intTypePromotion=1
ADSENSE

Nghiên cứu ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên thực nghiệm

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

25
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tình trạng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy (TBMNMMNC) sau ghép tự thân trên thỏ được gây bỏng thực nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên thực nghiệm

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU GHÉP TẤM BIỂU MÔ NIÊM MẠC MIỆNG NUÔI CẤY<br /> TRÊN THỰC NGHIỆM<br /> Nguyễn Thị Thu Thuỷ*; Hoàng Thị Minh Châu*; Nguyễn Thị Bình**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá tình trạng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy (TBMNMMNC) sau ghép<br /> tự thân trên thỏ được gây bỏng thực nghiệm.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 15 thỏ được gây bỏng giác mạc, sau 2 tuần, sinh<br /> thiết biểu mô niêm mạc miệng để nuôi cấy tạo tấm biểu mô, sau đó ghép tự thân TBMNMMNC<br /> cho thỏ.<br /> Kết quả: biểu mô hoá hoàn toàn sau ghép 30 ngày ở tất cả thỏ, sau 60 ngày, chỉ 1 thỏ có<br /> tân mạch vào chu biên, nhưng không vào trung tâm giác mạc, tất cả thỏ còn lại đều cho kết quả<br /> tốt, giác mạc trong, tấm biểu mô áp nguyên vẹn, nhẵn bóng, không có tân mạch.<br /> Kết luận: phẫu thuật ghép TBMNMMNC thành công trên thực nghiệm, cho phép ghi nhận<br /> hình ảnh vi thể về sự tồn tại của TBMNMMNC trên giác mạc sau ghép.<br /> * Từ khoá: Giác mạc; Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy; Thực nghiệm; Thỏ.<br /> <br /> CULTURED ORAL MUCOSAL EPITHELIAL<br /> TRANSPLANTATION IN EXPERIMENt<br /> summary<br /> Purpose: evaluate the survival of cultured oral mucosal epithelial sheet after transplantation<br /> in rabbit.<br /> Subjects and methods: 15 rabbit eyes were caused burns, 2 weeks later, the oral mucosal<br /> epithelial cells of theses rabbits was cultured on amniotic membrane from biopsy-derived oral<br /> mucosal tissues. The autologous cultivated oral mucosal epithelial sheet was transplanted into<br /> ocular surface of rabbit burned eyes.<br /> Results: epithelialisation completed at 30 days of follow-up in all of rabbit eyes. After postoperative<br /> 60 days, there was 1 rabbit eye having moderate result with neovascularization at peripheral<br /> cornea, the rest 14 rabbit eyes have good results: the epithelial sheets survive, intact and clear,<br /> no neovascularization.<br /> Conclusion: cultured oral mucosal epithelial transplantation was successfully in experimental,<br /> is the scientific basis for the application in human.<br /> * Key words: Cornea; Oral mucosal epithelial sheet; Experimental; Rabbit.<br /> * Bệnh viện Mắt Trung ương<br /> ** Đại học Y Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Thu Thủy (thuyoph@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 07/03/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/03/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 29/04/2014<br /> <br /> 31<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Rối loạn bề mặt nhãn cầu nặng do suy<br /> giảm toàn bộ tế bào gốc (TBG) vùng rìa là<br /> một thách thức đối với các bác sỹ nhãn<br /> khoa, do mức độ khó khăn trong tiên lượng<br /> và điều trị. Biểu hiện của các rối loạn này<br /> là sự xâm lấn của biểu mô kết mạc, tổ<br /> chức xơ và tân mạch vào giác mạc, gây<br /> giảm thị lực trầm trọng, kèm theo các dấu<br /> hiệu kích thích cơ năng, làm ảnh hưởng<br /> lớn đến chất lượng sống của người bệnh.