Nghiên cứu đột biến exon 9 và 20 gen PIK3CA trên bệnh nhân ung thư dạ dày

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN EXON 9 VÀ 20 GEN PIK3CA<br /> TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY<br /> Dương Thị Minh Thoa1, Tạ Thành Văn2<br /> Đặng Thị Ngọc Dung2, Nguyễn Thị Ngọc Lan2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, 2Trường Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> Ung thư dạ dày đứng hàng thứ tư trong các ung thư thường gặp với 876 000 trường hợp mới (8,7% tổng<br /> số) và 647 000 ca tử vong (10,4% tử vong do ung thư). Gần 2/3 trường hợp xảy ra ở các nước đang phát<br /> triển [1]. Các đột biến ở PIK3CA và AKT2 đã được báo cáo trong ung thư dạ dày và các bệnh ung thư khác.<br /> Kích hoạt phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) thông qua đột biến gen gây bất hoạt gen ức chế khối u PTEN<br /> là nguyên nhân phổ biến trong bệnh ung thư. Kích hoạt PI3K / Akt được chứng minh là có liên quan đến việc<br /> điều chỉnh một số chức năng tế bào như sự sống sót của tế bào, sự tăng trưởng tế bào và kích thích tạo<br /> mạch, ức chế quá trình apoptosis, dịch mã của một số protein trong sự phát triển của ung thư. Các đột biến<br /> PIK3CA, mã hóa p110α tiểu đơn vị xúc tác của PI3K, đã được xác định trong nhiều loại ung thư ở người,<br /> bao gồm ung thư dạ dày. 80% các đột biến được báo cáo trong hai exon 9 và 20, mã hóa tương ứng cho<br /> các miền xoắn ốc và kinase [2]. Nghiên cứu này nằm trong đề tài nghiên cứu về các biến đổi gen trong bệnh<br /> lí ung thư dạ dày. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu mô tả cắt ngang, 75 mẫu mô đúc paraffin gồm 36 mẫu<br /> ung thư dạ dày thể ruột và 39 mẫu ung thư dạ dày thể lan tỏa được thu thập, tách DNA, thực hiện phản ứng<br /> PCR với cặp mồi đặc hiệu và giải trình tự. Kết quả xác định được 2 bệnh nhân có đột biến (chiếm 2.67%)<br /> trong tổng số 75 bệnh nhân nghiên cứu. Trong số 2 trường hợp này, một trường hợp chứa đột biến<br /> G3108T (E1034D) trên exon 20, và một trường hợp khác với đột biến delA (Codon 542) trên exon 9. Cả<br /> hai đều thuộc loại ung thư dạ dày thể lan tỏa và là đột biến mới, chưa được báo cáo trước đó.<br /> Từ khóa: gen PIK3CA, đột biến, ung thư dạ dày<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư dạ dày là hậu quả của tương tác<br /> phức tạp giữa yếu tố vật chủ với môi trường.<br /> Nhiều yếu tố nguy cơ của ung thư dạ dày đã<br /> được xác định như: nhiễm Helicobacter pylori, hút thuốc lá, uống rượu, chế độ ăn nhiều<br /> nitrit, yếu tố di truyền, polip dạ dày, các biến<br /> đổi gen… Việc làm sáng tỏ các cơ chế bệnh<br /> học phân tử dẫn tới sự phát triển của ung thư<br /> dạ dày là rất quan trọng. Vì tín hiệu PI3K<br /> đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển<br /> <br /> của tế bào, sự chuyển hóa, sự sống còn, di<br /> căn, và sự đề kháng với hóa trị, con đường<br /> PI3K - AKT đã được coi là rất quan trọng<br /> trong quá trình gây ung thư [3; 4]. Gen<br /> PIK3CA nằm trên nhánh dài (q) của nhiễm sắc<br /> thể số 3 ở vị trí 26.32, gồm 91.979 cặp base<br /> (từ 179.148.114 đến 179.240.093) mã hóa<br /> protein p110α, tiểu đơn vị xúc tác của PI3K.