Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng hệ vi sinh trong ruột tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Sóc Trăng bằng kỹ thuật metagenomics

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH

TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG

BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH

TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG

BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8.42.01.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. Chu Hoàng Hà

Hà Nội – 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự

hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà và TS. Nguyễn Trung Nam. Các nội dung

nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới

bất kỳ hình thức nào.

Luận văn sử dụng thông tin, số liệu và hình ảnh từ các bài báo và nguồn tài

liệu của các tác giả khác đều được chú thích và trích dẫn đầy đủ.

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung

luận văn.

Hà Nội, tháng 11 năm 2018

Học viên

Nguyễn Hồng Nhung

ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà và TS. Nguyễn

Trung Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn Ths. Lê Hoàng Đức, cùng tập thể cán bộ, nghiên cứu

sinh, học viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực

vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực

hiện luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và Ban đào tạo Viện Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời

gian học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ và chia sẻ, động

viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn.

Hà Nội, tháng 11 năm 2018

Học viên

Nguyễn Hồng Nhung

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................. v

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... viii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1. Giới thiệu ................................................................................................................. 1

2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2

NỘI DUNG ................................................................................................................. 3

Chương 1. Tổng quan tài liệu ...................................................................................... 3

1.1. Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng.............................................................. 3

1.1.1. Hệ thống phân loại, đặc điểm hình thái cấu tạo của tôm thẻ chân trắng ..... 3

1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái và tập tính của tôm thẻ chân trắng; phân

bố tự nhiên của tôm thẻ chân trắng ................................................................................... 4

1.2. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam ..................... 6

1.2.1. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam ................. 6

1.2.2. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi và các biện pháp phòng trừ bệnh trên

thế giới và Việt Nam ............................................................................................................. 8

1.3. Công nghệ metagenomics và hướng tiếp cận mới trong nuôi trồng và phòng trừ bệnh hại trên tôm nuôi ...................................................................................... 10

1.3.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics ............................................................. 10

1.3.2. Các nghiên cứu và thành tựu của công nghệ metagenomics trong lĩnh vực

thủy sản ................................................................................................................................... 13

1.3.3. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next generation sequencing –

NGS) và hệ thống giải trình gen thế hệ mới Illumina ................................................ 19

1.3.3.1. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới .......................................................... 19

1.3.3.2. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina ............................ 20

iv

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ...................................................... 24

2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 24

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 24

2.1.2. Hóa chất phục vụ nghiên cứu ................................................................................ 24

2.1.3. Thiết bị phục vụ nghiên cứu .................................................................................. 24

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 24

2.2.1. Phương pháp thu mẫu ............................................................................................. 25

2.2.2. Các phương pháp phân tích mẫu nước ............................................................... 25

2.2.3. Phương pháp tách ADN ......................................................................................... 25

2.2.4. Đánh giá chất lượng ADN tách chiết .................................................................. 33

2.2.5. Các phương pháp giải trình tự .............................................................................. 33

2.2.6. Xử lý số liệu giải trình tự gen ADN 16S rARN .............................................. 33

Chương 3. Kết quả và thảo luận ................................................................................ 35

3.1. Kết quả thu mẫu và đánh giá các chỉ tiêu môi trường .................................... 35

3.2. Kết quả tách ADN tổng số của các mẫu ruột, nước ....................................... 37

3.2.1. Kết quả tách ADN mẫu ruột .................................................................................. 38

3.2.2. Kết quả tách ADN mẫu nước ................................................................................ 41

3.3. Kết quả xác định trình tự metagenome ADN ................................................. 46

3.3.1. Xác định trình tự ADN metagenome .................................................................. 46

3.3.2. Kết quả phân tích đa dạng vi sinh vật mẫu ruột và nước .............................. 48

3.3.3. Thành phần vi khuẩn trong mẫu tôm thẻ khỏe mạnh và bệnh ..................... 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 56

1. Kết luận .............................................................................................................. 56

2. Đề nghị ............................................................................................................... 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 57

v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Acute Hepatopancreatic Chứng hoại tử gan tụy cấp AHPND

Necrosis Disease

Biochemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hóa sau 5 BOD5

ngày

Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa học COD

Early Mortality Syndrome Hội chứng chết sớm EMS

Food and Agriculture Tổ chức Lương thực và Nông FAO

Organization of the United nghiệp Liên Hiệp Quốc

Nations

Liên minh Nuôi trồng Thủy sản GAA Global Aquaculture Alliance Toàn cầu

Global Outlook for Hội nghị Dự báo Toàn cầu cho GOAL

Aquaculture Leadership Giới lãnh đạo Nuôi trồng Thủy

sản

Genomes OnLine Database GOLD

Monodon Baculovirus Bệnh còi do Monodon MBV

Baculovirus gây ra

Operational Taxonomic Units Đơn vị phân loài OTUs

Denaturing Gradient Gel Phương pháp PCR điện di gel PCR-DDGE

dải nồng độ biến tính Electrophoresis

Real time PCR rt-PCR

Shrimp hemocyte iridescent SHIV

virus

Total ammonia nitrogen Tổng đạm amôn TAN

The Aquaculture Roundtable Chuỗi Hội nghị bàn tròn về nuôi TARS

Series trồng thủy sản

Total Dissolved Solids Tổng chất rắn hòa tan TDS

Total nitrogen Tổng nitơ TN

Total phosphorus Tổng phospho TP

vi

Turbidity and suspendid solids Tổng chất rắn lơ lửng TSS

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Thông tin các vị trí thu mẫu ..................................................................... 35

Bảng 3.2. Kết quả phân tích các chỉ tiêu môi trường ao nuôi thu mẫu .................... 36

Bảng 3.3. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp ......... 39

Bảng 3.4. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp ......... 42

Bảng 3.5. Bảng mô tả bộ dữ liệu giải trình tự gen trên máy Illumina ...................... 48

Bảng 3.6. Các thông số giải trình tự và các chỉ số đa dạng phân tích ở các mẫu

nước, ruột của tôm thẻ bị bệnh và khỏe mạnh .......................................................... 49

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình thái tôm thẻ chân trắng ...................................................................... 3

Hình 1.2. Quy trình sản xuất tôm thẻ chân trắng (Nguồn: FAO) ............................... 6

Hình 1.3. Sản lượng tôm trên thế giới giai đoạn 1995-2017, dự báo đến năm 2019 . 7

Hình 1.4. Tổng sản lượng tôm đánh bắt và nuôi trồng (Nguồn: FAO) ...................... 7

Hình 1.5. Số liệu sản xuất ngành tôm năm 2017 ........................................................ 8

Hình 1.6. Xây dựng và sàng lọc thư viện metagenomics. ........................................ 12

Hình 2.1. Hình ảnh quá trình lọc nước qua các màng lọc có kích thước 8 µm, 0,8

µm và 0,22 µm. ......................................................................................................... 29

Hình 3.1. Hình ảnh ao nuôi tôm thu mẫu (A); và mẫu tôm khỏe (hình B, phải) và

mẫu tôm bệnh (hình B, trái) ...................................................................................... 35

Hình 3.2. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm sử dụng ba phương

pháp khác nhau .......................................................................................................... 39

Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu ruột tôm phục vụ

giải trình tự gen thế hệ mới ....................................................................................... 41

Hình 3.4. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm sử dụng ba phương

pháp khác nhau .......................................................................................................... 43

Hình 3.5. Hình ảnh điện đi metagenomic ADN của mẫu với nhiệt độ ly giải 95 và

70 độ .......................................................................................................................... 44

Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu nước phục vụ giải

trình tự gen thế hệ mới .............................................................................................. 46

Hình 3.7. Sơ đồ quy trình giải trình tự ADN metagenome ...................................... 47

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra thư viện ADN được gắn adapter của các mẫu bằng

Bioanalyzer................................................................................................................ 47

Hình 3.9. Sơ đồ quá trình phân tích dữ liệu 16S rARN ........................................... 48

Hình 3.10. Đường cong biểu diễn mối tương quan giữa số lượng trình tự và số

lượng OTU ở các mẫu ............................................................................................... 50

ix

Hình 3.11. Thành phần 10 ngành chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh

và khỏe mạnh ............................................................................................................ 51

Hình 3.12. Thành phần 10 lớp chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và

khỏe mạnh ................................................................................................................. 52

Hình 3.13. Thành phần 10 lớp chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và

khỏe mạnh ................................................................................................................. 52

Hình 3.14. Thành phần 10 chi chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và

khỏe mạnh ................................................................................................................. 53

Hình 3.15. Kết quả phân tích thành phần chính (PcoA) ở các mẫu nước và ruột tôm

thẻ .............................................................................................................................. 54

1

MỞ ĐẦU

1. Giới thiệu

Theo dự báo của GOAL 2018, đến năm 2020 Việt Nam sẽ vượt qua hai quốc

gia xuất khẩu tôm lớn ở châu Á là Ấn Độ và Indonexia để trở thành quốc gia xuất

khẩu tôm lớn thứ hai châu Á, sau Trung Quốc. Theo VASEP, sản lượng tôm ước tính

của Việt Nam vào năm 2019 có thể đạt 700.000 tấn. Diện tích nuôi trồng và sản lượng

liên tục tăng là dấu hiệu đáng mừng đối với ngành nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, sự

tăng trưởng này cũng đi kèm với sự gia tăng nhiều yếu tố rủi ro, trong đó, nan giải

nhất vẫn là vấn đề dịch bệnh trên tôm nuôi với diễn biến phức tạp qua các năm. Các

bệnh phổ biến trên tôm nuôi có thể kể đến là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND)

(hay bệnh chết sớm – EMS) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, hội chứng

đốm trắng (Bacterial White Spot Syndrome – BWSS) do vi khuẩn thuộc họ

Bacillaceae, bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do White spot syndrome

virus (WSSV) gây ra,…. Hiện nay kháng sinh được sử dụng phổ biến để kiểm soát

dịch bệnh. Tuy nhiên, từ việc phụ thuộc vào kháng sinh trước khi sử dụng các biện

pháp phòng trị bệnh khác đến việc sử dụng kháng sinh mất kiểm soát đã dẫn đến hiện

tượng kháng kháng sinh (ABR - antibiotic resistance). Cùng với đó, chính sách kiểm

duyệt vệ sinh an toàn thực phẩm đối với dư lượng chất kháng sinh trong sản phẩm

thủy sản của các thị trường nhập khẩu và tiêu thụ lớn như Mỹ, EU,… ngày càng chặt

chẽ và gắt gao đã đặt ra thách thức không nhỏ đối với ngành Nuôi trồng thủy sản Việt

Nam trong việc quản lý sử dụng và nghiên cứu đưa ra các biện pháp thay thế kháng

sinh trong phòng ngừa và điều trị các bệnh thủy sản. Một trong những hướng đi mới

và hiệu quả đã được nhiều quốc gia trên thế giới hướng tới là sử dụng các chế phẩm

probiotics. Tuy nhiên, sử dụng probiotics trong nuôi trồng thủy sản hầu hết đều dựa

vào kinh nghiệm thực hành [91]; hơn nữa, việc nuôi cấy, phân lập và tìm hiểu các cơ

chế tương tác giữa các vi sinh vật trong môi trường nuôi tôm còn gặp nhiều khó khăn,

từ đó dẫn đến việc các chế phẩm probiotics chưa thực sự phát huy được tiềm năng

hiệu quả của chúng.

Sự phát triển vượt bậc của Công nghệ gen trong những năm gần đây đã cho ra

đời nhiều công cụ kỹ thuật hữu ích. Trong đó, công nghệ metagenomics được xem là

2

sự tổng hợp sức mạnh và các thành tựu mới nhất của các công nghệ genomics, sinh

tin học, sinh học hệ thống. Công nghệ này cho phép tiếp cận và phân tích toàn bộ hệ

gen của quần xã sinh vật trong sinh cảnh nhất định và tìm hiểu mối quan hệ tương tác

giữa các thành phần vi sinh vật trong quần xã đó. Từ đó cho phép phát hiện sớm các

chủng vi sinh vật gây bệnh cũng như tìm được các chủng vi sinh vật hoặc các gen có

ích trong phòng ngừa và điều trị các bệnh thủy sản.

Xuất phát từ thực tiễn này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

đa dạng hệ vi sinh trong ruột tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Sóc Trăng bằng kỹ

thuật metagenomics”.

2. Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài nhằm:

- Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA metagenome phục vụ cho quá trình giải

trình tự gen hệ vi sinh vật đất và ruột tôm thẻ chân trắng.

- Đánh giá cấu trúc và đa dạng hệ vi sinh vật trong nước và ruột tôm thẻ chân

trắng thông qua phân tích cơ sở dữ liệu 16S rRNA metagenome.

- Xác định mối tương quan giữa hệ vi sinh vật trong nước nuôi tôm thẻ và hệ

vi sinh vật trong ruột tôm thẻ.

3

NỘI DUNG

Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.1. Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng

1.1.1. Hệ thống phân loại, đặc điểm hình thái cấu tạo của tôm thẻ chân trắng

Tôm thẻ chân trắng có tên khoa học là Litopenaeus vannamei (Boone, 1931),

tên tiếng anh là Pacific white shrimp, thuộc giống Litopenaeus, họ Penaeidae, bộ

Decapoda, lớp Malacostraca, ngành Arthropoda.

Tôm thẻ chân trắng có vỏ màu xanh lam, khi vỏ mỏng có màu trắng đục, chân

bò có màu trắng ngà (Hình 1.1.). Chùy là phần kéo dài tiếp với bụng. Dưới chùy có

2 – 4 răng cưa, đôi khi có tới 5 - 6 răng cưa ở phía bụng, các răng cưa này kéo dài,

đôi khi tới đốt thứ hai. Vỏ đầu ngực của tôm thẻ chân trắng có những gai gân và gai

râu rất rõ, không có gai mắt và gai đuôi (gai telssm), không có rãnh sau mắt, đường

gờ sau chuỳ khá dài đôi khi từ mép sau vỏ đầu ngực. Gờ bên chuỳ ngắn, chỉ kéo dài

tới gai thượng vị. Phần bụng của tôm có 6 đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rất

hẹp hoặc không có. Telsson (gai đuôi) không phân nhánh. Râu không có gai phụ và

chiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp. Xúc biện của hàm dưới thứ nhất thon

dài và thường có 3 - 4 hàng, phần cuối của xúc biện có hình roi. Gai gốc (basial) và

gai ischial nằm ở đốt thứ nhất chân ngực [3].

Hình 1.1. Hình thái tôm thẻ chân trắng (Nguồn: wikipedia)

4

1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái và tập tính của tôm thẻ chân trắng; phân bố

tự nhiên của tôm thẻ chân trắng

Đặc điểm sinh trưởng

Vòng đời của tôm thẻ chân trắng được chia làm 6 thời kỳ:

Thời kỳ phôi: bắt đầu từ khi trứng được thụ tinh đến khi trứng nở, bao gồm

nhiều giai đoạn đến khi phát triển thành phôi Nauplius.

Thời kỳ ấu trùng: bao gồm nhiều giai đoạn để ấu trùng tôm lột xác và biến thái

hoàn toàn:

Giai đoạn Nauplius (N): gồm 6 giai đoạn phụ tương ứng với 6 lần lột xác của

ấu trùng Nauplius, diễn ra trong khoảng 36-51 giờ, trong đó các Nauplius bơi từng

đoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàng,

không cần cho ăn.

Giai đoạn Zoea (Z): gồm 3 giai đoạn phụ, diễn ra trong khoảng 105- 120 giờ,

trong đó các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ hai lần, mỗi lần khoảng 36 giờ.

Ở giai đoạn này, ấu trùng Zoea bơi lội liên tục có định hướng, thẳng về phía trước và

ăn thực vật nổi bằng hình thức lọc.

Giai đoạn Mysis (M): gồm 3 giai đoạn, diễn ra trong 72 giờ, trong đó các Mysis

có đặc tính treo mình trong nước, đầu chúc xuống dưới, và ăn các động vật nổi hoặc

tảo silic bằng hình thức bắt mồi chủ động.

Giai đoạn Post-larvae (PL) (giai đoạn hậu ấu trùng): tôm thẻ đã có hình dạng

loài nhưng chưa hoàn thiện sắc tố, các Post-larvae hoạt động nhanh nhẹn, bắt mồi chủ

động với thức ăn chủ yếu là động vật nổi. Ở cuối giai đoạn này, các Post-larvae

chuyển sang sống đáy.

Thời kỳ ấu niên: ở thời kỳ này, hệ thống mang của tôm đã hoàn chỉnh, tôm

chuyển sang sống đáy hoàn toàn, bắt đầu bò bằng chân và bơi bằng chân bơi. Thời

kỳ này tương ứng với cuối giai đoạn tôm bột và đầu tôm giống trong sản xuất [3].

Thời kỳ thiếu niên: tôm bắt đầu ổn định tỷ lệ thân. Giai đoạn này tương đương

với giai đoạn ươm giống và nuôi thịt trong sản xuất.

5

Thời kỳ sắp trưởng thành: thời kỳ này tôm trưởng thành về mặt sinh dục và

thể hiện sự sinh trưởng không đồng đều một cách rõ rệt giữa hai giới tính, trong đó

con cái lớn nhanh hơn con đực.

