau và th i điểm bổ sung elicitor (đầu pha log, giữa pha log và pha ổn

định) vào mẫu nuôi cấy tế bào Morinda elliptica. Mẫu tế bào có bổ sung jasmonic

acid 100 µM ở đầu và giữa pha log cho hàm lượng anthraquinone đạt 26,6 và 21,9

mg/g khối lượng khô, cao gấp 2,9 và 1,4 lần so với mẫu không bổ sung jasmonic

acid [39]. Lu và cs (2001) đã nghiên c u ảnh hưởng của sự cảm ng lên sản xuất

saponin trong nuôi cấy tế bào nhân sâm (Panax ginseng). Cả hai elicitor được thử

nghiệm là YE và MeJA đều cải thiện sản xuất saponin một cách đáng kể. M c tăng

cao nhất của 7 ginsengnoid khảo sát là 2,07% (khối lượng khô), gấp 28 lần so với

đối ch ng. Th i gian tối ưu để bổ sung elicitor được phát hiện là vào ngày nuôi cấy

ban đầu [60].

4.3. NG CỦA DỊCH CHI T N M MEN

Dịch chiết nấm men (YE) là một elicitor sinh học, được sử dụng trong nuôi

cấy mô và tế bào thực vật để tăng khả năng k ch th ch bộ máy bảo vệ, từ đó gia tăng

sản xuất các HCTC [47]. Pitta-Alvarez và cs (2000) nghiên c u sử dụng YE 0,8

mg/mL trên rễ tơ c y Brugmansia candida, sau 48 gi nuôi cấy các tác giả nhận

thấy hàm lượng scopolamine và hyoscyamine tăng khoảng 200% so với đối ch ng

(không có YE). Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy scopolamine cao hơn khoảng 600%

so với đối ch ng sau 24 gi nuôi cấy. Điều này có thể được lý giải bởi trong thành phần của YE được cho là có ch a một số cation như Zn2+, Ca2+ và Co2+ có vai trò

như là các elicitor phi sinh học. Bên cạnh đó YE cũng là một hợp chất bao gồm

nhiều thành phần khác nhau, ngoài các amino acid, vitamin và khoáng chất, nó còn

có thể ch a các thành phần elicitor khác chưa được xác nhận [76].

Cơ chế tác động chính xác của YE lên tế bào thực vật hiện nay vẫn chưa

được làm rõ. Tuy nhiên, sự truyền tín hiệu cảm ng được xem là một hệ thống

nhiều thành phần có ch c năng ph c tạp trong các phản ng bảo vệ khác nhau của

tế bào thực vật, giống như: các kênh ion, sự hoạt hóa tác nhân phân bào khởi động

protein kinase ho c con đư ng jasmonic acid ho c SA [86], [93].

71

4.3.1. ưởng c a nồ g ộ dịch chi t n m men

Không giống như khi xử lý bằng MeJA, khi bổ sung YE vào môi trư ng nuôi

cấy, tế bào cà gai leo sinh trưởng tốt hơn, dịch huyền phù tế bào sánh mịn đồng đều.

Sinh khối tươi và khô thu được đều cao hơn so với đối ch ng không bổ sung

elicitor. Có nghiên c u cho rằng, khi bổ sung vào môi trư ng nuôi cấy, YE có vai

trò hoạt động như một nguồn nitrogen và dưới áp lực dinh dưỡng này có thể cũng

đóng một vai trò quan trọng trong sinh trưởng và kích thích tế bào thực vật tăng

cư ng sản xuất HCTC [87].

Đã có nhiều công trình nghiên c u ch ng tỏ elicitor sinh học có thể tăng

cư ng sinh trưởng của tế bào trong một th i gian ngắn. Mathew và Sankar (2012)

khi nghiên c u ảnh hưởng của elicitor lên đ c t nh sinh trưởng của tế bào huyền phù

các loài Ocimum nhận thấy sinh khối tế bào tăng lên khi bổ sung elicitor vào môi

trư ng nuôi cấy; cụ thể, chitosan ở 200 mg/L sau 24 gi nuôi cấy là tối ưu đối với

loài O. basilicum trong khi chitosan 50 mg/L cũng sau 24 gi nuôi cấy tối ưu đối

với cả O. sanctum và O. gratissimum [62]. Kết quả này tương đương với kết quả

nghiên c u sự tăng sinh tế bào của cây nem giống KN-1 khi bổ sung 530 tế bào/mL

Cyanobacteria ở ngày nuôi th ba, sau 8 ngày sinh khối đạt 133,4 gm/L, cao hơn

1,38 lần so với mẫu đối ch ng không bổ sung elicitor (96,4 gm/L) [41].

Nghiên c u ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch lũy benzophanathridine

alkaloid trong tế bào Echscholtzia californica cho thấy sinh khối khô ở th i điểm 6

ngày đạt 7,5 g/L, cao hơn đối ch ng không có elicitor (6,9 g/L) [34]. Hakkim và cs

(2011) đã nghiên c u ảnh hưởng của các elicitor là YE (0,1-1,0 g/L) và MeJA (100-

500 µM) lên sự sinh trưởng và t ch lũy rosmarinic acid trong nuôi cấy tế bào cây

Ocimum sanctum. Kết quả nghiên c u cho thấy xử lý 0,5 g/L YE sau 18 ngày sinh

khối tế bào lẫn hàm lượng rosmarinic acid đều cao hơn khoảng 7 lần so với đối

ch ng, xử lý 100 µM MeJA tăng 8,6 lần so với đối ch ng không xử lý elicitor [46].

Từ kết quả nghiên c u của ch ng tôi cũng cho thấy, YE khi bổ sung vào môi

trư ng nuôi cấy đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và t ch lũy solasodine của tế bào

cà gai leo. Cả sinh khối và hàm lượng solasodine của tế bào cà gai leo đều tăng ở

nồng độ thích hợp (2-4 g/L). Điều này có thể do YE khi bổ sung vào môi trư ng đã

72

k ch th ch quá tr nh sinh trưởng của tế bào xảy ra nhanh trong th i gian ngắn, sau

đó tập trung năng lượng cho việc tạo thành HCTC. Kết quả nghiên c u của chúng

tôi tương tự như kết quả nghiên c u của Jain và cs (2015) trên một đối tượng khác

của họ cà là S. melongena. Khi xử lý 3 g/L YE trên rễ tơ c y S. melongena, sinh

khối thu được cao hơn đối ch ng khoảng 2 lần sau 28 ngày (6,75 g so với 3,39 g),

trong khi đó hàm lượng solasodine cao hơn đối ch ng khoảng 6,5 lần (43,12 µg/g

khô so với 6,5 µg/g khô). Các tác giả cho rằng YE ở trong môi trư ng sẽ đóng vài

trò như là nguồn nitrogen và ch ng đóng vai trò quan trọng trong việc sinh trưởng

cũng như t ch lũy các hợp chất [48].

Các nghiên c u sử dụng YE để tăng m c độ t ch lũy các HCTC đã được một

số tác giả công bố. Tuy nhiên, trong các công bố trước đ y, nồng độ YE được sử

dụng thư ng thấp hơn so với kết quả nghiên c u của chúng tôi. Chẳng hạn, nuôi cấy

rễ tơ c y Portulaca oleracea đã được Pirian và cs (2013) thực hiện để sản xuất

noradrenaline. Các tác giả đã sử dụng YE ở các nồng độ 0,125-1 g/L để cảm ng

làm tăng quá tr nh sản xuất noradrenaline, th i gian cảm ng 2 ngày. Các tác giả

nhận thấy liều lượng 0,25 và 0,5 g/L YE là thích hợp nhất, hàm lượng noradrenaline

tăng 3-4 lần so với đối ch ng [74]. Khi bổ sung dịch chiết nấm men, Aspergillus

niger, Fusarium oxysporum vào môi trư ng nuôi cấy Hypericum triquetrifolium

Turra ở các nồng độ từ 0,1-0,75 mg/L, Azeez và cs (2013) nhận thấy các elicitor

này có vai trò khác nhau trong việc sản xuất các HCTC. Đối với nấm men (0,5

mg/L), hàm lượng p-OH-benzoic acid và chlorgenic acid tăng lên đáng kể so với

đối ch ng. Caffeic acid và tannic acid giảm ở tất cả các công th c elicitor trong khi

catechin lại tăng khi cảm ng với A. niger. Rutin, hypersoid và quercitin tăng lên

đáng kể so với đối ch ng khi được xử lý elicitor ở tất cả các công th c [26].