<br /> Đột biến gen PIK3CA liên quan đến ung thư<br /> tạo ra một tiểu đơn vị p110α thay đổi cho<br /> phép PI3K phát tín hiệu mà không có sự điều<br /> chỉnh. Sự gia tăng tín hiệu có thể góp phần<br /> làm tăng sự phát triển không kiểm soát của tế<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Dương Thị Minh Thoa, Trường Đại học Y<br /> Dược Hải Phòng<br /> Email: dtmthoa@gmail.com<br /> Ngày nhận: 05/10/2018<br /> Ngày được chấp thuận: 20/11/2018<br /> <br /> 22<br /> <br /> bào, sự di căn và kháng hóa trị. Nhiều nghiên<br /> cứu của nước ngoài đã xác định đột biến gen<br /> PIK3CA ở bệnh nhân ung thư dạ dày, hơn<br /> 80% đột biến ở exon 9 và 20 [2]. Mười ba<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> bệnh nhân (13/111 bệnh nhân, 11,7%) có đột<br /> <br /> Địa điểm tiến hành: Trung tâm kiểm<br /> <br /> biến codon 545 gen PIK3CA, một bệnh nhân<br /> <br /> chuẩn chất lượng xét nghiệm y học, Đại học Y<br /> <br /> có đột biến codon 1047 trong nghiên cứu của<br /> <br /> Hà Nội.<br /> <br /> Chie Ito và cộng sự (2017) [5]. Nghiên cứu<br /> của Vivian Sze Wing Li và cộng sự báo cáo 4<br /> đột biến được phát hiện trên exon 9 và 20<br /> trong tổng số 94 bệnh nhân [6]. Tuy nhiên,<br /> nghiên cứu trong nước vẫn là một khoảng<br /> trống. Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu<br /> đề tài với mục tiêu:<br /> <br /> Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả<br /> cắt ngang.<br /> Cỡ mẫu: Mục tiêu thứ hai trong nghiên<br /> cứu là xác định mối lên quan giữa đột biến<br /> gen và mô bệnh học, do đó chúng tôi chọn 75<br /> mẫu mô gồm 39 mẫu ung thư dạ dày thể lan<br /> tỏa và 36 mẫu ung thư dạ dày thể ruột.<br /> <br /> 1. Xác định đột biến exon 9 và 20 của gen<br /> Nội dung nghiên cứu<br /> <br /> PIK3CA ở bệnh nhân ung thư dạ dày.<br /> 2. Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến<br /> gen PIK3CA với đặc điểm mô bệnh học.<br /> <br /> - Lựa chọn bệnh nhân.<br /> - Lấy mẫu mô ung thư dạ dày của bệnh<br /> nhân.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> - Tách chiết DNA từ mẫu mô bệnh nhân<br /> ung thư dạ dày tiến hành giải trình tự để phát<br /> hiện đột biến.<br /> <br /> Tiêu chuẩn lựa chọn: 75 bệnh nhân đến<br /> khám, được nội soi, phẫu thuật, làm giải phẫu<br /> bệnh chẩn đoán ung thư dạ dày không kèm<br /> ung thư khác tại Bệnh viện Hữu Nghị Việt<br /> Tiệp, Bệnh viên K cơ sở Tân Triều, bệnh viện<br /> Trung ương Quân Đội 108, Bệnh viện Đại học<br /> Y Hà Nội.<br /> Tiêu chuẩn loại trừ: Ung thư dạ dày kèm<br /> ung thư khác.<br /> - Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên<br /> cứu<br /> <br /> - Tính toán tỷ lệ bệnh nhân đột biến gen.<br /> Quy trình tiến hành nghiên cứu<br /> Lấy mẫu bệnh phẩm: 75 bệnh nhân được<br /> lấy mẫu mô ung thư dạ dày sau phẫu thuật<br /> hoặc sinh thiết, đúc paraffin. Cắt 4 - 6 lát mô<br /> dày 5 - 7um, xác định vùng ung thư.<br /> Tách chiết DNA: Chúng tôi thực hiện tách<br /> DNA mẫu mô theo bộ kit tách cột của QIAamp<br /> DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen). Tiến hành đo<br /> mật độ quang DNA trên máy quang phổ kế<br /> Nanodrop. Sau khi thu được DNA có chất<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> Thời gian nghiên cứu: từ 8/2017 đến<br /> <br /> lượng tốt, phản ứng PCR được thực hiện với<br /> việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu.<br /> Kĩ thuật PCR<br /> <br /> 9/2018.<br /> <br /> Exon 9 và exon 20 được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu [5].