Nghiên cứu định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin trong quả ớt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG CAPSAICIN VÀ DIHYDROCAPSAICIN TRONG<br /> QUẢ ỚT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến*<br /> Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương*<br /> TÓM TẮT<br /> Tiến hành định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin trong quả ớt bằng phương pháp sắc ký<br /> lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với quang phổ UV-Vis. Tiến hành phân tích trên cột pha<br /> đảo C18 (5 μm; 4,6 mm x 150 mm), với chương trình gradient sử dụng dung môi A (nước) và<br /> dung môi B (acetonitril), bước sóng 222 nm, tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Giới hạn phát hiện của<br /> capsaicin và dihydrocapsaicin tương ứng 8 và 11 ng/mL. Giới hạn định lượng của capsaicin và<br /> dihydrocapsaicin tương ứng 24 và 33 ng/g. Phương pháp này áp dụng cho 20 mẫu ớt thu mua<br /> trên thị trường. Kết quả: hàm lượng capsaicin và dihydrocapsaicin biến động nhiều giữa các mẫu.<br /> * Từ khóa: Capsaicin; Ớt; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> Quantitation of Capsaicin and Dihydrocapsaicin in<br /> Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis method<br /> summary<br /> We quantitated capsaicin and dihydrocapsaicin in Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis<br /> method. The separation was carried out on a reversed phase C18 (5 μm; 4.6 mm x 150 mm) by<br /> gradient elution with water and acetonitrile, the wave length was set at 222 nm, the flow rate<br /> water was set at 0.6 ml/min. The limit of detection (LOD) of the method was 8 and 11 ng/g for<br /> capsaicin and dihydrocapsaicin, respectively. The limit of quantification (LOD) was 24 and 33<br /> ng/mL. The developed method was applied to the quantitation of 20 sample of different Fructus<br /> Capsici samples purchased from markets. The results showed that the contents of capsaicin<br /> and dihydrocapsaicin were different between samples.<br /> * Key words: Capsaicin; Capsicum; HPLC.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ớt thuộc chi Capsicum, họ Cà (Solanaceae),<br /> có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ,<br /> ngày nay được trồng nhiều ở các nước<br /> nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt<br /> đới của châu Á [1]. Ở Việt Nam, hiện nay<br /> có gần 10 loại ớt được sử dụng trong<br /> chữa đau lưng, thấp khớp, đau dây thần<br /> <br /> kinh, viêm thanh quản, viêm họng… [2].<br /> Nghiên cứu về thành phần hóa học và tác<br /> dụng sinh học của ớt cho thấy các nhóm<br /> hoạt chất như capsaicinoid (capsaicin,<br /> dihydrocapsaicin...), sắc tố carotenoid là<br /> capsanthine, adenine, betaine và cholien<br /> vitamin B1, B2, C… có tác dụng giảm đau,<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 28/03/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/05/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/05/2014<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> tác dụng trên da và niêm mạc, tác dụng<br /> giảm tích lũy lipid gan… Gần đây, một số<br /> tác giả nước ngoài cũng đã chứng minh<br /> capsaicin có tác dụng giảm đau, chống<br /> đau viêm khớp và viêm [3, 4]. Một số<br /> nghiên cứu chỉ ra capsaicin có hiệu<br /> quả chống ung thư [5], cũng như chống<br /> lại cholesterol cao và béo phì [6, 7].