Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ạ Ọ

Ộ Ố  Đ I H C QU C GIA HÀ N I

ƯỜ

Ọ Ự

Ạ Ọ

TR

NG Đ I H C KHOA H C T  NHIÊN

=======

VŨ ANH PH

NGƯƠ

Ị

ƯỢ

Ứ NGHIÊN C U Đ NH L

NG PARAQUAT

Ẫ TRONG M U HUY T T

Ế ƯƠ  NG

NG

IƯỜ  B NGẰ

ƯƠ

Ắ

Ệ

PH

Ỏ NG PHÁP S C KÝ L NG HI U NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa phân tích

ố

Mã s : 6044011

8

Ọ

Ậ

Ạ LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C

ọ

ẫ

Ng

ườ ướ i h

ng d n khoa h c:

Ả

Ị

Ạ 1. PGS.TS. T  TH  TH O

Ư

Ầ

2. TS. HÀ TR N H NG

Ộ HÀ N I ­ 2015 Ờ Ả Ơ L I C M  N

ờ ầ ử ờ ả ơ ắ ớ ả ị L i đ u tiên cho tôi g i l i c m  n sâu s c t ạ i PGS.TS T  Th  Th o và TS. Hà Tr nầ

ư ậ ướ ự ệ ề ệ ẫ ạ ọ ố H ng đã t n tình h ỡ ng d n và t o m i đi u ki n giúp đ  tôi trong su t quá trình th c hi n đ ề

ế ậ tài và vi t lu n văn.

ượ ử ờ ả ơ ớ ể ạ Tôi xin đ i c m  n chân thành t c g i l i ban lãnh đ o và toàn th  nhân viên Trung tâm

ậ ợ ệ ệ ề ệ ạ ạ ố ộ ượ ọ ậ Ch ng Đ c – B nh vi n B ch Mai đã t o đi u ki n thu n l i cho tôi đ c h c t p và nghiên

c u.ứ

ỏ ạ ạ ầ ả ặ ệ Tôi xin bày t lòng bi ế ơ ớ t  n t i các th y cô giáo gi ng d y t i khoa Hoá, đ c bi t là các

ữ ứ ế ầ ộ ọ ậ   th y cô trong b  môn Hoá Phân tích, đã cho tôi nh ng ki n th c quý giá trong quá trình h c t p

ự ệ ề và th c hi n đ  tài này.

ử ờ ả ơ ị ạ ể ớ ọ Tôi cũng xin g i l ặ   ủ ậ i c m  n các anh ch , b n bè c a t p th  l p cao h c hoá K24, đ c

ệ ườ ạ ữ ẻ ỡ bi ữ t là nh ng ng i b n trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đ , chia s  nh ng khó khăn trong

ọ ậ ự ề ệ ố su t quá trình tôi h c t p và th c hi n đ  tài này.

ử ờ ả ơ ớ ố ạ ộ Cu i cùng tôi xin g i l i c m  n t ẻ ọ   i gia đình và b n bè đã luôn đ ng viên, chia s  m i

khó khăn cùng tôi.

ộ Hà N i, ngày 01 tháng 10  năm 2015

ọ H c viên

Vũ Anh Ph ngươ

Ụ

Ụ

M C L C

́

̉ ̉

DANH SACH BANG BIÊU

̀

́ DANH SACH HINH

ươ Ch ng 1.

Ữ Ế

Ụ

Ắ

DANH M C CÁC CH  VI T T T

Tên vi ế Tên ti ng anh ế Tên Ti ng vi ế ắ t t t % RSD % Relative standard deviation ộ ệ ộ ệ ệ t ố ẩ ươ ng đ i % Đ  l ch chu n t ặ   ẩ %   Đ   l ch   chu n   tái   l p % RSDR % Reproducibility standard deviation

ệ ố ố ứ

ệ

ACN AS ATP BN DAD DQ EPQ ố ươ ng đ i t Acetonitril H  s  đ i x ng pic Adenosin Triphophat B nh nhân ả detector m ng diode Diquat Ethylparaquat Acetonitrile Asymmetry factor Adenosin Triphophate Patient diode­array detector Diquat Ethylparaquat Gas chromatography ­ Mass ắ ố ổ GC ­ MS S c ký khí kh i ph

ấ ọ ụ HP L c máu h p ph spectroscopy Hemoperfusion High performance liquid ệ ắ ỏ HPLC S c ký l ng hi u năng cao

Chromatography Liquid Chromatography ­ Mass ắ ỏ ố ổ LC ­ MS S c ký l ng kh i ph

ng ệ i h n phát hi n ượ ị i h n đ nh l

ả

LOD LOQ MeOH ppm PQ R ROC RP­HPLC SD Spectroscopy Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Parts per million Paraquat Relative  coefficient Receiver operating characteristics Reverse phase­HPLC Standard deviation ộ ộ ủ ớ ạ Gi ớ ạ Gi Methanol ệ ầ Ph n tri u Paraquat ệ ố ươ H  s  t ng quan ườ Đ ng cong ROC ắ ỏ S c ký l ng pha đ o ẩ ộ ệ Đ  l ch chu n ỉ ố ộ n ngặ  c a ng  đ c  Ch  s  đ SIPP

ờ ử ả ế TCA tR UV­VIS Severity Index of Paraquat Poisoning Trichloroacetic acid Retention time Ultraviolet­Visible Paraquat Acid Tricloacetic  ư Th i gian l u ạ T  ngo i và kh  ki n

Ặ

Ấ

Ề

Đ T V N Đ

́ ́ ̀ ́ ́ ̣ ̣ Paraquat (viêt tăt cua ̉ paraquaternary bipyridyl) la môt thuôc diêt co ̉ gia thành re, ệ ̉  hi u qu ả

ưở ớ ệ ượ ử ụ ộ ̣ ̉ ̣ diêt co dai nhanh chonǵ ả , ít  nh h ng t i môi tr ườ  do đó hi n đang đ ng c s  d ng r ng rãi ở

́ ̀ ́ ệ ề ớ ươ ạ ̣ Vi t Nam v i nhi u tên th ng m i khác nhau. Tuy nhiên, paraquat (PQ) l ̣   i ạ la môt chât hoa hoc

̀ ̣ ớ ề ử ướ ả ị ̣ vô cung đôc v i ng ̀ ươ i. Li u t ủ  vong c a PQ c tính là kho ng 10 m ề   l dung d ch 20%. Tai nhi u

̃ ́ ư ở ử ể ế ệ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ướ n c phát tri n, PQ đa bi câm s  dung nh ng Viêt Nam viêc thi u các chính sách và bi n pháp quan

́ ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ữ ừ ử ợ ̣ ̣ ly s  dung hoa chât nay nên trong nh ng năm v a qua co rât nhiêu tr ̀ ươ ng h p ngô đôc ́ ấ   ̣ PQ đên c p

́ ́ ế ớ ử ượ ạ ̣ ứ c u [1]. Trên th  gi ̀ i, nhiêu ca t ̃ ộ  vong do ng  đôc PQ đa đ c bao cao [10][19][27]. T i Trung tâm

ộ ệ ố ượ ữ ệ ạ ầ ố ệ Ch ng đ c b nh vi n B ch Mai, trong nh ng năm g n đây, s  l ng b nh nhân ng  đ c ộ ộ PQ không

ộ ấ ạ ừ ở ọ ượ ưỡ ng ng gia tăng và tr  thành m t v n n n vô cùng nghiêm tr ng, v t ng ng 300 ca trong năm 2013

́ ớ ̣ ử ườ ả ̉ ̣ ̣ và năm 2014 lên t i 391 ca. Ti lê t vong do ngô đôc PQ rât cao, th ̀ ng kho ng 70­80% theo nhiêu

̀ ́ ́ ứ ố ộ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ nghiên c u cua cac tac gia n ́ ̉ ươ c ngoai [29][32]. Tai Trung tâm ch ng đ c (TTCĐ) bênh viên Bach

̀ ̣ ử ứ ợ ̉ ̣ ̣ ̣ Mai, ti lê t vong năm 2007 la 72,5% [ 4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên c u tai bênh viên Ch  Râỹ

̀ ố ồ thành ph  H  Chí Minh la 85%.

ộ ộ ề ệ ẩ ấ ị ị ượ Trong ch n đoán và đi u tr  ng  đ c c p PQ, xét nghi m đ nh l ng PQ  trong huy tế

ặ ệ ộ ặ ộ ộ ủ ọ ị ươ t ng đóng vai trò đ c bi ứ t quan tr ng, giúp xác đ nh m c đ  n ng c a ng  đ c, tiên l ượ   ng

ả ủ ị ặ ư ệ ệ ề ệ ấ ọ ệ b nh nhân cũng nh  đánh giá hi u qu  c a các bi n pháp đi u tr , đ c bi t là l c máu h p ph ụ.

ỷ ệ ử ộ ộ ấ ấ ị ệ ế ệ ề ả ầ T  l t vong do ng  đ c c p PQ r t cao vì thi u các bi n pháp đi u tr  hi u qu . G n đây, các

ứ ủ ề ộ ố ả ệ ấ nghiên c u c a nhi u tác gi ả ướ  n c ngoài và m t s  tác gi Vi ậ ọ   t Nam cho th y các kĩ thu t l c

ặ ộ ụ ằ ấ ấ ạ ằ ớ ọ ộ ườ máu m i, nh t là l c máu h p ph  b ng c t than ho t ho c c t resin nh m tăng c ả   ng đào th i

ộ ộ ấ ứ ố ộ ố ỏ ệ ế ả ả ệ   PQ cho k t qu  kh  quan, c u s ng m t s  không nh  b nh nhân ng  đ c c p PQ. Xét nghi m

ượ ế ươ ả ủ ụ ể ệ ấ ọ ị đ nh l ồ ng n ng đ ộ PQ huy t t ng cung c p công c  quan tr ng đ  đánh giá hi u qu  c a các

ả ừ ệ ề ị bi n pháp đi u tr  tăng th i tr  này.

ế ạ ệ ỉ ừ ệ ở ứ ộ ị Tuy nhiên, cho đ n nay t i Vi t Nam vi c xét nghi m ệ PQ ch  d ng m c đ  đ nh tính

ướ ể ươ ư ể ệ trong n ằ c ti u b ng ph ị ng pháp so màu đ  xác đ nh b nh nhân ng  đ c ộ ộ PQ mà ch a có c  s ơ ở

ể ự ệ ệ ệ ị ượ ớ ế ả xét nghi m nào có th  th c hi n vi c đ nh l ồ ng n ng đ ậ   ộ PQ máu v i k t qu  đáng tin c y.

ề ế ẫ ả ẩ ộ ố ớ ượ ư Đi u này d n đ n m t kho ng tr ng l n trong ch n đoán, tiên l ệ   ng cũng nh  đánh giá hi u

ả ủ ệ ệ ề ọ ị ạ ộ ố qu  c a các bi n pháp l c máu làm cho vi c đi u tr  ng  đ c ộ ộ PQ t i Trung tâm Ch ng đ c và

ả ướ ặ ấ ồ ứ ấ ứ các khoa h i s c c p c u trên c  n ề c g p r t nhi u khó khăn.

ượ ế ươ ế ớ ươ ắ ể ị Đ  đ nh l ng PQ trong huy t t ng trên th  gi ụ i đã áp d ng các ph ng pháp s c ký

ệ ả ắ ạ ố ổ ỏ ố ổ khí kh i ph  (GC­MS), đi n di mao qu n (CE), s c ký l ng kh i ph  (LC­MS)... T i Trung tâm

ệ ệ ạ ố ộ ử ụ ệ ỏ ch ng đ c b nh vi n B ch Mai hi nệ   đang s  d ng máy ắ s c ký l ng hi u năng cao ể   đ  xét

ư ư ệ ẩ ấ ộ ị ượ ế ươ nghi m đ c ch t nh ng cũng ch a có quy trình chu n đ nh l ng PQ  huy t t ậ   ng. Vì v y,

ứ ề ế ị ượ ẫ chúng tôi ti n hành nghiên c u đ  tài ứ “Nghiên c u đ nh l ế   ng Paraquat trong m u huy t

ươ ườ ằ ươ ệ ắ ụ ớ v i hai m c tiêu: t ng ng i b ng ph ỏ ng pháp s c ký l ng hi u năng cao”

ứ ự ế ế ươ ườ 1. Nghiên c u xây d ng quy trình chi t tách Paraquat trong huy t t ng ng i và phân

ể ị ằ ượ tích b ng HPLC đ  đ nh l ng paraquat.

ị ử ụ ủ ị ươ ị ượ 2. Xác đ nh giá tr  s  d ng c a ph ng pháp ụ và áp d ng đ nh l ế   ng paraquat trong huy t

ươ ộ ộ ệ ạ ố ệ ạ t ng b nh nhân ng  đ c paraquat t ộ ệ i Trung tâm ch ng đ c b nh vi n B ch Mai , Hà

N i.ộ

ƯƠ

Ổ

CH

NG 1: T NG QUAN

̀ ̉ 1.1. Tông quan vê paraquat

ứ 1.1.1. Công th c paraquat

ọ Paraquat là t ừ ế ắ ủ  paraquaternary bipyridyl, tên khoa h c là 1,1'­ t c a vi t t dimethyl­4,4'

ố ệ ỏ ổ ế ặ ấ ệ ỏ bipyridilium là thu c di ệ t c  ph  bi n nh t hi n nay do đ c tính di t c  nhanh và tri ệ ể   t đ .

ậ ấ ộ ợ ượ ổ ợ PQ thu c nhóm h p ch t amonium b c 4 bipyridylium,  đ ầ c t ng h p  đ u tiên vào năm

ứ ụ ệ ố ữ 1882,  ng d ng trong nông nghi p làm thu c tr ừ ỏ ừ  c  t nh ng năm 1950 [42].

ọ ủ

ứ

Hình 1.: Công th c hóa h c c a paraquat

ố ượ ư ố ọ PQ có kh i l ng phân t ử ươ  t ứ ng đ i 186,2 có công th c hóa h c nh  hình 1.1:

ọ ủ ấ 1.1.2. Tính ch t lý, hóa h c c a paraquat

oC là 1,240 ­ 1,260, đi mể

ườ ắ ỷ ọ ở PQ th ơ ng có màu tr ng h i vàng, không mùi, t tr ng 20

oC, đi m sôi kho ng 300

oC và pH c a dung d ch PQ trong n

ả ể ả ủ ị ướ ch y 175 ­ 180 c 6,5 ­ 7,5.

ườ ở ạ ể ắ ạ ặ PQ   th ng d ng  dimethylsulphate   ho c   dichloride.  D ng  dichloride   tinh  th   tr ng,

ả ữ ổ ị ị ườ ặ ạ d ng dimethylsulphate ch y r a. PQ  n đ nh trong dung d ch môi tr ng acid ho c trung tính và

ổ ị ườ không  n đ nh trong môi tr ề ng ki m.

oC), ít tan trong c n và h u nh  không tan trong ầ

ố ướ ộ ở ư ồ PQ tan t t trong n c (đ  tan 700 g/l 20

ữ ơ các dung môi h u c  khác.

ủ ướ ị ạ ở ề ặ ạ ộ ị ấ PQ b  phân h y d i ánh sáng UV, b  b t ho t b i các tác nhân ho t đ ng b  m t anionic

ở ấ ị ấ ế ạ ấ ơ ị và b i đ t sét, b  m t ho t tính nhanh khi ti p xúc v i ặ   ớ  đ t. PQ không bay h i. Dung d ch PQ đ c

ạ ẽ ế ấ ắ ăn mòn thép, t m thi c, s t m  k m và nhôm [43].

́ ́ ượ ả ấ ở ề ơ ươ ̣ PQ  đ c s n xu t b i nhi u công ty khác nhau v i cac tên th ng mai và hàm l ượ   ng

ườ ề ở ạ ộ ố ọ ị ườ khác nhau, nói chung th ng đ u d ng dung d ch màu xanh. M t s  tên g i th ủ   ặ ng g p c a

ư PQ nh : Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen... [42].

ộ ử ế ấ ầ ướ ử ụ ể ề ấ Do đ c tính gây t vong r t cao nên h u h t các n c phát tri n đ u đã c m s  d ng PQ

ệ ự ậ ấ ả ư ạ ộ ỹ ướ ộ ố ướ nh  là m t lo i hóa ch t b o v  th c v t (M  và các n c Châu Âu). M t s  n ậ   ư c nh  Nh t

ư ả ỉ ạ ớ ị ượ ấ ả B n ch  cho phép l u hành PQ  d ng dung d ch v i hàm l ể   ẽ ng th p 4,5% s  giúp gi m thi u

ơ ế ộ ộ ự ế ệ ế ớ ẫ ầ ướ ị nguy c  n u b  ng  đ c. Th c t hi n nay trên th  gi i v n có g n 130 n ử ụ   c cho phép s  d ng

ệ ệ ở ệ ố ừ ỏ ượ ư ị PQ trong đó có Vi t Nam [42]. Hi n Vi t Nam thu c t c  PQ đ ạ c l u hành d ng dung d ch

ộ ộ ấ ấ ớ ơ 20% do đó nguy c  ng  đ c c p tính r t l n.

ế ớ ớ ề ả ộ ệ M t đi u đáng nói là công ty s n xu t ấ ấ PQ l n nh t trên th  gi i hi n nay là Syngenta hay

ặ ọ ạ ấ ướ ố ấ ọ còn g i là Zeneca đ t nhà máy t i Trung Qu c và Anh. Trên đ t n c h  đã c m hoàn toàn PQ,

ạ ộ ấ ẩ ướ ủ ế ho t đ ng kinh doanh ch  y u xu t kh u sang các n ứ c th  ba [39].

ơ ế ộ ủ 1.1.3. C  ch  gây đ c c a paraquat

ơ ế

ộ ủ

Hình 1.. C  ch  gây đ c c a paraquat

[15]

ơ ế ấ ộ ủ ượ ả ơ ồ C  ch  g y đ c c a PQ đ c mô t theo s  đ  sau [37]:

2+ cùng v i NADPH tr i qua m t ph n  ng ả ứ   ả

ầ ủ ạ ớ ộ Trong giai đo n đ u c a chu trình này, ion PQ

+) và NADP+. PQ+ ph n  ng h u nh  ngay l p t c v i oxy tái t o ạ

ử ị ậ ứ ớ ả ứ ư ầ ạ t o ra ion paraquat b  kh  (PQ

2+ và g c superoxid. Có s n NADPH và oxy, chu trình oxy hoá ­ kh  c a PQ x y ra liên

ử ủ ẵ ả ố i PQạ l

ị ấ ố ự ụ ừ ệ ạ ớ ố ụ t c,  v i  vi c NADPH  liên t c  b  m t  đi  và không ng ng t o ra g c superoxid. G c t do

2O2), và v i Hớ

2O2 cùng Fe

ớ ả ả ứ ể ạ superoxid sau đó ph n  ng v i b n thân nó đ  t o ra peroxid hydro (H

ố ự ạ ệ ẫ ớ ế ế ể ạ đ  t o thành g c t do hydroxyl [18] [31]. C n ki t NADPH d n t i ch t t bào. Chu trình oxy

ử ạ ố ự ẫ ớ ề ế ơ ổ ươ ế hoá ­ kh  t o thành g c t do hydroxyl d n t i nhi u c  ch  làm t n th ng t ả ứ    bào: ph n  ng

ế ố ầ ế ế ớ v i lipid trên màng t bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein t i c n thi t cho t ố    bào s ng

ố ự ủ ị sót cũng b  các g c t do hydroxyl phá h y [12] [39] [40].

ậ ả ế ố ự ệ ố ự H u qu  lên t bào do vi c hình thành các g c t do (superoxid và các g c t do khác) là

ủ ấ ứ ử ề ề ệ ằ ổ ị ố ượ đ i t ệ ng c a r t nhi u nghiên c u. Các th  nghi m đi u tr  nh m vào vi c thay đ i các g c t ố ự

α ư ằ ấ ớ do b ng các ch t nh  desferioxamin, superoxid dismutase,  ­tocopherol và vitamin C cùng v i bài

ệ ưỡ ứ ế ệ ấ ố ượ ni u c ng b c. Tuy nhiên, cho đ n hi n nay không có ch t nào trong s  này đ ế c khuy n cáo

dùng.

ặ ế ầ ấ ọ ủ ủ ề ộ ố ự ẫ M c dù chi ti t đ y đ  v  đ c ch t h c c a các g c t do do PQ sinh ra v n ch a đ ư ượ   c

ế ư ữ ườ ế ề ơ ở ể ộ ộ ự ươ ữ bi t nh ng nh ng gì ng i ta đã bi t v  c  s  đ  ng  đ c là s  t ng tác gi a PQ, NADPH và

ở ứ ộ ế ế ệ ệ oxy. Sau đó, m c đ  t bào, oxy là y u t ế ố ố ầ  t i c n thi t cho vi c hình thành b nh lý do PQ.

ệ ạ ộ ộ ơ ở ế ệ ề ệ ấ ầ ị Đây là c  s  cho vi c h n ch  cung c p oxy trong vi c đi u tr  ban đ u b nh nhân ng  đ c PQ.

ổ ươ ư ề ắ ố ớ PQ có tính ăn mòn và gây t n th ế ng gi ng nh  ki m khi ti p xúc v i da, m t và các

ủ ế ộ ộ ạ ơ ườ ậ niêm m c. Các c  quan đích ch  y u trong ng  đ c toàn thân PQ là đ ng tiêu hoá, th n và

ộ ị ổ ạ ổ ươ ụ ự ề ế ệ ặ ố ph i. D  dày, ru t b  t n th ng n ng n  do tác d ng ăn mòn tr c ti p khi b nh nhân u ng PQ

ớ ồ ủ ậ ả ộ ơ ồ ộ ơ   có ch  ý v i n ng đ  cao. Th n là c  quan đào th i PQ và DQ và có n ng đ  bipyridyl cao h n

ớ ơ ở ộ ậ ụ ế ổ so v i các c  quan khác. Riêng ph i, PQ vào các ph  bào týp I và II không ph  thu c b c thang

ơ ế ậ ự ụ ể ộ ộ ồ n ng đ  mà theo c  ch  v n chuy n tích c c ph  thu c ATP.

ậ ổ ươ ế ấ ả ơ ể ề ơ Do v y PQ gây t n th ầ ng h u h t t t c  các c  quan trong c  th  vì đ u có liên quan

ấ ế ể ạ ụ ấ ặ ị ế đ n chuy n hóa và hô h p t bào, tuy nhiên t ế   ề i các v  trí h p ph  nhi u PQ ho c liên quan đ n

ả ừ ổ ươ ế ớ ặ ầ ơ ơ ử th i tr  PQ thì t n th ng đ n s m h n, n ng h n và cũng là nguyên nhân hàng đ u gây t vong

ươ ạ ườ ấ ổ ư ổ nh  t n th ậ ng ph i gây suy hô h p, suy th n, viêm gan, loét niêm m c đ ế   ng tiêu hóa và bi n

́ ́ ́ ́ ̃ ơ ượ ứ ễ ơ ử ơ ̣ ̣ ch ng nhi m trùng [6][13][37]. Viêc tiêp xuc v i l ̀ ng PQ it h n se lam châm nguy c  t vong

́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̃ ư ơ ơ ̉ ̉ ̣ ̣ ́   do x  phôi tiên triên va suy thân [33]. Môt sô nghiên c u gân đây còn cho thây ph i nhiêm PQ co

́ ơ ̣ ́ ư liên quan v i hôi ch ng Parkinson [21][23].

́ ượ ự ươ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ Trong ngô đôc câp PQ, co thê tiên l ́ ̀ ng bênh d a trên nông đô PQ trong huyêt t ̣   ng. Môt

̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ươ ượ ử ̣ ́ sô bao cao cho thây nông đô PQ huyêt t ng v t qua 2 µg/ml thi hâu hêt t ̣    vong, tuy nhiên môt

̃ ̀ ̀ ́ ợ ơ ̣ ̣ ̣ ̀ vai tr ̀ ươ ng h p bênh nhân vân hôi phuc khi nông đô trong mau cao h n 2 µg/ml [7][10][22].

ượ ộ ọ 1.1.4. D c đ ng h c paraquat

ấ 1.1.4.1. H p thu

ượ ư ấ ấ ấ Ở ườ  đ ng tiêu hoá PQ đ c h p thu r t nhanh nh ng ít (5­10%). H p thu ch  y u ủ ế ở ộ    ru t

ộ ị ổ ạ ươ ố ượ ượ ấ non. Khi d  dày ru t b  t n th ộ ng lan r ng, s  l ấ ộ ng ch t đ c đ ẽ c h p thu s  tăng lên. PQ

ế ươ ắ ớ ộ ỉ ế ươ ồ ạ ượ không g n v i protein huy t t ủ ng. N ng đ  đ nh c a PQ trong huy t t ng đ t đ c trong

ờ ơ ể ỉ ả ế ấ ố vòng 2 gi ế    sau u ng [6] [37]. Ti p xúc qua da, h p thu vào c  th  nói chung ch  x y ra khi ti p

ị ổ ươ ế ớ ườ ấ ượ ặ xúc kéo dài ho c da b  t n th ng. Ti p xúc v i PQ qua đ ng hô h p không làm cho l ng PQ

ượ ứ ủ ể ế ễ ấ ộ ở ướ ứ ầ ạ ớ đ c h p thu đ n m c đ  đ  gây nhi m đ c. B i vì kích th ế   c các h t ch a PQ l n (h u h t

ượ ườ ắ ế ể ấ ấ trên 100 (cid:0) m) làm cho PQ không đi sâu đ ố c xu ng đ ng hô h p đ  h p thu [11]. M t ti p xúc

ẽ ị ổ ươ ủ ể ư ễ ộ ớ v i PQ s  b  t n th ng, nh ng không đ  đ  gây nhi m đ c toàn thân.

