intTypePromotion=1

Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh ngựa đơn đặc hiệu kháng nọc rắn Hổ mèo (Naja siamensis) tại Việt Nam

Chia sẻ: Nguyễn Triềuu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
16
lượt xem
2
download

Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh ngựa đơn đặc hiệu kháng nọc rắn Hổ mèo (Naja siamensis) tại Việt Nam

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết nghiên cứu chế tạo kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo đơn giá và gây miễn dịch cho ngựa tạo kháng thể đơn đặc hiệu đóng vai trò quyết định trong sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn Hổ mèo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh ngựa đơn đặc hiệu kháng nọc rắn Hổ mèo (Naja siamensis) tại Việt Nam

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNG<br /> HUYẾT THANH NGỰA ĐƠN ĐẶC HIỆU KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja<br /> siamensis) TẠI VIỆT NAM<br /> Lê Khắc Quyến*; Trịnh Xuân Kiếm**; Hoàng Anh Tuấn***<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu chế tạo kháng nguyên (KN) nọc rắn Hổ mèo (RHM) đơn giá và gây<br /> miễn dịch cho ngựa tạo kháng thể (KT) đơn đặc hiệu đóng vai trò quyết định trong sản xuất<br /> huyết thanh kháng nọc (HTKN) RHM. Phương pháp: chế tạo KN nọc RHM từ nọc tổng số theo<br /> phương pháp giảm độc lực, gây miễn dịch cho ngựa theo phương pháp tiêm dưới da nhiều mũi<br /> liều thấp nhắc lại nhiều lần. Kết quả: tạo được 300 ml KN chuẩn, xác lập lịch trình gây miễn<br /> dịch thành công cho ngựa và thu được huyết tương có KT đặc hiệu làm nguyên liệu chế tạo<br /> HTKN RHM đơn đặc hiệu. Kết luận: đã tạo được KN chuẩn và gây miễn dịch thành công cho<br /> ngựa thu được huyết tương có KT đặc hiệu.<br /> * Từ khóa: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis); Kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo; Huyết thanh kháng<br /> nọc rắn Hổ mèo.<br /> <br /> Study of Antigen Production and Immunization Created Horse<br /> Monospecific Antiserum Against Indochinese Spitting Cobra (Naja<br /> siamensis) Venom in Vietnam<br /> Summary<br /> Objectives: To prepare Naja siamensis (NS) monovalent antigen and to immunize horse for the<br /> production of NS monospecific antibody. Methods: NS monovalent venom antigen was prepared<br /> from whole venom by detoxification method; horse hyper-immunization was done by subcutaneous<br /> multiple site and repeated low dose injections. Results: 300 ml of standard antigen was prepared,<br /> immunization for horse against NS venom and collected hyperimmune was established<br /> succesfully. Horse plasma containing specific antibody has been obtained as a material for NS<br /> monospecific antivenom production. Conclusion: NS standard antigen has been succesfully<br /> prepared and used for immunization of horse to produce specific antibody in horse plasma.<br /> * Key words: Naja siamensis; Naja siamensis antigen; Naja siamensis antivenom.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Rắn độc cắn vẫn là mối hiểm họa cho<br /> các quốc gia đang phát triển vùng nhiệt<br /> <br /> đới ở châu Phi, châu Á và Mỹ Latinh, trong<br /> đó có Việt Nam. Năm 2008, Tổ chức Y tế<br /> Thế giới (WHO) xếp bệnh lý rắn độc cắn<br /> vào các bệnh lý “Nhiệt đới bị lãng quên” [8].