intTypePromotion=1

Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu Cryiab vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chia sẻ: Trinhthamhodang Trinhthamhodang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
35
lượt xem
1
download

Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu Cryiab vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và nồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinh MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500 mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi kháng chất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện của gen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây cà chua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi gen kháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip của công ty Envirologix (Mỹ).

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu Cryiab vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA<br /> (Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN<br /> Agrobacterium tumefaciens<br /> <br /> Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2<br /> (1)<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com<br /> (2)<br /> Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí Minh<br /> <br /> TÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon<br /> esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng<br /> như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb<br /> chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu<br /> tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và<br /> nồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổi<br /> được dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinh<br /> MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500<br /> mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi kháng<br /> chất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện của<br /> gen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây cà<br /> chua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi gen<br /> kháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip của<br /> công ty Envirologix (Mỹ).<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Lycopersicon esculentum, chuyển gen, plasmid, lá mầm, gen cryIA,<br /> PCR.<br /> <br /> MỞ ĐẦU al. (2009) [12]. Trong những nghiên cứu này, lá<br /> Cà chua là một loại rau ăn quả được trồng mầm và lá thật được dùng làm nguyên liệu cho<br /> rất phổ biến ở nhiều nước. Đây là loại rau quả việc chuyển gen cà chua thông qua vi khuẩn<br /> được ưa thích vì phẩm chất ngon và dễ chế biến. Agrobacterium tumefaciens. Theo hướng nghiên<br /> Tính đa dụng và nhu cầu tiêu thụ cà chua tươi cứu này, chúng tôi tiến hành chuyển gen kháng<br /> ngày càng lớn đã thúc đẩy sự phát triển cây cà sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon<br /> chua như một trong những loại cây trồng chính. esculentum Mill.) với hy vọng sự biểu hiện của<br /> Ngoài ra, trồng cà chua đã mang lại hiệu quả gen chuyển cryIA sẽ có tác dụng góp phần làm<br /> kinh tế khá cao. giảm tác hại của sâu hại cà chua.<br /> Ở Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, Vật liệu<br /> tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích,<br /> do đó cà chua là loại rau quả được khuyến khích Sử dụng giống cà chua vô hạn TN386,<br /> phát triển. Tuy nhiên, cà chua thường bị hại bởi TN148 của Công ty Trang Nông và giống Hồng<br /> sâu ăn lá, đục quả (Heliothis armigera và Châu của Công ty Sygenta.<br /> Spodoptera litura). Một số loại thuốc hóa học Phương pháp<br /> bảo vệ thực vật được áp dụng vào các giai đoạn Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy<br /> khác nhau của cà chua để bảo vệ cây trồng<br /> chống lại dịch hại. Tuy nhiên, dư lượng chất Môi trường gieo hạt là 1/2MS [10] không<br /> hóa học của các loại thuốc này có thể tác hại chất điều hòa sinh trưởng.<br /> đến người tiêu dùng. Môi trường tiền tái sinh là MS với vitamin<br /> Có nhiều báo cáo về nghiên cứu chuyển B5 [7] có các chất điều hòa sinh trưởng 0,1 mg/l<br /> gen trên cây cà chua như các tác giả Cortina et NAA, 1 mg/l BA.