TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004
Nghiªn cøu hoµn chØnh kü thuËt nu«i cÊy
®¬n bµo ký sinh vµ g©y bÖnh
Ph¹m TrÝ TuÖ, Ph¹m V¨n Th©n, Tr−¬ng ThÞ Kim Ph−îng,
Ph¹m Ngäc Minh, Lª ThÞ TuyÕt Khanh, Cao V©n HuyÒn
Bé m«n Ký sinh trïng, Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi
§¸p øng yªu cÇu nu«i gi÷ dµi ngµy mét sè chñng ®¬n bµo phôc vô nghiªn cøu vµ gi¶ng d¹y, chóng t«i ®·
tiÕn hµnh ®Ò tµi nµy vµ cã mét sè nhËn xÐt sau:
1. M«i tr−êng Palova cã thÓ sö dông tèt ®Ó nu«i gi÷ E. histolytica vµ mét sè lo¹i ®¬n bµo kh¸c nh−: E.
gingivalis, Acanthamoeba, T. vaginalis. Nh÷ng yÕu tè ®¶m b¶o cho sù ph¸t triÓn tèt cña ®¬n bµo trong nu«i
cÊy lµ: nhiÖt ®é, tû lÖ huyÕt thanh ngùa, pH cña m«i tr−êng vµ l−îng tinh bét g¹o.
2. Quy tr×nh nu«i cÊy
- NhiÖt ®é nu«i cÊy lu«n gi÷ æn ®Þnh ë 370C.
- §¶m b¶o ®iÒu kiÖn v« trïng trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy.
- M«i tr−êng nu«i cÊy thÝch hîp cho sù ph¸t triÓn cña ®¬n bµo:
+ Tû lÖ huyÕt thanh ngùa: 10%.
+ pH cña m«i tr−êng nu«i cÊy: 6 - 6,5.
+ L−îng tinh bét g¹o: 5mg/1 èng nu«i cÊy.
- Khi cÊy truyÒn, lÊy ë r×a ®¸y èng m«i tr−êng cã nhiÒu ®¬n bµo nhÊt.
- Thêi gian cÊy truyÒn tèt nhÊt lµ ngµy ®¬n bµo cã mËt ®é cao nhÊt vµ ho¹t ®éng kháe. Víi nu«i cÊy amÝp:
+ Ngµy thø 2 (3 lÇn cÊy ®Çu).
+ Ngµy thø 3 (c¸c lÇn cÊy sau).
- Víi quy tr×nh nµy (tÝnh ®Õn th¸ng 7 n¨m 2004), chóng t«i ®· nu«i gi÷ ®−îc 12 mÉu ®¬n bµo thuéc c¸c gièng:
Entamoeba, Acanthamoeba vµ Trichomonas víi thêi gian tõ 6 ®Õn 24 th¸ng vµ hiÖn vÉn ®ang ph¸t triÓn tèt.
i. §Æt vÊn ®Ò
VÊn ®Ò nu«i cÊy amÝp trong phßng thÝ nghiÖm
®· ®−îc chó ý tõ l©u. §Õn n¨m 1918 hai t¸c gi¶ lµ
Boeck vµ Drbohlav ®· t×m ra m«i tr−êng ®Ó nu«i
cÊy amÝp g©y bÖnh Entamoeba histolytica.
ë ViÖt Nam trong nh÷ng n¨m tr−íc ®©y còng ®·
cã mét sè c¬ së trong ®ã cã Bé m«n Ký sinh trïng
Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi ®· nghiªn cøu nu«i cÊy E.
histolytica b»ng m«i tr−êng Palova vµ thu ®−îc
nh÷ng kÕt qu¶ nhÊt ®Þnh. Tuy nhiªn viÖc nu«i cÊy rÊt
khã kh¨n do thÓ ho¹t ®éng cña amÝp rÊt dÔ chÕt nªn
vÉn ch−a nu«i cÊy ®−îc dµi ngµy [1].