1.1.4.2. Phân bố

́ ́ ́ ́ ấ ớ ố ư ơ ổ ̉ Sau khi uông, PQ phân b  nhanh chóng nh t t ậ   i tât ca cac c  quan chinh nh  ph i, th n,

̀ ̃ ̀ ́ ́ ử ơ ự ể ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ gan và c , đăc biêt la phôi, PQ se bi kh  thanh dang gôc t do hoat tinh cao [8][22]. Th  tích phân

ố ủ b  c a PQ là 1,2 ­ 1,6 l/kg.

ạ ượ ồ ạ ồ ộ ể ơ ổ ồ ộ ổ PQ đ t đ c n ng đ  cao và t n t i lâu h n trong ph i, n ng đ  trong ph i có th  cao

ớ ồ ế ươ ộ ấ ầ ố ờ ồ ộ ổ ứ ơ h n so v i n ng đ  huy t t ng g p 50 l n. Sau u ng 5­7 gi , n ng đ  PQ trong t ổ    ch c ph i

ấ ượ ế ươ ạ ế ầ ộ ưỡ ớ ạ ể ạ đ t cao nh t. Tuy nhiên, l ng PQ huy t t ng cũng c n đ t đ n m t ng ng t i h n đ  cho

ấ ở ổ quá trình h p thu ễ  ph i di n ra [11].

ượ ị ố ứ ộ ồ ộ PQ qua đ c nhau thai. Trong m t nghiên c u, n ng đ  PQ trong d ch ố   i và máu dây r n,

ẹ ầ ơ ồ ộ ố bào thai cao h n n ng đ  trong máu m  4­6 l n [11]. Không có bào thai nào s ng sót. Tuy nhiên

ẹ ộ ộ ế ầ ể ế ố ế n u m  ng  đ c PQ còn s ng thì đ n l n có thai sau không nguy hi m đ n bào thai.

ả ừ ể 1.1.4.3. Chuy n hoá, th i tr

ượ ọ ủ ầ ả ầ ờ ả ư ậ ậ PQ đ c đào th i h u nh  hoàn toàn qua th n nh  c  quá trình l c c a c u th n và quá

ế ự ủ ố ờ ố ượ trình bài ti ậ t tích c c c a  ng th n. Trong vòng 12­24 gi sau u ng, trên 90% PQ đ ả   c đào th i

ướ ạ ứ ế ậ ậ ổ ườ ể d i d ng không đ i qua th n, n u ch c năng th n bình th ng [11].Tuy nhiên có th  xét

ệ ướ ự ể ố ừ ơ ờ nghi m th y ấ PQ trong n c ti u vài ngày sau do có s  tái phân b  PQ t các c  quan. Th i gian

̀ ̀ ̀ ờ ặ ơ bán th i c a ể ả ủ PQ có th  kéo dài 12­120 gi ̉   ậ  ho c lâu h n khi có suy th n. Ngoai ra PQ con đao thai

́ươ ̣ ̉ qua phân d i dang không đôi [8][22].

ượ ự ộ ồ ệ 1.1.5. Tiên l ng b nh nhân d a vào n ng đ  paraquat trong huy t t ế ươ . ng

ượ ệ ự ế ươ ồ Tiên l ng b nh nhân u ngố  PQ có th  ể d a vào n ng đ ộ PQ huy t t ng theo th iờ  gian.

ả ồ ộ ướ ề ệ ể ả ộ ồ ị ị N ng đ  PQ ph i đo tr ề c khi đi u tr  vì các bi n pháp đi u tr  có th  làm gi m n ng đ  PQ

ạ ọ ụ ộ ể ầ ấ (dùng than ho t, l c máu h p ph …). Proudfoot và c ự ng s  [29] ầ l n đ u tiên trình bày bi u đ ồ

ượ ả ố ừ ế ả ị ượ ế ươ ồ ạ ề ờ tiên l ng kh  năng s ng t k t qu  đ nh l ộ ng n ng đ  PQ huy t t ng t ể   i nhi u th i đi m

ộ ướ ữ ệ ố ồ khác nhau trên 79 b nh nhân. Nh ng BN s ng có n ng đ  d i 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/ l

ở ờ ộ ở ộ ươ t ứ ng  ng 4, 6, 10, 16, và 24 gi ố  sau u ng PQ . Schermann và c ng s ự [35] m  r ng đ ườ   ng

ượ ứ ứ ế ễ ấ ộ cong tiên l ữ   ng BN này lên đ n ngày th  7 sau nhi m đ c, và nghiên c u này cho th y nh ng

ế ươ ồ ượ ờ ườ ế ố ộ BN n ng đ  PQ huy t t ng trên 10 mg/ ị l (đ nh l ng trong vòng 8 gi ), th ng ch t vì s c tim

ộ ấ ữ ư ẫ ơ ườ ượ ế ồ trong 24h, trong khi nh ng BN có n ng đ  th p h n (nh ng v n trên đ ng tiên l ng), ch t vì

ổ ộ ơ ờ ố ộ ế ợ ấ ơ x  ph i và suy hô h p mu n h n 24 gi sau u ng. Suzuki và c ng s ự (1991) [36] đã k t h p d ữ

ệ ủ ộ li u c a Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann (1987), Sawada (1988) và thêm m t nhóm

ồ ị ế ượ ườ ợ ử ậ ằ 78 BN, k t lu n r ng đ  th  tiên l ng chính xác 101 trong 102 tr ng h p t vong và 61 trong

ố ượ ồ ị ặ ố 63 BN s ng đ c đánh giá trong vòng 24 h sau u ng PQ. M c dù đ  th  khá chính xác, giúp xác

ứ ộ ặ ượ ử ị ượ ượ ậ ứ ồ ị ị đ nh m c đ  n ng và tiên l ng t ế  vong n u đ nh l ng đ c PQ ngay l p t c, đ  th  này cũng

ướ ừ ễ ặ ố ệ đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ờ c tính th i gian t khi u ng PQ d  sai, đ c bi t trong vài

ờ ầ ế ươ ồ ộ ố ề ờ ế ậ ả gi đ u tiên n ng đ  PQ huy t t ng gi m nhanh sai s  v  th i gian th m chí 0,5 đ n 1h có th ể

ệ ồ ộ ố ổ ượ ộ ồ thay đ i hoàn toàn m i quan h  n ng đ  và tiên l ng. Ngoài ra, n ng đ  PQ trong huy t t ế ươ   ng

ể ượ ộ ố ươ có th  không hoàn toàn chính xác vì đ ằ c phân tích b ng m t s  ph ng pháp khác nhau và các

ứ ườ ự ế ồ ố ể nghiên c u th ộ ủ ng không trình bày rõ n ng đ  c a ion hay là mu i PQ, và th c t có th  có khác

ệ ề ứ ộ ạ ả ộ ủ ữ ụ ệ ớ ệ bi t  gi a các b nh nhân v  m c đ  nh y c m v i tác d ng đ c c a PQ, tuy khác bi ư   t này ch a

ữ ồ

ế ươ

ể

ồ

ộ

ờ

Hình 1.: Bi u đ  liên quan gi a n ng đ  Paraquat huy t t

ng (µg/ml), th i gian sau

ố

ả ố u ng, và kh  năng s ng.

ượ ứ đ c nghiên c u.

ộ ộ ộ ự Năm 1988 Sawada và c ng s ự [34] báo cáo ch  ỉ số tiên l ngượ  ng  đ c PQ d a trên nghiên

ồ ế ệ ứ c u n ng đ  ộ PQ huy t thanh ở 30 b nh nhân, 20 ử t vong và 10 BN s ng.ố Ch  s  đ ỉ ố ộ n ngặ  c aủ

ộ ộ ờ ờ ng  đ c PQ (SIPP : severity index of PQ poisoning) tính b ng ằ th i gian t ừ khi u ng ố ế   (gi ) cho đ n

ắ ầ ề ồ ế khi b t đ u đi u tr ị nhân v i ớ n ng đ ộ PQ huy t thanh (µg/ml) khi vào vi n.ệ

ế SIPP = [n ng đồ ộ PQ huy t thanh (µg/ml)] ế ắ ầ ừ ố đ n b t đ u đi u tr ờ t  × [th i gian u ng ề ị (h)]

ể ố ể ơ ể ử ộ ệ Khi đi m SIPP ít h n 10, b nh nhân có th  s ng sót; đi m 50 phân bi tệ  t vong mu n do

ử ầ ớ ặ ấ suy hô h p (10 < SIPP <50) v iớ  t vong s m do suy tu n hoàn (SIPP  > 50). M c dù đây là

ứ ệ ọ ị ượ ế ả nghiên c u quan tr ng, Sawada xét nghi m đ nh l ế   ng dùng huy t thanh không ph i huy t

ươ ộ ớ ồ ị ượ ố t ng. Suzuki và c ng s ự (1991) đã so sánh SIPP v i đ  th  tiên l ậ   ng s ng trên 167 BN nh p

ồ ị ủ ự ệ ố ế ụ ủ vi n trong vòng 24 h sau u ng PQ. Các k t c c c a BN d  đoán theo đ  th  c a Proudfoot đã

ở ườ ợ ử ố ở ố sai 1 tr ng h p t vong và 2 BN s ng; trong khi đó, SIPP sai 1 BN s ng và 10 tr ườ   ng

ợ ử ệ ố ả ế ằ ự h p t ữ  vong. Nh ng khác bi t này có ý nghĩa th ng kê, và tác gi ậ  k t lu n r ng d a trên

ồ ồ ị ủ ượ n ng đ ộ  PQ  trong  24  h đ uầ   sau u ng,ố đ  th  c a Proudfoot tiên l ng chính xác h n ơ SIPP

[36].

ươ ế ươ ị 1.2. Các ph ng pháp xác đ nh paraquat trong huy t t ng

ươ ̉ 1.2.1. Ph ng pháp quang phô

ộ ị ượ ể Rai M.K và c ng s ự [30] đ nh l ng PQ  s  d ng ử ụ NaBH4  đ  kh ử PQ  trong môi tr ngườ

ụ ự ạ ở ướ ề ấ ạ ị ki m t o ra dung d ch màu xanh h p th  c c đ i b c sóng 600nm trong khi  Kato K. và c ngộ

ạ ả ứ ể ạ i dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester ớ  (TBPE) ph n  ng v i PQ đ  t o ra dung sự [20] l

ữ ơ ể ờ ị d ch h u c  PQ­TBPE màu xanh da tr i, có th  chi ế ượ  b ng ằ c t đ dichloromethane. Chang­bin Li

ị ượ ế ươ ẫ ộ và c ng s ự [24] đã đ nh l ng PQ trong huy t t ng d a ự b ngằ  đo quang ph  ổ c a ủ d n xu t ấ  khi

ả ứ ph n  ng v i ớ Na2S2O4 10% và NaOH 5M.

Ư ể ủ ươ ề ệ ạ ộ ớ u đi m c a ph ử ng pháp kh  PQ b ng ằ NaBH4 là đ  nh y cao, v i các đi u ki n kh ử

ệ ộ ộ ổ ị ệ PQ là nhi t đ  35­40 °C, pH 10­11 thì màu có đ   n đ nh ế lên đ n 12h ể ổ   ầ  và không c n đ m đ   n

ộ ậ ị đ nh màu ồ , kho ngả  n ng đ  0,05 ị ­ 0,5 µg/ml tuân theo đ nh lu t Lambert – Beer , trong khi gi ớ ạ   i h n

ệ ươ ử ụ ẫ ượ phát hi n là 0,03 µg/m l. Trong khi đó, ph ng pháp s  d ng TBPE thì m u đ ể t c phép đ i đaố

ả ươ ế ề ạ ỏ trong 20 phút. C  2 ph ề ậ ng pháp này đ u đ  c p đ n DQ, trong khi Rai M.K [30] lo i b  DQ thì

ạ ị ượ ồ Kato K. [20] l i đ nh l ờ ả ng đ ng th i c  PQ và DQ.

4 đã lo i đ

ươ ị ượ ạ ượ ự ả ưở ủ ố Ph ng pháp đ nh l ằ ng PQ b ng NaBH c s   nh h ng c a các thu c tr ừ

ườ ấ ầ ạ ố ẽ ả ưở sâu thông th ng và các ion kim lo i khác. DQ, có c u trúc g n gi ng PQ, s  gây  nh h ng khi

ượ ẽ ị ạ ế ị đ nh l ng PQ. Tuy nhiên DQ, n u có, s  b  lo i khi thêm NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị

3+ và Al3+, có th   nh h

ư ấ ạ ể ả ưở ế ủ m t đi. Các ion kim lo i nh  Fe ẽ ị ạ   ng do làm k t t a hydroxide, s  b  lo i

ướ ị đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5% tr c khi thêm dung d ch NaOH [30]. Còn theo Kato K [20], DQ

ể ế ượ ớ ư ư ố cũng có th  chi t đ c v i TBPE trong dichloromethane cũng gi ng nh  PQ nh ng PQ­TBPE có

ụ ơ ộ ấ ổ ấ ụ ủ ớ quang ph  h p th  h i khác v i DQ­TBPE. Đo đ  h p ph  c a PQ ở ướ  b c sóng 603 nm & DQ ở

­7 M.

ướ ớ ồ ộ ớ ạ ệ b c sóng 608 nm v i dãy n ng đ  (4,5 ­ 45,0)×10­7 M. Gi i h n phát hi n 4,77.10

4  đã đ

ươ ị ượ ượ ứ ể ị ụ ượ Ph ng pháp đ nh l ằ ng PQ b ng NaBH c  ng d ng đ  đ nh l ng PQ  trong

ư ệ ẫ ẩ ướ ữ ư ự ể ẹ ẫ ẩ ệ m u b nh ph m b nh nhân nh  máu, n c ti u, s a m  cũng nh  các m u th c ph m và các

ẫ ườ m u trong môi tr ng.

ươ ổ ườ ệ ượ ớ V i ph ng pháp đo quang ph  thông th ng, không phát hi n đ c PQ t ạ ướ i b c sóng

ộ ị ượ ế ươ ồ ộ 257 nm. Nên Chang­bin Li và c ng s ự [24] đã đ nh l ng n ng đ  PQ trong huy t t ự ng d a trên

ổ ẫ ứ ệ ấ ậ ị vi c đo quang ph  d n xu t th  2 (tuân theo đ nh lu t Lambert Beer v i ớ r = 0,996). Dung d chị

ướ ẩ ượ ướ ừ ế ẫ ắ ớ n c chu n PQ 10 μg/ml đ c quét b c sóng t 200 đ n 300 nm, v i m u tr ng là n ướ ấ   c c t.

ế ươ ế ươ ạ ị ẩ ượ Huy t t ng s ch và các dung d ch huy t t ng chu n PQ 50 và 10 μg/ml đ c thêm TCA 20%

ỉ ệ ắ ấ ầ ị (t  l 6:1, v/v). L c xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. L y d ch trong ph n trên đi đo quét

ướ ừ ử ư ế ầ ị ượ b c sóng t ẫ  200 đ n 300 nm. Sau khi x  lý m u nh  trên, d ch trong ph n trên đ ể   c chuy n

ả ố ớ ướ ượ ắ ộ ả vào  ng Eppendorf m i, b o qu n tránh ánh sáng. Tr c khi đo, 400 ẫ μl m u đ c l c tr n nh ẹ

2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm t

ớ ể ỗ ợ ươ nhàng và hoàn toàn v i 100 ồ μl h n h p đ ng th  tích Na ng t ự

ế ươ ẫ ộ ấ ắ ả ố ướ ừ ớ v i m u huy t t ng tr ng đ i chi u ụ ế  và đo đ  h p th  quang trong kho ng b c sóng t 300

ả ướ ể ượ ừ ứ ẫ ấ ế đ n 500 nm (kho ng b c sóng Δ  λ = 0,5 nm). T  đó d n xu t th  2 này có th  đ c tính toán

ả ướ theo công th c ứ Δ2Abs/(Δλ)2 (kho ng b ẫ c sóng d n xu t ấ Δλ=4 nm) [24].

ươ ố ắ ổ 1.2.2. Ph ng pháp s c ký khí kh i ph

ươ ươ ả ạ ậ ơ ộ ộ ừ Ph ng pháp GC­MS là ph ng pháp đ n gi n có đ  nh y và đ  tin c y cao, t lâu đã

ượ ử ụ ể ị ượ ọ ị đ c s  d ng đ  đ nh l ng PQ trong d ch sinh h c. L. Gao [16] và Almeida R. M. [5] cùng sử

ươ ể ị ượ ứ ả ả ụ d ng ph ng pháp GC­MS đ  đ nh l ng PQ. Trong c  hai nghiên c u, các tác gi ử ụ    đã s  d ng

ọ ọ ể ậ ế ồ ệ ố h  th ng ch n l c ion (selected ion monitoring – SIM) đ  nh n bi ờ   t PQ, đ ng th i cũng thêm

ấ ộ ẩ ượ ể ư ư ấ ộ EPQ làm ch t n i chu n, khí He đ c dùng nh  là khí mang đ  đ a ch t phân tích vào c t. Dung

4 tr

ề ẫ ượ ử ằ ướ ệ ắ ị d ch m u phân tích đ u đ c kh  b ng NaBH c khi đem phân tích trên h  s c ký khí. Tuy

ứ ỗ nhiên m i tác gi ả ạ  l i nghiên c u các quy trình phân tích khác nhau.

ả ự ả ộ Tác gi ộ  L. Gao và c ng s  [16] l ộ ạ ử ụ  c t mao qu n (10 i s  d ng m  0,18 mm, đ  dày màng

oC. Khí mang

ệ ộ ủ ơ ầ ượ ồ 0,25 µm). Nhi t đ  c a b m tiêm, interface và ngu n ion l n l t là 280, 280, 200

ượ ơ ớ ố ộ ẳ ẫ ượ ư ế ộ ằ đ c b m đ ng dòng v i t c đ  là 1,01 m l/phút. M u đ c đ a vào b ng ch  đ  tiêm chia dòng

oC trong 1 phút và tăng đ n 295

oC v i t c đ ớ ố

ệ ộ ả ấ ụ ầ ế (10:1) và nhi t đ  gi i h p ph  lúc đ u là 70 ộ

oC đ

ệ ộ ượ ả 25oC/phút. Nhi t đ  295 c duy trì trong 10 phút. Trong đó các m nh ion 196 và 224 đ ượ   c

ể ị ượ ồ ủ ẫ ộ ướ ể ầ ượ dùng đ  đ nh l ng PQ & EPQ. Đ  thu h i c a m u máu và n c ti u l n l t là 94,00 ­

ế ả ớ ạ 99,85% và 95,00 ­ 100,34%, kho ng tuy n tính 0,1 ­ 50 µg/m l. Gi ệ i h n phát hi n (S/N = 3) là

ố ớ ả ướ ươ ượ ụ 0,01 µg/ml  đ i v i c  máu và n ể c ti u. Ph ng pháp này đã đ ể   c áp d ng đ  phân tích các

ẫ ọ ế ạ ố m u sinh h c thu đ ượ ừ c t các n n nhân ch t do u ng PQ.

ộ ử ụ ệ ắ ự  [5] s  d ng trên h  máy s c ký GC­MS (Gas Trong khi đó, Almeida R. M.  và  c ng s

ớ ộ ả chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972) v i c t mao qu n fused­

ớ ố ộ ế ộ ẳ ộ silica HP­5MS (30 m × 0,25 mm, đ  dày màng phim 0,1 µm) và ch  đ  đ ng dòng v i t c đ  0,6

oC. B m ho t ạ   ơ

ệ ộ ủ ơ ữ ộ ố ml/phút. Nhi ậ t đ  c a b m và interface (b  ph n ghép n i gi a GC và MS) là 270

oC trong 1 phút, tăng nhi

oC/phút đ n 200

oC

ở ế ộ ệ ộ ộ ế ộ đ ng ch  đ  chia dòng. Nhi t đ  c t duy trì 80 t 10ệ

oC và duy trì 270oC trong 4 phút. S  kh i c a các m nh ion đ

ế ố ủ ả ố ượ và 20oC/phút đ n 270 ọ c ch n cho

ấ ợ các h p ch t là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220 (EPQ), trong

ả ượ ể ị ượ đó các m nh ion 192 và 162 đ c dùng đ  đ nh l ng PQ & EPQ.

ươ ố ỏ ắ ổ 1.2.3. Ph ng pháp s c ký l ng kh i ph

ề ị ượ ọ Hai tác gi ằ   ẫ ng PQ trong m u sinh h c b ng ả ZhaohongWang và Proenca P. đ u đ nh l

ệ ỏ ố ổ ắ s c ký l ng ­ ion hóa tia đi n ­ kh i ph  [28] [41].

ử ụ ớ ộ ẫ ớ ZhaohongWang s  d ng ệ ố h  th ng Waters UPLC v i. Tiêm m u 5 μl v i c t ACQUITY

oC. Còn Proenca P. s  dùng h  th ng s c ký LC

ệ ố ử ắ BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) 30ở

ộ ệ ộ ộ Water 2695 Alliance System và c t silica HILIC (150 × 2,1 mm × 5 µm). Nhi t đ  c t duy trì

ạ ộ ả ẫ ơ 35oC. B m m u 10 µl. Detector m ng photodiode Water 996 ho t đ ng t ừ ướ  b c sóng 210­400 nm

ả ụ ượ ở ớ ộ v i đ  phân gi ộ ấ i 1,2 nm. Đ  h p th  UV đ c đo 258 nm.

ả ả ề ử ụ ộ C  hai tác gi đ u s  d ng pha đ ng là ammonium formate và acetonitrile. Trong khi

ế ề ằ ỉ ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (đi u ch nh đ n pH 3,7 b ng acid formic) và

ớ ố ế ộ ạ ộ ộ acetonitrile. Và ch y pha đ ng theo ch  đ  gradient v i t c đ  dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi

ả ẫ ừ ế ớ ở tiêm m u, % acetonitrile gi m t 60% đ n 20% trong 0,5 phút, sau đó tăng t i 60% 1,5 phút và

ở ế ạ ổ ờ duy trì 60% 1,5 phút ti p. T ng th i gian ch y là 3 phút. Thì tác gi ả Proenca P.  dùng pha đ ngộ

ế ộ ẳ ệ ớ ồ g m acetonitrile và đ m ammonium formate (200 mM) pH 3,6 v i ch  đ  đ ng dòng (30:70, v/v)

ố ộ và t c đ  300 µl/phút.

ả ề ử ụ ệ ồ ươ ể ẩ Các tác gi trên đ u s  d ng ngu n ion hóa tia đi n d ộ   ng đ  ion hóa PQ và chu n n i

ề ề ư ệ ố ổ nh ng có khác nhau v  đi u ki n kh i ph .

ử ụ ộ ổ ố Tác gi ả ZhaohongWang  s  d ng b  phân tích ph  kh i ACQUITY BSM_SM_Quattro

ố ư ề ệ ằ Premier XE MS. T i  u hóa đi u ki n MS­MS b ng cách tiêm dòng PQ và ethyl viologen trong

ớ ố ộ ị ố   acetonitrile/dung d ch ammonium formate 250 mM (40:60, v/v) v i t c đ  khí cone là 50 l/h và t c

oC. Đi n áp mao qu n là 3,5 kV và đi n áp cone là 20 V,

ở ệ ệ ả ộ đ  dòng khí làm khô là 651 l/h 350

ệ ệ ấ ị ượ ằ ậ ỹ đi n áp extractor là 4,0 V và đi n áp th u kính RzFl à 0,5 V. Đ nh l ng b ng k  thu t quét ion

ắ ả ầ ả ẩ (multi­reaction monitoring, MRM), b t các m nh ion ban đ u có m/z 186 và các ion s n ph m có

ố ớ ả ầ ả ẩ m/z 155 và 171 đ i v i PQ; m nh ion ban đ u có m/z 214 và các ion s n ph m có m/z 158 và 185

ẩ ộ ố ớ đ i v i chu n n i ethyl viologen [41].