4.3.2. ưởng c a thời gian x lý dịch chi t n m men

Đối với cây cà gai leo, th i gian xử lý elicitor càng dài càng kích thích sinh

khối tế bào phát triển. Khi bổ sung YE vào th i điểm bắt đầu nuôi cấy cũng như sau

7 ngày tế bào có khả năng sinh trưởng tương đương nhau, ở th i điểm cảm ng là

14 ngày chỉ số sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và mạnh nhất là ở 21 ngày. Kết quả

73

nghiên c u của Jain và cs (2015) trên cây S. melongena cũng cho thấy th i gian

cảm ng 28 ngày là tốt nhất cho phát triển sinh khối cũng như hàm lượng

solasodine như trong nghiên c u của chúng tôi [48].

Phân tích hàm lượng solasodine t ch lũy trong tế bào cây cà gai leo cho thấy

th i điểm cảm ng tốt nhất vẫn là lúc bắt đầu nuôi cấy giống như đối với MeJA

(solasodine đạt 220,5 mg/g khối lượng khô). Ở các th i điểm khác lượng solasodine

thu được thấp hơn từ 2-2,3 lần, dao động trong khoảng 92,0-110,5 mg/g khối lượng

khô. Kết quả này cũng tương tự như kết quả xử lý MeJA. Khả năng t ch lũy

solasodine trong tế bào cà gai leo đã được tiến hành nghiên c u trước đ y và thấy

rằng solasodine tăng t ch lũy từ tuần 2-4 [59]. Khi có xử lý elicitor, hàm lượng chất

này tăng chậm hơn, đến tuần th 3 mới tăng mạnh. Điều này có thể do tế bào đang

thích nghi với môi trư ng có elicitor nên cảm ng tạo HCTC chậm hơn. MeJA và

YE là hai elicitor có ảnh hưởng đến việc tăng t ch lũy solasodine trong tế bào, tuy

nhiên YE có tác dụng tốt hơn so với MeJA (lượng solasodine gấp 1,39 lần).

Sử dụng các elicitor sinh học th i gian dài cho kết quả tốt hơn th i gian ngắn

cũng đã được ghi nhận trên một số đối tượng. Vakil và cs (2013) sử dụng các chủng

nấm Aspergillus niger và Penicillium expansum làm elicitor để tăng khả năng tổng

hợp andrographolia khi nuôi cấy huyền phù tế bào Andrographis paniculata. Ở các

nồng độ dịch chiết nấm A. niger thí nghiệm (1; 1,5 và 2 mL) với th i gian cảm ng

khác nhau (4, 7 và 10 ngày), kết quả cho thấy bổ sung 1,5 mL cảm ng trong 10

ngày thu được lượng andrographolia t ch lũy trong nuôi cấy huyền phù tế bào A.

paniculata cao nhất (132 µg/g), gấp 6,94 lần so với đối ch ng. Đối với nấm P.

expansum, bổ sung các nồng độ (0,3; 0,6 và 1,2 %) với th i gian cảm ng khác

nhau (2, 5 và 8 ngày) nhận thấy hàm lượng andrographolia t ch lũy cao nhất khi có

0,6 % P. expansum cảm ng trong 8 ngày, cao hơn 6,23 lần so với đối ch ng [101].

4.4. NG CỦA SALICYLIC ACID

Salicylic acid (SA) là một hợp chất tín hiệu thực vật quan trọng trong việc

kích hoạt các gen liên quan đến cơ chế bảo vệ. Khi sử dụng làm elicitor, SA ảnh

hưởng đến khả năng t ch lũy các hợp chất liên quan đến cơ chế bảo vệ. SA được

74

biết như là tác nhân chống chịu tương tác thực vật gây bệnh, nhưng không phải là

chất cảm ng vạn năng trong sản xuất các chất chuyển hóa bảo vệ thực vật [33].

Theo Taguchi và cs (2001), SA t ch lũy ở các vị trí mầm bệnh để tấn công và kích

thích hệ thống bảo vệ thực vật và việc sản xuất các HCTC [97].

Pitta-Alvarez và cs (2000) nghiên c u ảnh hưởng của SA đến khả năng t ch

lũy scopolamine và hyoscyamine trong nuôi cấy rễ tơ Brugmansia candida nhận

thấy cả hai loại alkaloid này đều tăng sau 24 gi cảm ng. Ở tất cả các nồng độ SA

khảo sát (0,01-1,00 mM), hyoscyamine và scopolamine t ch lũy cực đại lần lượt sau

48 và 72 gi nuôi cấy (gấp khoảng 6 và 10 lần so với đối ch ng) [76].

4.4.1. ưởng c a nồ g ộ salicylic acid

Trong nghiên c u của chúng tôi, nồng độ 50 và 100 µM SA đã có ảnh hưởng

kích thích rõ rệt lên sinh khối tế bào so với đối ch ng. Sự sinh trưởng của tế bào ở

các nồng độ khác của SA (150-250 µM) không sai khác đáng kể so với đối ch ng.

Kết quả này cho thấy ảnh hưởng của SA lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo giống

như trong trư ng hợp hợp xử lý với YE và ngược với một elicitor phi sinh học khác

là MeJA. Kết quả này tương tự như nghiên c u của Sudha và cs (2003), xử lý 200

µM SA sau 15 nuôi cấy, sinh khối tế bào Capsicum frutescens cao hơn khoảng 1,5

lần so với đối ch ng không cảm ng [95].

Thông thư ng ở đa số trư ng hợp, sinh trưởng của tế bào bị c chế thì hàm

lượng HCTC t ch lũy mới tăng lên, nhưng tế bào cà gai leo đ c biệt hơn, sinh

trưởng tế bào tăng cùng với sự t ch lũy solasodine. Khi nghiên c u nhân giống vô

tính cây cà gai leo, Loc và cs (2011) nhận thấy sử dụng BAP khi kéo dài chồi (shoot

elongation) lại không hiệu quả bằng IBA [58]. Đ y cũng là hiện tượng lạ ở loài cây

này.

Hiện nay, không có nhiều công tr nh nghiên c u ghi nhận hiện tượng này

ngoại trừ ở họ cà. Trên họ cà, nghiên c u của Jain và cs (2015) cho thấy khi xử lý

50 µM SA trên nuôi cấy rễ tơ c y S. melongena sinh khối thu được cao hơn đối

ch ng khoảng 1,5 lần sau 28 ngày (5,16 g so với 3,39 g), trong khi đó hàm lượng

75

solasodine cao hơn đối ch ng khoảng 13,5 lần (89,03 µg/g khô so với 6,5 µg/g khô)

[48].

Trong hầu hết các công trình nghiên c u được công bố, việc xử lý elicitor

bằng SA sẽ c chế sự sinh trưởng của tế bào. Trong nghiên c u ảnh hưởng của SA

và elicitor tách chiết từ nấm (F5) ở các nồng độ riêng rẽ và phối hợp lên khả năng

sản xuất taxol trong nuôi cấy huyền phù tế bào Taxus chinensis. Yu và cs (2001)

nhận thấy khi bổ sung vào môi trư ng nuôi cấy 50 mg/l F5 ho c 50 mg/l SA ho c

phối hợp 50 mg/l F5 và 50 mg/l SA đều c chế sinh trưởng của tế bào, sinh khối

thấp nhất khi sử dụng phối hợp 50 mg/l F5 và 50 mg/l SA [109]. Nuôi cấy rễ tơ B.

candida bổ sung SA (0,01-1,00 mM) ở th i điểm sau 18 ngày, Pitta-Alvarez và cs

(2000) nhận thấy sinh trưởng tế bào bị ảnh hưởng, sinh khối tươi chỉ đạt 40% (480

mg) so với đối ch ng sau 72 gi cảm ng [76]. Loc và cs (2012) cũng có cùng kết

quả sinh khối tế bào rau má (C. asiatica) sau 24 ngày nuôi cấy giảm so với đối

ch ng ở tất cả các nồng độ SA (50-200 µM) bổ sung tại các th i điểm khác nhau (5-

15 ngày) [57].