Thời kỳ trưởng thành: tôm có khả năng tham gia sinh sản. Lúc này, tôm trưởng

thành sống ở vùng xa bờ nơi có độ trong cao và độ mặn ổn định [1].

Phân bố và tập tính

Trong tự nhiên, tôm thẻ chân trắng phân bố ở vùng ven bờ phía đông Thái

Bình Dương, từ biển Bắc peru đến nam Mexico và Equador. Ở vùng biển tự nhiên,

tôm chân trắng thích nghi sống nơi đáy là bùn, độ sâu khoảng 72 m, có thể sống ở độ

mặn trong phạm vi 5 - 50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28 - 34‰, pH = 7,7 - 8,3,

nhiệt độ thích hợp 25 - 32oC, tuy nhiên chúng có thể sống được ở nhiệt độ 12 - 28oC.

Tôm chân trắng là loài ăn tạp giống như những loài tôm khác. Song không đòi

hỏi thức ăn có hàm lượng đạm cao như tôm sú.

Tôm chân trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh, chúng lớn nhanh hơn tôm sú ở

tuổi thành niên. Trong điều kiện tự nhiên từ tôm bột đến tôm cỡ 40 g/con mất khoảng

thời gian 180 ngày hoặc từ 0,1 g có thể lớn tới 15 g trong giai đoạn 90 - 120 ngày.

Sinh sản

Tôm chân trắng thành thục sớm, con cái có khối lượng từ 30 - 45 g/con là có

thể tham gia sinh sản. Ở khu vực tự nhiên có tôm chân trắng phân bố thì quanh năm

đều bắt được tôm chân trắng. Song mùa sinh sản của tôm chân trắng ở vùng biển lại

có sự khác nhau ví dụ: ở ven biển phía Bắc Equađo tôm đẻ tử tháng 12 đến tháng 4.

Lượng trứng của mỗi vụ đẻ phụ thuộc vào cỡ tôm mẹ: Nếu tôm mẹ từ 30 - 45g thì

lượng trứng từ 100.000 - 250.000 trứng, đường kính trứng 0,22 mm.

Sau mỗi lần đẻ hết trứng, buồng trứng tôm lại phát triển tiếp. Thời gian giữa 2

lần đẻ cách nhau 2 - 3 ngày. Con đẻ nhiều nhất tới 10 lần/năm. Thường sau 3 - 4 lần

đẻ liên tục thì có lần lột vỏ. Sau khi đẻ 14 - 16 giờ trứng nở ra ấu trùng Nauplius. ấu

trùng Nauplius trải qua 6 giai đoạn: Zoea qua 3 giai đoạn, Mysis qua 3 giai đoạn

thành Postlarvae. Chiều dài của Postlarvae tôm P.Vannamei khoảng 0,88 - 3mm.

6

Hình 1.2. Quy trình sản xuất tôm thẻ chân trắng (Nguồn: FAO)

1.2. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam

1.2.1. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam

Tôm thẻ chân trắng bắt đầu được đánh bắt tự nhiên từ năm 1981 với sản lượng

khiêm tốn. Đến năm 1995 chúng mới bắt đầu được nuôi trồng và cho đến nay, đây là

loài tôm được nuôi phổ biến nhất. Theo thống kê của FAO (2018) và GOAL (2017),

tổng sản lượng tôm thẻ chân trắng đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng liên tục tăng qua

các năm, và tăng mạnh từ những năm 2000 đến nay (Hình 1.3) [22]. Đặc biệt, đối với

sản lượng tôm thẻ chân trắng nuôi trồng, có thể dễ dàng thấy được sự tăng trưởng

mạnh và đều qua các năm, và được dự doán là tiếp tục tăng trong năm 2019 (Hình

1.3). Trong báo cáo của FAO năm 2018, tính đến năm 2015, sản lượng tôm thẻ chân

7

trắng tự nhiên và nuôi trồng chiếm 47% tổng sản lượng tôm trên thế giới (2015) (Hình

1.4).

Hình 1.3. Sản lượng tôm trên thế giới giai đoạn 1995-2017, dự báo đến năm 2019

Hình 1.4. Tổng sản lượng tôm đánh bắt và nuôi trồng (Nguồn: FAO)

Các quốc gia dẫn đầu trong nuôi trồng và xuất khẩu tôm thẻ chân trắng có thể

kể đến là Trung Quốc, Ấn Độ, Ecuador, Việt Nam và Indonexia [22]. Theo thống kê

của FAO Fishery Stastistics, bắt đầu từ năm 2006, Việt Nam là một trong những nước

sản xuất tôm thẻ chân trắng chính trên toàn thế giới. Báo cáo của FAO (2018) chỉ ra

rằng trong suốt chín tháng (từ tháng 1 đến tháng 9) năm 2017, xuất khẩu tôm thẻ chân

8

trắng của Việt Nam đạt 390 000 tấn, tăng 11% so với cùng kỳ năm 2016. Thị trường

chính của tôm Việt Nam xuất khẩu là Trung Quốc (chiểm 50-60% tổng lượng tôm

xuất khẩu), tiếp đến là Mỹ, EU28, Nhật Bản, và Hàn Quốc.

Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổng cục thủy sản, diện tích nuôi tôm nước

lợ trong năm 2017 cả nước đạt 721,1 nghìn ha; tăng 3,8% so với năm 2016 trong đó

diện tích tôm chân trắng là 98,7 nghìn ha; tăng 4,7% so với năm 2016; và sản lượng

tôm nước lợ năm 2017 đạt 683,4 nghìn tấn, tăng 4% so với năm 2016 trong đó sản

lượng tôm chân trắng 427 nghìn tấn, tăng 8,5% so với năm 2016 (Hình 1.5.). Và theo

thống kê sơ bộ mới nhất của Tổng cục thủy sản, trong chín tháng đầu năm 2018, diện

tích nuôi tôm nước lợ đạt 701.302 ha (tăng 0,7% so với cùng kỳ năm 2017), sản lượng

nuôi đạt 509.400 tấn (tăng 8,0% so với cùng kỳ năm 2017).

Hình 1.5. Số liệu sản xuất ngành tôm năm 2017

(Nguồn: Tổng cục Thủy sản Việt Nam - 2017)

1.2.2. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi và các biện pháp phòng trừ bệnh trên thế

giới và Việt Nam

9

Theo đánh giá của GAA qua các năm, vấn đề bệnh và dịch bệnh trên tôm luôn

là vấn đề thách thức đối với sự phát triển bền vững của sản xuất tôm nuôi. Năm 1987

và 1988 sự bùng phát của bệnh gan tụy (MBV) tại Đài Loan gây thiệt hại nghiêm

trọng cho nghề nuôi tôm sú [14]. Tại Trung Quốc, sự bùng phát của dịch bệnh đốm

trắng vào năm 1992 làm sụt giảm nghiêm trọng sản lượng tôm sú nuôi trồng, và kéo

dài đến năm 2000. Bệnh này cũng gây thiệt hại tới năng suất tôm nuôi ở Thái Lan và

Ấn Độ trong giai đoạn 1995-2003 [37]. Sự phục hồi sản lượng tôm nuôi trồng được

thu nhận từ năm 2003 với sự xuất hiện của tôm thẻ chân trắng. Tuy nhiên, theo khảo

sát của GOAL, sản lượng trong năm 2012 giảm xuống còn 3,4 triệu tấn (giảm 5%

so với năm 2011) do tác động của hội chứng tôm chết sớm (EMS) hay là hội chứng

hoại tử gan tụy cấp tính ở Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam và Malaysia. Gần đây

nhất, trong Chuỗi Hội nghị Bàn tròn Nuôi trồng thủy sản gần đây (TARS) ở Chang

Mai, Thái Lan, bệnh SHIV - căn bệnh do virus gây ra, lần đầu tiên được phát hiện và

xác định trong mẫu tôm tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei được thu thập từ

một trang trại ở tỉnh Chiết Giang, Trung Quốc, vào tháng 12 năm 2014, đã được báo

cáo là “sát thủ” đối với tôm đã xuất hiện và hoành hành ở Trung Quốc, và cũng xuất

hiện ở một số quốc gia khác có sản lượng tôm thẻ chân trắng nuôi trồng lớn như Ấn

Độ, Việt Nam; và các thông tin liên quan đến tác nhân gây bệnh – SHIV mới chỉ được

nghiên cứu ở mức độ xác định đặc điểm [56], [57], phát hiện và định lượng bằng rt-

PCR hoặc bằng hệ thống SHIV RT-PCR/POCKITTM system và giải trình tự toàn bộ

hệ gen của loại virus này [55].

Tại Việt Nam, Theo báo cáo về tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi của Tổng

cục Thủy sản, trong 6 tháng đầu năm 2017 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt

hại là 11.430 ha, chiếm 1,89% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước. Trong đó, tổng

diện tích tôm nuôi bị bệnh là 4.165,78 ha, chiếm 36.4% (các bệnh trên tôm nuôi: bệnh

đốm trắng 14%, bệnh hoại tử gan tụy cấp 14%, bệnh đỏ thân, còi, phân trắng... chiếm

8%) tổng diện tích bị thiệt hại; không xác định nguyên nhân 4.745 ha, chiếm 41,6%;

do biến đổi môi trường, thời tiết là 2.519 ha, chiếm 22,0 %.

Thống kê hàng năm của GAA đều chỉ ra rằng, bệnh trên tôm luôn là thách thức

lớn đối với ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản nói chung và ngành công nghiệp

10

nuôi tôm nói riêng. Và các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh trên tôm để nhằm

giảm thiểu đến mức thấp nhất thiệt hại trên tôm nuôi trồng đã được đưa ra. Trong số

đó, kháng sinh được sử dụng như là một loại thuốc quan trọng trong điều trị các bệnh

nhiễm khuẩn, xử lý, cải tạo môi trường. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh với mức

độ cao trong nuôi tôm đã làm gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn.

Theo Phuong và cs (2006); Dang và cs (2007), kết quả điều tra thực địa đã chỉ ra

enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, oxolinic acid và flumequin,

sulfamethoxazole và oxytetracycline là các loại kháng sinh đang được sử dụng phổ

biến trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam [18], [54]. Cùng với đó, yêu cầu ngày càng

cao trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đối với các sản phẩm thủy sản về dư

lượng kháng sinh, hóa chất của các nước nhập khẩu đã đặt ra thách thức cho các nước

nuôi trồng thủy sản, trong đó có Việt Nam. Theo Nguyễn Quốc Ân (2009),

chloramphenicol hoặc các kháng sinh khác như oxytetracycline, sulfamethazone,

enrofloxacine, ciprofloxacin, flofenicol, trimethoprim… đã được phát hiện trong một

số lô hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam [2]. Vì vậy, trong những năm gần đây,

các biện pháp nuôi trồng sử dụng các chế phẩm sinh học đang được khuyển cáo và

khuyến khích sử dụng. Các nghiên cứu của Moriarty (1999), Farzanfar (2006) đã đề

xuất bổ sung các chủng khuẩn Bacillus spp., Lactobacillus spp. vào các chế phẩm

sinh học để kiểm soát và cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh [23], [50]. Nghiên cứu của

Balcázar (2007) và Liu (2010) đã đề cập đến vai trò của chủng vi khuẩn Bacillus

subtilis trong việc chống lại các chủng vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh chết sớm (EMS)

hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng giống [6], [43].

1.3. Công nghệ metagenomics và hướng tiếp cận mới trong nuôi trồng và phòng

trừ bệnh hại trên tôm nuôi

1.3.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics

Công nghệ metagenomics được xem là sự tổng hợp sức mạnh và các thành tựu

mới nhất của các công nghệ genomics, tin sinh học, sinh học hệ thống. Công cụ

genomics cho phép nghiên cứu hệ gen trong từng cá thể đơn lẻ, tuy nhiên khi áp dụng

trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật sẽ gặp phải những hạn chế sau: (i) Hầu hết các vi

sinh vật là không nuôi cấy được. Vi sinh vật trên hành tinh ước tính có 1030 loại, trong

11

đó số lượng sinh vật có thể nuôi cấy được chỉ chiếm 0,1-1% tùy theo từng môi trường

sinh thái); (ii) tính đa dạng của sinh vật trong hệ sinh thái và khả năng biến dị di

truyền xảy ra không ngừng để thích nghi nhanh chóng với những thay đổi của môi

trường sinh thái để đảm bảo cân bằng sinh thái bền vững.

Trong khi đó, công nghệ metagenomics là một bước tiến xa hơn trong nghiên

cứu hệ gen, cho phép phân tích hệ gen của cả quần xã sinh vật trong một khu hệ sinh

thái để con người có thể hiểu được bức tranh tổng thể về: (i) Mức độ phức tạp của

các sinh vật trong một khu hệ sinh thái nhất định như quần xã sinh vật có mặt trong

đường hô hấp, trong hệ tiêu hóa, tiết niệu của các nhóm người mắc các nhóm bệnh

khác nhau; sinh vật trong nước biển, trong các môi trường khắc nghiệt, cực đoan,…;

(ii) mối tương tác giữa các sinh vật trong một môi trường để đảm bảo tính bền vững

của hệ sinh thái, mối tương tác giữa các sinh vật để con người chống lại bệnh tật, tái

tạo lại môi trường xanh, sạch; (iii) và từ những hiểu biết tổng thể về đặc điểm di

truyền của quần xã sinh vật, cùng với metabolomics, metaproteomics và công cụ tin

sinh học, con người có thể học tập được các qui trình trao đổi chất, qui trình chuyển

hóa đảm bảo cân bằng sinh thái, môi trường và khai thác được nhiều nguồn gen mã

hóa cho các tính trạng quí, hiếm, phục vụ đắc lực cho đảm bảo sức khỏe cộng đồng,

nâng cao chất lượng cuộc sống, đảm bảo an ninh quốc gia, năng lượng và giữ được

trái đất xanh sạch chống lại biến đổi khí hậu toàn cầu đang đe dọa đến toàn nhân loại.

Về cơ bản, công nghệ Metagenomics bao gồm hai hướng chính: (i) Sàng lọc

thư viện metagenome dựa vào hoạt tính sinh học; (ii) Sàng lọc thư viện metagenome

dựa vào xác định trình tự nucleotid.

Cả hai hướng nghiên cứu này đều phải tiến hành tách chiết các phân tử di

truyền từ mẫu môi trường. Tùy theo mục đích mà Metagenomic ADN hay

Metagenomic ARN được tách chiết. Để khảo sát quần thể virus xâm nhiễm ở đường

mũi họng hoặc trong hệ tiêu hóa, Metagenomic ARN sẽ được tách chiết còn để khảo

sát vi sinh vật và đa dạng vi sinh vật thì Metagenomic ADN sẽ được tách chiết.

Metagenomic ADN sẽ được giải trình tự trực tiếp để có được bức tranh tổng thể về

quần xã sinh vật, toàn bộ các gen có trong đó và đây là bước định hướng cho các nhà

nghiên cứu đi khai thác các nguồn gen khác nhau hoặc khai thác con đường chuyển

12

hóa sinh học. Ngoài ra, từ nguồn metagenome đã tách được, các nhà khoa học có thể

tạo thư viện metagenome và thư viện này được chuyển vào các vật chủ tương thích

để sàng lọc các dòng có được hoạt tính sinh học mong muốn như sàng lọc các enzyme

mới, các chất kháng sinh mới, con đường chuyển hóa các chất độc hại hoặc nhận biết

các chất có khả năng dùng làm thuốc. Toàn bộ kỹ thuật có liên quan đến công nghệ

metagenomics được mô tả ở Hình 1.6.

Hình 1.6. Xây dựng và sàng lọc thư viện metagenomics.

Mặc dù các công cụ giải trình tự metagnome mới phát triển mạnh mẽ trong vài

năm gần đây nhưng các nhà khoa học đã nhen nhóm, ấp ủ các nghiên cứu về

metagenomics trong vòng 20 năm qua. Theo thống kê của GOLD, các nhà khoa học

đã nhận biết được có tới 7338 glycosyl hydrolase giả định. Gene mã hóa cho enzyme

này chiếm tới 1,5 % trong tổng số gene tương đồng thu được từ các dự án

metagenomics ở đối tượng VSV của mối, người và đường ruột của chuột. Trong đó

13

13 họ glycosyl hydrolase tương đồng là gene chiếm ưu thế trong các hệ metagenome.

Các chất xúc tác sinh học mới được phát hiện với số lượng lớn nhờ các công cụ giải

trình tự metatranscriptomics [79]. Và theo GOLD, tính đến tháng 10/2018, trên thế

giới có 33.475 dự án phân tích metagenome đã và đang được thực hiện.

Hiện tại, công nghệ Metagenomics đã và đang được sử dụng như một công cụ

hữu hiệu vào các lĩnh vực chủ yếu sau: (1) tái tạo môi trường; (2) sàng lọc các sản

phẩm cho công nghiệp; (3) sàng lọc các phân tử dùng làm thuốc; (4) ứng dụng trong

lĩnh vực y tế; (5) tìm ra mối tương tác giữa vi sinh vật và cây trồng, bảo vệ thực vật

như tìm ra mối tương tác giữa các sinh vật, quần xã sinh vật để đảm bảo cơ thể khỏe

mạnh, chống lại vi khuẩn, virus gây bệnh; (6) phát triển hệ sinh thái bền vững, chống

lại biến đổi khí hậu toàn cầu.