<br /> Phẫu thuật ghép TBG tự thân từ TBG<br /> vùng rìa của mắt lành để điều trị rối loạn<br /> bề mặt nhãn cầu 1 mắt là phương pháp<br /> tối ưu đã được áp dụng thành công trên<br /> thế giới và Việt Nam. Tuy nhiên, phương<br /> pháp này không áp dụng được cho bệnh<br /> nhân (BN) bị bệnh ở cả 2 mắt do không<br /> còn TBG. Phương pháp ghép dị thân đòi<br /> hỏi phối hợp thuốc ức chế miễn dịch toàn<br /> thân kéo dài để chống thải ghép, nhưng<br /> có nguy cơ cao gây tổn thương chức năng<br /> gan thận, nhiễm trùng toàn thân và tại chỗ,<br /> do đó chưa được áp dụng rộng rãi.<br /> Thời gian gần đây, ghép TBMNMMNC<br /> là giải pháp mới cho những BN bị rối loạn<br /> bề mặt nhãn cầu 2 mắt, đã được nghiên<br /> cứu trên thực nghiệm và áp dụng thành<br /> công trên người ở nhiều nước phát triển<br /> [1, 2, 4, 5]. Từ năm 2009 tới nay, Khoa<br /> Kết Giác mạc, Bệnh viện Mắt TW kết hợp<br /> với Bộ môn Mô phôi, Đại học Y Hà Nội<br /> tiến hành nghiên cứu và áp dụng phẫu<br /> thuật này, bước đầu cho kết quả khả quan<br /> trên lâm sàng.<br /> Để có minh chứng khoa học cho phương<br /> pháp ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng<br /> trong điều trị các bệnh lý rối loạn bề mặt<br /> nhãn cầu do tổn thương TBG, chúng tôi<br /> tiến hành ghép trên thỏ thực nghiệm để<br /> đánh giá khả năng sống và hình ảnh vi<br /> thể của TBMNMMNC sau khi ghép kiến<br /> tạo bề mặt nhãn cầu.<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 15 thỏ khoẻ mạnh, trọng lượng trung bình<br /> 2 ± 0,2 kg, được nuôi trong điều kiện phòng<br /> thí nghiệm 5 ngày trước khi làm thí nghiệm.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Gây bỏng giác mạc cho thỏ bằng phương<br /> pháp "in dấu" dung dịch NaOH 3% trên<br /> bề mặt giác mạc và vùng rìa trong 7 giây,<br /> rửa mắt bằng NaCl 0,9%, sau khi gây bỏng<br /> 1 phút<br /> Sau khi gây bỏng 2 tuần, thỏ được<br /> sinh thiết 1 mảnh niêm mạc ở mặt trong<br /> vùng giữa của má, kích thước 3 × 3 mm.<br /> Nuôi cấy tạo tấm biểu mô niêm mạc<br /> miệng theo quy trình và tiêu chuẩn tại<br /> Labo nuôi cấy Mô, Bộ môn Mô phôi, Đại<br /> học Y Hà Nội (quy trình này là một phần<br /> nội dung của Đề tài độc lập cấp Nhà<br /> nước “Nghiên cứu quy trình sử dụng TBG<br /> để điều trị một số bệnh của bề mặt nhãn<br /> cầu”, thuộc Bộ môn Mô phôi, Đại học Y<br /> Hà Nội, mã số ĐTĐL.2010T/15).<br /> Mỗi thỏ thực nghiệm được nuôi tạo 2<br /> tấm biểu mô niêm mạc miệng, 1 tấm dùng<br /> để ghép tự thân cho thỏ, 1 tấm dùng các<br /> kỹ thuật định danh kiểm tra chất lượng<br /> của tấm biểu mô.<br /> Ghép tự thân TBMNMMNC: gây mê tĩnh<br /> mạch tai thỏ bằng thiopental 10 mg/kg sát<br /> trùng mắt thỏ bằng dung dịch betadine<br /> 5%. Đặt vành mi. Mở kết mạc rìa 360º.<br /> Phẫu tích tổ chức màng xơ mạch trên<br /> giác mạc và củng mạc. Chuẩn bị diện<br /> ghép gồm: bề mặt giác mạc, vùng rìa và<br /> củng mạc quanh rìa, cách rìa giác củng<br /> mạc 5 mm. Trải tấm biểu mô nuôi cấy<br /> trên bề mặt nhãn cầu. Dùng chỉ 10/0 khâu<br /> cố định tấm biểu mô trên bề mặt nhãn<br /> cầu bằng các mũi chỉ rời. Kiểm tra độ<br /> 34<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> toàn vẹn của tấm biểu mô bằng test<br /> nhuộm fluorescein. Tra thuốc tại mắt phẫu<br /> thuật hàng ngày bằng dung dịch kháng<br /> sinh (cloroxit 0,4% × 4 lần/ngày), chống viêm<br /> (maxitrol × 4 lần/ngày).<br /> Đánh giá toàn trạng thỏ sau mổ, tình<br /> trạng mắt thỏ ở các thời điểm sau ghép 7<br /> ngày, 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày, 180<br /> ngày. Các tiêu chí đánh giá gồm: độ trong<br /> và áp của tấm biểu mô, sự toàn vẹn của<br /> bề mặt nhãn cầu và tân mạch giác mạc.