Kết quả phân tích hàm lượng solasodine trong tế bào cà gai leo cho thấy sự

t ch lũy tăng dần khi bổ sung SA từ 50-150 μM, sau đó giảm mạnh ở 200-250 μM

SA. Nh n chung, SA đã ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế

bào cà gai leo rõ rệt hơn cả MeJA và YE. Ở môi trư ng có bổ sung 150 µM SA,

lượng solasodine trong tế bào đạt cao nhất (245 mg/g khối lượng khô), cao hơn khi

xử lý 50 μM MeJA khoảng 1,5 lần và 3 g/L YE khoảng 1,1 lần.

Trong các nghiên c u đã công bố trước đ y, việc sử dụng SA làm elicitor để

tăng cư ng tổng hợp các HCTC từ nuôi cấy tế bào thực vật rất phổ biến. Yu và cs

(2005) đã nghiên c u sự tích lũy jaceosidin và siringin trong nuôi cấy tế bào của sen

tuyết (Saussurea medusa) bằng elicitor thực vật là SA, kết quả thu được jaceosidin

(95 mg/L) cao gấp 2,5 lần và siringin (631 mg/L) cao gấp 2,7 lần so với mẫu không

bổ sung SA [110]. Dong và cs (2010) nghiên c u vai trò của SA đến sự t ch lũy của

phenolic acid và tăng hoạt động các enzyme chống oxy hóa trong nuôi cấy tế bào của

Salvia miltiorrhiza. Phenolic acid gồm có hai thành phần salvianolic acid B và caffeic

acid. Khi bổ sung 6,25 mg/L SA vào môi trư ng nuôi cấy sau 8 gi , hàm lượng

76

salvianolic acid B và caffeic acid thu được cao nhất, gấp 2 lần so với mẫu không bổ

sung SA [43].

Đối với SA, việc xử lý elicitor ở nồng độ trung bình 100-150 µM SA thư ng

mang lại kết quả tốt. Trên tế bào rau má, Loc và cs (2012) nhận thấy 100 µM SA

cho hiệu quả cảm ng tốt nhất, hàm lượng asiaticoside tăng lên 5 lần so với tế bào

không xử lý elicitor, trong khi đó xử lý 4 g/l YE gi p hàm lượng asiaticoside tăng

lên 3,5 lần [54]. Wang và cs (2004) đã nghiên c u sử dụng SA vào sản xuất taxol

trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây Taxus chinensis var. mairei. Kết quả cho thấy

khi bổ sung SA ở nồng độ 145 µM, taxol được t ch lũy tối đa là 0,119 µM [104].

Một số công trình nghiên c u sử dụng nồng độ SA cảm ng thấp hơn nghiên

c u của ch ng tôi nhưng cũng thu được hiệu quả rất cao. Yousefzadi và cs (2010)

sử dụng SA để tăng cư ng tích lũy podophyllotoxin trong nuôi cấy tế bào của

Linum album. Khi bổ sung 10 µM SA vào ngày th ba của mẫu nuôi cấy, hàm

lượng podophyllotoxin thu được 333 µg/g khối lượng khô, cao gấp ba lần so với tế

bào nuôi cấy trên môi trư ng không bổ sung SA [108]. Rezaei và cs (2011) đã

nghiên c u sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào của T. baccata bằng elicitor SA

kết hợp với sóng siêu âm. Mẫu nuôi cấy được bổ sung SA các nồng độ 25-50 mg/L,

kết hợp với sóng siêu âm có tần số 40 kHz trong th i gian hai ph t. Hàm lượng

taxol thu được ở tế bào nuôi cấy trên môi trư ng có bổ sung 50 mg/L kết hợp xử lý

sóng siêu âm có tần số 40 KHz cao gấp 8 lần so với mẫu không bổ sung SA và xử

lý sóng siêu âm [85].

4.4.2. ưởng c a thời gian x lý salicylic acid

Tương tự với khi xử lý MeJA, th i gian xử lý bằng SA càng dài thì càng ảnh

hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào cây cà gai leo. Th i gian cảm ng ngắn (7

ngày) ít ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào. Tế bào đối ch ng có th i gian cảm

ng dài nhất, do đó sinh khối chỉ được 7,61 g tươi và 0,68 g khô.

Ảnh hưởng của th i gian xử lý SA lên khả năng tổng hợp solasodine cũng

tương tự như đối với MeJA và YE, th i gian cảm ng càng dài khả năng t ch lũy

solasodine càng cao. Kết quả khảo sát cho thấy xử lý 150 μM SA vào th i điểm 7-

77

21 ngày sau khi nuôi cấy không đủ th i gian cảm ng để tế bào có thể sản xuất một

lượng solasodine cao. Xử lý SA ngay từ lúc bắt đầu nuôi cấy vẫn cho kết quả tốt

nhất, cao hơn các trư ng hợp khác từ 2-3 lần.

4.5. NG PH I H P CÁC ELICITOR

Nhìn chung, xử lý kết hợp các elicitor ở các nồng độ khác nhau ở nghiên c u

này đều có tác dụng tăng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo so với đối

ch ng. Công th c kết hợp tốt nhất cho lượng solasodine cao hơn khoảng 1,6 lần so

với tế bào không được xử lý và khoảng 8,4 lần so với rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi.

Tuy nhiên, xử lý kết hợp chỉ cao hơn chỉ xử lý với 50 μM MeJA, và thấp hơn xử lý

riêng rẽ với 3 g/L YE hay 150 μM SA.

Bên cạnh việc sử dụng riêng lẻ các loại elicitor sinh học và phi sinh học, rất

nhiều công trình nghiên c u đã sử dụng kết hợp các elicitor để mang lại hiệu quả

cao hơn. Khosroushahi và cs (2006) đã cải thiện sản xuất taxol bằng cách kết hợp

các yếu tố cảm ng trong nuôi cấy huyền phù tế bào Taxus baccata. Kết quả là tế

bào được xử lý MeJA (10 mg/L), SA (100 mg/L) và YE (25 mg/L) đã sản xuất hàm

lượng taxol cao nhất (39,5 mg/L) gấp 16 lần so với nuôi cấy trên môi trư ng đối

ch ng B5 (2,45 mg/L) [51]. Xu và cs (2007) sử dụng elicitor để tăng cư ng sản

xuất syringin trong nuôi cấy huyền phù tế bào của sen tuyết (Saussurea medusa).

Nhóm tác giả sử dụng 3 elicitor: YE 1,5%, chitosan 0,2 mg/L và Ag2SO4 75 µM và

thu được hiệu quả cao nhất đạt 741,9 mg/L, gấp 3,6 lần so với đối ch ng [106].

Cho và cs (2007) đã nghiên c u ảnh hưởng MeJA và SA lên sự tạo thành

benzophenanthridine alkaloid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Eschscholtzia

californica. Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,5 mg MeJA và 0,02 mg SA khối lượng

tế bào tươi sau 7 ngày nuôi cấy th hàm lượng sanguinarine cao hơn 10 lần so với

đối ch ng. Nguyên nhân là do MeJA và SA có thể cảm ng biểu hiện vượt m c

enzyme cầu nối berberin và enzyme 3-hydroxy-(S)-N-methylcoclaurine-4-O-

methyltransferase, đ y là hai loại enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

benzophenanthridine alkaloid [38]. Roat và cs (2009) sử dụng các elicitor tổng hợp

stilbene trong nuôi cấy huyền phù tế bào của cây giây dác (Cayratia trifolia). Nhóm

78

tác giả thu được hiệu suất cao nhất ở nồng độ SA 500 µM , MeJA 100 µM, ethrel

500 µM, và YE 500 µM, bổ sung sau 7 ngày nuôi cấy, hàm lượng stilbene tăng 3-6

lần ở ngày th 15 của quá trình nuôi cấy [87].