§Ó ®¸p øng nh÷ng yªu cÇu cÇn thiÕt ph¶i nu«i
gi÷ dµi ngµy c¸c chñng ®¬n bµo ký sinh, chóng t«i
®· tiÕn hµnh ®Ò tµi: “Nghiªn cøu hoµn chØnh kü
thuËt nu«i cÊy ®¬n bµo ký sinh vµ g©y bÖnh” nh»m
c¸c môc tiªu sau:
1. X¸c ®Þnh mét sè yÕu tè chñ yÕu ¶nh h−ëng
®Õn nu«i cÊy ®¬n bµo.
2. X©y dùng qui tr×nh nu«i cÊy ®¬n bµo th−êng
qui ¸p dông trong Labo ®Ó gi÷ c¸c chñng ®¬n bµo
nu«i cÊy dµi ngµy.
ii. ®èi t−îng, vËt liÖu vµ ph−¬ng
ph¸p nghiªn cøu
1. §èi t−îng
1.1. Quy tr×nh nu«i cÊy
TiÕn hµnh nghiªn cøu theo quy tr×nh cña
Baillenger J trªn m«i tr−êng Palova [3].
61
TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004
1.2. C¸c chñng ®¬n bµo nghiªn cøu
- E. histolytica ph©n lËp tõ: ph©n bÖnh nh©n cã
héi chøng lþ, tiªu ch¶y, rèi lo¹n tiªu hãa. Chóng
t«i ®· ph©n lËp ®−îc 4 mÉu bÖnh phÈm cã E.
histolytica, ký hiÖu lµ H1, H2, H3, H4. MÉu H2 ®·
lµm ph¶n øng PCR víi gen måi lµ E. histolytica vµ
cho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh.
- E. gingivalis: bèn mÉu bÖnh phÈm cã E.
gingivalis ®−îc ph©n lËp tõ bùa r¨ng cña nh÷ng
bÖnh nh©n viªm quanh r¨ng, ký hiÖu lµ G1, G2, G3
vµ G4.
- Acanthamoeba: hai mÉu bÖnh phÈm cã
Acanthamoeba ph©n lËp tõ m¶nh gi¸c m¹c cña
bÖnh nh©n bÞ viªm loÐt gi¸c m¹c, ký hiÖu lµ M1 vµ
M2 (BÖnh viÖn M¾t trung −¬ng göi ®Õn).
- Trichomonas vaginalis: bèn mÉu bÖnh phÈm
cã T. vaginalis ph©n lËp tõ dÞch nhÇy ©m ®¹o cña
bÖnh nh©n viªm ©m hé - ©m ®¹o, ký hiÖu lµ V1,
V2, V3 vµ V4.
2. VËt liÖu nghiªn cøu
2.1. M«i tr−êng nu«i cÊy Palova
Lµ lo¹i m«i tr−êng láng, rÎ tiÒn, dÔ pha chÕ ®·
®−îc sö dông tõ l©u gåm:
- NaCl: 4,25g; Na2HPO4: 0,30g; H2PO4: 0,23g;
N−íc cÊt: 500ml.
2.2. HuyÕt thanh ®éng vËt cho m«i tr−êng
nu«i cÊy: huyÕt thanh ngùa ®−îc cho vµo m«i
tr−êng ngay tr−íc khi cÊy víi c¸c tû lÖ 5%, 10% vµ
15%.
2.3. Tinh bét g¹o: tinh bét g¹o ®−îc sÊy b¶o
qu¶n v« trïng vµ chØ cho vµo m«i tr−êng mét
l−îng nhá (3 - 10mg) tr−íc khi tiÕn hµnh cÊy.
2.4. Dung dÞch nhuém ®Ó ®Þnh lo¹i:
hematoxylin, hematoxylin - eosin.