<br /> Codon<br /> Exon 9<br /> <br /> Exon 20<br /> <br /> Mồi<br /> <br /> Trình tự<br /> <br /> Mồi xuôi<br /> <br /> GGGAAAATGACAAAGAACAGCTC<br /> <br /> Mồi ngược<br /> <br /> TCCATTTTAGCACTTACCTGTGAC<br /> <br /> Mồi xuôi<br /> <br /> CTAGCCTTAGATAAAACTGAGCAAG<br /> <br /> Mồi ngược<br /> <br /> AGAGTTATTAACAGTGCAGTGTGGA<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> 23<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Thành phần của phản ứng gồm Mastermix<br /> <br /> bằng phần mềm ApE và Bioedit và phân tích<br /> <br /> 2X 12.5ul, mồi xuôi 0.5ul, mồi ngược 0.5ul,<br /> <br /> kết quả giải trình tự với gen gốc trên<br /> <br /> nước không nuclease 10.5ul, DNA 1ul.<br /> <br /> Genebank.<br /> <br /> Chu trình nhiệt: 95°C trong 5 phút, 35 chu<br /> kì 95°C trong 30 giây, 35 chu kì 57°C trong 30<br /> <br /> 3. Xử lí số liệu: sử dụng phần mềm SPSS<br /> 16.0.<br /> <br /> giây, 35 chu kì 72°C trong 30 giây, 72°C trong<br /> <br /> 4. Đạo đức nghiên cứu<br /> <br /> 5 phút.<br /> <br /> Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo<br /> <br /> Phản ứng được tiến hành trên máy PCR<br /> <br /> đức nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân và<br /> <br /> Mastercycler pro S của hãng Eppendorf - Đức.<br /> <br /> gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham<br /> <br /> Điện di sản phẩm PCR trên máy điện di<br /> <br /> gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi<br /> <br /> Consort EV243 trong gel 1.5%, khoảng 30<br /> <br /> nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham<br /> <br /> phút đánh giá xem đoạn gen được khuếch đại<br /> <br /> gia. Bệnh nhân và gia đình được thông báo về<br /> <br /> có đúng kích thước và ước lượng nồng độ<br /> <br /> kết quả xét nghiệm gen. Các thông tin cá nhân<br /> <br /> DNA.<br /> <br /> được đảm bảo bí mật. Nghiên cứu được sự<br /> <br /> Giải trình tự: theo qui trình và sử dụng<br /> <br /> chấp thuận của các cơ sở nghiên cứu. Đề tài<br /> <br /> phương pháp Big Dye terminator sequencing<br /> <br /> được hội đồng y đức của Trường Đại học Y<br /> <br /> (Applied Biosystems, Foster city, USA).<br /> <br /> Hà Nội thông qua số198/HĐĐĐĐĐHYHN ngày<br /> 21/9/2016.<br /> <br /> Quy trình thực hiện<br /> 1. Tinh sạch sản phẩm PCR.<br /> 2. Phân tích 0,1 thể tích DNA trên gel<br /> agarose .<br /> 3. Pha trộn hỗn hợp trong ống Eppendof<br /> gồm: hỗn hợp mastemix, Terminator ready<br /> Reaction Mix, primer và sản phẩm PCR. Mỗi<br /> phản ứng PCR sequencing sử dụng duy nhất<br /> một mồi. Chạy mẫu với chu trình nhiệt tối ưu.<br /> Tinh chế sản phẩm bằng ABI phenol/<br /> chloroform. Thu tủa DNA bằng ly tâm. Loại bỏ<br /> Ethanol. Để khô qua đêm.<br /> Phương pháp phân tích kết quả<br /> - Các nucleotid trên gen sẽ được biểu hiện<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên<br /> cứu<br /> Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trên 75<br /> bệnh nhân có tuổi trung bình là 58,8 ± 13,5,<br /> nam nhiều hơn nữ. Tuổi trung bình nhóm ung<br /> thư dạ dày thể ruột (65,3 tuổi) cao hơn tuổi<br /> trung bình nhóm ung thư dạ dày thể lan tỏa<br /> (53,2 tuổi) (bảng 1).<br /> 2. Kết quả xác định khuếch đại exon 9<br /> và exon 20 của gen PIK3CA<br /> Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 9 và<br /> <br /> bằng các đỉnh (peak) với 4 mầu tương đương<br /> <br /> exon 20 gen PIK3CA để khuyếch đại DNA sau<br /> <br /> với 4 loại nucleotid A,T,G,C. Phân tích kết quả<br /> <br /> tách chiết từ mẫu mô của bệnh nhân.