<br /> al. (2004) [2], Park et al. (2003) [11], Sarker et Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm là MS với<br /> <br /> 205<br /> Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> <br /> <br /> vitamin B5 có bổ sung các chất điều hòa sinh BA trong thời gian 2 ngày; 2. Gây nhiễm các<br /> trưởng 1 mg/l IAA, 2 mg/l BA. mẫu lá mầm với vi khuẩn trong thời gian 20<br /> Môi trường chọn lọc như môi trường tái phút; vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa<br /> sinh có 100 mg/L kanamycin và 500 mg/l bằng giấy lọc; 3. Nuôi chung mẫu lá mầm với vi<br /> cefotaxime. khuẩn trong 2 ngày; sử dụng môi trường như<br /> trên nhưng có 100 µM acetosyringone; 4. Rửa<br /> Môi trường ra rễ là MS. thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và dung dịch<br /> Điều kiện nuôi cấy trong 9 giờ chiếu kháng sinh 500 mg/l cefotaxime (kết hợp lắc<br /> sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC. nhẹ); 5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các<br /> Dòng vi khuẩn, môi trường và điều kiện mẫu lá mầm trên môi trường tái sinh có chọn<br /> nuôi cấy lọc. Thời gian nuôi 15 ngày/chu kỳ chọn lọc; 6.<br /> Khi xuất hiện chồi tái sinh (cao khoảng 1-2 cm)<br /> Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium cấy truyền sang môi trường MS không chất sinh<br /> tumefaciens EHA 105 mang plasmid trưởng đến khi vươn chồi tạo cây, thời gian nuôi<br /> pCAMBIA2301 chứa gen cryIAb, gen gusA (có khoảng 1 tháng.<br /> intron, promoter CaMV35S) và gen nptII (kháng<br /> kanamycin) với promoter CaMV35S. Môi trường Kiểm tra cây chuyển gen<br /> giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50 mg/l Thử GUS [6]: Dùng để kiểm tra sự biểu<br /> kanamycin. Để nhân giống cho nghiên cứu hiện của gen chỉ thị gusA mã hóa enzyme β-<br /> chuyển gen, vi khuẩn được nuôi lắc qua đêm glucoronidase trong mô tế bào thực vật chuyển<br /> trong môi trường AB [3] cũng có nồng độ gen. Lá mầm sau khi chuyển gen 4 ngày và chồi<br /> kanamycin như trên và 50 mg/l rifamycin. Nhiệt con tái sinh được ngâm trong dung dịch X-Gluc<br /> độ nuôi cấy ở 28oC. (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) ở<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn nhiệt độ 37oC trong 20 giờ thì loại bỏ dung dịch<br /> Agrobacterium tumefaciens với các nồng độ và thay bằng cồn 70% cho đến khi các điểm<br /> khác nhau đến khả năng chuyển gen xanh xuất hiện rõ ràng.<br /> Sử dụng dịch vi khuẩn Agrobacterium Phân tích bằng phương pháp sinh học phân<br /> tumefaciens với nồng độ OD ở bước sóng 600 tử PCR: Cây con sau khi tái sinh chọn lọc được<br /> nm là 0,5; 1 và 1,5 trong quá trình chuyển gen tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ lá theo phương<br /> với giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí pháp của Dellaporta et al. (1983) [4].<br /> chuyển gen, các mẫu lá mầm được nhuộm với Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb<br /> dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu. Gen<br /> gen thông qua biểu hiện của gen gusA. nptII: Mồi 1 (F): 5’-GCACA ACAGA CAATC -<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 3’, Mồi 2 (R): 5’-CCGCC AAGCT CTTCA - 3’;<br /> acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ<br /> Agrobacterium tumefaciens đến khả năng (94C: 1 phút, 58C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C:<br /> chuyển gen 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 600 bp. Gen<br /> Để nâng cao tần số chuyển gen cryIA(b) : Mồi 1 (F): 5’ - TTC CT T GGA CGA<br /> acetosyringone được sử dụng với các nồng độ 50, AAT CCC ACC - 3’, Mồi 2 (R): 5’ - GCC AGA<br /> 100 và 150 µM trong quá trình chuyển gen với ATT GAA CAC ATG AGC GC - 3’; chương<br /> giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí chuyển trình nhiệt: 94C: 4 phút; 35 chu kỳ (94C: 30<br /> gen các mẫu lá mầm được nhuộm với dung dịch giây, 54C: 60 giây, 72C: 1 phút 30 giây); 72C:<br /> X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển gen. 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 559 bp.<br /> Quy trình chuyển gen Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb: Kit của<br /> Các mẫu lá mầm 10 ngày tuổi từ cây in vitro Công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ) được<br /> được sử dụng làm vật liệu chuyển gen. sử dụng để phát hiện protein độc tố tạo ra bởi<br /> gen cry1Ab trong lá của cây cà chua chuyển<br /> Các bước chuyển gen: 1. Nuôi cấy lá mầm<br /> gen. Lá tươi của cây cà chua được nghiền trong<br /> trên môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l<br /> <br /> 206<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> tube lá mầm có phát triển bằng cách phình to ra sau 2<br /> 1,5 ml đến khi lá bị vỡ nát cho thêm dung dịch ngày, các lá mầm này được sử dụng làm nguyên<br /> tách chiết protein được cung cấp bởi công ty. liệu chuyển gen.