intTypePromotion=3

Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm đến việc hoàn thiện xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
20
lượt xem
0
download

Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm đến việc hoàn thiện xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào (TB) dòng chảy. Phương pháp: thử nghiệm các quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch của các labo khác nhau, phát hiện các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp. Sau đó hoàn thiện và thử nghiệm quy trình hoàn chỉnh.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm đến việc hoàn thiện xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG CỦA QUY TRÌNH<br /> NHUỘM RỬA VÀ CỐ ĐỊNH MẪU BỆNH PHẨM ĐẾN VIỆC<br /> HOÀN THIỆN XÉT NGHIỆM XẾP LOẠI MIỄN DỊCH<br /> BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY<br /> Lê Xuân Hải*; Nguyễn Triệu Vân*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp<br /> loại miễn dịch bằng kỹ thu t phân tích tế bào (TB) dòng chảy. Phương pháp: thử nghiệm các<br /> quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch của các labo khác nhau, phát hiện các yếu tố ảnh<br /> hưởng đến quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp. Sau đó hoàn thiện và<br /> thử nghiệm quy trình hoàn chỉnh. Kết quả: đã tìm ra các bước cần cải tiến quy trình xử lý mẫu<br /> bệnh phẩm để cải thiện chất lượng xét nghiệm như: phá hồng cầu trước khi ủ kháng thể; rửa<br /> bỏ kháng thể thừa trước khi phân tích; sử d ng dung dịch cố định và bảo quản TB. Kết luận: để<br /> tăng cường chất lượng xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng phương pháp TB dòng chảy cần áp<br /> d ng một số thay đổi trong quy trình nhuộm rửa, cố định và bảo quản mẫu.<br /> * Từ khóa: Bệnh bạch cầu; Xếp loại kiểu hình miễn dịch; Đếm tế bào dòng chảy.<br /> <br /> Study on Affecting Factors of Staining, Washing and Fixing of Blood<br /> Samples to Complete Immmunophenotyping by Flow Cytometry Technic<br /> Summary<br /> Objectives: To optimize the process of staining, washing and fixing of samples that are used in<br /> immunophenotyping by flow cytometry. Methods: To perform the procedure of immunophenotyping<br /> in various samples to identify factors affecting the procedure of handling samples and the<br /> completed procedure is developed and tested afterward. Results: some improvements in the<br /> procedure help enhance the test quality including lysing erythrocytes before incubating, washing<br /> off excess antibodies before testing, fixing and preserving procedure. Conclusion: It is needed<br /> to apply some improvement in staining, washing, fixing and preserving sample procedure for<br /> ensuring a good sample quality of immunophenotyping.<br /> * Key words: Leukemia; Immunophenotyping; Flow cytometry.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh bạch cầu cấp (BCC) (Lơ-xê-mi<br /> cấp) là một bệnh ung thư máu thường<br /> <br /> gặp trong chuyên khoa huyết học. TB ung<br /> thư có thể phát triển từ các TB gốc tạo<br /> máu chưa biệt hóa hoặc các TB đã biệt<br /> hóa thành dòng tủy hoặc dòng lympho.