Đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume)

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này

Trước hết tôi xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban

Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường niềm kính trọng, sự tự hào

được học tập tại trường trong những năm qua.

Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh

Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và Th.s Nguyễn Trọng Lực –

Trưởng phòng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và

Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã tận tình

hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.

Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ

Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và các anh

chị trong Trung Tâm Ứng Dụng và Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và

Công Nghệ tỉnh Phú yên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt

thời gian tôi thực hiện đồ án này.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều

kiên, động viên, khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa

qua

Nha trang, ngày tháng 7 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Huỳnh Uyên

i

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ iv

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................................................. vi

LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1

Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 3

1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................ 3

1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) ................................ 3

1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào ................................................................... 3

1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào ................................. 4

1.1.2.3. Sự trẻ hoá ............................................................................................ 4

1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ...................................... 5

1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ............................... 6

1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV .................................................... 6

1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng................................................................... 7

1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo. ................................................................................. 7

1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn. .......................................................... 8

1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast ............................................................................. 9

1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời ............................................................. 9

1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn .......................................................................... 10

1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV .............................................................. 10

1.1.6.1. Khoáng đa lượng .............................................................................. 11

1.1.6.2. Khoáng vi lượng ................................................................................ 12

1.1.6.3. Nguồn cacbon ................................................................................. 12

1.1.6.4. Các vitamin ....................................................................................... 13

1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác ........................... 13

ii

1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ............................................ 14

1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................ 18

1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị ........................................................................... 18

1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy ...................................................... 18

1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh....................................................................... 19

1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ........................................................... 19

1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm ...................................... 20

1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV ............ 20

1.1.8.1. Điều kiện vô trùng ............................................................................. 20

1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ ......................................................................... 22

1.1.8.3. pH môi trường ................................................................................... 23

1.2. Giới thiệu về cây lan gấm .............................................................................. 23

1.2.1. Phân loại thực vật .................................................................................... 23

1.2.2. Đăc điểm thực vật ................................................................................... 24

1.2.3. Sự phân bố .............................................................................................. 26

1.2.4. Tính dược liệu và công dụng.................................................................. 26

1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm........................................................ 27

CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 28

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 28

2.1.3. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 28

2.2. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................... 29

2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. ......................................... 30

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu. ........................................................................... 30

2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. ............................................................. 30

2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm ................ 30

2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. ........................... 32

2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả

năng nhân nhanh chồi .................................................................................... 33

iii

2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

đến khả năng nhân nhanh chồi ...................................................................... 33

2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh ................................. 35

2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu. ........................................................................... 36

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 37

3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm ........................................... 37

3.1.1. Khử trùng bằng Javen ............................................................................ 37

3.1.2. Khử trùng bằng chlorine ........................................................................ 39

3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin ..................................................... 40

3.2. Tái sinh chồi .................................................................................................. 42

3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng thích hợp để nhân nhanh

chồi lan gấm ........................................................................................................ 45

3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng

nhân nhanh thể chồi ............................................................................................ 46

3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi.

........................................................................................................................... 47

3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh

chồi. ................................................................................................................... 49

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi .......... 50

3.5. Khảo sát quá trình nhân nhanh .................................................................. 53

3.6. Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm ..................................................... 55

CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 57

4.1. Kết luận ......................................................................................................... 57

4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 58

PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu ......................................................................... 31

Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của

vật liệu nuôi cấy ........................................................................................................ 33

Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi. ................................ 34

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. ..... 34

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi. ......... 35

Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh ................................................................ 36

Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen ...................................... 37

Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine ................................. 39

Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. ............................ 40

Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. ............... 41

Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy ............................................................... 42

Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm. ............. 45

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi ................... 47

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi .......................... 49

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51

Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh ............................................................... 53

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume ............................................ 25

Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. .............. 41

Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng .............................................................................. 42

Hình 3.3. Sự tái sinh chồi ......................................................................................... 44

Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng ........................ 46

Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau .................... 48

Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau ..................... 50

Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau .......................... 52

Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh ................................................................ 54

Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm .............................................. 55

Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm ............................................................... 56

vi

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

TBTV : Tế bào thực vật

DNA : Deoxyribonucleotic acid

RNA : Ribonucleotic acid

MS :Murashige&Skoog

VW :Vaccine và Went

KC :Kundson C

LS : Linsmainer và Skoog

ATP : Adenosine triphosphate

GA3 : Acid ascorbic

ĐTD : Đơn tử diệp

STD : Sông tử diệp

1

LỜI MỞ ĐẦU

Thế kỉ 21 được coi là thế kỷ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó

dược liệu là tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo. Nắm được, phát huy được tài

nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai. Dùng thế mạnh dược liệu đẩy

-

-

tộc.Từ lâu, người phương đông đã tôn hoa Lan là “ vương giả chi hoa” và người

phương tây cũng tôn hoa Lan là “ nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa Lan đã chinh

phục người phương Đông và người phươngTây không chỉ cấu trúc kì diệu và sự đa

dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà còn bỡi giá trị làm thuốc

của nó.

Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương

pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn

nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân

thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng

cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá

nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm

trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến

hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra

với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành

phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không

ngừng tăng lên của thị trường.. Đây là điều mà phương pháp truyền thống không

thực hiện được.

Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus

Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp

mà còn vì giá trị làm thuốc của nó. Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài

cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng

khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng

2

huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả

năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.

Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus. Blume là loại thảo dược có giá trị

và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự

nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm

thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng

trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan

Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang

nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007.

Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ

sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi

tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus

setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.

3

Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói

về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ

quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng [3]

Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện

như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực

vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo

mục tiêu và yêu cầu đặt ra.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả

nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở

ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh

tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và

nhiều vấn đề sinh học khác…

Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước:

- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi

phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau

trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn.

- Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu

lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.[3]

1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV)

1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào

Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả

năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi .

Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng

đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng

của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào

4

bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền

(DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào

đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”.

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của

phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng

minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng

rẽ.[7]

1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể

hiện một chức năng nào đó.

Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ

tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này

quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình

đó gọi là quá trình phản biệt hóa.

Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt

hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng

chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình

phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào.

Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao

nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.

Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các

tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa.

Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả

năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều

hướng từ ngọn xuống gốc.

1.1.2.3. Sự trẻ hoá

Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác nhau. Vì

vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu.

Trong nuôi cấy mô TBTV( hay còn gọi là nuôi cấy in vitro), các mẫu non trẻ có sự

5

phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong

nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh,

mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn.[7]

1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV

Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau:

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công

nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi được nuôi cấy

từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây.

- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân

dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp

hay đồng hợp.

- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí

nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu có kích

thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản

xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.

- Nâng cao chất lượng cây giống: cây được nuôi cấy đã được loại trừ các mầm bệnh

như virus, nấm, vi khuẩn … nên cấy giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh. Vì vậy, cây

giống tạo ra có sức sinh trưởng và phát triển tốt, năng suất cây trồng tăng 15-30%

so với phương pháp truyền thống.

- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác

nhau có thể tạo ra từ phương pháp nuôi cấy môTBTV như cây con in vitro (trong

ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi

hay là thân củ.

- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ

dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận

là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật

quốc tế.

6

- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời

gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.[4]

1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV

Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp nuôi cấy mô TBTV còn có những nhược

điểm:

- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều

năng lượng… nên giá thành sản xuất của cây giống cao so với các phương pháp

truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.

- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác

với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ

được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân

giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng

các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm

đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. [4]

1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV

Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm :

- Cấy cây : nuôi cấy cây con và cây lớn hơn

- Cấy phôi : gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành

- Cấy cơ quan : cấy các cơ quan thực vật tách rời

- Cấy mô hoặc mô sẹo : cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một

cơ quan thực vật

- Cấy tế bào và huyền phù tế bào : cấy các tế bào cô lập hoặc cụm tế bào rất

nhỏ trong môi trường lỏng

- Cấy tế bào trần : cấy teé bào trần thực vật là nuôi cấy những tế bào không

có thành (vách) được dùng trong kỹ thuật di truyền

- Cấy túi phấn (thể đơn bội) : cấy túi phấn hoặc những hạt phấn chưa trưởng

thành để thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo trong kỹ thuật di truyền.[3]

Trong các phương pháp được liệt kê như trên, các phương pháp thường được

áp dụng phổ biến như sau:

7

1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Trong nuôi cấy mô TBTV, một phương thức đơn giản và thường hay được

sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, có kích thước

từ 0,1 –0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện

dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường

không cao, Phương pháp này được ứng dụng tạo cây con sạch bệnh virus.[16]

Trên thực tế người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng

vài mm. Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách. Mỗi đỉnh sinh trưởng

nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển

thành cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó, có thể có ba khả năng:

- Cây phát triển từ chồi ngọn

- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ hạ diệp của cây

mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho rất nhiều mầm trên mô cấy và một số mầm

sau đó sẽ phát triển thành chồi và sau đó sẽ thành cây invitro hoàn chỉnh.

1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo.

Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã

phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh

trưởng thực vật…). Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ cây con vô trùng

trong ống nghiệm, rễ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng. Không phải tất

cả mọi tế bào trong mẫu cấy đều góp phần hình thành mô sẹo và chỉ có một số loại

mô sẹo nhất định mới có khả năng tái tạo lại các cơ quan có tổ chức. Mô sẹo là

nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế

bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi

soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… Các tế bào thuộc các mô

hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên.

Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình:

8

- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm

các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.

- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn STD dễ

dàng phân chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở

các loài cây cỏ hay dây leo.

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được

ưu tiên áp dụng ở ĐTD (đơn tử diệp), vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô

khó phản phân hoá so với STD (song tử diệp). Màu sắc của mô sẹo không giống

nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và

chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…

Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu

tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường mô sẹo được hình

thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau

hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây.

Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong

mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy

mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh

mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy.[16]

1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn.

Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh

phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tử, các hạt

phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù cảu bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân

tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi

Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn

khác nhau. Vì vậy mỗi chồi hoa phải kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát

triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy.

Có hai phương pháp cơ bản trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là :

9

- Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng

và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn.

- Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học hoặc

do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng.[16]

1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast

Nuôi cấy protoplast được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông

là người đầu tiên dùng enzyme để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ

tế bào rễ cà chua. Trong điều kiệ nuôi cấy phù hợp protoplast có thể táo sinh thành

tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Do không có thành tế bào nên protoplast trở thành một đối tượng lý tưởng

trong nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai

protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung

hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene.[4]

1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi nho dai, cùng với một số tác giả khác, ông

đã chứng minh các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều

hơn.

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây

là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng

đường và các muối của các nguyên tố đa lượng (nitơ, phospho, kali, canxi) và vi

lượng (magiê, sắt, mangan, cobê, kẽm,…). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như

vitamin (B1, B6, B3…) và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng

và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường

mới.

Dối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đôi với nuôi

cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ ở dạng acid

amine, có đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh

10

trưởng có vai trò quan trọng hơn vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp chất

này. [4]

1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể

được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy

tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX.

Tế bào đợn có thể ghi nhân bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng

enzyme. Mỗi loiạ cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy

khác nhau.

Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu

ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân

hóa của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.[4]

1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết

cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực

vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục

đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như

MS (Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường

MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong

nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá

mầm, 2 lá mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên

đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần.

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định

đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật

liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi trường thích hợp để

phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật.

11

Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ

bản sau :

+ Các khoáng đa lượng

+ Các khoáng vi lượng.

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin

+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

+ Các chất điều hòa sinh trưởng.

+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar

1.1.6.1. Khoáng đa lượng

Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên

30 ppm tức là 30mg/l. Những nguyên tố đó là : N, Fe, P, K, Ca, Mo. Riêng Na và Cl

cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng

- Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như

ammonium và nitrate. Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và trạng

thái phát triển của mô. Nitrogen được cung cấp dưới NO3 -, NH4+ [3]

- Phospho ( P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó

tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng. Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4 - và HPO4 2- còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong

quá trình nuôi cấy.

- Kali ( K): K+ là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các

anion vô cơ và hữu cơ. Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trò chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi

trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ

hấp thu photphate. Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat

(KNO3), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH2PO4) [3]

- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự có mặt của Ca2+ rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm. Sự ổn định

12

của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bỡi ion Ca 2+. Sự thiếu hụt Ca2+ sẽ làm tăng

quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào. Canxi được cung cấp dưới

dạng canxi nitrat ( Ca(NO3)2.4H2O) canxi clorua (CaCl2.6H2O)

- Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến quá

trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme lien quan trong biến dưỡng

cacbonhydrat sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu hết ion Mg2+ đều đc sử dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân bằng anion và

cation. Nếu thiếu hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA. Kết quả là cấu trúc

và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra thiếu hụt Mg, là

yếu tố không thể thiếu trong quá trình trao đổi năng lượng cảu thực vật bỡi vì nó có

vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP. Mg được cung cấp dưới dạng magiê

sunphat ( MgSO4.7H2O)

- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2,

FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6). Hiện nay hầu hết các phòng

phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylene Diamine

Tetra Acetate (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng tư từ ra môi

trường theo nhu cầu mô thực vật.[3]

1.1.6.2. Khoáng vi lượng

Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi

trường nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt

động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên

tố đa lượng. Các dung dịch vi lượng thường dùng là : Nistch (1951), Heller (1953),

Murashige – skoog ( 1962).[7]

1.1.6.3. Nguồn cacbon

Trong nuôi cấy mô TBTV, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể quang hợp

hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung

các hợp chất hydratcacbon. Nguồn hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường

13

saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V). Những loại đường khác như fructose,

glucose, maltose, sorbitol,... rất ít dùng [7]

1.1.6.4. Các vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamincần thiết cho sự tăng trưởng và

phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác

nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy invitro một vài vitamin trở thành yếu tố giới

hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong

nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol.

Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào.

Thiamine thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 – 10mg/l. Acid nicotini và

pyridixine thường được bổ sung vào môi tường nuôi cấy nhưng cũng không cần

thiết cho sự tăng trưởng của nhiều loài thực vật. Acid nicotinic được sử dụng với

nồng độ từ 0,1 – 5 mg/l. Pyrdoxine thường được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10mg/l.

Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù đây là

một cacbonhydrate chứ không phải là vitamin nhưng nó cũng được chứng minh là

kích thích sự tăng trưởng tế bào đa số loài thực vật.[4]

Các vitamin khác như biotine, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid,

vitamin E … cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy.

Inositol cũng được đề cập tới như một loại vitamin có tác dụng kích thich sự

sinh trưởng và phát triển của cây một cách đáng kể.[13]

1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các aminoacid cần thiết nhưng sự

bổ sung các aminoacid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của

tế bào. Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào và tế bào

trần. Amino acid cung cấp cho thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của

tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.[3]

Các nguồn nitrogen thường sử dụng trong nuôi cấy mô TBTV là hỗn hợp amino

acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adnine.

14

1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa học

khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ phận nhất

định của cây để điều hòa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh trưởng và phát

triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, các bộ phận trong

cơ thể thực vật.

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào,

phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh

hưởng mạnh đến những quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá

trình sinh tổng hợp các enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp … Chính vì vậy

chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng phát triển của cây. Các chất điều hòa sinh

truỏng bao gồm những chất sau:

a.Auxin

Auxin là chất điều hòa sinh trưởng được nghiên cứu đầu tiên với việc xác

định cấu trúc hóa học đầu tiên vào năm 1934. Auxin là chất xúc tác cho sự sinh

trưởng của cây trồng , có phổ hoạt động rộng hơn giberelin. Tác động sinh lý của

auxin đối với thực vật rất phức tạp. Các mô thực vật khác nhau có phản ứng khác

nhau đối với tác động của auxin. Hoạt động của auxin tùy thuộc vào nồng độ và sự

tác động tương hỗ giữa chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác.[3]

Auxin kết hợp chặt chễ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi

cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát

sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinine. Khi nồng

độ cytokinine cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy, ngược lại hoặc khi chỉ

xử lý với auxin thì rễ sẽ được tạo thành.. [3] [10]

Auxin đẩy mạnh sự sinh trưởng thông qua sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là

do chúng thúc đẩy các hoạt động của enzyme, làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế

bào làm cho sự xâm nhập của nước vào trong tế bào được dễ dàng, giảm sức đề

kháng của thành tế bào và tế bào tự kéo dài ra. Auxin hoạt hóa các quá trình sinh

tổng hợp các chất cao phân tử ( protein, xenluloza, pectin,… ) và ngăn cản sự phân

15

giải chúng. Vì vậy, chúng có tác dụng làm chậm trễ quá trình già hóa, kích thích ra

rễ và xúc tiến sự sắp xếp của những rễ bất định.

Nồng độ sử dụng của auxin liên quan chặc chẽ đến sự chiếu sáng, nhiệt độ và

sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng khác.

Năm 1957 Skoog và Miller nuôi cấy mô cây thuốc lá cho thấy khả năng tạo

chồi ở môi trường có nồng độ cytokinine cao và auxin thấp, tạo rễ trong môi trường

có nồng độ cytokinine thấp vào auxin cao. Sau đó một vài năm, sự hình thành phôi

sinh dưỡng bằng cách nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D vì thế auxin chỉ được

sử dụng trong giai đoạn đầu của sự hình thành rễ bất định và phát sinh phôi soma,

sau đó trở thành chất ức chế của các cơ quan và phôi mới được hình thành.

Các chất điều hòa sinh trưởng trong nhóm auxin được biết đến như IBA (3-

Indolbutyric acid); IAA (3-Indolacetic acid); NAA (Naphtalenacecetic acid); 2,4D (

acid 2,4 Dichloropphenoxy acetic).

b. Cytokinine

Cytokine được phát hiện trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật

vào năm 1945-1955. Nhưng đến năm 1965, Miller mới tách được chất hoạt tính

sinh học này với tên gọi là kinetin, sau đó mới xác định được cấu trúc hóa học của

nó. Cytokine là chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng đẩy mạnh sự sinh

trưởng của cây trồng.[6]

Cytokinine có khả năng kích thích sự phân chia tế bào, tính đặc hiệu của nó

là kích thích quá trình phân bào giảm nhiễm. Bên cạnh đó cytokinine có vai trò

quan trọng trong quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan. Để thực hiện

được quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan thì cytokinine phải kết hợp

với auxin hoặc giberelin. Nếu vắng mặt auxin hoặc giberelin thì quá trình phân hóa

tế bào và tạo mới các cơ quan sẽ không hiệu quả auxin thúc đẩy quá trình nhân đôi

DNA và cytokinine cho phép tách rời các nhiễm sắc thể. [6]

Trong nuôi cấy mô tế bào thực, cytokinine đẩy mạnh quá trình hình thành

chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo. Cytokinine rất có hiêu quả trong vai trò

16

kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên

mô thực vật nuôi cấy invitro.

Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinine sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh

hình thái mẫu cấy, khi nồng cytokinine cao hơn nồng độ cytokinine thì kích thích sự

tạo chồi và ngược lại nồng độ auxin cao hơn cytokinine thì kích thích sự tạo rễ.

Nồng độ cytokinine cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ đồng thời cũng ngăn

cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin.

Đại diện chính của cytokinine là kinetine được phát hiên trong dịch thủy

phân nấm men. Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong

tối, tăng cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia tế

bào khi nuôi cấy tế bào rời.

Trong nhóm cytokinine còn bao gồm các chất thường được sử dụng phổ biến

trong nuôi cấy mô: BA (6-benzylaminopurin) và TDZ (1-phenyl 3-(1-2,3 thiadiazol-

5yl) urea); Zeatine

c. Giberelin

Giberelin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất

khác nhau. Hoạt động của mỗi chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển qua mô hoặc

sự biến đổi nó thành một dạng hoạt động khác. Acid giberelic (GA3) và hỗn hợp

giũa GA3 và GA7 là những giberelin duy nhất có giá trị thương phẩm do chúng

thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Khi bổ sung giberelin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật thì chúng thường

có tác dụng như auxin tự nhiên, sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi,

Acid giberelic có ảnh hưởng chủ yếu lên sự phân hóa tế bào invitro ngoài sự

tác động của auxin. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và mẫu

cấy chồi cũng có thể tăng thêm khi bổ sung acid giberelic.[3][13]

d. Ethylene

Ethylen là chất điều hoà sinh trưởng dạng khí. Ethyllen có rất nhiều tác dụng

đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Đã từ lâu vai trò của

ethyllen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng

17

dụng nhiều. Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethyllen lên sự kéo

dài thân và rễ, kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy mầm, tạo

lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vận chuyển ngang và xuống của auxin. [7]

1.1.6.7. Các chất bổ sung

a. Nƣớc dừa

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và

chất kích thích sinh trưởng [15]. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa

và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường được lấy từ quả dừa

để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5- 20%

thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi.[4]

b. Dịch chiết nấm men

Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào.

Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế

bào động vật với nồng độ thích hợp.

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1- 1%) hoặc

bột chuối với hàm lượng 40g bột tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan

nuôi cấy.

c. Agar

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá

môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6- 10%, đây là loại tinh bột đặc chế

từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu O2

nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh

d. Than hoạt tính

Thường được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản

phẩm trao đổi chất thứ cấp... Trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức

chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào môi trường, than

hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở nên sẫm vì vậy có thể

kích thích quá trình tạo rễ, một số trường hợp còn có tác dụng thúc đẩy phát sinh

phôi vô tính và kích thích sinh trưởng phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ. Tuy

18

nhiên, than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng. Nồng

độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 - 0,3 % (w/v).

1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị

Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn nguyên liệu thực

vật vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy. Khâu đầu tiên của giai đoạn này có

thể coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy.

Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi

trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ

động nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm

trẻ hoá vật liệu giống. Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và

xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng.

Người ta thường sử dụng một số loại hoá chất như: HgCl2 0,1 %, cồn 700,

H2O2, Ca(OCl)2...để khử trùng mẫu cấy .Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy

mà lựa chọn loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp.[7]

1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu vật đã được

khử trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Về nguyên tắc thì mô nuôi cấy có

thể là bất kỳ bộ phận nào của cây lấy từ các phần non của cây (thân, rễ, lá,…)

nhưng theo Bhatt thì mô nuôi cấy lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy

thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác. Vì vậy, người ta

thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro.

Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của cây mô, các

mô ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh

chồi tốt hơn

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống

cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Giai đoạn này thường kéo dài trong 4-6 tuần.

19

1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với

các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy giai đoạn

nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống.

Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi mầm cung cấp

cho giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn 2 và cấy

chúng lên môi trường mới theo định kỳ. Phải xác định được môi trường dinh dưỡng

và môi trường vật lý phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất. Trong giai đoạn này thì vai

trò của các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất phụ

gia (nước dừa, chuối, khoai tây…) là cực kỳ quan trọng. Tuỳ vào đối tượng nuôi

cấy mà người ta có thể nhân nhanh theo hướng kích thích sự hình thành cụm chồi

hoặc kích thích sự phát triển của chồi nách

Mặt khác, cũng cần đảm bảo các nhân tố vật lý (nhiệt độ, ánh sáng …) phù

hợp. Trong giai đoạn này cần tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ ngày, cường độ ánh

sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích mô phân hoá

mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt 20-300C

Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra hệ số cao nhất nhưng không ảnh hưởng

đến sức sống và bản chất di truyền của cây.

1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ môi

trường ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hoàn

chỉnh. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành

cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng

lượng auxin để rễ phát triển. Các chất α- NAA, IBA, IAA thường được sử dụng ở

nồng độ 0,1-5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng. Lúc này cây con rất

nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây

chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng

20

1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài

trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi

trường tự nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp (chiều cao, số lá, rễ) thì mang

trồng. Giá thể phải đảm bảo tơi xốp và sạch bệnh. Trong 2- 3 tuần đầu cần duy trì

độ ẩm trên 50%, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh nhiễm khuẩn và nấm

gây hiện tượng thối nhũn. Điều kiện môi trường trong giai đoạn này là rất quan

trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng cáp và phòng bệnh cho cây. Đây

được xem là công đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn

sản xuất.

1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV

1.1.8.1. Điều kiện vô trùng

a. Vô trùng mẫu cấy

Mẫu cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống,

phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…Tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên

ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng lúa non khi còn

trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân

đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất

cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào

bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt. Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng

trong mùa khô nhưng không thể làm được trong mùa mưa. Phương pháp vô trùng

mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm

khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý,

nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô

cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động

và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy

trong vòng 30s trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.

21

Đồng thời người ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo,

Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn.[14]

b. Vô trùng dụng cụ và môi trƣờng nuôi cấy

Dụng cụ thuỷ tinh

Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được

xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử dụng; về sau

chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử

dụng.

Trong trường hợp các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy

mô và tế bào thực vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở nhiệt độ cao

trong nhiều phút hoặc nhiều giờ. Các dụng cụ này luôn được gói trong giấy nhôm

hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử trùng.[17]

Nút đậy

Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.Nút

phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi

trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm

nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có các nhược điểm sau:

- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất dễ bị

nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời gian dài

- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui mô lớn

- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ

Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các

hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng.

Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm bằng inox hoặc cao su rất thuận tiện

cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy…

Môi trường

Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave),

khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi

22

nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C. Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào

tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông để tránh bị

nhiễm trở lại.[17]

Việc hấp khử trùng bằng nồi hấp thì không thích hợp với nhiều hoá chất

nhạy cảm với nhiệt độ như: các acid amin, các vitamin, các hormon tăng trưởng, và

các chất kháng sinh. Các chất như vậy thường phải được khử trùng bằng cách lọc vô

trùng. Màng lọc được làm bằng màng polyethylen hoặc sợi cellulose. Các lỗ trên

màng siêu lọc này được thiết kế hiệu quả cho việc giữ lại các vi sinh vật gây nhiễm.

Lọc vô trùng

Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hoặc dùng các

phểu lọc thủy tinh xốp số 5. Một số loại màng lọc vô trùng của hàng Millipore. Đây

là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1 lần

Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp màng lọc

và giá đỡ bằng nhựa hịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có

đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế,

vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng

cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclave ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô

trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua

bộ lọc.[17]

1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu

tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.Thời gian

chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng

thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến

sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi

cấy là 1000 lux (Morein, 1974), chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát

sinh hình thái của mô thực vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân

23

chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế

sinh trưởng chiều cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo.

Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có

cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình

nuôi cấy từ 35- 40 cm.

Nhiệt độ : có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi

cấy in-vitro. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho

phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 20-250C. Một số loại cây cần có nhiệt độ tối ưu để tạo hình

1.1.8.3. pH môi trường

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong

nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần

thiết của thí nghiệm. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá

trình dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng loại môi trường

nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi

trường về mức ổn định ban đầu.[4]

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0. pH

dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất

cứng.

1.2. Giới thiệu về cây lan gấm

1.2.1. Phân loại thực vật

Lan Gấm Anoectochilus setaceus Blume

đồng danh là Anoectochilus roxburghi Wall

Họ: Phong lan Orchidaceae

Bộ: Phong lan Orchidales

Chi Lan Gấm (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp

dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ

Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê

24

được 12 loài, trong đó loài Lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) được biết

đến chủ yếu với công dụng làm thuốc.

1.2.2. Đăc điểm thực vật

Lan gấm là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước

mang 2-6 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có

mũi ngắn, cỡ 3-5 x 2-3cm. Lá thông thường có màu nâu đỏ ở mặt trên. Số lượng lá

trên cây thay đổi từ 2-6 lá, thông thường có 4 lá. Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè

trên mặt đất. Kích thước của lá cũng thay đổi, thường dài từ 3-5cm, trung bình là

3,5cm và rộng của lá từ 2-4cm, trung bình là 3cm. Các lá trên một cây thường có

kích thước khác nhau rõ rệt. Chiều rộng trung bình của các lá trên một cây là 2,5cm.

Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu

hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có

màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở

giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,5 - 1,2cm, thường nhẵn và có màu

trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Đôi khi có một số cây thì

toàn bộ lá có màu xanh lục sẫm. Tuy nhiên, hệ thống gân lá rất giống với loài đã mô

tả. Một số lá lại có 2 màu. Phía ngoài màu nâu đỏ, phía trong màu xanh vàng nhạt.

Đối với những lá này thì gân ở giữa lá không rõ. [16]

Hoa tự chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 5-20cm, thường phủ lông màu

nâu đỏ, mang từ 4-10 hoa. Mùa hoa nở tháng 9-12. Mùa quả chín tháng 12-2 năm

sau. Hoa có cánh môi màu trắng. Hai bên rìa mang từ 6-8 râu mỗi bên

Về mặt cấu tạo, lan gấm có các đặc điểm sau:

Đặc điểm thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò

dài. Chiều dài thân rễ từ 5-14cm, trung bình là 9,4cm. Đường kính thân rễ từ 2,5-

4,0cm, trung bình là 3,05cm. Số lóng trên thân rễ từ 3-10 lóng, trung bình là 4,71

lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6cm, trung bình là 2,01cm. Thân rễ thường có màu

xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.[9]

25

Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume

Đặc điểm thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất,

ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-6cm, trung bình 5,4cm. Đường

kính thân khí sinh từ 2,5-3,5cm, trung bình là 2,98cm. Thân khí sinh mang nhiều

lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4

lóng, trung bình là 3,6. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4cm, trung bình 1,52cm. Thân khí

sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi

có màu hồng nhạt.[9]

Đặc điểm của rễ: Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng

được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường

mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân

rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây

thường từ 4-10 rễ, trung bình là 5,9 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-10cm, rễ dài

nhất trung bình là 5,03cm và ngắn nhất trung bình là 0,96cm, chiều dài trung bình

của các rễ trên một cây là 3,47cm.[9]

26

Đặc điểm lá cây: Số lượng lá trên một cây thay đổi từ 2-6 lá, thông thường

có 4 lá. Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Kích thước của lá cũng

thay đổi, thường dài từ 3-5cm, trung bình là 3,75cm và rộng của lá từ 2-4cm, trung

bình là 2,95cm. Các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.[9]

1.2.3. Sự phân bố

Lan gấm rất khó tìm, vì cây mọc rải rác trong rừng sâu, vùng núi đá vôi, nơi

ẩm, dọc theo khe suối, ở độ cao 300-1000m Ở Việt Nam, lan gấm thường phân bố ở

các tỉnh: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quảng Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo),

Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kom Tum (Đắc Tô: Đăc

Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng), Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Thuận …

Trên thế giới, lan gấm thường gặp ở các nước: Trung Quốc (Vân Nam,

Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia, Nhật Bản, Nêpan, Xri Lanca, Việt Nam

1.2.4. Tính dược liệu và công dụng

Lan gấm là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí

huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn

tính, chữa suy nhược thần kinh. Theo Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến thì loài

lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp

xương, viêm dạ dày mãn tính . Trước đó, trong sách Khoa học quốc dược quyển I

kỳ 2 (năm 1958) của ông Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào (đăng tải trong tạp chí Đài

Loan dân gian dược dụng thực vật) có nói đến lan Gấm (A.setaceus) là một trong

những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan

Theo đông y, lan gấm có vị ngọt, hơi chát, tính mát, có tác dụng dư âm

nhuận phế, làm mát phổi, máu sinh tân dịch, tiêu viêm, lọc máu. Do đó, lan gấm

được dùng để chữa lao phôi, khô phổi, ho, khạc, ra máu, thần kinh suy nhược chứ

không phải chữa tim mạch hay ung thư như mọi người đồn đại.