<br /> Tiếp tục nghiền. Que thử được nhúng vào trong Nghiên cứu ảnh hưởng OD600nm của dịch nuôi<br /> tube khoảng 5 phút sẽ cho kết quả nếu có mặt vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả<br /> của độc tố tạo bởi gen cryIAb sẽ xuất hiện hai năng chuyển gen<br /> vạch (dương tính) trên que thử nếu chỉ có môt<br /> vạch là âm tính. Sau khi lá mầm giống cà chua TN 386<br /> được tạo vết thương và xâm nhiễm bởi vi khuẩn<br /> Các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn Agrobacterium tumefaciens mang<br /> ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Phần mềm MSTAT-C plasmidCAMBIA2301cryIAb và plasmid này<br /> được dùng để phân tích kết quả thí nghiệm. có mang gen gusA (gen chỉ thị) nên chúng tôi<br /> sử dụng biểu hiện của gen này để đánh giá kết<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> quả chuyển gen của thí nghiệm. Kết quả sau khi<br /> Giống cà chua TN 386 được dùng trong thí chuyển gen 4 ngày chúng tôi nhuộm các lá mần<br /> nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng để xem biểu hiện của gen GusA cho thấy mức<br /> chuyển gen. Theo tác giả Abida Yasmeen et al. độ chuyển gen thông qua biểu hiện của gen<br /> (2009) [1] nếu trước khi chuyển gen đặt lá mầm gusA gia tăng hay giảm tùy thuộc nồng độ của<br /> vào môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l dịch nuôi vi khuẩn phù hợp với miêu tả trước<br /> BA trong thời gian 2 ngày sẽ giúp tăng khả đây của tác giả Fillatti et al (1987) [5]. Biểu<br /> năng tái sinh và tần số chuyển gen nên trước khi hiện tạm thời cao nhất của gen gusA (hình 1)<br /> cho xử lí chuyển gen chúng tôi đặt lá mầm 10 khi OD600nm là 1,0 với tần suất là 40,55%, khi<br /> ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu và nuôi OD600nm là 0,5 thì biểu hiện của gen gusA cũng<br /> cấy trong môi trường này. Lá mầm đã được cắt giảm và khi OD600nm tăng là 1,5 thì biểu hiện<br /> ở phần đầu lá và phần cuống lá để tạo vết của gen gusA cũng không tăng theo chỉ số OD<br /> thương giúp vi khuẩn Agrobacterium (bảng 1).<br /> tumefaciens dễ dàng xâm nhiễm. Khoảng 80%<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Biểu hiện của gen gusA trên lá mầm<br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biểu hiện tạm<br /> thời của gen gusA<br /> Số lượng lá mầm xử lí Số lượng lá mầm biểu % lá mầm biểu hiện<br /> OD600nm<br /> chuyển gen hiện gen gusA gen gusA<br /> 0,5 30 6 b*<br /> 19,17  6,29<br /> 1,0 30 12 a<br /> 40,56  10,05<br /> 1,5 30 8 ab<br /> 26,67  2,89<br /> <br /> <br /> 207<br /> Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> <br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,05.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cho vào trong giai đoạn xử lý ngâm dung dịch<br /> acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với lá<br /> Agrobacterium tumefaciens đến khả năng mầm của giống cà chua TN386 ở các nồng độ<br /> chuyển gen 50, 100 và 150 µM. Kết quả cho thấy khi nồng<br /> Sự có mặt của acetosyringone làm tăng khả độ acetosyringone 100 µM sẽ cho tần số chuyển<br /> năng chuyển gen trên nhiều loại cây trồng trong gen cao nhất và khi tăng lên 150 µM sẽ làm<br /> đó có cà chua. Vì vậy, acetosyringone đã được giảm tần số chuyển gen (bảng 2).<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến khả năng biểu hiện tạm thời của gen gusA<br /> Số lượng lá mầm Số lượng lá mầm biểu % lá mầm biểu<br /> Nồng độ Acetosyringone<br /> xử lí chuyển gen hiện gen gusA hiện gen gusA<br /> b*<br /> 50 25 6 24,07  1,61<br /> a<br /> 100 25 9 36,11  2,41<br /> b<br /> 150 25 4 15,74  5,61<br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Biểu hiện của gen gusA Hình 3. Tái sinh chồi cà chua<br /> trên chồi cà chua trên môi trường chọn lọc<br /> <br /> Nghiên cứu chuyển gen cho thấy, khoảng 60% mẫu chồi giả định<br /> chuyển gen được kiểm tra gen gusA có những<br /> Lá mầm của các giống cà chua TN 386, đốm xanh chàm ở những mức độ đậm nhạt khác<br /> 148 và