<br /> <br /> chuẩn cho HPLC. Các hóa chất khác đạt<br /> tiêu chuẩn phân tích.<br /> - Máy HPLC Alliance Water 2695D,<br /> gồm hệ bơm 4 kênh dung môi, autosampler,<br /> buồng ổn định nhiệt cột và Water 996<br /> PDA Detector. Thực hiện phân tích trên<br /> cột pha đảo C 18 (4,6 mm x 150 mm,<br /> 5 µm).<br /> <br /> Dihydrocapsaicin có tác dụng chống lại<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> <br /> sự hình thành mảnh xơ vữa động mạch<br /> <br /> - Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc<br /> <br /> [8]. Ngoài ra, capsaicin và những chất<br /> khác trong nhóm capsaicinoid có tác dụng<br /> <br /> được pha bằng cách hòa tan capsaicin và<br /> dihydrocapsaicin chuẩn trong methanol<br /> <br /> sinh lý và dược lý trên đường ruột - dạ<br /> <br /> với nồng độ 1 mg/ml. Từ dịch gốc capsaicin<br /> <br /> dày, hệ tim mạch và hô hấp, cũng như<br /> <br /> và dihydrocapsaicin, pha các dung dịch<br /> <br /> các giác quan và hệ điều hòa nhiệt.<br /> <br /> chuẩn làm việc thích hợp.<br /> <br /> Hàm lượng của hoạt chất trong ớt phụ<br /> <br /> - Mẫu thử: cân chính xác 1 g mẫu bột<br /> <br /> thuộc nhiều vào loài, thổ nhưỡng, khí<br /> <br /> ớt, cho vào bình định mức 25 ml, thêm<br /> <br /> hậu, cách trồng, chăm sóc và thu hoạch.<br /> <br /> methanol 100% đến vạch. Chiết siêu âm<br /> <br /> Do vậy, việc đánh giá chất lượng ớt thu<br /> <br /> trong 60 phút ở 25oC, lọc qua màng 0,45 µm.<br /> <br /> mua trên thị trường là cần thiết. Trong<br /> <br /> Dịch lọc được dùng để tiêm mẫu.<br /> <br /> nghiên cứu này, chúng tôi phát triển<br /> phương pháp định lượng capsaicin và<br /> dihydrocapsaicin để lựa chọn nguyên liệu<br /> ớt có hàm lượng hoạt chất cao nhất.<br /> NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ<br /> PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> - Mẫu ớt được mua tại các khu vực<br /> khác nhau của Việt Nam và mã hóa thành<br /> các mẫu C01 đến C20.<br /> - Hóa chất: capsaicin và dihydrocapsaicin<br /> chuẩn (Sigma), độ tinh khiết > 98%.<br /> Acetonitril, methanol, nước cất đạt tiêu<br /> <br /> 8<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Khảo sát điều kiện sắc ký.<br /> Tiến hành khảo sát với điều kiện sắc<br /> ký: cột Water C18 (4,6 mm x 150 mm; 5 μm);<br /> pha động gồm nước:acetonitril với các<br /> điều kiện rửa giải khác nhau. Chúng tôi<br /> tìm được điều kiện sắc ký tối ưu gồm<br /> chương trình chạy đẳng dòng, tỷ lệ pha<br /> động là nước:acetonitril = 50:50; tốc độ<br /> dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl;<br /> detector UV tại bước sóng phát hiện<br /> 222 nm.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu bột ớt (b);<br /> 1: capsaicin, 2: dihydrocapsaicin.<br /> Sắc ký đồ thu được cho các píc tách rõ ràng, nhiễu nền thấp thể hiện qua sắc ký đồ<br /> của mẫu bột ớt và chuẩn capsaicin và dihydrocapsaicin. Trên sắc ký đồ, píc của mẫu<br /> thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của píc capsaicin và dihydrocapsaicin<br /> chuẩn với thời gian lưu 6,97 và 8,93 phút. Tại thời gian lưu píc capsaicin và<br /> dihydrocapsaicin trên các sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, so sánh phổ hấp thụ UV thu<br /> được của píc, kết quả: phổ mẫu thử và mẫu chuẩn trùng khít lên nhau với hệ số phù<br /> hợp 0,9998 (hình 2). Chứng tỏ, píc thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh khiết và<br /> các thành phần khác có trong mẫu thử không ảnh hưởng đến quá trình phân tích<br /> capsaicin và dihydrocapsaicin.