ệ ổ ượ ự ệ ố ớ Còn v i tác gi c th c hi n trên máy kh i ph  t ́ ổ ư ả Proenca P [28] phát hi n ph  (MS) đ

oC; nhi

oC; t c đố ộ

ế ậ ề ệ ồ ệ ệ ộ ự c c Water ZQ 2000. Thi t l p các đi u ki n: ngu n nhi t 120 t đ  làm khô 400

ố ộ ệ ế dòng khí cone (N2) 0 l/h và t c đ  dòng khí làm khô (N ệ   2) 600 l/h. Đi n th  capillary 3,5 kV; đi n

ế ượ ổ ừ th  cone 40 V; extractor 4 V; năng l ng ion 0,5 V; Quét ph  t ờ  m/z 130­500, th i gian quét 0,5 s

ờ ễ ườ ế ẩ ừ và th i gian tr (interscan) 0,1s. Đ ng chu n đ ộ PQ  trong máu tuy n tính t 0,010­2,0 µg/ml

ế ừ ướ trong máu (y=0,0142x+0,1497 v i ớ r2=0,9994) và tuy n tính t 0,025­10,0 µg/ml trong n ể c ti u (y

ớ ạ ệ ủ ướ ể ầ ượ = 0,0141x + 1,347 v i ớ r2 = 0,9994). Gi i h n phát hi n c a PQ trong máu và n c ti u l n l t là

ớ ạ ị ượ 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD,  S/N  = 3) và gi i h n đ nh l ng ( LOD,  S/N  = 10) là 0,0012

ướ ứ ứ ể ẫ µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong n ắ   c ti u. Nghiên c u cũng ch ng minh m u máu tr ng

ư ớ ấ ẩ ờ ộ không có pic nào trùng th i gian l u v i PQ và ch t chu n n i

ươ ệ ắ 1.2.4. Ph ỏ ng pháp s c ký l ng hi u năng cao

ấ ả ươ ể ị ượ ề Có r t nh u tác gi ử ụ  đã s  d ng ph ng pháp HPLC đ  đ nh l ọ   ị ng PQ trong d ch sinh h c

[7][17][26].

ộ ệ ố ử ụ ồ ơ ẫ   ự [7] s  d ng h  th ng HPLC. G m b m model 126 và tiêm m u Arys K.  và c ng s

ạ ộ ướ ẫ ớ ộ type 210A v i vòng tiêm m u 50 µl. B c sóng ho t đ ng là 230 nm. C t phân tích Aluspher

ướ ớ ộ ả ệ ạ 100 RP­select B (125 mm × 4,0 mm, kích th c h t 5 µm) v i c t b o v  100 RP­select B (4

ướ ạ ỗ ợ ộ ị mm × 4,0 mm, kích th c h t 5 µm). Pha đ ng là h n h p dung d ch NaOH 0,0125 M trong

ướ ộ ố ị ị ị n c (dung d ch A) và dung d ch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung d ch B), t c đ  dòng

ế ộ ạ ộ ị ừ ế ờ 1 ml/phút. Ch y pha đ ng ch  đ  gradient, dung d ch A t 90% đ n 10% trong th i gian 15

ạ ạ ề ệ ướ ạ phút. Sau khi ch y xong, ch y l ầ i đi u ki n ban đ u trong 5 phút tr ạ   ể c khi chuy n sang ch y

ẫ ớ ớ ạ ủ ươ ướ ể ầ ượ m u m i. Gi ệ i h n phát hi n PQ c a ph ng pháp trong máu và n c ti u l n l t là 63 và

32 µg/l.

ị ượ ế ế ươ ng PQ trong huy t thanh và  huy t t ng ng ườ ượ i đ ơ   c làm đ n Paixão  P.  [26]  đ nh l

ả ằ ươ ử ụ gi n và nhanh b ng ph ng pháp HPLC s  d ng 1,19­diethyl­4,49­  bipyridyldiylium (diethyl

ộ ơ ẫ ổ ị ệ paraquat)  làm n i chu n. ẩ   H  th ng ệ ố   HPLC  g m bồ m m u model 1100,  n đ nh nhi t, detector

ẫ ơ ộ ề ộ UV­VIS.  Vòng b m m u 50 µ l, c t NovaPar C 18  (150×4,6 mm, 5µm). Ti n c t C 18  (100×4,6

oC v i t c đ  dòng 0,8 m ộ

ấ ộ ẩ ượ ử ớ ố mm, 10µm). PQ và ch t n i chu n đ c r a gi ả ở i 25 l/phút và b cướ

ụ ấ ộ ồ sóng h p th  258 nm. Pha đ ng g m acid 1 ­ octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1

ướ ử ề ế ồ ỉ M trong 900 ml n ằ c kh  khoáng đi u ch nh pH đ n 3,0 b ng diethylamine. Acetonitrile n ng đ ộ

ủ ư ế ả ẩ ộ ờ ớ ạ 10% (v/v). K t qu : Th i gian l u c a PQ và chu n n i là 6,5 và 9,5 phút. Gi ệ   i h n phát hi n

ớ ạ ị ượ ế ươ (LOD) 0,1 µg/ml, gi i h n đ nh l ng (LOQ) 0 ,4 µg/ml trong huy t t ế ng và huy t thanh. Đ ộ

ượ ế ươ ế ộ đúng trong ngày không v t quá 3,5% ố ớ ; 3,2% đ i v i huy t t ng, huy t thanh. Đ  đúng trong

ượ ế ươ ế ồ khác ngày không v t quá 4,7% ố ớ ; 3,1% đ i v i huy t t ế   ộ ng, huy t thanh. Đ  thu h i trong huy t

ầ ượ ươ t ế ng và huy t thanh l n l t là 98,9% và 98,7%.

ị ượ ế ươ ồ ờ ươ Shuuji Hara [17] đ nh l ng đ ng th i PQ và DQ trong huy t t ằ ng b ng ph ng pháp

ệ ử ụ ậ ẫ ơ ơ HPLC. H  s  d ng b m L­7120 (Hitachi, Tokyo, Nh t), van b m m u (20 µ l)  Rheodyne 7125.

ượ ỡ ạ ả ộ PQ, DQ, IS đ ủ   c tách trên c t pha đ o Capcell PaK C18 UG120 (150­4,6 mm, c  h t 5µm, c a

ử ằ ị ả ủ ậ Shiseido Co., Tokyo, Nh t) b ng dung d ch r a gi i c a methanol và  200 mM axit phosphoric

ủ ố ộ ớ v i diethyl amine 0,1M và sodium 1­heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). T c đ  dòng c a pha

oC. D ch r a t ị

ệ ộ ộ ả ừ ử ừ ộ ượ ộ đ ng 0 ,5 ml/phút và nhi t đ  c t trong kho ng t 15­20 c t HPLC đ ớ   ộ c tr n v i

ủ ề ằ ị ế ị ộ ố ộ ỗ dung d ch ki m c a Sodium hydrosulfite b ng thi t b  tr n. T c đ  dòng 0,4 m ợ   l/phút. H n h p

ượ ẫ ợ ượ ể ướ ấ đ c d n vào s i dây (1 m x 0,5 mm) và đ c làm  m trong b  n c SB­9 (EYELA, Tokyo,

oC và đo

ậ ở ệ ộ ằ ộ Nh t) nhi t đ  20 ở ướ  b ủ   c sóng 391 nm b ng detector UV Hitachi L­ 7405. Đ  cao c a

ượ ể ị ượ ậ ằ pic đ c dùng đ  đ nh l ng b ng máy C­R6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nh t). Gi ớ ạ   i h n

ệ ủ ế ươ phát hi n c a PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên m l huy t t ng.

ượ ế ươ ả ặ ử ụ ệ ắ ỏ ị Đ nh l ng PQ trong huy t t ng s  d ng s c ký l ng hi u năng cao pha đ o c p ion đã

ự ệ ố ắ ượ ử ụ ơ đ ệ  trên h  th ng s c ký đ ơ c s  d ng có 2 b m, 1 b m 2 nòng đ ể c ượ Brunetto M.R. th c hi n

ể ể ể ộ ộ ộ ơ ộ chuy n pha đ ng vào c t phân tích và b m Knauer Model 64 đ  chuy n pha đ ng vào c t chi ế   t.

ử ẫ ặ ể ư ộ ế Van tiêm (V1) 6 c a có các vòng m u 20, 100 ho c 200 µ ẫ l đ  đ a m u vào c t chi ử ụ   t. S  d ng

ộ ượ ấ ầ ạ ướ ạ các c t 25 ­ 4 mm đ c l p đ y các h t LiChrospher RP­18 ADS (kích th ộ   c h t 25 µm) và c t

ầ ượ ạ ế ộ ộ VARIAN ODS C­18 (25 cm × 4,6 mm, h t 5 µm) l n l ộ t là c t chi t và c t phân tích. C t chi ế   t

ộ ượ ắ ử ớ ượ ề ể ằ ơ và c t phân tích đ c g n v i van xoay 6 c a Rheodyne đ c đi u khi n b ng b m 2 nòng. S ử

ể ớ ụ d ng detector UV­DAD Perkin­Elmer LC 235 ở ướ  b c sóng 258 nm v i flowcell 12 µm đ  phát

ệ ệ hi n các tín hi u.

Các pha đ ng:ộ

ể ộ ế ứ ộ ­ Pha đ ng đ  chi t (Pha đ ng 1): ch a natri octane sulfonate (SOS) 10mM và acid

ượ ằ ướ ấ ầ ọ orthophosphoric 0,05 M đ c pha b ng n ề   c c t 2 l n, và l c màng 0,45 µm. Đi u

ế ằ ồ ộ ỉ ch nh pH đ n 2,8 b ng TEA và thêm 2­propanol n ng đ  3% (v/v).

ể ộ ộ ­ Pha   đ ng   đ   phân   tích   (Pha   đ ng   2):   methanol   40   %   và   SOS   10   mM   trong   acid

ế ề ằ ỉ orthophosphoric 0,05 M. Đi u ch nh đ n pH 2,8 b ng TEA.

ộ ị ượ ọ ể ướ Các dung d ch và pha đ ng đ ạ c l c màng 0,45 µm và lo i khí trong b  siêu âm tr c khi

ớ ạ ỉ ệ ệ ễ ệ ườ ề ớ ử ụ s  d ng. Gi i h n phát hi n, t  l tín hi u (Signal) / Nhi u đ ng n n (Noise) v i S/N > 3, là

ể ẫ ớ 0,005 µg/ml PQ v i th  tích tiêm m u 200 µg [9].

ử ụ ộ ươ ể ắ ỏ ị Chen Lu và c ng s ự [25] đã s  d ng ph ệ ng pháp s c ký l ng hi u năng cao đ  xác đ nh

ế ườ ệ ế ẫ ượ ế ủ PQ trong huy t thanh ng i. Trong thí nghi m này, các m u huy t thanh đã đ c k t t a protein

ượ ầ ượ l n l t 30% acid perchloric, acetonitrile và dichlormethane, thu đ ộ   ị c 50 ml dung d ch. Pha đ ng

ứ ệ ệ ị acetonitrile­đ m (10:90), dung d ch đ m ch a natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric

ố ộ ề ế ằ ỉ ướ 0,26 M, đi u ch nh pH đ n 2,0 b ng triethylamine. T c đ  dòng 1,2 ml/phút, b ệ   c sóng phát hi n

oC. Đ ng chu n tuy n tính v i n ng đ  PQ huy t thanh t

ệ ộ ộ ớ ồ ườ ế ế ẩ ộ ừ 256 nm, nhi t đ  c t 40 0,1 ­ 40 mg/l

ớ ạ ộ ̣ ủ ệ ẫ ̉ (r = 0,9999). Gi i h n phát hi n là 0,1 mg/l (S/N = 3). Đ  lêch chuân (RSD) c a các m u ch nǵ ư

ộ ấ ộ ̣ ữ ̉ ồ n ng đ  th p, trung bình và cao là trong vòng 3,061% ­ 6,149%, đ  lêch chuân gi a các lô 0,705%

̀ ́ ́ ̃ ươ ử ồ ̣ ̉ ̣ ­ 2,796%, và đô thu hôi cua ph ng phap x  ly mâu 96,79 % ­ 100,07%, và đô thu h i ph ươ   ng

ươ ả ạ ả ơ pháp là 91,66% ­ 108,49%. Ph ng pháp này là đ n gi n, nh y c m, chính xác, nhanh chóng và

ể ượ ử ụ ỉ ằ cũng ch  ra r ng có th  đ ẩ c s  d ng trong ch n đoán lâm sàng.

̀ ̀ ́ ̃ ươ ượ ượ ̣ ̉ ̣ * Ngoai ra, môt vai ph ̃ ́ ng phap khac cung đa đ ́ ư c nghiên c u đê đinh l ng PQ trong

́ ́ ̃ ư ̣ ̣ ̣ ̉ mau nh : miên dich phong xa [14], điên di mao quan [38]…

ươ ế ươ ử ẫ 1.3. Các ph ng pháp x  lý m u huy t t ng phân tích Paraquat

ế ố ữ ộ ả ủ ế ị ế ệ ươ ị ượ M t trong nh ng y u t quy t đ nh đ n hi u qu  c a ph ng pháp đ nh l ng đó là

ươ ẫ ph ử ng pháp x  lý m u.

ứ ử ụ ề ấ ậ ỹ ế ể ử ắ ẫ ọ Có r t nhi u nghiên c u s  d ng k  thu t chi t pha r n đ  x  lý m u sinh h c trong

ộ ố ả ệ ẫ phân tích PQ [5][16][20][28][41]. M t s  tác gi ể  dùng đ m phosphate đ  thêm vào m u th  tr ử ướ   c

ộ ế ắ khi cho qua c t chi t pha r n [5][16][41].

ộ ế ườ ượ ể C t chi ắ t pha r n C18 th ng đ c dùng đ  chi ế PQ & DQ trong m u thẫ t ử [20]. Dung

ẫ ạ ượ ộ ượ ế ỉ ạ ằ ị d ch m u đã lo i protein đ c ch nh pH đ n 11 b ng ằ  NaOH. C t đ c ho t hóa b ng 5 m l n c,ướ

ướ ướ ơ ộ ơ 5 ml methanol và 20 ml n c tr ẫ c khi b m m u vào c t. 3 m l n ướ ấ ượ c c t đ c b m qua c t đ ộ ể

ạ ỏ ấ ợ lo i b  hoàn toàn các h p ch t khác trong máu. Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 m l × 3

ướ ử ượ ộ ể ử ả ớ ị ượ n c kh  khoáng đ c cho qua c t đ  r a gi i PQ & DQ. V i d ch thu đ c thêm 3 m l dung

ẫ ượ ị NaOH 0.2 M. M u này đ d ch c mang đi đo quang [20].

ể ộ ế ộ ượ ử ớ Chang­bin Li [5] cũng dùng c t C18 đ  chi t PQ, c t đ c r a v i 2 m l methanol và 2 ml

ẫ ị ượ ư ớ ướ ử ệ đ m phosphate (pH 8,0). Dung d ch m u đ ộ ồ ử c đ a qua c t r i r a v i 2 m l n c kh  khoáng.

ử ố ả ớ ử ị ơ ở ệ ộ ướ Cu i cùng, r a gi i v i 2 m l methanol và d ch r a gi ả ượ i đ c bay h i nhi t đ  phòng d i dòng

ắ ơ ệ ố khí nitrogen. Hòa tan c n trong 100 µ l methanol và b m 1 µ l vào h  th ng GC­MS.

ệ Zhaohong Wang  [41]  x  lýử   1,0 ml  máu, thêm 3 ml  đ m phosphate 0,1M (pH 7) và dung

ộ ộ ẩ ị d ch chu n n i 100 ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các c t Waters Oasis WCX 3 m l

ượ ầ ượ ạ ướ ử ệ đ c cho ch y qua l n l t 3 m l methanol, 3 ml n c kh  khoáng và 1 m l đ m phosphate 0,1 M

ộ ử ộ ớ ẫ ệ ạ (pH 7). Sau khi cho m u ch y qua c t, r a c t v i 3 m l đ m phosphate 0,1 M (pH 7), 3 m l n cướ

ử ấ ấ kh  khoáng và 3 m ộ l methanol. S y khô chân không c t trong 10 phút. Ch t phân tích đ ượ ử   c r a

ả ằ ơ ị ử ị ả ằ gi i b ng 2 m l dung d ch acid formic 2% trong acetonitrile 80%. Bay h i d ch r a gi i b ng dòng

oC. Hòa tan c n b ng 50   ắ

ằ ộ ị khí nitrogen 45ở μl  pha đ ng (dung d ch acetonitrile và ammonium

ỉ ệ formate 250 mM t  l 1:1).

̃ ̀ ́ ́ ử ướ ể ́ Proenca P [28] x  ly mâu băng cach lây 1 m l máu ho c 1 mặ l n c ti u thêm 50 µ l chu nẩ

ắ ộ ế ộ n i (10 µg/m l) và 2 ml acetonitrile. L c, ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. C t chi ắ   t pha r n

ướ ử ẫ (Oasis, 3 cc) đ ượ ử ớ ầ ượ c r a v i l n l t 1 m l methanol và 1 ml n ộ   ư c kh  khoáng. Đ a m u qua c t

ế ử ộ ớ ắ ệ ướ ử chi t pha r n. R a c t v i 1 m l đ m phosphate pH 7,1 m l n c kh  khoáng và 1 m l methanol.

ử ả ộ ớ Sau khi làm khô 10 phút trong chân không, r a gi i c t v i 1,5 m l acetonitrile/water/TFA (84:14:2,

oC. C n đ ắ

ử ắ ướ ở ượ ị v/v/v). D ch r a gi ả ượ i đ ơ ế c bay h i đ n c n d i dòng khí nitrogen 40 c hòa tan

ơ ệ ố trong 100 µl methanol và b m 10 µ l vào h  th ng LC­ESI­MS.

ể ạ ề Kyoko KATO, P. Paixão đ u dùng acid perchloric đ  lo i protein [20][26]. Tuy nhiên, m tộ

ể ế ủ ử ụ ế ươ ẫ ố s  công trình khác s  d ng acid trichloracetic đ  k t t a protein trong m u huy t t ng [7][17]

ấ ơ ụ ệ ể ậ ả ộ ở ị ả [24][30] r t đ n gi n và cho hi u qu  cao vì v y có th  áp d ng r ng rãi ơ  các đ n v  xét

nghi m. ệ

ươ ộ ể ị ụ ượ ượ Rai M.K. và c ng s Ph ng pháp này đ c ng PQ trong máu, n cướ ự áp d ng đ  đ nh l

ữ ể ị ẹ ti u và s a m . Thêm 1 m l dung d ch EDTA 5% và 1m ể ạ ự ả   l acid trichloracetic 1% vào đ  lo i s   nh

ưở ủ ạ ấ ạ ầ ị h ng c a các ion kim lo i và lo i protein. Ly tâm 1850 vòng/phút trong 10 phút. L y ph n d ch

ở trong trên đem đo quang [30].

ế ươ ế ươ ạ ị ẩ ượ Huy t t ng s ch và các dung d ch huy t t ng chu n PQ 50 và 10 μg/ml  đ c thêm

ỉ ệ ắ ầ ị TCA 20% (t  l 6:1). L c xoáy, li tâm 13000 ấ  vòng/phút trong 5 phút. L y d ch trong ph n trên đi

ướ ừ ế đo quét b c sóng t 200 đ n 300 nm [24].

́ ́ ̀ ́ ử ặ ẩ ̃ Arys K [7] x  ly mâu băng cach lây 1 m ẫ l (ho c 1 g) m u, thêm 50 µ ộ l chu n n i và thêm

ướ ừ ủ ủ ằ ướ ủ ạ ầ n c v a đ  4 m l. T a protein b ng acid trichloroacetic là b ẫ   c làm s ch đ u tiên c a các m u

ắ ị ậ máu, gan, th n. Thêm 1,5 m l dung d ch acid trichloroacetic 25%, l c 10 phút, ly tâm 400 vòng/phút

ể ị ở ự ạ ầ ủ ố trong 5 phút. Sau khi chuy n d ch trong trên sa ng  ng nh a s ch, ph n t a protein phía d ướ   i

ượ ạ ằ ắ ị đ c hòa tan l i b ng 2,5 m l  dung d ch   acid trichloroacetic 5%, l c 10 phút, ly tâm 1100

ầ ộ ị ạ ể ố vòng/phút trong 5 phút, g p ph n d ch trong l i, chuy n sang  ng silan hóa. Tuy nhiên ở ộ    m t

ượ ứ ầ ướ ố ườ s  tr ợ ng h p đã đ c ch ng minh c n thêm b ữ c ly tâm n a (2200 vòng/phút trong 10 phút)

ể ượ ố ớ ướ ạ ầ ị ể ạ ướ ạ đ  thu đ c ph n d ch s ch hoàn toàn. Đ i v i n ị c ti u và d ch d  dày, b c lo i protein

ể ỏ ướ ử ế ề ằ ỉ có th  b  qua và làm ngay b c ti p theo là kh  PQ b ng natri borohydride. Đi u ch nh pH

ế ằ ớ ơ ị ố ớ ướ ể ạ ủ c a dung d ch đ n pH l n h n 10 b ng 1 m l NaOH 1M (đ i v i n ị c ti u và d ch d  dày)

4 và l c

oC

ặ ố ớ ẫ ộ ắ ở ho c 1 m l NaOH 5M (đ i v i các m u khác). Sau đó, thêm 250 mg b t NaBH 60

ở ệ ộ ế ớ ị trong 25 phút. Sau khi làm mát nhi t đ  phòng, chi t dung d ch v i 8 m l diethyl ether b ngằ

ể ớ ữ ơ máy trong 15 phút. Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuy n l p h u c  phía trên

ơ ị ố ế ế ằ ắ sang  ng silan hóa hình nón. Bay h i d ch chi t đ n khô b ng dòng khí nitrogen. C n đ ượ   c

ộ ị ị hòa tan trong 60 µl pha đ ng (dung d ch A : dung d ch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µ l vào hệ

ố th ng HPLC.

ộ ế ộ ứ ủ Shuuji Hara và c ng s Theo nghiên c u c a ỉ ầ ấ ự [17] ch  c n l y 200 µ ớ   l huy t thanh tr n v i

ẩ ị ắ ộ 20 µl dung d ch n i chu n (10 µg/m l) và 120 µl TCA 10% và l c xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000

ấ ổ ở ị ơ vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, l y 20 µ l d ch n i trên b m vào máy.

ạ ổ ệ ệ ấ ả ị ượ ẫ Tóm l i, t ng quan tài li u tham kh o cho th y vi c đ nh l ế   ng PQ trong m u huy t

ượ ự ằ ươ ế ươ ẫ ượ ươ t ủ ế ng ch  y u đ ệ c th c hi n b ng ph ng pháp HPLC. Trong đó m u huy t t ng đ ạ   c lo i

ế ủ ằ ớ ị ượ ệ ộ ỏ b  protein b ng cách k t t a v i TCA và đ nh l ng trên h  HPLC c t tách C8 dung môi pha

ệ ể ồ đ ngộ  theo th  tích (5:95) g m ACN – Đ m photphat pH=2,5 g m ồ (natri heptanesulfonate; KCl;

PEG ; triethylamine; MeOH).

ƯƠ

Ố ƯỢ

ƯƠ

CH

NG 2:

Đ I T

NG

VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊ

N C UỨ

ố ượ ứ 2.1. Đ i t ng nghiên c u

ự ể ị ử ụ ị ươ Đ  xây d ng và xác đ nh giá tr  s  d ng c a ng pháp phân tích P Q  trong huy tế ủ   ph

ườ ố ượ ứ ế ươ t ng ng i, chúng tôi ti n hành nghiên c u trên các đ i t ng sau:

ẫ ắ ế ươ ườ ủ ệ ề ­ M u tr ng: là huy t t ng ng ế ọ i c a vi n Huy t h c và truy n máu trung ngươ .

ẫ ắ ẫ ẩ ượ ượ ị ạ ­ M u chu n: là m u tr ng đ c thêm l ng xác đ nh P Q t o thành mâu.̃

ế ươ ẫ ệ ượ ừ ẫ ử ­ M u th : là huy t t ng b nh nhân ng  đ c P ộ ộ Q thu đ ấ    m u máu, ly tâm l y c t

ế ươ ầ ph n huy t t ng.

ấ ấ ẩ 2.2. Ch t chu n, hoá ch t, thi ế ị t b

ẩ ấ 2.2.1 Ch t chu n

ủ ẩ ấ ộ ế Ch t chu n Paraquat dichloride.x­hydrate c a hãng Sigma ­ Aldrich đ  tinh khi t 99,5%;

Exp date: 14.Dec.2016.

2.2.2 Hoá ch tấ

ủ ệ ắ ỏ ­ Các dung môi dùng cho s c ký l ng hi u năng cao (MeOH, ACN ....) c a hãng Merck .

ể ộ ế ủ ­ KCl tinh th , đ  tinh khi t: 99,5% c a hãng Merck.

ế ủ ­ Acid trichloroacetic tinh khi t 98,5% c a hãng Merck.

3) c a hãng Merck.

ặ ủ ­ Acid phosphoric (H3PO4) đ c (d=1,685 g/cm

ẫ ủ ể ử ẩ ấ ạ ­ Các dung môi, hoá ch t dùng đ  x  lý m u c a hãng Merck và đ t tiêu chu n tinh khi ế   t

phân tích (P.A.)

ướ ấ ử ụ ướ ấ ầ ượ ­ N c c t s  d ng là n c c t hai l n đã đ c deion hoá.