<br /> <br /> * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hai (hailexuan@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/12/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 23/03/2016<br /> <br /> 84<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br /> <br /> Việc xác định chính xác dòng TB, giai<br /> đoạn phát triển của TB có giá trị trong chẩn<br /> đoán, theo dõi, tiên lượng, xếp loại và lựa<br /> chọn phác đồ đi u trị phù hợp. Trước năm<br /> 1976, việc chẩn đoán và xếp loại bệnh<br /> BCC hoàn toàn dựa vào hình thái học và<br /> hóa học TB theo tiêu chuẩn của FAB. Cuối<br /> th p kỷ 1990, WHO đã công nh n dấu ấn<br /> miễn dịch TB là một tiêu chuẩn chẩn đoán<br /> bắt buộc, h trợ xếp loại chính xác các<br /> bệnh lý tăng sinh ác tính có liên quan đến<br /> TB tạo máu. Ngày nay, trên thế giới, việc<br /> nh n biết các dấu ấn miễn dịch TB bằng kỹ<br /> thu t TB dòng chảy đã trở thành xét<br /> nghiệm thường quy nhằm h trợ xác định<br /> chính xác dòng TB ác tính và xếp loại dưới<br /> nhóm của bệnh, góp phần định hướng đi u<br /> trị và tiên lượng bệnh trước đi u trị. Việc áp<br /> d ng kỹ thu t này ở Việt Nam đã được tiến<br /> hành một vài năm, tuy nhiên đây là một kỹ<br /> thu t xét nghiệm có độ đặc hiệu và đòi hỏi<br /> độ chính xác cao, dễ dẫn tới dương tính giả<br /> hoặc âm tính giả nếu các thao tác không<br /> phù hợp. Vì v y, một khía cạnh quan trọng<br /> của kỹ thu t TB dòng chảy là tìm ra một<br /> quy trình xét nghiệm ổn định nhất, phù hợp<br /> nhất đối với đi u kiện c thể của m i phòng<br /> xét nghiệm. Chúng tôi thực hiện nghiên<br /> cứu này với m c tiêu: Phát hiện một số yếu<br /> tố ảnh hưởng của quy tr nh nhuộm, r a và<br /> cố định mẫu bệnh phẩm nhằm cải tiến và<br /> hoàn thiện xét nghiệm xếp loại theo kiểu<br /> h nh miễn dịch BCC bằng phương pháp<br /> phân tích TB dòng chảy.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣ ng nghiên cứu.<br /> Các quy trình xử lý bệnh phẩm làm xét<br /> nghiệm xếp loại miễn dịch đã công bố trên<br /> thế giới.<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Thiết lập quy tr nh xếp loại miễn dịch<br /> sơ bộ cho bệnh BCC:<br /> Dựa trên tài liệu của các nhóm nghiên<br /> cứu khác nhau v xếp loại miễn dịch trong<br /> bệnh BCC và dựa trên các panel xếp loại<br /> BCC tham khảo từ các Hội nghị Quốc tế,<br /> đồng nghiệp trong và ngoài nước, chúng tôi<br /> tiến hành xây dựng quy trình xét nghiệm<br /> xếp loại miễn dịch sơ bộ.<br /> * Áp dụng sơ bộ quy tr nh xếp loại miễn<br /> dịch trên xét nghiệm thực tế:<br /> Dựa trên quy trình xét nghiệm đã thiết<br /> l p, tiến hành áp d ng trên thực tế. Tổng<br /> kết các mặt ưu điểm và hạn chế của kết<br /> quả thu được.<br /> * Hoàn thiện quy tr nh xét nghiệm xếp<br /> loại miễn dịch:<br /> Dựa trên kết quả thu được sau khi áp<br /> d ng, tiến hành một số đi u chỉnh trong<br /> quy trình, có so sánh trước và sau khi<br /> thay đổi để đưa ra nh n định:<br /> - So sánh giữa ly giải hồng cầu trước<br /> khi ủ kháng thể với ly giải hồng cầu sau<br /> khi ủ kháng thể.<br /> - Rửa mẫu so với không rửa mẫu sau<br /> khi ủ với kháng thể.<br /> - So sánh giữa sử d ng dung dịch cố<br /> định TB để bảo quản TB với không sử<br /> d ng dung dịch bảo quản TB.