Trên đối tượng sen tuyết (Saussurea medusa), Xu và cs (2006) đã sử dụng 3

elicitor khác nhau và thu được kết quả tốt nhất ở nồng độ YE 1,5%, chitosan 0,2

mg/L và Ag2SO4 75 µM. Hàm lượng syringin cao nhất đạt 741,9 mg/L, gấp 3,6 lần

so với đối ch ng [106]. Khosroushahi và cs (2006) đã cải thiện khả năng sản xuất

taxol bằng cách kết hợp các yếu tố cảm ng trong nuôi cấy huyền phù tế bào thanh

tùng (Taxus baccata). Kết quả cho thấy tế bào được xử lý MeJA 10 mg/L, SA 100

mg/L và nấm 25 mg/L cho hàm lượng taxol cao nhất (39,5 mg/L), gấp 16 lần so với

nuôi cấy trên môi trư ng đối ch ng B5 (2,45 mg/L) [51].

Không giống như nghiên c u của chúng tôi, các công trình nghiên c u đã

công bố trước đ y cho thấy việc phối hợp cùng lúc nhiều elicitor sẽ cho hiệu quả

cao hơn việc sử dụng elicitor riêng lẽ. Cho và cs (2007) đã nghiên c u vai trò của

các elicitor MeJA và SA lên sự tích lũy benzophenanthridine alkaloid trong nuôi

cấy tế bào của Eschscholtzia californica. Kết quả thu được khi bổ sung MeJA (0,5

mg/g khối lượng tươi tế bào) hàm lượng benzophenanthridine alkaloid cao gấp 1,7

lần so với đối ch ng không bổ sung elicitor. Tế bào nuôi cấy trên môi trư ng có bổ

sung SA (0,02 mg/g khối lượng tươi tế bào) thu được hàm lượng

benzophenanthridine alkaloid cao gấp 1,6 lần so với đối ch ng. Tế bào nuôi cấy

trên môi trư ng có bổ sung phối hợp 0,5 mg/g MeJA + 0,02 mg/g SA hàm lượng

benzophenanthridine alkaloid cao gấp 10 lần so với tế bào nuôi cấy không bổ sung

các elicitor [38].

Artemisinin là chất thư ng được sử dụng để sản xuất thuốc chống sốt rét ở

châu Á và ch u Phi, Ahlawat và cs (2014) đã tạo ra hệ thống nuôi cấy rễ tơ c y

Artemisia annua L. để sản xuất chất này. Các tác giả bổ sung các elicitor như

MeJA, dịch chiết nấm (Alternaria alternate, Curvularia limata, Fusarium solani, và

Piriformospora indica), farnesyl pyrophosphate và miconazole vào quá trình nuôi

cấy. Kết quả bổ sung riêng rẽ các elicitor cho thấy hiệu quả cao nhất thu được khi

bổ sung dịch chiết P. indica, hàm lượng artemisinin cao gấp 1,97 lần so với đối

79

ch ng. Khi kết hợp bổ sung đồng th i MeJA và P. indica, hàm lượng artemisinin

tăng lên 2,44 lần so với đối ch ng [20].

Tương tự như xử lý riêng rẽ MeJA, YE và SA, xử lý kết hợp các elicitor

cũng cho thấy th i điểm bổ sung thích hợp nhất là lúc bắt đầu nuôi cấy, hay nói

cách khác th i gian cảm ng dài (4 tuần) có hiệu quả nhất. Sinh trưởng của tế bào

và lượng solasodine đều cao hơn so với các th i điểm cảm ng khác (7-21 ngày sau

khi nuôi cấy) tương ng với th i gian cảm ng là 21-7 ngày. So với kết quả nghiên

c u ở tế bào của phần lớn các loài thực vật khác mà chúng tôi sẽ đề cập trong phần

bàn luận, tế bào cà gai leo đòi hỏi th i gian cảm ng dài ngày hơn.

4.6. SO SÁNH HI U QU GIỮA CÁC ELICITOR

Các nghiên c u đã công bố trước đ y cho thấy mỗi elicitor cho hiệu quả cải

thiện hiệu suất của các HCTC khác nhau đối với từng loài thực vật. Vì vậy, việc lựa

chọn elicitor phù hợp với mỗi đối tượng nghiên c u là rất quan trọng. Chẳng hạn

MeJA tăng cư ng tích lũy azadirachtin trong nuôi cấy tế bào Azadirachta indica tốt

hơn các elicitor khác như SA, pectinase, pectolyase, AgNO3, CuSO4 và dịch chiết

nấm [81].

Trong nghiên c u này, cả 3 elicitor đều làm tăng khả năng sinh tổng hợp

solasodine trong tế bào c y cà gai leo, trong đó SA có vai trò cao nhất, tiếp đến là

YE và cuối cùng là MeJA, ảnh hưởng của các chất này lên sự phát triển của sinh

khối cũng tương tự.

SA là elicitor phi sinh học có giá thành rẻ, dễ dùng nên được nhiều tác giả sử

dụng, nhiều công trình nghiên c u cũng cho thấy SA có hiệu quả cao nhất trong

cảm ng tổng hợp các HCTC ở thực vật. Roat và cs (2005) đã nghiên c u ảnh

hưởng của các elicitor (MeJA, SA, Ethrel và YE) lên sự t ch lũy của stilbenes trong

nuôi cấy tế bào của Cayratia trifolia (L) Domin cho hiệu quả gấp 3-6 lần so với

mẫu không được bổ sung các elicitor đó. Trong đó, hiệu quả tác dụng của elicitor

đối với khả năng t ch lũy stillbenes giảm từ SA-MeJA-Ethrel-YE [87].

Ajungla và cs (2008) đã nghiên c u ảnh hưởng của các elicitor sinh học và

phi sinh học lên sự t ch lũy của hyoscyamine và scopolamine trong nuôi cấy rễ cây

80

cà độc dược (Datura metel). Ở công th c xử lý SA 500 µM, hàm lượng

hyoscyamine và scopolamine t ch lũy cực đại, tương ng là 4,35 mg/g và 0,28

mg/g khối lượng khô. Ở công th c xử lý YE 0,75 g/L, hàm lượng hyoscyamine và

scopolamine tương ng là 3,17 mg/g và 0,16 mg/g khối lượng khô. Ở công th c xử

lý AlCl3 250 µM, hyoscyamine đạt 2,49 mg/g khối lượng khô và scopolamine đạt

0,11 mg/g khối lượng khô, trong khi đó hàm lượng hyoscyamine và scopolamine

trong nuôi cấy rễ tế bào đối ch ng là 1,39 mg/g và 0,069 mg/g khối lượng khô [22].

Pise và cs (2013) đã nghiên c u ảnh hưởng của các elicitor đến khả năng sản

xuất shatavarin từ nuôi cấy tế bào Asparagus racemosus. Các elicitor được sử dụng

gồm elicitor sinh học (Fusarium oxysporium và Rhizopus stolonifer) và elicitor phi

sinh học (UV và SA), được xử lý ở hai th i điểm: ban đầu và ngày th 13 của quá

trình nuôi cấy. Hàm lượng shatavarin đạt cao nhất 14,44 mg/g (sau 20 ngày) và

22,48 mg/g khối lượng khô (sau 25 ngày) lần lượt với hai tác nhân elicitor là

Fusarium và Rhizopus. Trong khi đó, khi bổ sung tại th i điểm ban đầu, các elicitor

phi sinh học làm tăng lượng shatavarin cao hơn so với sử dụng elicitor sinh học. Cụ

thể, 200 µM SA gi p đạt hàm lượng shatavarin 22,32 mg/g và chiếu UV trong 5

ph t thu được 24,77 mg/g shatavarin sau 25 ngày nuôi cấy [75].