ệ ộ ị ượ ị ằ ẩ ồ ­ Dung   d ch   đ m   pha   đ ng   pH   =   2,5   đ c   chu n   b   b ng   cách   sau:   g m   1,1   g natri

heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 200 ml MeOH; 0,5 ml triethylamine thêm

́ ướ ủ ề ằ ộ ỉ ế ̉ n c xâp xi 1000 ml. Đi u ch nh pH c a pha đ ng b ng H ố   ị 3PO4 đ n các giá tr  pH mong mu n.

̀ ̀ ứ ư ị ươ ̉ Đ nh m c v a đu 1000 ml băng n ́ c deion.

ấ ẩ ẩ ố ị ­ Pha   dung   d ch   chu n   g c   PQ: Hòa   tan   100   mg   ch t   chu n   paraquat dichloride

ừ ố ị (C12H14Cl2N2.xH2O), hòa tan trong 100 ml n ướ ể ượ c đ  đ c dung d ch g c. T  đó pha thành các dung

ứ ấ ẩ ộ ồ ướ ẩ ồ ộ ị ị d ch chu n th  c p có n ng đ  0,1 ­ 20 µg/ml trong n ộ c. Tr n các n ng đ  dung d ch chu n th ứ

ế ươ ớ ể ả ể ắ ồ ị ấ c p v i huy t t ng tr ng đ  có n ng đ ộ PQ 0,02 ­ 10 µg/ml đ  kh o sát và xác đ nh giá tr  s ị ử

ủ ươ ụ d ng c a ph ng pháp .

ế ị ụ ụ 2.2.3. Thi t b , d ng c

(cid:0) Thi t bế ị

ế ị ắ ệ ộ ồ ỏ ơ ­ Thi t b  s c ký l ng hi u năng cao Agilent 1200, g m b m tr n dung môi gradient áp

ự ế ấ ằ ồ ổ ổ ộ ệ ế ị ẫ ự ộ su t cao, b  đu i khí tr c tuy n b ng chân không, bu ng  n nhi t, thi t b  tiêm m u t đ ng,

ấ ử ụ ư ệ ổ ộ ả detector m ng ả Diode (DAD), th  vi n ph  đ c ch t s  d ng detector m ng Diode, máy tính, máy

in.

ộ ả ­ C t pha đ o Agilent C8 ( 150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và c tộ  b o vả ệ C8 (20 mm x 4,0 mm,

5 μm).

ộ ọ ủ ­ Cân phân tích Precisa XT 220A, đ  đ c c a cân 0,0001 g.

ứ ể ­ B  siêu âm. Model: S30/H. Hãng ELMA, Đ c.

ị ọ ả ­ Máy đo pH Meter 744, giá tr  đ c ± 0,01, kho ng đo pH = 0,00 – 14,00

ố ộ ố ­ Máy ly tâm Universal 320 hãng Hettich, Đ cứ , t c đ  t i đa 4000 vòng/phút.

­ Máy l c ắ xoáy model: 3005 c a hủ ãng GFL, Đ c.ứ

ủ ấ ứ ủ ­ T  s y model: 500 c a hãng Memmert, Đ c.

ấ ướ ầ ­ Máy c t n c hai l n. Model: A4000D/Aquatron hãng Stuart ­ Barloworld Scientific, 4

l/h, Anh.

ộ ọ ướ ạ ­ B  l c n c siêu s ch. Model: WaterPro PS/HPLC/UF hybrid ­ Labconco, 115V, 60Hz,

Mỹ.

(cid:0) D ng cụ ụ

ứ ị ­ Bình đ nh m c dung tích: 5, 10, 25, 50, 100 ml.

ạ ừ ­ Pipetman các lo i t 0 ­ 1000 µl.

ộ ọ ỹ ủ ­ B  l c dung môi c a hãng Agilent, M .

Ố ứ ệ ệ ấ ố ­ ng nghi m l y máu ch a EDTA và  ng nghi m có nút xoáy.

ấ ả ả ượ ử ạ ụ ề ằ ướ ấ ụ ủ T t c  các d ng c  th y tinh đ u ph i đ c r a s ch, tráng b ng n c c t, sau đó tráng

oC trong vòng 1 gi

ấ ở ể ầ ờ ấ ể ằ b ng MeOH và đ  khô, tráng n­hexan 3 l n sau đó s y 105 ộ   , l y ra đ  ngu i

ướ ử ụ tr c khi s  d ng.

ươ ứ 2.3. Ph ng pháp nghiên c u

ứ ị 2.3.1. Nghiên c u xây d ng ự quy trình đ nh l ượ g paraquat. n

ị ẫ ẩ ẩ 2.3.1.1. Chu n b  m u chu n

ư ấ ố ướ Theo nh  tính ch t đã bi ế ủ paraquat  dichloride là tan t t c a t trong n c và ́ it tan trong

ề ộ ư ữ ệ ả ơ ự ủ   dung môi h u c  nh  EtOH, MeOH… Tham kh o các tài li u và so sánh v  đ  phân c c c a

ướ ọ ướ ể ự ướ n c và các dung môi, chúng tôi l a ch n n c đ  hòa tan PQ vì n ệ   ộ ạ c không đ c h i, thân thi n

ườ ơ ớ v i môi tr ng h n EtOH,  MeOH.

ươ ừ ế ươ 2.3.1.2. Ph ng pháp tách PQ t huy t t ng

̀ ́ ̀ ủ ự ệ ấ ố ̣ D a theo tính ch t lý hóa c a PQ, theo các tài li u đã công b  va trang thiêt bi phong thi ́

ệ ể ế ề ừ ế ươ ̣ ả nghiêm, chúng tôi ti n hành kh o sát các đi u ki n đ  tách PQ t huy t t ư ng nh  sau:

ế ươ ẫ ể ạ ắ ̣ V i 1 mớ l m u huy t t ớ   ng, thêm dung dich TCA đ  lo i protein, l c xoáy và ly tâm v i

ộ ổ ắ ờ ̣ ồ n ng đ  dung dich TCA thay đ i là: 2,0% ; 4,0%; 5,0%; 6,0% và th i gian l c xoáy: 30 giây, 1

phút, 2 phút.

ươ ể ị ề ượ ế ươ 2.3.1.3. Ph ng pháp k ệ ắ ả h o sát đi u ki n s c ký đ  đ nh l ng PQ trong huy t t ng

ỏ ề ế ươ ể ẫ ả ẩ ế Đ  đánh giá kh  năng tách PQ ra kh i n n m u huy t t ẫ ng, các m u chu n chi t PQ

ẫ ượ ạ ắ ọ ồ ị ằ ắ ẩ ề trong n n m u đ ự   c chu n b  b ng cách cho TCA, l c xoáy, ly tâm, l c r i ch y s c ký. D a

ợ ủ ệ ề trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù h p c a đi u ki n đo.

ộ ắ ế ị ệ ọ ộ * C t s c ký: C t tách có vai trò quan tr ng trong vi c quy t đ nh quá trình tách có đ ộ

ứ ể ạ ấ ầ ọ ử phân gi ả ố i t t hay không [ ợ 3]. Đ  ch n lo i pha tĩnh phù h p c n căn c  vào c u trúc phân t và

ự ủ ự ề ệ ả ấ ả ệ ơ ở ậ   ộ đ  phân c c c a ch t phân tích. D a trên kh o sát các tài li u tham kh o và đi u ki n c  s  v t

ấ ẵ ạ ử ụ ả ộ ố ộ ch t s n có t i Trung tâm Ch ng đ c, chúng tôi s  d ng c t pha đ o Agilent C8 (150 mm x 4,6

ứ mm; 5 µm) và c tộ  b o vả ệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm) trong nghiên c u này.

λ ự ạ ấ ự ạ ấ ụ ủ ướ ử ẫ ị ụ ủ   * B c sóng ( ): là c c đ i h p th  c a PQ trong m u th , xác đ nh c c đ i h p th  c a

ổ ấ ự ụ ả ệ ỏ PQ d a vào ph  h p th  UV trong kho ng 210 ­ 400 nm theo máy ắ s c ký l ng hi u năng cao

Agilent 1200, detector DAD.

ẫ ừ ể ể ẫ ổ * Th  tích tiêm m u: thay đ i th  tích tiêm m u t 10 ­ 50 µ l.

ự ệ ế ệ ả ả ộ ộ * Pha đ ng: d a vào các tài li u tham kh o, ti n hành kh o sát các h  pha đ ng có kh ả

ậ ợ ư ờ ố ị ượ ợ năng tách, th i gian l u phù h p và cho các pic cân đ i thu n l i cho phân tích đ nh l ồ   ng g m

ệ ộ các h  pha đ ng sau:

ệ ợ ỗ ướ ị ­ H  A: Kênh 1 là h n h p dung d ch ị NaOH 0,0125M trong n c và kênh 2 là dung d ch

ố ộ ỷ ệ ể ươ ứ NaOH 0,0125M trong methanol. T c đ  dòng 0,5 m l/phút. T  l th  tích 2 kênh t ng  ng là 90 :

10.

ệ ệ ồ ị ầ   ­ H  B: G m kênh 1 là ACN kênh 2 là dung d ch đ m pH = 3 (10:90, v/v). Thành ph n

ồ ướ ệ đ m g m acid 1 ­ octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 m l n c kh ử

ề ằ ỉ ế khoáng đi u ch nh pH đ n 3,0 b ng diethylamine.

ệ ệ ồ ị ­ H  C: ACN – dung d ch đ m (5:95, v/v) pH = 2,5 g m 1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g

́ ướ ̉ KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm n c xâp xi 1000 m l.

3PO4 đ c. Đ nh m c v a đu 1000 m

̀ ề ằ ỉ ứ ư ặ ị ̉ Đi u ch nh pH b ng H ̀ l băng n ́ươ  deion. c

̀ ́ ọ ượ ệ ả ộ ợ * Sau khi ch n đ c h  dung môi pha đ ng phù h p chúng tôi tiên hanh kh o sát thành

ầ ủ ộ ộ ị ượ ả ả ừ ph n c a pha đ ng. Giá tr  pH pha đ ng cũng đ c kh o sát trong kho ng t ế  2,5 đ n 4,5.

ệ ả ầ ồ ị *   Kh o   sát   thành   ph n   dung   d ch   đ m:   n ng   đ ộ natri   heptanesulfonate,   KCl   &

polyethylenglycol.

ổ ố ộ ộ ộ ố ừ ị ượ ố * T c đ  dòng: thay đ i t c đ  pha đ ng t 0,2 ­ ể 0,8 ml/phút đ  xác đ nh đ c t c đ ộ

ư ố ư ờ ợ ộ phù h p cho m t th i gian l u t i  u.

ế ả ượ ứ ớ ừ ả ượ ề ờ * Các k t qu  thu đ c  ng v i t ng kh o sát đ ư   c đánh giá, so sánh v  th i gian l u

R), đ  phân gi

S) và h  s  đ i x ng pic (A

S). Ph

ộ ả ệ ố ố ứ ươ ấ ủ c a các ch t phân tích (t i (R ng pháp đánh giá

ự ế ủ ả này d a trên lý thuy t Van Deemter sao cho 0,9 < A ớ   ấ S < 1,2, tR c a các ch t ph i không quá l n

ư ả ả ả nh ng đ m b o ph i tách xa nhau.

ươ ế ươ 2.3.2 Đánh giá ph ng pháp phân tíc h PQ trong huy t t ng

ọ ọ 2.3.2.1. Tính ch n l c

ế ươ ẩ ế ươ ắ ẫ ắ ị ẫ Chu n b  m u huy t t ng tr ng không có PQ và m u huy t t ế   ng tr ng có PQ. Ti n

ỏ ề ử ệ ẫ ả ẫ hành x  lý và phân tích m u, đánh giá hi u qu  tách PQ ra kh i n n m u.

ế ả ộ ồ 2.3.2.2. Kho ng n ng đ  tuy n tính

ế ươ ẩ ẫ ị ể ắ ượ ẫ ẩ ồ Chu n b  các m u huy t t ng tr ng, thêm PQ đ  thu đ c các m u chu n có n ng đ ộ

ừ ự ườ ẩ ồ ượ PQ t 0,02 ­ 10 µg/m l. Chúng tôi xây d ng đ ớ ng chu n v i 8 n ng đ ộ PQ đ ẫ   c them vào m u

ế ươ ầ ượ ẫ huy t t ng tr ng ắ  l n l t là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/m ử l. Sau đó x  lý m u và

ế ti n hành phân tích.

ớ ạ ệ ớ ạ ị ượ 2.3.2.3. Gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l ng

ế ươ ử ế ẫ ắ ẫ ẩ ả ồ ộ Ti n hành x  lý các m u huy t t ng tr ng và m u chu n có n ng đ  kho ng 0,01 ­ 0,1

ẩ ủ ệ ố ộ ệ ươ ồ ị µg/ml và phân tích trên h  th ng HPLC, tính đ  l ch chu n c a ph ng trình h i quy và xác đ nh

ắ ϭ ắ LOD theo quy t c 3 , LOQ theo quy t c 10 ϭ .

ộ ặ ạ ộ ụ ộ ồ ộ 2.3.2.4. Đánh giá đ  đúng (đ  thu h i) và đ  ch m (đ  l p l i)

ế ươ ẩ ị ồ ộ ộ ­ Đ  đúng ẫ : chu n b  các m u PQ trong huy t t ắ ng tr ng ỗ   ở 5 n ng đ  khác nhau, m i

ử ữ ầ ẫ ắ ầ ộ ồ ị ị ồ n ng đ  làm 5 l n, x  lý m u và phân tích s c ký r i so sánh giá tr  trung bình gi a các l n đ nh

ỗ ồ ộ ớ ủ ấ ượ l ng c a m i n ng đ  v i giá tr ị ch t thêm vào trong m u.ẫ

ộ ặ ạ ­ Đ  l p l i:

ộ ặ ạ ế ươ ẩ ị ở ồ ộ + Đ  l p l i trong ngày ẫ : chu n b  các m u PQ trong huy t t ắ ng tr ng 3 n ng đ  khác

ư ầ ỗ ồ ử ầ ẫ ắ ộ ộ ộ ệ   nhau, m i n ng đ  làm 5 l n, x  lý m u và phân tích s c ký nh  ph n đ  đúng, đánh giá đ  l ch

ẩ ươ ố ủ ừ ẫ ồ chu n t ộ ng đ i c a các m u theo t ng n ng đ .

ộ ặ ạ ế ươ ự ư ư ở + Đ  l p l i khác ngày : ti n hành t ng t nh  trên nh ng làm 5 ngày khác nhau.

ộ ổ ị 2.3.2.5. Đ   n đ nh

ộ ổ ủ ấ ờ ọ ị ị ị Xác đ nh đ   n đ nh c a ch t phân tích trong d ch sinh h c trong th i gian phân tích và

ả ờ ả th i gian b o qu n.

ộ ổ ờ ị ẩ ẫ ồ ộ ị ­ Đ   n đ nh trong th i gian phân tích : chu n b  3 m u PQ n ng đ  1 µg/m l trong huy tế

ế ụ ứ ỗ ẫ ồ ế ử ờ ầ ươ t ắ ng, x  lý m u r i ti n hành s c ký ngay và ti p t c c  m i gi 1 l n trong vòng 5 gi ờ, xác

r.

ị đ nh RSD

ộ ổ ầ ả ẩ ấ ẫ ờ ị ị ­ Đ   n đ nh trong th i gian b o qu n ư ả : chu n b  3 m u nh  trên, l y 1 ph n ra x ử lý và

oC trong 21 ngày. L y các m u đang b o ả   ấ

ế ầ ắ ạ ả ả ở ẫ ti n hành s c ký ngay, ph n còn l i b o qu n ­30

ể ử ứ ế ắ ả qu n ra đ  x  lý và ti n hành s c ký ngay vào các ngày th  7, 14 và 21.

ế ươ ẫ ệ ự ế ụ ượ 2.3.3. Phân tích PQ trong m u huy t t ng b nh nhân ­ áp d ng th c t tiên l ệ   ng b nh

ả ọ ệ ấ ụ nhân và đánh giá hi u qu  l c máu h p ph

ố ượ ứ 2.3.3.1. Đ i t ng nghiên c u

ị ạ ề ệ ệ ạ ố ừ ộ ộ 31 b nh nhân ng  đ c PQ đi u tr  t ộ ệ i Trung tâm Ch ng đ c b nh vi n B ch Mai t tháng

ế 3 đ n tháng 5 năm 2015.

ự ệ ẩ ẩ Ch n đoán ng  đ c ộ ộ PQ d a vào: b nh nhân có 1 trong 2 tiêu chu n:

ừ ỏ ể ệ ệ ố ố ­ B nh nhân u ng thu c tr  c  PQ và có bi u hi n lâm sàng ng  đ c ộ ộ PQ.

ấ ướ ệ ộ ể ị ­ Xét nghi m đ nh tính đ c ch t n c ti u tìm th y ấ PQ.

ạ ừ ệ ẩ 2.3.3.2. Tiêu chu n lo i tr  b nh nhân

ệ ậ ổ ề ử ệ ­  B nh nhân có ti n s  b nh ph i, th n, gan.

ộ ộ ồ ấ ộ ữ ệ ờ ­  Nh ng b nh nhân ng  đ c đ ng th i các ch t đ c khác.

ươ ệ ạ ứ ứ nghiên c u lo t ca b nh. Ph ng pháp nghiên c u:

ố ệ

ệ ừ ệ

ủ

ậ

ậ

ệ * Thu th p các s  li u b nh nhân khi nh p vi n t

b nh án (theo đánh giá c a bác

ị

ề sĩ đi u tr ):

ừ ỏ

ạ

ượ

ừ ỏ ượ

ố

ố ­ Tên lo i thu c tr  c  có

PQ, hàm l

ng

PQ trong thu c tr  c , l

ng

PQ u ng,ố

ắ ầ

ệ

ế

ề

ờ

ị ờ th i gian đ n vi n, th i gian b t đ u đi u tr .

ứ

ệ

ậ

­ Tri u ch ng lâm sàng, c n lâm sàng.

ị ọ

ụ ượ

ề

ấ

ụ

­ Đi u tr  l c máu h p ph  đ

c áp d ng.

ạ ứ

ế

ề

ệ

ễ

ị

ị

­ Các đi u tr  khác: than ho t,  c ch  mi n d ch, li u pháp lipid.

ứ ế Ti n hành nghiên c u:

ấ

ị

ượ

ế ươ

ệ

ướ

ầ ọ

ẫ * L y m u đ nh l

ng PQ huy t t

ng khi vào vi n, tr

c và sau các l n l c máu

ấ

ụ h p ph :

ượ ứ ộ ả ề ễ ệ ị ố ệ Các s  li u này đ ộ c dùng trong đánh giá hi u qu  đi u tr  và m c đ  nhi m đ c

ế ấ ộ ộ ệ ị ạ ề ệ ố ­ Ti n hành l y má u b nh nhân ng  đ c PQ đi u tr  t i Trung tâm Ch ng đ c ệ   ộ b nh vi n

ạ ộ ộ ệ ọ ị B ch Mai ngay vào vi n ệ khi đ ẩ c ượ ch n đoán ấ   xác đ nh ng  đ c PQ. Các b nh nhân l c máu h p

ụ ượ ấ ướ ệ ấ ạ ọ ố ph  đ c l y máu ngay tr ứ   c và sau l c. L y máu tĩnh m ch cánh tay vào  ng nghi m có ch a

ế ươ ấ EDTA, ly tâm l y huy t t ng.

ế ươ ẫ ượ ử ằ ươ ự ­ M u huy t t ng đ c x  lý và phân tích b ng ph ỗ   ng pháp HPLC đã xây d ng. M i

ượ ặ ạ ả ầ ươ ị ượ ẫ m u đ c phân tích l p l ế i 3 l n (n=3), tính k t qu  trung bình. Ph ng pháp đ nh l ng là

ươ ườ ẩ ph ng pháp đ ng chu n.

ả ồ ế ẫ ộ ử ượ ị ­ K t qu  n ng đ  PQ trong m u (µg/m l) trong dung d ch th  đ ự c tính d a vào đ ườ   ng

ị ỷ ệ ử

ả ề

ế

ậ

ạ

ố ệ

ệ

* Thu th p k t qu  đi u tr . T  l

t

vong t

ạ   i vi n, sau 3 tháng: ghi s  đi n tho i

ườ

ệ

ạ

ạ

ọ

ố

ị

ử

ủ c a BN và ng

i nhà, g i đi n tho i xác đ nh tình tr ng BN s ng/t

vong sau 3 tháng.

chu n.ẩ

ỉ ố ứ Các ch  s  nghiên c u chính:

ỷ ệ ử * T  l t vong sau 3 tháng

ế ươ ồ ử ệ ộ ồ *  N ng đ ộ PQ  huy t t ng khi vào vi n, dùng n ng đ  này tính đi m ổ   ể SIPP  s a đ i

ộ ộ (severity index of PQ poisoning: ch  s  đ ủ ỉ ố ộ n ngặ  c a ng  đ c PQ) – liên quan t  l ỉ ệ ử  t vong.

ồ ế ươ ờ ố ị ượ SIPP = [n ng đ ộ PQ huy t t ng (µg/ml)] × [th i gian ừ t khi u ng ế đ n b t đ u ắ ầ đ nh l ng (h)]

ủ ọ ả ọ ế ươ ụ ự ệ ấ ồ ướ * Hi u qu  l c PQ c a l c máu h p ph  (HP) (d a vào n ng đ ộ PQ huy t t ng tr c và

ầ ọ ấ ụ sau các l n l c máu h p ph )

ố ệ ử ề ằ ầ ượ ố ệ   b ng ph n m m SPSS for Windows 16.0. S  li u đ c trình bày d ướ   i *X  lý s  li u:

ộ ệ ẩ ặ ị ứ ị ế ẩ ố ạ d ng trung bình ± đ  l ch chu n, ho c trung v  và t phân v  n u phân b  không chu n, đánh giá

ượ ử ủ ồ ệ ệ ằ ộ ị giá tr  tiên l ng t vong c a n ng đ c Paraquat vào vi n b ng cách tính di n tích d ướ ườ   ng i đ

ị ồ ị ướ ộ ị ằ ề ROC, so sánh giá tr  n ng đ c Paraquat giá tr  tr c sau đi u tr  b ng test Wilcoxon.

ƯƠ

Ả

Ậ

Ả

Ế

CH

NG 3: K T QU  VÀ TH O LU N

́ ́ ạ ắ ố ư ỏ ệ ệ ề 3.1. T i  u hoa cac đi u ki n ch y s c lý l ng hi u năng cao

ị ướ ớ ệ ấ 3.1.1. Xác đ nh b c sóng phát hi n ch t phân tích v i detector DAD

ệ ậ ấ ộ ộ ừ ộ ắ ả Detector là b  ph n theo dõi phát hi n các ch t tan trong pha đ ng t c t s c ký ch y ra

ấ ự ộ ộ ụ ệ ậ ậ ấ ợ ộ ộ   m t cách liên t c. Nó là m t b  ph n thu nh n và phát hi n các ch t hay h p ch t d a theo m t

ấ ấ ụ ấ ấ ố ủ tính ch t nào đó c a ch t phân tích [4]. Paraquat là ch t có tính h p th  quang t t trong vùng UV

ấ ố ệ ị ị ượ do đó detector DAD (Diode ­ Array Detector) r t t t cho vi c đ nh tính và đ nh l ấ ng ch t phân

tích.

ổ ấ ủ ụ ứ ể ả   Trong quá trình nghiên c u, chúng tôi đã ki m tra ph  h p th  ánh sáng c a PQ trong d i

ướ ớ ế ị ắ ệ ỏ ớ b c sóng 210 t i 400 nm trên thi t b  s c ký l ng hi u năng cao Agilent 1200 v i detector DAD.

́ Hình 3.: Phô hâp thu UV cua PQ

̉ ̣ ̉

ự ạ ạ ướ ụ ế ả ấ ấ K t qu  trên cho th y PQ h p th  ánh sáng c c đ i t i b c sóng 259 nm. Do đó chúng

ọ ướ ố ớ ệ ấ tôi ch n b c sóng phát hi n ch t phân tích đ i v i PQ là 259 nm.

ả ả ưở ủ ể ẫ 3.1.2. Kh o sát  nh h ộ ng c a th  tích m u tiêm vào c t

ự ế ữ ự ủ ắ ộ Trên th c t ẫ   , m t trong nh ng khó khăn c a phép tách s c ký là: s  doãng chân pic d n

ệ ượ ể ẫ ộ ơ ộ ồ ế đ n hi n t ng ch ng pic, trong đó th  tích b m m u vào c t cũng là m t nguyên nhân gây ra

ệ ượ ế ượ ệ ượ ế ẫ ẫ ớ ộ ơ ẫ ộ hi n t ng này; n u l ng m u b m vào c t quá l n d n đ n hi n t ầ ng m t ph n m u vào

ướ ộ ẽ ế ầ ẫ ấ ầ ộ ộ ộ c t tách tr c, m t ph n ra sau d n đ n trong quá trình tách trên c t s  có m t ph n ch t phân

ướ ệ ượ ầ ộ ể ế tích ra tr c và m t ph n ra sau gây ra hi n t ơ   ng doãng chân pic. Tuy nhiên, n u th  tích b m

ố ẽ ấ ớ ệ ố ị ộ ậ ẫ ỏ ẫ   m u là quá nh  thì sai s  s  r t l n. H  th ng HPLC Agilent 1200 có trang b  b  ph n tiêm m u

ể ự ế ể ả ẫ ộ ọ ự ộ t ệ    đ ng do đó chúng tôi ti n hành kh o sát đ  l a ch n th  tích m u tiêm vào c t sao cho hi u

́ ả ố ể ấ ẫ ượ ớ ạ ế ả ̉ qu  tách là t t nh t. Th  tích tiêm m u đ c khao sat gi i h n trong kho ng 10 µl đ n 50 µl.