<br /> <br /> Hình 2: Phổ UV của chuẩn capsaicin và dihydrocapsaicin (a) và píc capsaicin và<br /> dihydrocapsaicin được xác định trong mẫu bột ớt (b).<br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> 2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng.<br /> * Lựa chọn bước sóng:<br /> Từ phổ UV của capsaicin và<br /> dihydrocapsaicin, chúng tôi thấy: capsaicin<br /> và dihydrocapsaicin đều có 2 đỉnh cực đại<br /> tại 222 nm và 278,7 nm. Kết quả đánh giá<br /> tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của capsaicin<br /> và dihydrocapsaicin tại 2 bước sóng này<br /> được thể hiện ở bảng 1.<br /> Bảng 1:<br /> BƯỚC<br /> SÓNG<br /> <br /> 222 nm<br /> <br /> 738147,6<br /> <br /> 419017,6<br /> <br /> 278,7 nm<br /> <br /> 53482,2<br /> <br /> 15865,6<br /> <br /> Tại bước sóng 222 nm, píc capsaicin<br /> và dihydrocapsaicin có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu<br /> cao nhất. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn bước<br /> sóng này để phân tích capsaicin và<br /> dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt.<br /> * Tính tương thích của hệ thống sắc ký:<br /> Khảo sát tính tương thích hệ thống sắc<br /> ký dựa vào phân tích 5 lần một mẫu<br /> chuẩn capsaicin trên máy HPLC với cùng<br /> điều kiện đã nêu. Đánh giá dựa vào sai<br /> số tương đối và độ lệch chuẩn tương đối<br /> của 5 phép thử song song đối với thời<br /> gian lưu, diện tích píc.<br /> <br /> - Phương trình đường chuẩn, giới hạn<br /> phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng<br /> (LOQ):<br /> Hòa tan capsaicin và dihydrocapsaicin<br /> trong methanol tới nồng độ 1.000 µg/ml<br /> được dung dịch chuẩn gốc. Từ dung dịch<br /> gốc, pha các dung dịch chuẩn có nồng độ<br /> thích hợp để thiết lập đường chuẩn về<br /> mối liên hệ giữa diện tích píc capsaicin<br /> và dihydrocapsaicin với nồng độ. Phương<br /> trình tuyến tính được xây dựng dưới<br /> dạng y = ax + b. Trong đó, y và x lần lượt<br /> tương ứng với diện tích píc và nồng độ<br /> capsaicin và dihydrocapsaicin. Đối với<br /> giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định<br /> lượng (LOQ), hòa loãng dung dịch chuẩn<br /> gốc tới nồng độ thích hợp với methanol<br /> và tiêm vào hệ thống HPLC để phân<br /> thích. Đánh giá LOD dựa trên píc thấp<br /> nhất có thể phát hiện trên sắc đồ có giá<br /> trị tỷ lệ tín hiệu/nhiễu bằng 3. Đánh giá<br /> LOQ dựa trên nồng độ thấp nhất có thể<br /> định lượng được có giá trị tín hiệu/nhiễu<br /> bằng 10.<br /> <br /> Bảng 2: Tính tương thích của hệ thống<br /> sắc ký.<br /> <br /> 10<br /> <br /> THỜI GIAN LƯU<br /> (phút)<br /> <br /> DIỆN TÍCH PÍC<br /> <br /> (10 µg/ml)<br /> 1<br /> <br /> 6,979<br /> <br /> 2597147<br /> <br /> 2<br /> <br /> 6,975<br /> <br /> 2642635<br /> <br /> 3<br /> <br /> 6,974<br /> <br /> 2613104<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6,976<br /> <br /> 2596175<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6,978<br /> <br /> 2632009<br /> <br /> (mAU x min)<br /> <br /> X<br /> <br /> 6,976<br /> <br /> 2616214<br /> <br /> SD<br /> <br /> 0,002<br /> <br /> 20750<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,0430<br /> <br /> 0,793<br /> <br /> Hình 3: Đường chuẩn của capsaicin (a)<br /> và dihydrocapsaicin (b).