3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
3.1. LÊy bÖnh phÈm: tïy theo vÞ trÝ ký sinh vµ
tÝnh chÊt g©y bÖnh cña tõng lo¹i ®¬n bµo:
- LÊy ë n¬i cã thÓ cã nhiÒu ®¬n bµo (nhÇy m¸u
®èi víi amÝp…)
- BÖnh phÈm ph¶i ®−îc gi÷ ë ®iÒu kiÖn Êm ®Ó
®¬n bµo sèng tr−íc khi cÊy
3.2. Kü thuËt pha m«i tr−êng Palova: pha theo
c«ng thøc, ®iÒu chØnh pH = 6 - 6,5. Chia vµo c¸c
èng nu«i cÊy, mçi èng 5ml, hÊp tiÖt trïng. §Ó
nguéi vµ b¶o qu¶n trong tñ l¹nh.
3.3. Kü thuËt nu«i cÊy [3], [6]
- CÊy bÖnh phÈm: sau khi lÊy bÖnh phÈm, xÐt
nghiÖm thÊy cã ®¬n bµo ph¶i tiÕn hµnh cÊy ngay
vµo m«i tr−êng (®· ®−îc lµm Êm) vµ ®Ó ë tñ Êm
370C.
- CÊy truyÒn trªn m«i tr−êng: cÊy truyÒn liªn
tiÕp tõ m«i tr−êng ®ang cÊy sang m«i tr−êng míi.
- §¸nh gi¸ kÕt qu¶ nu«i cÊy:
+ §¬n bµo sèng/chÕt.
+ Sù ho¹t ®éng cña ®¬n bµo.
+ MËt ®é cña ®¬n bµo.
3.4. Kü thuËt x¸c ®Þnh mËt ®é ®¬n bµo trong
m«i tr−êng nu«i cÊy: ®Õm sè l−îng ®¬n bµo cã
trong 0,05ml m«i tr−êng nu«i cÊy.
3.5. Kü thuËt nhuém ®¬n bµo: nhuém
Hematoxylin feric cña Heidenhain vµ nhuém c¶i
tiÕn Hematoxylin – Eosin (HE).
3.6. Ph¶n øng PCR ®Ó ®Þnh lo¹i ®¬n bµo: tiÕn
hµnh t¹i Labo Trung t©m, Tr−êng §¹i häc Y Hµ
Néi.
3.7. Xö lý sè liÖu: theo ph−¬ng ph¸p thèng kª y
sinh häc.
iii. KÕt qu¶
62
TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004
B¶ng 1. Theo dâi sù ph¸t triÓn cña mÉu amÝp H2 trong m«i tr−êng Palova qua c¸c lÇn cÊy
MËt ®é (sè con/0,05ml MTNC)
Ngµy thø 1 Ngµy thø 2 Ngµy thø 3 Ngµy thø 4 Ngµy thø 5
L
Ç
n
c
Ê
y
èng 1
èng 2
èng 3
TB
èng 1
èng 2
èng 3
TB
èng 1
èng 2
èng 3
TB
èng 1
èng 2
èng 3
TB
èng 1
èng 2
èng 3
TB
1 3
5
37 40 3
7
4
7
4
6
5
1
4
8
2
4
2
5
2
4
2
4
1
2
1
2
1
1
1
1
2 1 1 1
2 4
1
46 45 4
4
6
0
6
4
6
5
6
3
2
7
2
5
2
1
2
4
1
2
1
2
1
1
1
1
2 2 0 1
3 5
1
58 65 5
8
7
2
7
9
8
3
7
8
2
4
2
6
2
8
2
6
1
3
1
1
1
5
1
3
3 0 2 1
4 5
7
67 55 5
9
7
8
8
5
7
2
7
8
8
5
9
1
7
9
8
5
3
1
2
9
2
5
2
8
1
2
1
2
1
1
11
5 5
5
62 59 5
8
7
4
8
5
7
0
7
6
8
9
9
5
9
2
9
2
2
9
3
2
2
8
2
9
1
1
1
5
911
6 5
2
49 61 5
4
7
7
8
0
8
3
8
0
9
1
8
8
9
7
9
2
3
2
3
1
3
1
3
1
1
2
1
1
1
5
12
7 5
6
51 58 5
5
7
4
7
9
8
3
7
8
8
5
9
2
9
4
8
9
2
7
3
3
2
9
2
9
9 1
5
1
0
11
AmÝp ®¹t mËt ®é cao nhÊt vµo ngµy thø 2 trong 3 lÇn cÊy ®Çu, c¸c lÇn cÊy tiÕp theo mËt ®é amÝp ®Òu
cao vµo ngµy thø 3.
B¶ng 2. So s¸nh mËt ®é ngµy thø 3 cña mÉu amÝp
H
2 trong m«i tr−êng
Palova huyÕt thanh ngùa 5%, 10% vµ 15%
Tû lÖ HT ngùa Sè lÇn ®Õm (n) TB p
5% (1) 30 77 p 1/2 < 0,001
10% (2) 30 98 p 2/3 < 0,001
15% (3) 30 65 p 1/3 < 0,001
Sù ph¸t triÓn cña amÝp trong m«i tr−êng Palova huyÕt thanh ngùa 10% lµ cao nhÊt vµ cao h¬n h¼n so
víi m«i tr−êng Palova huyÕt thanh ngùa 5% vµ 15%. Sù kh¸c nhau nµy cã ý nghÜa thèng kª víi p < 0,001.
B¶ng 3. So s¸nh mËt ®é ngµy thø 3 cña mÉu amÝp H2 trong m«i tr−êng
Palova huyÕt thanh ngùa pH 6, pH 6,5 vµ pH 7
pH Sè lÇn ®Õm (n) TB p
6 (1) 30 106 p 1/2 > 0,05
6,5 (2) 30 108 p 2/3 < 0,001
7 (3) 30 57 p 1/3 < 0,001
63
TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004
Trong m«i tr−êng Palova pH = 6,5 amÝp ph¸t triÓn rÊt tèt vµ kh«ng kh¸c biÖt so víi m«i tr−êng cã pH
= 6 (p > 0,05). Tuy nhiªn trong m«i tr−êng Palova cã pH = 7 amÝp ph¸t triÓn kÐm h¬n rÊt nhiÒu vµ sù
kh¸c nhau nµy cã ý nghÜa thèng kª víi p < 0,001.
B¶ng 4. So s¸nh mËt ®é ngµy thø 3 cña mÉu amÝp H2 trong m«i tr−êng
Pavlova HT ngùa 10%, pH 6,5 víi l−îng tinh bét g¹o kh¸c nhau
L−îng tinh bét g¹o (mg) Sè lÇn ®Õm (n) TB p
3 (1) 30 71 p 1/2 < 0,001
5 (2) 30 113 p 2/3 < 0,001
10 (3) 30 75 p 1/3 < 0,001
M«i tr−êng Palova víi l−îng tinh bét g¹o 5mg amÝp ph¸t triÓn tèt nhÊt vµ ®¹t mËt ®é trung b×nh ngµy
thø 3 cao h¬n h¼n so víi cïng m«i tr−êng nh−ng l−îng tinh bét g¹o lµ 3mg vµ 10mg. Sù kh¸c nhau nµy
cã ý nghÜa thèng kª víi p < 0,001.
B¶ng 5. Sù ph¸t triÓn cña mÉu amÝp H2 trong m«i tr−êng Pavlova ë nhiÖt ®é 370C
MËt ®é amÝp (sè con/0,05ml MTNC)
Ngµy
theo dâi èng 1 èng 2 èng 3 èng 4 èng 5 Trung
b×nh
1 50 49 41 45 51 47
2 75 67 70 68 79 71
3 121 115 109 122 145 122
4 41 39 27 31 33 34
5 15 12 11 11 15 12
6 3 1 5 2 4 3
7 0 0 1 0 1 0
Trong m«i tr−êng Palova (10% huyÕt thanh ngùa, pH = 6,5 vµ 5mg tinh bét g¹o) ë nhiÖt ®é 370C amÝp
ph¸t triÓn rÊt tèt vµ cã mËt ®é trung b×nh vµo ngµy thø 3 rÊt cao.
B¶ng 6. Sù ph¸t triÓn cña mÉu amÝp H2 trong m«i tr−êng Pavlova ë nhiÖt ®é 36,50C
MËt ®é amÝp (sè con/0,05ml MTNC)
Ngµy
theo dâi èng 1 èng 2 èng 3 èng 4 èng 5 Trung
b×nh
1 41 39 47 45 46 43
2 70 64 73 65 71 68
3 115 97 101 98 122 106
4 39 35 41 36 42 38
5 12 11 13 9 15 12
6 3 2 3 0 2 2
7 0 0 0 0 0 0
ë nhiÖt ®é 36,50C amÝp còng ph¸t triÓn t−¬ng ®èi tèt, tuy nhiªn mËt ®é cã thÊp h¬n so víi ë nhiÖt ®é
370C.
64
TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004
B¶ng 7. Sù ph¸t triÓn cña mÉu amÝp H2 trong m«i tr−êng Pavlova ë nhiÖt ®é 360C
MËt ®é amÝp (sè con/0,05ml MTNC)
Ngµy
theo dâi èng 1 èng 2 èng 3 èng 4 èng 5 Trung
b×nh
1 47 45 39 41 46 43
2 25 17 12 8 11 14
3 3 1 2 0 2 1
4 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0
ë nhiÖt ®é 360C, amÝp kh«ng nh÷ng kh«ng ph¸t triÓn mµ cßn gi¶m rÊt nhanh kÓ tõ ngµy thø 2 vµ ngµy
thø 3 hÇu nh− kh«ng cßn.
B¶ng 8. Sù ph¸t triÓn cña mÉu amÝp H2 trong m«i tr−êng Pavlova ë nhiÖt ®é 37,50C
MËt ®é amÝp (sè con/0,05ml MTNC)
Ngµy
theo dâi èng 1 èng 2 èng 3 èng 4 èng 5 Trung
b×nh
1 46 42 39 47 45 43
2 39 42 37 29 31 35
3 9 11 12 7 6 9
4 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0
NhiÖt ®é 37,50C mËt ®é amÝp kh«ng nh÷ng kh«ng t¨ng mµ cßn gi¶m nhanh tõ ngµy thø hai vµ hÇu nh−
kh«ng cßn kÓ tõ ngµy thø t−.
B¶ng 9. KÕt qu¶ nu«i cÊy c¸c mÉu amÝp g©y bÖnh (TÝnh ®Õn hÕt th¸ng 7 n¨m 2004)
MÉu amÝp g©y bÖnh M«i tr−êng nu«i cÊy Thêi gian sèng
H1 Palova pH = 6 - 6,5 huyÕt thanh ngùa 10%,
5mg tinh bét g¹o 20 ngµy
H2 nt 7 th¸ng
H3 nt 12 th¸ng
H4 nt 7 th¸ng
MÉu bÖnh phÈm H1 chØ nu«i sèng ®−îc 20 ngµy vµ mÉu bÖnh phÈm H2 nu«i sèng ®−îc kho¶ng 7
th¸ng. Nguyªn nh©n chÕt cña c¶ 2 tr−êng hîp nµy ®Òu do sù cè mÊt ®iÖn kh«ng ®¶m b¶o ®−îc nhiÖt ®é
nu«i cÊy. C¸c mÉu bÖnh phÈm H3, H4 hiÖn nay vÉn ®ang ph¸t triÓn tèt.
65