<br /> <br /> 24<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu<br /> Thể ruột<br /> <br /> Thể ruột<br /> <br /> Thể lan tỏa Thể lan tỏa<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 23<br /> <br /> 63,89<br /> <br /> 23<br /> <br /> 58,97<br /> <br /> 46<br /> <br /> 61,33<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 13<br /> <br /> 36,11<br /> <br /> 16<br /> <br /> 41,03<br /> <br /> 29<br /> <br /> 38,67<br /> <br /> ≤ 60<br /> <br /> 11<br /> <br /> 30,56<br /> <br /> 27<br /> <br /> 69,23<br /> <br /> 38<br /> <br /> 50,67<br /> <br /> > 60<br /> <br /> 25<br /> <br /> 69,44<br /> <br /> 12<br /> <br /> 30,77<br /> <br /> 37<br /> <br /> 49,33<br /> <br /> Giới<br /> <br /> Tuổi<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> 65,3<br /> <br /> 53,2<br /> <br /> 58,8 ± 13,5<br /> <br /> 111bp<br /> <br /> 192bp<br /> <br /> Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR với<br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với<br /> <br /> cặp mồi exon 9 (111bp)<br /> <br /> cặp mồi exon 20 (192 bp)<br /> <br /> Giếng M: Marker 100 bp , giếng (-): mẫu âm, giếng 1042, 1456, 2317, 2956, 2996, 3028: mẫu<br /> bệnh nhân.<br /> Băng điện di rõ nét, đúng kích thước, không có sản phẩm phụ. Phản ứng PCR đã khuếch đại<br /> được đúng DNA đích đảm bảo cho bước giải trình tự tiếp theo<br /> 3. Kết quả đột biến gen và liên quan mô bệnh học<br /> Sản phẩm PCR được giải trình tự gen để phát hiện đột biến. Kết quả cho thấy đã phát hiện<br /> được 2/75 bệnh nhân có đột biến (2,67%).<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br /> 25<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 2. Các đột biến gen PIK3CA trong nghiên cứu của chúng tôi<br /> Số lượng<br /> đột biến<br /> <br /> Codon<br /> <br /> Mã đột biến<br /> <br /> Mã bệnh<br /> nhân<br /> <br /> Thay đổi<br /> DNA<br /> <br /> Thay đổi protein<br /> <br /> 1<br /> <br /> 542 (exon 9)<br /> <br /> c.1625delA<br /> <br /> 6082<br /> <br /> Dịch khung<br /> <br /> Thay đổi acid amin từ<br /> vị trí mất nucleotid<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1034<br /> (exon20)<br /> <br /> c.3102G > T<br /> <br /> D453<br /> <br /> GAG thành<br /> GAT<br /> <br /> p.E1034D<br /> <br /> Cả 2 đột biến đều chưa được công bố trước đó.<br /> c.1625delA<br /> <br /> Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân<br /> <br /> Kết quả giải trình tự gen của người<br /> <br /> mã số 8062<br /> <br /> bình thường<br /> Hình 3. Hình ảnh giải trình tự exon 9<br /> <br /> Giải trình tự exon 9 gen PIK3CA phát hiện bệnh nhân mã số 6082 có đột biến c.1625delA<br /> (codon 542) chưa được công bố. Đột biến mất nucleotid làm thay đổi acid amin, dịch khung<br /> protein tương ứng từ vị trí đột biến.<br /> c.3102G > T<br /> <br /> Người bình thường<br /> <br /> Bệnh nhân mã số D453<br /> <br /> Hình 4. Hình ảnh giải trình tự exon 20<br /> Giải trình tự exon 20 gen PIK3CA phát hiện bệnh nhân mã số D453 có đột biến sai nghĩa dị<br /> hợp tử chưa từng được công bố, thay thế nucleotid c.3102G > T dẫn đến bộ ba thứ 1034 GAG<br /> mã hóa acid amin glutamic chuyển thành GAT mã hóa acid amin aspartic.<br /> <br /> 26<br /> <br /> TCNCYH 117 (1) - 2019<br /> <br />