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> Bảng 3: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của capsaicin và dihydrocapsaicin.<br /> THAM SỐ<br /> Hệ số góc<br /> <br /> 4,86<br /> <br /> 2,58<br /> <br /> Giao trục tung<br /> <br /> 0,73<br /> <br /> 0,58<br /> <br /> 0,9997<br /> <br /> 0,9994<br /> <br /> 11,0<br /> <br /> 8,0<br /> <br /> Hệ số tuyến tính<br /> LOD (ng/ml)<br /> LOQ (ng/ml)<br /> Khoảng tuyến tính (ug/ml)<br /> <br /> 33,0<br /> <br /> 24,0<br /> <br /> 0,05 - 20<br /> <br /> 0,05 - 20<br /> <br /> * Độ thu hồi:<br /> Thí nghiệm độ thu hồi để đánh giá mức độ chính xác của phương pháp bằng cách<br /> thêm một lượng xác định chuẩn vào mẫu đã biết trước nồng độ. Hỗn hợp được chiết<br /> và phân tích ngay. Chất chuẩn thêm vào được chuẩn bị ở 3 nồng độ khác nhau. Tại mỗi<br /> nồng độ, tiến hành lặp lại 5 lần.<br /> Bảng 4: Độ thu hồi của capsaicin và dihydrocapsaicin.<br /> CHẤT<br /> <br /> NỒNG ĐỘ THÊM (ng/ml)<br /> <br /> Capsaicin<br /> <br /> Dihydrocapsaicin<br /> <br /> NỒNG ĐỘ PHÁT HIỆN<br /> (ng/ml)<br /> <br /> TỶ LỆ THU HỒI<br /> TRUNG BÌNH (%)<br /> <br /> 0,0<br /> <br /> 80,88<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 50,0<br /> <br /> 128,84<br /> <br /> 95,92<br /> <br /> 2,01<br /> <br /> 100,0<br /> <br /> 178,89<br /> <br /> 98,01<br /> <br /> 1,97<br /> <br /> 200,0<br /> <br /> 276,31<br /> <br /> 97,715<br /> <br /> 3,27<br /> <br /> 0,0<br /> <br /> 55,91<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 50,0<br /> <br /> 104,82<br /> <br /> 97,82<br /> <br /> 2,03<br /> <br /> 100,0<br /> <br /> 153,85<br /> <br /> 97,94<br /> <br /> 1,87<br /> <br /> 200,0<br /> <br /> 252,31<br /> <br /> 98,20<br /> <br /> 3,11<br /> <br /> * Độ đúng và độ chính xác (độ lặp):<br /> Độ đúng và độ lặp lại trong ngày được thực hiện bằng cách phân tích dung dịch<br /> chuẩn 5 lần/ngày. Độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày được thực hiện bằng cách phân<br /> tích dung dịch chuẩn trong 5 ngày liên tiếp.<br /> Bảng 5: Độ đúng và độ lặp lại của capsaicin và dihydrocapsaicin.<br /> CHẤT<br /> <br /> Capsaicin<br /> <br /> Dihydrocapsaicin<br /> <br /> NỒNG ĐỘ<br /> BAN ĐẦU<br /> (ng/ml)<br /> <br /> TRONG NGÀY (n = 5)<br /> <br /> GIỮA CÁC NGÀY (n = 5)<br /> <br /> Nồng độ phát<br /> Nồng độ phát<br /> Độ đúng (%) Độ lặp (%)<br /> Độ đúng (%) Độ lặp (%)<br /> hiện (µg/ml)<br /> hiện (µg/ml)<br /> <br /> 100<br /> <br /> 98,80 ± 1,64<br /> <br /> 98,80<br /> <br /> 1,64<br /> <br /> 98,60 ± 2,61<br /> <br /> 98,60<br /> <br /> 2,61<br /> <br /> 200<br /> <br /> 199,60 ± 3,91<br /> <br /> 99,80<br /> <br /> 1,96<br /> <br /> 200,20 ± 3,70<br /> <br /> 100,10<br /> <br /> 1,85<br /> <br /> 500<br /> <br /> 500,98 ± 4,71<br /> <br /> 100,20<br /> <br /> 0,94<br /> <br /> 501,18 ± 5,04<br /> <br /> 100,24<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> 100<br /> <br /> 99,58 ± 2,85<br /> <br /> 99,58<br /> <br /> 2,85<br /> <br /> 99,78 ± 3,16<br /> <br /> 98,60<br /> <br /> 3,16<br /> <br /> 200<br /> <br /> 201,18 ± 4,13<br /> <br /> 100,59<br /> <br /> 2,07<br /> <br /> 200,78 ± 4,41<br /> <br /> 100,39<br /> <br /> 2,20<br /> <br /> 500<br /> <br /> 501,18 ± 5,04<br /> <br /> 100,24<br /> <br /> 1,01<br /> <br /> 501,58 ± 5,73<br /> <br /> 100,32<br /> <br /> 1,15<br /> <br /> 11<br /> <br />