<br /> Kết quả tốt: tấm biểu mô áp tốt, bề mặt<br /> <br /> nhãn cầu nhẵn, không có tân mạch hoặc<br /> tân mạch chỉ dừng ở rìa giác mác. Kết<br /> quả khá: tấm biểu mô áp, bề mặt nhãn<br /> cầu thô ráp nhưng không có tổn thương<br /> biểu mô, tân mạch qua rìa vào chu biên<br /> giác mạc. Kết quả xấu: tấm biểu mô bong<br /> hoặc bị tiêu hủy, hoặc có tổn thương biểu<br /> mô dai dẳng, hoặc tân mạch vào trung<br /> tâm giác mạc.<br /> Giết thỏ theo từng lô ở từng thời điểm<br /> theo dõi và kiểm tra cấu trúc vi thể của giác<br /> mạc thỏ đã được ghép TBMNMMNC.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả về tấm biểu mô nuôi cấy.<br /> Sau 2 tuần nuôi cấy theo phương pháp mảnh biểu mô, đã tạo được 2 tấm biểu mô<br /> niêm mạc miệng ở mỗi thỏ thực nghiệm. Tất cả tấm biểu mô đều phẳng, phủ kín đáy<br /> giếng nuôi cấy trên nền chất mang là màng ối, tách được dễ dàng và nguyên vẹn khỏi<br /> đáy giếng nuôi cấy trong thì phẫu thuật.<br /> Về cấu trúc siêu vi, tấm biểu mô gồm tế bào đa diện đều nhau, mỗi tấm có 3 - 5<br /> hàng tế bào, lớp ở trên dẹt dần, lớp trên cùng có vi nhung mao ngắn, giữa các tế bào<br /> có thể liên kết và cầu bào tương dài. Trong bào tương của lớp đáy, các bào quan rất<br /> phát triển. Lớp đáy gắn chặt với màng ối bởi thể bán liên kết.<br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh vi thể TBMNMMNC.<br /> 35<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> Khi định danh tấm biểu mô nuôi cấy có<br /> sự xuất hiện của p63 (dấu ấn nhận biết<br /> TBG của biểu mô), đặc biệt ở nhân tế bào<br /> lớp đáy. Nhuộm phát hiện K3 và K12 (thể<br /> hiện tế bào biệt hóa) thể hiện yếu ở tế<br /> bào lớp trên. Nhuộm PAS thấy không có<br /> sự xuất hiện của tế bào tiết nhày trong<br /> tấm biểu mô nuôi cấy.<br /> 2. Kết quả của thỏ sau ghép.<br /> Ở tất cả thời điểm theo dõi, mọi tấm<br /> biểu mô đều trong và áp tốt trên bề mặt<br /> nhãn cầu. Trong 7 ngày đầu khi làm test<br /> nhuộm fluorescein, 2 thỏ có giác mạc bắt<br /> màu thuốc nhuộm ở trung tâm khoảng<br /> 4 mm và xuất hiện tân mạch ở chu biên.<br /> Tuy nhiên, sau 15 ngày, diện bắt màu đã<br /> thu gọn còn 2 mm, tân mạch chu biên rút<br /> bớt chỉ còn ở vùng rìa. Sau mổ 30 ngày,<br /> biểu mô hoá hoàn toàn ở tất cả thỏ, test<br /> fluorescein (-), tân mạch hết hoặc chỉ còn<br /> <br /> ở quanh rìa, không cương tụ. Sau mổ 60<br /> ngày, 1 thỏ còn tân mạch qua rìa vào chu<br /> biên, nhưng không vào trung tâm giác<br /> mạc, tất cả thỏ còn lại đều có kết quả tốt,<br /> giác mạc trong, tấm biểu mô áp tốt, nhẵn<br /> bóng và không có tân mạch giác mạc.<br /> Ở mức độ vi thể, khi quan sát mẫu<br /> sinh thiết là giác mạc thỏ sau ghép ở các<br /> thời điểm thấy: sau ghép 7 ngày, tấm biểu<br /> mô áp sát nhu mô nhưng chưa dán chặt,<br /> nên khi làm tiêu bản dễ bị bong, lớp nhu<br /> mô trương phù, các lá collagen tách xa<br /> nhau. Từ giai đoạn 15 ngày sau ghép,<br /> tấm biểu mô áp và dán chặt vào lớp nhu<br /> mô, hiện tượng trương phù giảm rõ rệt và<br /> hết hẳn sau ghép 30 ngày. Ở các thời<br /> điểm lâu hơn, tấm biểu mô áp chặt vào<br /> nhu mô, giác mạc hết phù, tế bào sắp xếp<br /> rất đều đặn. Lớp tế bào trên cùng vẫn còn<br /> nhân và không có hiện tượng sừng hóa.<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh cấu trúc vi thể giác mạc thỏ sau ghép ở các thời điểm 7, 15, 30, 60, 180 ngày.<br /> <br /> 35<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Về cấu trúc mô học, tế bào biểu mô giác<br /> mạc và biểu mô niêm mạc miệng đều là<br /> biểu mô lát tầng không sừng hóa, có cùng<br /> nguồn gốc phôi thai từ ngoại bì da và có<br /> hình thái tế bào lớp đáy rất giống nhau.<br /> Năm 2003, Nakamura và CS đã nuôi cấy<br /> thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng<br /> trên nền nuôi cấy là màng ối và ghép tự<br /> thân cho thỏ bị bỏng giác mạc [3]. Sau đó,<br /> Hayashida và CS (2005) tiến hành ghép tự<br /> thân TBMNMMNC cho thỏ bị tổn hại TBG.<br /> Kết quả nuôi cấy tạo được tấm tế bào có<br /> hình dạng, cấu trúc siêu vi giống tế bào biểu<br /> mô giác mạc. Sau khi ghép cho thỏ, tấm<br /> biểu mô gắn chặt với mô nền của giác mạc,<br /> dai và trong suốt, hạn chế được tân mạch<br /> xâm nhập giác mạc [1].<br /> Kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên<br /> thỏ thực nghiệm cũng cho thấy TBMNMMNC<br /> có cấu trúc sinh học tương đồng với biểu<br /> mô giác mạc, có khả năng bám dính và<br /> tồn tại tốt trên mắt thỏ sau khi ghép. Tấm<br /> biểu mô có khả năng thay thế lớp biểu mô<br /> giác mạc của thỏ trong tổn thương suy<br /> giảm TBG, giúp duy trì sự ổn định, trong<br /> suốt của bề mặt nhãn cầu.<br /> So với kết quả nghiên cứu ghép<br /> TBMNMMNC để điều trị cho BN bị rối loạn<br /> bề mặt nhãn cầu nặng ở 2 mắt do suy<br /> giảm TBG [2, 4, 5], kết quả phẫu thuật ở<br /> thỏ có nhiều thuận lợi và thành công hơn<br /> so với phẫu thuật trên BN, có thể do quá<br /> trình gây bỏng thực nghiệm cho thỏ là chủ<br /> động với mức độ vừa phải, nên chỉ gây rối<br /> loạn bề mặt nhãn cầu ở lớp nông, không<br /> gây ra tổn thương sâu, không còn chất<br /> gây bỏng nằm sâu trong tổ chức, do đó<br /> không có phản ứng viêm dai dẳng sau<br /> phẫu thuật. Đồng thời, mắt thỏ luôn có 1<br /> nếp mí phụ có tác dụng che phủ và nuôi<br /> dưỡng rất tốt cho bề mặt nhãn cầu, lớp<br /> kết mạc của thỏ, đặc biệt là kết mạc mi và<br /> kết mạc ở lớp mí phụ còn nguyên vẹn,<br /> không bị tổn thương sau gây bỏng, nên<br /> chế tiết nước mắt giúp không bị ảnh<br /> hưởng sau bỏng, đây là lợi thế lớn giúp<br /> <br /> cho tấm biểu mô nuôi cấy của thỏ bám<br /> dính và được nuôi dưỡng tốt trên bề mặt<br /> nhãn cầu, không bị xâm nhập bởi tân<br /> mạch viêm.<br /> KẾT LUẬN<br /> Kết quả nghiên cứu thành công trên thỏ<br /> thực nghiệm là minh chứng khoa học cho<br /> phẫu thuật ghép TBMNMMNC, tạo cơ sở cho<br /> việc ứng dụng phương pháp này trên BN.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Hayashida Y et al. Ocular suface reconstruction<br /> using autologous rabbit oral mucosal epithelial<br /> sheets fabricated ex vivo on a temperature<br /> responsive culture surface. Invest Ophthalmol<br /> Vis Sci. 2005, 46, pp.1632-1639.<br /> 2. Inatomi T, Nakamura T, Koizumi N,<br /> Sotozono C, Yokoi N, Kinoshita S. Midterm<br /> results on ocular surface reconstruction using<br /> cultivated autologous oral mucosal epithelial<br /> transplantation. Am J Ophthalmol. 2006, 141 (2),<br /> pp.267-275.<br /> 3. Nakamura T et al. The successful culture<br /> and autologous transplantation of rabbit oral<br /> mucosal epithelial cells on amniotic membrane.<br /> Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003, 44, pp.106-116.<br /> 4. Nakamura T, Takeda K, Inatomi T,<br /> Sotozono C, Kinoshita S. Long-term results of<br /> autologous cultivated oral mucosal epithelial<br /> transplantation in the scar phase of severe<br /> ocular suface disorders. Br J Ophthalmol.<br /> 2011, 95, pp.942-946.<br /> 5. Satake Y, Higa K, Tsubota K, Shimazaki J.<br /> Long-term outcome of cultivated oral mucosal<br /> epithelial sheet transplantation in treatment of<br /> total limbal stem cell deficiency. Ophthalmology.<br /> 2011, 118 (8), pp.1524-1530.<br /> <br /> 2<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2