ả ượ ệ ố ị ử ụ ự ư ề ệ ộ Quá trình kh o sát đ c th c hi n trong đi u ki n c  đ nh nh  sau: s  d ng pha đ ng là ACN –

́

̀

́

́

ơ

ớ ố ộ ệ ộ ồ ị dung d ch đ m pH 2,5 (5:95, v/v) v i t c đ  dòng là 0,5 ml/phút, PQ có n ng đ  5,0 µg/ml.

̃ Hình 3.: Săc đô khao sat thê tich b m mâu

a: 10 µl,     b: 20 µl,     c: 30 µl,     d: 40 µl,      e: 50 µl

Ả

ả

ưở

ủ

ơ

̉ ̉

B ng 3.:  nh h

̃ ́ ng c a thê tich b m mâu

̉

́ ̀ơ ̉ ̃ u (µl) Thê tich tiêm mâ ư  (phut́)

10 20 30 40 50 Th i gian l u 11,42 11,77 11,75 11,74 11,76 AS 0,72 0,91 0,75 0,77 0,88

ộ ả ể ấ ậ ẫ ưở ệ ế ế ả Nh n xét th y th  tích m u tiêm vào c t  nh h ế   ng rõ r t đ n k t qu  phân tích. N u

ố ứ ̉ ơ ủ ẽ ẫ ố ̣ ượ l ng m u tiêm vào côt nho h n 30 μl thì pic c a PQ s  không đ i x ng t ị ệ t, giá tr  di n tích pic

̀ ́ ̀ ẫ ớ ế ả ̉ ủ c a các pic này nho, chiêu cao pic thâp không chính xác và d n t ́ ơ   i k t qu  phân tích sai. Con v i

́ ̀ ́ ̃ ề ơ ́ ơ ượ ả ế ố ộ ̉ ̣ thê tich mâu l n h n 30 μl thi pic bi keo đuôi, đi u này đ c gi ế   i thích theo thuy t t c đ  (thuy t

ượ ủ ộ ẫ ả ố ộ ả ả Van Deemter), khi l ế ng m u tăng thì s  đĩa lý thuy t (N) c a c t gi m, đ  phân gi i gi m theo

ớ ượ ế ấ ả ẫ ả   [10]. K t qu  trong b ng 3.1 cho th y, v i l ế   ộ ng m u tiêm vào c t là 30 μl thì cho k t vì RS (cid:0)

ả ố ể ấ ẫ ả ậ ộ ọ qu  tách t ế   t nh t. Vì v y, chúng tôi ch n th  tích m u tiêm vào c t là 30 μl cho các kh o sát ti p

theo.

ự ̉ 3.1.3. Khao sat́ l a ch n ọ loaị  pha đ ngộ

ệ ả ả ộ Kh o sát kh  năng phân tách PQ trong huy t t ớ ế ươ  tr ngắ  v i các h  pha đ ng ng chu n bẩ ị

ỏ ề ử ụ ư ụ ệ ắ ẫ ồ nh  trong m c 2.3.1.3. S c đ  quá trình tách PQ ra kh i n n m u khi s  d ng các h  khác nhau

́

̀

́ơ

ướ

thu đ ượ ở c hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5

Hình 3.: Săc đô phân tích PQ v i hê dung môi A (

dung d ch

ị NaOH 0,0125M trong n

c và

ị

dung d ch NaOH 0,0125M trong methanol theo t

ỷ ệ  l

90:10, v/v)

̀

́

́ơ

̣

Hình 3.: Săc đô phân tích PQ v i hê dung môi B

ệ

ị (ACN và dung d ch đ m pH = 3 t

ỷ ệ 10:90, v/v).

l

̣

̀ ́ơ ̣ Hình 3.: Săć  đô phân tích PQ v i hê dung môi C

ị (ACN ­ dung d ch đ mệ  t ỷ ệ  l 5:95, v/v) .

ử ụ ệ ệ ế ả ả ấ ộ ộ   K t qu  kh o sát cho th y s  d ng h  pha đ ng ACN ­ đ m (5:95, v/v) pha tĩnh c t

ấ ả ợ ố ố ớ ọ ọ ế ươ C8 là phù h p nh t, có kh  năng tách t t và ch n l c đ i v i PQ trong huy t t ng, cho pic

ử ụ ứ ư ậ ợ ờ ộ ố cân đ i và có th i gian l u h p lý. Do v y trong nghiên c u này chúng tôi s  d ng c t C8 và

ệ ọ ộ ̣ ch n h  dung môi ACN ­ Đêm (5:95, v/v) làm pha đ ng.

ộ ̉ 3.1.4. Khao sat́ ầ  thành ph n pha đ ng

ả ầ ộ ưở ấ ớ ệ ế ấ ả ộ Thành ph n pha đ ng  nh h ể ả   ng r t l n đ n hi u qu  tách ch t. Pha đ ng có th   nh

ưở ớ ữ ề ắ ấ h ng t i nh ng v n đ  sau trong phép tách s c ký:

ộ ọ ọ ủ ệ ­ Đ  ch n l c c a h  pha

ữ ủ ư ấ ờ ­ Th i gian l u tr  c a ch t tan

ef)

ệ ự ộ ạ ượ ­ Hi u l c c t tách (đ i l ng N

ộ ả ủ ấ ộ ­ Đ  phân gi i c a ch t trong m t pha tĩnh

ộ ộ ắ ủ ­ Đ  r ng c a pic s c ký

ệ ắ ỏ ộ ườ ướ ộ ố ớ ộ Pha đ ng trong s c ký l ng hi u năng cao th ng là n c có tr n v i m t s  dung môi

ượ ự ừ ộ ị ớ ấ ợ ớ ữ ơ ể h u c  đ  thu đ c dung d ch có đ  phân c c t cao t i th p, phù h p v i quá trình tách. Căn c ứ

ự ủ ướ ị ủ ơ ơ theo tài li u s  [ ỉ ố ộ ệ ố 3] ta có ch  s  đ  phân c c c a n c là 10,2 đ n v , c a ACN là 5,8 đ n v , t ị ừ

ượ ự ủ ệ ứ ệ ộ ớ ộ ị đó ta tính đ c đ  phân c c c a các h  dung d ch pha đ ng ACN và đ m  ng v i các t ỷ ệ ể   th l

ừ ứ ự ộ tích khác nhau t 3:97, 5:95, 10:90, 15:85 và 20:80. Công th c tính đ  phân c c là:

(CT 2) PI = %Vi x PIi/ 100

7H15SO3

­ đ  t o ph c liên h p ion v i ion PQ

2+,

ử ụ ứ ể ạ ứ ợ ớ Trong nghiên c u này, chúng tôi s  d ng C

ứ ự ấ ấ ượ ả ọ ph c ch t này là ch t không phân c c. Trong khi đó, pha tĩnh đ ộ c ch n cũng là c t pha đ o kém

ự ừ ự ể ậ ả ả ộ ộ phân c c, v y pha đ ng dùng đ  tách ph i có đ  phân c c v a ph i thì quá trình tách m i t ớ ố ư   i  u.

ế ả ả ượ ả K t qu  kh o sát đ c cho trong b ng 3.2.

̀

́

Hình 3.: Săc ḱ ý đô khao sat ti lê pha đông ACN : Đêm %v/v

a: 20:80;           b: 15:85;        c: 10:90;        d: 5:95;         e: 3:97

Ả

ả

ưở

ủ ̉

ớ ộ

ệ ố ố ứ

ư

ự

ờ

̉ ̉ ̣ ̣ ̣

B ng 3.:  nh h

ng c a ti lê pha đông t

i đ  phân c c, th i gian l u, h  s  đ i x ng pic

̣ ̣

ư ờ ̉ ̣ ̣ Ti lê pha đông PI Th i gian l u AS ơ ̣ (ACN: Đêm, v/v) ị (đ n v ) (phút)

20 : 80 8,16 ­ ­

15 : 85 8,67 ­ ­

10 : 90 9,18 8,60 7,36

9,69 5 : 95 11,89 0,87

3 : 97 9,89 14,21 1,93

ắ ồ ỉ ứ ề ệ ẫ ấ “­” là không xu t hi n pic PQ trên s c đ , ch  ch a pic n n m u.

ự ủ ế ấ ầ ả ộ ộ ộ   K t qu  cho th y khi tăng thành ph n ACN trong pha đ ng đ  phân c c c a pha đ ng

ự ủ ư ả ắ ờ ộ ộ gi m, th i gian l u ng n h n. ơ Ở ỷ ệ ể  t ấ    th  tích 15:85 và 20:80, đ  phân c c c a pha đ ng th p, l

ỏ ề ượ ẫ làm cho PQ không tách ra kh i n n m u. ẫ Ở ỷ ệ  t l 10:90, đã tách đ ỏ ề c PQ ra kh i n n m u tuy

ự ủ ệ ấ ộ ộ ố ị ấ   nhiên tín hi u đo th p và pic không cân đ i. Khi đ  phân c c c a dung d ch pha đ ng tăng, ch t

S:

ư ộ ờ ố ị ữ b  gi trong c t lâu làm cho th i gian l u tăng dài, pic doãng. Ở ỷ ệ  t l ấ  5:95, pic ch t cân đ i A

ư ắ ờ ơ ố ỏ ề ẫ 0,87, th i gian l u ng n h n, pic tách t t ra kh i n n m u. Do đó, chúng tôi ch n t ọ ỷ ệ ể  l th  tích

ệ ố ư ề 5:95 là đi u ki n t i  u.

́ ưở ̉ ̉ ̉ ̣ 3.1.5. Khao sat anh h ng pH cua pha đông

ọ ượ ệ ệ ộ ợ Sau khi ch n đ c h  dung môi pha đ ng phù h p là ACN ­ đ m t ỷ ệ  l 5:95, chúng tôi

ả ạ ủ ắ ả ỏ ộ kh o sát l i pH c a pha đ ng. Trong s c ký l ng pha đ o RP ­ HPLC, pH có vai trò quan

ả ọ ưở ớ ạ ồ ạ ủ ồ ạ ấ ạ ờ ổ tr ng, nó  nh h ng t i d ng t n t i c a ch t phân tích, d ng t n t i thay đ i thì th i gian

ữ ả ự ấ ộ ọ ợ ớ ổ ư l u tr ch t phân tích trên c t cũng thay đ i. Do đó ph i l a ch n pH cho phù h p v i quá

ủ ộ ự ự ứ ả ọ trình tách và s  an toàn c a c t tách. Trong nghiên c u này, chúng tôi l a ch n kh o sát pH

ả ừ ớ ướ ể ầ trong kho ng t 2,5 t i 4,5. Vì PQ có pKa ~ 9 – 9,5 trong n c nên c n duy trì pH < pKa đ  PQ

+H, t o liên h p ion v i

ươ ạ ợ ế ả ồ ạ ở ạ t n t i d ng ion d ng RN ớ natri heptanesulfonate. Ti n hành kh o sát

ớ ố ộ ử ụ ệ ộ ạ t i các pH khác nhau s  d ng pha đ ng là ACN ­ đ m (5:95, v/v) v i t c đ  dòng là 0,5 ml/phút,

ể ẫ ơ ộ ồ PQ có n ng đ  5 µg/ml, th  tích b m m u là 30 µl.

́

́

ưở

ế ả ả ị ượ ả K t qu  kh o sát các giá tr  pH đ c cho trong b ng sau:

̀ Hình 3.: Săc đô khao sat anh h

ng cua pH

a: pH=4,5;        b: pH=4,0;         c: pH=3,5;        d: pH=3,0;        e: pH=2,5

ả

ưở

ệ ố ố ứ

ư

ờ

̉ ̉ ̉

B ng 3.:

nhẢ  h

ng cua pH

t

i ớ th i gian l u, h  s  đ i x ng pic

̉

ờ ư   Th i gian l u pH AS

2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 (phút) 11,89 12,75 12,36 12,90 12,69 0,870 ­ ­ 0,280 0,360

ắ ồ ỉ ứ ệ ề ẫ ấ “­” là không xu t hi n pic PQ trên s c đ , ch  ch a pic n n m u.

ừ ế ả ả ả ưở ủ ộ ở ả ậ T  k t qu  kh o sát  nh h ng c a pH pha đ ng b ng trên, chúng tôi nh n th y: ấ  T iạ

ư ắ ấ ớ ổ ơ ị ị ị ờ giá tr  pH = 2,5, pic s c nét và khá  n đ nh. Th i gian l u th p h n so v i các giá tr  pH khác, h ệ

ộ ố ổ ị ẫ ớ ỉ ị ố ố ứ s  đ i x ng và đ  phân gi ả ươ i t ng đ i  n đ nh. Khi pH tăng, các pic b  tách đ nh d n t i pic

2 (N+ trong phân tử

ộ ộ ạ ố ị không cân đ i và đ  r ng pic l n ớ , do ion PQ2+ b  chuy n thành d ng PQ(OH) ể

­) trong dung d ch pha đ ng, vì v y làm gi m kh  năng t o c p ion v i ớ

ế ợ ớ ả ả ặ ậ ạ ộ ị PQ k t h p v i OH

­ và kh  năng h p th  ánh sáng c a PQ.  ụ

ủ ấ ả C7H15SO3

ể ế ệ ổ ệ ả ờ Do đó, đ  các pic tách nhau rõ ràng, ti ọ ủ   t ki m th i gian phân tích, và b o v  tu i th  c a

ọ ộ ữ ổ ế ả ị ộ c t, chúng tôi ch n pH=2,5 cho pha đ ng và gi n đ nh cho các kh o sát ti p theo.

́ ̀ ̀ ̉ ̣ ̣ 3.1.6. Khao sat thanh phân dung dich đêm

ọ ượ ế ụ ộ ủ ủ ệ ả ồ ị Sau khi ch n đ ấ   c pH c a dung d ch đ m, chúng tôi ti p t c kh o sát n ng đ  c a các ch t

ầ ủ ệ ệ ả ấ ị ị ấ   trong dung d ch đ m. Thành ph n c a các ch t trong dung d ch đ m khác nhau thì kh  năng tách ch t

ầ ủ ệ ả ộ ị ưở ấ ớ ớ ủ c a pha đ ng là khác nhau. Do đó thành ph n c a dung d ch đ m  nh h ng r t l n t ử   i quá trình r a

ả ỏ ộ ả ố ư ấ ậ ệ ấ ộ ồ ị gi i ch t phân tích ra kh i c t. Vì v y, ph i t i  u hóa n ng đ  các ch t trong dung d ch đ m đ  s ể ự

ả ơ ứ ự ế ệ ả ọ ố tách   hi u   qu   h n.   Trong   nghiên   c u   này,   chúng   tôi   l a   ch n   kh o   sát   3   y u   t chính:

natriheptanesulfonate, PEG và KCl.

ả ưở ủ ồ ộ ả 3.1.6.1. Kh o sát  nh h ng c a n ng đ  natriheptanesulfonate

ứ ấ ộ Trong nghiên c u này, ch t phân tích PQ là m t cation, do đó natri heptanesulfonate

ượ ử ụ ể ạ ế ặ ấ ấ ớ đ c s  d ng đ  t o c p ion v i ch t phân tích PQ. Liên k t này giúp cho ch t phân tích

ượ ị ử ộ ả ượ ơ ộ ồ đ c gi ữ ạ  l i trong c t mà không b  r a gi i ngay sau khi đ ộ ủ   c b m vào c t. N ng đ  c a

ả ưở ớ ớ ủ ư ệ ả ấ ờ natri heptanesulfonate  nh h ng l n t ả   i hi u qu  tách và th i gian l u c a ch t, do đó ph i

ộ ố ư ệ ả ả ồ ọ ồ kh o sát và ch n n ng đ  t ộ ủ   i  u. Trong thí nghi m này chúng tôi kh o sát n ng đ  c a

ả ớ ả ượ ệ ở ề ự natriheptanesulfonate trong kho ng 1 t i 1,25 %. Các kh o sát đ c th c hi n ệ    đi u ki n :

ớ ố ệ ộ ộ ị ử ụ s  d ng pha đ ng là ACN – dung d ch đ m (5:95, v/v) v i t c đ  dòng là 0,5 ml/phút, th ể

́

̀

̀

́

ơ ẫ tích b m m u là 30 µl.

Hình 3.: Săc đô khao sat nông đô cua natriheptanesulfonate trong đêm pH 2,5

̉ ̣ ̉ ̣

a: 1,00 mg/m; b: 1,05 mg/ml; c: 1,10 mg/ml; d: 1,15 mg/ml; e: 1,20 mg/ml

̀

Ả

ả

ưở

ệ ố ố ứ

ư

ờ

B ng 3.:  nh h

ế ng nông đô natriheptanesulfonate đ n th i gian l u, h  s  đ i x ng pic

̣

̀ơ ̣ ̀ Nông đô ư   Th i gian l u AS (mg/ml) (phut)́

1,00 10,74 0,67

1,05 10,86 1,01

1,10 11,89 0,87

1,20 12,06 2,72

1,25 11,86 0,89

ư ủ ộ ủ ự ả ồ ờ Khi tăng n ng đ  c a natri heptanesulfonate th i gian l u c a PQ gi m tuy nhiên s  thay

ổ ử ồ ộ ớ ờ ể ổ đ i này là không dáng k . Khi n ng đ  thay đ i t 1,00 mg/m l t i 1,20 mg/m l, th i gian chênh

ầ ượ ừ ả ủ ế ạ nhau kho ng 1 phút l n l t t 10,74 phút đ n 12,06 phút. Trong khi đó, hình d ng c a các pic

ổ ấ ớ ộ ủ ấ ả ổ ồ ỏ ồ ch t thay đ i r t l n khi thay đ i kho ng nh  n ng đ  c a natri heptanesulfonate. Khi n ng đ ộ

­ th p, các ion PQ

2+ không đ

ấ ượ ạ ặ ả ợ ion C7H15SO3 c t o c p liên h p ion hoàn toàn làm cho kh  năng

ả ươ ấ ị ệ ấ ử r a gi ủ i PQ c a ph ng phá p kém, tín hi u quang th p, các pic ch t b  doãng và không cân

ộ ủ ư ư ứ ợ ố ồ ệ   đ i nh  hình 3.8 a và b. Nh ng khi n ng đ  c a ion âm quá cao, làm cho ph c h p mang đi n

ả ử ả ạ ồ ẻ ấ ộ ệ tích âm nên hi u qu  r a gi ư   i th p, pic ch  và doãng chân nh  hình 3.8 d, e. T i n ng đ  1,10

ố ắ ạ ấ ộ ả ủ ươ ố ố mg/ml hình d ng pic là cân đ i s c nét nh t, đ  phân gi i c a pic t ng đ i t ờ t, th i gian

ủ ự ệ ậ ọ ư l u c a PQ không quá dài (hình 3.8 c). Vì v y, chúng tôi l a ch n dung dich đ m 1,1 mg/m l

ướ ế natri heptanesulfonate, pH = 2,5 cho các b c ti p theo.

Ả ưở ủ ồ ộ 3.1.6.2.  nh h ng c a n ng đ  KCl

ọ ượ ồ ộ ợ Sau khi ch n đ ế ụ   c n ng đ  natri heptanesulfonate phù h p 1,1 mg/ml, chúng tôi ti p t c

ộ ủ ả ồ ộ ươ ử ả ẳ ượ ử ụ kh o sát n ng đ  c a KCl trong pha đ ng. Ch ng trình r a gi i đ ng dòng đã đ c s  d ng và

ớ ố ộ ệ ể ộ ồ ộ pha đ ng ACN ­ đ m (5:95, v/v) v i t c đ  dòng 0,5 ml/phút, n ng đ  5 µg/ml PQ, th  tích tiêm

ệ ẫ ồ ồ ộ ị m u là 30 μl. Dung d ch đ m bao g m: 1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, n ng đ  KCl trong

ừ ớ ả kho ng t 1 mg/ml t i 3 mg/ml, 0,2%(v/v) PEG, 0,05% triethylamine và 20%(v/v) MeOH.

̀

́

̀

ủ

ộ

ổ Hình 3.: Săc đô c a PQ khi thay đ i nông đô cua KCl trong pha đ ng.

a: 1,0 mg/ml; b: 1,5 mg/ml; c: 2,0 mg/ml; d: 2,5 mg/ml; e: 3,0 mg/ml

̣ ̉

̀

Ả

ả

ưở

ệ ố ố ứ

ư

ủ

ế

ờ

B ng 3.:  nh h

ng c a nông đô KCl đ n th i gian l u và h  s  đ i x ng pic.

̣

̀ơ ̀ Nông đô ̣ ư   Th i gian l u AS (mg/ml) (phút)

1,00 13,54 1,19

1,50 13,21 3,23

2,00 11,88 0,87

2,50 9,76 0,8

3,00 9,16 0,67

̀ ừ ế ả ở ả ắ ồ T  k t qu b ng 3. ồ 5 và các s c đ  trong hinh 3. ậ 9, nh n th y: ộ ủ   ấ  Khi tăng n ng đ  c a

ư ờ ượ ườ ệ ị KCl thì th i gian l u c a ả ủ PQ  gi m. KCl đ ể ạ c dùng đ  t o môi tr ng đi n ly cho dung d ch

ộ ấ ệ ấ ồ ệ đ m do đó khi tăng n ng đ  ch t đi n ly này làm các ch t mang đi n ệ dễ hòa tan trong dung d chị

ị ử ấ ộ ơ ả ạ ồ ơ pha đ ng h n làm cho ch t phân tích b  r a gi i nhanh h n . T i n ng đ  1 ộ ,00; 1,50; 2,50 mg/ml

ấ ấ ạ ộ ố ươ ạ ồ các pic ch t x u và không cân đ i. T i n ng đ  2,0 mg/ml hình d ng các pic t ố ng đ i cân

ả ấ ố ạ ồ ườ ề ộ ứ x ng, đ  phân gi i các pic ch t t t. Tuy nhiên, t i n ng đ  3 ộ ,00 mg/ml đ ấ ng n n x u và không

ổ ế ả ậ ộ ồ ọ ị n đ nh. Vì v y chúng tôi ch n n ng đ  KCl 2 ,00 mg/ml cho các kh o sát ti p theo.

ả ưở ủ ồ ộ ả 3.1.6.3. Kh o sát  nh h ng c a n ng đ  PEG

ế ụ ộ ủ ộ ủ ệ ả ồ ồ ị Chúng tôi ti p t c kh o sát n ng đ  c a PEG trong dung d ch đ m. N ng đ  c a PEG

ượ ể ả ọ ạ ắ ề ệ đ c ch n đ  kh o sát là 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,3 % v/v. ồ   Các đi u ki n ch y s c ký bao g m

ớ ỉ ệ ươ ệ ộ ị ị ớ ố ộ ứ dung d ch pha đ ng là ACN và dung d ch đ m v i t  l t ng  ng là 5 : 95 (v/v) v i t c đ  dòng

ệ ể ẫ ộ ồ ộ ơ ị ồ   pha đ ng là 0,5 ml/phút, PQ có n ng đ  5 µg/ml, th  tích b m m u là 30 µl. Dung d ch đ m g m

ồ ộ ủ   1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, 2 mg/ml KCl, 20% v/v MeOH và các n ng đ  khác nhau c a

́

̀

̀

ủ

ộ

ị ượ ề ỉ ớ ằ PEG, các dung d ch đ c đi u ch nh t i pH = 2,5 0 b ng acid phosphoric.

ổ Hình 3.: Săc đô c a PQ khi thay đ i nông đô cua PEG trong pha đ ng.

̣ ̉

a: 0,10 %v/v,  b: 0,15 %v/v; c: 0,20% v/v; d: 0,25% v/v; e: 0,30 % v/v

̀

Ả

ả

ưở

ệ ố ố ứ

ủ

ư

ế

ờ

B ng 3.:  nh h

ng c a nông đô PEG đ n th i gian l u và h  s  đ i x ng pic.

̣

̣ ̀ Nông đô ̀ơ Th i gian l u ư  (phút) AS (% v/v)

0,10 12,68 2,52

0,15 11,02 ­

0,20 11,88 0,86

0,25 11,32 ­

0,30 10,75 0,99

ừ ả

ồ

ượ

ấ ạ ồ

ộ

T  b ng 3.