1.3.2. Các nghiên cứu và thành tựu của công nghệ metagenomics trong lĩnh vực thủy

sản

Chúng ta phải chấp nhận một thực tế là 99% vi sinh vật trong hệ sinh thái vi

sinh vẫn chưa được nuôi cấy và đây là một hạn chế chủ yếu trong việc tìm kiếm các

gene, enzyme và các chất có hoạt tính sinh học mới cũng như nghiên cứu sinh lý, khả

năng trao đổi chất và vai trò của chúng trong môi trường [7], [59], [62]. Cuối những

năm 1980, các phân tích trực tiếp từ trình tự rARN đã chỉ ra phần lớn vi sinh vật có

mặt trong môi trường chưa được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy [30]. Phát hiện

này cùng với những tiến bộ trong phương pháp tách chiết, tinh sạch ADN từ môi

trường và công nghệ xác định trình tự ADN đã đẩy nhanh tốc độ phát triển của các

nghiên cứu di truyền quần thể vi sinh vật hỗn hợp [29], [44]. 16S ribosomal

DNA/RNA (rADN/rARN) đã được sử dụng rộng rãi trong việc phân loại vi sinh vật

chưa được phân lập (nuôi cấy) trong môi trường [76]. Những nghiên cứu dựa trên chỉ

số này thực sự đã định nghĩa lại và mở rộng tầm hiểu biết của chúng ta về đa dạng

sinh học, sinh thái vi sinh và tiến hóa [45]. Một tính toán đơn giản về đa dạng sinh

học của vi sinh vật đất giao động từ 3.000 đến 11.000 genome trên một gam đất,

nhưng chỉ với 1% trong số đó đã được nuôi cấy [17], [69], [70]. Phân tích vi sinh vật

đất được nuôi cấy đã phát hiện ra một nguồn dồi dào các hợp chất có ý nghĩa trong y

tế như chất kháng sinh, nhân tố kháng ung thư, chất ức chế miễn dịch [53] và rất

14

nhiều các sản phẩm có ý nghĩa công nghệ sinh học khác [34], [58], [65], [71]. Tuy

nhiên, phương pháp tiếp cận phụ thuộc vào vi sinh vật nuôi cấy bị giới hạn vì đa số

vi sinh vật đất không thể nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy thông thường trong phòng

thí nghiệm. Một khối lượng khổng lồ thông tin di truyền vẫn còn nằm trong vi sinh

vật chưa được nuôi cấy và metagenomics là công nghệ chìa khóa để xâm nhập vào

nguồn tài nguyên quý giá và giàu tiềm năng này [30], [52]. Phương pháp tiếp cận này

cho phép nghiên cứu sự đa dạng di truyền phổ rộng của mỗi gene đơn và các sản

phẩm của nó cũng như là phân tích toàn bộ operon mã hóa cho các con đường sinh

tổng hợp hoặc phân giải. Metagenomics cho phép chúng ta trả lời các câu hỏi chìa

khóa về hệ sinh thái vi sinh nhờ việc kết nối chức năng tiềm tàng tới các vi sinh vật

đặc biệt trong các quần thể vi sinh vật đất đa loài.

Trong số các phương pháp được thiết kế để thâm nhập ở mức độ di truyền của

vi sinh vật chưa được nuôi cấy, thì metagenomics nổi lên như một công cụ hữu hiệu

nhất. Thuận lợi của phương pháp này là phân tích dựa trên trình tự và chức năng trong

các mẫu nghiên cứu từ nước, đất và vật chủ eukaryotes. Ý tưởng cloning trực tiếp

ADN từ mẫu môi trường lần đầu tiên được đề xuất bởi Schmidt (1991) và tiếp theo

là việc xây dựng các thư viện metagenomics ADN từ hỗn hợp vi sinh vật được làm

giàu từ cỏ khô trong phòng thí nghiệm. Sau đó là các thư viện prokaryotes từ nước

biển [63]. Một clone có kích thước 40 kb được xác định từ thư viện này có chứa gene

16S rARN có nguồn gốc từ vi khuẩn cổ chưa được nuôi cấy trước đây [30]. Các kết

quả nghiên cứu metagenomics hệ vi sinh vật từ bọt biển đã chỉ ra rằng chúng mang

các gene và nhóm gene đặc biệt cho việc tổng hợp các chất tự nhiên có hoạt tính sinh

học [38]. Một số lipase mới cũng được phát hiện và phân tích từ việc sàng lọc thư

viện metagenomics [31], [44]. Năm 2007, Martin-Cuadrado và cộng sự đã xây dựng

thư viện metagenomic của fosmid từ các sinh vật phù du sâu 3000 m ở biển

Mediterranean. Kết quả phân tích 16S rARN cho thấy cấu trúc quần thể này tương

đồng với quần thể được tìm thấy trong đới thiếu ánh sáng của Thái Bình Dương. Gene

liên quan đến trao đổi chất, vận chuyển, phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp cũng

có sự tương đồng với hệ sinh vật dị dưỡng ở các vùng biển sâu. Gilbert và cộng sự

(2010) đã phân tích dữ liệu metagenomics và metatranscriptomics ở nước bề mặt ở

15

trạm quan trắc Western Channel Observatory (Mỹ) [28]. Kết quả cho thấy cấu trúc

theo mùa của các phức hệ vi sinh vật với sự đa dạng tương quan với độ dài của ngày.

Nhóm tác giả đã tạo ra 8 metagenomes (4.5 triệu trình tự, 1,9 Gbp, với khung đọc

trung bình khoảng 350 bp) và 7 metatranscriptomes (392.632 trình tự mARN, 159

Mbp, với khung đọc trung bình khoảng 272 bp). Dữ liệu này đã chứng minh được sự

khác biệt rõ ràng giữa tiềm năng di truyền và thực tế. Quần thể vi sinh vật trên bề mặt

của con trai (Mytilus californianus) ở đảo Tatoosh (Washington) cũng đã được Pfister

và cộng sự (2010) nghiên cứu để kiểm tra sự có mặt của hệ vi sinh vật nitơ [53]. Kết

quả phân tích trình tự của khoảng 31 triệu bp từ 6 mẫu trai đã chỉ ra một sự đa dạng

phong phú của các quần thể vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Một phần trăm protein được

xác định từ mỗi mẫu có liên quan đến chu trình nitơ, vượt xa so với các mẫu

metagenomics từ nước biển. Đĩa Hirudo verbana, loài động vật có ý nghĩa trong y

học, cũng đã được Bomar và cộng sự (2011) sử dụng công nghệ metatranscriptomics

để nghiên cứu phức hệ vi sinh vật trong ruột của chúng [7]. Thông tin phân tích dữ

liệu từ nghiên cứu này đã được sử dụng để thiết kế các loại môi trường tối ưu để nuôi

cấy một số vi sinh vật có ý nghĩa y học trong ruột của chúng. Thông qua việc nuôi cấy

này, một số enzyme và protein có giá trị đã được phân lập và xác định hoạt tính. Ghai

và cộng sự (2011) lần đầu tiên nghiên cứu hệ vi sinh vật ở sông Amazon sử dụng công

nghệ metagenomics [27]. Kết quả phân tích đã chỉ ra rất nhiều đặc điểm chung với các

phức hệ vi sinh vật trong các vùng nước ngọt khác (Hồ Gatun ở Panama), tuy nhiên có

rất ít tương đồng với các mẫu được thu từ biển.

Hơn hai thập kỷ qua, vi sinh vật trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản cũng

đã được nghiên cứu để điều chỉnh, tác động và kiểm soát các hệ thống này. Vi sinh

vật rất phong phú trong hệ sinh thái nuôi trồng thủy sản và phát tán cả chiều rộng và

chiều sâu trong tất cả các hệ thống nuôi trồng thủy sản cũng như bề mặt trầm tích. Hệ

vi sinh vật này cũng đóng một vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa hóa ở quy

mô nhỏ và toàn cầu, cấu trúc quần thể, di chuyển gene, sự tiến hóa của sinh vật biển…

thậm chí là trong chu kỳ carbon, chu kỳ dinh dưỡng của các vật liệu hữu cơ. Các

nghiên cứu metagenomics cho thấy có những nhóm phân bố toàn cầu, nhưng genome

của chúng chứa đựng thông tin về trình tự không tương đồng với các trình tự đang

16

tồn tại trong các cơ sở dữ liệu tin sinh học [35], [40], [51], [80]. Phân tích dữ liệu

trình tự metagenomics vi sinh vật từ chương trình thám hiểm đại dương (GOS),

Williamson và cộng sự (2008) đã phát hiện ra một sự phong phú về nguồn gene virus,

khoảng 3% trong tổng số protein được dự đoán, trong đó có hàng nghìn gene mã hóa

cho các chức năng tế bào và trao đổi chất khác nhau [80]. Djikeng và cộng sự (2009)

nghiên cứu ARN virus trong hồ nước ngọt Lake Needwood, Maryland, USA đã chỉ

ra rằng, cũng giống như các nghiên cứu về môi trường trong các thủy vực khác, phần

lớn trình tự axit nucleic được phát hiện không chỉ ra sự khác biệt ý nghĩa với các trình

tự đã biết [20]. Tuy nhiên, các trình tự còn lại chỉ giống nhau khoảng 30%. Từ kết

quả này, nhóm tác giả giả thuyết rằng các virus mới này có thể nhiễm vào các vật chủ

khác nhau như thực vật, côn trùng, cá, vật nuôi và con người. Trong số đó có các virus

dsARN chưa từng được xác định. Kết quả nghiên cứu này cũng đưa ra giả thuyết do sự

tiếp xúc trực tiếp của con người, vật nuôi và động vật, hệ sinh thái nước ngọt có thể là

một nguồn đa dạng virus (cả gây bệnh và không gây bệnh) và có thể là một nguồn phát

sinh các đại dịch. Bên cạnh đó virus trong các nguồn khác cũng đã được nghiên cứu

chi tiết, điển hình là năm 2011, Park và cộng sự đã sử dụng công nghệ metagenomics

và pyrosequencing để phân tích quần thể virus chưa được nuôi cấy từ ba nguồn thức ăn

lên men là tôm, kimchi và dưa cải [51]. Kết quả thu được 81.831 trình tự virus từ mẫu

tôm, 70.591 trình tự từ mẫu kimchi và 69.464 trình tự từ mẫu dưa. Kết quả nghiên cứu

này cho thấy thực phẩm lên men có chứa ít phức hệ virus hơn các quần thể trong môi

trường sống khác như nước biển, trầm tích biển và đất.Trong tổng kết của Alavandi và

Poornima (2012), nhiều virus mới đã được phát hiện gần đây trong các lĩnh vực sinh

học biển sử dụng công nghệ metagenomics [4]. Từ đó đã có một số phát hiện mới

như loài picornavirus (SePV1) chỉ có 19.3-30.0% trình tự protein tương đồng trong

3D polymerase của SePV1 so với những picornavirus khác thường xuất hiện trên loài

Phoca hispida, một loài động vật có vú ở Bắc cực. Tornovirus trên rùa biển (WTTV1)

và anellovirus trên hải cẩu California (ZcAV) có một sự tương đồng trong trình tự

genome rất ít so với những virus đã được xác định trước đó. SWTV1 được phát hiện

từ fibropapilloma ở một con rùa biển Florida, có genome mạch đơn gồm 1.800

nucleotide với sự tương đồng amino acid rất thấp so với virus gây thiếu máu gà

17

(chicken anemia virus) . ZcAV là một anellovirus phát hiện trong phổi của một con

hải cẩu California chết vì bệnh phổi, có một genome mạch chuỗi đơn gồm 2.140

nucleotide với 35% trình tự amino acid trên ORF1 giống với anellovirus ở mèo. Gần

đây, một circovirus và hai nodavirus mới đã được phát hiện trên loài tôm hoang dại

Penaeus duorum ở Florida sử dụng công nghệ metagenomic giải trình tự ADN và

ARN của những loài virus này. Circovirus ở trên tôm có genome ADN dài 1955

nucleotide và chỉ tương đồng 50% khi so với bất kỳ loài virus nào trên ngân hàng

gen. Tất cả các loài circovirus được biết trước đó đều gây bệnh trên chim, lợn, và có

nhánh phân loại riêng biệt so với các circovirus trên gia cầm hay lợn, làm cho loài

circovirus trên tôm được xem là loài mới lần đầu tiên phát hiện trên một động vật

không xương sống. Hai loài nodavirus mới, có độ tương đồng amino acid nhỏ hơn

60% so với các nodavirus khác, được xem là những loài virus mới, cũng đã được phát

hiện trên tôm. Trong một mô hình nuôi thủy sản của Sritunyalucksana và cộng sự, họ

đã sử dụng metagenomics để xác định trình tự loài Laem Singh virus (LSNV) kết hợp

với hội chứng sinh trưởng kém của loài tôm sú và virus mới đã được xem là một ARN

virus có độ tương đồng trình tự amino acid thấp trong RNA-dependent RNA

polymerases (RdRp) so với những virus khác trong họ Luteoviridae. Theo Min-Soo

Kim và cs (2013), ngày càng có nhiều các nghiên cứu về metagenomic virus kể từ

khi có những hướng nghiên cứu mới mở ra như sinh thái virus với hơn 200 công trình

(61 bài tổng quan) đã được xuất bản [48]. Phân tích trình tự nucleotide thu được từ

metagenomics cho thấy rằng phần lớn các trình tự trong metagenome của virus biển

là không giống với bất kỳ gen nào trong ngân hàng gen. Như vậy, có rất nhiều các

virus trong môi trường sống còn chưa được xác định. Cyrielle Jan và cs (2014) đã sử

dụng công nghệ metagenomics để phân loại đa dạng ở mức độ họ hoặc cao hơn từ

mẫu tôm thu tại ngư trường dòng hải lưu nước ấm Rainbow dựa trên trình tự 16S

rARN cho thấy rằng một số lượng lớn các trình tự này có thể xếp vào nhóm vi khuẩn

(84%), còn lại có thể là Eukarya (14%, có thể là R. exoculata) và Archaea (2%). Hầu

hết các vi khuẩn được xếp vào nhóm Proteobacteria (78%), bao gồm

Epsilonproteobacteria (39%), Gammaproteobacteria (30%), Alphaproteobacteria

(4%), Zetaproteobacteria (2.2%), Betaproteobacteria (1.6%) và Deltaproteobacteria

18

(1.0%). Nghiên cứu các gen chức năng từ cơ sở dữ liệu metagenomics này đã cho

thấy có nhiều gen tham gia vào các quá trình cố định carbon, chuyển hóa sulfur, sắt,

đồng hóa nitrogen, khử nitrate …giúp cho việc cải thiện môi trường, tạo nguồn dinh

dưỡng cho tôm.

Sử dụng kỹ thuật công nghệ metagenomics, cấu trúc hệ vi sinh vật trong nhiều

mô hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới đã được xác định như nuôi tôm hùm đá

nhiệt đới (Panulirus ornatus) ở Australia in Australia, tôm thẻ chân trắng (L.

vannamei) ở Mỹ; tôm sú châu Á (L. monodon) ở Thái Lan; cá Tuyết Atlantic (G.

morhua L.) ở Nauy; cá chép cỏ (C. idellus), tôm (L. vannamei, P. orientalis), bào ngư

(H. diversicolor) ở Trung Quốc [36], [61], [73], [84], [85].

Công nghệ metagenomics cũng đã được sử dụng để xác định sự đa dạng quần

xã sinh vật trong môi trường nước nuôi tôm, sự khác biệt về thành phần vi sinh vật

của tôm khai thác tự nhiên và tôm nuôi trồng, đặc điểm thành phần vi sinh vật ruột

tôm và chế độ ăn cho tôm thẻ chân trắng [25], [32], [68], [85]. Năm 2014, Yuyi và cs

đã nghiên cứu hệ vi sinh vật trong hệ thống đầm nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus

vannamei) [83]. Kết quả phân tích 18.427 đoạn trình tự đã cho thấy nhóm vi khẩn

chiếm ưu thế thu từ vùng nước ấm là Actinobacteria, vi khuẩn không xác định,

Proteobacteria và Bacteroidetes, tương ứng 53,5%, 22,4%, 18,8% và 4,32%. Nhóm

các vi khuẩn chiếm thiểu số bao gồm Cyanobacteria/Chloroplast (0,289%),

Firmicutes (0,265%), Gemmatimonadetes (0,203%) và Acidobacteria (0,109%),

Fibrobacteres (0,0078%), Fusobacteria (0,0055%), Spirochaetes (0,0078%), và

Verrucomicrobia (0,0078%). Trong khi đó, nhóm vi khẩn chiếm ưu thế thu từ vùng

nước lạnh là Actinobacteria (41,80%), Proteobacteria (39,52%) và Bacteroidetes

(17,29%). Nhóm các vi khuẩn chiếm thiểu số bao gồm Cyanobacteria/Chloroplast

(0,195%), Deferribacteres (0,04%), Firmicutes (0,05%) và Gemmatimonadetes

(0,017%). Nhóm vi khuẩn không xác định chỉ chiếm 1,07%.