Trên đối tượng bảy lá một hoa, Raomai và cs (2014) đã sử dụng nhiều elicitor

khác nhau (chitosan, SA và YE) để bổ sung vào môi trư ng nuôi cấy lỏng thân rễ

mini, kết quả thu được cho thấy hiệu quả cao nhất khi xử lý 50 mg/L SA, hàm

lượng saponin tăng lên 3,6 lần so với củ tự nhiên [84].

Bên cạnh đó, một số công trình nghiên c u cho thấy xử lý MeJA lại có hiệu

quả cao nhất. Ogata và cs (2004), sử dụng các elicitor YE, MeJA tăng cư ng tích

lũy rosmarinic acid trong nuôi cấy tế bào của Lithospermum erythrorhizon. Ở mẫu

tế bào nuôi cấy có bổ sung elicitor YE, hàm lượng rosmarinic acid thu được cao

nhất sau 48 h nuôi cấy, gấp 4 lần so với mẫu không bổ sung YE. Mẫu có bổ sung

MeJA, hàm lượng rosmarinic acid thu được cao nhất sau 48 h nuôi cấy, gấp 10 lần

so với mẫu không bổ sung YE [71]. Wang và cs (2004) đã nghiên c u sử dụng

MeJA và SA vào sản xuất taxol trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây Taxus

chinensis var. mairei. Kết quả cho thấy khi bổ sung MeJA ở nồng độ 100 µM taxol

81

được t ch lũy tối đa là 0,143 µM [104]. Sanschez và cs (2005) đã nghiên c u sự tích

lũy silymarin trong nuôi cấy tế bào của cây cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn)

bằng elicitor thực vật là YE và MeJA. Hiệu quả thu được đối với mẫu có bổ sung

MeJA là cao gấp 10 lần, và YE là cao gấp 2 lần so với mẫu không bổ sung MeJA và

YE [91].

Ở chiều ngược lại, một số công trình nghiên c u lại cho rằng cảm ng bằng

các tác nhân sinh học tốt hơn các tác nh n phi sinh học. Goyal và cs (2008) tăng

cư ng t ch lũy isoflavonoid trong nuôi cấy tế bào của Pueraria tuberose có bổ sung

các elicitor YE, MeJA và SA. Hàm lượng isoflavonoid thu được ở mẫu có bổ sung

200 µg/L YE đạt cao nhất gấp 12,4 lần so với mẫu không bổ sung YE. Trong khi

các mẫu có bổ sung SA ho c MeJA, hàm lượng isoflavonoid thấp hơn mẫu bổ sung

YE nhưng vẫn cao hơn mẫu đối ch ng từ 9,53-10,1 lần [45].

82

K T LU Ề NGHỊ

K T LU N

1. Sự sinh trưởng và t ch lũy solasodine trong tế bào huyền phù cà gai leo đạt cao

nhất sau 4 tuần nuôi cấy, sinh khối tươi đạt 4,98 g/bình, sinh khối khô đạt 0,45

g/b nh và hàm lượng solasodine đạt 123,5 mg/g khối lượng khô, cao hơn trong rễ tự

nhiên khoảng 5,3 lần.

2. Ảnh hưởng của các elicitor đến khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào in vitro

của cây cà gai leo:

2.1. Hàm lượng solasodine t ch lũy cao nhất khi tế bào cà gai leo được xử lý

150 µM salicylic acid ở th i điểm bắt đầu nuôi cấy (245 mg/g khối lượng khô).

2.2. Khi bổ sung các elicitor riêng lẽ hay phối hợp, solasodine tăng dần từ

tuần th 2-3, đạt cực đại ở tuần th 4 và sau đó giảm dần từ tuần 5-7.

3. Solasodine từ tế bào huyền phù cà gai leo có khả năng kháng viêm, thể hiện qua

khả năng c chế collagenase của chúng.

4. Đề xuất quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế bào của

cây cà gai leo có xử lý 150 µM salicylic acid từ nguồn cây tự nhiên.

Ề NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên c u cải thiện sản xuất solasodine từ tế bào cà gai leo trong hệ lên

men bioreactor.

2. Tiếp tục nghiên c u cơ chế tác động của elicitor đến con đư ng chuyển hóa

solasodine trong tế bào cà gai leo.

83

DANH M C C C C Ì Ã C

1. Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Le Thi Minh Khuyen, Ton Nu

Thuy An (2014). Effects of yeast extract and methyl jasmonate on the enhancement

of solasodine biosynthesis in cell cultures of Solanum hainanense Hance. J. BioSci.

Biotech. 2014, 3(1): 1-6.

2. Nguy n H u Thuần Anh, Tôn Nữ Thùy An, Lê Thị Hà Thanh, Võ Thị Viên

Dung, Nguyễn Thuần Nho, Đinh Hồng Kim Cương, Nguyễn Ngọc Hiếu, Nguyễn

Thanh Giang, Nguyễn Hoàng Lộc (2015). Nghiên c u ảnh hưởng của methyl

jasmonate và dịch chiết nấm men lên sinh trưởng và t ch lũy solasodine của tế bào

cà gai leo (Solanum hainanense Hance). Tạp chí Công nghệ sinh học 13(2A): 513-

519.

3. Nguyen Huu Thuan Anh, Ton Nu Thuy An, Nguyen Thuan Nho, Vo Thi Vien

Dung, Nguyen Hoang Loc (2016). Effect of salicylic acid on the biosynthesis of

solasodine in cell suspension culture of Solanum hainanense Hance. Plant Cell

Biotechnology and Molecular Biology 17(1-2): 14-20.

84

TÀI LI U THAM KH O

Ti ng Việt

1. Nguyễn Hữu Thuần Anh, Lê Thị Hà Thanh, Đoàn Hữu Nhật B nh, Trương Thị

B ch Phượng, Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Nghiên c u khả năng t ch lũy

glycoalkaloid ở callus của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance), Những vấn

đề nghiên cứ cơ bản trong Khoa học sự sống, tr. 229-232.

2. Vũ Văn Hợp, Vũ Xu n Phương (2003), Các loài ch a alkaloid trong họ Cà

(Solanaceae Juss.) ở Việt Nam, T p chí Sinh học, 24,(4), tr. 27-31.

3. Nguyễn Thị Minh Khai, Phạm Kim Mãn, Nguyễn B ch Thu, Vũ Kim Thu, Phạm

Thanh Trúc, Lã Kim Oanh, Nguyễn Văn Mùi, Trịnh Thị Xuân Hòa, Nguyễn Anh

Tuấn, Mão NĐ (2001), Nghiên c u điều chế thuốc Haina điều trị viêm gan B mạn

hoạt động từ cà gai leo, T p chí Dược liệu, 6,(2+3), tr. 68-71.

4. Huỳnh Văn Kiệt, Cao Đăng Nguyên, Nguyễn Hoàng Lộc (2005), Ảnh hưởng của

một số chất k ch th ch sinh trưởng lên tái sinh in vitro cây cà gai leo (Solanum

hainanense Hance), Những vấn đề nghiên cứ cơ bản trong Khoa học sự sống NXB

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 602-605.

5. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006), Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng

trưởng thực vật và đư ng saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn

(Catharanthus roseus), T p chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 9, tr. 59-66.

6. Nguyễn Hoàng Lộc, Đoàn Hữu Nhật B nh, Phan Đ c Lâm, Phan Thị Á Kim,

Trương Thị B ch Phượng (2008), Nghiên c u khả năng t ch lũy asiaticoside trong

mô sẹo rau má (Centella asiatica L. Urban), T p chí Công nghệ Sinh học, 6,(4B), tr.

873-881.

7. Nguyễn Hoàng Lộc (2011), Nuôi cấy mô và tế bào thực vật-Các khái niệm và

ứng d ng, NXB Đại học Huế.

8. Nguyễn Hoàng Lộc (2013), Sản xuất một số hợp chấ dược phẩm bằng nuôi cấy

tế bào thực vật và cây trồng chuyển gen, NXB Đại học Huế.

9. Phạm Kim Mãn, Nguyễn Bích Thu, Trần Văn Hanh (1999), Tác dụng chống ung

thư của cà gai leo, Thông báo T p chí Dược liệu, 3,(4), tr. 126.

85

10. Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), Đ nh gi đ d ng di truyền một số loài cây

dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã

v ch, Trư ng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

11. Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Hoàng Thị Thu, Bùi Văn Lệ

(2010), Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào c y bèo đất Drosera burmanni

Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone, T p chí Phát triển Khoa học và Công nghệ,

13,(T2), tr. 53-60.

12. Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Võ Thị Bích Thủy, Bùi Văn

Lệ (2010), Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng quinone trong cây Drosera burmanni

Vahl in vitro bằng phương pháp sử dụng tác nhân cảm ng (elicitor), T p chí Công

nghệ Sinh học, 8,(3B), tr. 1439-1444.

13. Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Lê Phi Yến, Nguyễn Kim

Phi Phụng, Bùi Văn Lệ (2011), Sàng lọc và thu nhận hợp chất có hoạt tính kháng

oxy hóa từ dịch chiết cây Drocera indica L. nuôi cấy in vitro, T p chí Phát triển

Khoa học và Công nghệ, 14,(T3), tr. 30-36.

14. Nguyễn Bích Thu, Nguyễn Minh Khai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu (2000),

Nghiên c u tác dụng của cà gai leo (Solanum hainanense Hance) trên collagenase,

T p chí Dược liệu, 5,(5), tr. 149-152.

15. Nguyễn Bích Thu, Phạm Kim Mãn (2000), Nghiên c u phương pháp định lượng

glycoalkaloid trong Solanum hainanense Hance bằng phương pháp acid màu, T p

chí Dược liệu, 5,(4), tr. 104-108.

16. Nguyễn Bích Thu, Nguyễn Thị Quỳ, Do Young Yoon, Phạm Kim Mãn, Đoàn

Thị Nhu (2001), Bước đầu nghiên c u tác dụng c chế của cà gai leo đối với gen

g y ung thư của virus, T p chí Dược liệu, 6,(4), tr. 118-121.

17. Lê Thị Thủy Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đ c Lượng (2010), Khảo sát vài

yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp taxol của các hệ thống tế bào Taxus

wallichiana Zucc. in vitro, T p chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 13,(T3), tr.

67-77.

18. Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội.

86

19. Vũ Văn Vụ Sinh lý thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội.

Ti ng Anh

20. Ahlawat S, Saxena P, Alam P, Wajid S, Abdin MZ (2014), Modulation of

artemisinin biosynthesis by elicitors, inhibitor, and precursor in hairy root cultures

of Artemisia annua L, Journal of Plant Interactions, 9,(1), pp. 811-824.

21. Ahmed SA, Baig MMV (2014), Biotic elicitor enhanced production of psoralen

in suspension cultures of Psoralea corylifolia L, Saudi Journal of Biological

Sciences, 21,(5), pp. 499-504.

22. Ajungla L, Patil PP, Barmuhk RB, Nikam TD (2009), Influence of biotic and

abiotic elicitors on accumulation of hyoscyamine and scopolamine in root cultures

of Datura metel L., Indian Journal of Biotechnology, 8, pp. 317-322.

23. Alvarez MA, Nigra HM, Giulietti AM (1993), Solasodine production by

Solanum eleagnifolium Cav. in vitro cultures: Influence of plant growth regulators,

age and inoculum size. Large-scale production., Natural Product Letters, 3,(1), pp.

9-19.

24. Alvarez MA, Talou JR, Paniego NB, Giulietti AM (1994), Solasodine

production in transformed organ cultures (roots and shoots) of Solanum

eleagnifolium Cav., Biotechnology Letters, 16,(4), pp. 393-396.

25. Angelova Z, Georgiev S, Roos W (2006), Elicitation of Plants, Biotechnology &

Biotechnological Equipment, 20,(2), pp. 72-83.

26. Azeez THA, Ibrahim KM (2013), Effect of biotic elicitors on secondary

metabolite production in cell suspensions of Hypericum triquetrifolium, Bulletin

UASVM Horti, 70,(1), pp. 26-33.

27. Bernhoft A (2010), A brief review on bioactive compounds in plants, Bioactive

compounds in plant - benefits and risk for man and animals, pp. 11-17.

28. Bhat MA, Ahmad S, Aslam J, Mujib A, Mahmooduzzfar (2008), Slinity Stress

Enhances Production of Solasodine in Solanum nigrum L., Chemical and

Pharmaceutical Bullentin, 56,(1), pp. 17-21.

87

29. Bhat MA, Mujib A, Junaid A, Mahmooduzzfar (2010), In vitro regeneration of

Solanum nigrum with enhanced solasodine production, Biologia Plantarum, 54,(4),

pp. 757-760.

30. Bhatnagar P, Bhatnagar M, Nath AK, Sharma DR (2004), Production of

solasodine by Solanum laciniatum using plant tissue culture technique, Indian

Journal of Experimental Biology, 42, pp. 1020-1023.

31. Bonfill M, Mangas S, Moyano E, Cusido R, Palazón J (2011), Production of

centellosides and phytosterols in cell suspension cultures of Centella asiatica, Plant

Cell Tiss Organ Cult, 104,(1), pp. 61-67.

32. Bota C, Deliu C (2012), Effect of some biotic elicitors on flavonoids production

in Digitalis lanata cell cultures, Revista medico-chirurgicala a Societatii de Medici

si Naturalisti din Iasi, 116,(2), pp. 624-629.

33. Bulgakov VP, Tchernoded GK, Mischenko NP, Khodakovskaya MV, Glazunov

VP, Radchenko SV, Zvereva EV, Fedoreyev SA, Zhuravlev YN (2002), Effect of

salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone

production by Rubia cordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC

genes, Journal of Biolotechnology, 97, pp. 213-221.

34. Byun SY, Kim C, Pederson H (1992), Elicitation of Alkaloid Production at

different growth stages in Cell suspensions of of Eschscholtizia californica, Plant

Tissue Culture Letter, 9,(3), pp. 164-168.

35. Cham BE (1994), Solasodine glycosides as anti-cancer agents: Preclinical and

clinical studies, Asian Pacific Journal of Pharmacology, 9, pp. 113-118.

36. Cham BE (2008), Cancer Intralesion Chemotherapy with Solasodine Rhamnosyl

Glycosides, Research Journal Biology Science, 3,(9), pp. 1008-1017.

37. Cheong J-J, Choi YD (2003), Methyl jasmonate as a vital substance in plants.,

TRENDS in Genetic, 19,(7), pp. 409-413.

38. Cho HY, Lee P, Carolyn WT, Yoon SY, Rhee HS, Park JM (2007), Enhanced

benzophenanthridine alkaloid production and protein expression with combined

elicitor in Eschscholtzia californica suspension cultures, Biotechnology Letter,

29,(12), pp. 2001-2005.

88

39. Chong TM, Abdullah MA, Lai OM, NorAini FM, Laijs NH (2005), Effective

elicitation factors in Morinda elliptica cell suspension culture, Process

Biochemistry, 40,(11), pp. 3397-3405.

40. Cousins MM, Adelberg J, Chen F, Rieck J (2010), Secondary metabolism-

inducing treatments during in vitro development of turmeric (Curcuma longa L.)

rhizomes, Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, 15,(4), pp. 303-317.

41. Devi BP, Vimala A, Sai I, Chandra S (2008), Effect of Cyanobacterial Elicitor

on Neem Cell Suspension Cultures, Indian Journal of Science and Technology,

1,(7), pp. 1-5.

42. Dicosmo F, Misawa M (1995), Plant cell and tissue culture: Alternatives for

metabolite production, Biotechnology Advance, 13,(3), pp. 425-453.

43. Dong J, Wan G, Liang Z (2010), Accumulation of salicylic acid-induced

phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative

enzymes in Salvia miltiorrhiza cell culture, Journal of Biotechnology, 148,(2-3), pp.

99-104.

44. Frankfater CR, Dowd MK, Triplett BA (2009), Effect of elicitors on the

production of gossypol and methylated gossypol in cotton hairy roots, Plant Cell

Tissue Organism Culture, 98, pp. 341-349.

45. Goyal S, Ramawat KG (2008), Increased isoflavonoids accumulation in cell

suspension cultures of Pueraria tuberosa by elicitors, Indian Journal of

Biotechnology, 7,(3), pp. 378-382.

46. Hakkim FL, Kalyani S, Essa M, Girija S, Song H (2011), Production of

rosmarinic in Ocimum sanctum cell cultures by the influence of sucrose,

phenylalanine, yeast extract, and methyl jasmonate, International Journal of

Biological and Medical Research, 2,(4), pp. 1070-1074.

47. Hamza MA (2013), Effect of yeast extract (biotic elicitor) and incubation

periods on selection of Lupinus termis explant in vitro, Journal of Applied Sciences

Research, 9,(7), pp. 4186-4192.

89

48. Jain A, Singh S (2015), Effect of growth regulators and elicitors for the

enhanced production of solasodine in hairy root culture of Solanum melongena (L.),

Journal of Indian Botanical Society, 94,(1-2), pp. 23-39.

49. Jiao J, Gai Q-Y, Fu Y-J, Ma W, Peng X, Tan S-N, Efferth T (2014), Efficient

Production of Isoflavonoids by Astragalus membranaceus Hairy Root Cultures and

Evaluation of Antioxidant Activities of Extracts, Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 62,(52), pp. 12649-12658.

50. Keng CL, Wei AS, Bhatt A (2010), Elicitation effect on cell biomass and

production of alkaloids in cell suspension culture of the tropical tree Eurycoma

longifolia, Research Journal of the Costa Rican Distance Education University,

2,(2), pp. 239-244.

51. Khosroushahi YA, Valizadeh M, Ghasempour M, Khorowshahli M, Naghdibadi

H, Dadpour MR, Omidi Y (2006), Improved Taxol production by combination of

inducing factors in suspension cell culture of Taxus baccata, Cell biology

International, 30, pp. 262-269.

52. Kittipongpatana N, Hock RS, Porter JR (1998), Production of solasodine by

hairy root, callus, and cell suspension cultures of Solanum aviculare Forst., Plant

Cell, Tissue and Organ Culture, 52, pp. 133-143.

53. Li P, Mao Z, Lou J, Li Y, Mou Y, Lu S, Peng Y, Zhou L (2011), Enhancement

of diosgenin production in Dioscorea zingiberensis cell cultures by oligosaccharides

from its endophytic fungus Fusarium oxysporum Dzf17, Molecules, 16,(12), pp.

10631-10644.

54. Loc N, Giang N (2012), Effects of elicitors on the enhancement of asiaticoside

biosynthesis in cell cultures of centella (Centella asiatica L. Urban), Chemical

Papers, 66,(7), pp. 642-648.

55. Loc NH, An TTT (2010), Asiaticoside production from cell culture of centella

(Centella asiatica L. Urban), Biotechnol Bioprocess Engineering, pp. 1065-1070.

56. Loc NH, Anh NHT, Binh DHN, Yang M-s, Kim T-g (2010), Production of

glycoalkaloids from callus cultures of Solanum hainanense Hance, Journal of Plant

Biotechnology, 37, pp. 96-101.

90

57. Loc NH, Giang NT (2012), Effects of elicitors on the enhancement of

asiaticoside biosynthesis in cell cultures of centella (Centella asiatica L. Urban),

Chemical Papers, 66,(7), pp. 642-648.

58. Loc NH, Kiet HV (2011), Micropropagation of Solanum hainanense Hance

Annals of Biological Research, 2,(2), pp. 394-398.

59. Loc NH, Thanh LTH (2011), Solasodine production from cell culture of

Solanum hainanense Hance, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16,(3), pp.

581-586.

60. Lu MB, Wong HL, Teng WL (2001), Effects of elicitation on the production of

saponin in cell culture of Panax ginseng, Plant Cell Report, 20, pp. 674-677.

61. Mann JD (1979), Production of Solasodine for the Pharmaceutical industry,

Academic Press, Inc.

62. Mathew R, Sankar P (2012), Effect of methyl jasmonate and chitosan on growth

characteristics of Ocimum basilicum L., Ocimum sanctum L. and Ocimum

gratissimum L. cell suspension cultures, African Journal of Biotechnology, 11,(21),

pp. 4759-4766.

63. Misawa M (1994), Plant tissue culture: An alternative for production of useful

metabolite, FAO Agricultural services bulletin, 108, pp.

64. Mulabagal V, Tsay H (2004), Plant cell cultures - an alternative and efficient

soucre for the production of biologycally important secondary metabolites,

International Journal of Applied Science and Engineering, 2, pp. 29-48.

65. Namdeo AG (2007), Plant Cell Elicitation for Production of Secondary

Metabolites: A Review, Pharmacognosy Reviews, 1,(1), pp. 69-79.

66. Neuman KH, Kumar A, Imani J (2009), Plant Cell and Tissue Culture-A Tool in

Biotechnology, Springer Verfag Berlin Heidelberg.

67. Nigra HM, Alvarez MA, Giulietti AM (1989), The influence of auxins, light and

cell differentiation on solasodine production by Solanum eleagnifolium Cav. calli,

Plant Cell Reports, 8, pp. 230-233.

91

68. Nigra HM, Alvarez MA, Giulietti AM (1990), Effect of carbon and nitrogen

source on growth and solasodine production in batch suspension cultures of

Solanum eleagnifolium Cav., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 21, pp. 55-60.

69. Nigra HM, Caso OH, Giulietti AM (1987), Production of solasodine by calli

from different parts of Solanum eleagnifolium Cav. plants, Plant Cell Reports, 6,

pp. 135-137.

70. Nopo-Olazabal C, Condori J, Nopo-Olazabal L, Medina-Bolivar F (2014),

Differential induction of antioxidant stilbenoids in hairy roots of Vitis rotundifolia

treated with methyl jasmonate and hydrogen peroxide, Plant Physiology and

Biochemistry, 74, pp. 50-69.

71. Ogata A, Tsuruga A, Matsuno M, Mizukami H (2004), Elicitor-induced

rosmarinic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorhizon cell suspension

cultures: activities of rosmarinic acid synthase and the final two cytochrome P450-

catalyzed hydroxylations, Plant Biotechonology, 21,(5), pp. 393-396.

72. Parsons J, Marconi P, Giulietti AM, Alvarez MA (2001), Solasodine production

by protoplasts derived from Solanum eleagnifolium Cav. cell suspension cultures,

International Journal of Experimental Botany, pp. 159-163.

73. Pereira PS, Ticli FK, Franca SC, Breves CMS, Lourenco MV (2007), Enhanced

triterpene production in Tabernaemontana catharinensis cell suspension cultures in

response to biotic elicitors, Quim Nova, 30,(8), pp. 1849-1852.

74. Pirian K, Piri K (2013), Influence of yeast extract as a biotic elicitor on

noradrenaline production in hairy root culture of Portulaca oleracea L.,

International Journal of Plant Production, 4,(11), pp. 2960-2964.

75. Pise M, Rudra J, Begde D, Bundale S, Nashikkar N, Upadhyay A (2013),

Elicitor induced production of shatavarín in the cell cultures of Asparagus

recemosus, Indian Journal of Plant Sciences, 2,(2), pp. 100-106.

76. Pitta-Alvarez SI, Spollansky TC, Guilietti AM (2000), The influence of

different biotic and abiotic elicitors on the production and profile of tropane

alkaloids in hairy root cultures of Brugmansia candida, Enzyme and Microbial

Technology, 26, pp. 252-258.

92

77. Prakash G, Srivastava AK (2008), Statistical elicitor optimization studies for the

enhancement of azadirachtin production in bioreactor Azadirachta indica cell

cultivation, Biochemical Engineering Journal, 40, pp. 218-226.

78. Quadri LEN, Giulietti AM (1993), Effect of elicitation on the accumulation of

solasodine by immobilized cells of Solanum eleagnifolium Cav., Enzyme and

Microbial Technology, 15, pp. 1074-1077.

79. Ramawat K, Merillon J (2004), Biotechnology Secondary Metabolites, Science

Publishers, UK.

80. Ramawat KG, Goyal S (2008), Increased isoflavonoids accumulation in cell

suspension cultures of Pueraria tuberosa by elicitors, Indian Journal of

Biotechnology, 7, pp. 378-382.

81. Ramawat KG, Merillon JM (2008), Bioactive Molecules and Medicinal Plants,

Springer.

82. Rao B, Kumar V, Amrutha N, Jalaja N, Vaidyanath K, Rao A, Polavarap S,

Kishor P (2008), Effect of growth regulators, carbon source and cell aggregate size

on berberine production from cell cultures of Tinospora cordifolia Miers, Current

Trends in Biotechnology and Pharmacy, 2,(2), pp. 269-276.

83. Rao SR, Ravishanka GA (2002), Plant cell culture: chemical factories of

secondary metabolites, Biotechnology Advance, 20, pp. 101-153.

84. Raomai S, Kumaria S, Tandon P (2014), Plant regeneration through direct

somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of the medicinal plant,

Paris polyphylla Sm, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 118,(3), pp. 445-455.

85. Rezaei A, Ghanati F, Dehaghi MA (2011), Stimulation of taxol production by

combined salicylic acid elicitation and sonication in Taxus baccata cell culture,

International Conference on Life Science and Technology, Singapore, 3, pp. 193-

197.

86. Rhee HS, Cho H-Y, Son SY, Yoon HS-Y, J.M. JMP (2010), Enhanced

accumulation of decursin and decursinol angelate in root cultures and intact roots of

Angelica gigas Nakai following elicitation, Plant Cell Tissue Organ Culture, 101,

pp. 295-302.

93

87. Roat C, Ramawat KG (2009), Elicitor-induced accumulation of stilbenes in cell

suspension cultures of Cayratia trifolia (L.) Domin, Plant Biotechnology Report, 3,

pp. 135-138.

88. Roddick JG (1989), The acetylcholinesterase inhibitory activity of steroidal

glycoalkaloids and their aglycones, Phytochemistry, 28, pp. 2631-2634.

89. Roddick JG (1996), Steroidal glycoalkaloids: Nature and consequences of

bioactivity, Advance in Experimental Medicine and Biology, 404, pp. 277-295.

90. Rodríguez-Monroy M, Trejo-Espino JL, Jimenez-Aparicio A, Luz MM,

Villarreal ML, Trejo-Tapia G (2004), Evaluation of morphological properties of

Solanum chrysotrichum cell cultures in a shake flask and fermentor and rheological

properties of broths, Food Technology Biotechnology, 42,(3), pp. 152-158.

91. Sanschez MA, Fernández-Tárago J, Corchete P (2005), Yeast extract and

methyl jasmonate-induced silymarin production in cell cultures of Silybum

marianum (L.) Gaertn, Journal of Biotechnology, 119,(1), pp. 60-69.

92. Sato F, Takeshihta N, Fujiwara H, Katagiri Y, Huan L, Yamada Y (1994),

Characterization of Coptis japonica cells with different alkaloids productivities,

Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 38, pp. 249-256.

93. Sharma M, Sharma A, Ashwani K, Kumar BS (2011), Enhancement of

secondary metabolites in cultured plant cells through stress stimulus, American

Journal of Plant Physiology, 6,(2), pp. 50-71.

94. Sheper T (2001), Advances in biochemical engineering biotechnology - Plant

cells, Springer-Verlag, Berlin Heideberg.

95. Sudha G, Ravishankar GA (2003), Influence of methyl jasmonate and salicylic

acid in the enhancement of capsaicin production in cell suspension cultures of

Capsicum frutescens Mill Current Science, 85,(8), pp. 1212-1217.

96. Sutkovic J, Ler D, Gawwad MRA (2011), In vitro production of solasodine

alkaloid in Solanum nigrum under salinity stress, Journal of Phytology, 3,(1), pp.

43-49.

97. Taguchi G, Yazawa T, Hayashida N, Okazaki M (2001), Molecular cloning and

heterologous expression of novel glucosyltransferases from tobacco cultured cells

94

that have broad substrate specificity and are induced by salicylic acid and auxin,

Journal of Biochemistry, 268, pp. 4086-4094.

98. Thai NP, Trung LV, Hai NK, Huynh L (1998), Protective efficacy of Solanum

hainanense Hance during hepatotoxicity in male mice with prolonged and small

oral doses of trinitrotoluene, Journal of Occupational Health, 40, pp. 276-278.

99. Thanh NT, Murthy HN, Yu KW, Hahn EJ, Peak KY (2005), Methyl jasmonate

elicitation enhanced synthesis of ginsenoside by cell suspension culture of Panax

ginseng in 5L balloon type bubble bioreactor, Apply Microbiology Biotechnology,

67, pp. 197-201.

100. Vaddadi S, Parvatam G (2015), Impacts of biotic and abiotic stress on major

quality attributing metabolites of coffee beans, Journal of Environmental and

Biology, 36,(2), pp. 377-382.

101. Vakil MMA, Mendhulkar VD (2013), Enhanced synthesis of andrographolide

by Aspergillus niger and Penicillium expansum elicitors in cell suspension culture

of Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees, Botanical Studies, 54,(2), pp. 1-8.

102. Veerashree V, Anuradha CM, Vadlapudi K (2012), Elicitor-enhanced

production of gymnemic acid in cell suspension cultures of Gymnema sylvestre R.

Br., Plant Cell Tissue Organism Culture, 108, pp. 27-35.

103. Vijaya SN, Aswani KY, Ravi BB, Phani KY, Vijay VM (2010),

Advancements in the production of secondary metabolites, Journal of Natural

Products, 3, pp. 112-123.

104. Wang YD, Yuan YJ, Wu JC (2004), Induction studies of methyl jasmonate and

salicylic acid on taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis var.

mairei, Biochemical Engineering Journal, 19, pp. 259-265.

105. Weissenberg M (2001), Isolation of solasodine and other steroidal alkaloids

and sapogenis by direct hydrolysis-extraction of Solanum plants or glycosides

therefrom, Phytochemistry, 58, pp. 501-508.

106. Xu C, Zhao B, Ou Y, Wang X, Wang Y (2007), Elicitor-enhanced syringin

production in suspension cultures of Saussurea medusa, World Journal of

Microbiology and Biotechnology, 23, pp. 965-970.

95

107. Yogananth N, Bhakyaraj E, Chanthuru A, Parvathi S, Palanivel S (2009),

Comparative analysis of solasodine from in vitro and in vivo cultures of Solanum

nigrum Linn., Kathmandu University Journal of Science, Enginerring and

Technology, 5,(1), pp. 99-103.

108. Yousefzadi M, Sharifi M, Behmanesh M, Ghasempour A, Moyano E, Palazon

J (2010), Salicylic acid improves podophyllotoxin production in cell cultures of

Linum album by increasing the expression of genes related with its biosynthesis,

Biotechnol Lett, 32,(11), pp. 1739-1743.

109. Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001), Effects of salicylic acid on fungal

elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and taxol production in cell

suspension cultures of Taxus chinensis, Process Biochemistry, 37,(5), pp. 477-482.

110. Yu ZZ, Fu CX, Han YS, Li YX, Zhao DX (2005), Salicylic acid enhances

jaceosidin and siringin production in cell cultures of Saussurea medusa, Biotechnol

Lett, 28,(13), pp. 1027-1031.

111. Zhang CH, Mei XG, Liu L, Yu LJ (2000), Enhanced paclitaxel production

induced by the combination of elicitors in cell suspension cultures of Taxus

chinensis, Biotechnology Letters, 22, pp. 1561-1564.

112. Zhao D, Xing J, Li M, Lu D, Zhao Q (2001), Optimization of growth and

jaceosidin production in callus and cell suspension cultures of Saussurea medusa,

Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 67, pp. 227-234.

96