Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm Elisa phát hiện nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam và ứng dụng chấn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực nghiệm

TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ XÉT NGHIỆM ELISA PHÁT HIỆN NỌC<br /> CỦA BỐN LOÀI TẮN ĐỘC THƯỜNG GẶP Ở VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG<br /> CHẤN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN TRÊN MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM<br /> <br /> <br /> §ç Kh¾c §¹i*; §ç Minh Trung*<br /> NguyÔn §Æng Dòng*; Lª V¨n §«ng<br /> Tãm t¾t<br /> LÇn ®Çu tiªn t¹i ViÖt Nam chóng t«i ®· chÕ t¹o thµnh c«ng bé kÝt ELISA ph¸t hiÖn ®-îc näc cña bèn<br /> loµi r¾n ®éc th-êng g©y tai n¹n r¾n c¾n t¹i ViÖt Nam: Lôc xanh (Trimeresurus albolabris), Chµm qu¹p<br /> (Calloselasma rhodostoma), Hæ ®Êt (Naja kaouthia) vµ Hæ chóa (Ophiophagus hannah). XÐt nghiÖm cã<br /> kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn näc ®éc trong c¸c lo¹i dÞch sinh häc kh¸c nhau bao gåm m¸u toµn phÇn, huyÕt thanh,<br /> huyÕn t-¬ng, n-íc tiÓu vµ dung dÞch ®Öm víi ®é nh¹y ®¹t møc nanogram. Trªn m« h×nh g©y nhiÔm ®éc<br /> näc r¾n thùc nghiÖm, xÐt nghiÖm cã kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn näc ®éc trong 20/20 (100%) sè mÉu m¸u chuét<br /> g©y ®éc víi liÒu 2 LD50 vµ 15/20 (75%) sè mÉu m¸u chuét g©y ®éc víi liÒu 0,5 LD 50 näc ®éc cña c¸c loµi<br /> r¾n nghiªn cøu. Kh«ng thÊy cã ph¶n øng d-¬ng tÝnh gi¶ xuÊt hiÖn ë c¶ 5/5 mÉu chøng ©m. KÕt qu¶ cho<br /> thÊy bé xÐt nghiÖm cã kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn näc ®éc ë c¸c ®èi t-îng cã nhiÔm näc ®éc toµn th©n vµ t¹i chç,<br /> cã thÓ ®em ra øng dông thö nghiÖm víi c¸c mÉu bÖnh phÈm lÊy tõ ng-êi bÞ r¾n c¾n.<br /> * Tõ kho¸: R¾n ®éc c¾n; XÐt nghiÖm ELISA; KÝt ph¸t hiÖn näc r¾n.<br /> <br /> <br /> <br /> Development of ELISA for detection of venoms of<br /> the four common venomous snakes in vietnam and<br /> application in experimental snakebite diagnosis<br /> <br /> Do Khac Dai; Do Minh Trung<br /> Nguyen Dang Dung ; Le Van Dong<br /> SUMMARY<br /> We have successfully, for the first time in Vietnam, developed a snake venom detection kit for the<br /> identification of venoms of the four common venomous snakes in Vietnam viz. Green pit Viver<br /> (Trimeresurus albolabris), Malayan pit Viper (Calloselasma rhodostoma), common Cobra (Naja kaouthia)<br /> and king Cobra (Ophiophagus hannah). The kit can detect snake venom in different sample types<br /> including whole blood, serum, plasma, urine and sample buffer with the sensitivity of nanogram levels. In<br /> the experimental envenoming model, the kit can detect venom in 20/20 blood samples taken from animal<br /> injected with 2 LD50 of the venoms; 15/20 blood samples taken from animal injected with 0.5 LD 50 of the<br /> venoms; none of 5 negative control show fault positive results. These data show that this venom detection<br /> kit can detect venoms in systemically as well as locally envenomed animals, and can be potential in testing<br /> with snakebite human samples.<br /> * Key words: Snakebite; ELISA; Snake venom detection kit.<br /> <br /> <br /> <br /> * Häc viÖn Qu©n y<br /> Ph¶n biÖn khoa häc: TS. Hoµng C«ng Minh<br /> <br /> 1<br />  TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> §Æt VÊn ®Ò ph¸t tõ nh÷ng vÊn ®Ò nªu trªn, chóng t«i<br /> tiÕn hµnh nghiªn cøu nµy nh»m môc tiªu:<br /> R¾n c¾n lµ mét tai n¹n th-êng gÆp ë c¸c<br /> n-íc vïng nhiÖt ®íi, tËp trung ë c¸c ®èi - Nghiªn cøu chÕ t¹o bé xÐt nghiÖm<br /> ELISA ph¸t hiÖn näc cña bèn loµi r¾n ®éc<br /> t-îng b¾t vµ nu«i r¾n, n«ng d©n, c«ng nh©n<br /> th-êng gÆp ë ViÖt Nam.<br /> l©m tr-êng, bé ®éi thùc hµnh huÊn luyÖn vµ<br /> t¸c chiÕn trong ®iÒu kiÖn d· ngo¹i... §©y lµ - §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn näc r¾n<br /> ®éc ë m« h×nh g©y ®éc thùc nghiÖm trªn<br /> mét cÊp cøu cÇn ph¶i ®-îc xö trÝ kÞp thêi,<br /> ®éng vËt.<br /> võa ®Ó cøu tÝnh m¹ng n¹n nh©n, võa ®Ó<br /> ng¨n ngõa c¸c tæn th-¬ng do näc ®éc lµm<br /> ¶nh h-ëng ®Õn chøc n¨ng lao ®éng vµ thÈm §èi t-îng vµ ph-¬ng ph¸p<br /> <br /> mü cña n¹n nh©n sèng sãt sau tai n¹n nghiªn cøu<br /> <br /> [2, 10]. 1. §èi t-îng vµ vËt liÖu nghiªn cøu.<br /> ë n-íc ta, theo thèng kª cña BÖnh viÖn Bèn lo¹i huyÕt thanh kh¸ng näc r¾n ®¬n<br /> Chî RÉy, Thµnh phè Hå ChÝ Minh, hµng gi¸ cña bèn loµi r¾n ®éc gåm: Lôc xanh,<br /> n¨m cã kho¶ng 600 - 1000 n¹n nh©n bÞ r¾n Chµm qu¹p, Hæ ®Êt vµ Hæ chóa ®-îc chÕ<br /> t¹o vµ x¸c ®Þnh hiÖu gi¸ trong nghiªn cøu<br /> c¾n ®Õn cÊp cøu vµ ®iÒu trÞ, trong ®ã hay<br /> tr-íc [1].<br /> gÆp nhÊt lµ: Lôc xanh (Trimeresurus albolabris),<br /> Chµm qu¹p (Calloselasma rhodostoma), Hæ C¸c hãa chÊt, sinh phÈm bao gåm: kÝt<br /> t¸ch chiÕt IgG b»ng ph-¬ng ph¸p s¾c ký<br /> ®Êt (Naja kaouthia) vµ Hæ chóa (Ophiophagus<br /> ¸i lùc víi protein A vµ kÝt ®Þnh l-îng<br /> hannah) [3, 4]. HiÖn nay, c¸c c¬ së trong<br /> protein b»ng ph-¬ng ph¸p ®o mµu (Bio-<br /> n-íc nh- Trung t©m chèng ®éc Quèc gia vµ<br /> Rad, Hoa Kú); h¹t sepharose 4B ho¹t hãa<br /> ViÖn V¾cxin Nha Trang, ®· vµ ®ang tiÕn<br /> b»ng CNBr cña h·ng Armersham (Thôy<br /> hµnh chÕ t¹o c¸c lo¹i huyÕt thanh kh¸ng<br /> §iÓn); c¸c hãa chÊt DSMO, biotin-N-hydroxy-<br /> näc r¾n ®¬n gi¸ chèng l¹i näc ®éc cña tõng<br /> succinimide ester, phøc hîp avidin-enzym<br /> loµi r¾n ®éc kÓ trªn vµ ®ang ¸p dông vµo<br /> peroxidase, c¬ chÊt o-phenylenediamine<br /> ®iÒu trÞ trªn l©m sµng t¹i BÖnh viÖn B¹ch<br /> (OPD), c¬ chÊt tetramethylbenzidine (TMB)<br /> Mai, BÖnh viÖn Chî RÉy, BÖnh viÖn Nhi<br /> cña h·ng Sigma (Hoa Kú). C¸c hãa chÊt<br /> ®ång 1 Thµnh phè Hå ChÝ Minh, Khoa CÊp<br /> th«ng th-êng cßn l¹i ®Õn ®¹t tiªu chuÈn<br /> cøu r¾n ®éc c¾n thuéc Tr¹i r¾n §ång T©m,<br /> chÊt l-îng ph©n tÝch do nhµ ph©n phèi<br /> Qu©n khu 9. Tuy nhiªn, ®iÒu quan träng<br /> chÝnh thøc cung cÊp.<br /> trong cÊp cøu vµ ®iÒu trÞ cho nh÷ng bÖnh<br /> Chuét nh¾t tr¾ng (45 con) khoÎ m¹nh,<br /> nh©n bÞ r¾n ®éc c¾n, ®Æc biÖt lµ khi dïng<br /> träng l-îng tõ 18 - 22 gam do Ban cung cÊp<br /> huyÕt thanh kh¸ng näc r¾n ®¬n gi¸, lµ cÇn<br /> ®éng vËt thÝ nghiÖm, Häc viÖn Qu©n y cung<br /> x¸c ®Þnh chÝnh x¸c loµi r¾n ®· c¾n bÖnh<br /> cÊp.<br /> nh©n ®Ó xö trÝ cÊp cøu ®óng c¸ch vµ sö<br /> dông ®óng lo¹i kh¸ng huyÕt thanh. XuÊt 2. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu.<br /> <br /> <br /> <br /> 2<br />  TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> * Tinh chÕ kh¸ng thÓ: X©y dùng xÐt nghiÖm theo nguyªn t¾c<br /> Kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu víi näc r¾n cña tõng ph¶n øng ELISA kiÓu sandwich (h×nh 1a).<br /> loµi r¾n ®-îc t¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch tõ GiÕng g¾n kh¸ng thÓ ®-îc dïng ngay ®Ó<br /> huyÕt thanh thá g©y miÔn dÞch theo qui tr×nh xÐt nghiÖm ph¸t hiÖn näc r¾n hoÆc b¶o<br /> tinh chÕ 3 b-íc phèi hîp s¾c ký ¸i lùc víi qu¶n ë 4C trong tói nilon g¾n kÝn cho ®Õn<br /> s¾c ký miÔn dÞch: 1) t¸ch chiÕt IgG tõ huyÕt khi sö dông.<br /> thanh thá b»ng s¾c ký ¸i lùc víi cét protein * KÝt ELISA chÈn ®o¸n r¾n ®éc c¾n:<br /> A; 2) t¸ch chiÕt IgG ®Æc hiÖu näc r¾n tõ chÕ<br /> Sö dông phiÕn ELISA lo¹i 6 giÕng g¾n<br /> phÈm IgG tæng sè b»ng s¾c ký miÔn dÞch<br /> trªn c¸c gi¸ ®ì ®Ó tiÕn hµnh chÕ t¹o bé xÐt<br /> víi cét kh¸ng nguyªn protein näc r¾n: dung<br /> nghiÖm. Trong ®ã, mét giÕng B lµm chøng<br /> dÞch kh¸ng thÓ IgG thu ®-îc tõ huyÕt thanh<br /> d-¬ng, 1 giÕng C lµm chøng ©m vµ 4 giÕng<br /> thá (g©y miÔn dÞch víi tõng kh¸ng nguyªn<br /> cßn l¹i dïng ®Ó chÈn ®o¸n ph©n biÖt 4 lo¹i<br /> näc r¾n) cho ch¹y qua cét s¾c ký miÔn dÞch<br /> näc ®éc r¾n (h×nh 1b). Kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu<br /> chøa kh¸ng nguyªn näc r¾n t-¬ng øng; và<br /> loµi r¾n g¾n lªn c¸c giÕng t-¬ng øng. Qui<br /> 3) lo¹i bá c¸c ph©n tö kh¸ng thÓ ph¶n øng<br /> tr×nh xÐt nghiÖm nh- sau:<br /> chÐo gi÷a c¸c loµi r¾n b»ng ph-¬ng ph¸p<br /> hÊp phô miÔn dÞch: kh¸ng thÓ kh¸ng näc<br /> r¾n thu ®-îc ë b-íc 2 cho ch¹y lÇn l-ît qua<br /> c¸c cét chøa kh¸ng nguyªn näc r¾n cña 3<br /> loµi cßn l¹i.