Hồng Châu sau khi xử lí chuyển gen nhau cho thấy, việc biểu hiện của gen gusA<br /> được đặt vào môi trường tái sinh chồi có bổ (hình 2) không đồng nhất trong các chồi chuyển<br /> sung chất chọn lọc 100 mg/l kanamycin, kết quả gen, trong khi đó, các mẫu không chuyển gen<br /> sau hai tuần một số lá mầm có mô sẹo phát triển thì không có vệt xanh nào. Đồng thời, tần số<br /> và tái sinh chồi sau 4-6 tuần trong khi các lá chuyển gen dựa trên khả năng tái sinh trong môi<br /> mầm đối chứng (không xử lí chuyển gen) hoàn trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin cho thấy<br /> toàn không phát triển mô sẹo và chồi sau 4 tuần rất phụ thuộc vào giống, các giống TN 386 và<br /> trong môi trường chọn lọc. Các chồi đã tái sinh TN148 khả năng tái sinh chồi tạo dòng kháng<br /> trên môi trường chọn lọc được chọn ngẫu nhiên kanamycin (hình 3) là 5,22% và 4,11% theo thứ<br /> để kiểm tra biểu hiện của gen gusA đồng thời tự, riêng với Hồng Châu, tỷ lệ tái sinh khá thấp<br /> quan sát trên chồi không chuyển gen. Kết quả 2,45% (bảng 3). Các chồi kháng kanamycin và<br /> <br /> <br /> 208<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> có biểu hiện gen gusA được cấy chuyền vào môi trường MS để chồi phát triển thành cây và ra rễ.<br /> Bảng 3. Tần số chuyển gen của lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số<br /> giống cà chua<br /> Giống Số lượng lá mầm Số lượng chồi tái sinh Phần trăm chồi tái sinh trên<br /> cà chua xử lí chuyển gen trên môi trường chọn lọc môi trường chọn lọc (%)<br /> a*<br /> TN 386 350 18 5,22  0,69<br /> ab<br /> TN148 350 14 4,11  0,84<br /> b<br /> Hồng Châu 250 6 2,45  0,43<br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.<br /> <br /> Phân tích PCR các gen nptII và cryIAb Kết quả PCR các gen cryIAb và nptII với các<br /> Các dòng chồi tái sinh và phát triển tốt trên cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của<br /> môi trường tái sinh có chất chọn lọc kanamycin các băng DNA được khuếch đại tương ứng là<br /> được tách chiết nhiễm sắc thể để kiểm tra sự 559 bp (hình 4) và 600 bp (hình 5) trong các<br /> hiện diện của gen chuyển bằng phản ứng PCR. dòng cà chua giả định chuyển gen.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. PCR gen cryIAb dương tính với băng Hình 5. PCR gen nptII dương tính với băng DNA<br /> DNA 559 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. 600 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. Đối<br /> ĐC dương (plasmid); 3. NC âm (cây không chứng dương (plasmid); 3. NC âm (cây không<br /> chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5. Cây chuyển gen. chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5: Cây chuyển gen.<br /> <br /> Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb gen trong khi mẫu đối chứng chỉ<br /> Chọn một ít dòng cây cà chua giả định<br /> chuyển gen phát triển tốt trên môi trường chọn<br /> lọc 100 mg/l kanamycin để kiểm tra biểu hiện<br /> của gen cryIAb thông qua bộ Kit của Công ty<br /> Envirologix Quickstix (Mỹ) bằng cách phát<br /> hiện protein độc tố tạo ra bởi gen cry1Ab trong<br /> lá của cây cà chua chuyển gen. Lá của cây giả<br /> định chuyển gen và đối chứng được nghiền<br /> trong dung dịch tách chiết protein, que thử được<br /> nhúng vào trong tube khoảng 5 phút cho kết quả<br /> sự có mặt của độc tố Bt (Bacillus thuringiensis)<br /> đã được khẳng định bằng sự xuất hiện hai vạch<br /> (dương tính) trên que thử cây cà chua chuyển<br /> <br /> <br /> 209<br /> Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> <br /> <br /> có một vạch (âm tính) (hình 6). Hình 6. Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb<br /> bằng que thử của Envirologix Quickstix<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> KẾT LUẬN 4. Dellaporta S., Wood J., Hicks J. B., 1983. A<br /> Qua nghiên cứu chuyển nạp gen nhờ vi plant DNA minipreparation: version II. Plant<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các Molecular Biology Reporter, 1(4): 19-21.<br /> giống cà chua, chúng tôi nhận thấy, nồng độ 5. Fillatti, JoAnne J., Kiser John, Rose Ronald,<br /> thích hợp cho vi khuẩn Agrobacterium Comai Luca, 1987. Efficient transfer of a<br /> tumefaciens trong quá trình xử lí chuyển gen là glyphosate tolerance gene into tomato using<br /> OD600nm bằng 1 và nồng độ acetosyringone cho a binary Agrobacterium tumefaciens vector.