Theo một số chuyên gia ở Đài Loan, cây lan gấm vô cùng quý giá, có bán tại

các tiệm thuốc Bắc trong nhân dân, là một loại cây nổi tiếng, có tác dụng làm tăng

cường sức khỏe và lưu thông khí huyết. Ngoài ra, cây lan gấm còn dùng để chữa

27

thần kinh suy nhược, chữa ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận, chữa di tinh,

đau lưng, phong thấp làm tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt, chữa các bệnh khí quản,

viêm gan mãn tính.

1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm

Năm 2001: các tác giả Yih-Juh Shiau và cộng sự đã nghiên cứu và nhân

giống thành công loài lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata từ hạt đem lại

triển vọng sản xuất số lượng lớn loài lan này.

Năm 2005: các tác giả Ông Chun-nian He và cộng sự đã nghiên cứu các hợp

chất có trong loài lan gấm Anoectochilus roxburghi và tìm ra đăc tính lâm sàng cụ

thể và hiệu quả của loại cây thảo dược này.

Năm 2004: Tiến sĩ Nguyễn Văn Kết cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in

vitro thành công cho loài lan Kim tuyến ( A. formosanus) với vật liệu ban đầu là từ

chồi đỉnh tại trường Đại học tổng hợp quốc gia Hàn Quốc. Năm 2009: Phùng Văn

Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng nghiên cứu về Đặc điểm hình thái,

phân bố của loài lan oectochilus setaceus blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh

Vĩnh Phúc

Năm 2010: Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành

đã nghiên cứu về quá trình nhân nhanh chồi của lan gấm.

28

CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu đề tài là cây lan gấm (Anoectochilus setaceus Blume)

được Trung tâm ứng dụng và chuyển giao công nghệ - Sở khoa học và công nghệ

Tỉnh Phú Yên thu thập trên địa bàn tỉnh Phú Yên và trồng thử nghiệm tại trung tâm

Nguồn mẫu bình giống tại phòng nuôi cấy mô của Trung tâm ứng dụng và

chuyển giao công nghệ tỉnh Phú Yên

2.1.2. Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy sử dụng các loại môi trường cơ: MS (Murashige và

Skoog, 1962) VW (Vacin và Went, 1949), KC (Kundson C), ngoài ra môi trường có

bổ sung các thành phần như:

- Đường 20g/l

- Agar 6,5g/l

- Nước dừa 10% thể tích

- Môi trường được điều chỉnh pH = 5,8

Tùy vào mục đích thí nghiệm, trong môi trường bổ sung các chất điều hòa

sinh trưởng : NAA, BA, TDZ, Kinetine,… với nồng độ khác nhau.

Môi trường sau khi pha chế được đổ vào bình tam giác có dung tích 250ml

với lượng 60 ml môi trường/bình. Các bình được đem đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phút. Sau đó, chúng được lưu giữ ở điều kiện 25oC trong

5-7 ngày để kiểm tra độ nhiễm trước khi cấy mẫu.

2.1.3. Điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ phòng cấy: 25 ± 2oC

- Cường độ chiếu sáng: 2000 ÷ 3000 lux

- Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày

29

Độ ẩm phòng nuôi: 60% – 70%

2.2. Nội dung nghiên cứu.

Quy trình nghiên cứu dự kiến như sau:

Chất khử trùng là Javen

Chất khử trùng là chlorine Thí Nghiêm 1: Nghiên cứu khử trùng mẫu

Kết hợp chất khử trùng là chlorine và Javen

Không có chất điều hòa sinh trưởng

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tái sinh chồi

Có chất điều hòa sinh trưởng: BA, TDZ, Kinetin.

Môi trường MS (Murashige&Skoog) Thí nghiệm 3:

Nghiên cứu ảnh

hưởng môi trường

khoáng thích hợp

Môi trường VW ( Vacine & Went) Môi trường MS/2 (Murashige&Skoog) nuôi cấy lan gấm

nhanh chồi Môi trường Knudson C

BA: 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; Thí nghiệm 4:

2,0mg/l Nghiên cứu ảnh

hưởng chất điều Kinetine: 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; hòa sinh trưởng 2,0mg/l đến khả năng nhân

TDZ : 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,6mg/l; nhanh chồi

0,8mg/l

30

Nồng độ BA tối ưu + Nồng độ TDZ

tối ưu

Nồng độ BA tối ưu + Nồng độ Thí nghiệm 5: kinetine tối ưu

Nồng độ Kinetine tối ưu + Nồng độ

Khảo sát khả năng

Nồng độ BA tối ưu + Nồng độ TDZ

nhân nhanh TDZ tối ưu

tối ưu+ Nồng độ Kinetine tối ưu

2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu.

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô – tế bào thực vật thuộc

Trung tâm ứng dụng và chuyển giao công nghệ - Sở khoa học và công nghệ tỉnh

Phú Yên

Thời gian thực hiện đề tài : từ 27/02/2012 – 25/06/2012

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.

2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm.

Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành

2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm

Nghiên cứu nhằm xác định nồng độ, thời gian, loại hóa chất khử trùng phù

hợp nhất cho vật liệu nuôi cấy.

 Vật liệu vô mẫu: thân khí sinh

 Môi trường nuôi mẫu: MS

 Thao tác tiến hành vô mẫu

Bước 1: Mẫu được xử lý bên ngoài bằng dung dịch xà phòng loãng và

được rửa sạch dưới vòi nước chảy trong 10 – 15 phút

31

Bước 2: Mẫu được đưa vào trong box cấy và khử trùng mẫu bằng cồn 70o

trong 1 phút sau

Bước 3: Khảo sát chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng :

- Javen: với nồng độ và thời gian theo bảng 2.1

- Chlorine: với nồng độ và thời gian theo bảng 2.1

- Javen kết hợp Chlorine : nồng độ và thời gian theo bảng 2.1

Qua mỗi lần khử trùng rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần.

Bước 3: Cấy mẫu vào môi trường nuôi mẫu.

Vật liệu được cắt thành các đoạn có kích thước 2cm và có 1-2 đốt thân rồi

cấy vào môi trường: MS

Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu

Công thức thí nghiệm

Nghiệm Javen Chlorin

thức Tỉ lệ Thời gian Nồng độ Thời gian

Javen: nƣớc cất (phút) (%) ( phút)

1:1 5 NT1

1:1 10 NT2

1:1 15 NT3

1:1 20 NT4

2:1 5 NT5

2:1 10 NT6

2:1 15 NT7

2:1 20 NT8

3:1 5 NT9

3:1 10 NT10

3:1 15 NT11

3:1 20 NT12

5 5 NT13

32

NT14 5 10

NT15 5 15

NT16 10 5

NT17 10 10

NT18 10 15

NT19 15 5

NT20 15 10

NT21 15 15

NT22 10 5 2:1 5

NT23 10 5 2:1 10

NT24 5 10 2:1 5

NT25 5 10 2:1 10

NT26 10 10 2:1 5

NT27 10 10 2:1 10

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 10 mẫu/lần lặp

Thí nghiệm được đánh giá sau 1, 4, 6, 8 tuần nuôi cấy,

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tái sinh

Tỷ lệ mẫu chết

Tỷ lệ mẫu nhiễm

2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi.

 Vật liệu: chồi đốt thân

 Môi trường nuôi cây: MS

 Chất điều hòa sinh trưởng:

- Nghiệm thức 1: 0,3mg/l BA

- Nghiệm thức 2: 0,3mg/l Kinetin

- Nghiệm thức 3: 0,1mg/l TDZ

- Nghiệm thức 4: 0,3mg/l BA + 0,3mg/l Kinetin + 0,1mg/l TDZ

- Nghiệm thức 5: Không có chất điều hòa sinh trưởng

33

 Thí nghiệm được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy

 Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 3 mẫu/lần lặp

 Chỉ thiêu thu thập: Số chồi/ mẫu.

 Đặc điểm chồi tái sinh.

2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng

nhân nhanh chồi

 Vật liệu: Đốt thân

 Môi trường nuôi cấy: theo bảng 2.3

 Thí nghiệm có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng: 0,3mg/l BA + 0,3mg/l

Kinetine + 0,1mg/l TDZ

Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của

vật liệu nuôi cấy

Môi trƣờng

MS ½ MS KC VW

Vật liệu

Đốt thân

Thí nghiệm được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 3 mẫu/lần lặp

Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu

Đặc điểm chồi.

2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả

năng nhân nhanh chồi

a. Thí nghiệm 4.1: Khảo sát ảnh hƣởng của BA đến khả năng nhân

nhanh chồi.

 Vật liệu: đốt thân

 Môi trường nuôi cấy: tối ưu trong thí nghiệm 3

 Chất điều hòa sinh trưởng: bổ sung nồng độ BA theo bảng 2.4

34

Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi.

Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l)

NT1 (Đ/C) 0

NT2 0.5

NT3 1

NT4 1.5

NT5 2

Thí nghiệm được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 3 mẫu/lần lặp

Chỉ tiêu thu thập: Số chồi/mẫu

Số đốt/ chồi

Đặc điểm chồi

b. Thí nghiệm 4.2: Khảo sát ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng nhân

nhanh chồi.

 Vật liệu: đốt thân

 Môi trường nuôi cấy: tối ưu trong thí nghiệm 3

 Chất điều hòa sinh trưởng: bổ sung nồng độ Kinetine theo bảng 2.5

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi.

Nồng độ Kinetin Nghiệm thức (mg/l)

NT1 (Đ/C) 0

NT2 0.5

NT3 1

NT4 1.5

NT5 2

Thí

nghiệm được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 3 mẫu/lần lặp

Chỉ tiêu thu thập: Số chồi/mẫu

35

Số đốt/ chồi

Đặc điểm chồi

c. Thí nghiệm 3.3: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ đến khả năng nhân

nhanh chồi.

 Vật liệu: đốt thân

 Môi trường nuôi cấy: tối ưu trong thí nghiệm 3

 Chất điều hòa sinh trưởng: bổ sung nồng độ TDZ theo bảng 2.6

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi.

Nồng độ TDZ Nghiệm thức (mg/l)

NT1 (Đ/C) 0

NT2 0,1

NT3 0,2

NT4 0,4

NT5 0,6

Thí

nghiệm được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 3 mẫu/lần lặp

Chỉ tiêu thu thập: Số chồi/mẫu

Số đốt/ chồi

Đặc điểm chồi

2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh

 Vật liệu: đốt thân

 Môi trường nuôi cấy: tối ưu trong thí nghiệm 3

 Chất điều hòa sinh trưởng: bổ sung nồng độ chất điều hòa sinh trưởng theo bảng 2.7

36

Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh

Nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng Nghiệm

thức

TDZ (mg/l) BA (mg/l) Kinetin (mg/l)

1

Tốt nhất ở thí nghiệm 4.1 Tốt nhất thí nghiệm 4.3

Tốt nhất thí nghiệm 2 Tốt nhất thí

4.1 nghiệm 4.2

3

Tốt nhất thí nghiệm 4.3 Tốt nhất thí nghiệm 4.2

4 Tốt nhất thí nghiệm Tốt nhất thí nghiệm Tốt nhất thí

4.1 4.3 nghiệm 4.2

Thí nghiệm được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, 3 mẫu/lần lặp

Chỉ tiêu thu thập: Số chồi/mẫu

Số đốt/ chồi

Đặc điểm chồi

2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu.

37

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm

Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu tiên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, mẫu

cấy được lấy từ bên ngoài tự nhiên nên dễ bị nhiễm các loại như: nấm, vi khuẩn,

virus …do đó ngay ở giai đoạn này các mẫu cần phải đạt tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu

tái sinh cao …Phương pháp khử trùng mẫu cấy thường được ấp dụng hiện nay là

dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn do tính chất dễ thao tác, đòi hỏi thiết

bị đơn giản và hiệu quả cao. Các chất hóa học thường được sử dụng như: calcium

hypochlorid Ca(OCl)2, thủy ngân clorua HgCl2, hydroxid H2O2... Sử dụng chất nào,

nồng độ cao hay thấp, thời gian dài hay ngắn hoàn toàn phụ thuộc vào đặc điểm và

tình trạng mẫu.

Với đặc điểm lan Gấm là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân khí

sinh mọng nước nên việc khử trùng tương đối khó. Vì vậy, trong đề tài này chúng

tôi sử dụng thân khí sinh là vật liệu để khử trùng. Chất khử trùng được sử dụng là

Javen và chlorin. Đây là những loại hóa chất dễ tìm, rẻ tiền, dễ sử dụng và ít gây

độc cho người thao tác.

3.1.1. Khử trùng bằng Javen

Mẫu lan gấm được tiến hành khử trùng với javen với tỷ lệ javen: nước tương

ứng 1:1; 2:1 và 3: 1. Thời gian khử trùng với 5, 10, 15, 20 phút. Kết quả khử trùng

được thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen

Thời Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Tỷ mẫu Nghiệm Tỉ lệ gian nhiễm (1tuần) mẫu chết tái sinh thức Javen:nƣớc (phút) (4tuần) (6tuần)

NT1 1:1 5 100% 0% 0%

NT2 1:1 10 100% 0% 0%

NT3 1:1 15 93,33% 6,67% 0%

NT4 1:1 20 66,67% 30% 3,33%

38

NT5 2:1 5 90% 10% 0%

NT6 2:1 10 83,3% 6,67% 10%

2:1 15 NT7 50% 13,33% 36,67%

NT8 2:1 20 3,33% 90% 6,67%

NT9 3:1 5 66,67% 16,67% 16,67%

NT10 3:1 10 56,67% 20% 23,33%

NT11 3:1 15 33,33% 56,67% 10%

NT12 3:1 20 0% 100% 0

Qua bảng 3.1 cho thấy

Ở cùng một nồng độ Javen, khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu bị nhiễm

giảm dần, tỷ lệ mẫu chết tăng dần. Tuy nhiên tỷ lệ mẫu tái sinh không tuân theo quy

luật này. Cụ thể ở tỷ lệ 3:1 khi tăng thời gian lên 5 – 10 – 15 – 20 phút thì tỷ lệ

nhiễm giảm dần từ 66,67 – 56,67 – 33,33 – 0%. Tỷ lệ mẫu chết tăng dần từ 16,67 –

20% – 56,67 – 100%. Khi tăng thời gian tử 5 – 10 phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh tăng từ

16,67 – 23,33%, nhưng khi tăng thời gian từ 10 – 20phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh giảm

từ 23,33 xuống còn 0%

Ở cùng thời gian khử trùng, khi tăng nồng độ chất khử trùng thì tỷ lệ mẫu bị

nhiễm giảm dần. Cụ thể khi khử trùng 10 phút thì ở tỷ lệ 1:1 thì tỷ lên nhiễm 100%,

ở tỷ lệ 2:1 thì tỷ lệ nhiễm giảm còn 83,33% và đến tỷ lệ 3:1 thì tỷ lệ nhiễm còn

56,67%

Với tỷ lệ 3:1 thời gian khử trùng là 20 phút tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất nhưng

hầu như các mẫu đều chết sau 4 tuần nuôi cấy, nhưng với tỷ lệ khử trùng là 2:1 với

thời gian khử trùng 15 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm đạt 50% và tỷ lệ tái sinh đạt cao

nhất là 36,67%.

Khi khử trùng với thời gian 20 phút, các mẫu có hiện tượng mềm nhũng và rã ra.

Như vậy, khi dùng javen là chất khử trùng thì tỷ lệ Javen: nước là 2:1 với thời

gian khử trùng thích hợp nhất là 15 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất.

39

3.1.2. Khử trùng bằng chlorine

Mặc dù khử trùng với Javen ở tỷ lệ 2:1 trong thời gian khử trùng 15 phút cho

tỷ lệ mẫu tái sinh đạt cao nhất, nhưng tỷ lệ nhiễm của mẫu chỉ đạt 50%, nên trong

thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khử trùng với chất khử trùng là Chlorine. Nồng

độ và thời gian khử trùng được thể hiện qua bảng 3.2.

Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine

Nồng Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Nghiệm Thời gian độ mẫu nhiễm mẫu chết mẫu tái sinh ( phút) thức (%) (4tuần) (6tuần) (1tuần)

NT13 5 5 100% 0% 0%

NT14 5 10 66,67% 20% 13,33%

NT15 5 15 43,3% 53,33% 3.33%

NT16 10 5 66,67% 23,33% 10%

NT17 10 10 46,67% 30% 23,33%

NT18 10 15 0% 100% 0%

NT19 15 5 83,3% 6,67% 3,33%

NT20 15 10 33,3% 46,67% 20%

NT21 15 15 0% 100% 0%

Qua kết quả khử trùng ở bảng 3.2 cho thấy:

- Ở cùng một nồng độ Javen, khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu bị

nhiễm giảm dần, tỷ lệ mẫu chết tăng dần. Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất 0% ở nồng độ

Chlorine 10% với thời gian khử trùng là 15 phút và 15% với thời gian khử trùng 15

phút, nhưng các mẫu đều chết sau 4 tuần nuôi cấy.

- Nồng độ khử trùng càng cao và thời gian khử trùng càng kéo dài thì tỷ lệ

tái sinh mẫu thấp.

- Nồng độ Chlorine 10% với thời gian khử trùng là 10 phút thì tỷ lệ mẫu tái

sinh sau 6 tuần cao nhất đạt 23,33%.

Như vậy, khi sử dụng Cholorine để khử trùng lan gấm thì nồng độ thích hợp

để khử trùng là 10% với thời gian khử trùng là 15 phút.

40

3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin

Từ kết quả trên cho thấy, khi sử dụng chlorine nồng độ 10% cho tỷ lệ nhiễm

thấp hơn so với dùng Javen, nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh lại thấp hơn. Để nâng cao hiệu

quả khử trùng, chúng tôi tiến hành kết hợp 2 loại chất khử trùng này để khảo sát

hiệu quả khử trùng. Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine.

Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ mẫu tái sinh Nghiệm thức (1tuần) (4tuần) (6tuần)

NT22 33,33% 16,67% 50%

NT23 43,33% 46,67% 10%

NT24 36,67% 43,33% 20%

NT25 26,67% 50% 23,33%

NT26 20% 53,33% 26,67%

NT27 0% 100% 0%

Từ bảng 3.3 cho thấy:

- Khi khử trùng kết hợp giữa Javen và Chlorin cho tỷ lệ nhiễm thấp ở các

nghiệm thức chỉ 20% - 43,33% và tỷ lệ mẫu tái sinh tương đối cao hơn so với khi

dùng chất khử trùng riêng lẻ.

- Khử trùng Javen (2:1) trong 10phút sau đó khử chlorine 5% trong 5 phút

cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao đạt 50% và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp đạt 33,33% so với các

nghiệm thức còn lại.

Như vậy, hiệu quả khử trùng cao nhất khi có sự kết hợp Javen (tỷ lệ 2:1) với

thời gian khử trùng trong 10 phút, chlorine 5% trong 5 phút và kết quả mẫu tái sinh

đạt 50%.Nhận xét:

* So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng (Javen, Chlorine)

41

Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau.

Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Nghiệm mẫu nhiễm mẫu chết mẫu tái sinh thức (1tuần) (4tuần) (6tuần)

NT7 50% 13,33% 36,67%

NT17 46,67% 30% 23,33%

NT22 33,33% 16,67% 50%

Tỷ lệ %

Nghiệm thức

Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau.