<br /> S¶n phÈm thu ®-îc sau hÊp phô miÔn<br /> dÞch ®-îc coi lµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu loµi r¾n.<br /> KiÓm tra ho¹t tÝnh cña kh¸ng thÓ thu ®-îc<br /> (a)<br /> sau tinh chÕ vµ kh¶ n¨ng ph¶n øng chÐo<br /> cña chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu loµi b»ng<br /> ph-¬ng ph¸p ELISA gi¸n tiÕp [1].<br /> * G¾n biotin vµo kh¸ng thÓ:<br /> Trén dung dÞch biotin (biotin-N-hydroxy-<br /> succinimide ester, 2 mg/ml trong DMSO) víi<br /> dung dÞch kh¸ng thÓ (1,0 mg/ml trong NaHCO3<br /> 0,1M, pH = 8,3) theo tû lÖ 1:8 vÒ thÓ tÝch vµ<br /> ñ ë nhiÖt ®é phßng 4 giê. Lo¹i bá biotin cßn<br /> d- b»ng ph-¬ng ph¸p s¾c ký läc gel. Kh¸ng (b)<br /> thÓ g¾n biotin ®-îc b¶o qu¶n ë -200C ®Õn<br /> H×nh 1: Nguyªn lý ph¶n øng ELISA (a)<br /> khi sö dông.<br /> vµ s¬ ®å kit ph¸t hiÖn näc r¾n (b).<br /> * XÐt nghiÖm ELISA ph¸t hiÖn näc r¾n:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 3<br />  TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> - B-íc 1: chuÈn bÞ bé ELISA lµm xÐt - Cã nhiÒu h¬n 1 giÕng trong 4 giÕng (tõ<br /> nghiÖm g¾n trªn gi¸ ®ì. D ®Õn G) cho mµu vµng hoÆc xanh: giÕng<br /> - B-íc 2: cho 100 l mÉu thö (m¸u toµn nµo cho mµu râ nhÊt chøa näc r¾n t-¬ng<br /> phÇn cã chèng ®«ng, huyÕt t-¬ng, huyÕt øng víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu loµi ®· g¾n trªn<br /> thanh, n-íc tiÓu...) vµo mçi giÕng tõ D ®Õn giÕng ®ã.<br /> G, hai giÕng ®èi chøng cho dung dÞch kh¸ng<br /> - Kh«ng cã giÕng nµo (tõ giÕng D ®Õn<br /> o<br /> nguyªn chuÈn. ñ 37 C trong 15 phót. giÕng G) lªn mÇu: cã 2 kh¶ n¨ng.<br /> - B-íc 3: röa 5 lÇn b»ng dung dÞch röa<br /> + MÉu xÐt nghiÖm cã näc ®éc cña 1<br /> PBS-Tween.<br /> trong 4 loµi r¾n, nh-ng nång ®é qu¸ thÊp<br /> - B-íc 4: ®-a kh¸ng thÓ g¾n biotin vµo<br /> d-íi ng-ìng ph¸t hiÖn cña xÐt nghiÖm.<br /> tÊt c¶ c¸c giÕng. ñ 37oC trong 15 phót.<br /> + MÉu xÐt nghiÖm cã chøa näc ®éc cña<br /> - B-íc 5: röa nh- b-íc 3.<br /> loµi r¾n nµo ®ã, kh«ng thuéc 1 trong 4 loµi<br /> - B-íc 6: thªm phøc hîp enzym avidin-<br /> r¾n ®ang nghiªn cøu.<br /> HRP vµo mèi giÕng. ñ 37oC trong 5 phót.<br /> * G©y ®éc thùc nghiÖm chuét nh¾t tr¾ng<br /> - B-íc 7: röa nh- b-íc 3.