Năm 2017, Fernanda và cộng sự đã đánh giá sự khác biệt thành phần vi khuẩn

trong gan tụy và ruột của tôm thẻ chân trắng trong tự nhiên, trong điều kiện nuôi trồng

và tôm nuôi trồng có triệu chứng bệnh EMS/AHPND [25]. Kết quả cho thấy có sự

khác nhau về thành phần vi khuẩn và chức năng dự đoán của vi khuẩn trong gan tụy

19

và ruột của tôm tự nhiên và tôm nuôi trồng; và thành phần vi khuẩn trong gan tụy và

ruột của mỗi mẫu tôm từ các điều kiện khác nhau là khác nhau; có sự tương đồng

giữa thành phần vi sinh vật trong ruột tôm nuôi trồng và lớp bùn lắng trong đầm nuôi;

và nhóm tác giả nhận thấy rằng, các loài như Faecalibacterium prausnitzii and

Pantoea agglomerans chiếm thành phần lớn trong gan tụy và ruột tôm nuôi khỏe

mạnh, và Aeromonas taiwanensis, Simiduia agarivorans và Photobacterium

angustum là loài chiếm ưu thể trong gan tụy và ruột tôm nuôi bị bệnh.

Các kết quả phân tích từ cơ sở dữ liệu metagenome còn được sử dụng để tìm

ra và sau đó tiến hành phân lập các gen liên quan đến chuyển hóa chất trong môi

trường nuôi và trong ruột tôm. Gao và cs (2018) đã xác định được các gen liên quan

đến các enzyme tiêu hóa trong ruột tôm chủ yếu là từ hai chi

Vibrio và Pseudoalteromonas [26]. Từ đó, cung cấp thông tin có giá trị trong sàng

lọc các chủng probiotic và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản.

1.3.3. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next generation sequencing – NGS)

và hệ thống giải trình gen thế hệ mới Illumina

1.3.3.1. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Vào những năm 1970, sự ra đời của phương pháp giải trình tự ADN bằng chuỗi

tổng hợp của Sanger và cộng sự đã khởi đầu cho sự phát triển công nghệ giải trình tự

gen. Tiếp đó, vào những năm 2000, dự án Giải trình tự bộ gen người do VIện Nghiên

cứu hệ gen người quốc gia (NHGRI- Hoa Kỳ) khởi động với sự hợp tác của 15 quốc

gia đã đạt được những thành tựu bước đầu với chi phí đắt đỏ, tiêu tốn nhiều thời gian

và nguồn lực. Và sự ra mắt của nền tảng giải trình tự hiệu năng cao đầu tiên đã làm

giảm 50.000 lần giá thành giải trình tự hệ gen so với chi phí trước đó của Dự án giải

trình tự bộ gen người. Từ đó, cụm từ “Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới” ra đời

gắn với cột mốc này. Và trong vòng một thập kỷ trở lại đây, công nghệ giải trình tự

gen thế hệ mới vẫn tiếp tục phát triển, tăng lưu lượng xử lý lên 100 – 1000 lần, và

giúp giảm đáng kể giá thành giải trình tự gen. Tính từ thời điểm ra đời, công nghệ

giải trình tự gen đã phát triển qua ba thế hệ, và hiện nay đang phát triển đến công

nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ tư. Cụ thể, giải trình tự gen theo phương pháp của

20

Sanger, dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp chuỗi ADN bằng dideoxynucleotide , là

công nghệ giải trình gen thế hệ thứ nhất; công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai

bao gồm các phương pháp Pyrosequencing: đo lượng PPi giải phóng trong phản ứng

tổng hợp chuỗi ADN, phương pháp Ion Semiconductor: đo tín hiệu ion H+ giải phóng

ra trong phản ứng tổng hợp chuỗi ADN, và phương pháp của Illumina: đo tín hiệu

từng loại huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản ứng tổng hợp chuỗi ADN; công

nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ ba dựa trên các kỹ thuật phân tích tín hiệu đơn phân

tử. Phân tích tức thời tín hiệu đơn phân tử huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản

ứng tổng hợp 1 chuỗi ADN trong lỗ nano.

1.3.3.2. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina

Về cơ bản, công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina bao gồm

bốn bước, cụ thể là bước 1: tạo thư viện bằng cách cắt ADN genome thành các mảnh

ADN và chọn lọc các mảnh ADN có kích thước 200-300 bp, sau đó ADN được xử lý

để mặc định gắn thêm 1 A vào đầu 3’ hoặc 5’ của mỗi mạch đơn, tiếp đó 2 loại PE

adapter có chữ T nhô ra được nối với ADN đích (PE adapter). PE adapter có vùng

bám cho mồi PCR vì thế cho phép khuếch đại ADN đích với mồi mà ở đầu 5’ có gắn

thêm trình tự Index2-P5 và Index1-P7 (có thể chỉ cần 1 Index cũng được). (tổng cộng

phần gắn thêm khoảng 60 nu); bước 2: polony-PCR tạo ra các cluster ADN; bước 3:

giải trình tự ADN trong từng cluster; và bước 4: ráp nối các đoạn trình tự ghi nhận

được và xử lý kết quả. Các hệ thống máy cho Illumina Seq bao gồm: HiSeq2500,

HiSeq3000, HiSeq4000, HiScanSQ, Genome Analyzer Ilx, MiSeq.

Trong công nghệ metagenomics, chất lượng ADN đầu vào để giải trình tự có

vai trò quan trọng, ADN được tách chiết phải đại diện cho đầy đủ các vi sinh vật có

trong mẫu cũng như đủ chất lượng cho giải trình tự và xây dựng thư viện. Nồng độ

và độ tinh sạch của metagenomic ADN tách từ các sinh vật trong môi trường đạt yêu

cầu cho giải trình tự thế hệ mới là rất quan trọng. Tuy nhiên, metagenomic ADN tách

chiết từ môi trường thường chứa các tạp chất như axit humic, và các cơ chất của axit

humic, đây là các chất ức chế phản ứng enzyme làm ảnh hưởng đến quá trình giải

trình tự ADN [78]. Do vậy, một vấn đề vẫn còn vướng mắc trong các nghiên cứu

metagenomics là tách chiết được metagenomic ADN không bị lẫn các tạp chất. Thêm

21

vào đó, quá trình tách chiết ADN cho giải trình tự metagenome ở các đối tượng khác

nhau yêu cầu một protocol riêng biệt cho từng loại mẫu, do đó có nhiều phương pháp

tách chiết ADN khác nhau đã được công bố [11], [19].

Phương pháp tách chiết metagenomic ADN được chia thành 2 bước chính:

bước đầu tiên là ly giải tế bào ly giải tế bào vi sinh vật, ở bước thứ 2 là quá trình tách

chiết và tinh sạch ADN. Quá trình ly giải tế bào dựa trên 3 nguyên lý chính là vật lý

(sử dụng nhiệt độ, sóng siêu âm, nghiền trong nitơ lỏng, sử dụng hạt bead), hóa học

(sử dụng hóa chất như SDS, CTAB, Chelax, PVPP) và enzyme (sử dụng các enzyme

như Lysozyme, Proteinase K). Các phương pháp này có thể được tiến hành độc lập,

nhưng thường được kết hợp với nhau để làm tăng hiệu quả của quá trình tách chiết

ADN [49].

Từ những nguyên lý kể trên, nhiều hãng đã phát triển các bộ kit thương mại

cho việc tách chiết ADN của hệ vi sinh vật trong môi trường. Hai bộ kit thương mại

hóa được sử dụng phổ biến trong tách chiết metagenomic ADN là bộ kit Power Soil™

DNA Isolation (MO-BIO), và bộ kit FastDNA Spin Kit for soil (Qbiogene), chúng

dựa trên nguyên lý sử dụng hạt bead để ly giải tế bào kết hợp với ly giải bằng hóa

chất, sau đó ADN được tinh sạch qua cột lọc. Bộ kit QIAmp DNA Stool Mini Kit

(QIAgen) cũng là một bộ kit được sử dụng phổ biến trong tách chiết Metagenomic

ADN trên nhiều đối tượng khác nhau. Nguyên lý của bộ kit dựa trên sự kết hợp giữa

ly giải bằng enzyme Proteinase K kết hợp với ly giải bằng nhiệt độ. Cũng dựa trên

nguyên lý này, bộ kit Metagenomic DNA Isolaion Kit for Water của hãng Epicentre

cũng đã được phát triển và thương mại hóa phục vụ tách chiết metagenome ADN từ

nước (http://www.epibio.com).

Ưu điểm của việc sử dụng kit tách chiết ADN là tiết kiệm thời gian và thu

được ADN có độ sạch cao do ADN được tinh sạch qua cột có gắn màng silica. Tuy

nhiên nhược điểm chính của việc sử dụng kit tách chiết ADN là giá thành và lượng

ADN thu được thường thấp hơn so với phương pháp phenol-chloroform [33]. Hơn

nữa, từng loại mẫu lại có một đặc thù nhất định, do đó thì việc áp dụng một phương

pháp tách chiết ADN cho nhiều loại mẫu chưa hẳn đã đem lại hiệu quả tốt nhất.

22

Trong nghiên cứu metagenome hệ vi sinh vật trong môi trường nước, quá trình

tách chiết ADN cũng dựa trên các nguyên lý cơ bản kể trên nhưng được chia làm 3

bước: bước đầu tiên là loại bỏ các chất rắn lơ lửng bằng vải lọc hoặc ly tâm. Sau đó

là thu các tế bào vi khuẩn thông qua màng lọc. Cuối cùng là tách ADN từ màng lọc

khuẩn [83]. Khó khăn chính trong quá trình tách chiết ADN từ mẫu nước là lượng

sinh khối vi sinh vật thu được ở màng lọc là rất ít, dẫn đến lượng ADN thu được

thường không cao.

Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tách chiết Metagenomic ADN hệ vi

sinh vật trong môi trường nước nói chung, cũng như trong môi trường nước ở các

đầm nuôi tôm. Một số nghiên cứu có thể kể đến như nghiên cứu của Urakawa và cộng

sự năm 2010, với việc sử dụng 3 phương pháp tách ADN từ nước biển khác nhau

gồm 2 phương pháp tách chiết sử dụng kit FastDNA Spin kit for soil (MP

Biomedicals); kit UltraClean Soil DNA (MO-BIO) và phương pháp tách chiết còn lại

sử dụng Phenol-Chloroform. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp tách chiết

sử dụng Phenol-chloroform cho hiệu suất thu hồi ADN, tổng lượng ADN và số bản

sao của gen 16S rARN/ng ADN tổng số là cao hơn so với 2 phương pháp sử dụng kit

tách chiết [72].

Trong nghiên cứu của Hwang và cộng sự (2012), các tác giả đã so sánh hiệu

quả tách chiết ADN hệ vi sinh vật từ màng sinh học (biofilms) hình thành trong hệ

thống phân phối nước sinh hoạt (DWDS) phục vụ giải trình tự pyrosequencing, với 5

phương pháp khác nhau gồm: 2 phương pháp sử dụng các bộ kit PowerSoil DNA

Isolation (MO-BIO); FastDNA Spin Kit for soil (Qbiogene) và 3 phương pháp khác

lần lượt được mô tả bởi Miller và cộng sự (1999); Schmidt và cộng sự (1991); Zhou

và cộng sự (1996) [33], [47], [63], [87]. Kết quả cho thấy, phương pháp tách ADN

sử dụng bộ kit FastDNA đem lại hiệu quả tách chiết ADN hơn hẳn so với 4 phương

pháp còn lại, mặc dù lượng ADN thu được thấp nhưng phương pháp này loại bỏ được

tạp nhiễm gây ức chế phản ứng PCR là axit humics.

Trong nghiên cứu metagenome hệ vi sinh vật đường ruột, mẫu ADN tổng số

có nồng độ và độ tinh sạch cao từ các mẫu đường ruột là yêu cầu bắt buộc. Tuy nhiên,

23

hệ vi sinh đường ruột rất phức tạp và chứa rất nhiều vi sinh vật khó ly giải trong quá

trình tách chiết [81]. Do đó, đã có rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành

tách chiết ADN tổng số từ các mẫu ruột. Các phương pháp không sử dụng kit có thể

kể đến như sử dụng các enzyme dung giải, cơ học sử dụng các hạt bead, và hóa học

[16], [21], [46], [82]. Hàng loạt các bộ kit thương mại đã được ra đời và sử dụng rộng

rãi như QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen, Mỹ), FastDNA SPIN kit (Qbiogene,

Mỹ), PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio, Mỹ), ZR Fecal DNA MiniPrep (Zymo,

Mỹ), PSP Spin Stool DNA Kit (Stratec, Đức). Tuy nhiên, các phương pháp này cũng

đã cho thấy sự hạn chế về mức độ tinh sạch và lượng ADN tổng số sau khi tách chiết

không cao. Một số nghiên cứu so sánh giữa các phương pháp đã được các nhóm tác

giả thực hiện qua đó làm sáng tỏ hơn ưu nhược điểm của các phương pháp [81], [86].

24

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu nước, mẫu ruột tôm thẻ chân trắng thu tại các đầm nuôi bán thâm

canh tôm thẻ chân trắng tại Sóc Trăng được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu.

2.1.2. Hóa chất phục vụ nghiên cứu

Các hóa chất dùng để tách chiết ADN, ARN và đọc trình tự là: PowerSoil®

DNA Isolation Kit - Mo Bio (Mỹ), QIAamp DNA Mini Kit (Đức), agarose, ethanol,

chloroform, isopropanol, RevertAid First strand cDNA (Thermo Fisher Scientific

Inc. Singapore), TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit

2.1.3. Thiết bị phục vụ nghiên cứu

Các thiết bị và dụng cụ nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific, Mỹ), Agilent Bioanalyzer 2100

system (Agilent, Mỹ), Máy li tâm Sorvall RT 1900 W (Đức); Nồi khử trùng (Nhật

Bản); pH kế Melter Toledo (Đức); Máy chạy PCR PTS – 100 (do hãng Nyxtechnik,

Mỹ sản xuất) và PCR – 9700 do hãng Applied Bio system – Mỹ sản xuất; Pipetteman

các loại (Đức); Màng lọc polycarbonate membranes 0,8 và 0,22 μm (Millipore,

Ireland), Bể ổn nhiệt và một số dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm.

Máy đọc trình tự Illumina HiSeq (Illumina, San Diego, California, USA);

Máy chủ tính toán hiệu năng cao với bộ vi xử lý gồm 24 CPU Intel(R) Xeon(R)

CPU X5650 @ 2.67GHz, dung lượng RAM là 188GB, dung lượng lưu trữ là 8TB và

được cấu hình trên hệ điều hành Ubuntu phiên bản 15.04 Vivid với các phần mềm tin

sinh học và thống kê mới nhất.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

25

2.2.1. Phương pháp thu mẫu

Phương pháp thu mẫu tôm

Các mẫu tôm được thu ở đầm nuôi tôm bán thâm canh tại các tỉnh Sóc Trăng

trong khoảng thời gian tháng 10-11/2015, bao gồm: đầm nuôi bị bệnh chưa rõ nguyên

nhân (ST2), và đầm nuôi tôm khoẻ mạnh (ST1). Các đầm nuôi tôm có diện tích trung

bình 1 ha và được nuôi với thức ăn thương mại của hãng GroBest (Việt Nam) với

thành phần chứa 40% protein, 5% carbohydrate và 3% lipit. Các mẫu được phân loại

thành mẫu bệnh và không bệnh dựa trên đặc điểm bệnh dịch bên ngoài của tôm như

chuyển động chậm và không có thức ăn trong ruột.

Phương pháp thu mẫu nước

Nước ở các đầm nuôi tôm được thu ở 5 điểm khác nhau trong đầm bằng can

nhựa 10 lít, sau đó được bảo quản với đá lạnh trong quá trình đưa về phòng thí

nghiệm. Các mẫu nước được lọc sơ bộ qua vải lọc kích thước 45 μm để loại bỏ tảo

và các vật chất có kích thước lớn, sau đó tiếp tục được lọc qua các màng

polycarbonate kích thước 0,8 và 0,22 μm (Millipore, Ireland).

2.2.2. Các phương pháp phân tích mẫu nước

Các chỉ tiêu TAN, TSS, NO-3, TN,… thu trong chai nhựa. Mẫu được thu tại 3

vị trí theo đường chéo của ao. Các chỉ tiêu H2S, DO thu vào chai nút mài nâu và DO

được cố định tại hiện trường bằng 1ml KI – NaOH và 1 ml MnSO4. Tất cả các mẫu

đều được ghi chú cẩn thận và được trữ lạnh (<4C) trong suốt quá trình vận chuyển

và phân tích.

Tất cả các chỉ tiêu môi trường được phân tích theo phương pháp chuẩn

(Andrew, 1995), đang được áp dụng tại phòng phân tích chất lượng nước, khoa Thủy

sản, Trường Đại học Cần Thơ.

2.2.3. Phương pháp tách ADN

2.2.3.1. Tách metagenomic ADN từ các mẫu ruột

Mẫu ruột được tách bằng ba phương pháp khác nhau nhằm tối ưu hóa quá trình

tách ADN phục vụ giải trình tự metagenome trên các hệ máy giải trình tự thế hệ mới.

26

Phương pháp 1: Sử dụng Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol

Quy trình thực hiện:

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorf.

- Hòa tan mẫu trong dung dịch đệm tách chiết (Extract Buffer) với tỉ lệ 100 mg

mô/1,2 ml dung dịch đệm.Thành phần dung dịch đệm như sau:

o 100 mM KCl

o 10 mM Tris-HCl, pH = 8

o 25 mM EDTA, pH = 8

o 0,5 % SDS

- Thêm Lysozyme đến nồng độ cuối cùng là 10 mg/ml, sau đó ủ mẫu ở 25oC

trong khoảng 2 giờ.

- Sau khi lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt thêm 1 ml NaCl 6M vào hỗn hợp dung

dịch, giữ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm ở 14000 v/p trong

15 phút ở 4oC. Chuyến dịch phía trên sang ống Eppendorf mới.

- Thêm vào dung dịch mẫu một lượng tương đương về thể tích hỗn hợp dung

dịch Phenol: Chloroform : Isoamyl alcohol (25: 24 :1), lắc mạnh, sau đó ly

tâm ở 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Hút dịch pha trên (pha nước có chứa

ADN tổng số) chuyển sang ống Eppendorf mới.

- Tiếp tục thêm vào dung dịch một lượng tương đương về thể tích dung dịch

Chloroform : Isoamyl Alcohol (24 :1), lắc mạnh, sau đó ly tâm ở 14000 v/p

trong 15 phút ở 4oC. Hút dịch pha trên (pha nước có chứa ADN tổng số)

chuyển sang ống Eppendorf mới.

- Tủa ADN bằng Ethanol 100% (cồn tuyệt đối). Bổ sung cồn tuyệt đối với tỉ lệ

thể tích cồn: mẫu (2:1). Ủ ở -20oC qua đêm. Ly tâm 14000 v/p trong 15 phút

ở 4oC. Loại bỏ dịch, thu lấy tủa.

- Rửa tủa bằng cồn 70%. Ly tâm 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch,

thu lấy tủa.

- Làm khô tủa ADN bằng máy SpeedVac trong 5 phút. Sau đó hòa tan lại tủa

trong 100 µl H2O tinh sạch. Bảo quản ADN ở -20oC. Kiểm tra ADN bằng điện

di trên gel agarose 0,8 %.

27

Phương pháp 2: Sử dụng Kit PowerSoil® DNA Isolation

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống PowerBead

- Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu.

- Kiểm tra dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trước khi

sử dụng.

- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn.

- Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa.

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl.

- Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l.

- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4 C trong 5 phút.

- Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l.

- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex

5 trong giây.

- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ở

mỗi mẫu.

- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột.

- Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch.

- Thêm 100 l đệm C6.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

ADN sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng

máy Nanodrop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC.

Phương pháp 3: Kết hợp giữa phương pháp tách tay và sử dụng bộ Kit thương

mại

28

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorf

sạch.

- Dẫn dung dịch PBS 1X vào mỗi ống tới 2 ml.

- Ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ cặn lắng. Dùng pipet nhẹ nhàng

hút phần dịch sang ống eppendorf mới. Lặp lại 1-2 lần cho tới khi không thấy

cặn tủa.

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu tủa.

- Kiểm tra dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trước khi

sử dụng.

- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn.

- Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa.

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl.

- Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4  C trong 5 phút.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l .

- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4  C trong 5 phút.

- Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l .

- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex

5 trong giây.

- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ở

mỗi mẫu.

- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột.

- Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch.

- Thêm 100 l đệm C6.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

29

ADN sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng

máy Nanodrop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC.

2.2.3.2. Tách metagenomic ADN từ các mẫu nước

Các mẫu nước lọc qua lưới lọc có kích thước 45 µm để loại bỏ tảo cũng như

các chất lơ lửng và được bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển về phòng thí

nghiệm để tiến hành lọc thu sinh khối tế bào vi khuẩn theo mô tả của Yuyi và cộng

sự., 2014.

Hình 2.1. Hình ảnh quá trình lọc nước qua các màng lọc có kích thước 8 µm, 0,8

µm và 0,22 µm.

Mẫu nước được lọc lần lượt qua màng 8 µm và 0,8 µm (Whatman) bằng bơm

hút chân không và giữ lại phần nước dưới bình lọc. Phần nước sau khi được lọc qua

màng 0,8 µm tiếp tục được lọc qua màng 0,22 µm (Corning), sau khi lọc qua màng

0,22 µm phần màng lọc được dùng để tách ADN theo ba phương pháp khác nhau

(Hình 2.2).

Phương pháp 1: Sử dụng bộ Powersoil MOBIO (MO-BIO)

- Chuẩn bị mẫu: Cân 250 mg màng lọc khuẩn, bổ sung vào ống có chứa dung dịch

PowerBead, vortex để trộn đều mẫu. Sau đó bổ sung thêm 60 µl dung dịch C1, trộn

đều mẫu bằng cách đảo ngược ống hoặc vortex. Siết chặt nắp ống và vortex mạnh

30

mẫu trong 5-10 phút. Sau khi vortex, ly tâm ống mẫu với tốc độ 10.000g/phút trong

30 giây ở nhiệt độ phòng.

- Ly giải tế bào: Hút khoảng 400 – 500 µl dịch nổi phía trên ống mẫu sau khi ly tâm,

chuyển sang ống eppendorf 2ml mới và bổ sung thêm vào mỗi ống mẫu 250 µl dung

dịch C2, vortex trong 5 giây và ủ mẫu ở 4oC trong 5 giây. Ly tâm ống mẫu với vận

tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Loại bỏ các chất ức chế: Hút 600 µl dịch nổi phía trên ống sau khi ly tâm, chuyển

sang ống eppendorf 2ml mới, bổ sung 200 µl dung dịch C3, vortex trong 5 giây, ủ

mẫu ở 4o trong 5 phút. Ly tâm mẫu với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt

độ phòng.

- Gắn kết ADN: Hút 600 µl dịch nổi phía trên, chuyển sang ống eppendorf 2ml mới.

Sau đó bổ sung 1200 µl thêm dung dịch C4, vortex đều trong 5 giây, ủ mẫu ở 4oC

trong 5 phút. Chuyển 600 µl dung dịch sang cột ly tâm, ly tâm ở 10.000 vòng/phút

trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch ở đáy ống ly tâm. Lặp lại bước này 3 lần.

- Rửa ADN: Bổ sung 500 µl dung dịch C5 vào cột ly tâm, ly tâm 10.000 vòng/phút

trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Thôi ADN: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 2ml mới, bổ sung vào giữa cột lọc

100 µl dung dịch C6, ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó loại bỏ cột lọc.

Phương pháp 2: Sử dụng bộ kit DNA Stool Mini Kit (QIAgen) các bước tiến hành

bao gồm:

- Chuẩn bị mẫu: Cân từ 180-220 mg mẫu, cho mẫu vào ống eppendorf 2 ml.

- Bổ sung 1,4 ml dung dịch ASL vào mỗi ống mẫu. Vortex mẫu liên tục trong 1 phút.

- Ủ ống mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong 5 phút.

- Vortex ống mẫu trong 15 giây và ly tâm ống mẫu ở tốc độ 20.000 x g trong 1 phút.

- Hút 1,2 ml dịch nổi phía trên ống và chuyển sang ống eppendorf 2 ml mới. Loại bỏ

cặn dưới đáy ống.

31

- Bổ sung vào mỗi ống mẫu 1 viên InhibitEX, vortex ngay lập tức và liên tục trong 1

phút cho đến khi viên InhibitEX tan hoàn toàn. Ủ ống mẫu trong 1 phút ở nhiệt độ

phòng để các chất ức chế bị hấp thu vào viên InhibitEX.

- Ly tâm ống mẫu ở tốc độ cao trong 3 phút để thu dịch nổi phía trên, hút toàn bộ dịch

nổi cho sang ống eppendorf 1,5 ml mới, loại bỏ cặn lắng. Tiếp tục ly tâm ống mẫu ở

tốc độ cao trong vòng 3 phút.

- Hút 200 µl dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới có bổ sung 15 µl Proteinase

K.

- Bổ sung vào ống mẫu 200 µl dung dịch AL, vortex trong 15 giây.

- Ủ ống mẫu ở 70oC trong 10 phút.

- Bổ sung 200 µl ethanol (96-100%) vào ống mẫu, vortex trong thời gian ngắn.

- Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống sang cột QIAamp và ống ly tâm mới, ly tâm ở

tốc độ cao trong vòng 1 phút. Loại bỏ dịch dưới đáy ống ly tâm.

- Bổ sung vào cột QIAamp 500 µl Buffer AW1, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1

phút.

- Tiếp tục bổ sung 500 µl Buffer AW2 vào cột QIAamp, ly tâm ở tốc độ cao trong

vòng 3 phút để loại hoàn toàn dịch bám ở màng lọc.

- Chuyển cột QIAamp sang ống eppendorf 2 ml mới. Bổ sung 100-200 µl Buffer AE

vào chính giữa cột, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút để thôi ADN ra khỏi màng

lọc.

Phương pháp 3: Sử dụng các hóa chất và protocol theo mô tả bởi Yu và cộng sự năm

2004, các bước tiến hành gồm:

- Chuyển 0,25 g mẫu màng lọc sang ống 2 ml. Bổ sung 1 ml Lysis buffer (500 mM

NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, and 4% SDS) và 0.4 g hạt bead

zirconia beads (0.5 mm).

32

- Vortex ống mẫu ở tốc độ cao nhất trong 3 phút.

- Ủ ống mẫu ở 70oC trong 15 phút, đảo nhẹ ống mẫu mỗi 5 phút/lần.

- Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 16.000 xg ở nhiệt độ 4oC trong 5 phút. Chuyển dịch nổi

sang ống 2 ml mới.

- Bổ sung 300 µl lysis buffer vào ống mẫu, lặp lại từ bước 2 tới bước 4, sau đó gộp

dịch nổi ở các ống sang ống 2 ml mới.

- Bổ sung 260 µl ammoni axetat 10 M vào mỗi ống, trộn đều và ủ 5 phút trên đá. Ly

tâm ống mẫu ở 4oC trong 10 phút với tốc độ 16.000 xg.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung 1 thể tích Iso-propanol

và trộn đều, ủ ống mẫu trong đá 30 phút.

- Ly tâm ở 4oC trong vòng 15 phút ở tốc độ 16.000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi, rửa

kết tủa bằng etanol 60%, để khô tủa tự nhiên trong điều kiện phòng.

- Hòa tan tủa trong 100 µl TE buffer và gộp các ống mẫu lại với nhau.

- Bổ sung 2 µl RNase (10 mg/ml), ủ ở 37oC trong 15 phút.

- Bổ sung 15 µl Proteinase K và 200 µl Buffer AL (trong bộ kit QIAamp DNA Stool

Mini Kit), trộn đều, và ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt đô 70oC trong 10 phút.

- Bổ sung 200 µl Ethanol, trộn đều và chuyển hỗn hợp dung dịch sang cột QIAamp,

ly tâm 16.000 xg trong 1 phút.

- Bỏ dịch dưới đáy cột, bổ sung 500 µl AW1 buffer (QIAgen), ly tâm 1 phút ở nhiệt

độ phòng.

- Bỏ dịch dưới đáy cột, bổ sung 500 µl AW2 buffer (QIAgen), tiếp tục ly tâm ở nhiệt

độ phòng trong 1 phút.

- Làm khô cột bằng cách ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

- Bổ sung 200 µl AE buffer (QIAgen), ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.

33

- Chuyển cột sang ống 1,5 ml mới. Ly tâm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, thu ADN.

2.2.4. Đánh giá chất lượng ADN tách chiết

Các mẫu metagenomic ADN sau khi tách chiết sẽ được điện di kiểm tra trên gel

agarose 1%, và đo nồng độ, tỷ số OD (A260/A280) trên máy đo Nanodrop Lite (Thermo

Scientific). Lượng ADN theo tiêu chuẩn đọc trình tự NGS phải lớn hơn 3 µg, và tỷ

số OD (A260/A280) nằm trong khoảng 1,8-2,0.

2.2.5. Các phương pháp giải trình tự

Phương pháp giải trình tự ADN vùng V3-V4 gen 16S rARN

Vùng V3-V4 gen 16S rARN được khuếch đại bằng cặp mồi 341F (5’-

CCTAYGGGRBGCASCAG-3’) và 806R (5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)

có gắn 6 nucleotide ở đầu 5’ cho phép phân tích các mẫu đồng thời [100]. Sau đó, sản

phẩm PCR được gửi đọc trình tự tại công ty First Base (Malaysia) để đọc trình tự.

Thư viện giải trình tự được chuẩn bị bằng bộ kit TruSeq® DNA PCR-Free Sample

Preparation Kit (Illumina, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chất lượng thu

viện được đánh giá bằng máy Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific, Mỹ) và

Agilent Bioanalyzer 2100 system (Agilent, USA). Sau đó, thư viện được giải trình tự

trên máy Illumina HiSeq 2500 platform (Illumina, Mỹ).

2.2.6. Xử lý số liệu giải trình tự gen ADN 16S rARN

Phân loại OTU, chú giải loài và tính toán các chỉ số đa dạng Alpha và Beta

Các đoạn đọc trình tự paired-end trên máy Illumina HiSeq 2500 có kích thước

khoảng 250 bp. Các đoạn này được sắp xếp tương ứng với các mẫu dựa trên trình tự

barcode gắn với mồi. Sau đó được ghép lại với nhau bằng phần mềm FLASH phiên

bản 1.2.7, dựa trên mức độ tương đồng trình tự của hai đoạn đọc. Các trình tự đơn

sau đó được lọc để lựa chọn các trình tự có chất lượng tốt dựa trên các thông số mặc

định bằng phần mềm QIIME phiên bản 1.7.0. Các đoạn trình tự tốt sau đó được so

sánh với cơ sở dữ liệu GOLD bằng thuật toán UCHIME để phát hiện và loại bỏ các

trình tự chimeric. Tiếp theo, phần mềm UPARSE phiên bản v7.0.1001 được sử dụng

34

để chọn các OTU dựa trên các trình tự có độ tương đồng ≥ 97%. Trình tự đại diện

của mỗi OTU được sử dụng để chú giải loài với cơ sở dữ liệu GreenGenes bằng thuật

toán phân loại RDP phiên bản 2.2. Các chỉ số đa dạng alpha, beta như: observed

richness (OTUs), Good’s coverage, Chao1, and Shannon, Principal Coordinate

Analysis (PCoA) được tính toán bằng phần mềm QIIME phiên bản 1.7.0 và biểu diễn

với phần mềm R phiên bản 2.15.3.

35

Chương 3. Kết quả và thảo luận

3.1. Kết quả thu mẫu và đánh giá các chỉ tiêu môi trường

Các mẫu nước và ruột của tôm thẻ chân trắng được thu tại tỉnh Sóc Trăng, với

các chỉ số năng suất, mức độ bệnh được thể hiện trên bảng 3.1.

Bảng 3.1. Thông tin các vị trí thu mẫu

Ao 1

Ao 2

Huyện Cù Lao Dung,

Thị xã Vĩnh Châu,

Địa điểm

tỉnh Sóc Trăng

tỉnh Sóc Trăng

2

2

Mật độ nuôi

150-200 con/m

150-200 con/m

4 – 5 tấn/ao/vụ

2 – 3 tấn/ao/vụ

Năng suất

Không bệnh

Bệnh

Mức độ bệnh

Hình 3.1. Hình ảnh ao nuôi tôm thu mẫu (A); và mẫu tôm khỏe (hình B, phải) và

mẫu tôm bệnh (hình B, trái)

36

Bảng 3.2. Kết quả phân tích các chỉ tiêu môi trường ao nuôi thu mẫu

Chỉ tiêu Ao 2 Chỉ tiêu Ao 1 Ao 1 Ao 2

Bệnh Mức độ bệnh Không bệnh

8,0 7,85 0,171 0,847 pH TAN

10 13 1,987 1,975 TSS

-

N-NO3

2905 3110 0,159 0,462 TDS

3-

P-PO4

12,5 15 2,463 3,609 Độ đục TN

13 12 1,253 2,635 TP BOD5

13,46 9,06 4,3 6,3 COD TOM

3,37 4,17 6,15 6,05 CO2 Oxy hòa tan (DO)

41 50 0,74 0,65 H2S Chlorophyll-a

Kết quả khảo sát cho thấy tổng vật chất lơ lửng (TSS) dao động từ 10-13 mg/L

cho thấy mức tích lũy vật chất lơ lửng trong ao nuôi tôm vào thời điểm thu mẫu thấp

do mới ở tháng đầu của chu kỳ nuôi. Qua khảo sát ở 2 ao nuôi, hàm lượng CO2 ở mức

cho phép theo Ellis (1937) quần thể cá/tôm phát triển tốt khi môi trường nước chứa

hàm lượng CO2 tự do nhỏ hơn hoặc bằng 5 ppm và khi CO2 vượt quá mức sẽ kết hợp

trong điều kiện oxy thấp có thể gây hại cho cá/tôm do làm cản trở quá trình hấp thu

O2 của cơ thể [12].

Qua khảo sát cho thấy, hàm lượng TAN dao động từ 0,171-0,847 mg/L. Theo

Boyd (1998), Chanratchakool (2003), hàm lượng TAN thích hợp cho ao nuôi tôm là

- cho

0,2-2 mg/L và hàm lượng NH3 phải nhỏ hơn 0,1 mg/L [13], [17], [18]. Hàm lượng

- trong các mẫu khoảng 1,9 mg/L. Theo Boyd (1998) hàm lượng NO3

N-NO3

- trong các ao thu mẫu hầu hết nhỏ hơn 2 mg/L nên rất thích hợp cho

phép trong ao nuôi thủy sản là nhỏ 10 mg/L, tốt nhất là nhỏ hơn 2 mg/L. Như vậy,

hàm lượng NO3

nuôi tôm [12].

Kết quả phân tích (bảng 1) cho thấy hàm lượng H2S dao động từ 0,65 -0,74

mg/L. Theo (Boyd 1998) hàm lượng từ 0,01-0,05 mg/L có thể gây chết thủy sinh vật

37

[9]. Theo (Boyd 1990) H2S là loại khí độc sẽ liên kết với Fe của hemoglobine hoặc

Cu của hemocyanin làm cho tế bào máu mất khả năng vận chuyển oxy dẫn đến tôm

sinh trưởng chậm và tỉ lệ sống thấp do bị thiếu oxy [8]. Theo Fast và Boyd (1992),

hàm lượng H2S thích hợp cho tôm sinh trưởng và phát triển phải bằng 0 [24]. Theo

Chanratchakkol et al. (2003) hàm lượng H2S thích hợp cho ao tôm phải nhỏ hơn 0,03

mg/L [12], [13]. Theo Chen (1990) nồng độ H2S =0,003 đã gây độc cho tôm cá. Như

vậy những ao được thu mẫu có hàm lượng H2S cao hơn ngưỡng cho phép [20].

Hàm lượng đạm ở các ao dao động từ 2,463-3,609 mg/L. Hàm lượng đạm ở

đáy ao phụ thuộc rất lớn vào hàm lượng chất hữu cơ tích trữ,nguồn thức ăn thừa, sản

phẩm thải của tôm và hiệu quả hoạt động của vi sinh vật, khả năng phân hủy đạm của

vi khuẩn có giới hạn nên đạm sẽ tích lũy ở đáy ao ngày càng nhiều. Qua khảo sát cho

thấy hàm lượng vật chất hữu cơ tích tụ (TOM) ở tất cả các ao dao động từ 4,3- 6,3%.

BOD5 của ao nuôi nằm trong khoảng 12-13 mg/L cho thấy có sự nhiễm bẩn nhẹ trong

ao nuôi, tuy nhiên giá trị này chưa vượt ngưỡng 20 mg/L và có thể chấp nhận được

trong các ao nuôi tôm.

DO trung bình giữa hai ao nuôi chênh lệch nhau không lớn, dao động từ 6,0

đến 6,15 mg/L. Theo Boyd (1998), Krishnani và cs (2006), giá trị DO trong ao nuôi

tôm phải đạt tối thiểu > 5ppm để đảm bảo cho sự phát triển của tôm và các hoạt động

bình thường của thủy vực [9], [39]. Báo cáo của Liao và Murai (1986) cho thấy tỷ lệ

hô hấp oxy của tôm sú bảo hoà khi oxy hòa tan (DO) nồng độ cao hơn 3,0-4,0 ppm ở

độ mặn 4-45 ppt và nhiệt độ từ 20-30°C [42]. Tôm chết ở khoảng nồng độ 0,3 – 0,7

ppm. Các giá trị tương tự cũng đươc ghi nhận trong nghiên cứu của Liao và Huang

(1975) [41]. Hàm lượng DO quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến tỉ lệ sống và năng suất

trong ao nuôi tôm [10].

3.2. Kết quả tách ADN tổng số của các mẫu ruột, nước

38

Một bước quan trọng trong nghiên cứu metagenome là chuẩn bị mẫu và tách

chiết ADN, ADN được tách chiết phải đại diện cho đầy đủ các vi sinh vật có trong

mẫu cũng như đủ chất lượng cho giải trình tự và xây dựng thư viện. Nồng độ và độ

tinh sạch của metagenomic ADN tách từ các sinh vật trong môi trường đạt yêu cầu

cho giải trình tự thế hệ mới là rất quan trọng. Tuy nhiên, metagenomic ADN tách

chiết từ môi trường thường chứa các tạp chất như axit humic, và các cơ chất của axit

humic, đây là các chất ức chế phản ứng enzyme làm ảnh hưởng đến quá trình giải

trình tự ADN [78]. Do vậy, một vấn đề vẫn còn vướng mắc trong các nghiên cứu

metagenomics là tách chiết được metagenomic ADN không bị lẫn các tạp chất. Thêm

vào đó, quá trình tách chiết ADN cho giải trình tự metagenome ở các đối tượng khác

nhau yêu cầu một protocol riêng biệt cho từng loại mẫu, do đó có nhiều phương pháp

tách chiết ADN khác nhau đã được công bố [11], [19]. Trong khuôn khổ luận văn,

chúng tôi đã tiến hành tối ưu các phương pháp tách ADN metagenome từ các mẫu

ruột và mẫu nước với các bộ kit thương mại, cũng như các phương pháp tách kết hợp

giữa kit và các hóa chất khác.

3.2.1. Kết quả tách ADN mẫu ruột

Sử dụng ba phương pháp tách ADN từ mẫu ruột như đã mô tả ở phần phương

pháp, chúng tôi thu được các kết quả như hình 3.2 và bảng 3.3.Từ kết quả thu được

như trên bảng 3.3 và hình 3.2, có thể thấy lượng ADN tổng số thu được bằng phương

pháp 1 là lớn nhất ở cả hai mẫu ruột tôm không bệnh và bị bệnh, lần lượt là 62,5 ng/µl

và 80,9 ng/µl, tuy nhiên, sản phẩm tách bị lẫn nhiều tạp chất (A260/280 chỉ đạt 1,61 và

1,72 lần lượt ở hai mẫu)và xuất hiện dải smear cho thấy ADN bị đứt gãy khá nhiều

(Hình 3.4A). Kết quả trên Hình 3.4B và 3.4C thể hiện chất lượng của ADN tách được

bằng hai phương pháp 2 và 3 được cải thiện hơn rất nhiều so với phương pháp 1 về

độ tinh sạch và chất lượng ADN tổng số ở cả hai mẫu. Cụ thể, không nhận thấy (hình

3.4C) hoặc nhận thấy rất ít (hình 3.4B) dải smear của ADN tổng số, cho thấy ADN

tổng số không bị đứt gãy nhiều trong quá trình tách chiết. Bên cạnh đó, mặc dù ADN

của hai mẫu ruột thu nhận được từ hai phương pháp có độ tinh sạch khá cao (A260/280

lần lượt là 1,86 và 1,90, 1,87 và 1,92), nhưng nồng độ ADN của hai mẫu ruột thu

được từ phương pháp 2 thấp hơn nhiều (lần lượt là 22,3 ng/µl và 34,2 ng/µl) so với

39

thu được từ phương pháp 3 (lần lượt là 50,4 ng/µl và 56,7 ng/µl). Như vậy, có thể

khẳng định thực hiện phương pháp 3 (kết hợp giữa phương pháp tách bằng tay và sử

dụng bộ kit thương mại) có thể thu nhận được metagenome ADN có chất lượng tốt

phục vụ giải trình tự metagenome ADN thu được từ mẫu nước bằng máy giải trình tự

thế hệ mới.

Bảng 3.3. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp

Phương pháp Mẫu Nồng độ OD (A260/280)

Phương pháp 1 ST1 62,5 1,61

Phương pháp 1 ST2 80,9 1,72

Phương pháp 2 ST1 22,3 1,86

Phương pháp 2 ST2 34,2 1,90

Phương pháp 3 ST1 50,4 1,87

Phương pháp 3 ST2 56,7 1,92

Hình 3.2. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm

sử dụng ba phương pháp khác nhau

A: Phương pháp 1, B: Phương pháp 2, C: Phương pháp 3;

M: Marker 1 kb (Thermo Scientific)

40

Như vậy, chúng tôi đã tối ưu quy trình tách metagenome ADN từ mẫu ruột

tôm thẻ kết hợp giữa phương pháp tách tay và sử dụng bộ kit PowerSoil® DNA

Isolation gồm các bước cụ thể như sau (Hình 3.3):

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorf

sạch.

- Dẫn dung dịch PBS 1X vào mỗi ống tới 2 ml.

- Ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ cặn lắng. Dùng pipet nhẹ nhàng

hút phần dịch sang ống eppendorf mới. Lặp lại 1-2 lần cho tới khi không thấy

cặn tủa.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu tủa.

- Kiểm tra dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trước khi

sử dụng.

- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn.

- Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa.

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl.

- Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l.

- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4 C trong 5 phút.

- Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g.

- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l.

- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex

5 trong giây.

- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ở

mỗi mẫu.

- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột.

- Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

41

- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch.

- Thêm 100 l đệm C6.

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

ADN sau khi tách thành công được bảo quản ở -20oC.

Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu ruột tôm phục vụ

giải trình tự gen thế hệ mới

3.2.2. Kết quả tách ADN mẫu nước

Sử dụng 3 phương pháp tách chiết ADN như đã mô tả trong phần phương

pháp, chúng tôi đã thu được các kết quả tách ADN tổng số của các mẫu nước được

trình bày trên hình 3.4 và bảng 3.4.Về nguyên tắc, hai phương pháp tách dùng kit của

MOBIO và QIAgen đều sử dụng cột ly tâm, cho phép ADN với màng silica trong cột

bằng liên kết ion. Còn phương pháp của Yu và cộng sự năm 2004 thì sử dụng muối

42

nồng độ cao để tủa ADN, sau đó tủa ADN được tinh sạch một lần nữa qua cột silica

trong bộ kit của QIAgen.

Bảng 3.4. Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp

Mẫu

Phương pháp Nồng độ (ng/µl) Độ tinh sạch (A260/280)

Phương pháp 1 29,9 1,8 ST1

Phương pháp 1 ST2 27,8 1,81

Phương pháp 2 ST1 48,0 1,85

Phương pháp 2 ST2 45,9 1,9

Phương pháp 3 ST1 107,8 2,0

Phương pháp 3 ST2 91,0 1,98

Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, phương pháp sử dụng hóa chất theo mô tả của

Yu và cộng sự (2004) (phương pháp 3) cho nồng độ ADN cao nhất ở cả 2 mẫu nước

ao tôm bệnh và nước ao tôm không bệnh. Tuy nhiên, hình ảnh điện di hình 2.3 cho

thấy metagenomic ADN tách theo phương pháp này bị đứt gãy rất cao với hình ảnh

vệt sáng kéo dài, do đó dẫn đến máy Nanodrop tính toán cả các đoạn đứt gãy này

thành nồng độ tổng số của ADN.

Kết quả ở hình 3.4 cho thấy, ở cả 2 phương pháp tách chiết sử dụng bộ kit của

MOBIO và QIAGEN đều thu được các băng metagenomic ADN có kích thước lớn,

băng sáng gọn, ít bị đứt gãy. Trong khi đó phương pháp tách sử dụng hóa chất theo

mô tả của Yu (2004) thì các băng ADN thu được đều bị đứt gãy ở cả 2 mẫu màng lọc

nước.

43

Hình 3.4. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm

sử dụng ba phương pháp khác nhau

A: Phương pháp 1, B: Phương pháp 2, C: Phương pháp 3;

M: Marker 1 kb (Thermo Scientific)

Với hai phương pháp tách sử dụng bộ kit của QIAgen, và bộ kit MOBIO, độ

tinh sạch của metagenomic ADN đều nằm trong khoảng cho phép (A260/280 từ 1,8

– 2). Nồng độ metagenomic ADN ở 2 mẫu nước ao tôm không bệnh và nước ao tôm

bệnh lần lượt là 48 ng/µl và 45,9 ng/µl. Trong khi đó các mẫu tách theo phương pháp

sử dụng bộ kit MOBIO có nồng độ lần lượt là 29,9 ng/µl và 27,8 ng/µl. Cả hai bộ kit

này đều sử dụng công nghệ loại bỏ axit humic, một hợp chất tồn tại phổ biến trong

môi trường và gây ức chế phản ứng PCR. Bộ kit MOBIO là công nghệ Inhibitor

Removal (trong dung dịch Solution 3); bộ kit QIAgen là công nghệ InhibitEX. Do

vậy, chất lượng của metagenomic ADN tách theo hai phương pháp này đều đạt cho

giải trình tự gen thế hệ mới.

Do nồng độ metagenomic ADN tách theo bộ kit của QIAgen cao hơn so với

nồng độ ADN tách theo bộ kit MOBIO, vì vậy chúng tôi lựa chọn bộ kit này cho việc

tối ưu phương pháp cũng như sử dụng để tách ADN với các mẫu tiếp theo.

44

Để tăng hiệu suất tách metagenomic ADN, chúng tôi tăng nhiệt độ ủ mẫu ở bước 3 của quá trình tách chiết lên 95oC. Nhiệt độ này giúp cho quá trình ly giải thành tế bào của các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn gram dương được dễ dàng hơn (https://www.qiagen.com). Kết quả định lượng ADN bằng máy đo Nanodrop cho thấy, nồng độ trung bình của metagenomic ADN khi ly giải ở 95oC là 50 ng/µl cao hơn so với mẫu ly giải ở nhiệt độ 70oC (45,9 ng/µl) (Hình 3.5).

Hình 3.5. Hình ảnh điện đi metagenomic ADN của mẫu với nhiệt độ ly giải 95 và

70 độ; M: Marker 1kb (Thermo Scientific); ST95: Mẫu tách với nhiệt độ ly giải

95oC; ST70: Mẫu tách với nhiệt độ ly giải 70oC

Như vậy có thể khẳng định việc sử dụng tỏ nhiệt độ cao (95oC) đã tăng sự ly

giải tế bào vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương, dẫn đến nồng độ ADN thu được cũng

tăng theo.

Từ những kết quả trên, chúng tôi đã xây dựng được một quy trình tách metagenomic ADN từ mẫu nước sử dụng bộ kit QIAgen stool mini kit gồm các bước

cụ thể sau (Hình 3.6):

+ Chuẩn bị mẫu

- Lọc mẫu nước lần lượt qua màng 8 µm và 0,8 µm (Whatman) bằng bơm hút chân

không và giữ lại phần nước dưới bình lọc. Phần nước sau khi được lọc qua màng 0,8

45

µm tiếp tục được lọc qua màng 0,22 µm (Corning), sau khi lọc qua màng 0,22 µm

phần màng lọc được dùng để tách ADN.

- Cân từ 180-220 mg màng lọc, cắt nhỏ màng và cho vào ống eppendorf 2 ml.

+ Tách metagenomic ADN

- Bổ sung 1,4 ml dung dịch ASL vào mỗi ống mẫu. Vortex mẫu liên tục trong 1 phút.

- Ủ ống mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong 5 phút.

- Vortex ống mẫu trong 15 giây và ly tâm ống mẫu ở tốc độ 20.000 xg trong 1 phút.

- Hút 1,2 ml dịch nổi phía trên ống và chuyển sang ống eppendorf 2 ml mới. Loại bỏ

cặn dưới đáy ống.

- Bổ sung vào mỗi ống mẫu 1 viên InhibitEX, vortex ngay lập tức và liên tục trong 1

phút cho đến khi viên InhibitEX tan hoàn toàn. Ủ ống mẫu trong 1 phút ở nhiệt độ

phòng để các chất ức chế bị hấp thu vào viên InhibitEX.

- Ly tâm ống mẫu ở tốc độ cao trong 3 phút để thu dịch nổi phía trên, hút toàn bộ dịch

nổi cho sang ống eppendorf 1,5 ml mới, loại bỏ cặn lắng. Tiếp tục ly tâm ống mẫu ở

tốc độ cao trong vòng 3 phút.

- Hút 200 µl dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới có bổ sung 15 µl Proteinase

K.

- Bổ sung vào ống mẫu 200 µl dung dịch AL, vortex trong 15 giây.

- Ủ ống mẫu ở 95oC trong 10 phút.

- Bổ sung 200 µl ethanol (96-100%) vào ống mẫu, vortex trong thời gian ngắn.

- Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống sang cột QIAamp và ống ly tâm mới, ly tâm ở

tốc độ cao trong vòng 1 phút. Loại bỏ dịch dưới đáy ống ly tâm.

- Bổ sung vào cột QIAamp 500 µl Buffer AW1, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1

phút.

46

-Tiếp tục bổ sung 500 µl Buffer AW2 vào cột QIAamp, ly tâm ở tốc độ cao trong

vòng 3 phút để loại hoàn toàn dịch bám ở màng lọc.

- Chuyển cột QIAamp sang ống eppendorf 2 ml mới. Bổ sung 100-200 µl Buffer AE

vào chính giữa cột, ly tâm ở tốc độ cao trong vòng 1 phút để thôi ADN ra khỏi màng

lọc.

Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu nước phục vụ giải

trình tự gen thế hệ mới

3.3. Kết quả xác định trình tự metagenome ADN

3.3.1. Xác định trình tự ADN metagenome

47

Quá trình giải trình tự trên hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới Illumina

Hiseq 2500 bao gồm các bước được mô tả như hình 3.7.

Hình 3.7. Sơ đồ quy trình giải trình tự ADN metagenome

Với các mẫu giải trình tự 16S rARN, ADN sẽ được làm khuôn cho phản ứng

PCR vùng gen V3-V4 với cặp mồi có gắn các adapter đặc hiệu. Thư viện giải trình

tự được tạo bằng bộ kit Truseq ADN PCR-Free và chất lượng thư viện được đánh giá

bằng hệ thống Agilen Bioanalyzer 2100 trước khi giải trình tự trên máy Illumina

Hiseq 2500.

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra thư viện ADN được gắn adapter của các mẫu ruột (A),

nước (B) của mẫu tôm thẻ khỏe mạnh và các mẫu ruột (C), nước (D) của tôm thẻ

bệnh bằng Bioanalyzer.

Các thư viện sau đó được đưa lên máy giải trình tự gen thế hệ mới Illumina

HiSeq 2500 và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả giải trình tự được

48

thu nhận dưới dạng bộ dữ liệu đọc hai chiều (xuôi và ngược), có dung lượng như

Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Bảng mô tả bộ dữ liệu giải trình tự gen trên máy Illumina

STT Tên thư viện Tên file dữ liệu

1 Dung lượng dữ liệu thô 136.015

2 123.357

3 125.780

4 120.146 16S Ruột tôm thẻ bệnh 16S Ruột tôm thẻ khỏe mạnh 16S Nước ao nuôi tôm thẻ bệnh 16S Nước nước ao nuôi thẻ khỏe mạnh IST1-1. fastq.gz IST1-2. fastq.gz IST2-1. fastq.gz IST2-2. fastq.gz WST1-1. fastq.gz WST1-2. fastq.gz WST2-1. fastq.gz WST2-2. fastq.gz Loại thư viện 16S rRNA 16S rRNA 16S rRNA 16S rRNA

Từ các thư viện giải trình tự vùng gen V3-V4 gen 16S rARN, chúng tôi sẽ tiến

hành phân tích đa dạng loài và đa dạng mức độ gen ở các mẫu.

3.3.2. Kết quả phân tích đa dạng vi sinh vật mẫu ruột và nước

Hình 3.9. Sơ đồ quá trình phân tích dữ liệu 16S rARN

Để phân tích đa dạng vi sinh vật trong các mẫu ruột, nước ở các ao, đầm nuôi

tôm chúng tôi sử dụng phương pháp giải trình tự gen vùng V3-V4 của gen 16S rARN.

49

Các trình tự đầu ra được xử lý bằng các phần mềm tin sinh học, trên hệ thống máy

chủ của Viện Công nghệ sinh học như đã mô tả trong phần phương pháp. Các bước

của quy trình phân tích dữ liệu được mô hình hóa như hình 3.9.

Sau khi xử lý số liệu giải trình tự của các mẫu ruột, và nước của tôm thẻ bệnh

và khỏe mạnh, chúng tôi thu được tổng số 512.896 đoạn trình tự chất lượng tốt của

vùng gen V3-V4 gen 16S rARN. Bốn tập hợp mẫu đọc trình tự bao gồm mẫu ruột

tôm thẻ khỏe mạnh, mẫu ruột tôm thẻ bị bệnh, mẫu nước ở đầm nuôi tôm thẻ khỏe và

mẫu nước ở ao nuôi tôm thẻ bị bệnh chứa lần lượt 115.198, 105.021, 108.224 và

102.322 trình tự (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Các thông số giải trình tự và các chỉ số đa dạng phân tích ở các mẫu

nước, ruột của tôm thẻ bị bệnh và khỏe mạnh

Ruột tôm thẻ khỏe mạnh Ruột tôm thẻ bệnh Nước ao nuôi tôm thẻ khỏe mạnh Ruột ao nuôi tôm thẻ bệnh

115.198 601 105.021 643 108.224 592 102.322 643

0,999 597,405 4,939 0,999 610,595 4,526 0,999 435,652 3,484 0,999 582,875 2,984 Kết quả phân tích Tổng số trình tự Số OTUs Các chỉ số đa dạng Good's coverage Chao1 Shannon

Các trình tự được sắp xếp vào đơn vị phân loài (OTU) với 97% tương đồng.

Kết quả cho thấy, số lượng OTU ở các mẫu ruột tôm thẻ khỏe mạnh, ruột tôm thẻ

bệnh, nước ao nuôi tôm thẻ khỏe và nước ao nuôi tôm thẻ bệnh lần lượt là 601, 643,

592 và 643. Chỉ số Good coverage ở các mẫu đều là 0,999 cho thấy các OTU ở các

mẫu đều đại diện cho các loài có trong mẫu. Tiếp đó, chỉ số Chao1 được sử dụng để

đánh giá độ phong phú của các loài trong mẫu, kết quả cho thấy ở chỉ số này ở các

mẫu lần lượt là 597,405 với ruột khỏe mạnh, 610,595 với ruột tôm thẻ bệnh, 435,652

với nước tôm thẻ khỏe mạnh và 582,875với nước tôm thẻ bệnh. Chỉ số Shannon cho

thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa các mẫu (Bảng 3.6).

50

Hình 3.10. Đường cong biểu diễn mối tương quan giữa số lượng trình tự và số

lượng OTU ở các mẫu

Hình 3.10 biểu diễn mối tương quan giữa số lượng trình tự và số lượng OTU

trong các mẫu. Các đường cong ở Hình 3.10 chưa đạt đến trạng thái bão hòa trong

bốn mẫu nghiên cứu cho thấy rằng sự phong phú của vi khuẩn chưa được xác định

đầy đủ.

3.3.3. Thành phần vi khuẩn trong mẫu tôm thẻ khỏe mạnh và bệnh

Thành phần vi khuẩn chứa trong 4 mẫu phân tích được phân loại thành 10

ngành chính gồm Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes,

Verrucomicrobia, Cyanobacteria, Chlorobi, Gemmatimonadetes, GN02 và

Tenericutes (Hình 3.11).

51

Hình 3.11. Thành phần 10 ngành chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh

và khỏe mạnh

Trong đó, Proteobacteria là ngành chiếm ưu thế chính, dao động từ 68,2% -

83,4% trong 4 mẫu. Ngành chiếm ưu thế thứ hai tính trên tất cả các mẫu là ngành

Actinobacteria với tỉ lệ phần trăm nằm trong khoảng từ 5,1% tới 22,6% trong các

mẫu. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Oxley và cs năm 2002 và

Rungrassamee và cs năm 2014 trên hai đối tượng lần lượt là tôm bạc thẻ (Banana

prawn) và tôm sú (Penaeus monodon) [60]. Ngành Proteobacteria là ngành chiếm ưu

thế trong các hệ vi khuẩn được ghi nhận ở rất nhiều loài thuỷ sản trong đó có tôm thẻ

chân trắng [74]. Bên cạnh đó, từ kết quả thu được cũng ghi nhận sự thay đổi tỷ lệ giữa

hai ngành Actinobacteria và Bacteroidetes, cụ thể tỷ lệ số lượng vi sinh vật thuộc

ngành Actinobacteria/số lượng vi sinh vật thuộc ngành Bacteroidetes trong mẫu nước

và ruột tôm thẻ bị bệnh đều giảm so với trong mẫu nước và ruột tôm thẻ khỏe mạnh.

Điều này tương đồng với nghiên cứu của Qi và cộng sự (2018) trên tôm thẻ chân

trắng ở Mexico.

52

Hình 3.12. Thành phần 10 lớp chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và

khỏe mạnh

Hình 3.13. Thành phần 10 lớp chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và

khỏe mạnh

53

Hình 3.14. Thành phần 10 chi chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh và

khỏe mạnh

Ở mức độ chi, số lượng trình tự của 10 chi chiếm ưu thế nhất chiếm từ 40-58%

tổng số trình tự của toàn bộ các chi có trong các mẫu ruột và nước ao nuôi tôm thẻ

chân trắng (Hình 3.14). Đối với mẫu nước, Pseudomonas là chi chiếm ưu thế nhất

trong cả mẫu tôm thẻ khỏe mạnh và bị bệnh, với 36,1 % ở mẫu nước tôm thẻ khỏe

mạnh và 35,8% ở mẫu nước tôm thẻ bệnh. Sự khác biệt rõ rệt nhất trong 10 chi chiếm

ưu thể thể hiện ở các mẫu ruột. Cụ thể, ở mẫu ruột tôm khoẻ mạnh, chi Shewanella

chiếm tỉ lệ 12,2% còn ở ruột tôm thẻ bị bệnh là 1,7%. Các loài thuộc chi Shewanella

được phân bố rộng rãi trong môi trường nước, và được biết đến như các chủng

probiotic tiềm năng [5]. Ví dụ như S. algae đã được chứng minh có hoạt tính kháng

lại các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Vibrio như V. harveyi, V. parahaemolyticus

và V. alginolyticus [64]. Do đó, chi Shewanella có thể được sử dụng như các probiotic

tiềm năng cho nguôi tôm. Ngược lại, thành phần chi Vibrio trong mẫu ruột tôm thẻ

bị bệnh chiếm tới 21%. Trong khi đó, ở ruột tôm thẻ chi Vibrio chỉ chiếm 0,03%. Các

nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng thành phần vi khuẩn thuộc chi Vibrio có thể gây

ra các bệnh trên tôm như hội chứng hoại tử gan tụy cấp cho tôm. Kết quả của nghiên

54

cứu này cho thấy, thành phần loài thuộc chi Vibrio có tỉ lệ cao hơn ở các mẫu bệnh.

Bên cạnh đó, sự giảm đột ngột số lượng vi khuẩn thuộc chi Marinomonas trong mẫu

ruột tôm bị bệnh so với trong mẫu ruột tôm khỏe cũng có thể được xem xét là một

trong những nguyên nhân dẫn đến sự tăng sinh của các vi khuẩn thuộc chi Vibrio.

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng pH trong ruột tôm giảm (<5) có thể giúp kiểm soát mức

độ vibrio, và chi Marinomonas là chi có khả năng sinh axit từ mannit. Do đó, có thể

các loài thuộc chi này là nguyên nhân gây bệnh cho mẫu tôm thẻ trong nghiên cứu.

Hình 3.15. Kết quả phân tích thành phần chính (PcoA) ở các mẫu nước và ruột tôm

thẻ

Phân tích thành phần chính (Principal coordinate analysis - PCoA) trong các

mẫu nước và ruột tôm cho thấy, thành phần vi khuẩn trong nước và ruột ở tôm khỏe

mạnh có xu hướng tách xa nhau, trong khi đó ở nước và ruột của tôm bị bệnh thì

thành phần này cụm lại gần nhau. Kết quả này cho thấy thành phần vi khuẩn ở ruột

và nước của ao nuôi tôm bị bệnh có độ tương đồng cao hơn so với ruột và nước ở ao

nuôi tôm khỏe mạnh. Nghiên cứu của Soonthornchai và cộng sự, 2010 chỉ ra rằng,

các tác nhân gây bệnh ở trong môi trường như vi khuẩn và virus có thể xâm nhập vào

55

ống tiêu hóa của tôm và kích hoạt tính miễn dịch của tôm. Các nghiên cứu trước đây

cũng chỉ ra việc giữ ổn định sự cân bằng đa dạng vi khuẩn đóng vai trò quan trọng

trong tiêu hóa và miễn dịch ở tôm. Do đó, có thể thấy sự cân bằng này chỉ tồn tại ở

tôm khỏe mạnh và đã bị phá vỡ ở tôm bị bệnh [67].

56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

- Đã thu mẫu và đánh giá sơ bộ các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến chất

lượng tôm trong ao nuôi.

- Đã tối ưu hóa quy trình tách metagenome ADN từ mẫu nước và ruột tôm thu

từ ao nuôi tôm thâm canh tại Sóc Trăng, từ đó thu được ADN có chất lượng tốt phục

vụ cho việc giải trình tự gen.

- Đã thu được tổng số 512.896 đoạn trình tự vùng gen V3-V4 gen 16S rARN

có chất lượng tốt từ bốn tập hợp mẫu bao gồm mẫu ruột tôm thẻ khỏe mạnh, mẫu ruột

tôm thẻ bị bệnh, mẫu nước ở đầm nuôi tôm thẻ khỏe và mẫu nước ở đầm nuôi tôm

thẻ bị bệnh.

- Từ thư viện giải trình tự vùng gen V3-V4 gen 16S rARN, đã nhận thấy được

sự tương đồng về thành phần vi sinh vật giữa nước tôm thẻ bị bệnh và ruột tôm thẻ

bị bệnh và sự mất cân bằng về thành phần vi sinh vật trong ruột tôm bệnh, từ đó đưa

ra nhận định ban đầu về sự cân bằng các thành phần vi sinh vật trong ruột tôm giúp

duy trì sức khỏe của tôm.

2. Đề nghị

Sử dụng dữ liệu trong thư viện metagenome ADN thu được để tiến hành phân

tích và phân lập các nguồn gen có ích, phục vụ cho các mục đích sau này.

57

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần Minh Anh (1989), Đặc điểm sinh học và kỹ thuật nuôi tôm he. NXB. Tp.

Hồ Chí Minh.

2. Nguyễn Quốc Ân (2009), “Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y ở Việt

Nam”, Phòng Quản lý thuốc – Cục Thú y, MARD.

3. Nguyễn Trọng Nho, Tạ Khắc Thường, Lục Minh Diệp (2006), Kỹ Thuật nuôi

giáp xác, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

Tiếng Anh

4. Alavandi S. V. and Poornima M. (2012), “Viral Metagenomics: A Tool for

Virus Discovery and Diversity in Aquaculture”, Indian Journal of Virology

23(2), pp. 88–98.

5. Ariole C.N. , Eddo T.T. (2015), “Effect of an Indigenous Probiotic

(Shewanella algae) Isolated from Healthy Shrimp (Penaeus monodon)

Intestine on Clarias gariepinus”, International Journal of Aquaculture 5(36),

pp. 1-9.

6. Balcázar J.L., Rojas-Luna T. (2007), “Inhibitory activity of probiotic Bacillus

subtilis UTM 126 against Vibriospecies confers protection against vibriosis in

juvenile shrimp (Litopenaeus vannamei)’’, Current Microbiology 55(5), pp.

409–412.

7. Bomar L., Maltz M., Colston S. (2011), “Directed culturing of

microorganisms using metatranscriptomics”, mBio. 2(2).

8. Boyd C.E. (1990), “Water Quality in Ponds for Aquaculture”, 2nd Edn.,

Alabama Agricultural Experiment Station, Auburn University, Auburn, AL.,

USA, p. 482.

9. Boyd C.E. (1998), “Water quality in ponds for aquaculture”, Research and

Development Series. Number 43. International Centre for Aquaculture and

Aquatic Environments, Alabama Agricultural Experimental Station, Auburn

University, Alabama, pp: 402.

58

10. Boyd C. E., Tucker C. S. (2014), “Handbook for aquaculture water quality”,

Craftmaster Printers, Auburn, Alabama, pp. 439.

11. Burke C., Kjelleberg S., Thomas T., (2009), “Selective extraction of bacterial

DNA from the surfaces of macroalgae”, Applied and Environmental

Microbiology 75(1), pp. 252-256.

12. Chanratchakool, P. (2003), “Problems in Penaeus monodon culture in low

salinity areas”, Aquaculture Asia 8(3), pp. 53-56.

13. Chanratchakool, P., Turnbull J.F., Funge-Smith S.J., Macrae I.H., Limsuwan

C. (2003), “Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi”. Tái bản lần thứ 4. Người

dịch: Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần

Ngọc Hải. Danida-Bộ Thủy sản 2003, pp. 153.

14. Chen S. N., Chang, P. S., Kou, G. H., Lightner, D. (1989), “Studies on

virogenesis and cytopathology of Penaeus monodon baculovirus(MBV) in the

giant tiger prawn (Penaeus monodon) and the red tail prawn (Penaeus

penicillatus)”, Fish Pathology 24, pp. 89-100.

15. Chen S.N. (1990), “Collapse and Remedy for the Shrimp Culture Industry in

Taiwan”, Department of Zoology, National Taiwan University, Taipei.

16. Claassen S., du Toit E., Kaba M., Moodley C., Zar H.J., Nicol M.P. (2013),

“A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction

kits for extraction of DNA from faecal samples”, Journal of Microbiological

Methods 94, pp. 103–110.

17. Curtis T.P., Sloan W.T. (2004), “Prokaryotic diversity and its limits: microbial

community structure in nature and implications for microbial ecology”,

Current Opinion in Microbiology (7), pp. 221-226.

18. Dang P. K., Binh D. V., Ngan P. H., Douny C., Scippo M.-L., Degand G.,

Maghuin-Rogister, G. (2007), “Situation of shrimp culture and antibiotics

using in shrimp farming at Quang Ninh province, Vietnam”, Journal of

Agricultural Science and Technology, pp. 28-35.

59

19. Delmont T.O., Robe P., Clark I., Simonet P., Vogel T.M. (2011),

“Metagenomic comparison of direct and indirect soil DNA extraction”,

Journal of Microbiological Methods 86(3), pp. 397-400.

20. Djikeng A., Kuzmickas R., Anderson N.G., Spiro D.J. (2009), “Metagenomic

analysis of RNA viruses in a fresh water lake”, PLoS ONE. 4, pp. 7264.

21. Dridi B., Henry M., El Khéchine A., Raoult D., Drancourt M. (2009), “High

prevalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae

detected in the human gut using an improved DNA detection protocol”, PloS

One 4, e7063.

22. FAO (2018), Globalfish highlight, 1st issue.

23. Farzanfar A. (2006), “The use of probiotics in shrimp aquaculture”,

Immunology & Medical Microbiology 48(2), pp. 149-158.

24. Fast, A.W., and Boyd, C.E. (1992), “Water circulation, aeration and other

management practices”, In: Fast, A. W. Lester, L.J., Marine Shrimp Culture;

Principles and Practices, Elsevier Sciences Publishers, The Hague,

Netherlands, pp. 457-495.

25. Fernanda C.-G. (2017), “Microbiome of Pacific Whiteleg shrimp reveals

differential bacterial community composition between Wild, Aquacultured

and AHPND/ EMS outbreak conditions”, Scientific Report 7, pp. 11783.

26. Gao, Shuo, Pan, Luqing, Huang, Fei, Song, Mengsi, Tian, Changcheng,

Zhang, Mengyu (2018), “Metagenomic insights into the structure and function

of intestinal microbiota of the farmed Pacific white shrimp (Litopenaeus

vannamei)”, Aquaculture 499, pp. 109-118.

27. Ghai R., Rodrıguez-Valera F., McMahon K.D., Toyama D., Rinke R., Oliveira

T.C.S., Garcia J.W., Miranda F.P., Henrique-Silva F. (2011), “Metagenomics

of the water column in the pristine upper course of the Amazon river”, PLoS

ONE 6, pp. 23785.

28. Gilbert J.A., Meyer F., Schriml L., Joint I.R., Mühling M., Field D. (2010),

“Metagenomes and metatranscriptomes from the L4 long-term coastal

60

monitoring station in the Western English Channel Standards in Geno”,

Science 3, pp. 183-193.

29. Handelsman J., Rondon M.R., Brady S.F., Clardy J., Goodman R.M. (1998),

“Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a

new frontier for natural products”, Chemistry & Biology 5, pp. 245-249.

30. Handelsman J. (2004), “Metagenomics: Application of genomics touncultured

microorganisms”, Microbiology and Molecular Biology Review 68(4), pp.

669.

31. Hardeman F., Sjoling S. (2007), “Metagenomic approach for the isolation of

a novel low-temperature-active lipase fromuncultured bacteria of marine

sediment”, FEMS Microbiology Ecology 59, pp. 524-534.

32. Hou D., Zeng S., Liu J., Yan M., Weng S., He J., Huang Z. (2016),

“Characterization of prokaryotic and eukaryotic microbial community in

pacific white shrimp ponds”, Journal of Aquaculture Research &

Development 7(12), pp. 463–472.

33. Hwang C, Ling F, Andersen GL, LeChevallier MW, Liu WT (2012).

Evaluation of methods for the extraction of DNA from drinking water

distribution system biofilms. Microbes Environ. 27(1): 9-18.

34. Inoue K., Makino Y., Itoh N. (2005), “Purification and characterization of a

novel alcohol dehydrogenase from Leifsonia sp. strain S749: a promising

biocatalyst for an asymmetric hydrogen transfer bioreduction”, Applied and

Environmental Microbiology 71, pp. 3633-3641.

35. Jacquet S., Miki T., Noble R., Peduzzi P., Wilhelm S. (2010), “Viruses in

aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects

for the future in the field of microbial oceanography and limnology”,

Limnology and Oceanography 1, pp. 97-141.

36. Johnson C.N., Barnes S., Ogle J., Grimes D.J. (2008), “Microbial community

analysis of water, foregut, and hindgut during growth of Pacific white shrimp,

Litopenaeus vannamei, in closed-system aquaculture”, Journal of the World

Aquaculture Society 39, pp. 251–258.

61

37. Karunasagar I. & Ababouch, L. (2012), “Shrimp viral diseases, import risk

assessment and international trade”, Indian Journal of Virology 23(2), pp.

141-148.

38. Kennedy J., Marchesi J.R., Dobson A.D.W. (2007), “Metagenomic

approaches to exploit the biotechnological potential of the microbial consortia

of marine sponges”, Applied Microbiology and Biotechnology 75, pp. 11-20.

39. Krishnani K. K., Parimala V., Gupta B. P., Azad I. S., Meng X., Abraham M.

(2006), “Bagasse-Assisted Bioremediation of Ammonia from Shrimp Farm

Wastewater”, Water Environment Research 78(9), pp. 938–950.

40. Lang A.S., Rise M.L., Culley A.I., Steward G.F. (2009), “RNA viruses in the

sea”, FEMS Microbiology Review 33, pp. 295-323.

41. Liao I.C., Huang H.J. (1975), “Studies on the respiration of economic prawn

in Taiwan. I. Oxygen consumption and lethal dissolved oxygen of egg up to

young prawn of Penaeus monodon Fabricius”, Journal of the Fisheries Society

of Taiwan 4, pp. 33-50.

42. Liao I.C., Mural T. (1986), “Effects of dissolved oxygen, temperature and

salinity on the oxygen consumption of the grass shrimp, Penaeus monodon”,

In: The First Asian Fisheries Forum, eds. JL Maclean, LB Dizon, LV Hosillos.

Manila, Philipines: Asian Fisheries Society, pp. 641-646.

43. Liu K.F., Chiu C.H., Shiu Y.L., Cheng W., Liu C.H. (2010), “Effects of the

probiotic, Bacillus subtilis E20, on the survival, development, stress tolerance,

and immune status of white shrimp, Litopenaeus vannamei larvae”, Fish and

Shellfish Immunology 28(5-6), pp. 837–844.

44. Lussier F.X., Chambenoit O., Cote A., Hupe J.F., Denis F., Juteau P., Beaudet

R., Shareck F. (2011), “Construction and functional screening of a

metagenomic library using a T7 RNA polymerase-based expression cosmid

vector”, Indian Microbiology Biotechnology 38, pp. 1321-1328.

45. Martın-Cuadrado A.B., Lopez-Garcıa P., Alba J.C., Moreira D., Monticelli L.,

Strittmatter M., Gottschalk G., Rodrıguez-Valera F. (2007), “Metagenomics

62

of the deep Mediterranean, a warm bathypelagic habitat”, PLoS ONE 2(9), pp.

914.

46. Maukonen J., Simões C., Saarela M. (2012), “The currently used commercial

DNA-extraction methods give different results of clostridial and

actinobacterial populations derived from human fecal samples”, FEMS

Microbiology Ecology 79, pp. 697–708.

47. Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L., Ghiorse W.C. (1999), “Evaluation and

optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and

sediment samples”, Applied and Environmental Microbiology 65(11), pp.

4715-4724.

48. Min-Soo K., Tae W. W., Jin-Woo B. (2013), “Comparative Viral

Metagenomics of Environmental Samples from Korea”, Genomics

Information 11(3), pp. 121-128.

49. Monika U, Marek A. (2008), “Exploration of metagenomes for new enzymes

useful in food biotechnology – a review”, Polish Journal of Food and

Nutrition Sciences 58(1), pp. 11-22.

50. Moriarty D. J. K. (1999), “Disease Control in Shrimp Aquaculture with

Probiotic Bacteria”, Proceedings of the 8th International Symposium on

Microbial Ecology - Microbial Interactions in Aquaculture Disease 2013, pp.

424123.

51. Park E.J., Kim K.H., Abell G.C.J., Kim M.S., Roh S.W., Bae J.W. (2011),

“Metagenomic analysis of the viral communities in fermented foods”, Applied

and Environmental Microbiology 77, pp. 1284-1291.

52. Pettit R.K. (2004), “Soil DNA libraries for anticancer drug discovery”, Cancer

Chemotherapy and Pharmacology 54, pp. 1-6.

53. Pfister C.A., Meyer F., Antonopoulos D.A. (2010), “Metagenomic profiling

of a microbial assemblage associated with the California mussel: A node in

networks of carbon and nitrogen cycling”, PLoS ONE 5, e10518.

63

54. Phuong N. T., Huynh T. T., Pham K. D., Dang V. B. (2006), “Survey on the

use of chemicals and drugs in shrimp farming in Vietnam”, In: Final report of

a Joint Vietnamese - Belgian project funded by SPO, Brussels, pp. 4-23.

55. Qiu L., Chen M. M., Wang R. Y., Wan X. Y., Li C., Zhang Q. L., Dong X.,

Yang B., Xiang J. H., … Huang J. (2017), “Complete genome sequence of

shrimp hemocyte iridescent virus (SHIV) isolated from white leg shrimp,

Litopenaeus vannamei”, Archives of virology 163(3), pp. 781-785.

56. Qiu L., Chen M. M., Wan X. Y., Li C., Zhang Q. L., Wang R. Y., Cheng D.

Y., Dong X., Yang, B., Wang X. H., Xiang J. H., … Huang J. (2017),

“Characterization of a new member of Iridoviridae, Shrimp hemocyte

iridescent virus (SHIV), found in white leg shrimp (Litopenaeus

vannamei)”, Scientific reports 7(1), pp. 11834.

57. Qiu L., Chen M.-M., Wan X.-Y., Zhang Q.-L., Li C., Dong X., Huang J.

(2018), “Detection and quantification of shrimp hemocyte iridescent virus by

TaqMan probe based real-time PCR”, Journal of Invertebrate Pathology 154,

pp. 95–101.

58. Raaijmakers J.M., Weller D.M., Thomashow L.S. (1997), “Frequency of

antibiotic-producing Pseudomonas spp. in natural environments”, Applied and

Environmental Microbiology 63, pp. 881-887.

59. Riesenfeld C. S., Schloss D. P., Handelsman J. (2004), “Metagenomics:

Genomic analysis of microbial communities”,.Annual Review of Genetics 38,

pp. 525-552.

60. Rungrassamee W., Klanchui A., Maibunkaew S., et al., (2015), “Bacterial

dynamics in intestines of the black tiger shrimp and the Pacific white shrimp

during Vibrio harveyi exposure”, Journal of Invertebrate Pathology 133, pp.

12–19.

61. Sakami, T., Fujioka, Y., Shimoda. T. (2008), “Comparison of microbial

community structures in intensive and extensive shrimp culture ponds and a

mangrove area in Thailand”, Fisheries Science 74, pp. 889–898.

64

62. Schmeisser C., Steele H., Streit W.R. (2007), “Metagenomics, biotechnology

with non-culturable microbes”. Applied Microbiology Biotechnology 75, pp.

955-962.

63. Schmidt T. M., DeLong E. F., & Pace N. R. (1991), “Analysis of a marine

picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing”,

Journal of bacteriology 173(14),pp. 4371-4378.

64. Shakibazadeh S., Saad Che Roos, Hafezieh M. , Christianus A. , Saleh

Kamarudin M., Sijam K. (2012), “A putative probiotic isolated from hatchery

reared juvenile Penaeus monodon’, Iranian Journal of Fisheries Sciences

11(4), pp. 849-866.

65. Shen B., Du L., Sanchez C., Edwards D.J., Chen M., Murrell J.M. (2001),

“The biosynthetic gene cluster for the anticancer drug bleomycin from

Streptomyces verticillus ATCC15003 as a model for hybrid peptide–

polyketide natural product biosynthesis”, Journal of Industrial Microbiology

and Biotechnology 27, pp. 378-385.

66. Skoko N., Vujovic J., Savic M., Papic N., Vasiljevic B., Ljubijankic G. (2005),

“Construction of Saccharomyces cerevisiae strain FAV20 useful in detection

of immunosuppressants produced by soil actinomycetes”, Journal of

Microbiological Methods 61, pp. 137-140.

67. Soonthornchai W., Rungrassamee W., Karoonuthaisiri N., Jarayabhand P.,

Klinbunga S., Söderhäll K., Jiravanichpaisal P. (2010), “Expression of

immune-related genes in the digestive organ of shrimp, Penaeus monodon,

after an oral infection by Vibrio harveyi”, Developmental & Comparative

Immunology 34(1), pp. 19–28.

68. Tang Y., Tao P., Tan J., Mu H., Peng L., Yang D., Tong S., Chen L. (2014),

“Identification of bacterial community composition in freshwater aquaculture

system farming of Litopenaeus vannamei reveals distinct temperature-driven

patterns”, International Journal of Molecular Sciences 15(8), pp. 13663-

13680.

65

69. Torsvik V., Ovreas L. (2002), “Microbial diversity and function in soil: from

genes to ecosystems”, Current Opinion in Microbiology 5, pp. 240-245.

70. Torsvik V., Ovreas L., Thingstad T.F. (2002), “Prokaryotic diversity–

magnitude, dynamics, and controlling factors”, Science 296, pp. 1064-1066.

71. Ullrich R., Nuske J., Scheibner K., Spantzel J., Hofrichter M. (2004), “Novel

haloperoxidase from the agaric basidiomycete Agrocybe aegerita oxidizes aryl

alcohols and aldehydes”, Applied and Environmental Microbiology 70, pp.

4575-4581.

72. Urakawa H., Martens-Habbena W., Stahl D.A. (2010), “High abundance of

ammonia-oxidizing Archaea in coastal waters, determined using a modified

DNA extraction method”, Applied and Environmental Microbiology 76(7), pp.

2129-2135.

73. Van der Meeren T., Brunvold L., Sandaa R.-A., Bergh O., Castberg T.,

Thyrhaug R., Mangor-Jensen A. (2011), “Water quality and microbial

community structure in juvenile Atlantic cod (Gadus morhua L.) cultures”,

Aquaculture 316, pp. 111–120.

74. Van Kessel M.A., Dutilh B.E., Neveling K., Kwint M.P., Veltman J.A., Flik

G., Op den Camp H.J. (2011), “Pyrosequencing of 16S rRNA gene amplicons

to study the microbiota in the gastrointestinal tract of carp (Cyprinus carpio

L.)”, AMB Express 1, pp. 41.

75. Verschuere L., Heang H., Criel G., Dafnis S., Sorgeloos P., and Verstraete W.

(2000), “Protection of Artemia against the pathogenic effects of Vibrio

proteolyticus CW8T2 by selected bacterial strains” Applied and

Environmental Microbiology 66, pp. 1139-1146.

76. Wang Y., Qian P.Y. (2009), “Conservative fragments in bacterial 16S rRNA

genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in mtagenomic

sudies”, PLoS ONE 4, pp. 7401.

77. Wang L., Chen Y., Huang H., Huang Z., Chen H., Shao Z. (2014), “Isolation

and identification of Vibrio campbellii as a bacterial pathogen for luminous

66

vibriosis of Litopenaeus vannamei”, Aquaculture Research 46(2), pp. 395–

404.

78. Wang Y, Fujii T. (2011) Evaluation of methods of determining humic acids in

nucleic acid samples for molecular biological analysis. Biosci Biotechnol

Biochem. 75(2): 355-357.

79. Warneckea F., Matthias H. (2009), “A perspective: Metatranscriptomics as a

tool for the discovery of novel biocatalysts”, Journal of Biotechnology 142,

pp. 91-95.

80. Williamson S.J., Rusch D.B., Yooseph S., Halpern A.L., Heidelberg K.B.,

Glass J.I., Andrews-Pfannkoch C., Fadrosh D., Miller C.S., Sutton G., Frazier

M., Venter J.C. (2008), “The sorcerer II global ocean sampling expedition:

Metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples”

PLoS ONE 3, e1456.

81. Yu Z., Morrison M. (2004), “Improved extraction of PCR-quality community

DNA from digesta and fecal samples” Biotechniques 36(5), pp. 808-812.

82. Yuan S., Cohen D.B., Ravel J., Abdo Z., Forney L.J. (2012), “Evaluation of

Methods for the Extraction and Purification of DNA from the Human

Microbiome”, PLoS ONE 7.

83. Yuyi T., Peiying T., Jianguo T., Haizhen M., Li P., Dandan Y., Shilu T. and

Lanming C., (2014), “Identification of Bacterial Community Composition in

Freshwater Aquaculture System Farming of Litopenaeus vannamei Reveals

Distinct Temperature-Driven Patterns”, International Journal of Molecular

Sciences 15, pp. 13663-13680.

84. Zeng Y., Ma Y., Wei C., Jiao N., Tang K., Wu Z., Jian, J. (2010), “Bacterial

diversity in various coastal mariculture ponds in Southeast China and in

diseased eels as revealed by culture and culture-independent molecular

techniques”, Aquaculture Research 41, e172–186.

85. Zhang M., Sun Y., Chen K., Yu N., Zhou Z., Chen L., Du Z., Li E. (2014),

“Characterization of the intestinal microbiota in Pacific white shrimp,

67

Litopenaeus vannamei, fed diets with different lipid sources”, Aquaculture

434, pp. 449–455.

86. Zoetendal E.G., Heilig H.G.H.J., Klaassens E.S., Booijink C.C.G.M.,

Kleerebezem M., Smidt H., de Vos W.M. 2006, “Isolation of DNA from

bacterial samples of the human gastrointestinal tract”, Nature Protocols 1, pp.

870–873.

87. Zhou J., Bruns M.A., Tiedje J.M. (1996), “DNA –recovery from soils of

diverse composition”. Applied and Environmental Microbiology 62(2), pp.

316-322.