ắ 6 và các s c đ  thu đ

c, ch

úng tôi th y t

i n ng đ  0,20 % v/v hình

̃

ệ ố

ấ

ố

ả

ắ ạ d ng pic là cân đ i và s c nét nh t, h  s  phân gi

i cao, các pic tách nhau ro ràng. Vì

ộ ố ư ủ

ọ

ồ

ậ v y, chúng tôi ch n n ng đ  t

i  u c a PEG là 0,20 % v/v .

ắ ồ ỉ ứ ệ ề ấ ẫ “­” là không xu t hi n pic PQ trên s c đ , ch  ch a pic n n m u.

́ ̀ ưở ̉ ̉ 3.1.7. Khao sat anh h ̉ ố ộ ng cua t c đ  dong

ả ộ ố ưở ớ ế ệ ắ ả ộ T c đ  pha đ ng cũng  nh h ng t i hi u qu  tách s c ký vì nó liên quan đ n quá trình

ế ậ ủ ằ ấ ộ ộ ố ỏ ộ thi ấ   t l p cân b ng c a ch t tan trong 2 pha tĩnh và pha đ ng. Khi t c đ  pha đ ng nh , ch t

ể ả ộ ộ ộ ố ớ ộ ạ phân tích ra mu n, gây doãng pic, gi m đ  nh y. Khi t c đ  pha đ ng quá l n có th  làm cho

ỏ ộ ẫ ị ẩ ệ ượ ư ế ấ ỏ ồ ch t phân tích ch a tách kh i nhau đã b  đ y ra kh i c t d n đ n hi n t ng ch ng pic, gây áp

ấ ớ ơ ố su t l n trong b m và t n dung môi.

ể ả ố ộ ự ệ ề ả ộ ọ ừ Đ  đ m b o các đi u ki n trên chúng tôi l a ch n kh o ả  sát t c đ  dòng pha đ ng t 0,2 ­

ạ ắ ệ ề ồ ộ ị ị ệ   0,8 ml/phút. Các đi u ki n ch y s c ký bao g m dung d ch pha đ ng là ACN và dung d ch đ m

ớ ỉ ệ ươ ứ ể ẫ ơ pH 2,5 v i t  l t ng  ng là 5 : 95 (v/v) ồ , PQ có n ng đ  5 ộ µg/ml, th  tích b m m u là 30 µl.

ướ ụ ấ B c sóng h p th  là 259 nm.

̀

́

́

́

̀

Hình 3.: Săc đô khao sat tôc đô dong

́

́

́

́ a: 0,2 ml/phut, b: 0,3ml/phut, c: 0,4 ml/phut, d: 0,5 ml/phut,

́ ́ e: 0,6 ml/phut, f: 0,8ml/phut

́

̀

Ả

ả

ưở

ệ ố ố ứ

ư

ủ

ế

ờ

̉ ̣

B ng 3.:  nh h

ng c a tôc đô dong đ n th i gian l u và h  s  đ i x ng pic

̣

̀ ́ ̀ơ ̣ Tôc đô dong ư   Th i gian l u AS (ml/phut)́ (phút)

30,94 3,29 0,2

20,10 1,84 0,3

15,00 1,51 0,4

11,89 0,87 0,5

9,98 3,04 0,6

7,52 3,54 0,8

ừ ế ả ượ ấ ỏ ờ T  k t qu  thu đ c cho th y, k ố ộ hi t c đ  dòng nh  th i gian l u ư  l nớ , pic không cân đ i.ố

ố ộ ỏ ề ầ ẫ ị ố ư ẫ Khi tăng quá cao, pic b  kéo đ u dù v n tách kh i n n m u. T c đ  dòng 0,5 ml/phút là t i  u vì

ượ ấ ề ẫ ọ ỏ ạ ợ ờ tách riêng đ c PQ kh i các ch t n n trong m u sinh h c, l i có th i gian phân tích h p lý, ti ế   t

ệ ki m dung môi.

ạ ệ ố ư ủ ệ ố ề ề Tóm l i đi u ki n t ẫ   i  u c a quá trình tách PQ trên h  th ng HPLC n n m u

ế ươ huy t t ư ng nh  sau:

ả ộ ­ Pha tĩnh: c t pha đ o Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và c tộ  b o vả ệ C8 (20 mm x 4,0

oC. Th  tích b m m u

ệ ộ ộ ể ơ mm, 5 μm). Nhi t đ  c t: 30 ẫ 30 µl.

ệ ệ ộ ồ ­ Pha đ ng: ACN – Đ m (5:95, v/v). Đ m g m 1,10 g natri heptanesulfonate; 2,00 g KCl;

́ ướ ̉ 2,00 ml polyethylenglycol 400; 0,05% triethylamine; 200 ml MeOH; thêm n c xâp xi 1000

3PO4 đ c. Đ nh m c v a đu 1000 m

ế ề ằ ị ỉ ̀ ứ ư ặ ị ̉ ml. Đi u ch nh pH đ n 2,5 b ng dung d ch H l băng̀

ćươ  deion. n

ướ ­ B c sóng: 259 nm (Detetor DAD).

ố ộ ­ T c đ  dòng: 0,5 m l/phút.

̀ ượ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ ươ 3.1.8. Đ ng chuân, gi ́ ́ ơ i han phat hiên va gi ́ ơ i han đinh l ng.

ự ườ ẩ 3.1.8.1. Xây d ng đ ng chu n

ể ự ị ườ ẩ ượ ư ụ ồ Các dung d ch dùng đ  d ng đ ng chu n đ ụ c pha nh  m c (m c 2.3.2.2). N ng đ ộ

ượ ể ễ ả ỗ ị ượ ệ ắ ơ ị các dung d ch này đ c bi u di n trong b ng 3.11. M i dung d ch đ c b m trên h  s c ký 3

ệ ượ ẽ ố ệ ể ự ườ ẩ ự ụ ộ ủ ầ l n, di n tích pic trung bình thu đ c s  là s  li u đ  d ng đ ệ   ng chu n s  ph  thu c c a di n

̀

́

́

́

́

̀

ồ ộ tích pic vào n ng đ .

Hình 3.: Săc ky đô cac nông đô PQ khac nhau t

̀ ư  0,02 – 10,00 µ

g/ml

ủ

ệ

ả

ồ

ộ

B ng 3.: N ng đ  và di n tích pic trung bình c a PQ

̣

̣ ́ Diên tich pic ̀ ̣ Nông đô PQ ( µg/ml) (mAU)

0,05 11,24

0,10 19,87

0,50 103,85

1,00 205,90

2,00 410,87

5,00 1027,46

10,00 2050,76

́ ̀ ươ ̉ ̣ Hình 3.: Đ ng chuân PQ theo diên tich pic

ụ ự ự ế ệ ế ả ấ ộ ộ ồ K t qu  trên cho th y, s  ph  thu c di n tích pic vào n ng đ  PQ có s  tuy n tính trong

ế ả ộ ồ ươ ườ ả kho ng t ừ 05 µg/ml đ n 10 0, µg/ml. Trong kho ng n ng đ  này, ph ng trình đ ẩ ng chu n có

2 = 0,9999. Trong đó y là di n tích pic (mAU),

ớ ệ ố ố ươ ệ ạ d ng y = 0,84 + 205,06x v i h  s  s  t ng quan R

ế ươ ộ ồ x là n ng đ  PQ trong huy t t ng.

y = 0,89.

ẩ ủ ộ ệ ươ Đ  l ch chu n c a ph ng trình : S

a = 0,39

ẩ ủ ệ ố ộ Đ  lêch chu n c a h  s  a : S

b = 0,10

ẩ ủ ệ ố ộ ệ Đ  l ch chu n c a h  s  b:  S

Ta có:

ươ ầ ủ ạ ồ Ph ng trình h i quy đ y đ  có d ng

ớ ạ ệ ớ ạ ị ượ 3.1.8.2. Gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l ng

ớ ạ ệ (cid:0) Gi i h n phát hi n (LOD)

L) c a ch t phân tích mà h  th ng phân tích cho

ượ ộ ấ ấ ồ ệ ố ủ ấ LOD đ c xem là n ng đ  th p nh t (x

L) khác có nghĩa v i tín hi u c a m u tr ng hay tín hi u n n.

ệ ệ ủ ề ệ ắ ẫ ớ tín hi u phân tích (y

ể ượ ẩ ủ ộ ệ ẫ ắ ặ ị ươ ồ LOD có th  đ c xác đ nh qua đ  l ch chu n c a m u tr ng ho c ph ng trình h i quy.

ườ ế ươ ẫ ợ ệ ắ ấ ạ Trong tr ng h p này, khi phân tích m u huy t t ng tr ng không xu t hi n pic t ờ i th i gian

b đúng b ng sai s  c a ph

ẩ ủ ộ ệ ể ắ ẫ ố ủ ằ ươ ư ủ l u c a PQ nên có th  xem đ  l ch chu n c a m u tr ng S ng trình

b = Sy và tín hi u khi phân tích m u n n y

b = a. Khi đó tín hi u thu đ

ứ ệ ề ẫ ệ ượ ứ ồ h i quy, t c là S ớ   c  ng v i

ộ ệ . ồ n ng đ  phát hi n

ớ ộ ậ ươ ể ồ YLOD = a + k.Sy. V i đ  tin c y 95%, k = 3. Sau đó dùng ph ng trình h i quy có th  tìm

.3

S y b

ượ đ c LOD :

xLOD=

ớ ạ ị ượ (cid:0) Gi i h n đ nh l ng (LOQ)

Q) c a ch t phân tích mà h  th ng phân tích đ nh

ượ ộ ấ ấ ồ ệ ố ủ ấ ị LOQ đ c xem là n ng đ  th p nh t (x

Q) khác có ý nghĩa đ nh l

ượ ệ ớ ị ượ ủ ệ ẫ ớ ượ l ng đ c v i tín hi u phân tích (y ắ   ng v i tín hi u c a m u tr ng

ệ ề hay tín hi u n n.

YQ =  + K. Sb

Q = 10.SB/b.

ườ ượ ứ ớ Thông th ng LOQ đ c tính v i K = 10 t c là C

Hay S/N = 10 nên suy ra LOQ = 3,33 LOD.

ừ ự ụ ệ ồ ộ ượ ủ ấ ộ ủ T  s  ph  thu c c a di n tích pic c ua PQ̉ vào n ng đ , ta tính đ c LOD, LOQ c a ch t.

̀ ả ươ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ B ng 3.:  Gi ́ ́ ơ i han phat hiên va gi ́ ơ i han đinh l ng cua PQ

b Sy LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml)

205,06 0,89 0,013 0,040

ớ ớ ạ ệ ớ ạ ị ượ ẫ V i các gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l ng tính đ ượ ở c ự   ử  trên, khi x  lý m u th c

ể ế ả ấ ợ ợ ầ c n pha loãng cho phù h p đ  quá trình tính toán k t qu  là h p lý nh t.

ươ ườ ẩ 3.1.8.3.  Đánh giá ph ng trình đ ng chu n

ữ ệ ố ự ể ị ­ Ki m tra s  khác nhau có nghĩa gi a h  s  a và giá tr  0

ươ ườ ẩ ườ ưở ả Trong ph ng trình đ ng chu n y = a + bx, tr ợ ng h p lý t ng x y ra khi a = 0. Tuy

(cid:0) ự ế ố ệ ườ ắ ẫ ố nhiên, trong th c t các s  li u phân tích th ng m c sai s  ng u nhiên luôn làm cho a 0. N uế

ố ị ươ ố ệ ố ẽ ắ giá tr  a khác không có nghĩa th ng kê thì ph ậ   ng pháp phân tích s  m c sai s  h  th ng. Vì v y,

ướ ườ ụ ầ ự ữ ể ẩ tr ử ụ c khi s  d ng đ ng chu n cho phân tích công c  c n ki m tra xem s  khác nhau gi a giá

ố ị ị tr  a và giá tr  0 không có ý nghĩa th ng kê không.

(cid:0) ế ươ ượ ế ươ N u xem a 0 thì ph ng trình y=a+bx đ c vi t thành ph ng trình y =b'x

ả ữ ủ ế ả ớ ị ị ươ ườ B ng 3.: K t qu  so sánh gi a giá tr  a v i giá tr  0 c a ph ng trình đ ẩ ng chu n PQ.

̀ ̣ Nông đô PQ y b b' (µg/ml) (mAU)

0,05 11,24 208,04 224,84 11,02 10,38

0,10 19,87 190,31 198,71 21,19 20,76

0,50 103,85 206,02 207,7 102,61 103,8

1,00 205,90 205,06 205,9 204,38 207,59

2,00 410,87 205,02 205,44 407,91 415,19

5,00 1027,46 205,32 205,49 1018,53 1037,97

10,00 2050,76 204,99 205,08 2036,21 2075,93

Trung binh̀ 203,54 207,59

305,85

767,08

́ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̣ ̣ ̃ ư Kêt qua so sanh gi a gia tri a va gia tri 0

ươ ươ ượ ư Ph ủ ng sai c a 2 ph ng trình đ c tính nh  sau:

== = 61,17

== 191,77

0.32

Fbang̉ :  F(0.05, n­3, n­2)  = F(0.05, 4, 5)  = 5.19

tính

ể ế ậ ượ ậ ị Ta th y Fấ c giá tr  a và 0 khác nhau không có ý nghĩa

ố ươ ị ố ệ ố ắ th ng kê, hay ph ng pháp xác đ nh PQ không m c sai s  h  th ng.

ự ữ ể ­ Ki m tra s  sai khác gi a b và b’

ố ệ ố ươ ươ Khi không có sai s  h  th ng thì ph ng trình y = ở a + bx tr  thành ph ng trình y = b′x,

ự ể ố ứ t c là s  khác nhau gi a ữ b và b′ không có ý nghĩa th ng kê. Do đó có th  dùng chu n ể ể   ẩ t đ  ki m

ự ủ ị tra s  khác nhau c a 2 giá tr  trung bình.

ướ ể ươ ủ ế ấ ồ Tr c tiên ki m tra xem 2 ph ồ   ng sai c a chúng có đ ng nh t không, n u chúng đ ng

ế ấ ố ậ nh t thì ta k t lu n luôn 2 giá tr ị b  và  b′  là khác nhau không có nghĩa th ng kê, hay chúng

ự ề ầ ố ị gi ng nhau. D a vào ph n m m minitab 1 6, so sánh 2 giá tr  trung bình ể b và b′. Ki m tra xem

ươ ươ ế ấ ả ồ chúng có ph ng sai t ng đ ng nh t không. K t qu  so sánh gi a ữ b  và  b′  trong ph ngươ

ườ ượ trình đ ng chu n c a ẩ ủ PQ đ ỉ c ch  ra ở ả  sau. b ng

ả ế ả ươ ườ B ng 3.: K t qu  so sánh gi a ữ b và b′ trong ph ng trình đ ẩ ủ ng chu n c a PQ

̣ ̣ ̉ ̣ ̉ N=8 Trung binh̀ Đô lêch chuân Đô sai chuân

b 203,54 5,93 2,24

b' 207,59 8,11 3,07

́ ự ́ ơ ̣ ̣ S  sai khac v i đô tin cây  95%: ( ­9,92; 1,81)

T­ Test = 0;  T­ Value = ­1,69 ; P­Value = 0,142

value = 0,142  > 0,05 nên k t lu n đ

ậ ấ ế ậ ượ ằ ươ Nh n th y P c r ng 2 ph ng sai c a ủ b và b’ là khác

ử ụ ộ ệ ể ố nhau không có nghĩa hay chúng gi ng nhau. S  d ng chu n ợ   ẩ t đ  xem xét ti p. Tính đ  l ch h p ế

pooled c a 2 giá tr  trên.

ấ ủ ươ ủ ị nh t c a 2 ph ng sai trên S

= 7,10

ớ ố ỏ ơ ệ ể V i s  thí nghi m nh  h n 30 dùng chu n ẩ t (2 phía) đ  so sánh.

ttinh́  =  =  = 1,07

ượ ừ ự ệ ả ậ ộ So sánh giá tr  ị t tính đ th c nghi m và c t t tra b ng (đ  tin c y 95 %):

; n1+n2­2) = tbang (0,95

; 12) = 2,179

̉ ̉ tbang (0,95

́ < tbang̉

ttinh

ế ậ ượ ằ ủ ủ ị Suy ra ttinh́  < tb ngả   => k t lu n đ c r ng 2 giá tr  trung bình c a h  s ệ ố b, b’ c a đ ườ   ng

ẩ ủ ố ươ ị chu n c a PQ khác nhau không ý có nghĩa th ng kê. Hay ph ắ   ng pháp xác đ nh PQ không m c

ố ệ ố ố ệ ố ố ệ ố ả ổ ổ ế sai s  h  th ng (c  sai s  h  th ng bi n đ i và sai s  h  th ng không đ i).

́ ́ ́ ươ ử ̉ 3.2. Khao sat ph ̃ ng phap x  ly mâu

ố ớ ươ ử ề ắ ẫ ẫ ả ưở Đ i v i các ph ng pháp s c ký, n n m u và quy trình x  lý m u có  nh h ế   ớ ng l n đ n

ươ ặ ệ ố ượ ớ ứ ạ ư ị ẫ ọ ả ủ ế k t qu  c a ph ng pháp, đ c bi t là v i các đ i t ng m u ph c t p nh  d ch sinh h c. Do

ể ế ị ượ ế ươ ả ố ầ ự ế ằ đó, đ  ti n hành đ nh l ng PQ trong huy t t ng b ng HPLC có k t qu  t ộ   t c n xây d ng m t

ợ ử quy trình x  lý phù h p.

ộ ố ự ệ ề ệ ệ ả Sau khi tham kh o m t s  tài li u [7][17][24][30] và d a vào các đi u ki n hi n có,

ế ả ả ưở ủ ồ ắ ộ ờ ị chúng tôi ti n hành kh o sát  nh h ng c a n ng đ  dung d ch TCA, th i gian l c xoáy.

́ ̀ ̉ ̣ ̣ 3.2.1. Khao sat nông đô dung dich TCA

́ ̀ ́ ́ ̀ ̃ ư ́ ư ́ ươ ̣ Trong nghiên c u nay, chung tôi nghiên c u xac đinh nông đô ̣ PQ trong mâu huyêt t ng,

́ ̀ ́ ́ ̀ ̃ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ư ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ la dung dich mâu co nên ph c tap va kho đoan đinh. Trong đo chu yêu la cac loai protein. Đê viêc

́ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ượ ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ đinh l ̀ ng PQ co kêt qua tôt va bao vê côt săc ky va keo dai tuôi tho cua côt cân phai loai protein

̀ ́ ́ ̀ ̃ ̀ ́ ̉ ̉ ̣ ̣ ra khoi nên mâu. Qua tham khao môt sô tai liêu cho thây a cid trichoroacetic (TCA) la chât th ̀ươ   ng

́ ́ ̀ ́ ượ ử ử ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ đ ̣   c s  dung đê kêt tua protein trong cac dich sinh hoc. Vi vây, chung tôi s  dung TCA đê loai

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ư ưở ̣ ̉ protein trong nghiên c u nay. Tuy nhiên, nông đô TCA anh h ́ ng rât l n t ́ ̀ ̀ ́ ơ ơ i qua trinh tach va lam

́ ̀ ́ ̃ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ư ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ sach dung dich mâu. Do đo cân khao sat đê chon điêu kiên tôi  u nông đô TCA trong qua trinh x ử

́ ̃ ly mâu.

́ ̀ ́ ̀ ự ̣ ̣ ̣ ̉ Trong thi nghiêm nay, chung tôi l a chon nông đô TCA trong khoang 2,0% v/v t ́ ơ i 6,0%

̃ ́ ̀ ̃ ́ ̀ ̃ ́ ử ươ ́ ơ ̉ ́ v/v. Quy trinh x  ly mâu sau: Lây 1,00 m l mâu huyêt t ̣  ng đa thêm chât chuân PQ v i nông đô

́ ́ ̀ ́ ̃ ́ ́ ợ ́ ơ ượ ̣ 5,00 µg/ml sau đo cho 1 m l TCA v i cac nông đô khac nhau. Hôn h p đ c đem lăc xoay trong 1

̀ ́ ́ ́ ́ ượ ̣ ̣ phut, sau đo đem ly tâm 4000 vong /phút trong 15 phut. Dung dich phia trên đ ̀ c loc va đem đi

́ ị ạ ồ ẫ ộ ẩ ằ ươ ̉ ́ phân tich. Kêt qua xác đ nh l i n ng đ  PQ trong m u th êm chu n b ng ph ng pháp đ ườ   ng

̀

ả

Ả

ưở

ế

ả

ế

ế ươ

ẩ ượ ̉ chu n thu đ . c trong bang 3.12

B ng 3.:

nh h

ng c a

ủ nông đô TCA

ệ  đ n hi u qu  chi

ỏ t PQ ra kh i huy t t

ng

̣

̀ ̣ Nông đô PQ ̀ ộ ồ ̣ Nông đô TCA (%) Đ  thu h i (%) RSD (%) (µg/ml)

4,89 2,0 97,8 2,20

4,93 4,0 98,6 1,40

4,99 5,0 99,8 0,20

4,99 6,0 99,8 0,20

́ ̃ ́ơ ồ ộ ị ̉ ượ ̉ ̣ V i 1 ml n ng đ  dung d ch a cid trichloroacetic 5,0 % qua khao sat đa loai bo đ ́   c hêt

́ ́ ́ ̀ ́ ̀ ươ ư ượ ưở ươ ̉ ̉ protein trong huyêt t ng, d  l ̃ ng trong mâu nho, it anh h ng đên đ ́ ̀ ng nên nhât va it pha

̃ ̃   loang mâu.

́ ́ ̀ ơ ̉ ́ 3.2.2. Khao sat th i gian lăc xoay

́ ̃ ́ ́ ́ ́ ̃ ́ ̀ ̀ ơ ưở ̉ ̉ Th i gian lăc xoay cung anh h ng t ́ ̀ ̀ ơ i qua trinh tach cac chât nên ra khoi mâu. Do đo cân

́ ́ ́ ́ ư ̀ ơ ̉ ượ ̉ ̣ ̉ phai chon th i gian lăc xoay tôi  u đê kêt qua đ ́ ́ c tôt nhât.

̀ ̃ ́ ̃ ̃ ́ ̀ ử ươ ́ ơ ̉ ̣ ́ Quy trinh x  ly mâu sau: Lây 1m ́ l mâu huyêt t ng đa thêm chât chuân PQ v i nông đô 5,0 0

́ ̃ ́ ́ ợ ượ ̣ ̣ µg/ml sau đo cho 1 m ̀ l dung dich TCA nông đô 5 %. Hôn h p đ c đem lăc xoay trong 0,5 ; 1; 2 phut,́

́ ́ ́ ̀ ượ ̣ ̣ sau đo đem ly tâm 4000 vong ̀ /phút trong 15 phut. Dung ́  dich phia trên đ c loc va đem đi phân tich.

́ ượ ̉ ̉ Kêt qua thu đ c trong bang 3.13:

ả Ả ưở ủ ế ắ ờ ế B ng 3.: nh h ng c a th i gian l c xoay đ n quá trình chi t

́ ̀ ̀ ơ ̣ ́ Th i gian lăc xoay Nông đô PQ ộ ồ Đ  thu h i (%) RSD (%) (phut)́ (µg/ml)

0,5 4,91 98,2 1,8

99,8 1,0 4,99 0,2

2,0 4,99 99,8 0,2

́ ́ ́ ̀ ́ ̀ ắ ờ ở ̀ ơ ̉ Th i gian l c xoáy ́ sau khi khao sat cac th i gian 30 giây; 1,0 phut va 1,5 phut thi chung

̀ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ơ ̀ ơ ̣ ̣ ̣ ̉ tôi chon th i gian ́ ơ là 1 phút. Vi khi tiên hanh thi nghiêm v i th i gian 30 giây đô thu hôi cua PQ

́ ̀ ́ ́ ́ ở ự ̀ ơ thâp h n, con ̣ .  1 va 1,5 phut không co s  khac biêt

ư ậ ế ươ ẫ ượ ư ế ử Nh  v y, quy trình x  lý m u PQ huy t t ng đ c ti n hành nh  trong hình 3.14:

ơ ồ

ử

ế ươ

Hình 3.: S  đ  quy trình x  lý PQ

ẫ  trong m u huy t t

ng

́

́

́

̃

́

̀

́

̀

ươ

ử

̀ Hình 3.: Săc ky đô PQ trong huyêt t

ng chuân ap dung quy trinh x  ly mâu hinh 3.14

̉ ̣

ả ẫ ộ ổ ị 3.2.3. Kh o sát đ   n đ nh m u phân tích

oC

ư ử ấ ẩ ầ ẫ ầ ẫ ị ạ ả ả ở Chu n b  3 m u nh  trên, l y 1 ph n m u ra x  lý ngay, ph n còn l i b o qu n ­20

ứ ế ấ ẫ ả ả ắ ử trong 21 ngày. L y các m u đang b o qu n ra x  lý và ti n hành s c ký trong các ngày th  7, 14

́

́

́

ả

và 21.

̀ B ng 3.: Kêt qua xac đinh đô ôn đinh khac ngay

̉ ̣ ̣ ̉ ̣

RSD Ngày 0 7 14 21

(%) M uẫ

1,06 1 2,00 1,98 1,96 1,95

2 2,01 1,98 1,97 1,95 1,11

1,11 3 2,01 1,97 1,97 1,95

ậ ứ ỏ ộ ấ Nh n xét th y, các giá tr ị RSD nh  (< 2%) ch ng t ỏ ươ  ph ng pháp này có đ  tái l p t ặ ươ   ng

́ ́ ̀ ̀ ̃ ị ử ụ ể ứ ụ ể ̉ ư đôi tôt và giá tr  s  d ng cao, có th   ng d ng đ  phân tích mâu sau nhiêu ngay kê t ̃ ́ ̀  khi lây mâu.

ị ử ụ ủ ậ ươ 3.3. Xác nh n giá tr  s  d ng c a ph ng pháp

́ ́ ̣ ̣ ̣ 3.3.1. Đanh gia đô chon loc

̃ ́ ̀ ́ ̃ ́ ́ ươ ươ ử ̉ ̣ ́ Chuân bi mâu huyêt t ́ ng trăng không co PQ va mâu huyêt t ng trăng co thêm PQ x  ly ́

̀ ̀ ̃ ̀ ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ́ ư ̣ ̣ ̉ ơ mâu theo s  đô hinh 3.1 4 va tiên hanh phân tich theo điêu kiên săc ky nh  muc 2.3.2.1. Kêt qua thu

ươ

̀ ượ ̣ ở ̉ đ c thê hiên hinh 3. 1 6

Hình 3.: Đô chon loc PQ cua ph

ng phaṕ

̣ ̣ ̣ ̉

́ ̃ ̀ ́ ́ ươ ươ ư ́ ư ̀ ơ ́ ơ ̣ ̣ ̉ ́ Trên săc ky đô mâu huyêt t ́ ng trăng tai vi tri t ng  ng v i th i gian l u cua PQ không

́ ́ ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ươ ̣ ̣ ̣ ̉ xuât hiên pic la. Săc ky đô huyêt t ́ ́ ng co PQ cân đôi, săc net, tach riêng biêt. Kêt qua trên xac

́ ̀ ́ ́ ươ ́ ơ ư ự ̣ ̣ ̣ nhân ph ́ ́ ng phap v a xây d ng co tinh chon loc tôt đôi v i PQ.

ủ ộ ươ 3.3.2. Đánh giá đ  đúng c a ph ng pháp

ồ ủ

ệ

ấ

ươ

ạ ượ

ữ

ử

ẫ

ộ

Hi u su t thu h i c a ph

ng pháp x  lý m u là m t trong nh ng đ i l

ng quan

ả ủ

ể

ệ

ọ

ươ

ấ ị ấ

tr ng đ  đánh giá hi u qu  c a ph

ng pháp. Nó cho bi

ế ượ t l

ng ch t b  m t đi trong quá

ậ ủ

ử

ệ

ẫ

ấ

ồ

ộ

ươ

trình x  lý m u. Đánh giá hi u su t thu h i là đánh giá đ  tin c y c a ph

ử   ng pháp x  lý

ẫ

ọ

m u đã ch n.

ồ ủ

ệ

ể

ấ

ươ

ử ụ

ươ

Đ  đánh giá hi u su t thu h i c a ph

ng pháp, chúng tôi s  d ng ph

ng pháp

́

ẩ

ấ

ượ

ự

ề

ẫ

ồ ủ ộ ươ 3.3.2.1. Đánh giá đ  thu h i c a ph ng pháp

thêm chu n. Ch t chu n

ẩ PQ đ

c thêm vào n n m u th c là m u

ẫ  huyêt thanh bênh nhân

ượ

ế

ở

ứ

ẩ

̣

ngô đôc PQ

. Quá trình đánh giá đ

c ti n hành

5 m c thêm chu n khác nhau:

̣ ̣

M u thẫ

ử không thêm chu n PQẩ

ẩ

ở ứ

­ M c 0:ứ

u thẫ

ử có thêm chu n PQ

m c 0,

1 µg/ml

ẩ

­ M c 1: Mứ

u thẫ

ử có thêm chu n PQ

ở ứ  0,5 µg/ml

m c

ẩ

­ M c 2: Mứ

ử có thêm chu n PQ

ở ứ  1 µg/ml

m c

ẩ

­ M c ứ 3: M u thẫ

ử có thêm chu n PQ

ở ứ  2 µg/ml

m c

ẩ

­ M c ứ 4: M u thẫ

ử có thêm chu n PQ

ở ứ  5 µg/ml

m c

ượ

ư ụ

ệ ố

ử

ẫ

ỗ

ẫ M u đ

c x  lý nh  m c 3.3. và phân tích trên h  th ng HPLC. M i m u th

ử

ượ

ặ ạ

ế

ầ

ượ

ở ả

đ

c làm l p l

ả i 3 l n. K t qu  trung bình đ

c trình bày

b ng sau:

­ M c ứ 5: M u thẫ

ồ ố ớ ệ ế ả ấ ả ươ B ng 3.: K t qu  đánh giá hi u su t thu h i đ i v i ph ng pháp phân tích PQ

M u ẫ 0 1 2 3 4 5

ồ N ng đ ộ

PQ chu nẩ 2,04 0,10 0,50 1,00 2,00 5,00

(µg/ml) ồ N ng đ ộ

PQ

thu h iồ 2,15± 0,18 2,52± 0,03 3,02± 0,12 4,08± 0,04 7,06 ± 0,11

đ cượ

(µg/ml) ấ   ệ Hi u su t

thu h iồ 105,89 96,11 98,23 102,12 100,47

(%)

ể ế

ả ộ

ế

ậ

ậ

K t qu  đ  thu h i c a

ồ ủ PQ  khá cao,  đat  ̣ 100,56%.  Vì v y có th  k t lu n răng̀

̀

ươ

ử

ậ

ẫ

ph

ng pháp x  lý m u này la đáng tin c y.

ệ ấ ồ Hi u su t thu h i trung bình 100,56 (%)

ủ

ể

ươ

ứ

ể

ế

ộ Đ  đánh giá đ  đúng c a ph

ng pháp nghiên c u, chúng tôi ti n hành ki m tra

ữ

ị

ạ

ự

ẩ

ị

ị

ự s  sai khác gi a giá tr  phân tích l

ể i và giá tr  thêm chu n đ  xác đ nh xem s  sai khác

ố

ượ

ự

ệ

đó có ý nghĩa th ng kê không. Quá trình đánh giá đ

c th c hi n theo chu n

ẩ t. M cứ

ẩ

ượ ự

ể

ọ

ư

thêm chu n đ

c l a ch n đ  thêm vào các m u

ẫ huyêt t

́ ươ   nh  sau:

ng

PQ 2  µg/ml.

ẫ

ỗ

ượ

ả ượ

ế

ễ

ể

ả

M i m u đ

c phân tích l p l

ầ ặ ại 10 l n. K t qu  đ

c bi u di n trên b ng 3.16.

ủ ộ ươ 3.3.2.2. Đánh giá đ  đúng c a ph ng pháp phân tích

ặ ạ ế ả ả B ng 3.: K t qu  phân tích l p l i các m u ẫ huyêt t ́ ươ  thêm chu nẩ ng

Giá trị

phân L nầ L nầ L nầ L nầ L nầ L nầ L nầ L nầ L nầ L nầ

tích l iạ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(µg/ml)

ử ụ

ừ

ế

ầ

ả

ượ

T  các k t qu  trên, s  d ng ph n m m

ề minitab 16, chúng tôi tính toán đ

c các

ư ả

ố

ạ ượ đ i l

ng th ng kê nh  b ng 3.1

7.

PQ 1,99 2,05 2,0 1,97 2,0 2,04 1,99 1,98 2,02 1,99

ạ ượ ả B ng 3.: Các đ i l ố ng th ng kê

ế ả   K t qu  so Sai số ộ ệ ẩ   Đ  l ch chu n ị Giá tr  phân tích l ạ   i sánh v iớ ươ t ố ng đ i ttính ươ t ố ng đ i tbang̉ (P=0,95; trung bình (µg/ml) (%) (%) f=9) = 2,26

́

ươ

ứ

ế

ỏ ự

ố ớ Đ i v i ph

ng phap phân tích

PQ  cho  k t qu

ả ttính  <  tb ngả   ch ng t

s  sai khác

ữ

ạ

ẩ

ố

ị

ị gi a giá tr  phân tích l

i và giá tr  thêm chu n không có ý nghĩa th ng kê. Hay nói cách

PQ 2,01 0,37 ttính < tb ngả 0,5 0,5

ươ

ố ệ ố

ể

ắ

ươ

khác, ph

ng pháp phân tích không m c sai s  h  th ng và có th  dùng ph

ng pháp này

̃

ể

ị

ượ

́ ươ

đ  phân tích đ nh l

ng

́ PQ trong cac mâu huyêt t

ng.

ộ ặ ạ ặ ạ 3.3.3. Đánh giá đ  l p l i và tái l p l i

ộ ệ

ặ ạ

ự ổ

ộ

ớ

ị

ạ V i m t h  máy có đ  nh y cao thì s   n đ nh và l p l

ọ   i đóng vai trò quan tr ng

ặ ạ ố

ể

ớ

ộ

ố

ộ

trong phân tích. L p l

i t

t m i có th  cho đ  chính xác t

ạ t, trong m t ph m vi cho phép.

ố ớ ệ

ọ ượ

ự

ắ

ệ ố ư

ề

Đ i v i h  máy s c ký, khi đã l a ch n đ

c đi u ki n t

ộ   i  u cho quá trình tách, thì m t

ộ ặ ủ

ế ị

ệ

ọ

ế ị

ồ

ế ố y u t

ả  quan tr ng quy t đ nh hi u qu  phân tích đó là đ  l p c a thi

t b , bao g m c  đ

ả ộ

ộ ặ ạ ủ ệ ắ

ư

ệ

ả

ờ

ọ

ỉ

ặ l p di n tích pic và th i gian l u. B ng 3.16 ch  ra đ  l p l

i c a h  s c ký đã ch n v

ề

ư

ệ

ả

ờ

ượ

ố ị

ự

ệ

ệ

ề

di n tích pic và th i gian l u. Quá trình kh o sát đ

c th c hi n trong đi u ki n c  đ nh

ư

nh  sau:

ộ ặ ạ ủ 3.3.3.1. Đánh giá đ  l p l i c a thi ế ị t b

ố ộ ­ T c đ  dòng: 0,5 ml/phút

ướ ­ Detector UV­VIS: b c sóng 259 nm

ứ ệ ộ ị ̣ ­ H  dung môi pha đ ng: ACN – dung d ch đêm ch a 1,1mg/ml natri heptanesulfonate; 2

3PO4.

ề ỉ mg/ml KCl; 0,2 %v/v PEG; 0,05% triethyamine đi u ch nh pH = 2,5 băng H̀

ế ộ ộ ̉ ̣ ̀ ­ Ch  đ  pha đ ng đăng dong ACN ­ Đêm: 5 ­ 95 %v/v

ỗ

ị

ượ

ộ ể

ộ ặ

ệ

ầ

ơ

M i dung d ch đ

ờ   ị c b m 5 l n vào c t đ  xác đ nh đ  l p di n tích pic và th i

ả ượ

ư

ế

ể

ễ

ả

gian l u. K t qu  đ

c bi u di n trên b ng 3.1

8:

ể ẫ ­ Th  tích m u tiêm: 30 µl

ộ ặ ạ ả ư ủ ệ ờ B ng 3.: Đ  l p l ấ i th i gian l u và di n tích pic c a các ch t

1,00 µg/ml 5,00 µg/ml 10,00 µg/ml

ờ ờ ờ ̣ ̣ ̣ Diên tich́ Th i gian Diên tich́ Th i gian Diên tich́ Th i gian Lân ̀

pic l u ư pic l u ư pic l u ư

(mAU) (phút) (mAU) (phút) (mAU) (phút)

200,95 11,87 1023,57 11,85 2058,56 11,99 1

2 198,34 11,98 1025,05 11,94 2061,04 12,00

3 205,88 11,94 1026,18 11,86 2062,44 11,94

4 201,52 11,89 1025,97 11,81 2049,53 12,02

5 209,69 11,96 1033,30 12,02 2053,04 12,01

Trung 203,28 11,93 1026,81 11,90 2056,92 11,99 binh̀

ứ

ế

ả

ấ

ị

ỏ ề

ệ ố

ệ

ắ

K t qu  cho th y các giá tr  RSD < 3% ch ng t

đi u ki n và h  th ng s c ký

ọ

ợ

ị

ượ

RSD (%) 2,21 0,39 0,37 0,70 0,27 0,25

ự HPLC đã l a ch n là

ị ổ   n đ nh,

phù h p đê đ nh l

ng PQ.

̉

ị ử ụ

ủ

ể

ậ

ươ

ế

Đ  xác nh n giá tr  s  d ng c a ph

ng pháp phân tích, chúng tôi ti n hành đánh

ẩ ặ ạ

ụ

ộ

ặ

ườ

ộ ệ giá đ  ch m, đ  l ch chu n l p l

i và tái l p. Thông th

ng, quá trình đánh giá đ

ượ   c

ự

ệ

ế ị

ự

ặ

ậ

ỹ

th c hi n trên các thi

ệ   t b  khác nhau ho c cho các k  thu t viên khác nhau cùng th c hi n

ử

ự

ệ

ề

ệ

ệ

ộ

ọ

m t phép th  nghi m. Trong đi u ki n phòng thí nghi m, chúng tôi l a ch n ph

ươ   ng

ổ ỹ

ậ

pháp đ i k  thu t viên.

́

ẫ

ươ

ượ

ượ

ử

M u huyêt t

ng đ

ẩ c thêm chu n 2 µg/ml.

ẫ M u đ

ư ụ c x  lý nh  m c 3.3.4 và

ệ ố

ượ

ự

ệ

ớ

phân tích trên h  th ng HPLC. Quá trình phân tích đ

ẫ   c th c hi n song song v i m u

ừ

ẩ

ị

ượ

ự

ồ

ộ

ươ

không thêm chu n. T  đó, xác đ nh đ

c n ng đ  PQ thêm vào d a trên ph

ng trình

ườ

ỗ ỹ

ặ ạ

ả ượ

ế

ầ

ể ệ ở ả

đ

ng chu n

ậ ẩ . M i k  thu t viên làm l p l

i 10 l n. K t qu  đ

c th  hi n

b ng 3.1

9:

ẩ ặ ạ ộ ụ ộ ệ ủ ươ 3.3.3.2. Đánh giá đ  ch m (đ  l ch chu n l p l ặ i và tái l p) c a ph ng pháp phân tích

ả ả ượ ạ ượ ằ ươ ẩ ủ ỹ ế B ng 3.: K t qu  hàm l ng PQ tìm l c b ng ph i đ ậ   ng pháp thêm chu n c a 3 k  thu t

viên khác nhau

STT KTV­1 (µg/ml) KTV­2 (µg/ml) KTV­3 (µg/ml)

1 1,99 1,99 2,01

2 2,00 1,99 2,00

3 2,00 1,97 2,00

4 2,00 1,97 1,97

5 1,99 1,98 1,98

6 2,00 2,02 1,98

7 2,00 1,98 2,00

8 1,98 1,98 2,01

9 1,98 2,00 2,00

ử ụ

ừ

ế

ề

ả

ượ

ầ T  các k t qu  trên, s  d ng ph n m m minitab 16, chúng tôi thu đ

ả c b ng d

ữ

ư ả

ệ

ố

ki n th ng kê nh  b ng 3.

20.

10 2,00 2,01 2,00

ộ ặ ạ ủ ữ ệ ả ươ ế ở ố B ng 3.: Các d  ki n th ng kê đánh giá đ  l p l i c a ph ng pháp phân tích ti n hành b i ba

KTV khác nhau

ạ ượ Đ i l ng đánh giá KTV­1 KTV­2 KTV­3

Xtb 1,99 1,98 1,99

D)

ẩ ặ ạ ộ ệ Đ  l ch chu n l p l i (S 0,01 0,02 0,01

ẩ ặ ạ ươ ộ ệ ố Đ  l ch chu n l p l i t ng đ i (% RSD) 0,45 0,75 0,65

R) (%)

ố ươ Sai s  t ố ng đ i (E ­0,35 ­0,55 ­0,20 ẫ ẩ ớ ị (so v i giá tr  trong m u chu n)

ư ậ

ể ế

ứ

ủ

ậ

ỗ

ị

ố ớ   Nh  v y, căn c  vào các giá tr  % RSD c a m i KTV có th  k t lu n, đ i v i

ị

ượ

ộ ặ ạ

ộ ụ

ủ

ố

ấ

phép đ nh l

ng PQ, đ  ch m (hay đ  l p l

i) c a KTV­1 là t

ủ t nh t và c a KTV­2 là

ứ

ấ

ỏ

ị

ỏ ả

kém nh t. Tuy nhiên, các giá tr  RSD là nh  (< 1%) ch ng t

ệ    c  ba KTV làm thí nghi m

ộ ặ ạ ố

ộ ụ ề đ u cho đ  ch m (đ  l p l

i) t

t.

ố ươ

ự

ữ

ố

ượ

ị

D a vào sai s  t

ị ng đ i gi a giá tr  trung bình tìm đ

c và giá tr  đúng μ có th

ể

ố ệ ố

ủ ả

ề

ế

ắ

ậ

ả

ộ

ế k t lu n k t qu  phân tích c a c  ba KTV đ u m c sai s  h  th ng âm. Đ  đúng đánh

ố ươ

ủ

ế

ả

ấ

ố

ố

ấ

giá qua sai s  t

ng đ i cho th y k t qu  phân tích PQ c a KTV­3 là t

t nh t và KTV­2

ố ươ

ấ

ả

ị

ố ề

ứ

ấ

ỏ

là kém nh t. Tuy nhiên, c  ba giá tr  sai s  t

ng đ i đ u th p (< 1%), ch ng t

các KTV

ủ ả

ề

ế

ả

ộ ụ   ề đ u làm đúng. Nói cách khác, k t qu  phân tích c a c  ba KTV đ u chính xác (đ  ch m

ộ

ố t

t, đ  đúng cao).

ừ

ế

ả

ế ụ

ộ ệ

ẩ

ả T  các k t qu  trên b ng 3.

ặ   20, chúng tôi ti p t c tính toán đ  l ch chu n tái l p

ứ

ủ c a PTN theo các công th c:

ươ

ươ Ph ng sai 0,000081 0,000225 0,000169

ng sai trong cùng m u (

ẫ within­sample estimation of variance):

=

­ Ph

ợ ậ ­ Trung bình t p h p là

ươ ữ ­ Ph ng sai gi a các m u ( ẫ between­sample estimation of variance):

L

ươ ặ ­ Ph ng sai tái l p

R= S2

+ = MSwithin + MSbetween

S2

ộ ệ ặ ươ ẩ ­ Đ  l ch chu n tái l p t ố ng đ i

%RSDR = 100.SR/ (%)

ặ ủ

ữ ệ

ả

ộ

ươ

B ng 3.: Các d  ki n đánh giá đ  tái l p c a ph

ng pháp phân tích

ứ ượ ả ư ả ế ­ Dùng các công th c trên, chúng tôi thu đ c các k t qu  nh  b ng 3. 21.

ạ ượ Đ i l ng PQ

within

ươ ẫ Ph ng sai trong cùng m u MS 0,000158

ậ ợ Trung bình t p h p 1,99

between

ươ ữ ẫ Ph ng sai gi a các m u MS 0,000037

ươ ặ 0,000195 Ph ng sai tái l p

ộ ệ ặ ươ ẩ ố Đ  l ch chu n tái l p t ng đ i 0,70 (% RSDR)

R nh  (< 1%) ch ng t

ậ ấ ị ứ ỏ ỏ ươ ộ Nh n xét th y, các giá tr  RSD ph ng pháp này có đ  tái l p t ặ ố   t

ị ử ụ ể ứ ụ ể ở ề ệ và giá tr  s  d ng cao, có th   ng d ng đ  phân tích nhi u phòng thí nghi m khác nhau.

ộ ổ ị 3.3.4. Đ   n đ nh

ộ ổ ủ ế ể ạ ị Trong ph m vi đ  tài, chúng tôi ti n hành đánh giá đ   n đ nh c a PQ trong huy t t ế ươ   ng

ả ả ờ ờ trong th i gian phân tích và th i gian b o qu n.

ộ ổ ờ ị Đ   n đ nh trong th i gian phân tích

ế ươ ẫ ẩ ị ở ồ ẫ ồ ế ử Chu n b  3 m u PQ trong huy t t ắ ng tr ng n ng đ  2 ộ µg/ml, x  lý m u r i ti n hành

̀ ̃ ế ụ ứ ỗ ờ ầ ờ ượ ̣ ắ s c ký ngay và ti p t c c  m i gi 1 l n trong vòng 5 gi . Nông đô đo đ c sau môi gi ̀ ơ ượ  đ c

̉ cho trong bang sau.

́ ́ ả ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ̀ B ng 3.: Kêt qua xac đinh đô ôn đinh trong ngay

Giờ RSD 0 1 2 3 4 5 (%) M uẫ

1(µg/ml) 2,00 1,99 1,99 1,98 1,98 1,98 0,402

2 (µg/ml) 2,02 2,00 2,00 1,99 1,98 1,97 0,851

3 (µg/ml) 2,01 2,00 2,03 1,99 1,98 1,98 0,601

ậ ứ ỏ ỏ ươ ặ ố ộ ấ Nh n xét th y, các giá tr ị RSD nh  (< 1%) ch ng t ph ng pháp này có đ  tái l p t t và

́ ́ ̀ ́ ị ử ụ ể ứ ụ ể ở ử ơ ̉ giá tr  s  d ng cao, có th   ng d ng đ  phân tích ̃  cac th i điêm khac nhau sau khi x  ly mâu

́ ̀ trong vong 5 tiêng.

ế ươ ẫ ự ế ụ ệ ượ 3.4. Phân tích m u PQ trong huy t t ng b nh nhân ­ áp d ng th c t tiên l ệ   ng b nh

ả ọ ệ ấ ụ nhân và đánh giá hi u qu  l c máu h p ph

ứ ể ặ 3.4.1. Đ c đi m chung nhóm BN nghiên c u:

ộ ộ ẩ ượ ủ ệ ứ ệ ọ 31 b nh nhân ng  đ c PQ đ  tiêu chu n đ c ch n vào nghiên c u. Trong đó 16 b nh nhân

ữ (BN) nam (51,6%) và 15 BN n  (48,4%).

ố ệ ứ ổ Hình 3.: Phân b  b nh nhân nghiên c u theo nhóm tu i

́ ́ ́ ̀ ́ ứ ̉ ̉ ̉ ̉ ̀ Trong nhom BN nghiên c u, tuôi thâp nhât la 14 tuôi, tuôi cao nhât la 63 tuôi, trung bình:

̣ ở ể ặ ộ ố ̣ ̣ ̣ ̉ ̉ 32,1 (cid:0) 15,2. Ngô đôc PQ hay găp đô tuôi lao đ ng 18­50 tuôi (64,5%). Đ c đi m phân b  nhóm

ứ ươ ổ ự ứ ướ ủ ả ặ ễ ị tu i BN nghiên c u t ng t các nghiên c u tr c c a các tác gi Đ ng Th  Xuân, Nguy n Th ị

ụ ạ ộ ộ ố ộ D  [4] và Vũ Mai Liên [2] t i Trung tâm ch ng đ c. Đáng chú ý là 16,1% BN ng  đ c PQ ở ổ    tu i

ế thi u niên.

ố ệ ệ ượ ề ở Phân b  b nh nhân theo ngh  nghi p đ ỉ c ch  ra hình 3.18.

ố ệ ứ ề ệ Hình 3.: Phân b  b nh nhân nghiên c u theo ngh  nghi p

̀ ̀ ́ ́ ứ ệ ệ ố ̣ ̉ ̣ Trong s  các b nh nhân nghiên c u, nghê lam ruông chiêm ti lê cao nhât 11 b nh nhân (35,5%)

ệ ợ ượ ấ ẵ ệ ở ớ phù h p v i vi c PQ đ c dùng trong nông nghi p nên r t s n có ọ  nông thôn. H c sinh, sinh viên

́ ấ ́ ư ̉ ̣ chiêm ti lê cao th  hai (25,8%) r t đáng quan tâm.

ộ ộ ộ ộ ứ ề ế ầ Khi xem xét v  nguyên nhân ng  đ c, h u h t các BN trong nghiên c u ng  đ c do t ự ử   t

́ ệ ỉ ̉ (29 b nh nhân ­ 93,6%). Ch  có 2 BN do tai n n ( ́ ạ 6,4%), trong đó 1 BN do bât cân khi phun thuôc,

̀ ́ 1 BN do uông nhâm.

ẩ ươ ̣ ủ ế ệ ́ ả Trong cac s n ph m th ng mai c a PQ do BN và gia đình mang đ n vi n, Gfaxone

́ ộ ố ả ẩ ̣ 20SL hay găp nhât, ngoài ra có m t s  tên s n ph m khác: Gramoxone, Fansipan, Tungmaxone,

ỏ C  cháy.