Từ biểu đồ hình 3.1 cho thấy: hiệu quả khử trùng cao nhất khi có sự kết hợp

giữa Javen (tỷ lệ 2:1) và Chlorine 5%, khi đó mẫu nhiễm đạt 33,33 %. Tỷ lệ mẫu

chết cao nhất khi dùng Chlorine và thấp nhất khi dùng Javen. Tuy nhiên, khi kết

hợp giữa Javen và Chlorine thì tỷ lệ mẫu chết không thấp hơn so với khi dùng dùng

Javen đơn, nhưng kết quả mẫu tái sinh cao, đạt 50%. Sau 6 tuần các mẫu bắt đầu

phát triển chồi ngọn hoặc chồi nách.

Kết luận: Qua kết quả nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm cho thấy

sử dụng Javen tỷ lệ 2:1 với thời gian khử trùng 10 phút sau đó kết hợp với Chlorine

5% thời gian khử trùng 5 phút thì kết quả mẫu tái sinh chồi đạt hiệu quả 50%

42

a

b

.

Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng

(a ) mẫu sống sau 4 tuần

(b ) mẫu tái sinh sau 6 tuần

3.2. Tái sinh chồi

Khả năng tái sinh chồi mẫu là một trong những yếu tố quyết định sự thành

công trong quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Đây là nguồn vật liệu khởi đầu cho việc nhân giống. Giai đoạn này, người ta thường

bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng để kích thích sự phát triển của chồi. Tuỳ

thuộc vào từng loại mẫu cấy, loại thực vật mà người ta bổ sung nồng độ các chất

điều hòa sinh trưởng khác nhau. Trong tự nhiên, khả năng nhân nhanh của Lan gấm

tương đối chậm, thường mỗi đoạn thân rễ cho từ 1-2 chồi con và thời gian tái sinh

chậm. Vì vậy, nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của lan gấm trongnuôi cấy mô là

một trong những công đoạn cần thiết.

Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, chúng tôi chỉ ứng dụng kết quả nghiên cứu

tương tự để quan sát khả năng tái sinh chồi của lan gấm nên chúng tôi không khảo

sát các yếu tố liên quan đến khả năng tái sinh chồi. Phạm vi nghiên cứu trong công

đoạn này, chúng tôi sử dụng môi trường không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng

và môi trrường có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (BA, kinetin, TDZ, và sự kết

hợp). Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy

43

Nghiệm thức Số chồi/mẫu Đặc điểm chồi

NT1 To khỏe, màu xanh 3

NT2 To khỏe, màu xanh 5

NT3 Màu vàng 3

Vừa tạo chồi vừa tạo Chồi màu xanh, protocorm NT4 protocorm màu vàng xanh

NT5 Chồi ít phát triển ,nhỏ 1

- Môi trường không có chất kích thích, chỉ phát triển chồi ngọn hoặc chồi

nách (Hình 3.3. a).

- Môi trường có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, số lượng chồi tạo trên

mỗi mẫu cao trung bình 3-5 chồi/mẫu (Hình 3.3). Kết quả cho thấy trên môi trường

bổ sung BA và Kinetin thì mẫu hầu như chỉ phát triển thành chồi mà không phát

triển protocorm. Kinetin là chất có khả năng tái sinh chồi cao nhất (5 chồi/mẫu).

- Môi trường có bổ sung 0,1 mg/l TDZ, sự phát sinh hình thái chồi có xu

hướng chuyển sang tạo thành protocorm nhưng chưa rõ rệt (Hình 3.3.c).

- Môi trường có bổ sung cả 3 loại chất điều hoà sinh trưởng thì thấy xuất

hiện chồi dạng protocorm (Hình 3.3. d), nhưng màu sắc của dạng chồi này có màu

trắng.

Kết luận: Khi bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thì khả năng tạo chồi

mạnh hơn và số lượng chồi nhiều hơn. Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng sử

dụng trong các thí nghiệm này đều phù hợp và kết quả tái sinh chồi cao. Tuỳ mục

đích lựa chọn phương pháp nhân giống bằng chồi hoặc đốt thân hoặc protocorm mà

chúng ta áp dụng liều lượng nồng độ chất kích thích sinh trưởng trên để tái sinh

chồi.

44

a

b

c

d

e

Hình 3.3. Sự tái sinh chồi

(a) Môi trường bổ sung 0,3mg/l BA;

(b) Bổ sung 0,3mg/l kinetin;

(c) Bổ sung 0,1 mg/l TDZ;

(d) Bổ sung 0,3mg/l BA+0,3mg/l kinetin+0,1 mg/l TDZ;

(e) Không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng.

45

3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng thích hợp để nhân nhanh chồi

lan gấm

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần môi trường nuôi cấy đóng vai

trò rất quan trọng đối với mô tế bào thực vật. Tuỳ mỗi loại cây trồng mà chọn lựa

môi trường nuôi cấy phù hợp để cây sinh trưởng phát triển tốt. Nếu môi trường quá

giàu dinh dưỡng đôi khi dẫn đến ngộ độc mô tế bào trong giai đoạn nhân nhanh,

ngược lại môi trường nghèo dinh dưỡng dẫn đến cây chậm phát triển, hạn chế tốc

độ nhân nhanh. Vì vậy, trong nghiên cứu này chọn môi trường thích hợp để lan gấm

phát triển.

Theo kết quả một số công trình nghiên cứu nuôi cấy phong lan, môi trường

thường sử dụng để nuôi cấy như MS (Murashige&Skoog, 1962); Knudson C,

Vacine Went, môi trường Hyponex ( Lou and Kako, 1995)…Lan gấm là một loại

thuộc họ Phong lan, nên trong nghiên cứu này chúng tôi chọn môi trường MS;

Knudson C, Vacine Went, 1/2MS để khảo sát sự thích hợp của lan gấm. Kết quả

nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm.

Nghiệm thức Môi trƣờng Số chồi Đặc điểm chồi

1/2 MS Chồi to, khỏe, màu xanh, có từ 1-2 đốt NT1 4

NT2 MS 3 Chồi to, khỏe, màu xanh

NT3 VW 3 Chồi phát triển chậm

NT4 K C 6 Chồi to, khỏe, màu xanh, có 1-2 đốt

Qua bảng 3.6 cho thấy: các môi trường sử dụng khảo sát đều có sự tạo chồi,

nhưng số lượng chồi ở môi trường Knudson C cho số lượng cao nhất 6 chồi/mẫu và

các chồi này tương đối đồng đều. Các loại lan nói chung thường phát triển trên môi

trường có hàm lượng khoáng thấp, nghèo chất dinh dưỡng như môi trường Kundson

C, môi trường ½MS vì thế lan Gấm có thể phát triển và tạo chồi tốt hơn các môi

trường khác. Nhưng trong môi trường ½MS mặc dù có hàm lượng khoáng thấp

nhưng có lượng vitamin và khoáng vi lượng phong phú hơn nên sẽ gây ức chế cho

46

mô nuôi cấy làm cho mô phát triển không tốt. Môi trường MS và môi trường VW là

môi trường giàu dinh dưỡng, nên quá trình phát triển có thể gây độc cho mô nuôi

cấy nên hạn chế sự phát triển chồi.

Như vậy, môi trường thích hợp để nuôi cấy thích hợp lan gấm giai đoạn

invitro là môi trường Knudson C.

b

a

c

d

Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng

(a) Môi trường MS; (b) Môi trường WV; (c) Môi trường 1/2MS; (d) Môi trường KC

3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân

nhanh thể chồi

Nhân nhanh chồi là bước quyết định và tạo hệ số nhân nhanh của phương pháp

nuôi cấy mô. Để tạo hệ số nhân nhanh, người ta thường bổ sung chất điều hoà sinh

trưởng để tạo hệ số nhân chồi. Tùy mỗi loại cây, loại mô có nồng độ chất điều hoà

sinh trưởng và loại chất điều hoà sinh trưởng phù hợp. Thông thường người ta sử

dụng nhóm cytokinine để nhân nhanh chồi hoặc sự kết hợp với auxin. Trong phạm

47

vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi chỉ khảo sát các chất BA, kinitine, TDZ để tạo số

lượng chồi cao nhất.

3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi.

BA (6-benzyllaminopurin) là một cho cytokinine nhân tạo có khả năng làm

cho các chất dinh dưỡng trong môi trường tập trung về vùng nó tác động, đồng thời

kích thích sự phân chia và ưu thế ngọn bị ức chế dẫn đến hình thành cụm chồi. BA

có tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của chồi. Chính vì

vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ BA lần lượt là

0.0mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 1.5mg/l; 2.0mg/l. Sau 6 tuần nuôi cấy, kết quả thí

nghiệm được thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi

Nồng độ Số Nghiệm thức Số đốt/chồi Chất lƣợng chồi BA (mg/l) chồi/mẫu

NT1 (Đ/C) 0 1 2 +

NT2 0.5 3 1 +

NT3 1 4 2 ++

NT4 1.5 7 3 +++

NT5 2 3 3 ++

Chú thích:

+ + +: Tốt (chồi phát triển mạnh, lá to, xanh đậm)

+ + : Trung bình (chồi nhỏ, lá nhỏ hoặc k có, màu xanh nhạt)

+ : Yếu (chồi nhỏ, lá nhỏ, màu xanh)

Qua bảng 3.7 cho thấy :

- Khi không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thì phát triển một chồi, nhưng

khi có sự có mặt của BA số lượng chồi tăng và phát triển mạnh.

- Tại nồng độ BA 0.5 mg/l thì số lượng chồi là 03 chồi, nhưng khi tăng nồng

độ BA lên 1 mg/l thì số lượng chồi tăng lên 4, chồi phát triển mạnh và có 2 đốt. Số

48

lượng chồi cao nhất là 07 chồi/cụm khi nồng độ BA ở 1.5 mg/l. Đồng thời, tại nồng

độ 1.5 mg/l BA thì số đốt/chồi tăng lên 3. Tuy nhiên, khi nồng độ BA 2.0 mg/l thì

số lượng chồi không tăng lên mà giảm xuống còn 3 chồi/mẫu.

Như vậy hàm lượng BA có ảnh hưởng lớn trong quá trình tạo cụm chồi, khi

hàm lượng BA bên ngoài môi trường cao sẽ dẫn đến hàm lượng BA nội sinh cao.

Có thể mẫu cấy đã hấp thu cytokinine từ ngoài môi trường hoặc sự có mặt của

cytokinine đã kích thích sự tổng hợp các cytokinine nội sinh, kết quả kích thích sự

phát triển hình thái chồi.

 Kết luận:

Nồng độ BA 1.5 mg/l là thích hợp tạo cụm chồi tốt nhất đối với lan gấm.

a

b

c

d

Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau

(a) Bổ sung 0,5mg/l BA (c) Bổ sung 1,5mg/l BA

(b) Bổ sung 1mg/l BA (d) Bổ sung 2mg/l BA

49

3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi.

Kinetin (6-furfurylaminopurine-C10H9N5O) là một cytokinin tổng hợp được

sử dụng chủ yếu trong kỷ thuật nuôi cấy mô. Chức năng của kinetin kích thích sự

hình thành chồi, cải thiện chất lượng chồi, kích thích chồi chính nhưng không kìm

hãm sự sinh trưởng của chồi phụ. Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát

kinetin ở các nồng độ 0.0mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 1.5mg/l; 2.0mg/l để đánh giá hệ số

nhân nhanh chồi. Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.8

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi

Nồng độ Số Nghiệm thức Số đốt/chồi Đặc điểm chồi kinetin (mg/l) chồi/mẫu

0 1 2 + NT1 (Đ/C)

0.5 4 2 ++ NT2

1 8 1 +++ NT3

1.5 3 2 ++ NT4

2 2 2 + NT5

Chú thích:

+ + +: Tốt (chồi phát triển mạnh, lá to, xanh đậm)

+ + : Trung bình (chồi nhỏ, lá nhỏ hoặc k có, màu xanh nhạt)

+ : Yếu (chồi nhỏ, lá nhỏ, màu xanh)

Từ bảng 3.8 cho thấy:

- Khi môi trường không bổ sung kinetin chỉ phát triển một chồi, nhưng có sự

hiện diện của Kinetin thì số lượng chồi tăng lên đáng kể và số đốt/chồi cũng tăng

lên.

- Số lượng chồi thay đổi theo nồng độ kintine. Tại nồng độ 0.5mg/l Kinetin số

lượng chồi tạo ra là 04 chồi/mẫu, nhưng khi tăng nồng độ kinetin 1 mg/l thì số

lượng chồi/mẫu tăng lên gấp đôi (8 chồi/mẫu) và tại mỗi mẫu có xuất hiện một số

50

chồi dạng protocorm có màu trắng. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ kinitine lên 1.5

mg/l và 2.0 mg/l thì số lượng chồi và chất lượng chồi giảm đáng kể. Như vậy, nồng

độ kinitine 1mg/l cho kết quả số chồi nhiều nhất và đạt 8 chồi/mẫu.

 Kết luận: khi sử dụng kinitin là chất điều hoà sinh trưởng để nhân nhanh chồi

thì nồng độ tối ưu là 1 mg/l, khi đó tạo ra số lượng chồi là 8 chồi/mẫu.

a

b

c

d

Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau

(a) Bổ sung 0,5mg/l Kinetin (c) Bổ sung 1,5mg/l Kinetin

(b) Bổ sung 1mg/l Kinetin (d) Bổ sung 2mg/l Kinetin

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi

TDZ – thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5’-ylurea), được công bố lần đầu tiên như là một chất có khả năng làm rụng lá gòn, là một dẫn xuất của urea có hoạt tính tương tự như cytokinin (Eapen và cs, 1998; Mok và cs, 1982), cảm ứng sự tăng sinh chồi, tái sinh chồi bất định từ mô lá của một số loài cây thân gỗ và cảm

51

ứng cho quá trình phát sinh phôi. Các nhà khoa học cho rằng TDZ có thể kích thích

quá trình chuyển đổi dạng nucleotide của cytokinin sang dạng nucleoside có hoạt

tính sinh học cao hơn và kích thích sự tích lũy các cytokinin nội sinh dạng purin (Thomas và cs,1986). Theo Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), TDZ rất dễ kháng với các

cytokinin adenine. Trong nuôi cấy mô TDZ được sử dụng một mình hay kết hợp với

NAA có thể cảm ứng sự phát sinh cơ quan hay sự phát sinh phôi (Babaoglu và cs,

2000; Lu Chin-Yi, 1993; Hosokawa và cs, 1998; Magioli và cs, 1998). TDZ có chức năng như 1 cytokinin. Các sinh trắc nghiệm được thực hiện nhận thấy rằng

TDZ có ảnh hưởng gấp 4 lần hơn cytokinin. Ở nồng độ thấp, TDZ cảm ứng tái sinh

chồi trực tiếp từ mô. Ở nồng độ cao, TDZ cảm ứng hình thành sẹo và những cấu

trúc bất thường.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng TDZ ở các

nồng độ 0.0mg/l; 0.1mg/l; 0.2mg/l; 0.4mg/l; 0.6mg/l. Kết quả khảo sát sau 6 tuần

nuôi cấy thể hiện trong bảng 3.9

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy

Nồng độ Số chồi Số đốt/ Nghiệm thức Đặc điểm chồi TDZ (mg/l) /mẫu mẫu

NT1 (Đ/C) 0 1 2 Chồi xanh

Chôi trắng, một ít NT2 0.1 4 0 chồi xanh

Chồi màu vàng

NT3 0.2 10 0 xanh, có sự xuất

hiện protocorm

Cụm chồi màu NT4 0.4 Cụm chồi 0 xanh, protocorm

NT5 0.6 Cụm chồi 0 Có sự tạo mô sẹo, chồi màu xanh

Qua bảng 3.9 cho thấy:

- Khi không có chất kích thích sinh trưởng thì số chồi tạo ra chỉ 1 chồi, nhưng khi môi trường có bổ sung và tăng nồng độ TDZ thì chiều hướng phát sinh hình thái chồi có sự thay đổi.

52

- Tại nồng độ 0.1 mg/l và 0.2 mg/l TDZ, thì chồi phát triển mạnh và tăng dần

từ 4 chồi lên đến 10 chồi. Đồng thời, tại nồng độ 0.2 mg/l TDZ không những tại ra

nhiều chồi mà còn có những chồi phát triển theo kiểu dạng protocorm. Khi tăng nồng độ TDZ lên 0.4 - 0.6 mg/l, thì thấy xuất hiện hiện tượng tạo cụm chồi (Hình

3.7 c và d) và có khuynh hướng xuất hiện mô sẹo tại nồng độ 0.6 mg/l TDZ.

- Tuỳ mục đích việc nhân nhanh dạng chồi, protocorm, mô sẹo mà chúng ta

chọn nồng độ thích hợp. Để chọn vật liệu nhân nhanh là chồi thì chúng ta chọn nồng độ 0.2 mg/l; vật liệu nhân nhanh là protocorm chọn nồng độ 0.4 mg/l. Vấn đề tạo

mô sẹo và nhân nhanh mô sẹo cần có những hướng nghiên cứu tiếp theo và sâu hơn.

Đây là vấn đề phát hiện mới trong quá trình nhân giống cây lan gấm.  Kết luận: Khi sử dụng TDZ ở các nồng độ khác nhau có sự phát sinh hình thái

chồi khác nhau. Tại nồng độ 0,4 mg/l khả năng tạo protocorm cao.

a

b

c

d

Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau

(a) Môi trường có 0,1mg/l TDZ (c) Môi trường có 0,4mg/l TDZ

(b) Môi trường có 0,2mg/l TDZ (d) Môi trường có 0.6mg/l TDZ

53

3.5. Khảo sát quá trình nhân nhanh

Quá trình nhân nhanh chồi là giai đoạn tăng hệ số nhân, tạo được số lượng

cây giống nhiều nhất nhằm hạ giá thành sản xuất. Hệ số nhân nhanh tuỳ thuộc vào

nồng độ chất kích thích sinh trưởng và môi trường thích hợp. Theo kết quả nghiên

cứu trong thí nghiệm 4 cho thấy: nồng độ 1.5 mg/l BA; nồng độ 1 mg/l kinitine;

nồng độ 0.4 mg/l TDZ cho hệ số nhân chồi cao nhất. Tuy nhiên, khi tổ hợp các

nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng tối ưu thì khả năng tạo được hệ số nhân

nhanh cao hơn khi sử dụng đơn lẻ. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi

nghiên cứu vấn đề này. Kết quả nghiên cứu được thể hiện bảng 3.10.

Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh

Nghiệm Chồi Protocorm Đặc điểm chồi thức Số chồi/mẫu Số đốt/mẫu

NT1 3 1 8 Chồi vàng, xanh

NT2 8 3 Chồi xanh, to khỏe

NT3 2 2 5 Chồi vàng, trắng

NT4 1 1 15 Chồi trắng

Qua bảng 3.10 ta thấy:

- Khi kết hợp BA và TDZ; kinitine và TDZ; BA, kinitine và TDZ kết quả

cho 2 loại hình thái chồi: chồi và protocorm. Số lượng protocorm cao hơn dạng chồi

và chất lượng protocorm tốt hơn.

- Khi kết hợp BA và kinitine kết quả thu đuợc 01 dạng chồi với số lượng là

08 chồi và số đốt/chồi là 03 đốt. Kết quả nghiên cứu này cao hơn khi dùng 1.5 mg/l

BA (7 chồi và 3 đốt/chồi); 1 mg/l kinitine (8 chồi và 02 đốt/chồi) và chất lượng chồi

tốt hơn khi dùng các chất điều hoà sinh trưởng riêng rẻ. Như vậy, BA và kinitien có

tác dụng hỗ trợ nhau giúp tạo nhiều chồi hơn, số đốt/chồi cao hơn và chiều dài

lóng/đốt kéo dài hơn (Hình 3.8.b).

54

Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh

(a) Môi trường có BA+TDZ (c) Môi trường có kinetin+TDZ

(b) Môi trường có BA+kinetine (d) Môi trường có BA+TDZ+ kinetin

- Khi kết hợp BA, kinitin và TDZ thì kết quả tạo nhiều protocorm nhất, đạt

15 protocorm/mẫu và chất lượng tốt hơn khi dùng dạng TDZ riêng lẻ. Kết quả này

mở ra hướng nhân nhanh lan gấm thông qua nhân nhanh protocorm. Đây là hướng

nhân nhanh thường áp dụng phổ biến cho các loại lan.