<br /> <br /> * Bệnh viện FV<br /> ** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn<br /> *** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lª Kh¾c QuyÕn (lekhacquyen@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/01/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 29/01/2015<br /> <br /> 43<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> Việt Nam là quốc gia đầu tiên trên thế giới<br /> sản xuất và điều trị HTKN rắn Hổ từ nghiên<br /> cứu của A. Calmette tại Viện Pasteur Sài<br /> Gòn năm 1894 [5]. Hơn 100 năm sau,<br /> Việt Nam vẫn chưa tự sản xuất được<br /> HTKN rắn. Ước tính có đến 30.000<br /> trường hợp bị rắn cắn mỗi năm. Từ năm<br /> 1990, Trịnh Xuân Kiếm và CS đã nghiên<br /> cứu phát triển kỹ thuật sản xuất HTKN<br /> rắn [2, 4]. Hiện nay chúng ta có được các<br /> loại HTKN rắn Chàm quạp, Hổ đất, rắn<br /> Lục, Cạp nia và Hổ chúa. Tỷ lệ tử vong<br /> đã giảm từ 19,5% lúc chưa có huyết thanh<br /> xuống còn 3,1% sau điều trị HTKN đơn<br /> đặc hiệu [4].<br /> Rắn Hổ mèo thường gây tai nạn cho<br /> bệnh nhân (BN) sinh sống ở vùng Đông<br /> Nam Bộ, nhiều trường hợp tử vong hoặc<br /> để lại thương tật nặng nề như cắt cụt chi<br /> hoặc mất da rộng gây sẹo co rút mất khả<br /> năng lao động. Việc điều trị hiện nay chủ<br /> yếu là điều trị triệu chứng do chưa có<br /> HTKN đặc hiệu [6]. Nghiên cứu sản xuất<br /> HTKN RHM là cần thiết và yêu cầu cấp<br /> bách trong vấn đề cứu chữa người bị<br /> RHM cắn. Do đó, yêu cầu đặt ra là chế<br /> tạo được KN, xác lập quy trình lịch gây<br /> miễn dịch cho động vật lớn như ngựa để<br /> tạo huyết thanh ngựa có KT kháng nọc<br /> RHM với hiệu giá cao, làm nguyên liệu<br /> tiến tới sản xuất HTKN RHM đầu tiên tại<br /> Việt Nam.<br /> ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> - Rắn Hổ mèo: 50 cá thể thu nhận<br /> trong điều kiện tự nhiên tại khu vực miền<br /> Đông Nam Bộ, kích thước từ 0,2 - 1,5 m,<br /> 44<br /> <br /> nặng từ 100 g - 2,5 kg, màu vàng nhạt<br /> oliu hoặc màu vàng nhạt trắng. Rắn có<br /> thể bạnh mang và phun nọc độc xa tới 2<br /> m. Mặt lưng cổ phình mang có 2 vòng<br /> tròn nối với nhau theo hình chữ U hoặc V:<br /> 2 mắt kính nhưng không có gọng kính,<br /> phía mang vùng bụng có 2 đốm đen và<br /> 1 - 2 khoang đen.<br /> <br /> Hình 1: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis).<br /> - Ngựa gây miễn dịch: 02 ngựa đực 5<br /> tuổi khỏe mạnh, trọng lượng 300 kg, dùng<br /> để gây miễn dịch.<br /> 2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu.<br /> - Dung dịch PBS 10%, glutaraldehyd 20%,<br /> methanol, thạch agarose, thuốc nhuộm<br /> coomasie blue 0,025%, axit acetic, máy<br /> đo pH, bộ lọc vô khuẩn, lọ vô khuẩn, tủ<br /> ấm, phiến kính, nước cất vô trùng, kim<br /> tiêm vô trùng.<br /> - Môi trường cấy vi khuẩn Sabouraud,<br /> thioglycolat và nấm.<br /> - Tá chất Freund hoàn chỉnh (Complete<br /> Freund Adjuvant - CFA) và tá chất Freund<br /> không hoàn chỉnh (Incomplete Freund<br /> Adjuvant - IFA) (Hãng Sigma, Mỹ).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> 3. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng<br /> thí nghiệm và trên động vật.<br /> * Thu nhận nọc rắn:<br /> Thu nhận nọc RHM theo hướng dẫn<br /> của Tổ chức Y tế Thế giới bằng phương<br /> pháp kích thích cơ học vào hai bên tuyến<br /> nọc để rắn nhả nọc vào đĩa petri vô trùng.<br /> Trộn đều hỗn hợp nọc của 50 cá thể rắn<br /> để bảo đảm tính đại diện loài và địa<br /> phương phân bố của rắn [8]. Ly tâm bỏ<br /> cặn hỗn hợp nọc, sau đó bảo quản ở<br /> -20ºC liên tục đến khi sử dụng.<br /> * Chế tạo KN:<br /> Chế tạo KN nọc RHM đơn giá theo kỹ<br /> thuật khử nọc rắn độc bằng dung dịch<br /> <br /> glutaraldehyd, sau đó dùng phương pháp<br /> nhiệt để tạo KN đặc hiệu [8]. Kiểm định<br /> tính vô trùng KN nọc RHM bằng các xét<br /> nghiệm vi sinh thường quy.