<br /> * Thu thập kết quả, so sánh và đánh giá<br /> các kết quả thu được:<br /> - Thu th p kết quả có được khi xếp loại<br /> miễn dịch theo quy trình ban đầu và quy<br /> trình có sửa đổi.<br /> 85<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br /> <br /> - Đánh giá, so sánh kết quả khi thực<br /> hiện quy trình ban đầu với kết quả khi<br /> thực hiện với quy trình có thay đổi ở một<br /> bước nhất định.<br /> - Thống nhất áp d ng một số thay đổi<br /> có hiệu quả để có một quy trình tối ưu<br /> nhất.<br /> * Vật liệu nghiên cứu:<br /> - Bệnh phẩm nghiên cứu: 10 mẫu máu<br /> ngoại vi chống đông EDTA của 10 người<br /> khỏe mạnh (m i mẫu 2 ml).<br /> - Hóa chất, sinh phẩm: dung dịch PBS,<br /> dung dịch phá hồng cầu NH4Cl, dung dịch<br /> formaldehyde 40%, sodium azide dạng<br /> bột, huyết thanh bào thai bê, bộ kháng<br /> thể gắn chất màu hu nh quang.<br /> - Thực hiện trên máy đếm TB dòng chảy<br /> Navious (Hãng Beckmann Coulter).<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Xây dựng quy trình sơ b cho xét<br /> nghiệm xếp loại miễn dịch BCC.<br /> Qua tham khảo các quy trình xử lý<br /> mẫu và xét nghiệm xếp loại miễn dịch của<br /> tài liệu khác nhau trên thế giới [2, 3, 4, 5],<br /> chúng tôi nh n thấy một số điểm chung<br /> như sau:<br /> - Mẫu sử d ng xếp loại miễn dịch là<br /> máu hoặc dịch hút tủy xương chống đông<br /> bằng EDTA.<br /> <br /> Với các dữ kiện như trên, chúng tôi xây<br /> dựng quy trình sơ bộ dùng cho xử lý mẫu<br /> và xét nghiệm xếp loại kiểu hình miễn dịch<br /> như sau:<br /> Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy<br /> xương hoặc máu toàn phần), kháng thể<br /> pha sẵn, dung dịch PBS 1X, dung dịch<br /> lysing, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn,<br /> máy Vortex.<br /> Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể<br /> tương ứng vào ống nghiệm.<br /> Bước 3: hút 100 μl bệnh phẩm vào ống<br /> xét nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex.<br /> Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện<br /> tối, 40C trong 30 phút.<br /> Bước 5: thêm 1 ml dung dịch ly giải<br /> hồng cầu vào ống nghiệm.<br /> Bước 6: tiếp t c ủ trong 10 phút.<br /> Bước 7: trộn đ u ống nghiệm bằng<br /> máy Vortex, đưa ống nghiệm vào máy<br /> đọc kết quả.<br /> 2. Áp dụng thử nghiệm quy trình xét<br /> nghiệm xếp loại iểu hình miễn dịch.<br /> Với quy trình xét nghiệm sơ bộ trên,<br /> chúng tôi áp d ng trên hệ thống máy<br /> Navious-Beckman Coulter với 10 bệnh<br /> phẩm của người bình thường, các dấu ấn<br /> miễn dịch được phối hợp như sau:<br /> <br /> - Dung dịch phá hồng cầu NH4Cl.<br /> <br /> HLA-DRFITC - CD34PE - CD45ECD<br /> <br /> - Dung dịch pha loãng bệnh phẩm PBS.<br /> <br /> CD13FITC - CD33PE - CD45ECD<br /> <br /> - Bệnh phẩm cần được ủ với kháng<br /> thể trong đi u kiện tối, nhiệt độ 40C trong<br /> 30 phút để đảm bảo gắn kết hoàn toàn.<br /> 86<br /> <br /> - Ly tâm ở tốc độ 500 g/5 phút để thu<br /> cặn và loại bỏ dịch nổi chứa các kháng<br /> thể thừa.<br /> <br /> CD3FITC - CD19PE - CD45ECD - CD2PC5<br /> CD15FITC - CD117PE - CD45ECD<br /> CD20FITC - CD22PE - CD45ECD<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br /> <br /> Phân tích kết quả thu được khi nhuộm<br /> các dấu ấn trên với bệnh phẩm dựa trên<br /> quần thể TB đã khẳng định tính chính<br /> xác của kháng nguyên biểu hiện, quần<br /> thể dòng hạt dương tính mạnh với CD15,<br /> CD13, CD33; quần thể lympho dương<br /> tính với CD2, CD3, CD19, HLA-DR, CD20,<br /> CD22; quần thể mono dương tính với<br /> HLA-DR, CD33; các dấu ấn đặc trưng của<br /> m i dòng thì âm tính trên các dòng còn<br /> lại (ví d : CD19 âm tính trên dòng hạt,<br /> CD15 âm tính trên dòng lympho). Kết<br /> quả bước đầu như sau:<br /> Dương tính giả: 3/10 mẫu (30%); âm<br /> tính giả: 0 mẫu (0%).<br /> Quy trình xét nghiệm trên đã cơ bản<br /> đảm bảo khả năng gắn các kháng thể lên<br /> b mặt TB với tỷ lệ âm tính giả 0%. Tuy<br /> nhiên, tỷ lệ dương tính giả của các dấu<br /> ấn khá cao, tới 30%, do kháng thể thừa<br /> bám không đặc hiệu trên b mặt TB. Bên<br /> cạnh đó, còn một số vấn đ liên quan đến<br /> xử lý mẫu như hiện tượng cặn xơ, hạt<br /> mỡ, hồng cầu tồn đọng gây tắc kim và<br /> gây nhiễu trong quá trình phân tích.<br /> <br /> 3. Hoàn thiện quy trình xếp loại iểu<br /> hình miễn dịch.<br /> * Ly giải hồng cầu:<br /> Qua áp d ng sơ bộ quy trình ban đầu,<br /> chúng tôi nh n thấy việc ly giải hồng cầu ở<br /> cuối quy trình không đảm bảo chất lượng<br /> xét nghiệm. Với cách ly giải hồng cầu này,<br /> các ống mẫu tồn dư nhi u cặn xơ, hạt mỡ,<br /> cửa sổ phân tích lẫn nhi u quần thể rác<br /> hoặc hồng cầu chưa tan hoàn toàn lẫn vào<br /> TB có nhân, dễ dẫn đến sai lệch kết quả.<br /> Một số phòng xét nghiệm trên thế giới áp<br /> d ng phương pháp ly giải hồng cầu, thu<br /> cặn bạch cầu trước khi ủ kháng thể.<br /> Phương pháp này có thể giúp tránh được<br /> ảnh hưởng của hóa chất ly giải hồng cầu<br /> đối với kháng thể sau ủ. Chúng tôi cải tiến<br /> quy trình trên bằng cách chuyển bước ly<br /> giải hồng cầu vào trước khi thu được cặn<br /> bạch cầu để ủ với kháng thể.<br /> So sánh hiệu quả của quy trình này với<br /> quy trình nêu trước đó, kết quả như sau:<br /> <br /> Bảng 1: So sánh kết quả giữa 2 quy trình ly giải hồng cầu trước và sau ủ.<br /> Ly giải hồng cầu sau hi ủ<br /> (n = 10)<br /> <br /> Ly giải hồng cầu trƣớc hi ủ<br /> (n = 10)<br /> <br /> Hạt mỡ trong ống xét nghiệm<br /> <br /> 10/10 (100%)<br /> <br /> 0/10 (0%)<br /> <br /> Cặn, xơ trong ống xét nghiệm<br /> <br /> 8/10 (80%)<br /> <br /> 0/10 (0%)<br /> <br /> Nhi u<br /> <br /> Ít<br /> <br /> 1/10 (10%)<br /> <br /> 0/10 (0%)<br /> <br /> Quần thể mảnh vỡ hồng cầu, cặn bẩn<br /> phân tích trên máy<br /> Hiện tượng tắc kim khi chạy máy<br /> <br /> Việc phá hồng cầu trước khi ủ bệnh phẩm với kháng thể giúp loại bỏ được cặn bẩn,<br /> hạt mỡ trong ống xét nghiệm. Đi u này cải thiện chất lượng bệnh phẩm khi phân tích<br /> trên máy, không bị lẫn các mảnh hồng cầu tồn dư hoặc rác với TB có nhân. Ngoài ra,<br /> việc phá hồng cầu trước khi ủ cũng cải thiện hiện tượng tắc kim khi chạy máy.