<br /> víi näc r¾n:<br /> - B-íc 8: thªm c¬ chÊt mµu. Mçi giÕng<br /> Chuét nh¾t tr¾ng ®-îc chia thµnh 9 l«,<br /> 100 l c¬ chÊt OPD nång ®é 0,5 mg/ml cã<br /> mçi l« 5 con. Tõ l« thø nhÊt ®Õn l« thø t-<br /> bæ sung thªm 0,006% H2O2. §äc kÕt qu¶<br /> tiªm näc ®éc t-¬ng øng cña c¸c loµi r¾n Lôc<br /> sau 5 phót. C¬ chÊt tõ kh«ng mµu chuyÓn<br /> xanh, Chµm qu¹p, Hæ ®Êt vµ Hæ chóa víi<br /> sang mµu vµng. HoÆc ®o c-êng ®é quang<br /> häc ë b-íc sãng 450 nm vµ ph©n tÝch kÕt nång ®é näc t-¬ng ®-¬ng víi 0,5 LD50 cña<br /> <br /> qu¶. mçi näc r¾n. Tõ l« thø n¨m ®Õn l« thø t¸m<br /> <br /> NhËn ®Þnh kÕt qu¶: xÐt nghiÖm ®-îc coi tiªm näc ®éc t-¬ng øng cña c¸c loµi r¾n Lôc<br /> <br /> lµ cã gi¸ trÞ khi giÕng ®èi chøng d-¬ng cho xanh, Chµm qu¹p, Hæ ®Êt vµ Hæ chóa víi<br /> mµu vµng râ, giÕng ®èi chøng ©m kh«ng lªn nång ®é näc t-¬ng ®-¬ng víi 2 LD50 cña<br /> mµu hoÆc cã mµu vµng nh¹t. KÕt qu¶ nhËn mçi näc r¾n. L« thø chÝn lµ chøng ©m, tiªm<br /> ®Þnh nh- sau: dung dÞch NaCl 0,9%. Pha näc r¾n trong<br /> - ChØ 1 trong 4 giÕng (D ®Õn G) cho mµu NaCl 0,9% vµ tiªm vµo mÆt ngoµi ®ïi sau<br /> vµng râ rÖt, cßn c¸c giÕng kh¸c kh«ng mµu bªn ph¶i cña chuét. 30 phót sau khi tiªm,<br /> hoÆc mµu nh¹t: mÉu xÐt nghiÖm ®ã chøa lÊy m¸u chuét, sö dông m¸u toµn phÇn<br /> näc r¾n t-¬ng øng víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu hoÆc huyÕt t-¬ng ®Ó x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña<br /> loµi r¾n ®· g¾n trªn giÕng ®ã. näc ®éc.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 4<br />  TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn<br /> 1. Tinh chÕ kh¸ng thÓ kh¸ng näc r¾n ®Æc hiÖu loµi r¾n.<br /> KiÓm tra tÝnh ®Æc hiÖu cña mçi chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu víi tõng loµi r¾n b»ng<br /> ph-¬ng ph¸p ELISA. ñ c¸c chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu loµi ë c¸c nång ®é kh¸c nhau víi<br /> näc ®éc cña loµi r¾n ®· dïng g©y miÔn dÞch vµ näc ®éc cña c¸c loµi r¾n cßn l¹i.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 2: KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh ®Æc hiÖu loµi r¾n cña c¸c chÕ phÈm kh¸ng thÓ.<br /> <br /> C¸c chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu loµi chÕ phÈm kh¸ng thÓ thu ®-îc lµ kh¸ng thÓ<br /> r¾n thu ®-îc ph¶n øng rÊt m¹nh víi näc ®éc ®Æc hiÖu loµi r¾n.<br /> t-¬ng øng. T¹i nång ®é kh¸ng thÓ cao trªn 2. §é nh¹y cña xÐt nghiÖm ELISA vµ<br /> 100 ng/ml vÉn cã hiÖn t-îng ph¶n øng chÐo kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn näc r¾n trong c¸c<br /> cho kÕt qu¶ d-¬ng tÝnh. Tuy nhiªn, víi c¸c lo¹i mÉu thö kh¸c nhau trªn in vitro.<br /> nång ®é nµy ®é t-¬ng ph¶n vÒ mËt ®é<br /> §é nh¹y cña ph¶n øng ELISA nhËn biÕt<br /> quang häc gi÷a cÆp ph¶n øng ®Æc hiÖu víi<br /> näc ®éc r¾n ®· ®-îc x¸c ®Þnh víi tõng lo¹i<br /> ph¶n øng chÐo rÊt lín, cho phÐp coi c¸c<br /> dÞch c¬ thÓ lµ m¸u toµn phÇn, huyÕt t-¬ng,<br /> <br /> 5<br />  TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> huyÕt thanh, n-íc tiÓu vµ dung dÞch ®Öm HuyÕt t-¬ng 1,6 0,8 0,8 0,8<br /> PBS. Näc ®éc víi nång ®é ®-îc pha lo·ng HuyÕt thanh 0,8 0,8 0,4 0,8<br /> bËc hai trong c¸c mÉu dÞch sinh häc kÓ trªn N-íc tiÓu 1,6 1,6 1,6 3,2<br /> cña ng-êi kháe m¹nh kh«ng bÞ r¾n c¾n Dung dÞch ®Öm 0,8 0,8 0,4 0,4<br /> hoÆc pha trong dung dÞch ®Öm. Mçi mÉu<br /> KÕt qu¶ trªn cho thÊy xÐt nghiÖm cã thÓ<br /> xÐt nghiÖm tiÕn hµnh 3 giÕng song song<br /> ph¸t hiÖn näc ®éc trong tÊt c¶ c¸c mÉu thö<br /> (triplicate), sö dông PBS lµm ®èi chøng ©m.<br /> X¸c ®Þnh gi¸ trÞ giíi h¹n b»ng gi¸ trÞ trung vµ ®é nh¹y cña ph¶n øng kh¸c nhau ë mçi<br /> <br /> b×nh céng víi 3 lÇn ®é lÖch chuÈn (mean + lo¹i dÞch thÓ vµ loµi r¾n. Tuy nhiªn xÐt<br /> 3SD) cña ®é hÊp phô quang tõ c¸c mÉu nghiÖm nµy cã thÓ ph¸t hiÖn näc ®éc ë møc<br /> chøng ©m. nanogram. Selvanayagam vµ CS (1999)<br /> th«ng b¸o l-îng näc ®éc cña bèn loµi r¾n<br /> phæ biÕn ë Ên §é trong c¸c dÞch sinh häc<br /> dao ®éng tõ 0 - 479 ng/ml vµ trung b×nh 200<br /> ng/ml [6]. Nång ®é näc ®éc trong m¸u bÖnh<br /> nh©n phô thuéc vµo mét sè yÕu tè, c¶ vÒ<br /> l-îng näc r¾n ®-îc tiªm vµo c¬ thÓ n¹n<br /> nh©n còng nh- c¸c yÕu tè thuéc vÒ b¶n<br /> th©n ng-êi bÖnh vµ c¸c yÕu tè cÊp cøu, ®iÒu<br /> trÞ, thêi gian lÊy vµ lo¹i mÉu xÐt nghiÖm [6,<br /> 7, 9, 10]. Trong nghiªn cøu nµy, ®é nh¹y<br /> H×nh 3: §-êng chuÈn biÓu thÞ t-¬ng quan cña xÐt nghiÖm ®¹t møc nanogram ®èi víi<br /> gi÷a mËt ®é quang häc cña xÐt nghiÖm<br /> c¸c mÉu m¸u, huyÕt t-¬ng, huyÕt thanh,<br /> ELISA nhËn biÕt näc ®éc r¾n ë c¸c nång<br /> n-íc tiÓu. Ng-ìng ph¸t hiÖn nµy cã thÓ ®¸p<br /> ®é kh¸c nhau pha trong dung dÞch PBS 1%.<br /> øng yªu cÇu cÇn xÐt nghiÖm ë møc vµi chôc<br /> B¶ng 1: §é nh¹y cña ph¶n øng ELISA nanogram ë bÖnh nh©n cã biÓu hiÖn nhiÔm<br /> ph¸t hiÖn näc cña bèn loµi r¾n trén trong näc ®éc toµn th©n vµ mét sè tr-êng hîp míi<br /> c¸c lo¹i dÞch sinh häc vµ dung dÞch ®Öm<br /> chØ cã nhiÔm näc ®éc côc bé nh-ng viÖc lÊy<br /> kh¸c nhau.<br /> mÉu vµ thêi gian lÊy mÉu thÝch hîp [4, 5, 6].<br /> §é nh¹y (ng/ml) 3. ChÈn ®o¸n r¾n ®éc c¾n trªn m«<br /> Lo¹i mÉu Lôc Chµm Hæ Hæ<br /> h×nh g©y ®éc thùc nghiÖm.<br /> xanh qu¹p ®Êt chóa<br /> TiÕn hµnh thö nghiÖm g©y nhiÔm ®éc<br /> M¸u toµn phÇn 3,2 3,2 1,6 1,6<br /> näc r¾n víi mçi lo¹i näc 2 nång ®é thÊp<br /> <br /> 6<br />  TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> (t-¬ng ®-¬ng víi 0,5 LD50) vµ cao (t-¬ng KÕt qu¶ cho thÊy c¸c mÉu m¸u cña ®éng<br /> ®-¬ng víi 2 LD50) nh»m ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng vËt g©y ®éc víi liÒu cao (2 LD50) (nhãm 5<br /> chÈn ®o¸n ®Þnh tÝnh loµi r¾n g©y nhiÔm ®éc ®Õn 8) ®Òu cho ph¶n øng d-¬ng tÝnh. Tû lÖ<br /> näc r¾n khi cã hoÆc kh«ng cã biÓu hiÖn ph¸t hiÖn cã näc ®éc ®¹t 20/20 mÉu m¸u<br /> nhiÔm ®éc toµn th©n. (100%). Cã sù phï hîp hoµn toµn gi÷a lo¹i<br /> näc g©y ®éc cho ®éng vËt vµ kÕt qu¶ xÐt<br /> B¶ng 2: KÕt qu¶ chÈn ®o¸n r¾n c¾n trªn<br /> thùc nghiÖm. nghiÖm ELISA víi tû lÖ mÉu d-¬ng tÝnh chØ<br /> thÞ ®óng loµi r¾n víi sè ®éng vËt g©y ®éc víi<br /> Loµi r¾n vµ<br /> Ph¶n øng d-¬ng tÝnh víi näc cña c¶ bèn loµi r¾n ®Òu ®¹t 5/5 mÉu.<br /> Nhãm r¾n (n = 5)<br /> nång ®é<br /> Víi ®éng vËt ®-îc g©y ®éc liÒu thÊp (0,5<br /> näc tiªm Lôc Chµm Hæ Hæ<br /> xanh qu¹p ®Êt chóa LD50) (nhãm 1 ®Õn 4) cho kÕt qu¶ xÐt<br /> 1 Lôc xanh 4/5 0/5 0/5 0/5 nghiÖm kh«ng ph¶i tÊt c¶ c¸c mÉu m¸u lÊy<br /> 1 mg/kg tõ ®éng vËt g©y ®éc víi liÒu thÊp ®Òu cho<br /> (0,5 LD50)<br /> kÕt qu¶ d-¬ng tÝnh. Tû lÖ ph¸t hiÖn cã näc<br /> 2 Chµm qu¹p 0/5 5/5 0/5 0/5 ®éc chØ ®¹t 15/20 (75%). Tuy nhiªn, kÕt qu¶<br /> 3 mg/kg<br /> (0,5 LD50) d-¬ng tÝnh ®Òu hiÓn thÞ ®óng loµi r¾n cña<br /> mÉu näc ®· dïng ®Ó g©y ®éc thùc nghiÖm.<br /> 3 Hæ ®Êt 0/5 0/5 3/5 0/5<br /> 0,08 mg/kg C¶ 5 mÉu tiªm n-íc muèi sinh lý chøng ©m<br /> (0,5 LD50) ®Òu cho kÕt qu¶ ©m tÝnh, kh«ng cã tr-êng<br /> 4 Hæ chóa 0/5 0/5 0/5 3/5 hîp nµo d-¬ng tÝnh gi¶. §iÒu nµy thÓ hiÖn<br /> 0,4 mg/kg<br /> kh¶ n¨ng lo¹i trõ tr-êng hîp kh«ng cã näc<br /> (0,5 LD50)<br /> ®éc, gãp phÇn vµo chÈn ®o¸n tr-êng hîp cã<br /> 5 Lôc xanh 5/5 0/5 0/5 0/5<br /> 4 mg/kg<br /> r¾n c¾n nh-ng lµ r¾n kh«ng ®éc hoÆc r¾n<br /> (2 LD50) ®éc c¾n kh«ng tiªm näc ®éc vµo c¬ thÓ n¹n<br /> 6 Chµm qu¹p 0/5 5/5 0/5 0/5 nh©n [7, 9, 10]. C¸c kÕt qu¶ nµy cho thÊy<br /> 12 mg/kg kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn näc ®éc cao khi cã<br /> (2 LD50)<br /> nhiÔm näc ®éc toµn th©n (tiªm liÒu 2 LD50),<br /> 7 Hæ ®Êt 0/5 0/5 5/5 0/5<br /> khi chØ cã nhiÔm ®éc côc bé th× kh¶ n¨ng<br /> 0,32 mg/kg<br /> (2 LD50) ph¸t hiÖn näc ®éc trong m¸u h¹n chÕ. §iÒu<br /> <br /> 8 Hæ chóa 0/5 0/5 0/5 5/5<br /> nµy phï hîp víi kÕt qu¶ diÔn biÕn trªn l©m<br /> 1,6 mg/kg sµng cña c¸c t¸c gi¶ kh¸c vµ cho thÊy bé<br /> (2 LD50) xÐt nghiÖm nµy ®ñ tiªu chuÈn ®Ó thö nghiÖm<br /> 9 N-íc muèi 0/5 0/5 0/5 0/5 víi bÖnh phÈm l©m sµng [4, 6].<br /> sinh lý<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 7<br />  TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> kÕt luËn 5. Le Van Dong, Le Khac Quyen, Khoo Hoon<br /> Eng, P. Gopalakrishnakone. Immunogenicity of<br /> XÐt nghiÖm ELISA ®-îc t¹o ra cã kh¶ venoms from four common snakes in the south<br /> n¨ng ph¸t hiÖn vµ ph©n biÖt näc ®éc cña of Vietnam and development of ELISA kit for<br /> venom detection. Journal of Immunological<br /> bèn loµi r¾n ®éc th-êng gÆp ë ViÖt Nam víi<br /> Methods. 