<br /> * Gây miễn dịch cho ngựa:<br /> Được thực hiện theo kinh nghiệm trong<br /> sản xuất HTKN rắn Hổ đất của Trịnh<br /> Xuân Kiếm và CS (1997) [4] và hướng<br /> dẫn của WHO (2010) [8]. Ngựa được gây<br /> miễn dịch bằng cách tiêm dưới da lặp lại<br /> nhiều lần liều thấp KN nọc RHM đơn giá<br /> phối trộn với tá chất miễn dịch Freund<br /> hoàn chỉnh và không hoàn chỉnh, tăng<br /> dần theo mỗi tháng. Xác định KT đặc hiệu<br /> kháng nọc RHM trong máu ngựa gây<br /> miễn dịch bằng kỹ thuật khuếch tán miễn<br /> dịch đơn [1].<br /> <br /> Bảng 1: Lịch trình miễn dịch, liều lượng KN phối hợp tá chất.<br /> Liều KN (ml)<br /> CFA (ml)<br /> IFA (ml)<br /> <br /> 1<br /> 1<br /> 0<br /> <br /> 3<br /> 3<br /> 0<br /> <br /> 5<br /> 5<br /> 0<br /> <br /> 5<br /> 0<br /> 5<br /> <br /> 5<br /> 0<br /> 5<br /> <br /> 5<br /> 0<br /> 5<br /> <br /> 5<br /> 0<br /> 5<br /> <br /> 5<br /> 0<br /> 5<br /> <br /> 5<br /> 0<br /> 5<br /> <br /> Tổng số (KN + tá chất) (ml)<br /> <br /> 2<br /> <br /> 6<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 10<br /> <br /> * Địa điểm nghiên cứu:<br /> - Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sự,<br /> Học viện Quân y.<br /> - Trung tâm Nghiên cứu sản xuất thuốc,<br /> Học viện Quân y (Hoà Lạc).<br /> - Bộ môn - Khoa Huyết học - Truyền máu,<br /> Bệnh viện Quân y 103.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả thu nhận nọc rắn và chế<br /> tạo KN.<br /> Pha 30 gr nọc RHM thu nhận từ 50 cá<br /> thể rắn trong dung dịch PBS 10% tạo<br /> thành 300 ml dung dịch nọc RHM. Khử độc<br /> <br /> 45<br /> <br /> dung dịch nọc này bằng glutheraldehyd<br /> 20%, sau đó ủ nhiệt, ly tâm, bỏ cặn, lọc<br /> vô trùng, thu được 270 ml sản phẩm. Sau<br /> khi lấy mẫu cấy khuẩn kiểm tra độ vô<br /> khuẩn, chia nhỏ 100 ml sản phẩm sau<br /> lọc, đóng lọ nắp cao su với thể tích 1 ml,<br /> 3 ml và 5 ml. Sản phẩm được đánh số<br /> thứ tự, dán nhãn, ghi ngày sản xuất, tên<br /> KN, điều kiện và thời gian bảo quản. Bảo<br /> quản thành phẩm KN đóng lọ và sản<br /> phẩm còn lại trong tủ lạnh -20ºC liên tục<br /> đến khi sử dụng.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> Hình 2: KN nọc RHM.<br /> Kết quả cấy khuẩn và nấm trong các môi trường Sabouraund, thioglycolat theo dõi<br /> trong 7 ngày không thấy vi khuẩn và nấm mọc, cho thấy sản phẩm KN nọc RHM đạt<br /> tiêu chuẩn vô khuẩn.<br /> 2. Kết quả gây miễn dịch ngựa.<br /> Sau khi tiêm KN + CFA với tỷ lệ 1:1 (V/V), lần 1 đến lần 3 thấy ngựa mệt mỏi, yếu,<br /> nằm, bỏ ăn. Tại chỗ có biểu hiện viêm, sưng tấy tạo áp xe. Tiêm lần 2, 3, tại chỗ xuất<br /> hiện vết loét, chảy mủ, dịch. Tiêm KN từ lần thứ 4 đến lần thứ 9, ngựa vận động và ăn<br /> uống bình thường, tại chỗ vẫn bị viêm, loét và chảy mủ.<br /> Trong tất cả các lần tiêm gây miễn dịch, không thấy ngựa có biểu hiện rối loạn đông<br /> máu toàn thân hoặc suy hô hấp, nhưng có tổn thương tại chỗ tiêm.<br /> Bảng 2: Theo dõi ngựa sau mỗi lần miễn dịch.<br /> L Ç n<br /> m iÔ n<br /> d Þ c h Vận động<br /> <br /> N g ù<br /> 1 a<br /> <br /> Toàn thân<br /> Hô hấp<br /> <br /> Tiêu hóa<br /> <br /> Tại chỗ<br /> <br /> Toàn thân<br /> Vận động<br /> <br /> Hô hấp<br /> <br /> Tiêu hóa<br /> <br /> Tại<br /> chỗ<br /> <br /> 1<br /> <br /> Yếu<br /> <br /> BT<br /> <br /> Bỏ ăn<br /> <br /> Viêm<br /> <br /> Yếu<br /> <br /> BT<br /> <br /> Bỏ ăn<br /> <br /> Viêm<br /> <br /> 2<br /> <br /> Yếu<br /> <br /> BT<br /> <br /> Bỏ ăn<br /> <br /> Loét<br /> <br /> Yếu<br /> <br /> BT<br /> <br /> Bỏ ăn<br /> <br /> Loét<br /> <br /> 3<br /> <br /> Yếu<br /> <br /> BT<br /> <br /> Bỏ ăn<br /> <br /> Loét<br /> <br /> Yếu<br /> <br /> BT<br /> <br /> Bỏ ăn<br /> <br /> Viêm<br /> <br /> 4<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> Yếu<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Viêm<br /> <br /> 5<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> 6<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> 7<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> 8<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> 9<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> BT<br /> <br /> Loét<br /> <br /> (BT: bình thường).<br /> 46<br /> <br /> N g ù<br /> 2 a<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> 3. Kết quả xác định KT đặc hiệu với<br /> KN nọc RHM trong huyết thanh ngựa.<br /> <br /> ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống<br /> [6]. Sinh hóa học về nọc rắn Hổ đã được<br /> <br /> Trong quá trình gây miễn dịch theo lịch<br /> <br /> nghiên cứu khá kỹ trên thế giới và trong<br /> <br /> trình, theo dõi khả năng sinh KT đặc hiệu với<br /> <br /> nước [9]. Sự khác biệt loài rắn (Hổ đất, Hổ<br /> <br /> KN nọc RHM bằng kỹ thuật Ouchterlony cho<br /> <br /> mèo và Hổ mang bành) về phân bố địa lý<br /> <br /> thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với KN nọc<br /> rắn rất khả quan. KT đặc hiệu xuất hiện sau<br /> 2 lần gây miễn dịch và những lần gây miễn<br /> dịch nhắc lại tiếp theo.<br /> <br /> cũng như khác biệt về trình tự sắp xếp<br /> aminoaxit trên mtADN đã được Wüster và<br /> Thorpe chứng minh [10]. Vì vậy, nhu cầu cần<br /> thiết cấp bách chế tạo HTKN RHM phục vụ<br /> điều trị trên lâm sàng. Nghiên cứu này đã<br /> chế tạo thành công KN nọc RHM theo<br /> hướng dẫn của WHO. Sản phẩm KN nọc<br /> RHM tạo ra đảm bảo tiêu chuẩn vô khuẩn và<br /> sinh KT tốt trên ngựa, đảm bảo hiệu lực và<br /> an toàn theo các tiêu chuẩn yêu cầu [8].<br /> - Cùng với việc chế tạo KN nọc RHM,<br /> việc gây miễn dịch cho ngựa tạo huyết<br /> thanh ngựa có hiệu giá KT đặc hiệu cao,<br /> làm nguyên liệu sản xuất HTKN là khâu rất<br /> <br /> Hình 3: Vết tủa KN nọc RHM và KT từ huyết<br /> <br /> quan trọng. Việc tính toán liều lượng KN, tá<br /> <br /> thanh ngựa đã gây miễn dịch<br /> <br /> chất và khoảng cách giữa hai lần tiêm sao<br /> <br /> trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony).<br /> <br /> cho hợp lý, đảm bảo sinh KT tốt mà không<br /> gây nguy hiểm cho ngựa, giảm chi phí trong<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> - Rắn Hổ mèo với đặc tính và hình dạng<br /> khác biệt: màu vàng nhạt oliu, hai mắt kính<br /> không gọng kính, đặc biệt có khả năng phun<br /> nọc rắn rất xa (> 2 m) [6, 9]. Các triệu chứng<br /> <br /> nghiên cứu. Đây là lần đầu tiên xác định lịch<br /> miễn dịch cho ngựa đối với KN nọc RHM<br /> được áp dụng tại Việt Nam và trên thế giới.<br /> Lịch trình gây miễn dịch dựa trên kinh<br /> nghiệm trong sản xuất HTKN rắn Hổ đất [4]<br /> và hướng dẫn của WHO (2010) [8]. Tuy<br /> <br /> lâm sàng trên BN bị loài này cắn rất khác<br /> <br /> nhiên, nọc RHM gây hoại tử tại chỗ và độc<br /> <br /> biệt với BN bị rắn Hổ đất cắn: không có hội<br /> <br /> tố toàn thân, nhất là trên tim mạch rất nặng<br /> <br /> chứng nhiễm độc thần kinh, nhưng có các<br /> <br /> nề [3]. Vì vậy, nghiên cứu đề ra quy trình<br /> <br /> hội chứng nhiễm độc tế bào và rối loạn đông<br /> <br /> khẳng định lịch miễn dịch, liều lượng KN, tá<br /> <br /> cầm máu nhẹ. BN không đáp ứng điều trị<br /> <br /> chất phù hợp, ngựa đáp ứng sinh KT tốt và<br /> <br /> với huyết thanh kháng nọc rắn Hổ đất làm<br /> <br /> an toàn. Trong đó:<br /> <br /> tăng tỷ lệ tử vong, hoặc để lại di chứng<br /> nặng nề,<br /> 47<br /> <br /> + Thời gian miễn dịch cần 8 - 9 tháng để<br /> có KT tốt.<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản