Nghiên cứu đặc điểm hình thái mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô tế bào gan người

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MÔ U TRÊN CHUỘT<br /> THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƢ<br /> BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN NGƢỜI<br /> Nguyễn Văn Ba* và CS<br /> TÓM TẮT<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghép tế bào (TB) ung thư gan người dòng Hep 3B2 vào dưới d a<br /> đùi chuột và tạo khối ung thư phát triển trên chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice”. Kết quả cho thấy<br /> 6<br /> chuột hình thành khối u sau 1 tuần ghép 10 TB ung thư Hep 3B. Kích thước khối u phát triển đạt kích<br /> 3<br /> thước xấp xỉ 600 mm sau 4 tuần ghép TB. Phân tích giải phẫu bệnh lý chứng minh khối u mới tạo<br /> thành trên chuột có hình ảnh TB đa diện, tăng sản, nhân quái, nhân chia, một số TB có sắc tố mật.<br /> * Từ khóa: Tế bào ung thư gan người dòng Hep 3B; Chuột thiếu hụt miễn dịch; Ghép dị loài.<br /> <br /> Study on morphological characteristics of<br /> tumor tissue in nude mice bearing human<br /> hepatocellular carcinoma<br /> Summary<br /> In this study, we had implanted human hepatocellular carcinoma Hep 3B2 cells into subcutanous<br /> thigh of athymic mice. Results showed that mice developed tumor after 1 week of injection Hep 3B<br /> cell line with 106 cells/mouse. The size of tumors were 600 mm 3 approximately after transplated 4<br /> weeks. The tumor histologic analysis indicated that the tumors contained hyperchromasia, nuclear<br /> enlargement with atypia and bile pigments inside cytoplasm.<br /> * Key words: Hep 3B; Nude mice; Xenograft.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư biểu mô tế bào gan (UBTG) là<br /> bệnh ác tính thường gặp. Trong tổng số các<br /> bệnh nhân (BN) UBTG, châu Á chiếm 70%,<br /> châu Phi chiếm 12%, trong khi đó châu Âu<br /> chỉ có 9% và Bắc Mỹ 2%. Khu vực có tỷ lệ<br /> mắc UBTG cao nhất là châu Á, từ 27,6 36,6 BN/100.000 dân [4]. Ở Việt Nam,<br /> UBTG đứng hàng thứ 3 trong các loại ung<br /> thư (sau ung thư phế quản và ung thư dạ<br /> <br /> dày). Phan Thị Phi Phi và CS khám 1.251<br /> BN bị bệnh gan đã phát hiện 193 BN UBTG<br /> (15,4%), sàng lọc 4.677 người trong quần<br /> thể phát hiện 2 BN UBTG [1].<br /> Đứng trước thách thức về mức độ ác<br /> tính, kháng điều trị của ung thư gan, ngày<br /> nay người ta đang phát triển các liệu<br /> pháp và dược chất mới điều trị. Để có thể<br /> ứng dụng kỹ thuật, vật liệu mới trong điều<br /> trị ung thư, cần phải có mô hình bệnh lý<br /> để áp dụng cho thử nghiệm tiền lâm sàng.<br /> <br /> * Häc viÖn Qu©n y<br /> Ng-êi ph¶n håi (Corresponding): NguyÔn V¨n Ba (bsnguyenvanba@yahoo.com)<br /> Ngµy nhËn bµi: 27/7/2013; Ngµy ph¶n biÖn ®¸nh gi¸ bµi b¸o: 5/9/2013<br /> Ngµy bµi b¸o ®-îc ®¨ng: 26/9/2013<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013<br /> Các mô hình ung thư trước đây được<br /> tạo ra trên động vật có nguồn gốc đồng loài.<br /> Tuy nhiên, hạn chế của mô hình đó là khối<br /> u không mang đặc tính sinh học giống như<br /> khối u trên người, điều này làm hạn chế<br /> trong nghiên cứu cơ chế bệnh lý và áp<br /> dụng thử nghiệm điều trị cho các loại ung<br /> thư người.<br /> Do vậy, yêu cầu cấp thiết là cần phải có<br /> mô hình động vật bị ung thư mang đặc tính<br /> sinh học ung thư là nguyên bản của TB ung<br /> thư người. Để phục vụ nghiên cứu tiền lâm<br /> sàng ung thư gan, chúng tôi tiến hành đề<br /> tài này nhằm: Đánh giá đặc điểm hình thái<br /> mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang<br /> khối UBTG người. Nghiên cứu là cơ sở cho<br /> việc thử nghiệm các liệu pháp chẩn đoán<br /> điều trị UBTG.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> - 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn<br /> dịch, không có TB lympho T (nude mice,<br /> Foxn1 nu) nhập khẩu từ Công ty CharlesRiver (Hoa Kỳ).<br /> - Môi trường nuôi cấy và bảo quản TB:<br /> môi trường EMEM (Eagle's Minimum Essential<br /> Medium), Catalog No.30-2003, ATCC được<br /> bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh penicillin<br /> và streptomycine.<br /> - Dòng TB ung thư biểu mô gan Hep<br /> 3B2 mua từ Công ty ATCC (Hoa Kỳ).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Nuôi cấy và ghép TBUT vào chuột:<br /> Nuôi cấy UBTG người trong môi trường<br /> EMEM, bổ sung 10% FBS và 1% kháng<br /> sinh penicillin và streptomycine. Mỗi chai<br /> nuôi cấy diện tích 75 cm 2 được cấy chứa<br /> 106 TB. TB được nuôi cấy tăng sinh và thay<br /> <br /> môi trường 3 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ<br /> 370C, CO2 5%. Khi TB phát triển đạt 75 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển sang<br /> chai mới. Trước ghép, rửa TB 2 lần bằng<br /> dung dịch PBS 1X, sau đó, tách bằng dung<br /> dịch Trypsin-EDTA 1X. Hút dung dịch TBUT<br /> đã chuẩn bị, bơm tiêm 1 ml với số lượng<br /> 107/ml. Cố định chuột nude và tiêm 0,1 ml<br /> vào dưới da đùi phải (106 TB/chuột). Quá<br /> trình thao tác thực hiện trong điều kiện vô<br /> trùng tuyệt đối.<br /> * Theo dõi và xác định sự hình thành<br /> khối ung thư trên chuột:<br /> - Đánh giá theo dõi sự phát triển khối u<br /> tại vị trí tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần, bằng<br /> quan sát, sờ nắn và đo kích thước khối u<br /> bằng thước chính xác NSK.<br /> - Xác định kích thước khối u: đo theo hai<br /> kích thước dài x rộng bằng thước chính xác<br /> NSK (Nhật Bản), 2 lần/tuần. Xác định kích<br /> thước u theo phương pháp của Yamaura<br /> và CS [5].<br /> - Theo dõi trọng lượng chuột 2 lần/tuần,<br /> xác định biến đổi trọng lượng chuột giữa<br /> các lần cân kế tiếp.<br /> * Xác định hình thái vi thể khối ung thư<br /> trên chuột:<br /> - Sau 4 tuần tiến hành giết chuột, bóc<br /> tách khối u, bảo quản trong dung dịch<br /> formalin 10% trong 24 - 48 giờ. Tiếp theo,<br /> khối u được đúc khối paraffin, cắt lát dày<br /> 5 µm, nhuộm HE (Hematoxylin-Eosin) và đọc<br /> phân tích kết quả mô ung thư hình thành<br /> dưới kính hiển vi quang học. Phân tích đặc<br /> điểm về hình thái học TB, cấu trúc mô hình<br /> thành, mạch máu, xâm lấn… Kỹ thuật<br /> tiến hành tại Khoa Giải phẫu Bệnh lý, Bệnh<br /> viện 103.<br /> * Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm<br /> SPSS15.0.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả nuôi cấy, tăng sinh tế bào<br /> ung thƣ gan.<br /> Tế bào ung thư gan người được lựa<br /> chọn là dòng Hep 3B2 do công ty ATCC<br /> (Hoa Kỳ) cung cấp. Đây là dòng TB ung thư<br /> chuẩn quốc tế được nhiều nhà nghiên cứu<br /> trên thế giới áp dụng thử nghiệm in vitro và<br /> in vivo. TB ung thư gan Hep 3B2 là TB biểu<br /> mô, có tính bám dính tốt, có khả năng tăng<br /> sinh nhanh. Để chủ động thời gian nuôi cấy<br /> phục vụ cho thử nghiệm in vitro sau này và<br /> ghép TB lên chuột nude, chúng tôi tiến hành<br /> quan sát tốc độ tăng sinh của dòng TB này.<br /> <br /> Tế bào ung thư gan người được nuôi<br /> cấy, tăng sinh trong chai 75 cm 2. Sau 24<br /> giờ gieo TB, TB bắt đầu tăng sinh. Với số<br /> lượng TB gieo ban đầu khoảng 0,3 - 0,4 x<br /> 106/chai, diện tích che phủ chai đạt khoảng<br /> 25 - 30%. Tốc độ tăng sinh TB cao nhất trong<br /> khoảng 2 - 5 ngày sau gieo. Sau 5 ngày,<br /> diện tích che phủ chai nuôi lên tới 65 - 70%.<br /> Sau thời điểm này, tốc độ tăng sinh TB<br /> chậm lại và đạt 80% diện tích chai nuôi sau<br /> 7 - 8 ngày. Theo khuyến cáo của nhà cung<br /> cấp, lúc này là thời điểm thu hoạch TB để<br /> tiến hành thử nghiệm hoặc lưu giữ. Số lượng<br /> TB mỗi chai nuôi đạt trung bình 106 TB.<br /> 2. Theo dõi và xác định sự hình thành<br /> khối ung thƣ trên chuột.<br /> Kết quả 10 ngày sau ghép TB có 10/10<br /> chuột (100%) hình thành khối u, kích thước<br /> khối u đạt 38,4 ± 7,2 mm 3. Sau 4 tuần, khối<br /> u phát triển đạt kích thước trung bình 585,9<br /> ± 114,9 mm 3.<br /> Bảng 1: Kích thước khối ung thư gan<br /> trên đùi chuột<br /> <br /> Hình 1: TB ung thư gan khi mới gieo vào<br /> môi trường.<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh TB ung thư gan người<br /> Hep 3B2 phủ ~70% diện tích chai nuôi<br /> sau 5 ngày nuôi cấy.<br /> <br /> Ngµy<br /> <br /> KÝch th-íc khèi<br /> <br /> sau ghÐp<br /> <br /> u (mm3, n = 10)<br /> <br /> t_11<br /> <br /> 38,4<br /> <br /> 7,2<br /> <br /> t_14<br /> <br /> 74,1<br /> <br /> 11,4<br /> <br /> t_18<br /> <br /> 108,5<br /> <br /> 10,7<br /> <br /> t_21<br /> <br /> 218,4<br /> <br /> 34,7<br /> <br /> t_25<br /> <br /> 383,9<br /> <br /> 85,3<br /> <br /> t_28<br /> <br /> 585,9<br /> <br /> 114,9<br /> <br /> SE<br /> <br /> Dễ dàng nhận thấy, sau khi khối ung thư<br /> xuất hiện vào thời điểm 11 ngày sau ghép,<br /> khối này phát triển liên tục theo thời gian<br /> đến khi kết thúc thí nghiệm. Tốc độ phát<br /> triển mạnh khi khối u đạt kích thước khoảng<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013<br /> 200 mm 3, tại thời điểm 21 ngày sau ghép<br /> TB. Chỉ trong vòng 2 tuần, khối u tăng gần<br /> gấp 3 lần kích thước. Kết quả nghiên cứu<br /> của chúng tôi cũng phù hợp với Kubota T<br /> (1994) [3].<br /> Sau ghép, kiểm tra vị trí tiêm TB ung thư<br /> 2 lần/tuần, liên tục cho tới khi kết thúc, tiến<br /> hành làm giải phẫu bệnh lý sau ghép TB<br /> khoảng 4 tuần. Khối ung thư gan người<br /> phát triển dưới da đùi chuột có màu tím<br /> sẫm, khác biệt với các dòng TB ung thư<br /> người cùng kích thước.<br /> <br /> Hình 3: Hình ảnh khối u xâm lấn vào<br /> khối cơ đùi (HE x100).<br /> <br /> Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ<br /> thành công trong tạo khối UBTG người trên<br /> chuột thiếu hụt miễn dịch rất cao, đạt 100%<br /> tổng số chuột ghép. Kết quả này phù hợp<br /> với nghiên cứu của một số tác giả đã công<br /> bố: tỷ lệ thành công trong kỹ thuật ghép dị<br /> loài từ 85 - 100% [2, 3].<br /> 3. Đặc điểm hình thái vi thể mô u hình<br /> thành trên chuột thiếu hụt miễn dịch.<br /> Khối u sau khi bóc tách ra khỏi đùi chuột,<br /> cắt thành mảnh nhỏ, bảo quản ở -800C, lấy<br /> 3 mảnh bảo quản trong dung dịch formalin<br /> 10% trong 24 - 48 giờ. Sau đó, đúc mảnh<br /> mô ung thư trong khối parafin, cắt lát 5 μm,<br /> nhuộm HE để phân tích hình ảnh mô bệnh<br /> học mô ung thư hình thành trên chuột.<br /> Kết quả nghiên cứu giải phẫu bệnh cho<br /> thấy cấu trúc của tổ chức sinh thiết gồm TB<br /> hình đa diện sắp xếp thành các đám hoặc<br /> ổ, giữa chúng là xoang mạch máu. Các TB<br /> u có bào tương rộng, nhân không đều, tăng<br /> sắc, chất nhân thô, có nhiều nhân quái và<br /> nhân chia bất thường. Trong bào tương,<br /> một số TB u có chứa sắc tố mật. U xâm lấn<br /> tổ chức cơ vân. Đây là hình ảnh UBTG biệt<br /> hoá thấp, xâm lấn cơ vân.<br /> <br /> Hình 4: Hình ảnh các TB đa diện xếp thành<br /> đám, giữa là xoang mạch máu (HE x 200).<br /> <br /> Hình 5: Hình ảnh TB u có bào tương rộng,<br /> nhân không đều, tăng sắc, chất nhân thô,<br /> có nhiều nhân quái và nhân chia bất<br /> thường (HE x 400).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013<br /> Như vậy đã xây dựng thành công mô<br /> hình UBTG người trên động vật thiếu hụt<br /> miễn dịch, đáp ứng tốt cho đòi hỏi trong<br /> điều kiện thực tế nghiên cứu về ung thư tại<br /> Việt Nam. Các điều kiện nuôi động vật, TB<br /> đều đáp ứng yêu cầu nghiêm ngặt về vô<br /> khuẩn, tuân thủ theo hướng dẫn của nhà<br /> cung cấp, tổ chức FDA (Hoa Kỳ).<br /> KẾT LUẬN<br /> - Đã ghép thành công TB tạo khối UBTG<br /> người trên chuột thiếu hụt miễn dịch bằng<br /> kỹ thuật ghép dị loài.<br /> Tế bào UBTG Hep 3B được nuôi cấy,<br /> tăng sinh và phát triển tốt tại phòng thí<br /> nghiệm. Với số lượng TB ghép 1 x 106/con,<br /> toàn bộ số chuột nude đều phát triển khối u<br /> tại vị trí được ghép. Sau khi cấy ghép lên<br /> chuột nude, TB ung thư gan đã phát triển<br /> thành khối u có kích thước 600 mm 3 sau<br /> 4 tuần ghép trên chuột nude.<br /> - Hình thái vi thể trên tiêu bản nhuộm HE<br /> cho thấy mô u có hình ảnh UBTG biệt hoá<br /> thấp. Khối u xâm lấn tổ chức cơ vân, có cấu<br /> trúc gồm TB hình đa diện sắp xếp thành<br /> các đám hoặc ổ, giữa chúng là xoang mạch<br /> máu. Các TB u có bào tương rộng, nhân<br /> không đều, tăng sắc, chất nhân thô, có<br /> nhiều nhân quái và nhân chia bất thường,<br /> trong bào tương một số TB u có chứa sắc<br /> tố mật. Kết quả này đã chứng minh khối<br /> ung thư gan người phát triển trên chuột<br /> nude<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Phan Thị Phi Phi và CS. Góp phần nghiên<br /> cứu ung thư gan nguyên phát ở Việt Nam, tần<br /> suất HBsAg trong huyết thanh người lành và<br /> người bị UBTG. Y học Việt Nam. 1993, 171,<br /> tr.26-30.<br /> <br /> 2. GG Steel, MJ Peckham. Human tumour<br /> xenografts: A critical appraisal. Br J Cancer.<br /> 1980, 41, Suppl, IV, pp.133-139.<br /> 3. Kubota T. Metastatic models of human<br /> cancer xenografted in the nude mouse: the<br /> importance of orthotopic transplantation. J Cell<br /> Biochem. 1994, 56 (1), pp.4-8.<br /> 4. Myron J Tong et al. Surveillance for<br /> hepatocellular carcinoma in patients with chronic<br /> viral hepatitis in the United States of America.<br /> Journal of Gastroenterology and Hepatology.<br /> 2001, 16, pp.553-559.<br /> 5. Yamaura et al. Solitary lung tumors and<br /> their spontaneous metastasis in athymic nude<br /> mice orthotopically implanted with human nonsmall cell lung cancer. Neoplasia. 2000, 2,<br /> pp.315-324.<br /> <br />