2003, 282, pp.13-31.<br /> ng-ìng ph¸t hiÖn ®¹t nanogram trong dÞch<br /> 6. Selvanayagam Z.E., Gopalakrishnakone<br /> sinh häc th«ng th-êng nh- m¸u, n-íc tiÓu. P. Tests for detection of snake venoms, toxins<br /> Thö nghiÖm víi ®éng vËt tiªm näc ®éc cho and venom antibodies: review on recent trends<br /> thÊy xÐt nghiÖm cã kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn (1987-1997). Toxicon. 1999, Apr 37 (4), pp.565-<br /> 86.<br /> ®-îc näc ®éc trong m¸u ®éng vËt sau<br /> 7. Selvanayagam, Z. E., Gnanavendhan, S.<br /> khi g©y ®éc víi liÒu g©y nhiÔm ®éc toµn<br /> G., Ganesh, K. A., Rajagopal, D., Rao, P. V.<br /> th©n (2 LD50) còng nh- nhiÔm ®éc côc bé ELISA for the detection of venoms from four<br /> (0,5 LD50). medically important snakes of India. Toxicon.<br /> 1999b, 37, pp.757-570.<br /> 8. Steuten J, Winkel K, Carroll T, Williamson<br /> Tµi liÖu tham kh¶o NA, Ignjatovic V, Fung K, Purcell AW, Fry BG.<br /> 1. §ç Kh¾c §¹i, NguyÔn §Æng Dòng, Lª V¨n The molecular basis of cross-reactivity in the<br /> §«ng. Nghiªn cøu chÕ t¹o huyÕt thanh kh¸ng Australian snake venom detection Kit (SVDK).<br /> näc r¾n cña bèn loµi r¾n ®éc th-êng gÆp ë ViÖt Toxicon. 2007, 50 (8), pp.1041-52.<br /> Nam lµm nguyªn liÖu chÕ t¹o xÐt nghiÖm miÔn 9. Theakston, R.D.G., Jones, M.J.L., Reid,<br /> dÞch chÈn ®o¸n r¾n ®éc c¾n. T¹p chÝ Y-D-îc häc H.A. Micro-ELISA for detecting and assaying<br /> qu©n sù. 2008, sè 33 (2) tr. 108-113. snake venom and venom antibody. Lancet ii.<br /> 1977, pp.639-641.<br /> 2. Vò V¨n §Ýnh vµ CS. R¾n ®éc trong “ CÊp<br /> cøu ngé ®éc” . NXB Y häc, Hµ Néi. 2001, tr. 10. Warrell, D.A. WHO/SEARO Guidelines<br /> 115-120. for “ The clinical management of the snakebite<br /> in Southeast Asian region. Southeast Asian<br /> 3. TrÞnh Xu©n KiÕm. R¾n c¾n t¹i ViÖt Nam:<br /> Journal of Tropical Medicine and Public Health.<br /> kÕt qu¶ nghiªn cøu 10 n¨m t¹i BÖnh viÖn Chî<br /> 1999, 30, pp.1 - 85.<br /> RÉy. Kû yÕu c¸c b¸o c¸o khoa häc t¹i Héi nghÞ<br /> Quèc tÕ vÒ r¾n ®éc vµ ch¨m sãc bÖnh nh©n r¾n<br /> ®éc c¾n. TP. HCM th¸ng 11 - 1998.<br /> 4. Le Khac Quyen. Clinical evaluation of<br /> snake bites in Vietnam: study from Cho Ray<br /> Hospital. Master thesis (Clinical Science).<br /> National University of Singapore. 2003.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 8<br /> TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2009<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 9<br />