<br /> hiệu quả chuyển gen cao là 100 µM. Đã nhận Nature Biotechnology, 5(7): 726-730.<br /> được nhiều dòng cây cà chua mang gen nptII và<br /> 6. Jefferson R. A., Kavanagh T. A., Bevan B.<br /> cryIAb và sự có mặt của gen chuyển trong cây<br /> W., 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a<br /> đã được kiểm tra dương tính bằng phân tích<br /> sensitive and versatile gene fusion marker in<br /> PCR. Đồng thời biểu hiện của độc tố Bt đã được<br /> higher plants. EMBO, 6: 3901-3907.<br /> kiểm tra bằng que thử của công ty Envirologix<br /> Quickstix (Hoa Kỳ). 7. Gamborg O., Miller R., Ojima K., 1968.<br /> Nutrient requirement suspensions cultures<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO of soybean root cells. Experimental Cell<br /> Research, 50(1): 151-158.<br /> 1. Abida Yasmeen, 2009. An improved<br /> protocol for the regeneration and 8. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised<br /> transformation of tomato (cv Rio Grand), medium for rapid growth and bioassay with<br /> Acta. Physiol. Plant, 31: 1271-1277. tobacco tissue culture. Physiol. Plant, 15:<br /> 473-497.<br /> 2. Cortina C., Culiánez-Macià F. A., 2004.<br /> Tomato transformation and transgenic plant 9. Park S. H., Morris J. L., Park J. E., Hirschi<br /> production. Plant Cell, Tissue and Organ K. D., Smith R. H., 2003. Efficient and<br /> Culture, 76: 269-275. genotype-independent Agrobacterium-<br /> mediated tomato transformation. J. Plant<br /> 3. Chilton M. D., Currier T. C., Farrand S. K.,<br /> Physiol., 160: 1253-1257.<br /> Bendich A. J., Gordon M. P., Nester E. W.,<br /> 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and 10. Sarker R. H., Islam K., Hoque M. I., 2009.<br /> P58 bacteriophage DNA not detected in In vitro regeneration and Agrobacterium-<br /> crown gall tumours. Proc. Natl. Acad. Sci. mediated genetic transformation of tomato.<br /> USA, 71: 3672-3676. Plant Tissue Cult., 19(1): 101-111.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 210<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> A STUDY ON GENETIC TRANSFORMATION<br /> OF TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.) WITH AN INSECT<br /> RESISTANCE GENE CRY1AB BY Agrobacterium tumefaciens<br /> <br /> Le Tan Duc1, Pham Duc Tri1, Nguyen Huu Ho1 , Ha Tran Minh Dung1, Duong Thi Ngoc Thi2<br /> (1)<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> (2)<br /> Research and Development Center for Hi-tech Agriculture<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Damage caused by insects to crops is a major problem for the agricultural economy in the tropics. The<br /> main objective of this study was to transfer the gene cryIAb into tomato by using an Agrobacterium-mediated<br /> transformation method. Kanamycin was used as the transformant selectable agent. Agrobacterium tumefaciens<br /> strain EHA105, containing plasmidCAMBIA2301cryIAb that consists of kanamycin resistance gene, gusA<br /> gene and cry1Ab gene encoding for delta endotoxin of Bacillus thuringiensis, was used. Conditions such as<br /> bacterial concentration and concentration of acetosyringone were studied. For genetic transformation, the<br /> cotylendons were infected and co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens. After the 2 day co-<br /> cultivation, the cotylendons were washed by the cefotaxime solution and transferred to the MS medium<br /> containing IAA (0.5 mg/l), BA (2 mg/l) and kanamycin (100 mg/l) for selection. After a few weeks, putative<br /> transformed explants, able to grow on the kanamycin-containing medium, were transferred to MS medium for<br /> root development. Expression of GusA was detected by the X-glu substrate in the GUS assay. The presence of<br /> nptII and cry1Ab in the putative transformed tomatoes was confirmed by polymerase chain reaction analysis.<br /> Transgenic tomatoes were able to produce Bt endotoxin in the leaf tissue, revealed by the Envirologix<br /> Quickstix strip test.<br /> Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bacillus thuringiensis, Lycopersicon essculentum, genetic<br /> transformation.<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 211<br />
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2