ả ệ ộ ộ ế Hình 3.: K t qu  b nh nhân ng  đ c Paraquat

ế ươ ộ ồ ượ ệ ệ 3.4.2. N ng đ  Paraquat huy t t ng trong tiên l ả ọ   ng b nh nhân và đánh giá hi u qu  l c

ụ máu h p phấ

́ ́ ́ ư ệ ấ ẫ ượ ̀ ơ Th i gian t ̀  luc BN uông PQ cho đên khi l y m u xét nghi m đ ả   c trình bày trong b ng

́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ơ ệ ấ ẫ ờ ̀ 3.23. Trung binh th i gian t ̀ ư  luc uông đên luc l y m u xét nghi m la 6,6 ± 4,23 gi ̀ ơ . Th i gian

̀ ́ ̀ ́ ̀ ờ ờ ủ ế ẫ ấ ố ờ ́ ngăn nhât la 1 gi , nhiêu nhât la 23 gi . Th i gian l y m u sau khi u ng ch  y u là trên 4 gi ờ

(74,2%).

́ ́ ́ ̀ ơ ả ư ệ ẫ B ng 3.: Th i gian t ̀ ấ  luc uông đên khi l y m u xét nghi m

́ ̣ ̣ Sô bênh nhân Ti lê %̉ ̀ơ Th i gian

1 3,2 ≤ 2 giờ

7 22,6 >2 ­ 4 giờ

12 38,7 >4 ­ 6 giờ

11 35,5 Sau 6 giờ

ế ươ

ộ

ồ

ệ

N ng đ  Paraquat trong huy t t

ng khi vào vi n:

ụ

ự

ượ

ồ

ộ

ị

Áp d ng quy trình phân tích xây d ng đ

c, chúng tôi xác đ nh n ng đ  PQ trong

ế ươ

ặ ạ

ẫ

ỗ

ả

ầ

huy t t

ng. M i m u phân tích l p l

ế i 3 l n. K t qu  thu đ

ượ ở ả c

ị ủ    b ng 3.24. Giá tr  c a

ế ươ

ộ

ấ

ấ

ồ n ng đ  PQ trong huy t t

ấ   ng trung bình 8,1 µg/ml (th p nh t: 0,215 µg/ml; cao nh t

88,66 µg/ml).

Tu iổ

ả ị

ế

ượ

K t qu  đ nh l

ng PQ (µg/ml)

Gi

iớ

STT

cướ

B nhệ   nhân

Vào  vi nệ

Sau  HP1

Tr HP2

Sau  HP2

Trướ c HP3

Sau  HP3

Th iờ   gian  u ngố   đ nế   khi XN

6

1 Dinh Thi P

18

Nữ

18,68

5

2 Kieu Anh V

21

Nam

21,48

6

3 Hoang Van G

60

Nam

38,98

8

4 Nguyen T Hong T

42

Nữ

8,6

6

5 Vu Thi H

63

Nữ

9,77

8

6 Vu Thi H

22

Nữ

3,09

0,26

0,05

0,12

<0,04

5

7 Nguyen Thi T

22

Nữ

19,3

4,40

14

8 Dam Huy Q

Nam

48

5,10

2,32

1,90

6

ặ

ị

9 Đ ng Th  H

51

Nữ

0,63

0,03

<0,04

3

ễ 10 Nguy n Thi H

21

Nữ

17,45

8

11 Nguyen Huy H

26

Nam

43,2

4

ầ

12 Tr n Thi T

54

Nữ

88,66

5

ạ

13 Ph m Văn L

31

Nam

0,21

18

14 Lã Anh D

31

Nam

5,36

0,76

0,48

0,45

0,13

ị 15 Lò Th  C

27

Nữ

0,51

0,24

0,05

<0.04

23

ễ   16 Nguy n Xuân T

55

Nam

6,34

0,76

0,41

0,24

7

17 Nghiêm Anh V

31

Nam

52,0

3,60

1,70

1,44

2,47

4

ễ 18 Nguy n Thanh C

18

Nam

1,56

8

ễ   19 Nguy n Xuân L

34

Nam

6,60

0,48

0,27

<0.04 <0.04 <0.04 KPH

3

ọ

ễ 20 Nguy n Ng c C

21

Nam

0,50

0,16

<0.04 <0.04

15

ạ

ễ 21 Nguy n M nh T

23

Nam

9,12

5

ị

ễ 22 Nguy n Th  C

55

Nữ

57,97

3

ọ

ễ 23 Nguy n Ng c T

38

Nam

59,29

1

ễ 24 Nguy n Văn S

48

Nam

0,78

3

ầ

ọ

25 Tr n Ng c D

24

Nữ

0,29

9

ị 26 Lê Th  H

16

Nữ

59,10

1,31

5

ươ

ị

27 D ng Th  Q

14

Nữ

0,58

6

28 Đòan Văn K

14

Nam

0,59

0,05

7

ị

ễ 29 Nguy n Th  B

15

Nữ

46,30

1,60

0,60

3

ả

ễ 30 Nguy n Kh  C

37

Nam

3,00

0,05

5

ị

31 Phùng Th  N

16

Nữ

5,16

0,23

0,08

0,29

0,04

5

ả ị ả ượ ệ ế B ng 3.: K t qu  đ nh l ng PQ trên 31 b nh nhân

ễ ự ụ

ộ ồ

ả ể

ế ươ

ế

ộ

ệ

K t qu  bi u di n s  ph  thu c n ng đ  PQ trong huy t t

ng khi vào vi n theo

ờ

ừ

ế

ệ

ế

ấ

ầ

ố

ố

th i gian t

ế    khi u ng thu c đ n khi xét nghi m (hình 3.20) cho th y h u h t BN đ n

ệ

ờ

ồ

ộ

ơ

ế

ị

vi n trong vòng 10 gi

có n ng đ  PQ cao h n 10

(cid:0) g/ml đ u t ề ử

vong. Do đó n u đ nh

ế ươ

ẽ

ờ

ượ

ượ l

ng chính xác PQ trong huy t t

ố ng theo th i gian u ng s  cho phép tiên l

ng t

ử

vong.

ả ị ượ ệ ở ệ ồ ộ ố ử ế Hình 3.: K t qu  đ nh l ng n ng đ  PQ khi vào vi n b nh nhân s ng và t vong.

ỉ ố ộ ặ ộ ộ ứ ủ ứ ể Căn c  vào công th c tính ch  s  đ  n ng c a ng  đ c PQ (hay thang đi m SIPP):

ế ươ ờ ắ ầ ề ể SIPP=[PQ  huy t t ng ((cid:0) g/ml)]×[th i gian ừ ố t u ng ế đ n b t đ u đi u tr ủ   ị  (h)], đi m SIPP c a

ả ể ế ễ ấ ấ ế   nhóm BN nghiên c uứ  trung bình là 51,5 (th p nh t: 1,1, cao nh t 354,6). K t qu  bi u di n k t ấ

ể ượ ở ở ể ố ụ ủ c c c a BN theo đi m SIPP đ ỉ c ch  ra hình 3.20. Các BN ấ    nhóm s ng có đi m SIPP th p

ẳ ử ấ ả ề ử ể ơ h n h n nhóm t vong. T t c  các BN có đi m SIPP trên 40 đ u t vong.

ế ơ

ị ủ

ể

ượ

ả Chúng tôi kh o sát chi ti

t h n giá tr  c a thang đi m SIPP đ

c trình bày d

ướ   i

ườ

ệ

dang đ

ng cong ROC (hình 3.23). Di n tích d

ướ ườ i đ

ủ ng cong (AUC) c a SIPP là 0,886.

ư ậ

ị ố

ể

ể

ượ

ử

ể

ị

Nh  v y, đi m SIPP có giá tr  t

t dùng đ  tiên l

ng t

vong. Giá tr  thang đi m SIPP =

ấ ươ

ệ

ạ

ộ

ứ

ể

ộ ặ 25 có đ  nh y và đ  đ c hi u cao nh t (t

ng  ng 0,82 và 0,88), đi m SIPP trên 40 có

ộ ặ

ề ử

ệ

ể

ạ

ạ

ộ đ  nh y 0,73 và đ  đ c hi u đ t 100% có nghĩa BN có đi m SIPP trên 40 đ u t

vong.

ị ể ở ệ ố ử Hình 3.: Giá tr  đi m SIPP b nh nhân s ng và t vong.

ế ươ

ộ

ồ

ướ

ỗ ầ ọ ượ

ọ

ể

ị

N ng đ  PQ huy t t

ng tr

c và sau l c m i l n l c đ

ả   c bi u th  trong b ng

3.25.

ể ượ ử ng t vong Hình 3.: Thang đi m SIPP tiên l

N ng đồ

ổ ồ ế ươ ấ ọ ụ ả   B ng 3. ng sau l c máu h p ph ộ : Thay đ i n ng đ  Paraquat huy t t

ộ

N ng đồ

ộ

ầ

L n HP

tr

ướ ọ c l c

sau l cọ

S  BNố

p*

(µg/ml)

L nầ

Trung vị

(µg/ml) 9,84

1,10

12

0,002

1 L nầ

ị ứ T  phân v Trung vị

0,70 ­ 12,10 0,91

0,23 ­ 1,60 0,48

11

0,003

2 L nầ

ị ứ T  phân v Trung vị

0,16 ­ 1,60 0,62

0,08 ­ 0,60 0,31

6

0,04

ứ

3

ị T  phân v

0,09 ­ 0,95

0,001 ­ 0,54

ằ

ị

ị

ổ ồ   * Giá tr  p xác đ nh b ng Wilcoxon Signed Ranks Test, p <0,05 có nghĩa là thay đ i n ng

ớ ướ ọ

ố

ọ ộ đ  PQ sau l c so v i tr

c l c có ý nghĩa th ng kê.

ượ

ế ươ

ồ

ướ

ấ ọ

ấ

ọ

ị Đ nh l

ộ ng n ng đ  PQ huy t t

ng tr

c và sau l c cho th y l c máu h p ph

ụ

ỏ ơ ể ặ

ụ

ệ

ệ

ầ ọ

ầ

ệ ấ có tác d ng rõ r t trong vi c l y PQ ra kh i c  th , đ c bi

t là l n l c đ u tiên. Khi

ả ở

ệ

ấ

ả

ầ ọ

ằ

ẫ

ị

ồ n ng đ  P

ộ Q đã gi m th p, hi u qu

ầ    2 l n l c sau v n còn giá tr  dù không b ng l n

ả ị

ầ

ượ

ồ ọ

ủ

ứ

ấ

ằ

ộ

ế ọ l c đ u. K t qu  đ nh l

ng này cung c p b ng ch ng  ng h  cho phác đ  l c máu

ớ ượ

ự

ạ

ầ ọ

ầ

ộ

ố

HP m i đ

c xây d ng t

i Trung tâm ch ng đ c trong đó 3 l n l c HP đ u tiên đ

ượ   c

ả ừ

ế

ế

ệ

ả

ệ

ả

ượ

ự

ả ti n hành liên ti p đ m b o bi n pháp tăng th i tr

PQ hi u qu  này đ

ệ   c th c hi n

ấ ướ

ắ

ờ

ớ ả

ủ

ệ

ơ

trong th i gian ng n nh t h

ng t

i c i thi n h n n a t

ữ ỷ ệ ố  l

ộ ộ    s ng c a các BN ng  đ c

ỡ ẫ

ứ

ậ

ố

ỉ

ấ c p PQ. Trong nghiên c u này, do c  m u khiêm t n, nên chúng tôi ch  ghi nh n 1

ườ

ượ

ế ụ ọ

ữ ớ

ầ

tr

ợ ng h p đ

c ti p t c l c HP thêm 2 l n n a t

i PQ âm tính trong máu.

́

̣

KÊT LUÂN

́ ̃ ́ ́ ́ ́ ơ ượ ̉ ư ̣ ̣ ́ ư V i cac muc tiêu nghiên c u đăt ra, chung tôi đa thu đ c cac kêt qua nh  sau:

ượ ượ ế ươ ẫ 1. Đã xây d ng đ c quy trình phân tích PQ trong m u huy t t ng

ố ư ể ề ằ ị ươ ­ T i  u hóa các đi u ki n ệ  đ  tách PQ và xá đ nh b ng ph ng pháp HPLC, detetor

λ ệ ố ư ề ả ộ ồ DAD ( =259 nm). Các đi u ki n t i  u bao g m: c t pha đ o Agilent C8 ( (150 mm x

4,6 mm; 5 µm) và c tộ  b o vả ệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm). Pha đ ngộ  đ mệ  photphat pH

ệ ể ồ ồ =  2,5   theo   th   tích   (5:95)   g m   ACN   –   Đ m   g m   ( natri   heptanesulfonate;  KCl;

polyethylenglycol; triethylamine; MeOH)

ỏ ề ế ươ ử ệ ề ẫ ẫ ­ Đi u ki n x  lý m u PQ ra kh i n n m u huy t t ng kh ọ ấ   i có TCA ly tâm và l c l y

ị dung d ch xác đ ệ ố ịnh trên h  th ng HPLC.

ươ ế ươ ề ẫ ươ 2. Ph ng pháp phân tích PQ trên n n m u huy t t ng thu đ ượ ph c ̀ ng trinh đ ̀ ươ   ng

̀ ̣ ư ̉ ̉ chuân trong khoang nông đô t ̀  0,040 ­ 10 µg/ml y = (0.84±0.32) + (205.06 ± 0.08) x có

̀ ươ ặ ạ ̣ ́ LOD = 0,013 µg/ml; LOQ = 0,040 µg/ml va hê sô t ng quan R2 = 0.9999. Đ  ộ l p l ̉   i cua

̀ ́ ́ ́ ươ ỏ ơ ặ ạ ề ̣ ̣ thiêt bi va ph ng phap phân tich (RSD đ u nh  h n 3%) và đô tái l p l i (RSD ỏ ơ   R nh  h n

̀ ̀ ́ ơ ơ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ̀ ̀ 1%); đô ôn đinh trong th i gian phân tich va đô ôn đinh trong th i gian bao quan (RSD đêu

2  = 0,9999); đ  thu h i (hi u su t thu h i cua PQ

̉ ơ ế ị ệ ấ ồ ồ ộ ̉ nho h n 2%); tính tuy n tính (giá tr  R

trung binh ̀ 100,56%).

́ ượ ượ ượ ượ ̣ ̣ 3. Ph ngươ  phap đinh l ng PQ ự  xây d ng đ c đã đ ụ c áp d ng đ ể đinh l ng PQ trong

ế ươ ộ ộ ệ ạ ộ m uẫ   huy t t ấ t ng trên 31 b nh nhân ng  đ c c p ệ   ố i Trung tâm Ch ng đ c – B nh

ệ ị ủ ấ ồ ướ ạ vi n B ch Mai, cho th y giá  tr  c a n ng đ  P ộ Q lúc BN vào vi n ệ , tr ọ   c và sau l c

ấ ượ ử ấ h p ph ụ có giá trị  trong vi cệ  tiên l ng t vong và cung c p công c ữ ụ r t ấ h u ích để

ệ ấ ụ ả ủ ọ đánh giá hi u qu  c a l c máu h p ph .

Ả

Ệ

TÀI LI U THAM KH O

́ ̣ : Tiêng Viêt

a.i.1. Nguyên Thi Ph

̃ ́ ̀ ̀ ươ ư ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̀ ̣   Nghiên c u đăc điêm lâm sang va cân lâm sang cua ngô ́ ng Khăc (2008),

́ ố ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ đôc paraquat tai Trung tâm Chông đôc, Bênh viên Bach Mai ậ , Lu n án t ệ   t nghi p bác sĩ

ồ ứ ấ ứ ườ ạ ọ ộ chuyên khoa 2 h i s c c p c u Tr ng Đ i h c Y Hà N i.

a.i.2.Vũ Mai Liên, Hà Tr n H ng (2011),

ư ầ ậ ộ ộ Nh n xét t  l ỉ ệ ử  t vong do ng  đ c paraquat và m t s ộ ố

ạ ộ ệ ệ ạ ố ế ố y u t liên quan t i Trung Tâm Ch ng đ c b nh vi n B ch Mai năm 2010­2011 , Khóa lu nậ

ệ ỹ ườ ạ ọ ộ ố t t nghi p bác s  đa khoa Tr ng Đ i h c Y Hà N i.

a.i.3.Nguy n Văn Ri (2009),

ễ ươ ạ ọ ự ả ọ Các ph ng pháp tách , Bài gi ng Đ i h c Khoa h c T  Nhiên –

ĐHQGHN.

a.i.4.Đăng Thi Xuân, Nguyên Thi Du (2007),

̃ ́ ̀ ̀ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ Nghiên c u đăc điêm lâm sang, cân lâm sang va ̀

́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ề ị ỷ ế ư ư ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ đi u tr  cua ngô đôc paraquat, ́ ́  K  y u Hôi thao hôi s c câp c u va chông đôc toan quôc

năm, tr. 128­133.

a.i.5.Almeida RM, Yonamine M (2003), “Gas chromatographic­mass spectrometric method for the

ế Ti ng Anh:

determination of the herbicides paraquat and diquat in plasma and urine samples”, Journal of

a.i.6.Alvin CB, “Herbicide”, Medical Toxicology 239 (4), pp. 1515­1527.

a.i.7. Arys K, Van Bocxlaer J, Clauwaer K, et al (2000), “Quantitative determination of Paraquat in

Chromatography 853, pp.  260­264.

a fatal intoxication by HPLC­DAD following chemical reduction with Sodium borohydride”,

a.i.8.Baselt RC (2004), Disposition of toxic drugs and chemicals in man, 7th edition. Biomedical

Jounal of Analytical Toxicology 24, pp. 116­121.

a.i.9.Brunetto MR, Morales AR, Gallignani M et al (2003), “Determination of paraquat in human

Publication, pp. 844­846.

blood plasma using reversed­phase ion­pair high­performance liquid chromatography with

direct sample injection”, Talanta 59, pp. 913­921.

a.i.10. Castro R

, Prata C, Oliveira L et al (2005), “Paraquat intoxication and hemocarboperfusion”,

Acta Med Port 18, pp. 423­431.

a.i.11. Darren   MR   (2011),   “Herbicide”,

Goldfrank’s   Toxicologic   Emergencies,   9th  edition,

a.i.12. Dean RT, Fu S, Stocker R et al (1997), “Biochemistry and pathology of radical­mediated

McGraw­Hill, pp. 1494­1515.

a.i.13. Ecobichon DJ  (2001),  Casarett & Doull's  Toxicology: the Basic Science of Poisons,  6th

protein oxidation”, Biochem J 324, pp. 1­18.

a.i.14. Fatori D, Hunte WM (1980), “Radioimmunoassay for serum paraquat”, Clin Chim Acta 100,

edition., McGraw­Hill, p.763.

a.i.15. Fussell KC, Udasin RG, Gray JP et al (2011), “Redox cycling and increased oxygen utilization

pp. 81­90.

contribute   to   diquat­induced   oxidative   stress   and   cytotoxicity   in   Chinese   hamster   ovary   cells

overexpressing NADPH­cytochrome P450 reductase”,  Free radical biology & medicine  50, pp.

874­882.

a.i.16. Gao L, Liu J, Wang C et al  (2014), “Fast determination of paraquat in plasma and urine

samples   by   solid­phase   microextraction   and   gas   chromatography­mass   spectrometry”,

a.i.17. Hara   S,   Sasaki   N,   Takase   D   et   al   (2007),   “Rapid   and   sensitive   HPLC   method   for   the

Journal of Chromatography 944, pp. 136­140.

simultaneous determination of paraquat and diquat in human serum”, Analytical sciences 23,

a.i.18. Huang CB et al (2011), “Prognostic significance of arterial blood gas analysis in the early

pp. 523­526.

a.i.19. M. Ito, Y. Hori, Manami Fujisawa, Akira Oda, Shinichiro Katsuyama, Yasuo Hirose, and

evaluation of  Paraquat  poisoning  patients”, Clinical Toxicology, 49, pp. 734­738.

Toshiharu Yoshioka (2005), “Pharmaceutical Society of Japan Rapid Analysis Method for

Paraquat   and   Diquat   in   the   Serum   Using   Ion­Pair   High­Performance   Liquid

a.i.20. Kato K, Okada H, Imura H et al (1999), “Highly sensitive determination of paraquat and

Chromatography”, Biol. Pharm. Bull. 28, pp. 725­728.

diquat   in   human   blood   with   tetrabromophenolphtalein   ethyl   ester   by   ion   pair   extraction

spectrophometric method”, Analytical sciences 15, pp. 689­693.

a.i.21. Mandel JS

, Adami HO, Cole P  (2012), “Paraquat and Parkinson's disease: an overview of

the epidemiology and a review of two recent studies”, Regul Toxicol Pharmacol 62, pp. 385­

a.i.22. Moffat AC, Osselton MD, Widdop B (2004), Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, third

92.

edition, Pharmaceutical Press.

a.i.23. Moretto   A

, Colosio   C  (2011),   “Biochemical   and   toxicological   evidence   of   neurological

a.i.24. Li   C,   Li   X,   Wang   Z   et   al  (2011),   “Serum   paraquat   concentration   detected   by

effects of pesticides: the example of Parkinson's disease”, Neurotoxicology 32, pp. 383­391.

a.i.25. Lu  C,   Jing  Z,  Xiao  H   et   al,  “Determination   of   paraquat   in   human   serum   by  high­

spectrophotometry in patients with paraquat poisoning”, World J Emerg Med 2, pp. 179.

a.i.26. Paixão P, Costa P, Bugalho T et al (2002), “Simple method for determination of paraquat in

performance liquid chromatography”.

plasma and serum of human patients by high­performance liquid chromatography”, Journal

a.i.27. Taylor   PJ,   Salm   P,   Pillans   PI   (2001),     “A   Detection   Scheme   for   Paraquat   Poisoning:

of Chromatography 775, pp. 109­113.

Validation and a Five­Year Experience in Australia”, Journal of Analytical Toxicology 25, pp.

456­460.

a.i.28. Proenca P, Vidinha J, Teixeira H et al, “Determination of paraquat in blood and urine by

a.i.29. Proudfoot AT (1995), “Predictive value of early plasma paraquat concentration, paraquat

liquid chromatography­electrospray­mass spectrometry”.

poisoning”,  Paraquat Poisoning: Mechanisms, Prevention, Treatment, Bismuth C and Hall

a.i.30. Rai   MK,   Joyce   VD,   Gupta   VK   (1997),  “Sensitive   determination   of   paraquat   by

AH edition, Marcel Dekker, New York. pp. 275­282.

a.i.31. Richmond R, Halliwell B (1982), “Formation of hydroxyl radicals from the paraquat radical

spectrophotometry”, Talanta 45, pp. 343­348.

cation,   demonstrated   by   a   highly   specific   gas   chromatographic   technique,   the   role   of

superoxide radical anion, hydrogen peroxide, and glutathione reductase”, J Inorg  Biochem 17,

a.i.32. Senarathna L, Edd M, Buckly NA (2008), “Prediction of outcome after paraquat poisoning

pp. 95­107.

by measurement of the plasma paraquat concentration”, QJ Med, pp. 251­258.

a.i.33. Serra A

, Domingos F, Prata MM (2003), “Paraquat  intoxication”, Acta Med Port 16, pp. 25­

a.i.34. Sawada Y, Yamamoto L, Hirokane T et al (1988), “Severity index of paraquat poisoning”,

32.

a.i.35. Scherrmann JM, Houze P, Bismuth C et al (1987), “Prognostic value of plasma and urine

Lancet 1, pp. 1333.

a.i.36. Suzuki K, Takasu N, Arita S et al (1991), “Evaluation of severity indexes of patients with

paraquat concentration”, Hum Toxicol 6, pp. 91­93.

a.i.37. Talbot A (2005), “Paraquat and diquat”, Critical Care Toxicology 92, pp. 947­961.

a.i.38. Tomita M, Okuyama T, Nigo Y (1992), “Simultaneous determination of paraquat and diquat

paraquat poisoning”, Hum Exp Toxicol 10, pp. 21­23.

a.i.39. Yamamoto   HA   (2001),   “Effects   of   melatonin   on   paraquat   or   ultraviolet   light   exposure­

in serum using capillary electrophoresis”, Biomed Chromatogr 6, pp. 91­94.

a.i.40. Yasaka T et al (1986), “Further studies of lipid peroxidation in human paraquat poisoning”,

induced DNA damage”, J Pineal Res 31, pp. 308­313.

Arch Intern Med 146, pp. 681­685.

a.i.41. Zhaohong W, Zhiping W, Junbo X (2011), “The Quantitative Analysis of Paraquat inBiological

Samples by Liquid Chromatography­ Electrospray Ionization ­ Mass Spectrometry”, Journal of

a.i.42. Watts M (2011), Paraquat, Pesticide action network Asia & the pacific, pp. 1011­1055.

a.i.43. www.inchem.org/documents/pds/pds/pest4_e.htm (Paraquat, Data sheets on pesticide 4, Rev

Analytical Toxicology 35, pp. 23­27.

1, WHO ­2015).

26­30,32,34,35,37­40,49,57,58,61­63 1­25,31,33,36,41­48,50­56,59­62,64­