Do thời gian thực hiện đề tài ngắn nên trong phạm vi nghiên cứu chúng tôi

tiến hành khảo sát nhân nhanh protocorm trên môi trường Knudson C có bổ sung

các chất điều hoà sinh trưởng là 1.5 mg/l BA+1 mg/l kinitine + 0.4 mg/l TDZ, kết

quả quan sát sau 4 tuần nuôi cấy số lượng protocorm tạo ra là 25-30 protocorm/cụm

55

chồi. Tiếp tục thử nghiệm chuyển protocorm sang môi trường Knudson C có bổ

sung 1.5 mg/l BA + 0.2 mg/l NAA, kết quả sau 4 tuần nuôi cấy mẫu chuyển thành

chồi cây (hình 3.9).

Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm

 Kết luận: sự kết hợp BA và kinitine cho số lượng chồi cao nhất là 8 chồi với 03

đốt/chồi nên tạo đuợc hệ số nhân là 24 lần. Khi kết hợp BA + kinitine + TDZ

khả năng nhân chồi dạng protocorm cao, với hệ số nhân là 25-30 lần.

3.6. Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm

Thời gian nghiên cứu diễn ra trong thời gian 04 tháng tương đối ngắn nên

các vấn đề nghiên cứu liên quan chưa đuợc nghiên cứu hết. Vì vậy, trong phạm vi

các kết quả nghiên cứu đạt được, chúng tôi đề xuất quy trình nhân nhanh cây lan

gấm như sau:

56

Cây lan gấm

10 phút + Chlorine 5% 5 phút

- Khử trùng Javen (2:1) - Môi trường: Knudson C

Vô mẫu thành công

KC + 0.3 mg/l kinitine

KC + 0.3 mg/l kinitine + 0.3 mg/l BA + 0,1 mg/l TDZ

Tái sinh chồi Tái sinh protocorm

KC + 1 mg/l kinitine + 1.5 mg/l BA

KC + 1 mg/l kinitine + 1.5 mg/l BA + 0,4 mg/l TDZ

Nhân nhanh chồi Nhân nhanh protocrm

Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm

57

CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi có những kết luận về kỹ thuật nhân nhanh

như sau:

1. Khử trùng mẫu bằng dung dịch Javen (2:1) trong 10 phút sau đó khử

chlorine 5% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao 50% và tỷ lệ mẫu nhiễm đạt

33,33%.

2. Môi trường thích hợp để nhân nhanh lan gấm là môi trường Knudson C.

3. Với nồng độ 0.3 mg/l kinetin cho khả năng tái sinh chồi lan Gấm cao nhất

(5 chồi/mẫu). Tại nồng độ 0.3 mg/l BA+0.3 mg/l kinitine+0.1 mg/l TDZ tái sinh

chồi dạng protocorm.

4. Nồng độ thích hợp nhân nhanh chồi lan Gấm là 1.5 mg/l BA + 1 mg/l

kinitine.

5. Nồng độ thích hợp nhân nhanh protocorm lan gấm là 1.5 mg/l BA + 1

mg/l kinitine + 0.4 mg/l TDZ.

4.2. Kiến nghị

Bên cạnh những kết quả đạt được như trình bày ở trên. Để hoàn thiện được

quy trình nhân giống lan gấm, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu một số hướng

sau:

1. Cần tiếp tục khảo sát quá trình vô mẫu sử dụng vật liệu vô mẫu là thân

ngầm, gieo hạt.

2. Khảo sát nồng độ chất điều hoà sinh trưởng để tái sinh chồi theo hướng

tạo mô sẹo và protocorm.

3. Khảo sát quá trình nhân nhanh với vật liệu là Protocorm.

4. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh.

5. Huấn luyện cây và đưa ra ngoài đồng ruộng.

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn

Minh, Nguyễn Thị Phương Thảo(2009), Cơ sở công nghệ sinh học – tập ba

công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục Việt Nam

2. Dương Công Kiên (2006), Giáo trình nuôi cấy mô – Tập 1-2-3. Đại học quốc

gia TP Hồ Chí Minh.

3. Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia TP

Hồ Chí Minh.

4. PGS – TSKH Lê Văn Hoàng, Giáo trình công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực

vật. NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật.

5. TS Dương Tấn Nhựt (2007) , Công nghệ sinh học thực vật tập 1, NXB Nông

Nghiệp , Tp Hồ Chí Minh

6. Hồ Ngọc Văn (2007), “Nghiên cứu quy trình nhân giống invitro cây lan hài

hồng (paphiophidium delenatii) đặc hữu quý hiếm của Việt Nam”. Luận văn

tốt nghiệp Đại hoc Nha Trang

7. Luận văn :“Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật nhângiống in vitro loài lan Kim

Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)” Bộ môn Giống& Công nghệ sinh

học- khoa Lâm Học- trường Đại học Lâm Nghiệp

8. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010)

248-253, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In Vitro loài Lan kim tuyến

Anoectochilus roxburghii - Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn

Trung Thành,

9. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010)

104-109, Đặc điểm hình thái, phân bố của loài lan Kim tuyến Anoectochilus

setaceus blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

10. Trần Văn Minh (1997), Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh học công nghệ

tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới, Trung tâm Khoa học tự nhiên và

công nghệ quốc gia

59

11. Nguyễn Công Nghiệp(1985), Trồng hoa lan, Nhà xuất bản trẻ.

12. Lê Hồng Thủy Tiên(2006), Luận văn Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm

ở cây dừa cạn (catharanthus roseus) và dã yên thảo (Petunia hybrida), Đại

học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh..

Tài liệu Tiếng anh 13. Roberts H. Smith (1992), plant tissue culture – Techniques and Experiments,

Academic press, Inc, The United States of America.

14. Dr. Oradee Sahavacharin (1996), Tissue culture micropropagation

technology, Department of Horiticulture, Facutly of Agriculture, Kasetsart

University.

15. George SA, Bilsland DJ, Wainwright NJ, Ferguson J. Failure of coconut oil

to accelerate psoriasis clearance in narrow-band UVB phototherapy or

photochemotherapy. Photobiology Unit, Ninewells Hospital and Medical

School, Dundee, Scotland, U.K. 1993

Tài liệu trên Internet 16. http://thuviensinhhoc.com/component/content/article/594.html?joscclean=1

&comment_id=3099

17. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/cay-lan-gam.569480.html

PHỤ LỤC 1 Các thành phần cơ bản của môi trường MS ( Murashige & shoog, 1962) Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) MS

1900 Kali nitrat (KNO3)

Khoáng đa lượng 1650 Amoni nitrat ( NH4NO3)

440 Canxi clorua ( CaCl2)

370 Magiê sunphat (MgSO4. 7H2O)

Phosphats 170 Kali monophosphat (KH2PO4)

6,2 Boric acid (H3PO3)

Khoáng vi lượng 1 Mangan sunphat 22.3

(MnSO4.7H2O)

8,6 Kẽm sunphat (ZnSO4.7H2O)

Khoáng vi lượng 2 Kali iốt (KI) 0,83

0,25 Natri molypdat (Na2Mo4.H2O)

Khoáng vi lượng 3 Đồng sunphat 0,025

(CuSO4.5H2O)

Coban sunphat 0,025

(CoCl2.6H2O)

Sắt EDTA 37,3 Na2-EDTA

Sắt sunphat 27,8

(FeSO4.7H2O)

Glycine 2,0

Nicotinic acid 0,5

Vitamin 0,5 Piridoxin – HCl (B6)

0,1 Thiamin – HCl (B1)

Myo – inositol 100

PHỤ LỤC 2 Thành phần cơ bản của môi trường VW (Vacin & Went) Tên hóa chất VW Nồng độ (mg/l)

Khoáng đa lượng 525 Kali nitat(KNO3)

500 Amoni sunphat ((NH4)2SO4)

200 Canxi photphat ( Ca3(PO4)2)

250 Magiê sunphat (MgSO4.7H2O)

Phosphate Kali monophosphat 250

(KH2PO4)

Khoáng vi lượng 1 10 Boric acid (H3PO3)

19 Mangan sunphat (MnSO4.7H2O)

Kẽm sunphat 10

(ZnSO4.7H2O)

Khoáng vi lượng 2 Kali iốt(KI) 0,83

Natri molypdat 0,25

(Na2Mo4.H2O)

Vi lượng 3 Đồng sunphat 0,025

(CuSO4.5H2O)

Coban sunphat 0,025

(CoCl2.6H2O)

Sắt EDTA 37,3 Na2-EDTA

Sắt tatrate 27,8

Vitamin 0,4 Thiamin – HCl (B1)

Myo – inositol 100

PHỤ LỤC 3 Thành phần cơ bản của môi trường KundSon C Tên hóa chất KundSon C Nồng độ (mg/l)

1000 Canxi nitat ((CaNO3)2)

Amoni sunphat 500

Khoáng đa lượng ((NH4)2SO4)

Magiê sunphat 250

(MgSO4.7H2O)

Kali monophosphat 250

(KH2PO4)

Sắt II sunphat 25

Khoáng vi lượng ( FeSO4.7H2O)

25

0,4 Mangan sunphat (MnSO4.7H2O) Thiamin – HCl (B1) Vitamin Myo – inositol 100

PHỤ LỤC 4 Các thành phần cơ bản của môi trường 1/2 MS ( Murashige & shoog, 1962)

MS Tên hóa chất Nồng độ (mg/l)

800 Kali nitrat (KNO3)

Khoáng đa lượng 825 Amoni nitrat ( NH4NO3)

220 Canxi clorua ( CaCl2)

185 Magiê sunphat (MgSO4. 7H2O)

Phosphats 185 Kali monophosphat (KH2PO4)

6,2 Boric acid (H3PO3)

Khoáng vi lượng 1 Mangan sunphat 22.3

(MnSO4.7H2O)

8,6 Kẽm sunphat (ZnSO4.7H2O)

Khoáng vi lượng 2 Kali iốt (KI) 0,83

0,25 Natri molypdat (Na2Mo4.H2O)

Khoáng vi lượng 3 Đồng sunphat 0,025

(CuSO4.5H2O)

Coban sunphat 0,025

(CoCl2.6H2O)

Sắt EDTA 37,3 Na2-EDTA

Sắt sunphat 27,8

(FeSO4.7H2O)

Glycine 2,0

Nicotinic acid 0,5

Vitamin 0,5 Piridoxin – HCl (B6)

0,1 Thiamin – HCl (B1)

Myo – inositol 100