<br /> 87<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br /> <br /> * R a bệnh phẩm sau ủ kháng thể:<br /> Một nguyên nhân khác gây nên hiện<br /> tượng dương tính giả khi phân tích TB<br /> dòng chảy là do thừa kháng thể trong quá<br /> trình ủ. Khi lượng kháng thể thừa so với<br /> số TB đưa vào, chúng có thể bám không<br /> đặc hiệu lên TB với ái lực thấp và cho tín<br /> hiệu dương tính đối với cảm biến của<br /> máy đếm, gây sai lệch kết quả. Để giải<br /> quyết vấn đ này, chúng tôi bổ sung<br /> bước rửa bệnh phẩm sau khi ủ bằng<br /> cách: thêm 2 ml PBS vào h n hợp sau ủ,<br /> ly tâm 500 g/5 phút, hút dịch nổi và tái<br /> huy n dịch lại bằng 1 ml PBS.<br /> Bảng 2: So sánh kết quả giữa 2 quy<br /> trình có rửa và không rửa kháng thể.<br /> <br /> Tỷ lệ dương tính giả<br /> Mức độ t p trung của<br /> tín hiệu phân tích<br /> <br /> Kh ng rửa<br /> háng thể<br /> <br /> Có rửa<br /> háng thể<br /> <br /> 4/10 (40%*)<br /> <br /> 0/10 (0%)<br /> <br /> Phân tán<br /> <br /> T p trung<br /> <br /> (* Các dấu ấn thường có hiện tượng<br /> dương tính giả gồm CD22, CD20, CD15).<br /> Việc rửa kháng thể thừa sau khi ủ với<br /> bệnh phẩm là bước quan trọng, giúp tối<br /> ưu hóa kết quả phân tích trên máy đếm<br /> TB dòng chảy.<br /> Qua 2 bước cải tiến trên, chúng tôi<br /> đưa ra quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm<br /> xếp loại kiểu hình miễn dịch hoàn thiện<br /> như sau:<br /> - Kỹ thu t xử lý mẫu trước khi xếp loại<br /> kiểu hình miễn dịch:<br /> Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương<br /> hoặc máu toàn phần), kháng thể pha sẵn,<br /> dung dịch PBS 1X, dung dịch ly giải hồng<br /> cầu, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, máy<br /> Vortex.<br /> 88<br /> <br /> Bước 2: ủ bệnh phẩm với dung dịch ly<br /> giải theo tỷ lệ 1/15 trong 10 phút.<br /> Bước 3: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch<br /> nổi, thu cặn bạch cầu.<br /> Bước 4: tái huy n dịch cặn bằng 2 ml<br /> dung dịch PBS 1X.<br /> Bước 5: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi,<br /> thu cặn bạch cầu.<br /> - Kỹ thu t ủ kháng thể xếp loại kiểu<br /> hình miễn dịch:<br /> Bước 1: tái huy n dịch cặn bằng dung<br /> dịch PBS 1X, pha loãng đảm bảo nồng độ<br /> 106 bạch cầu/μl dung dịch (theo số đếm<br /> bạch cầu).<br /> Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể<br /> tương ứng vào ống nghiệm.<br /> Bước 3: hút 100 μl dung dịch bạch cầu<br /> đã chuẩn bị vào ống xét nghiệm, trộn đ u<br /> bằng máy Vortex.<br /> Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện<br /> tối, 40C trong 30 phút.<br /> Bước 5: thêm 2 ml PBS vào h n hợp<br /> sau ủ, ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi,<br /> thu cặn bạch cầu đã gắn kháng thể.<br /> Bước 6: thêm 1 ml dung dịch PBS 1X<br /> vào ống nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex,<br /> đọc kết quả sau khi chạy máy.<br /> * Bảo quản bệnh phẩm bằng dung dịch<br /> cố định TB:<br /> Một vấn đ khó khăn là bệnh phẩm chỉ<br /> có thể lưu giữ trong vòng 48 giờ. Sau thời<br /> gian này, TB có xu hướng thoái hóa, vón<br /> t lại và không còn đảm bảo tính chính<br /> xác khi phân tích. Vì v y, chúng tôi áp<br /> d ng phương pháp bảo quản bệnh phẩm<br /> bằng cách sử d ng dung dịch cố định TB<br /> và dung dịch bảo quản TB pha chế theo<br /> công thức tham khảo từ nhi u tài liệu<br /> nghiên cứu.<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản